UA123682C2 - Вірус качиного ентериту та його застосування - Google Patents
Вірус качиного ентериту та його застосування Download PDFInfo
- Publication number
- UA123682C2 UA123682C2 UAA201900802A UAA201900802A UA123682C2 UA 123682 C2 UA123682 C2 UA 123682C2 UA A201900802 A UAA201900802 A UA A201900802A UA A201900802 A UAA201900802 A UA A201900802A UA 123682 C2 UA123682 C2 UA 123682C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- gene
- oem
- deletion
- nucleic acid
- virus
- Prior art date
Links
- 241001492342 Anatid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 title claims description 17
- 241000271566 Aves Species 0.000 claims abstract description 88
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims abstract description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 294
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 91
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 77
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 75
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 75
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 60
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 60
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 48
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 46
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 41
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims description 40
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 claims description 40
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 33
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 30
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 30
- 108091029795 Intergenic region Proteins 0.000 claims description 29
- 230000012447 hatching Effects 0.000 claims description 26
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 23
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 claims description 23
- 230000036039 immunity Effects 0.000 claims description 17
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 17
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 17
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 16
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 16
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 16
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 claims description 13
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 11
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 11
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 10
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 8
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 8
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims description 8
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 8
- 101150029857 23 gene Proteins 0.000 claims description 7
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 7
- 101710140929 MP2 protein Proteins 0.000 claims description 7
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 7
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 7
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 7
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 claims description 6
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 claims description 6
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 claims description 6
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 claims description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 6
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 claims description 6
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 6
- 208000004232 Enteritis Diseases 0.000 claims description 5
- 108010011222 cyclo(Arg-Pro) Proteins 0.000 claims description 4
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 claims description 4
- 101150008989 55 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 241000711404 Avian avulavirus 1 Species 0.000 claims description 3
- 101710204837 Envelope small membrane protein Proteins 0.000 claims description 3
- 101710145006 Lysis protein Proteins 0.000 claims description 3
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 claims description 3
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 claims description 3
- 241000272525 Anas platyrhynchos Species 0.000 claims description 2
- 206010006811 Bursitis Diseases 0.000 claims description 2
- 241000701063 Gallid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 claims description 2
- 101150034144 ci gene Proteins 0.000 claims 3
- 241000219112 Cucumis Species 0.000 claims 1
- 235000015510 Cucumis melo subsp melo Nutrition 0.000 claims 1
- 241001659863 Panna Species 0.000 claims 1
- 241001377010 Pila Species 0.000 claims 1
- FJJCIZWZNKZHII-UHFFFAOYSA-N [4,6-bis(cyanoamino)-1,3,5-triazin-2-yl]cyanamide Chemical compound N#CNC1=NC(NC#N)=NC(NC#N)=N1 FJJCIZWZNKZHII-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 206010009887 colitis Diseases 0.000 claims 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 claims 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 abstract description 15
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 57
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 52
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 52
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 32
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 28
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 26
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 25
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 21
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 18
- 239000000047 product Substances 0.000 description 16
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 16
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 15
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 15
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 13
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 13
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 12
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 11
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 11
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 11
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 10
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 9
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 9
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 9
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 9
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 230000034994 death Effects 0.000 description 7
- 238000013461 design Methods 0.000 description 7
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 7
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 7
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 7
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 7
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 7
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 6
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 6
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 6
- 241000272517 Anseriformes Species 0.000 description 5
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 5
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 5
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- 101150033839 4 gene Proteins 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 230000002354 daily effect Effects 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 239000013212 metal-organic material Substances 0.000 description 4
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 4
- 241001260012 Bursa Species 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 230000010415 tropism Effects 0.000 description 3
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000666896 Homo sapiens V-type immunoglobulin domain-containing suppressor of T-cell activation Proteins 0.000 description 2
- 108700001237 Nucleic Acid-Based Vaccines Proteins 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 102100038282 V-type immunoglobulin domain-containing suppressor of T-cell activation Human genes 0.000 description 2
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000003889 eye drop Substances 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 2
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 2
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 2
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- 125000003821 2-(trimethylsilyl)ethoxymethyl group Chemical group [H]C([H])([H])[Si](C([H])([H])[H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])C(OC([H])([H])[*])([H])[H] 0.000 description 1
- 101150043982 44 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150049308 54 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 101001053395 Arabidopsis thaliana Acid beta-fructofuranosidase 4, vacuolar Proteins 0.000 description 1
- GZYDPEJSZYZWEF-MXAVVETBSA-N Asp-Val-Val-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O GZYDPEJSZYZWEF-MXAVVETBSA-N 0.000 description 1
- 241000182988 Assa Species 0.000 description 1
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 description 1
- 241001519465 Avian metapneumovirus Species 0.000 description 1
- 241000700663 Avipoxvirus Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 1
- 241000700662 Fowlpox virus Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 241000701047 Gallid alphaherpesvirus 2 Species 0.000 description 1
- 101000834253 Gallus gallus Actin, cytoplasmic 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- 241000711450 Infectious bronchitis virus Species 0.000 description 1
- 208000002979 Influenza in Birds Diseases 0.000 description 1
- 241001430197 Mollicutes Species 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 108020004485 Nonsense Codon Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 102100034574 P protein Human genes 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 241000286209 Phasianidae Species 0.000 description 1
- 108010015724 Prephenate Dehydratase Proteins 0.000 description 1
- 241000287530 Psittaciformes Species 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 230000009418 agronomic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 description 1
- 241000701792 avian adenovirus Species 0.000 description 1
- 206010064097 avian influenza Diseases 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 208000011090 bird disease Diseases 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000003837 chick embryo Anatomy 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 101150048120 coa5 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000002845 discoloration Methods 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 210000000416 exudates and transudate Anatomy 0.000 description 1
- 229940012356 eye drops Drugs 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 101150010778 griI gene Proteins 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 231100000225 lethality Toxicity 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- IZXGZAJMDLJLMF-UHFFFAOYSA-N methylaminomethanol Chemical compound CNCO IZXGZAJMDLJLMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940031348 multivalent vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000006072 paste Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000000988 reflection electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004626 scanning electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 1
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/465—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from birds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
- C12N15/869—Herpesviral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5258—Virus-like particles
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
- A61K2039/552—Veterinary vaccine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16311—Mardivirus, e.g. Gallid herpesvirus 2, Marek-like viruses, turkey HV
- C12N2710/16334—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16311—Mardivirus, e.g. Gallid herpesvirus 2, Marek-like viruses, turkey HV
- C12N2710/16341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/16343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16311—Mardivirus, e.g. Gallid herpesvirus 2, Marek-like viruses, turkey HV
- C12N2710/16361—Methods of inactivation or attenuation
- C12N2710/16362—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
- C12N2720/00011—Details
- C12N2720/10011—Birnaviridae
- C12N2720/10034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Oncology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Винахід стосується вірусу качиного ентериту (DEV) і його застосування для вакцинації для вакцинації або імунізації домашньої птиці проти пташиних патогенів. 2
Description
(57) Реферат:
Винахід стосується вірусу качиного ентериту (ОЕМ) і його застосування для вакцинації для вакцинації або імунізації домашньої птиці проти пташиних патогенів.
Даний винахід стосується нових вірусів і їх застосування. Більш конкретно, винахід стосується нових конструкцій вірусу качиного ентериту і їх застосування для експресії або доставки поліпептидів, які представляють інтерес, тваринам, особливо домашнім птахам.
Винахід особливо підходить для вакцинації домашньої птиці проти патогенів птахів.
Рівень техніки
М'ясо та яйця птиці є важливими джерелами їжі, споживання яких постійно зростає через зростання чисельності населення і високого співвідношення ціни і якості. Недавня епідемія пташиного грипу звернула громадську думку на здоров'я птахів, а також на безпеку і збереження харчових продуктів, а технологія вакцинації птахів стала загальносвітовою проблемою.
Як вакцини для домашньої птиці проти цільових патогенів зазвичай застосовуються рекомбінантні віруси, які експресують білки патогенів. Вакцини, які містять такі віруси, викликають експресію чужорідних білків патогена або їх фрагментів в інфікованих клітинах, які згодом можуть індукувати специфічний і захисний гуморальний імунітет, а також клітинний імунітет.
У зв'язку з цим був розроблений цілий ряд вірусів, у які був вбудований чужорідний ген з патогена, для застосування в якості вакцин на основі вірусних векторів. Ці вірусні вектори (або рекомбінантні віруси) зазвичай грунтуються на авіпоксвірусах типу вірусу віспи птахів (ЕР-А- 0,517,292), герпесвірусах, зокрема НМТ (наприклад, УУО-А-87/04463, 5,980,906, 5,853,733), вірусі хвороби Н'юкасл (МОМ ) або пташиних аденовірусах. Ці рекомбінантні віруси птахів виявляють різні рівні захисту в залежності від захворювання та/або тварини.
Наприклад, оскільки поксвірусів, МОМ і аденовіруси не персистують у курей, вони вважаються не найкращими кандидатами для тривалого імунітету у курей. Рекомбінантні НМТ, які експресують антигени, проявляли переваги і в даний час комерційно доступні для вакцинації курей (наприклад, Месіогтипе? ІВО, Месіотптпипе? МО або Месіогтипе? І Т).
Однак, з огляду на дедалі зростаючу кількість і різноманітність патогенів та безперервне зростання споживання домашньої птиці, існує потреба в альтернативних стратегіях і/або системах вакцинації, які можна використовувати для вироблення ефективного захисного імунітету у домашніх птахів. Зокрема, існує потреба в ефективних системах для забезпечення
Зо імунітету у дуже молодих тварин (З дні або менше) або іп омо.
