UA77735C2 - Method for recovery of poxviruses from infected cells - Google Patents
Method for recovery of poxviruses from infected cells Download PDFInfo
- Publication number
- UA77735C2 UA77735C2 UA20040705906A UA20040705906A UA77735C2 UA 77735 C2 UA77735 C2 UA 77735C2 UA 20040705906 A UA20040705906 A UA 20040705906A UA 20040705906 A UA20040705906 A UA 20040705906A UA 77735 C2 UA77735 C2 UA 77735C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- poxvirus
- virus
- stage
- cells
- infected cells
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 88
- 238000011084 recovery Methods 0.000 title abstract description 3
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 claims abstract description 46
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 23
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 claims description 25
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 17
- 241000700626 Cowpox virus Species 0.000 claims description 14
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 10
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 9
- 238000009295 crossflow filtration Methods 0.000 claims description 7
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 7
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 claims description 5
- 241001112691 Goatpox virus Species 0.000 claims description 4
- 241000700665 Sheeppox virus Species 0.000 claims description 4
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 4
- 241000178270 Canarypox virus Species 0.000 claims description 3
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 3
- 241000700662 Fowlpox virus Species 0.000 claims description 2
- 241000587120 Vaccinia virus Ankara Species 0.000 claims 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 abstract description 48
- 241001183012 Modified Vaccinia Ankara virus Species 0.000 abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 83
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 16
- 208000033017 acquired idiopathic inflammatory myopathy Diseases 0.000 description 13
- 208000013643 idiopathic inflammatory myopathy Diseases 0.000 description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 13
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 12
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 11
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 10
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 9
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 9
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 9
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 8
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 8
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 7
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 7
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 6
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 6
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 4
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 208000005585 Poxviridae Infections Diseases 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 2
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 2
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 2
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 2
- TYNLGDBUJLVSMA-UHFFFAOYSA-N 4,5-diacetyloxy-9,10-dioxo-2-anthracenecarboxylic acid Chemical compound O=C1C2=CC(C(O)=O)=CC(OC(C)=O)=C2C(=O)C2=C1C=CC=C2OC(=O)C TYNLGDBUJLVSMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 241000700663 Avipoxvirus Species 0.000 description 1
- 235000011293 Brassica napus Nutrition 0.000 description 1
- 240000008100 Brassica rapa Species 0.000 description 1
- 235000000540 Brassica rapa subsp rapa Nutrition 0.000 description 1
- 108010040864 CERE Proteins 0.000 description 1
- 241001137864 Camelpox virus Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000012270 DNA recombination Methods 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 241000725619 Dengue virus Species 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- 108010058643 Fungal Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 101710085938 Matrix protein Proteins 0.000 description 1
- 101710127721 Membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 206010067482 No adverse event Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 108700040099 Xylose isomerases Proteins 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 229940031567 attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 238000010923 batch production Methods 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 238000005422 blasting Methods 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 201000003740 cowpox Diseases 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000008029 eradication Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- -1 for example Proteins 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 239000008240 homogeneous mixture Substances 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000011261 inert gas Substances 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000010297 mechanical methods and process Methods 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 244000309711 non-enveloped viruses Species 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 230000007505 plaque formation Effects 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- LTUDISCZKZHRMJ-UHFFFAOYSA-N potassium;hydrate Chemical compound O.[K] LTUDISCZKZHRMJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940024231 poxvirus vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000010802 sludge Substances 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 1
- 210000004895 subcellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
- C12N7/02—Recovery or purification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/275—Poxviridae, e.g. avipoxvirus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/24011—Poxviridae
- C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
- C12N2710/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/24011—Poxviridae
- C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
- C12N2710/24151—Methods of production or purification of viral material
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Virology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
- Meat, Egg Or Seafood Products (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
Description
Опис винаходу
Даний винахід відноситься до способу одержання поксвірусів, зокрема модифікованого вірусу коров'ячої 2 віспи Анкара (ММА), з інфікованих клітин. Згідно даного винаходу інфіковані клітини піддаються гомогенізації високим тиском для одержання вірусовмісного гомогенату. Вірусовмісний гомогенат може бути підданий принаймні одній стадії очищення для одержання фракції збагаченої на поксвірус. Винахід також відноситься до вірусовмісної фракції та вірусовмісного гомогенату одержаного методом згідно даного винаходу.
Рохмігідае являє собою велике сімейство ДНК-вірусів, котрі реплікуються в цитоплазмі клітин хребетних та 70 безхребетних. Сімейство Рохмігідае може бути поділене на підсімейства Спогдорохмігіпае (поксвіруси хребетних) та Епіоторохмігіпае (поксвіруси комах).
СПпогаорохмігіпае налічує декілька поксвірусів тварин (класифіковані в декілька родів) які мають велике економічне значення, такі як поксвіруси верблюда, поксвіруси вівці, козячі поксвіруси, авіпоксвіруси або поксвіруси птахів. Існують ослаблені вакцини з живими або інактивованими вірусами для вакцинації свійських 12 тварин від овечих або козячих поксвірусів. Для вакцинації птахів були розроблені рекомбінантні вакцини в яких пташиний поксвірус використано як вектор.
Оскільки пташиний поксвірус інфікує людські клітини, можна передбачати те, що він може бути використаний як вектор для експресії гетерологічних генів у людей і викликати відповідні імунні відповіді. Поксвіруси птахів, які містять в своєму геномі гени ВІЛу описані в патентах 5 5,736,368 та 05 6,051,410.
У людей вірус віспи, член роду Огіпорохмігиз, був найбільш важливим поксвірусом. Вірус коров'ячої віспи, також член родини Рохмігідае, використовувався як жива вакцина для імунізації від віспи. Успішна всесвітня вакцинація вірусом коров'ячої віспи досягла кульмінації у викоріненні вірусу віспи |Ппе діоба! егадісайоп ої зтайрох. Ріпа! герогі ої їШйе діора! сопттізвіоп ог (Ше сепійїйсайоп ої зтайЙрох егадісайоп; Нівіогу ої
Рибіїс Неапкй, Мо. 4, Сепема: МуУопа Неайй Огдапіганйоп, 19801). Після цієї заяви ВОЗ, вакцинація була с припинена на багато років за виключенням людей із високим ризиком інфікування поксвірусом (наприклад, Ге) лабораторні працівники). Програми вакцинації знову набули актуальності з огляду на ризик використання вірусу віспи у біологічній війні або з біотерористами.