У зв'язку з цим вивчалися нові серотипи вірусів з метою пошуку альтернативних сумісних вірусних векторів для поліпшення вакцинації тварин, особливо свійських птахів, що забезпечують стабільну експресію білка і ефективний захист.
УМО 2014/0036735 обговорюється можливе застосування вірусу качиного ентериту у курей.
У природі ОЕМ інфікує качок або гусей, але не має ніякого відомого тропізму для курей. У цьому документі передбачається, що конструкції з ОЕМ можна вводити внутрішньом'язово 1-тижневим курчатам. Однак в цьому документі повідомляється тільки про пізнє введення.
Проте, при проведенні подальших експериментів з ОЕМ автори винаходу виявили, що такий вірус летальний при введенні молодим курчатам (3 дні або менше) або іп омо. Несподівано, хоча введення курчатам ОЕМ дикого типу (або конструкції ОЕМ, що містить всі нативні гени, як запропоновано в УМО 2014/0036735) через 1 тиждень після вилуплення начебто добре переноситься, однак введення такої конструкції в 1-й день після вилуплення або іп омо викликає масову загибель тварин (тобто від 80 до 10095). Ще більш несподівано автори винаходу змогли модифікувати структуру ОЕМ і отримати такі конструкції ОЕМ, які можуть використовуватися у домашніх птахів, в тому числі на дуже ранній стадії (З дні або менше) або іп омо, причому вони можуть викликати істотну експресію білка іп мімо на ранній стадії. Отже, такі віруси є новими потужними векторами для вакцинації домашньої птиці.
Сутність винаходу
Винаходом передбачені нові вірусні конструкції, придатні для експресії генів або білків іп мімо у тварин, особливо у домашньої птиці, в тому числі на дуже ранній стадії (тобто на 3-й день після вилуплення або раніше, а також іп омо). Зокрема, винаходом передбачені нові ОЕМ, отримані шляхом інактивації генів 054 і О55, і показано, що такі ОЕМ (ї) піддаються атенуації іп мімо, особливо у курей, і (ії) є стабільними і здатні експресувати чужорідні гени відповідним чином для формування захисного імунітету. Крім того, ці дефектні і атенуйовані ОЕМ зберігають високу швидкість росту, що дозволяє їх отримувати з високим титром. Оскільки такі ОЕМ не володіють ніяким відомим природним тропізмом, наприклад, для курей, то застосування таких конструкцій ОЕМ для вакцинації курчат не пов'язане з ризиком поширення або зараження невакцинованих тварин. Крім того, у курей не виробляються материнські антитіла або імунітет проти ОЕМ, і віруси винаходу можуть застосовуватися для вироблення дуже раннього імунітету бо у вакцинованих тварин. Несподівано, як уже сказано раніше, хоча ОЕМ дикого типу летальний для молодих курчат або іп омо, однак віруси ОЕМ за винаходом безпечні і можуть ефективно експресувати гени, які представляють інтерес, іп мімо. Отже, такі нові ОЕМ є дуже потужними векторами для вакцинації тварин, особливо свійських птахів, і для вироблення раннього захисного імунітету.
Більш конкретно, предметом винаходу є такий вірус качиного ентериту (ОЕМ), який містить неактивні гени 054 і 055. Так, винахід показав, що при інактивації цих генів можуть бути отримані життєздатні, стабільні і реплікативні ОЕМ, причому такі віруси можуть застосовуватися для отримання рекомбінантних ОЕМ шляхом введення чужорідного генетичного матеріалу.
Результати також показують, що такий чужорідний генетичний матеріал експресується на високому рівні у таких вірусів при інфікуванні клітин, причому така експресія залишається стабільною в часі. Більше того і неочікувано, хоча нативні ОЕМ, а також багато інших конструкції
РЕМ з делеціями, отримані авторами винаходу, виявилися патогенними або летальними для молодих курчат (на 3-й день після вилуплення або раніше) і іп омо, однак при інактивації О54 і 055 виникають атенуйовані віруси, які можна безпечно використовувати для експресії білків і антигенів у молодих тварин, в тому числі іп омо. Такий результат був цілком несподіваним і дає даним вірусам великі переваги і застосовність.
Іншим предметом винаходу є такий вірус качиного ентериту (ОЕМ), який має неактивні гени 054 і Ш55 і містить чужорідну нуклеїнову кислоту.
Відповідно до конкретних втілень, гени Ш54 і 055 піддавалися мутації або делеції або перериванню; і/або замість всіх або частини послідовностей генів 054 і 0055 розташовується чужорідна нуклеїнова кислота, причому чужорідна нуклеїнова кислота кодує пташиний патоген.
В іншому конкретному втіленні ОЕМ за винаходом додатково містить неактивний ген ЦІ 4,
ОІ23 або 057.
Наступним предметом винаходу є молекули нуклеїнової кислоти, які містять геном ОЕМ з неактивними генами БА і 055.
Винахід також стосується клітин господаря, які містять ОЕМ або нуклеїнову кислоту, як визначено вище.
Винаходом також передбачений спосіб отримання або реплікації ОЕМ, як визначено вище, що включає інфікування компетентних клітин молекулою нуклеїнової кислоти або самим ОЕМ, як визначено вище, і видалення ОЕМ.
Винахід також стосується способу отримання рекомбінантного ОЕМ, який включає вставку чужорідної нуклеїнової кислоти замість всіх або щонайменше 2095 послідовностей генів 054 і 55.
Винаходом також передбачені композиції, які містять ОЕМ, нуклеїнову кислоту або клітини господаря, як визначено вище, фармацевтично або ветеринарно прийнятний ексципієнт або носій і, необов'язково, ад'ювант.
Винаходом також передбачені вакцини, які містять ОЕМ, нуклеїнову кислоту або клітини господаря, як визначено вище, фармацевтично або ветеринарно прийнятний ексципієнт або носій і, необов'язково, ад'ювант.
Наступним предметом винаходу є композиції, ОЕМ, нуклеїнові кислоти або клітини господаря, як визначено вище, для застосування для вакцинації або імунізації птахів, особливо домашніх птахів, більш конкретно курей, більш конкретно молодих птахів (на 3-й день після вилуплення або раніше або іп омо).
Наступним предметом винаходу є композиції, ОЕМ, нуклеїнові кислоти або клітини господаря, як визначено вище, для застосування для формування захисного імунітету у птахів, особливо домашніх птахів, більш конкретно курей, більш конкретно молодих птахів (на 3-й день після вилуплення або раніше або іп омо).
Винахід також стосується способу вакцинації тварин, особливо домашніх птахів, більш конкретно курей, більш конкретно молодих птахів (на 3-й день після вилуплення або раніше або іп омо), що включає введення даним тваринам композиції або вірусу, як визначено вище.
Кращим предметом винаходу є спосіб вакцинації домашніх птахів, який включає введення іп омо композиції або вірусу, як визначено вище.
Іншим переважним предметом винаходу є спосіб вакцинації домашніх птахів, який включає введення композиції або вірусу, як визначено вище, в день 1 (тобто приблизно в межах 24 годин) після вилуплення.
У наступному аспекті винаходом передбачений спосіб вироблення імуногенної або захисної відповіді у тварин проти одного або декількох патогенів птахів, що включає введення даним тваринам, особливо домашнім птахам, більш конкретно курям, більш конкретно молодим птахам (на 3-й день після вилуплення або раніше або іп омо) композиції, вакцини або вірусу, як (516) визначено вище.
Віруси або композиції винаходу можна вводити будь-яким способом. Переважно їх вводять іп омо або підшкірно (наприклад, п/ш) через 1 або 2 дні після вилуплення, щоб імунітет вироблявся дуже рано.
Крім того, винаходом передбачені вакцинаційні набори для імунізації птахів, які включають такі компоненти: а) ефективна кількість композиції, як зазначено вище, і р) засіб для введення даної композиції даним птахам.
Винахід може застосовуватися для експресії поліпептидів у будь-яких тварин, переважно для вакцинації птахів, причому він підходить для експресії одного або декількох поліпептидів або пептидів, особливо імуногенних пептидів з патогенів птахів.
Короткий опис фігур
На Фіг. 1 представлена схематична діаграма генома вірусу качиного ентериту (ОЕМ) і розташування генів 05.
На Фіг. 2 представлені схематичні діаграми розташування сайту вставки в вихідному геномі
ОЕМ і структури геномів рОС18-КАРЕМАС-О54055деІ-ВасмР2 і рЕМ/54И55де|/ВасмР2.
Показано розташування з'єднувальної ділянки (стику) 1, стику 2 і стику 3, які використовуються для ампліфікації при реакціях ПЛР.
На Фіг. З представлена експресія МР2 в клітинах СЕК, інфікованих ОЕМ/О54055ае!/Васмга2, при аналізі методом чорних бляшок.
На Фіг. 4 представлені схематичні діаграми розташування сайту вставки в вихідному геномі
ОЕМ ії структури геномів риС18-КАРЕМАС-О54ИО55деІ і ОЕМ/ЛЗ4И055деї. Показано розташування стику 1, використовуваного для ампліфікації при реакціях ПЛР.
На Фіг. 5 представлені схематичні діаграми розташування сайту вставки в вихідному геномі
РЕМ ї структури геномів рОС18-КАРЕМАС-ШІ 23деІ-Соаб5МР2 і ОЕМ/ОЗ4ОО5Б5аейІ 23/СоабУ РО.
Показано розташування стику 1, стику 2 і стику 3, які використовуються для ампліфікації при реакціях ПЛР.
На Фіг. 6 представлені схематичні діаграми розташування сайту вставки в вихідному геномі
РЕМ їі структури геномів рОС18-КАРЕМАС-0О! 26-Соа5МР2 і СЕМ/ЛЗ4О5Б5ЯЙейІІ 26/Соаб5МРа2.
Показано розташування стику 1, стику 2 і стику 3, які використовуються для ампліфікації при
Зо реакціях ПЛР.
На Фіг. 7 представлені схематичні діаграми розташування сайту вставки в вихідному геномі
РЕМ їі структури геномів рОС18-КАРЕМАС-ОІ 45-Соаб5МР2 і СЕМ/ЛОЗ4ИОО55децйі 45/Соаб5МУРа2.
Показано розташування стику 1, стику 2 і стику 3, які використовуються для ампліфікації при реакціях ПЛР.
На Фіг. 8 представлені схематичні діаграми розташування сайту вставки в вихідному геномі
РЕМ ї структури геномів рОС18-КАРЕМАС-ОЇ 50-Соа5МР2 і СЕМ/ЛОЗ4И55аДемцШІ 50/СоабМРа2.
Показано розташування стику 1, стику 2 і стику 3, які використовуються для ампліфікації при реакціях ПЛР.
На Фі,0 9 представлена експресія МР2 в клітинах СЕР, інфікованих
РЕМ/ОЗ4О55аеиЦІ 23/Соаб М Р, РЕМ/ЛІОЗ4О55аеиЦІ 26/СоабМУ Р2, рЕМ/В4И55дей ШІ 45/Соа5МР2 або РЕМ/ЛІ54И55дейШІ 50/Соаб5МР2, при аналізі методом чорних бляшок.
На Фіг. 10 представлений аналіз методом вестерн-блот експресії білка МР2 вірусом
РЕМ/ОЗ4О55аецицІ 23/Соаб У Р, РЕМ/ЛІЗ4О55аєиШІ 26/Соаб МР, рЕМЛЗ4И55ає!иШІ 45/
Соаб5МР2 або бЕМ/І54И55дейШІ|50/Соаб5МР2. 1 - ОЕМ/Л54О55деи123/Соаб5МР2 2 -
РЕМ/О54О55адеЦ1 26/СоабМР2; З - ОЕМ/О54О55йе/0145/СоабМР2; 4 - ОЕМ/ЛО54О55ае1/
МОГ 50/СоаБ5М Р2; 5 - вихідний ОЕМ; 6 - СЕРН.
Розкриття суті винаходу
Даний винахід в цілому стосується атенуйованих вірусів ОЕМ, які містять послідовності чужорідних генів. Цей винахід також стосується композицій, які містять такі ОЕМ, а також їх застосування для вакцинації тварин, особливо домашніх птахів, більш конкретно молодих птахів (на 3-й день після вилуплення або раніше або іп омо).
Даний опис стане більш зрозумілим з урахуванням наступних визначень.
Визначення
Термін "вірус" означає, зокрема, вірусні частинки, які містять молекулу нуклеїнової кислоти (наприклад, геном), інкапсульовану в капсиді або капсулі. Термін "вірус" також означає вірусний вектор або виділений вірусний геном.
Термін "рекомбінантний" означає молекули, які були створені, розроблені або модифіковані з використанням генетичних технологій. Відносно вірусів термін "рекомбінантний" більш бо конкретно позначає віруси, у яких геном (або геном предка) був модифікований шляхом вставки або делеції щонайменше однієї послідовності нуклеїнової кислоти.
Термін "чужорідна нуклеїнова кислота" по відношенню до вірусів означає нуклеїнові кислоти, які в природі не зустрічаються в геномі вірусу або ж зустрічаються в природі в даному геномі, але в іншій формі або в іншому положенні.
У цьому описі термін "нуклеїнова кислота" або "нуклеїнові кислоти" означає будь-які молекули або послідовності нуклеїнових кислот типу дезоксирибонуклеотидів (ДНК) або рибонуклеотидів (РНК), які можуть бути, наприклад, одноланцюговими або дволанцюговими.
Нуклеїнові кислоти можуть містити ОКЕ або ні. Молекули нуклеїнової кислоти можуть бути отримані методами, відомими рег 5е в даній області, як--о методами штучного синтезу, рекомбінантними методами, ензиматичними методами, реплікації в клітинах господаря або їх комбінаціями. "Ген" означає молекулу або послідовність нуклеїнової кислоти, яка містить відкриту рамку зчитування, що кодує продукт типу поліпептиду (наприклад, пептид, білок і т.д.) або РНК.
У контексті винаходу ОЕМ, який містить "неактивний" ген, означає такий ОЕМ, який не може експресувати функціональний білок або РНК, кодованих даним геном. Так, неактивний ген 054 означає ген 54 з мутацією, делецією і/або перериванням, який не може кодувати білок 054 дикого типу. Неактивний ген 055 означає ген 55 з мутацією, делецією і/або перериванням, який не може кодувати білок 055 дикого типу. Якщо ген Ш55 містить послідовність, яка кодує 555 і 3'О55, то неактивний 055 означає ген 055 з мутацією, делецією і/або перериванням, який не може кодувати будь-який білок дикого типу, який кодується зазначеними послідовностями 5'Ш55 і 3'О55 , наприклад, 555 і 3'О55 обидва містять мутацію, делецію або переривання (розрив).
Термін "атенуйований" в цьому винаході означає такий вірус, який практично не викликає захворювання на моделі у тварин. Атенуйований вірус зазвичай може реплікуватися у господаря, не викликаючи його загибелі. Більш конкретно, атенуйований вірус означає такий вірус, який не є вірулентним у ембріонів при ін'єкції в дозі 1х103 бляшкоутворюючих одиниць (рі) на яйце. Найбільш бажані атенуйовані віруси безпечні в дозі 1х103 рі на 1 яйце щонайменше у 7095 ін'єктованих яєць, більш переважно щонайменше у 8095 ін'єктованих яєць, ще більш переважно щонайменше у 9095, 9595 9795, 9895, 9995 або більше. Атенуйовані віруси за винаходом також безпечні для введення після вилуплення, в тому числі в день 0 (тобто між 0,1 ї 48 годинами після вилуплення).
Термін "пташиний" повинен охоплювати всі види птахів типу птахів з класу Аме5, тобто хребетних тварин, які є пернатими, крилатими, двоногими, ендотермічними і яйцекладними. У контексті винаходу птахи або види птахів, зокрема, означають птахів, які представляють економічний і/або агрономічний інтерес типу домашніх птахів, більш переважно курей і індиків; або декоративних птахів типу лебедів і папуг.
Термін "вакцина" в цьому винаході означає засоби, які можуть застосовуватися для вироблення, стимуляції або посилення імунної відповіді у організму. "Імунна відповідь" означає розвиток у господаря клітинної та/або антитільної імунної реакції на певну композицію або вакцину. Зазвичай "імунна відповідь" включає вироблення антитіл, В- клітин, хелперних Т-клітин і/або цитотоксичних Т-клітин, спрямованих конкретно на антиген або антигени, включені в дану композицію або вакцину. Переважно імунна відповідь є захисною, тобто повинна підвищуватися стійкість до нової інфекції та/або зменшуватися клінічна тяжкість захворювання.
Термін введення або ін'єкція "іп омо" зазвичай означає інокуляцію або ін'єкцію в ембріон, який міститься в яйці. Введення іп омо переважно проводять в будь-який час між 5-м і 1-м днем до вилуплення.
Вірус качиного ентериту
Вірус качиного ентериту (ОЕМ), також відомий як вірус качиного вірусного ентериту (ОМЕМ), в природі інфікує качок і гусей. Повна нуклеотидна послідовність ОЕМ вже встановлена і доступна онлайн (наприклад, див. 90673560). Вірусний геном містить приблизно 162 т.н., які кодують близько 80 різних білків. Було виділено кілька серотипів і штамів ОЕМ, як-то штам
Уапзеп, штам С5С, штам СНм, штам МАС і штам 2085. Повні послідовності декількох штамів
РЕМ доступні в СепрапК, як-то штаму МАС - ІЮ ЕОО82088.2; ізоляту Апайй С-КСЕ - ІО
КЕе263690.1; штаму Апайа СНм - ІЮ 90647509.1; штаму Апайа 2085 - ІЮ дУРг999965; штаму Апаїіа
СМ - ІО КОб549663.1 або штаму Апайа СС - ІЮ 20673560.1.
ОЕМ залишається погано вивченим, а його застосування в якості вектора для експресії генів не піддавалося глибокому вивченню. Наприклад, І ім еї аї. (2013) ї УМО 2014/0036735 намагалися використовувати рекомбінантний МЕМ для експресії генів у курей. Вони використовували бо конструкцію ОЕМ, в якій нуклеїнова кислота була клонована між генами 057 і 058 вірусного генома без зміни експресії нативних генів. Хоча і повідомлялося, що така конструкція може передаватися при внутрішньом'язовій ін'єкції 1-тижневим курчатам, проте в цьому документі або в будь-якому іншому документі попереднього рівня техніки не розкрите якесь можливе застосування ОЕМ для вакцинації іп омо домашніх птахів або для вакцинації молодих птахів, т.б. в день З після вилуплення або раніше, особливо в день 1 або день 2 після вилуплення.
При проведенні подальших експериментів з ОЕМ автори винаходу виявили, що даний вірус летальний при введенні молодим курчатам (3 дні або менше) або іп омо. Несподівано, хоча введення курчатам СЕМ дикого типу (або конструкції ОЕМ, яка містить всі нативні гени, як запропоновано в УМО 2014/0036735) через 1 тиждень після вилуплення начебто добре переноситься, однак введення такої конструкції в 1-й день після вилуплення або іп омо викликає масову загибель тварин (тобто від 80 до 10095), як зазначено в прикладі 1.