Останнім часом, вірус коров'ячої віспи також був використаний для створення вірусних векторів для експресії рекомбінантних векторів та потенційно для використання як рекомбінантні живі вакцини (МаскКей, М., о тій, 0. Ї. апа Мозз, В. 1982) Р.М.А.5. ОБА 79,7415-7419; Зтійй, с.Ї., Маскей, М. апа Мовзз, В. (19841 «се
ВіоїесппоІоду апа Сепеїйїс Епдіпеегіпуд Кеміемув 2,383-407|. Це було пов'язано з тим, що за допомогою методу рекомбінації ДНК в геном вірусу коров'ячої віспи були введені послідовності ДНК (гени), які кодують чужорідні в антигени. Якщо ген інтегровано в ділянку вірусної ДНК, котра не є життєво важливою для життєвого циклу ча вірусу, може так статися, що новопродуковані рекомбінантні віруси коров'ячої віспи будуть інфекційними, що 39 каже про їхню здатність інфікувати інші клітини й таким чином експресувати інтегровану послідовність ДНК в (патентні заявки ЕР 83286 та 110385). Рекомбінантні віруси коров'ячої віспи одержані таким чином, можуть бути використані з одного боку як живі вакцини для профілактики інфекційних захворювань, з іншого боку, для виготовлення гетерологічних протеїнів в еукаріотичних клітинах. «
Використання вірусу коров'ячої віспи як вектора для створення рекомбінантних живих вакцин було під впливом заходів безпеки та регулювання. Більшість рекомбінантних вірусів коров'ячої віспи, описаних в З с літературі засновані на Західному Резервному штамі вірусу коров'ячої віспи. Відомо, що цей штам має високу
І» нейровірулентність й, таким чином, мало придатний для використання на людях і тваринах |Могіга ейа!., Массіпе 5,65-70 (19871). З іншого боку, модифікований вірус коров'ячої віспи Анкара (ММА) є відомим як виключно безпечний. ММА був одержаний довготривалими послідовними пасажами штаму Анкара вірусу коров'ячої віспи (СМА) на курячих ембріофібробластах |для огляду див. Мауг, А. Носпвіеіп-МіпігеіІ, М. та 5сКІ, Н. (1975) це. Іпїесіоп 3,6-14; СН5б8,392)Ї. Зразками штамів вірусу ММА, які депоновано у відповідності із вимогами -І Будапештської угоди є штами ММА 572, ММА 575 та ММА-ВМ, які депоновано в Європейській Колекції Тваринних
Клітинних Культур (ЕСАСС), Салісбері (ШК) під депозитними номерами ЕСАСС М94012707, ЕСАСС М00120707 та це. ЕСАСС УО00083008, відповідно. ММА є відомим своїми значною ослабленістю що визначається його низькою со 20 вірулентністю або інфекційністю при збереженні гарної імуногенності. Вірус ММА був досліджений для визначення змін в геномі порівняно зі штамом СМА природного типу. Було визначено шість основних делецій в геномній ДНК сл (делеції І, І, Ш, ІМ, М, та МІ) які разом мають 31000 пар основ |(Меуег, Н., З,цЧег, б. апа Мауг А. 119911
У. Сеп. Мігої. 72,1031-1038). Одержаний вірус ММА стає жорстко обмеженим за клітиною-хазяїном до клітин птахів. Також, ММА характеризується своєю надзвичайною ослабленістю. При тестуванні на різноманітних 25 тваринних моделях було доведено його вірулентність лише у імунопригнічених тварин. Більш важливим є те, що
ГФ) відмінні якості штаму ММА було показано при широких клінічних випробуваннях |Мауг еї аї., 7БІ. Вакі. Нуа. І,
Арі Ога. В 167, 375-390 (1987), БСК ек аї.,, Оси. тей. МуУвспг. 99,2386-2392 (19741). Під час цих о досліджень на більш ніж 120тис. людей, включаючи пацієнтів високого ризику, не було виявлено жодних побічних ефектів пов'язаних із використанням вакцини ММА. Вже створений та використовується в клінічних дослідженнях 60 рекомбінантний ММА, придатний для використання як вакцина. У УУО 98/13500 описується рекомбінантний ММА, який містить й здатний експресувати одну чи більше ДНК послідовностей, що кодують антигени вірусу тропічної лихоманки. Чужорідні послідовності ДНК були рекомбіновані у вірусну ДНК у сайт делеції, що природно трапляється в геномі ММА.
Перед використанням поксвірусів або рекомбінантних поксвірусів для вакцинації необхідно очистити вірус до бо певної міри для відповідності регуляторним вимогам. Традиційний шлях для очищення поксвірусів, зокрема ММА та рекомбінантного ММА, є наступним: на першій стадії культивують клітини сприйнятливі до інфекції відповідним поксвірусом. У випадку ММА сприйнятливими клітинами є такі як фібробласти курячого ембріону.
Сприйнятливі клітини інфікують поксвірусом і культивують на протязі часу, достатнього для генерування вірусного продукту. Потім клітини заморожують й розморожують для того, щоб відділити клітини з культуральної вірусної поверхні та для часткового руйнування клітин. Суміш інтактних та зруйнованих клітин віддентрифуговується. Для одержання гомогенату використовується ультразвук. Вірус виділяють з гомогенату центрифугуванням на сахарозній підкладці ШоКІїК МУК. "Те ригіїсайоп ої їТоциг вігаійпе ої рохмігив" Мігоїосду 1962; 18: 9-18). Ключовою стадією в цьому процесі є гомогенізація із застосуванням ультразвуку (Недвігот, К. 70 б. апа Гіпарего, О., 2. Іттип. Рогесп. 1969 137: 421-430; сСКІ, Н., Когб, МУ. апа Носпзіеїіп-Міпігеї, М., 701. Вакї., І. АБ. Огід. (1970), 215,38-50). В промислових процесах було б бажаним, щоб усі стадії процесу були б легко контрольованими й відтворюваними. Однак, недоліком використання ультразвуку для гомогенізації вірусно-клітинної суспензії є те, що ультразвукова стадія є складною для ідентичного відтворення, складною для пристосування та складним є також масштабувати лабораторний процес у промисловий.
Отже, суттю винаходу є створення методу одержання поксвірусів, зокрема вірусів коров'ячої віспи, такого як штам ММА, з клітин інфікованих поксвірусом, при якому гомогенізація інфікованих клітин є відтворюваною, легко контрольованою й дозволяє перейти від масштабів лабораторії до масштабів промисловості.
Даний винахід відноситься до способу одержання поксвірусів, зокрема вірусу коров'ячої віспи, такого як штам ЕїЇвігее чи модифікований вірус коров'ячої віспи АпКага (ММА), з інфікованих клітин. Спосіб, згідно 2о даного винаходу, спрямований на одержання поксвірусу з інфікованих клітин та включає стадію обробки інфікованих клітин гомогенізацією високим тиском для одержання поксвірус-вмісного гомогенізату.
Було неочікуваним те, що інтактні й інфіковані поксвіруси можуть бути одержані способом згідно даного винаходу. Гомогенізація високим тиском є загально застосовною для руйнування клітинних й субклітинних структур для виділення протеїнів чи ліпідів з еукаріотичних чи прокаріотичних клітин. В 05 3983008 описується сч спосіб екстрагування корисних компонентів з мікробних клітин за допомогою гомогенізації високим тиском.
Екстраговані речовини були дріжджовими протеїнами, бактеріальними ферментами й дріжджовими ліпідами. В ОЄ о); 19918619 описується використання гомогенізації високим тиском для виділення НьЬздАад з дріжджових клітин. В О5 4255521 описується спосіб екстрагування глюкозної ізомерази з клітин мікроорганізмів за вивільненням високим тиском. Гомогенізація високим тиском також використовувалася для виділення вірусоподібних часток (ВПУ) з ю зо рекомбінантних Засспаготусевз сегемізвіде |МіїЇриги апабиппії! (1994) Віоїесппоїсду апа Віоепдіпеегіпад 44,736-744| та для продукування й очищення аденовірусних векторів (05 6194191). ВПЧ й аденовіруси є о безоболонковими та більш малими й простішими вірусами, котрі, таким чином, схожі на клітинні протеїнові М структури. От чому, не є дивним, що гомогенізація високим тиском, котра є придатною для виділення протеїнів з клітин також може використовуватися для виділення аденовірусів ВПЧ з еукаріотичних клітин. В протилежність ї-
Зв ЦЬОМУ, внутрішньоклітинні зрілі віріосни поксвірусу мають дуже складну структуру, котра, між іншим, включає ї- ліпідну мембрану (ММ, див. нижче, див. РієеЇїд5 еї аї., Ріеід5 Мігоїоду, 1996, Іірріпсой-Камеп рибіїзНегв,
РПйадеїрнпіа, ОБА, ІЗВМ 0-7817-0253-4, спарієег 83, радез 2654-5). Морфологія й фізичні властивості поксвірусу
ІЇММ у деяких аспектах дуже сильно схожа до морфології й фізичних властивостей клітини ніж до безоболонкових вірусів. От чому, було очікуваним, що умови для руйнування клітин гомогенізацією високим тиском також « 0 призведуть до руйнування поксвірусів. Таким чином, неочікуваним результатом стало те, що гомогенізація шо с високим тиском руйнує клітини але лишає неушкодженими достатню кількість поксвірусів, які в подальшому можуть бути очищені. Іншими словами, не можна було припустити, що гомогенізація високим тиском могла )» застосовуватися як метод одержання поксвірусів з інфікованих клітин. Дійсно, відомим методом для одержання поксвірусів з інфікованих клітин є використання ультразвуку для гомогенізації, котрий є більш м'яким шляхом гомогенізації. -І На відміну від способів одержання, котрі використовують ультразвук, є спосіб за даним винаходом, що дозволяє відтворювано гомогенізувати інфіковані клітини; спосіб є легко контрольованим і його легко розвинути ш- від лабораторних до промислових масштабів. -І В контексті даного винаходу термін "поксвірус" відноситься до будь-яких вірусів, що належать до родини
Рохмігідае. Спосіб згідно даного винаходу переважно проводиться із представниками Рохмігідаеє підсімейства о спогдорохумігіпае, більш переважно родів огіпорохмігив, амірохмігиз, саргірохмігиз та зиїірохміги5. Найбільш с переважно, винахід стосується способу одержання й очищення поксвірусів з групи, яка складається з вірусу коров'ячої віспи, козячого поксвірусу, овечого поксвірусу, канарейкового поксвірусу та пташиного поксвірусу.
Зокрема бажаним є вірус коров'ячої віспи. Прикладами штамів коров'ячої віспи, використаними в способі за в даним винаходом є штами ЕїІвігее, МУуейй, Сореппадеп, Тетріе ої Неамеп, МУСВН, У/евіегп Кезегме. Винахід не є обмеженим до цих спеціально зазначених штамів вірусу коров'ячої віспи, але може бути застосований з будь-яким іФ, штамом вірусу коров'ячої віспи. Переважним прикладом вірусу коров'ячої віспи є модифікований штам вірусу ка коров'ячої віспи АпКага (ММА). Типовим штамом ММА є ММА 575, котрий був депонований в Європейській Колекції
Тваринних Клітинних Культур із депозитним номером ЕСАСС МО00120707. Більш переважним є ММА-ВМ або його бо похідні. ММА-ВМ було описано в УМО 02/42480 |РСТ/ЕРО1/13628). Вказана міжнародна заявка розкриває біологічні тести, які дозволяють визначити чи є штам ММА штамом ММА-ВМ чи його похідним й способи одержання ММА-ВМ або його похідних. Зміст цієї заявки є включеним до теперішньої заявки через посилання. ММА-ВМ депоновано в
Європейській Колекції Тваринних Клітинних Культур із депозитним номером ЕСАСС У00083008.
Віруси, що одержуються можуть бути природними вірусами, ослабленими вірусами або рекомбінантними 65 вірусами.
Термін "рекомбінантний вірус" відноситься до будь-якого вірусу, який має у вірусному геномі вставлений гетерологічний ген, котрий не є в нормі частиною вірусного геному. Гетерологічний ген може бути терапевтичним геном, геном, що кодує антиген чи пептид, представлений принаймні одним епітопом для викликання імунної відповіді, антисмисловою експресійною касетою або рибозимним геном. Способи одержання рекомбінантних вірусів є відомими досвідченим особам в даній галузі. Гетерологічний ген переважно вставлений в неважливу ланку вірусного геному. В іншому переважному втіленні винаходу гетерологічна послідовність нуклеїнової кислоти вставлена в сайт природної делеції геному ММА |описано в РСТ/ЕРО6/029261. "Ослаблений вірус" є вірусом, котрий інфікуючи організм хазяїна призводить до меншої смертності та/або захворюваності порівняно із неослабленим батьківським вірусом. Прикладом ослабленого вірусу коров'ячої віспи /0 8 штам ММА, зокрема ММА-575 та МУА-ВМ.
Відомо, що поксвіруси, такі як вірус коров'ячої віспи, можуть існувати в двох різних формах: поксвірус прикріплений до клітинної мембрани в цитоплазмі інфікованої клітини (внутрішньоклітинний зрілий віріон (ІММ)) та віруси які мають бути виведені назовні (зовнішньоклітинний оболонковий віріон (ЕЕМ)) |(Мапаегріаззспеп
А,Ноїїпзпеай М, Бтійй СІ "ІпігасейшШіаг апа ехігасеЇШіаг массіпіа мігіопз епіег сев Бу айегепі /5 теснапізтз»" .). беп. Мігої. (1998), 79,877-8871. Обидва ІММ та ЕЕМ є інфекційними, але морфологічно різними, оскільки ЕЕМ має додаткову ліпопротеїнову оболонку. За нормальних умов частки ІММ присутні в більшій кількості ніж ЕЕМ, але методом згідно даного винаходу можна отримати обидва типи часток.
Початковий матеріал для стадії гомогенізації згідно даного винаходу є клітинами інфікованими відповідним поксвірусом. Термін "інфіковані клітини" використовується для позначення початкового матеріалу для гомогенізації відповідно до даного винаходу, відноситься до інтактних клітин інфікованих відповідним вірусом, до частин чи фрагментів інфікованих клітин, до котрих приєднано відповідний поксвірус або до суміші інтактних та лізованих/зруйнованих клітин. Прикладами частин чи фрагментів інфікованих клітин є клітинні мембрани лізованих/зруйнованих клітин, до яких приєднано відповідний поксвірус. Початковий матеріал також може містити вільні вірусні частки, котрі не є приєднаними до клітинної мембрани і не розташовані внутрішньоклітинно. сч
Для одержання інфікованих клітин, котрі є початковим матеріалом для способу за даним винаходом еукаріотичні клітини інфікують відповідним поксвірусом. Еукаріотичні клітини є клітинами, що є сприйнятливими о); до інфікування відповідним поксвірусом і дозволяють реплікацію й вироблення інфекційного вірусу. Такі клітини є відомими для всіх поксвірусів особам досвідченим в даній галузі. Для ММА та вірусу коров'ячої віспи штам
ЕІвігее прикладом цього типу клітин є курячі ембріофірбобласти (СЕР) |Огехіег І., НеїМПег К., УМайгеп В., Ете ю зо М. апа зЗийег б. "Нідну айепиаа тодйей массіпіа АпКага геріїсаез іп Бару Натзіег Кідпеу сеї, а роїепіїа! пові їТог мігиз ргорадайоп, Биї пої іп магоиз питап ігапзіогтей апа ргітагу сеїв" 9. беп. Мігої. о (1998), 79,347- 352). Клітини СЕР можуть бути культивовані в умовах, відомих особам досвідченим в даній М галузі. Переважно клітини СЕР культивують у безсироватковому середовищі в стаціонарних колбах або в циліндричних пляшках. Інкубація переважно займає від 48 до 96 годин при 372С--220. Для інфікування поксвіруси ї- беруть в інфекційній кількості (МОЇ) від 0,05 до 1 ТСІОво й інкубація переважно займає від 48 до 72годинпри 372С-296.
Спостерігати прогрес інфікування можна розглядаючи цитопатичні ефекти, які зазвичай з'являються як заокруглення інфікованих клітин. «
Даний винахід дозволяє одержувати поксвіруси, такі як ЕІвігее або ММА з інфікованих клітин. Під терміном "одержання" мається на увазі, що спосіб згідно даного винаходу дозволяє руйнувати клітини інфіковані - с поксвірусом та/або відділити поксвіруси від клітинних мембран, з котрими вони звичайно зв'язані, до такого стану, коли стає можливим подальше очищення. Таким чином, продукт виділення поксвірусів з інфікованих клітин )» (відноситься до "гомогенату, що містить поксвірус" в даній заявці) є гомогенною сумішшю вільних поксвірусів й клітинних детритів (шламів), котрі містять незначні кількості інтактних, незруйнованих клітин та вірусу, зв'язаного з клітинними мембранами. -і Якщо інфіковані клітини є клітинами, котрі можуть бути культивовані в суспензійній культурі, то -1 інфіковані клітини можуть легко бути зібрані центрифугуванням.