Ще більш несподівано автори винаходу змогли модифікувати структуру ОЕМ і отримати такі конструкції ОЕМ, які можуть застосовуватися у домашніх птахів, в тому числі на дуже ранній стадії (З дні або менше) або іп омо, причому вони можуть викликати істотну експресію білка іп мімо на ранній стадії. Зокрема, автори винаходу провели подальші дослідження з ОЕМ і отримали різні рекомбінанти з різними делеціями або змінами генів. Автори винаходу несподівано виявили, що при інактивації обох генів 054 і 055 можна отримати такі рекомбінантні ОЕМ, які (ї) піддаються атенуації іп мімо, особливо у курей, і (ії) стабільні і здатні експресувати чужорідні гени відповідним чином для формування захисного імунітету.
Результати також показують, що такий чужорідний генетичний матеріал сильно експресується такими вірусами при інфікуванні клітин, причому така експресія залишається стабільною в часі.
Більш того і несподівано, при інактивації 054 ії 055 виходять атенуйовані ОЕМ, які можна безпечно використовувати для експресії білків або антигенів у молодих домашніх птахів і іп омо, тоді як ОЕМ з одним лише неактивним геном 054 або одним лише неактивним геном 055 залишаються патогенними або летальними для молодих курчат (у віці менше З днів або іп омо).
Оскільки такі ОЕМ не володіють ніяким відомим природним тропізмом, наприклад, для курей, то застосування конструкцій ОЕМ за винаходом для вакцинації курчат не пов'язане з ризиком поширення або зараження невакцинованих тварин. Крім того, у курей не виробляються материнські антитіла або імунітет проти ОЕМ, і віруси винаходу можуть застосовуватися для
Зо формування дуже раннього імунітету у вакцинованих тварин.
Отже, предметом винаходу є такий вірус качиного ентериту (ОЕМ), який містить неактивні гени 054 ії 055.
Іншим предметом винаходу є такий вірус качиного ентериту (ОЕМ), який має неактивні гени 054 і Ш55 і містить чужорідну нуклеїнову кислоту.
Віруси ОЕМ за винаходом можуть бути отримані з будь-яких видів або штамів ОЕМ.
Повідомлялося про ряд штамів ОЕМ, які доступні з загальнодоступних колекцій, як--о штам
Уапзеп, штам МАС (ІЮ ЕШШО82088.2), штам С-КСЕ (ІЮ КЕ263690.1), штам СНм (0 90647509.1), штам 2085 (0 У6999965), штам СМ (ІЮ КО549663.1) або штам СС (І 920673560.1).
У кращому втіленні ОЕМ за винаходом походить або отриманий з вихідного штаму, обраного з штаму Уапзеп або штаму С5С, або будь-якого штаму ОЕМ, ідентичного послідовності штаму
Уапхзеп або штаму С5С щонайменше на 9095, більш переважно щонайменше на 9595, щонайменше на 9695, щонайменше на 9795, щонайменше на 9895 або щонайменше на 9995.
Винахід показав, що при інактивації (тобто перетворення в нефункціональні або видаленні) генів 054 ії 055 можна отримати атенуйовані ОЕМ, які безпечні навіть при введенні іп омо або молодим птахам і можуть реплікуватися і експресувати білки у домашніх птахів. Зокрема, як показано в прикладах, конструкції ОЕМ з неактивними генами 054 і 055 є стабільними, можуть реплікуватися в культурі і їх можна безпечно вводити в яйця домашніх птахів або молодим птахам. Отже, такі віруси можна використовувати для отримання рекомбінантних ОЕМ, що містять чужорідний матеріал нуклеїнової кислоти, зокрема генів, які кодують антигени, для експресії таких генів у домашніх птахів.
У контексті винаходу ЮЕМ з неактивним геном означає такий ОЕМ, який не може експресувати функціональний білок або РНК, які кодуються даним геном. Таким чином, неактивний ген, зокрема, означає ген з мутацією, делецією і/або перериванням, який не може кодувати білок дикого типу.
В одному конкретному втіленні ген неактивний внаслідок однієї або кількох мутацій в послідовності, що кодує, особливо точкових мутацій в послідовності, що кодує, що запобігають експресію повнорозмірного білка. Такі мутації можуть вводити стоп-кодони або нонсенс-кодони в послідовність або викликати заміни залишків незамінних амінокислот в кодованому білку, при цьому виходить неактивний білок. бо В іншому втіленні ген неактивний внаслідок делеції щонайменше частини (кодуючої)
послідовності даного гена, переважно щонайменше 2095 (кодуючої) послідовності гена, більш переважно щонайменше 3095, щонайменше 4095, щонайменше 50956, щонайменше 6095, щонайменше 7095, щонайменше 8095 або щонайменше 8595 і аж до 10095. У кращому прикладі
ОЕМ за винаходом має делецію щонайменше 300 п.н. з (кодуючої послідовності) гена, який підлягає інактивації. При такій делеції видаляється кодуюча послідовність і тим самим запобігається експресія білка дикого типу або навіть будь-якого білка.
В цьому відношенні одне конкретне втілення винаходу стосується такого вірусу качиного ентериту (ОЕМ), який має делеції генів 054 і 055, зокрема, кодуючої послідовності генів 054 і 55.
Передбачається, що гени Ш54 і 055 вірусу ОЕМ кодують білки. Однак дійсна функція цих генів залишається неясною. Аж до цього винаходу здатність отримувати подвійно дефектні за 054-055 віруси ОЕМ була відома, а здатність таких вірусів ОЕМ реплікуватися і експресувати чужорідні гени без летальності у птахів була повністю невідома.
Ген 054 зазвичай складається з 1380 пар основ генома ОЕМ і кодує білок, що містить приблизно 459 амінокислотних залишків. 054 сильно консервативний між штамами ОЕМ.
Звертаючись до штаму С5С, ген 054 відповідає нт. 141123-142502 в геномі. Передбачається, що фахівці в цій галузі зможуть легко встановити точне місце розташування гена 054 у будь- якого штаму ОЕМ, використовуючи інформацію, яка міститься в цій заявці і загальні знання, або ж шляхом поєднання послідовностей. У переважного ОЕМ за винаходом делеція становить щонайменше 2095 (кодуючої) послідовності гена 054, більш переважно щонайменше 3095, щонайменше 4095, щонайменше 5095, щонайменше 6095, щонайменше 7095, щонайменше 8095, щонайменше 9095 і аж до 10095. У кращому прикладі ОЕМ за винаходом має делецію щонайменше 500 п.н. з (кодуючої) послідовності гена 54, більш переважно щонайменше 600, 700, 800, 900, 1000 або більше. В одному конкретному втіленні ОЕМ за винаходом має делецію, що охоплює щонайменше нт. 200-1000 послідовності гена 054, більш переважно щонайменше нт. 150-1150, ще більш переважно щонайменше нт. 100-1300. В одному конкретному прикладі
РЕМ за винаходом має делецію від нт. 51 до нт. 1330 (тобто більше 9095) послідовності гена
О54. В іншому конкретному втіленні ОЕМ за винаходом має делецію всієї послідовності гена 54 (нт. 1-1380).
Зо Ген 055 вірусу ОЕМ кодує глікопротеїн, функція якого залишається невідомою. У більшості штамів ОЕМ (наприклад, МАС, СС, С-КСЕ, СНум, СМ) ген О55 складається приблизно з 1620 п.н. ї кодує білок приблизно з 539 амінокислотних залишків. У деяких штамів ОЕМ типу штаму 2085 і штаму дапзеп (або Каремас) ген О55 містить дві коротші кодуючі області: 5055 приблизно в 396 п.н. і 3'ШЮБЗ5 приблизно в 1197 п.н., розділені невеликою міжгенною ділянкою приблизно в 25 п.н. (Див. Фіг. 1). Звертаючись до штаму СС, ген 055 відповідає нт. 142662- 144281 в геномі. Передбачається, що фахівці в цій галузі зможуть легко встановити точне місце розташування гена 055 у будь-якого штаму ОЕМ, використовуючи інформацію, яка міститься в цій заявці і загальні знання, або ж шляхом поєднання послідовностей. У переважного ОЕМ за винаходом делеція становить щонайменше 2095 (кодуючої) послідовності гена 055, більш переважно щонайменше 309565, щонайменше 4095, щонайменше 5095, щонайменше 6090, щонайменше 7095, щонайменше 8095, щонайменше 9095 і аж до 10095. У кращому прикладі ОЕМ за винаходом має делецію щонайменше 500 п.н. з (кодуючої) послідовності гена 055, більш переважно щонайменше 600, 700, 800, 900, 1000 або більше. В одному конкретному втіленні
ОЕМ за винаходом має делецію, що охоплює щонайменше нт. 200-1000 послідовності гена 055, більш переважно щонайменше нт. 100-1100, ще більш переважно щонайменше нт. 80-1120.
Коли ген 055 містить дві ОКЕ, то переважно обидві ОКЕ є неактивними. В цьому відношенні, якщо ОЕМ отримують з вірусного штаму з послідовністю гена 055, що містить одну ОКЕ, то ОЕМ переважно має делецію щонайменше 9095 даної ОКЕ типу делеції щонайменше від нт. 51 до нт.1570 послідовності гена 055, більш переважно делецію всього гена 55. Якщо ОЕМ отримують з вірусного штаму з послідовністю гена 055, що містить дві ОКЕ, то ОЕМ переважно має делецію щонайменше 9095 кожної з цих ОКЕ, більш переважно делецію, що включає щонайменше 9095 першої ОКР, всю міжгенну ділянку і щонайменше 9095 другої ОКЕ.