Якщо інфіковані клітини є більш чи менш інтактними адгезивними клітинами, вони мають бути зібрані, тобто -і видалені з культуральної судини, перед гомогенізуванням високим тиском. Такий метод є відомим особам, сю 50 досвідченим в даній галузі. Придатними для цього є механічні методи (наприклад, з використанням гумового клітинного скребка), фізичні методи (наприклад, охолодження нижче -152С й відтавання культуральних посудин до сл 1592) або біохімічні методи (обробка ферментами, наприклад, трипсином, для відділення клітин від культуральних посудин). Якщо для цих потреб використовуються ферменти, слід контролювати час інкубації, оскільки ці ферменти можуть під час інкубації також пошкодити вірус. 99 В способі згідно даного винаходу, інфіковані клітини, більш точно, зібрані інфіковані клітини потім
ГФ) піддаються гомогенізації високим тиском. В даному описі термін "гомогенізація високим тиском " іноді приводиться в абревіатурі "НРН". Гомогенізація високим тиском має подвійний ефект. З одного боку де гомогенізація високим тиском призводить до руйнування інтактних клітин. Таким чином, ІММ вивільнюються і стають доступними для подальшого очищення. З іншого боку гомогенізація високим тиском має той ефект, що 60 поксвіруси відокремлюються від клітинної мембрани або принаймні зменшується / розмір клітинно-мембранно-вірусних агрегатів. До того ж це спрощує подальше очищення поксвірусу.
Особа досвідчена в даній галузі, є знайомою із загальними принципами гомогенізації високим тиском |(М/пйе
МО, Магсивз 0., "Оівіпіедгайоп ої тісгоогдапізтв", Адм. ВіоїесппоЇ. Ргосеззез 1988; 8: 51-96). Системи НРН базуються на використанні високого тиску для проштовхування зразка через малий фіксований отвір на високій бо Швидкості за контрольованих й відтворюваних умов. В даному описі терміни "патрубок", "отвір" та "форсунка"
використовуються взаємозамінно.
Основною частиною кожного руйнівника є руйнуюча голівка. Руйнуюча голівка переважно складається з (І) камери/циліндра високого тиску, (ІІ) поршня високого тиску, котрий рухається в камері/циліндрі, й таким чином збільшується тиск в камері/циліндрі й (І) патрубка/форсунки через котрий випорскується вміст камери.
Випорскнутий вміст камери спрямовується на поверхню, таку як шматок металу, котрий переважно має теплообмінну поверхню, що сприяє охолодженню. Для того щоб зібрати зруйнований вміст камери в системі передбачено засіб для збору зруйнованого зразку (названий "збірна камера"). Типовим гомогенізатором високим тиском є Вавіс 2-- від Сопвіапі СеїІ Оізгиріоп Зузіетв | ом/ Магсй, ОЮОамепігу, Могпійапів, ММ11450, Опіей Кіпддоті. 70 В переважному втіленні руйнування клітин за допомогою системи гомогенізації високим тиском проводиться в три стадії. (І) Зразок вводиться в камеру/циліндр високого тиску. Потім створюється тиск в камері/циліндрі.
Доки це триває, поршень високого тиску опускається. (ІІ) Поршень потім подає зразок через форсунку на високій швидкості. Швидке переміщення зразку із зони з високим тиском в зону з низьким тиском призводить до руйнування клітин. (І) Зразок досягає кінцевої цілі й наноситься радіально поперек охолоджуваної теплообмінної поверхні. Продукт потім стікає в камеру для накопичення. Гідравліка наповнюється знову й цикл продовжується.
В кінці процесу випорскнутий гомогенат збирається у відповідну посудину, залежно від об'єму.
Для одержання поксвірусів згідно даного винаходу форсунка повинна мати діаметр в межах 0,10 до 0,бмм, 0,15 до О,бмм, 0,15 до О0,5О0мм, бажано в межах від 0,15 до 04Омм, 0,20 до 0,50мм, більш бажано 0,20 до 0,40мм, найбільш бажано 0,25мм до 0,35мм. Приклади найбільш переважних діаметрів 0,25мм та 0,ЗБмм.
Значення тиску в камері/циліндрі встановлюється в межах від 200 до 1000бар, бажано 400 до 1000бар, 200 до 800бар, більш бажано 400 до 800бар, 600 до 1000бар, ще більш бажано 600 до 900бар, найбільш бажано 700 до 900бар. Найбільш переважний тиск становить 800бар.
Температура гомогенату на виході не повинна перевищувати 252 й бажано не бути нижче 4152, ще більш сч бажано нижче «1096.
Спосіб згідно даного винаходу може бути лінійно розширений і може проводитися як пакетним чином так і о безперервно.
При пакетному провадженні процесу кожний пакет клітин, які мають бути гомогенізовані можуть бути піддані стадії гомогенізації високим тиском один або декілька разів. Бажано щоб над кожним пакетом стадію юю гомогенізації було виконано від одного до трьох разів, більш бажано лише один раз.
Успіх стадії гомогенізації може бути оцінений визначенням титру вірусу (еквіваленту кількості інфекційних о вірусних часток, визначених або інфікуючою дозою культури тканини (ТСІЮОБО), або одиницями утворення бляшок /-|че (ріш)) в початковому матеріалі, як визначено вище, та в матеріалі, одержаному після стадії гомогенізації.
Іншими словами, титр вірусу визначається до та після гомогенізації високим тиском. Початковий матеріал, що - містить більш-менш інтактні клітини й значна більшість великих агрегатів представлені поксвірусними частками, |че зв'язаними із клітинними мембранами. Якщо такий матеріал використовувався для визначення вірусного титру, одержаний титр є нижчим ніж дійсна кількість інфекційних часток. Це має місце завдяки тому факту, що тест-системи, що використовуються для визначення вірусного титру, зазвичай являють собою системи клітинних « культур (такі як системи описані в прикладі 2) в котрих підраховується кількість інфікованих клітин або 7470 кількість утворених бляшок. Такі тест-системи не можуть знайти різницю між позитивними результатами які є - с наслідком інфікування клітини лише однією вірусною часткою й інфікування клітин, наприклад, великим агрегатом вірусів зв'язаних із клітинними мембранами. Після гомогенізації високим тиском опоксвіруси стають і» відокремленими від клітинних мембран та/або розмір клітинно-мембранно-вірусних агрегатів значно зменшується, що призводить до зростання кількості менших агрегатів. Якщо цей матеріал використовувався для визначення титру, одержані результати будуть вищими, навіть якщо дійсна кількість інфекційних вірусних частинок не - І зменшиться. Таким чином, успіх гомогенізації переважно відображається принаймні таким самим або вищим -1 значенням ТС во/мл Стар" є абревіацією від Чіввце сийиге іп'есбоцз дове", "доза, що інфікує тканинну культуру") гомогенату порівняно із початковим матеріалом. В розділі прикладів показано в деталях, як може - І бути визначене значення ТСІЮО со/мл. Також якість й успішність гомогенізації високим тиском може бути визначена електронною мікроскопією. мні Для подальшого очищення одержаний гомогенат проходить принаймні одну стадію очищення для одержання сл фракції збагаченої поксвірусом. Зокрема, ці стадії можуть бути проведені на гомогенаті, що містить вірус коров'ячої віспи, який призначений для подальшого очищення вказаного вірусу коров'ячої віспи.
Стадія очищення, між іншим, може бути: - пакетним центрифугуванням (наприклад, з використанням сахарозної підкладки) або безперервно-проточним ультрацентрифугуванням (сахарозні градієнти) (Нібеппацйв, 9., Копіег, К. апа Огизсикацч, Н., 9.ВіоІї. (апа. іФ) (1976) 4,285-293; Мадаїнп»кКі, МУ., Вапкоу»кі, А. апа Когбрескі, М., Асіа Мігої. (1977) 21,104-108), ко - ультрафільтрацією (наприклад, поперечно-проточною фільтрацією з використанням мембрани із порами розміром більше 500кДа, але рівними чи меншими 0,1ЦМ), 60 - колонковою хроматографією (наприклад, іонообмінною, гідрофобною взаємодією, розмірною ексклюзією або комбінацією) (Недзвігот, К. б. апа Ііпарего, О., 7. Іттип. Рогесп. 1969 137: 421-430; 5сКІ, Н., Кого, МУ. апа
Носзівіп-Міпігеї, М., 7БІ. Вакі., І. АБ. Огід. (1970), 215,38-50), - комбінацією вище наведених (Мазиаа, М., ЄПеп, К. Р. апа ОСгоме, 0. А...