В одному конкретному втіленні ОЕМ за винаходом містить делецію безперервної області, що охоплює щонайменше частину гена 054, всю міжгенну ділянку 054-055 і частину гена О55.
В іншому конкретному втіленні ОЕМ містить делецію нуклеотидної області, що включає щонайменше 5095 гена 054, всю міжгенну ділянку між геном 054 і геном Ш55 і щонайменше 5095 гена 055.
У більш кращому втіленні ОЕМ містить делецію нуклеотидної області, що включає весь ген 054, всю міжгенну ділянку між геном 054 і геном 055 і весь ген 055. Конкретним прикладом бо такої конструкції є, наприклад, ОЕМ/О54055/Васмра.
Як зазначено вище, ОЕМ за винаходом можуть містити одну або кілька чужорідних нуклеїнових кислот, які представляють інтерес. Як правило, чужорідна нуклеїнова кислота знаходиться під контролем транскрипційного промотора. Переважно промотор клонують з чужорідною нуклеїновою кислотою. Промотором може бути будь-який природний або синтетичний промотор, отриманий з клітинних або вірусних генів. Приклади відповідних промоторів включають, наприклад, промотор р-актину курки (Вас) або його похідні типу Соа5, промотор Рес, найраніший промотор (іє)ї цитомегаловірусу миші (Мстм), промотор цитомегаловірусу людини (Неіту), промотор мавпячого вірусу (5М)40 і промотор вірусу саркоми
Рауса (К5М) або такі їх фрагменти, які зберігають активність промотора. В одному варіанті чужорідна нуклеїнова кислота клонується нижче і під транскрипційним контролем промотора транскрипції, присутнього в геномі ОЕМ.
В одному конкретному втіленні чужорідна нуклеїнова кислота розташовується в послідовності гена 054 вірусного генома ОЕМ, або на додаток до існуючої послідовності гена 054 (що робить ген неактивним шляхом переривання послідовності гена), або замість видаленої послідовності гена 054, або в мутованій послідовності гена 054. В альтернативному втіленні чужорідна нуклеїнова кислота розташовується в послідовності гена 055 вірусного генома ОЕМ, або на додаток до існуючої послідовності гена 055 (що робить ген неактивним шляхом переривання послідовності гена), або замість видаленої послідовності гена 055, або в мутованій послідовності гена 055.
У кращому втіленні ОЕМ за винаходом має делецію в послідовності генів 054 і 055 і містить чужорідну нуклеїнову кислоту, розташовану замість вилучених нуклеотидів.
В альтернативному втіленні ОЕМ за винаходом має неактивні гени 054 і 055 і містить чужорідну нуклеїнову кислоту, розташовану в іншому сайті клонування типу сайту, обраного з гена ЦІ 4, гена ЦІ 44, міжгенної ділянки ШІ 27-01 26, гена 0123, міжгенної ділянки ЦІ 45-01 46, міжгенної ділянки ШІ 50-01 51, гена 057, міжгенної ділянки 57-58 або гена 0510. В цьому випадку чужорідна нуклеїнова кислота може бути клонована з заміною всього або частини зазначеного гена або може бути вставлена в даний ген.
Крім того, ОЕМ5 винаходу можуть містити кілька чужорідних нуклеїнових кислот. При цьому кілька чужорідних нуклеїнових кислот можуть бути вставлені в одне і те ж положення у вірусу, наприклад, в області О54/055, як описано вище, під контролем одного або декількох різних промоторів. З іншого боку, чужорідні нуклеїнові кислоти можуть бути вставлені в різні сайти клонування вірусу, як-то одна в районі ОЗА/ЛІ55, як описано вище, і щонайменше одна в іншій ділянці, переважно обраній з гена Ш14, гена ЦІ 44, міжгенної ділянки ШІ 27-Ш1 26, гена ШІ 23, міжгенної ділянки ШІ.45-01 46, міжгенної ділянки ШОЇ 50-ШІ 51, гена 057, міжгенної ділянки 0О57- 058 або гена 0510, як правило, з заміною всього або частини ендогенного гена або ділянки.
Ген ШІ 4 зазвичай складається з 717 пар основ генома ОЕМ. Звертаючись до штаму СС, ген ЦІ 4 відповідає нт. 142662-144281 в геномі. Передбачається, що фахівці в цій галузі зможуть легко встановити точне місце розташування гена ЦІ 4 у будь-якого штаму ОЕМ, використовуючи інформацію, яка міститься в цій заявці і загальні знання, або ж шляхом поєднання послідовностей. В одному конкретному втіленні винахід стосується такого вірусу качиного ентериту (ОЕМ), який містить неактивні гени 054, 055 і 0/4. Більш переважно винахід стосується такого вірусу ОЕМ, який має неактивні гени 054, 055 і ЦІ 4 і містить першу чужорідну нуклеїнову кислоту, клоновану в гени 0054/0055 або в ген Ш14, переважно з заміною щонайменше 2095 даного гена. У переважного ОЕМ за винаходом делеція становить щонайменше 2095 послідовності гена 0/4, більш переважно щонайменше 3095, щонайменше 4095, щонайменше 5095, щонайменше 60956, щонайменше 7095, щонайменше принаймні 80905, щонайменше 9095 і аж до 10095. У кращому прикладі ОЕМ за винаходом має делецію щонайменше 500 п.н. з послідовності гена ШІ 4, більш переважно щонайменше 600, 700, 800, 900, 1000 або більше.
Ген ШІ 23 зазвичай складається з 1077 пар основ генома ОЕМ. Звертаючись до штаму СС, ген ШІ 23 відповідає нт. 77997-79073 в геномі. Передбачається, що фахівці в цій галузі зможуть легко встановити точне місце розташування гена 123 у будь-якого штаму ОЕМ, використовуючи інформацію, що міститься в цій заявці і загальні знання, або ж шляхом поєднання послідовностей. В одному конкретному втіленні винахід стосується такого вірусу качиного ентериту (ОЕМ), який містить неактивні гени 054, Ш5Б5 ії 023. Більш переважно винахід стосується такого вірусу ОЕМ, який має неактивні гени 054, 55 і ШІ 23 і містить першу чужорідну нуклеїнову кислоту, клоновану в гени 54/55 або в ген ШІ 23, переважно з заміною щонайменше 2095 даного гена. У переважного ОЕМ за винаходом делеція становить щонайменше 2095 послідовності гена ШІ 23, більш переважно щонайменше 3095, щонайменше 60 4095, щонайменше 5095, щонайменше 60956, щонайменше 7095, щонайменше, принаймні 80905,
щонайменше 9095 і аж до 10095. У кращому прикладі ОЕМ за винаходом має делецію щонайменше 500 п.н. з послідовності гена ШІ 23, більш переважно щонайменше 600, 700, 800, 900, 1000 або більше. В одному конкретному втіленні ОЕМ за винаходом має делецію, що охоплює щонайменше нт. 200-900 з послідовності гена ШІ 23, більш переважно щонайменше нт. 100-1000, ще більш переважно щонайменше нт. 80-1000. В одному конкретному прикладі ОЕМ за винаходом має делецію від нт. 51 до нт. 1027 (тобто близько 9095) з послідовності гена ЦІ 23.
Ген 057 зазвичай складається з 1116 пар основ генома ОЕМ. Звертаючись до штаму С5С, ген 057 відповідає нт. 145769-146884 в геномі. Передбачається, що фахівці в цій галузі зможуть легко встановити точне місце розташування гена 057 у будь-якого штаму ОЕМ, використовуючи інформацію, що міститься в цій заявці і загальні знання, або ж шляхом поєднання послідовностей. В одному конкретному втіленні винахід стосується такого вірусу качиного ентериту (ОЕМ), який містить неактивні гени О54, О55 і 057. Більш переважно винахід стосується такого вірусу ОЕМ, який має неактивні гени 054, 055 ії 057 і містить першу чужорідну нуклеїнову кислоту, клоновану в гени И054/)55 або в ген 57, переважно з заміною щонайменше 2095 даного гена. У переважного ОЕМ за винаходом делеція становить щонайменше 2095 послідовності гена 057, більш переважно щонайменше 3095, щонайменше 4095, щонайменше 5095, щонайменше 60956, щонайменше 7095, щонайменше принаймні 80905, щонайменше 9095 і аж до 10095. У кращому прикладі ОЕМ за винаходом має делецію щонайменше 500 п.н. з послідовності гена 057, більш переважно щонайменше 600, 700, 800, 900, 1000 або більше.
Винахід також стосується такого вірусу ОЕМ, який містить першу чужорідну нуклеїнову кислоту, клоновану в гени 54/55, і другу чужорідну нуклеїнову кислоту, клоновану в міжгенну ділянку, розташовану між генами ШІ 27 ії ШІ 26, переважно з заміною щонайменше 2095 даного гена. Винахід також стосується такого вірусу ОЕМ, який містить неактивні гени 054 і О55 і при цьому містить чужорідну нуклеїнову кислоту, клоновану в міжгенну ділянку, розташовану між генами ШІ 27 і Ш0/ 26. Звертаючись до штаму С5С, міжгенна ділянка, розташована між ЦІ 27 і 0126, відповідає нт. 72195-72646 в геномі. Клонування може проводитися в будь-якому положенні в межах цього району, більш переважно між нт.72300-72500, більш переважно між нт. 72350-72450. В одному конкретному втіленні клонування проводиться між нт. 72431-72432.