Бажано, щоб стадія очищення була стадією ультрафільтрації. Більш бажано, стадією ультрафільтрації має 65 бути поперечно-проточна фільтрація відома особі досвідченій в даній галузі. (Див. наприклад, Кіспагаз, 0. Р. апа Соїідтіпії, 0О., 9. МігоЇ. Меїйподз (1982), 4 (3), сс.147-153. "Емаішайоп ої а сгов8е-Пом/ Пгайоп
Тесппідце ог ехігасіїоп ої роїомігизев тот іпосціайеа сузіег (зве потодепаїев".
Хоча одна стадія очищення може бути достатня для досягнення рівня вимог регулювання для біофармацевтичних продуктів, дві або більше вище згаданих стадій очищення можуть бути скомбіновані для одержання ще більш чистого продукту.
В найбільш бажаному втіленні першої стадії очищення є поперечно-проточна фільтрація із наступною стадією колонкової хроматографії. Більш бажано, щоб стадія колонкової хроматографії була іонообмінною або гідрофобної взаємодії.
Одержана фракція збагачена на вірус може, необов'язково, бути висушена заморожуванням. Спосіб 7/0 висушування заморожуванням є відомим особам досвідченим в цій галузі (Оау У). апа Мсі еМап М., Меййоаз іп
Моіесшіаг Віоіоду (1995), 38, Нитапа Ргевззв, "Стуоргезегуайоп апа їтееге-агуіпо ргоїосої8").
Також винахід відноситься до фракцій збагачених на поксвірус та/або гомогенат збагачений на поксвірус, одержаний за допомогою метода одержання поксвірусів згідно даного винаходу, тобто, спосіб, який включає оброблення інфікованих клітин гомогенізацією високим тиском. Зокрема, винахід відноситься до фракцій, 7/5 Збагачених на поксвірус, одержаних способом виділення/очищення згідно даного винаходу, тобто, способом, в котрому гомогенат, що містить поксвірус, одержаний за допомогою НРН, й пройшов принаймні одну стадію очищення. Поксвірус може бути будь-яким вище згаданим поксвірусом. Зокрема, поксвірус згідно даного винаходу є вірусом коров'ячої віспи, так само як і будь-який штам, котрий є придатним для вакцинації, зокрема штам
ЕІвігее або модифікований вірус коров'ячої віспи АпКкага, більш бажано ММА-ВМ.
Гомогенат, що містить поксвірус та/або фракція збагачена на поксвірус, одержана способом згідно даного винаходу, котрий включає стадію НРН, характеризується дуже високим співвідношенням вільних ІММ поксвірусів до ЕЕМ поксвірусів. Термін "вільний ІММ" використовується для позначення ІМУ, від'єднаних від клітинних мембран після, до або підчас руйнування інфікованих клітин і котрі можуть бути надалі очищені. В усіх промислових способах виділення поксвірусів з початкового матеріалу включено інфіковані клітини так само як сч об супернатант культур. Таким чином, початковий матеріал включає поксвіруси ІММ, що містяться в інфікованих клітинах так само як поксвіруси ЕЕМ, котрі переважно знаходяться в супернатант. Відомі способи руйнування о); клітин із наступною гомогенізацією (наприклад, за допомогою ультразвуку) не так добре руйнують клітини та/або відокремлюють поксвіруси ІММ від клітинних уламків, як гомогенізація високим тиском. Іншими словами, більшість ІММ залишаються зв'язаними із клітинними мембранами й уламками. Таким чином, співвідношення ю зо Вільних ІММ до ЕЕМ є меншим ніж в способі згідно даного винаходу. В способі використання ультразвуку це співвідношення змінюється незначно при стадіях подальшого очищення тоді як клітинні уламки із котрими і, залишаються зв'язаними ІМУ, зазвичай видаляються. На відміну від відомих способів одержання поксвірусів М спосіб виділення за даним винаходом призводить до дуже ефективного руйнування інфікованих клітин, а ІММ дуже ефективно відокремлюються від клітинних мембран. Таким чином, загальна кількість вільних ІМУМ, котрі стають в.
Зз5 доступними до подальшого очищення є більшою ніж в способах відомих з рівня техніки, також співвідношення ї- вільних ІММ до ЕЕМ поксвірусів є більшим.
Гомогенат, що містить поксвірус та/або фракція збагачена на поксвірус, одержана за методом відповідно даному винаходу є придатними для використання як вакцини.
Якщо гомогенат, що містить поксвірус та/або фракція збагачена на поксвірус включає не модифіковані « поксвіруси або ослаблені поксвіруси, такі як штам вірусу коров'ячої віспи ЕІвігее або ММА, то вона може бути шв с використана для вакцинації проти поксвірусних інфекцій. Наприклад, гомогенат, збагачений на вірус та/або фракція збагачена на вірус, котра містить штам вірусу коров'ячої віспи ЕІвігее або ММА, зокрема ММА-ВМ може )» бути використана як вакцина проти віспяних інфекцій.
Якщо гомогенат, що містить поксвірус та/або фракція збагачена на поксвірус містять вірус, що містить та екпресує один або більше гетерологічних ген(ів), гомогенат, що містить поксвірус та/або фракція збагачена на -І поксвірус може, також, бути використана для вакцинації тварин, включаючи людей, проти протеїнів, які експресуються гетерологічними геном(ами).
Ш- Для виготовлення вакцини, гомогенат, що містить поксвірус, та/"або фракція збагачена на поксвірус, -І одержані способом згідно даного винаходу конвертується в фізіологічно прийнятну форму. Це може бути
Виконано, керуючись досвідом виготовлення поксвірусних вакцин, які використовуються для вакцинації проти о віспи як описано |ЗІЇсКІ, Н.еї аї. (1974) Оівсп. тей. МУвспг. 99,2386-2392)|. Наприклад, гомогенат, що містить с поксвірус та/або фракцію, збагачену на поксвірус зберігають при -802С із титром 5х109 ТСІЮБО/ті із 10тМ Ттів, 140тМ масі, рН 7.4. Для виготовлення вакцинних доз, наприклад, 10 3-109 ТСІОво вірусу, ліофілізують в фосфатному буферному розчині (РВ5) в присутності 295 пептону та 195 альбуміну в ампулі, бажано в скляній ампулі. Також, вакцина може бути виготовлена поступовим сублімаційним висушуванням вірусу в композиції. Ця композиція може містити додаткові добавки, такі як, манітол, декстрин, цукор, гліцин, лактозу або о полівінілпіролідон, або інші добавки, такі як антиоксиданти або інертний газ, стабілізатори або рекомбінантні іме) протеїни (такі як, сироватковий альбумін людини) придатний для застосування іп мімо. Типова вірусовмісна композиція, придатна для ліофільного сушіння, включає 10тМ Тгіз-буферу, 140тМ Масі, 18,9г/л декестрану (ММУ 6о 36000-40000), 45г/л сахарози, 0,108г/л І -глутамінової кислоти моно калієвої солі моногідрату рН 7,4. Скляна ампула запаюється й може зберігатися між 42С та кімнатною температурою на протязі декількох місяців. Тим не менш, якщо не має потреби, то ампула зберігається при температурі нижче -20296.
Для вакцинації ліофілізований або ліофільно висушений продукт може бути розведений від 0,1 до 0,5ті водного розчину, бажано фізіологічного розчину або Тгіз-буферу, і застосовується системно або локально, бо наприклад, паретерально, внутрішньом'язево або будь-яким іншим шляхом відомим досвідченому професіоналу.
Спосіб застосування, доза та кількість застосувань може бути оптимізована досвідченими професіоналами загальновідомим способом. Більш бажано, щоб поксвірусні вектори вводилися внутрішньошкірно або внутрішньом'язево.
Винахід, також, відноситься до способу вакцинації тварин, включаючи людей, який включає інокуляцію тваринам, включаючи людей, при потребі, гомогенатом, що містить поксвірус, або фракцією, збагаченою на поксвірус, одержаними способом, згідно даного винаходу.
Винахід, між іншим, включає наступне, окрема або в комбінації:
Спосіб виділення поксвірусу з інфікованих клітин, що включає стадію обробки інфікованих клітин гомогенізацією високим тиском для одержання гомогенату, що містить поксвірус. 70 Спосіб, як описано вище, в котрому поксвірус вибрано з групи, яка включає огіпорохмігив, амірохмігив, зцірохмігив та саргірохмігив.
Спосіб, як описано вище, в котрому поксвірус вибрано з групи, яка включає вірус коров'ячої віспи, козячий поксвірус, овечий поксвірус, канарейковий поксвірус та пташиний поксвірус.
Спосіб, як описано вище, в котрому вірус коров'ячої віспи є модифікованим вірусом коров'ячої віспи АпКага 7/5 «МУА), зокрема МУА-ВМ із депозитним номером ЕСАСС 00083008.
Спосіб, як описано вище, в котрому поксвірус є рекомбінантним поксвірусом.
Спосіб, як описано вище, в котрому гомогенізація високим тиском виконується поміщенням інфікованих клітин в камеру високого тиску, збільшенням тиску в камері та випорскування інфікованих клітин через патрубок.
Спосіб, як описано вище, в котрому тиск в камері збільшується до значення в діапазоні від 200 до 1000бар.
Спосіб, як описано вище, в котрому патрубок має діаметр в межах 0,10 до 0,бтт.
Спосіб, як описано вище, в котрому гомогенат, що містить поксвірус піддається, щонайменше одній стадії очищення для одержання фракції, збагаченої на поксвірус.
Спосіб, як описано вище, в котрому принаймні одна стадія очищення є стадією ультрафільтрації.
Спосіб, як описано вище, в котрому ультрафільтрація є поперечно-проточною фільтрацією. сч
Спосіб, як описано вище, в котрому на стадії поперечно-проточної фільтрації використовується мембрана, що має розмір пор більше 500кДа але дорівнює або менше 0,1уМ. о);
Спосіб, як описано вище, в котрому за ультрафільтрацією має місце принаймні одна стадія колонкової хроматографії.
Спосіб, як описано вище, в котрому одержаний гомогенат, що містить поксвірус або фракція збагачена на ю поксвірус є ліофільно висушеною.
Гомогенат, що містить поксвірус або фракція збагачена на поксвірус одержані способом, описаним вище. о
Гомогенат, що містить поксвірус або фракція збагачена на поксвірус як описано вище є вакциною. ча
Використання гомогенату, що містить поксвірус або фракції збагаченої на поксвірус як описано вище для виготовлення вакцини. -
Спосіб вакцинації тварин, включаючи людину, за такої потреби, характеризується застосуванням гомогенату, ча що містить поксвірус або фракції збагаченої на поксвірус або вакцини як визначено вище в тілі тварини.
Фігура: клітини СЕРЕ інфіковані ММА-ВМ, оброблені циклом заморожування-розморожування для отримання суспензії клітин. Вірусний титр було визначено, як описано в Прикладі 2, без подальшого очищення клітинно-вірусної суспензії ("О-значення"). Вірусно-клітинну суспензію гомогенізовано, способом відомим з « 70 рівня техніки з використанням ультразвуку ("Зопійег") або гомогенізацією згідно даного винаходу ("НРН"), як ш
Гані описано в прикладі 1. На стадії НРН тиск був 800бар та форсунка мала діаметр 0,25мм. Наприкінці стадії гомогенізації титр вірусу було знову визначено. )» Приклад(и)
Наступні приклад(и) проілюструють даний винахід. Особі добре обізнаній в даній галузі має бути зрозуміло, що наведений(і) приклад(и) ні в якому разі не може інтерпретуватися як обмеження застосування технології, що -і пропонується даним винаходом.
Приклад 1: Гомогенізація поксвірусно-клітинної суспензії з використанням гомогенізатора високого тиску і Фібробласти курячого ембріону (СЕРЕ) культивовані в циліндричних колбах були інфіковані ММА-ВМ (ЕСАСС -і УО00083008). Інфіковані клітини були оброблені замороженням та розмороженням для одержання вірусно-клітинної суспензії. о В гомогенізатор Вавзіс 2- (Сопвіапі Се! Оівгиріоп Зувіетве, І ом/ Магсп, Юамепігу, Могіпапів, ММ11450, с Опіеа Кіпддот) завантажували 5Омл початкової вірусно-клітинної суспензії на кожний запуск. Для визначення оптимальних умов гомогенізації було випробувано форсунки з діаметром в межах 0,18 до 0,40мм та тиск в межах 200 до 1000бар. Початкова суспензія оброблялася гомогенізацією високим тиском один, два або три рази. Гомогенізатор використовувався згідно інструкції виробника. Оцінка методу виконувалася моніторингом титру, як описано в прикладі 2. іФ) В підготовчих дослідженнях було з'ясовано, що діаметр форсунки більший за 04мм не дає жодного ко позитивного впливу на результати гомогенізації. При використанні форсунок з діаметрами 0,18мм, 0,25мм та 0,З5мм найкращі результати були одержані при обробці вірусно-клітинної суспензії одноразово тиском 800бар. За бо цих умов не спостерігалося значних відмінностей в умовах титру.
Спосіб згідно даного винаходу був порівняний із прямою проточною ультразвуковою обробкою відомою з рівня техніки. Результати підсумовано в Фіг. Порівняно із обробкою ультразвуком, спосіб згідно даного винаходу призводить до більшого титру вірусу та кращої гомогенності суспензії, що є більш придатним для подальшої обробки. 65 Приклад 2. Титрування модифікованого вірусу коров'ячої віспи АпКага (ММА)
Титрування модифікованого вірусу коров'ячої віспи АпКага (ММА) проводилося методом заснованим на ТСІЮО 5о з використанням 10-разового розведення в 9б-лункових планшетах. Кінцева точка тесту, інфіковані клітини візуалізовані з використанням антитіл до вірусу коров'ячої віспи та відповідним забарвлюючим розчином. 2-3-денні первинні клітини СЕЕ (курячі ембріобласти) були розведені до 1х10?клітин/мл в 795 ВЕРМІ. 10-кратні розведення виконані із 8-ма реплікатами на кожне розведення. Після розведення 100 цІ поміщали в кожну лунку 96-лункової планшети. Клітини інкубували на протязі ночі при 372С та 595 СО».
Розведення розчинів, що містили вірус були виконані в 10 стадій (107! до 10712 як призначено) з використанням
ЕРМІ без телячої сироватки. Потім, 100 І кожного вірусного зразка додавали в лунки із клітинами. 96-лункові планшети інкубували при 372С та 595 СО» на протязі 5 днів для того щоб дати реплікуватися вірусній інфекції.
Через 5 днів після інфікування клітини обробляти антитілами специфічними до вірусу коров'ячої віспи. Для визначення специфічних антитіл використовували пероксидазу хрону (НЕР) зв'язану із вторинними антитілами.
Антитіла специфічні до ММА є антитілами специфічними до вірусу коров'ячої віспи, кролячими політональними антитілами, фракція до (Оцапекн, Вегіп, Септапу 9503-2057). Вторинні антитіла є антитіла до кролячого (дО, поліклональні козячі зв'язані із НКР антитіла (Рготеда, Мапппеїт, Сегтапу, 72//4011). Кольорові реакції виконуються згідно відомих методик.
Кожна лунка із клітинами, котра є позитивною при кольоровій реакції, маркувалася як позитивна для обрахування ТСіІОко.