Зо Винахід також стосується такого вірусу ОЕМ, який містить неактивний ген ЦІ 4 і при цьому містить чужорідну нуклеїнову кислоту, клоновану в міжгенну ділянку, розташовану між генами 57 ї 058 або між генами Ші 45 і ЦІ 46 або між генами ШІ 50 і ШІ 51. Звертаючись до штаму СС, міжгенна ділянка, розташована між 145 і ЦО 46, відповідає нт. 25132-25352 в геномі.
Клонування може проводитися в будь-якому положенні в межах цього району, більш переважно між нт. 25200-25300. В одному конкретному втіленні клонування проводиться між нт. 25275- 25276. Звертаючись до штаму СЗС, міжгенна ділянка, розташована між ШІ 50 і ЦІ 51, відповідає нт. 15914-16063 в геномі. Клонування може проводитися в будь-якому положенні в межах цього району, більш переважно між нт. 15970-16010. В одному конкретному втіленні клонування проводиться між нт. 15979-15980.
Конструювання і клонування вірусів може здійснюватися методами, відомими рег 5е в даній області. Клонування генів і конструювання плазмід добре відомо пересічним фахівцям в даній області і може в основному проводитися стандартними методами молекулярної біології (Моїіеєсшціаг Сіопіпуд: А ІГарогаюту Мапиаї. 4 Еайоп, Сода 5рііпд Нагбогі арогаюгу, Соїд 5ргіпа
Нагрог , Мем/ Мого, ОСОБА , 2012). Як правило, рекомбінантні віруси отримують шляхом гомологічної рекомбінації між вірусним геномом і конструкцією (наприклад, гомологічною плазмідою), що містить нуклеїнову кислоту для вставки, фланковану нуклеотидами з сайту вставки для забезпечення рекомбінації. Клонування може здійснюватися з вилученням або без вилучення ендогенних послідовностей. У конкретному втіленні рекомбінантна послідовність клонується з заміною принаймні частини послідовності генома типу щонайменше 50 нуклеотидів або більше. Така делеція підвищує клонуючу здатність вірусу.
Для конструювання послідовність, яка містить цільову ділянку вставки, зазвичай спочатку клонують у відповідний вектор, отримуючи вектор з гомологією. Приклади векторів включають плазміди типу РВК322, рВК325, рВК327, рВЕ328, рОсС18, рОсС19, рОсС7, рОсС8 або рисо; такі фаги, як фаг лямбда і фаг М13; або косміди типу рРНС79. Послідовність цільової ділянки вбудовують у вектор стандартними методами клонування. Переважно послідовність цільової ділянки, що використовується, має достатню довжину з тим, щоб забезпечити подальшу гомологічну рекомбінацію іп мімо з вірусним геномом СЕМ. Переважно послідовність цільової ділянки, яку клонують, повинна мати довжину щонайменше в 100 нуклеотидів, зазвичай більше 300, як-то від 500 до 2000 нуклеотидів. Потім в цільову ділянку, клоновану в вектор, вставляють бо чужорідну нуклеїнову кислоту (яка зазвичай містить ген і промотор). Вставка переважно проводиться таким чином, щоб на кожній стороні від клонованої вставки залишалася частина послідовності цільової ділянки з довжиною, достатньою для забезпечення гомологічної рекомбінації (наприклад, щонайменше 50 нуклеотидів, переважно щонайменше 100 нуклеотидів). Чужорідна нуклеїнова кислота вводиться в клоновану цільову ділянку класичними методами, як-то за допомогою рестрикційних ферментів та процедури лігування. За необхідності в певний сайт цільової ділянки можна вводити мутації для створення нового сайту розщеплення для рестрикційного ферменту. Для цієї мети можна використовувати стандартні методи мутагенезу, добре відомі фахівцям в даній області, такі, наприклад, як мутагенез іп міго або ПЛР. Потім вектори з гомологією, у яких в цільову ділянку була вставлена чужорідна нуклеїнова кислота, можна вводити в інфіковані СЕМ клітини або клітини, трансфіковані геномом ОЕМ, використовуючи такі відомі методи, як електропорація, фосфат кальцію, метод на основі ліпофектину і т.п. При цьому в даних клітинах при рекомбінації між вірусом і вектором виникають рекомбінантні віруси. Отримані рекомбінантні віруси можна піддати відбору за генотипом або за фенотипом за допомогою відомих методів, наприклад, за допомогою гіоридизації, секвенування, ПЛР або функціонального аналізу для виявлення будь-яких продуктів, що кодуються чужорідної нуклеїнової кислотою, як описано в прикладах. Обраний рекомбінантний вірус можна культивувати в великому обсязі в клітинній культурі, після чого можна виділити рекомбінантні віруси.
Чужорідний ген
РЕМ за винаходом може містити будь-яку чужорідну нуклеїнову кислоту, переважно будь- який чужорідний ген. Чужорідний ген може кодувати будь-який продукт, який представляє інтерес, як-то РНК або біологічно активні і/або імуногенні (наприклад, антигенні) білки, поліпептиди або пептиди. У кращому втіленні чужорідний ген кодує антиген, ще більш переважно пептид або поліпептид, який походить з антигену патогенного організму, здатного викликати інфекції у тварин, особливо птахів. Приклади патогенів, що викликають інфекції у птахів, включають віруси, бактерії, грибки, найпростіші і т.д. Імуногенний (полі) пептид переважно може (походити з) поверхневого білка, білка, що секретується або структурного білка даного патогена або їх фрагментів. Поліпептид може походити з будь-якого джерела, наприклад, вірусного, прокаріотичного, еукаріотичного або синтетичного.
Зо У кращому втіленні чужорідний ген кодує антигенний пептид збудника хвороби птахів.
Конкретні приклади збудників хвороб включають, без обмеження, вірус пташиного грипу, пташиний параміксовірус типу 1, який також називають вірусом хвороби Мем/сазЦе (МОМ), пташиний метапневмовірус, вірус хвороби Марека, вірус хвороби Ситброго, який також називають вірусом інфекційного бурситу (ІВОМ), вірус інфекційного ларинготрахеїту (І-ТМ), вірус інфекційного бронхіту (ІВМ), Езспегіспіа соїї, Заітопеїйа 5р., РавівигеМПйа тийосіда, КіетегейПа апаїйрезійег, Огіййтобрасієгішт пПіпоїгаспєаіє, Мусоріазєта даїЇїзеріїсит, Мусоріаєта 5упоміає, різні мікоплазми, що інфікують птахів, або кокцидії.
Переважно чужорідний ген кодує антиген, обраний з Е-білка МОМ, білка НМ МОМ, білка МР2
ІВОМ, білка 98 І-ТУ, білка 40К Мусоріахта даїїзеріїсит або поверхневого білка гемаглютиніну (НА) вірусу пташиного грипу або їх імуногенних фрагментів. У контексті винаходу термін "фрагмент" білка переважно означає фрагмент, що містить щонайменше 5 послідовних амінокислотних залишків даного білка, ще більш переважно від 5 до 100. В кращому втіленні такий фрагмент містить щонайменше один епітоп і/або є імуногенним іп мімо, тобто може викликати вироблення антитіл, що зв'язують повнорозмірний білок.
Конкретні приклади імуногенних пептидів включають, наприклад, пептид, що містить амінокислотні залишки 1-453 з МР2, 1-469 з 98 або 1-540 з Е-білка.
Переважні віруси ОЕМ
Переважні ОЕМ за винаходом містять делецію цілих генів 054 і 055.
Певні ОЕМ за винаходом містять делецію безперервної області, що включає щонайменше 5095 послідовності нуклеотидів гена 054, всю міжгенну ділянку 054-055 і щонайменше 5095 послідовності нуклеотидів гена 055.
Інші кращі ОЕМ за винаходом містять делецію безперервної області, що включає всю послідовність нуклеотидів гена 054, всю міжгенну ділянку 054-055 і всю послідовність нуклеотидів гена 055.
У бажаних ОЕМ за винаходом чужорідна нуклеїнова кислота кодує пташиний антиген, більш переважно УР2, НМ або Р-білок або його імуногенний фрагмент.
Інші кращі ОЕМ за винаходом містять неактивні гени 054 і 055 і щонайменше ще одну делецію, обрану з: - делеції щонайменше нт. 100-1000 з послідовності гена 057, 60 - делеції щонайменше нт. 1000-1200 з послідовності гена ЦІ 4 і/або
- делеції щонайменше нт. 100-1000 з послідовності гена ЦІ 23.
Інші кращі СЕМ за винаходом містять неактивні гени 054 і 055 і щонайменше одну чужорідну нуклеїнову кислоту, клоновану в окрему ділянку, переважно обрану з гена ЦІ 4, гена
ЦІ 44, міжгенної ділянки ШІ.27-01 26, гена ЦІ 23, міжгенної ділянки ОІ45-ЦІ 46, міжгенної ділянки
ШІ 50-ЦІ 51, гена 057, міжгенної ділянки 57-58 або гена 0510.
Нуклеїнові кислоти
Винахід також стосується молекул нуклеїнової кислоти, що містить геном ОЕМ з неактивними генами 054 і 055. Така нуклеїнова кислота може бути одноланцюговою або дволанцюговою, ДНК або РНК. У кращому втіленні нуклеїнова кислота представлена молекулою ДНК, яка містить геном ОЕМ, як визначено вище.
Нуклеїнова кислота може перебувати у вільному вигляді або у векторі типу плазміди, ВАС і т.п. Нуклеїнова кислота може бути виділеною або міститься в клітинах господаря.
Клітинні культури
Рекомбінантні віруси цього винаходу можна розмножувати в будь-яких культурах компетентних клітин. Після досягнення необхідного зростання вірусів клітини можна відокремити від лунок за допомогою скребка або трипсину, а інфіковані клітини виділити з супернатанта центрифугуванням.
Приклади компетентних клітин включають СЕР, яйця з ембріонами, ниркові клітини курей і т.п. Клітини або віруси можна культивувати в культуральному середовищі типу середовища
МЕМ Ігля, середовища І еїром/й»-І-15/МсеСоу 5А (суміш 1:1) за температури близько 37" протягом 3-6 днів. Інфіковані клітини зазвичай суспендують в культуральному середовищі, що містить 1095 диметилсульфоксиду (ОМ50О), і зберігають в замороженому вигляді в рідкому азоті.
Композиції та вакцини
Винахід також стосується композицій типу вакцин, що містять один або кілька ОЕМ за винаходом.
Композиції та вакцини винаходу можуть містити ОЕМ в фармацевтично або ветеринарно прийнятному носії або наповнювачі. Крім того, композиції та вакцини також можуть містити відповідний ад'ювант.
Композиції та вакцини відповідно до даного винаходу можуть містити відповідний розчинник, такий, наприклад, як водний буфер або фосфатний буфер. Переважно композиції і вакцини також містять добавки, як-то стабілізуючі речовини, консерванти, барвники, поверхнево-активні речовини та ін.
Наприклад, композиції або вакцини винаходу можуть бути складені з однією або декількома додатковими добавками для підтримки |ізотонічності, фізіологічного рН і стабільності, наприклад, з таким буфером, як фізіологічний сольовий розчин (0,8595), фізрозчин з фосфатним буфером (РВ5) цитратний буфер, трис(гідроксиметиламінометан) (ТКІ5), фізрозчин з трис- буфером і т.п., або з антибіотиком, наприклад, неоміцином або стрептоміцином і т.п.).
В одному конкретному втіленні композиція даного винаходу містить консервант.
В іншому конкретному втіленні композиція даного винаходу містить солюбілізуючий засіб.
В іншому конкретному втіленні композиція даного винаходу містить ад'ювант. Ад'юванти можуть бути отримані з цілого ряду джерел, включаючи різні білки і пептиди, що походять з тварин (наприклад, гормони, цитокіни, костимулюючі фактори), і нові нуклеїнові кислоти, що походять з вірусів і інших джерел (наприклад, двохланцюгової РНК, Сро) і т.п., які самі по собі або в комбінації достатні для посилення імунної відповіді.
Композиції винаходу можуть бути рідкими (розчини, суспензії, емульсії) або твердими (порошки, гелі, пасти, олії) і можуть бути складені для будь-якого способу введення. Переважно вони складаються для ін'єкцій типу ін'єкцій іп омо або ж, наприклад, для внутрішньовенного, підшкірного, внутрішньом'язового, внутрішньоглазного, внутрішньоочного, внутрішньошкірного іМабо внутрішньочеревного введення. З іншого боку, вони можуть бути складені для перорального, очного (наприклад, за допомогою очних крапель), інтраназального або окуло- назального введення, наприклад, за допомогою аерозолю або спрею.
Кожна доза вакцини може містити відповідну дозу, достатню для вироблення захисного імунітету у даного виду птахів. Оптимізація таких доз добре відома в даній області. Кількість антигену на 1 дозу може бути встановлено відомими методами з використанням реакцій антиген/антитіло, наприклад, методом ЕГІЗА.
Вакцини винаходу можна вводити у вигляді одноразових або багаторазових доз, в залежності від методики вакцинації.
В одному конкретному втіленні винахід стосується вакцин, що містять вірус, нуклеїнових кислот або клітини, як визначено вище, і відповідний ексципієнт або ад'ювант. бо В іншому конкретному втіленні винахід стосується вакцин, що містять рідкі композиції вірусу,
нуклеїнової кислоти або клітин, як визначено вище, і відповідний ексципієнт або ад'ювант.
Цей винахід також стосується застосування вірусів, композицій, вакцин, нуклеїнової кислоти або клітин, як описано вище, для імунізації птахів типу домашніх птахів, і способу імунізації птахів шляхом введення імунологічно ефективної кількості вірусу, композиції, вакцини, нуклеїнової кислоти або клітин, як описано вище.
Наступним предметом винаходу є композиції, ОЕМ, нуклеїнові кислоти або клітини господаря, як визначено вище, для застосування для вакцинації або імунізації птахів, особливо домашніх птахів, більш переважно курей, більш переважно молодих птахів (на 3-й день після вилуплення або раніше) або іп омо.
Наступним предметом винаходу є композиції, вакцини, ОЕМ, нуклеїнові кислоти або клітини господаря, як визначено вище, для застосування для вироблення захисного імунітету у птахів, особливо домашніх птахів, більш переважно курей, більш переважно молодих птахів (на 3-й день після вилуплення або раніше) або іп омо.
Винахід також стосується способу вакцинації тварин, особливо свійських птахів, більш переважно курей, більш переважно молодих птахів (на 3-й день після вилуплення або раніше або іп омо), що включає введення даним тваринам композиції вакцини, ОЕМ, нуклеїнової кислоти або клітин господаря, як визначено вище.
Кращим предметом винаходу є спосіб вакцинації домашніх птахів, який включає введення композиції, вакцини, ОЕМ, нуклеїнової кислоти або клітин господаря, як визначено вище, іп омо.
Іншим переважним предметом винаходу є спосіб вакцинації домашніх птахів, що включає введення композиції, вакцини, ОЕМ, нуклеїнової кислоти або клітин господаря, як визначено вище, в 1-й день або на 2-й день після вилуплення.
У наступному аспекті винаходу передбачений спосіб вироблення імуногенної або захисної відповіді у тварин проти одного або декількох пташиних патогенів, що включає введення даним тваринам, особливо домашнім птахам, більш переважно курям, більш переважно молодим птахам (на 3-й день після вилуплення або раніше) або іп омо композиції, вакцини, ОЕМ, нуклеїнової кислоти або клітин господаря, як визначено вище.
Як зазначено в експериментальному розділі, віруси за винаходом особливо вигідні для вакцинації молодих птахів (в 1 день, 2 день або З день після вилуплення) або для вакцинації іп
Зо омо. Так, несподівано винахід показав, що віруси за винаходом безпечні при такому ранньому введенні, тоді як нативний ОЕМ або ЮЕМ дикого типу летальний. Таке раннє введення, в поєднанні з раннім виникненням імунітету, викликаного цими вірусами, особливо вигідно для вироблення раннього захисного імунітету ще до того, як домашня птиця може піддатися значному впливу патогенів.
В цьому відношенні, в більш загальному аспекті винахід також стосується способу вакцинації або імунізації птахів, переважно домашніх птахів, більш переважно курей, який включає введення даним птахам іп омо атенуйованого ОЕМ, що кодує антиген. Винахід також стосується способу експресії чужорідного гена у птахів, переважно домашніх птахів, більш переважно курей, який включає введення даним птахам іп омо атенуйованого ОЕМ, що містить даний чужорідний ген. Винахід також стосується застосування атенуйованого ОЕМ, що містить чужорідний ген, для експресії даного гена у птахів шляхом введення даного ОЕМ іп омо. Винахід також стосується атенуйованих ОЕМ, що кодують антигени, для застосування для індукції імунної відповіді або для вакцинації птахів шляхом введення даного ОЕМ іп омо. ОЕМ переважно містить неактивний ендогенний ген, що робить даний ОЕМ атенуйованим і який добре переноситься при ін'єкції іп омо.
Цей винахід також стосується вакцинаційних наборів для імунізації птахів, які містять ефективну кількість полівалентної вакцини, як описано вище, і засіб для введення даних компонентів даному виду птахів. Наприклад, такий набір містить ін'єкційний пристрій, наповнений вакциною за винаходом, а також інструкції для внутрішньошкірного, підшкірного, внутрішньом'язового введення або введення іп омо. В якості альтернативи набір містить пристрій для розпилення/аерозолю або очних крапель, заповнений вакциною за винаходом, а також інструкції з окуло-назального введення, перорального або мукозального введення.
Інші аспекти і переваги винаходу будуть розкриті в наступному експериментальному розділі, який розкриває заявлений винахід.
ПРИКЛАДИ
Приклад 1. Вірулентність ОЕМ дикого типу у яєць або молодих птахів
Проводили клінічне дослідження для вивчення патогенності або вірулентності ОЕМ у курчат при введенні за різними часовими схемами. Зокрема, проводили введення іп омо (за З дні до вилуплення), в день 1 після вилуплення або в день 4 після вилуплення. Використовували ОЕМ бо дикого типу штаму Уапзеп. Доза, що вводиться становила 100 чи 1000 ри на 1 дозу. В якості контролю вводили розчин РВ5. Патогенність визначали шляхом вимірювання смертності кожен день після вилуплення.
Результати представлені в наступній таблиці.
Смерт-
Група | Вакцина Доза спосіб | день! | п ність сім) со от|ог (оз оч ов ов ог|оеіеовг То 1 | РВ5 | - |іпомоЇ З |17Ї0|0 0|0|010|01010 2 | 12 2 | ОЕМ | т100 |іпомо| З |16Ї3|219|1/171-/-1-1/-1 - | оо
З | ОЕМ |т1000 | іпомо| З |17/|5|219|1/-1-1-1-1/-1 - | 00 4 | ОЕМ |т1000|Ї пк | 1 |(17Г0|0 0|0/|01/6|4|21|1 1 | 82
І 5 | ОЕМ |т000| пк | 4 |17Їо0|о0|0|0|0/0|0|0|0|/о0| о (1) Вік у днях при інокуляції (2) Кількість загиблих птахів у віці від 9 до 19 днів
Наведені вище результати показують, що введення МЕМ дикого типу в день 4 після вилуплення безпечне при 10095 виживання (див. Групу 5). На відміну від цього, після введення
РЕМ іп омо 10095 птахів загинули в віці до 4 днів, тоді як введення РВЗ іп омо було безпечним.