Титр обраховувався з використанням формули Зреагтап |1) та Каегрег |2). Оскільки всі параметри методу залишалися незмінними, то використовувалася спрощена формула:
Віруснийтитр (ТСІОво і ті|- - др аялвжта ють кто а а 8 а - коефіцієнт розведення останньої колонки, в котрій всі вісім лунок були позитивними Га
Ха - кількість позитивних лунок в колонці ахт1
Хь - кількість позитивних лунок в колонці а2 і9)
Хо - кількість позитивних лунок в колонці ажЗ
Claims (18)
1. Спосіб виділення поксвірусу з інфікованих клітин, що включає стадію гомогенізації інфікованих клітин че при високому тиску для одержання гомогенату, що містить поксвірус.
2. Спосіб за п.1, який відрізняється тим, що поксвірус вибрано з групи, яка включає огіпорохмігизев, - З5 амірохмігизев, зцірохмігизев та саргірохмігизев. че
З. Спосіб за будь-яким з пп.1, 2, який відрізняється тим, що поксвірус вибрано з групи, яка включає вірус коров'ячої віспи, вірус віспи кіз, вірус віспи овець, вірус віспи канарок та вірус віспи свійської птиці.
4. Спосіб за п.3, який відрізняється тим, що вірусом коров'ячої віспи є штам ЕІвігее або модифікований штам вірусу коров'ячої віспи Анкара (ММА), зокрема МУА-ВМ із депозитним номером ЕСАСС 00083008. «
5. Спосіб за будь-яким з пп.1-4, який відрізняється тим, що поксвірус є рекомбінантним поксвірусом. ш с
6. Спосіб за будь-яким з пп.1-5, який відрізняється тим, що гомогенізацію при високому тиску виконують шляхом введення інфікованих клітин в камеру високого тиску, збільшенням тиску в камері й виведенням )» інфікованих клітин через сопло.
7. Спосіб за п.б, який відрізняється тим, що тиск в камері збільшують до значення в інтервалі від 200 до 1000 бар. -І
8. Спосіб за будь-яким з пп.б, 7, який відрізняється тим, що сопло має діаметр в інтервалі від 0,10 до 0,6 мм.
9. Спосіб за будь-яким з пп.1-8, який відрізняється тим, що гомогенат, який містить поксвірус, піддають це. принаймні одній стадії очищення для одержання фракції, збагаченої на поксвірус. -І
10. Спосіб за п.9, який відрізняється тим, що принаймні одна із стадій очищення є стадія ультрафільтрації.
11. Спосіб за п.10, який відрізняється тим, що стадія ультрафільтрації є стадією поперечно-проточної о фільтрації. сл
12. Спосіб за п.11, який відрізняється тим, що на стадії поперечно-проточної фільтрації використовують мембрану, що має розмір пор більше 500 кДа, але дорівнює або менше 0,1 Ям ,
13. Спосіб за будь-яким з пп.10-12, який відрізняється тим, що за ультрафільтрацією має місце принаймні одна стадія колонкової хроматографії.
14. Спосіб за будь-яким з пп.1-13, який відрізняється тим, що гомогенат, який містить поксвірус, або іФ) фракцію, збагачену на поксвірус, піддають ліофілізації. ко
15. Фракція, збагачена на поксвірус, або гомогенат, який містить поксвірус, одержані способом згідно з будь-яким з пп.1-14. во
16. Фракція, збагачена на поксвірус, або гомогенат, який містить поксвірус згідно з п.15, як вакцина.
17. Використання фракції, збагаченої на поксвірус, або гомогенату, який містить поксвірус згідно з п.15, для виготовлення вакцини.
18. Спосіб вакцинації тварин, включаючи людей, за такої потреби, який включає введення в тіло тварини фракції, збагаченої на поксвірус, або гомогенату, який містить поксвірус згідно з п.15, або вакцини згідно з п.16. б5
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DKPA200101928 | 2001-12-20 | ||
| PCT/EP2002/014179 WO2003054175A1 (en) | 2001-12-20 | 2002-12-13 | Method for the recovery and purification of poxviruses from infected cells |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA77735C2 true UA77735C2 (en) | 2007-01-15 |
Family
ID=8160920
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UA20040705906A UA77735C2 (en) | 2001-12-20 | 2002-12-13 | Method for recovery of poxviruses from infected cells |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7056723B2 (uk) |
| EP (1) | EP1407006B9 (uk) |
| JP (2) | JP5322252B2 (uk) |
| KR (1) | KR100947976B1 (uk) |
| CN (1) | CN1289663C (uk) |
| AT (1) | ATE302268T1 (uk) |
| AU (1) | AU2002352247B2 (uk) |
| BR (1) | BRPI0215003B1 (uk) |
| CA (1) | CA2467099C (uk) |
| DE (1) | DE60205631T2 (uk) |
| DK (1) | DK1407006T3 (uk) |
| EA (1) | EA006485B1 (uk) |
| ES (1) | ES2247404T3 (uk) |
| HK (1) | HK1071765A1 (uk) |
| HU (1) | HU227507B1 (uk) |
| IL (2) | IL161526A0 (uk) |
| MX (1) | MXPA04006001A (uk) |
| NO (1) | NO335975B1 (uk) |
| NZ (1) | NZ533586A (uk) |
| PL (1) | PL205929B1 (uk) |
| SI (1) | SI1407006T1 (uk) |
| UA (1) | UA77735C2 (uk) |
| WO (1) | WO2003054175A1 (uk) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2560976C2 (ru) * | 2009-05-12 | 2015-08-20 | Трансген Са | Способ продуцирования и очистки ортопоксвируса |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EE05680B1 (et) * | 2000-11-23 | 2013-10-15 | Bavarian Nordic A/S | Muundatud vaktsiiniaviirus, selle valmistamine ja kasutamine, seda sisaldav farmatseutiline kompositsioon ning vaktsiin |
| US7445924B2 (en) | 2000-11-23 | 2008-11-04 | Bavarian Nordic A/S | Modified Vaccinia Ankara virus variant and cultivation method |
| EA009008B1 (ru) * | 2002-09-05 | 2007-10-26 | Бавариан Нордик А/С | Способ амплификации вируса оспы |
| EP1807508A4 (en) * | 2004-11-05 | 2008-03-12 | Us Gov Health & Human Serv | METHODS FOR PREPARING CELLS AND VIRUSES |
| US7625570B1 (en) * | 2005-03-10 | 2009-12-01 | The Regents Of The University Of California | Methods for purifying adeno-associated virus |
| JP2010526546A (ja) * | 2007-05-14 | 2010-08-05 | バヴァリアン・ノルディック・アクティーゼルスカブ | ワクシニアウイルス系及び組換えワクシニアウイルス系ワクチンの精製 |
| US8003363B2 (en) | 2007-05-14 | 2011-08-23 | Bavarian Nordic A/S | Purification of vaccinia virus- and recombinant vaccinia virus-based vaccines |
| BRPI0908474A2 (pt) * | 2008-02-12 | 2016-07-26 | Sanofi Pasteur Ltd | métodos de uso de cromatografia de troca de íon e de filtração de gel para purificação de vírus causador da catapora |
| FR2953686B1 (fr) * | 2009-12-14 | 2012-11-02 | Agronomique Inst Nat Rech | Procede pour reduire la teneur bacterienne d'un milieu alimentaire et/ou biologique d'interet, contenant des gouttelettes lipidiques |
| AU2011281982B2 (en) | 2010-07-20 | 2015-12-17 | Bavarian Nordic A/S | Method for harvesting expression products |
| CN102353792A (zh) * | 2011-07-07 | 2012-02-15 | 贵州大学 | 一种基于gpv p32蛋白的间接elisa试剂盒及制备方法 |
| FR3042121A1 (fr) | 2015-10-08 | 2017-04-14 | Jean-Marc Limacher | Composition anti-tumorale |
| JP2020519666A (ja) | 2017-05-15 | 2020-07-02 | ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェーＪａｎｓｓｅｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ＆ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ Ｂ．Ｖ． | 安定性のウイルス含有組成物 |
| EP3624845A1 (en) | 2017-05-15 | 2020-03-25 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Stable virus-containing composition |
| US20210187100A1 (en) | 2018-09-06 | 2021-06-24 | Bavarian Nordic A/S | Storage Improved Poxvirus Compositions |
| CN115243717A (zh) | 2020-03-12 | 2022-10-25 | 巴法里安诺迪克有限公司 | 改善痘病毒稳定性的组合物 |
| WO2024003238A1 (en) | 2022-06-29 | 2024-01-04 | Bavarian Nordic A/S | Epstein-barr-virus vaccine |
| WO2024003239A1 (en) | 2022-06-29 | 2024-01-04 | Bavarian Nordic A/S | RECOMBINANT MODIFIED saRNA (VRP) AND VACCINIA VIRUS ANKARA (MVA) PRIME-BOOST REGIMEN |
| CN115197966A (zh) * | 2022-08-15 | 2022-10-18 | 深圳源兴基因技术有限公司 | 一种利用生物反应器大规模生产重组痘苗病毒载体的方法 |
Family Cites Families (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB877898A (en) | 1956-12-06 | 1961-09-20 | Apv Co Ltd | A new or improved method of liberating enzymes |
| JPS5328989B2 (uk) | 1974-05-27 | 1978-08-17 | ||
| CH621573A5 (en) | 1976-08-05 | 1981-02-13 | Vnii Biosinteza Belkovykh Vesc | Process for the continuous disintegration of microorganism cells and system for carrying out this process |
| JPS54154594A (en) | 1978-05-25 | 1979-12-05 | Sumitomo Chem Co Ltd | Extraction of glucose isomerase |
| WO1991001367A1 (en) | 1989-07-20 | 1991-02-07 | Bioeng, Inc. | Supercritical fluid disruption of and extraction from microbial cells |
| UA68327C2 (en) * | 1995-07-04 | 2004-08-16 | Gsf Forschungszentrum Fur Unwe | A recombinant mva virus, an isolated eukaryotic cell, infected with recombinant mva virus, a method for production in vitro of polypeptides with use of said cell, a method for production in vitro of virus parts (variants), vaccine containing the recombinant mva virus, a method for immunization of animals |
| TW426733B (en) | 1995-10-06 | 2001-03-21 | Merck & Co Inc | Method of disrupting cultured cells using an impinging jet device |
| EP0951555A2 (en) | 1996-09-24 | 1999-10-27 | Bavarian Nordic Research Institute A/S | Recombinant mva virus expressing dengue virus antigens, and the use thereof in vaccines |
| US5721120A (en) | 1996-10-02 | 1998-02-24 | Merck & Co., Inc. | Method of disrupting cultured cells using an impinging jet device |
| NZ299720A (en) * | 1996-11-08 | 1999-07-29 | Howick Engineering Ltd | Epicyclic input/output annuli of same pcd, with planetary input/output gear sets, and with only one set having aligned teeth |
| ATE348155T1 (de) * | 1996-11-20 | 2007-01-15 | Introgen Therapeutics Inc | Ein verbessertes verfahren zur produktion und reinigung von adenoviralen vektoren |
| US6000551A (en) | 1996-12-20 | 1999-12-14 | Eastman Chemical Company | Method for rupturing microalgae cells |
| FR2787465A1 (fr) * | 1998-12-21 | 2000-06-23 | Transgene Sa | Procede d'inactivation des virus enveloppes dans une preparation virale de virus non enveloppes |
| DE60029195T2 (de) * | 1999-02-22 | 2007-06-28 | Transgene S.A. | Verfahren zur Gewinnung von purifizierter Virenzusammensetzung |
| DE19918619A1 (de) | 1999-04-23 | 2000-10-26 | Rhein Biotech Proz & Prod Gmbh | Verfahren zum Gewinnen von rekombinantem HBsAg |
| US6951752B2 (en) * | 2001-12-10 | 2005-10-04 | Bexter Healthcare S.A. | Method for large scale production of virus antigen |
-
2002
- 2002-12-13 UA UA20040705906A patent/UA77735C2/uk unknown
- 2002-12-13 AU AU2002352247A patent/AU2002352247B2/en not_active Ceased
- 2002-12-13 MX MXPA04006001A patent/MXPA04006001A/es active IP Right Grant
- 2002-12-13 SI SI200230220T patent/SI1407006T1/sl unknown
- 2002-12-13 DK DK02787945T patent/DK1407006T3/da active
- 2002-12-13 ES ES02787945T patent/ES2247404T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-12-13 EP EP02787945A patent/EP1407006B9/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-12-13 AT AT02787945T patent/ATE302268T1/de active
- 2002-12-13 EA EA200400833A patent/EA006485B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2002-12-13 CN CNB028255267A patent/CN1289663C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2002-12-13 US US10/495,151 patent/US7056723B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-12-13 JP JP2003554879A patent/JP5322252B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2002-12-13 WO PCT/EP2002/014179 patent/WO2003054175A1/en active IP Right Grant
- 2002-12-13 KR KR1020047009777A patent/KR100947976B1/ko active IP Right Grant
- 2002-12-13 BR BRPI0215003A patent/BRPI0215003B1/pt not_active IP Right Cessation
- 2002-12-13 CA CA2467099A patent/CA2467099C/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-12-13 DE DE60205631T patent/DE60205631T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-12-13 IL IL16152602A patent/IL161526A0/xx unknown
- 2002-12-13 NZ NZ533586A patent/NZ533586A/en not_active IP Right Cessation
- 2002-12-13 HU HU0402337A patent/HU227507B1/hu not_active IP Right Cessation
- 2002-12-13 PL PL369498A patent/PL205929B1/pl unknown
-
2004
- 2004-04-20 IL IL161526A patent/IL161526A/en not_active IP Right Cessation
- 2004-07-19 NO NO20043181A patent/NO335975B1/no not_active IP Right Cessation
-
2005
- 2005-05-26 HK HK05104416A patent/HK1071765A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2009
- 2009-11-19 JP JP2009263687A patent/JP2010046093A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2560976C2 (ru) * | 2009-05-12 | 2015-08-20 | Трансген Са | Способ продуцирования и очистки ортопоксвируса |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| UA77735C2 (en) | Method for recovery of poxviruses from infected cells | |
| US8236560B2 (en) | Modified Vaccinia Ankara virus variant and cultivation method | |
| CN110093324A (zh) | 基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒及其作为疫苗的应用 | |
| JP3826055B2 (ja) | 組換えアビポックスウイルスによる免疫方法 | |
| AU640460B2 (en) | Recombinant poxvirus internal cores | |
| EA020230B1 (ru) | Рекомбинантный модифицированный вирус осповакцины анкара (mva), экспрессирующий гомологичные последовательности, встроенные в поксвирусный геном, и его применение | |
| JP3411307B2 (ja) | 組み換えアビポックスウイルス、該ウイルスを感染させた細胞の培養及び該ウイルスから誘導されるワクチン | |
| JP2005512565A5 (uk) | ||
| UA123682C2 (uk) | Вірус качиного ентериту та його застосування | |
| CN104812894B (zh) | 新型mva病毒及其用途 | |
| US8623381B2 (en) | Viral strains derived from the vaccinia virus Lister VACV-107 and uses thereof | |
| RU2697151C2 (ru) | Рекомбинантный нокаутный мутант вируса нодулярного дерматита и его применение | |
| JP2024500174A (ja) | 増加した免疫原性を有する改変パラポックスウイルス | |
| RU2621868C1 (ru) | Рекомбинантный штамм VACΔ6 вируса осповакцины с нарушенными генами вирулентности C3L, N1L, J2R, A35R, A56R, B8R для получения живой культуральной аттенуированной вакцины против натуральной оспы и других ортопоксвирусных инфекций человека | |
| US20040170646A1 (en) | Production of ALVAC on avian embryonic stem cells | |
| US20110052626A1 (en) | Leporipoxvirus-derived vaccine vectors |