Ці результати показують, що, хоча ОЕМ дикого типу може підходити для введення дорослим тваринам, але несподівано він виявився летальним для молодих тварин (3-й день або менше після вилуплення) або при введенні іп омо.
Приклад 2. Вірулентність ОЕМ з неактивним геном 54 або 055 2.41. Конструювання ОЕМ, що містять неактивний ген 054 або ген 055
Прагнучи зменшити вірулентність для курячих ембріонів, конструювали ОЕМ з неактивним 054 або 055.
Конструювання касети гр5іІ пео-О5Неаг2
Конструювали фрагмент ДНК в 2,8 т.н. з касети гр5І пео-Ю5Кеа2 за допомогою реакцій ПЛР.
Якщо коротко, проводили три реакції ПЛР. Першу реакцію ПЛР проводили за допомогою пари праймерів ЗЕО ІЮ МО: 1 (5-СсСсСОСстаатТаАтТаАта,аСсацпАТСаТттатАТ-3) і ЗЕО ІЮ МО: 2 (5- сСсАТОСТаИСТаСастСАпААСААСТОСТСА-3) з матрицею з синтезованого фрагмента гро пео (5ЕО ІЮ МО: 3). Другу реакцію ПЛР проводили за допомогою пари праймерів 5ЕО ІЮ
МО: 4 (5-АСЯАДСсТтоттотадаСаСАасСАССАТассос-3) і 5ЕО ІЮ МО: 5 (5-ТсОсСОАаааАаас
САТССТТАДОадастатТААТ-3) з матричною плазмідою рі типу вектора для ссавців, що експресує (Рготеда, кат. Ме Е1721). Третю реакцію ПЛР проводили за допомогою пари праймерів 5ЕО ІЮ МО: 6 (Б-ТАСАаСТоТтТААдапАтТас!сстосСтТоСОаАСцА-3) і 5ЕО І МО: 7 (5- ,САСТаАААААДААТастТТТАТТТИатТОаАААТ-3) з матричною плазмідою рікЕ52-О5Неаг2
Зо (Сіопіесі, кат. Мо 632420). Проводили ще одну реакцію ПЛР, використовуючи суміш продуктів
ПЛР з першої і другої реакції ПЛР як матрицю і 5ЕО ІО МО: 1 ії БЕО ІЮО МО: 5 в якості праймерів.
Цей продукт ПЛР змішували з продуктом ПЛР з третьої реакції і використовували для останньої реакції ПЛР з парою праймерів ЗЕО ІЮ МО: 1 ії 5ЕО ІЮ МО: 7, отримуючи касету гр5іпео- реВедг.
Конструювання касети зі вставкою
Конструювали фрагмент ДНК з касети гр5іІ пео-О5Кеа2 з додаванням гомологічних 5'- і 3'- кінців області 054 або 055 ОЕМ послідовностей (по 50 пар основ) на обидва кінці за допомогою реакцій ПЛР. Реакції ПЛР проводили, використовуючи касету гр5Ї пео-О5Кеа2 як матрицю.
Використовували наступні пари праймерів: ЗЕО ІЮ МО: 8 (5'АТайСААСААТаАТАОаСТОа теаататтаатттта,асаадсасатттА,аасасстаатаАтаАтааСОа(соа-3) і 5ЕО ІЮО МО: 9 (5-ТТАААСТААТасААаСасСса тТтавААТТТСААХатоттааСасССАААСАТтСИ,аСАсСТААААдДАА
ТаСтТТТА-3) для ОЕМ з онеактивним 54 і ЗЕБЕО ОО МО: 10 (5-АТаТАТАСАСа
АСатТтТАСОЯСатсАТИаТОСО!тТАа,аССа,стТаАТТТТАТТТАСТАТОСССТОСТОАТаА тТасСОаоаа-3) і
ЗЕБЕО І МО: 11 (5-ТСАТАССАТАСААДАпасАТАаИТАСАаСССАС АпИатТТААААДАСАААСАдДА
ССАСТОаААААдДААТасттТтТА-3) для ОЕМ з неактивним 55. Отримані ПЛР-фрагменти (касети
О5А-трзі пео-О5Кеа2 і О55-гроі пео-О5Кеаг) піддавали електрофорезу і очищали.
Конструювання рекомбінантного ОЕМ, що несе ген гр5І пео-О5Неаг
Конструювання рекомбінантного ОЕМ, що несе ген гр5і пеоб5Кед2 в районі 054 або 055, проводили шляхом гомологічної рекомбінації в несучому геном ОЕМ штамі Б. сої, трансфікованому 0,5 мкг О54-трзі пеорзВеа2 або 055-гроЇ пеор5Кеаг. Трансфекцію проводили методом електропорації за допомогою Сепе Риїзег Хсеї! (Віо-Кай І арогайфогіе5) при 1,75 кВ, 25 мкФ і 200 Ом. Після трансфекції Е. соїї висівали на чашки з агаром І ига-Вегіапі (І В) і інкубували протягом ночі при 30"С. Клони БЕ. соїї, які несуть відповідну вставку, що містить ген гр5і пео-
реікеді2 в районі 054 або 055, ідентифікували методом ПЛР за допомогою пари праймерів, яка ампліфікує ділянку між геном гро5і пео-О5Кеа2 і районом сайту вставки в геномі ОЕМ (стик 1).
Використовували праймери ЗЕО ІЮО МО: 12 (5-ААСТатТАТАААТТАСАСААатАаТастАТаса-з» і
ЗЕО ІЮ МО: 13 (5-ТСАСААПААСТСИТСААСААОас-3) для ОЕМ з неактивним 054 і 5ЕО ІЮ
МО: 13 ї ЗЕО ІЮ МО: 14 (9-Я4ТТТАТАТТІАСасСацсААТаттаАс-3 для ОЕМ з неактивним 55. З клонів Е. соїї, що несуть відповідні вставки, виділяли ДНК ОЕМ і трансфікували в клітини СЕБЕ за допомогою Мисіеотесіог І (опа, ВазеіІ, Швейцарія). Трансфіковані клітини вносили в середовище І еібомії»"5 І -15 (І їе Тесппоїодієз Согр., кат. Мо 41300-39) із середовищем МеСоу 5
БА (Ге ТесппоїЇодіє5з Согр., кат. Мо 21500-061) (1:1) ї 495 телячої сироватки (середовище І М (5), висівали в 96-ямкові планшети для тканинних культур, а потім інкубували при 37"С в 4-595 СО» протягом 5-7 днів, поки не проявлявся цитопатичний ефект (СРЕ) ОЕМ. Після цього виділяли рЕМ5, що несуть ген гро пео-О5Кейд2 в районі 54 або 055 (ОЕМ/О54/гріі пео-ЮО5Кед2 або
РЕМ/О55/грзі пео-О5Неаг).
Перевірка структури генома
Структуру генома у рекомбінантного ЮЕМ/ЛІЗА/грзі пео-О5Кей2 або ОЕМ/О55/гр5і пео- рзКед2 перевіряли за допомогою трьох реакцій ПЛР, які ампліфікують стикувальні ділянки (стик 1, стик 2 і стик 3) на кожному кінці вставленого гена. Пари праймерів, що використовувалися в реакціях ПЛР для стику 1, описані вище. У реакціях ПЛР з ОЕМ/О54/грзі пео-О5Неадг2 використовували пари праймерів 5ЕБО ОО МО: 6 і 5БО ІЮ МО: 15 (5-
САТТТТААСССОТТТААаИтСААСАТТОСОС-3) для стику 2 і 5ЕО ІЮ МО: 12 і ЗЕО ІЮО МО: 15 для стику 3. У реакціях ПЛР з ОЕМ/О55/гріІ пео-О5Кеа2 використовували пари праймерів ЗЕО ІЮ
МО: 6 і БЕО ІЮ МО: 16 (3-АСТаАаАТаТТапАССАТАССАТСАААТОСТИ-3) для стику 2 і БЕО ІЮ
МО: 14 ії 5ЕО ІО МО : 16 для стику 3. Спостерігалися очікувані розміри продуктів ПЛР, що підтверджують, що ОЕМ/О54/гтрзіпео-О5Кеа?2 ії ОЕМ/55/гтріІі пео-Ю5Кед2 мають очікувані структури генома. 2.2. Експресія чужорідного гена рекомбінантними ОЕМ з неактивним геном 54 або 055
Експресію білка О5Кеа2 у ОЕМ/О5З4/рзіпео-О5Кей2 або ОЕМ/ЗБ5/гтрзі пео-О5Недг2 перевіряли по флуоресценції О5Кеа2. Збудження флуоресценції О5Кед2 проводили на клітинах
СЕР, інфікованих ЮЕМ/О54/трзі пео-Ю5Кеа2 або ОЕМ/О55/гроіІ пео-О5Кеа2. Якщо коротко,
Зо клітини СЕБЕ в б-лунковому планшеті інфікували за допомогою ОЕМ/ОБ4/р5і пео-ЮО5Невдг,
РЕМ/О55/грзЇ пео-Ю5Кейд2 або вихідного штаму ОЕМ при множинності зараження приблизно 0,01. Через З дні після інокуляції клітини збуджували при 563 нм і спостерігали червону флуоресценцію в бляшках рекомбінантних ОЕМ/О5А4/гтроі пео-О5Кей2 або ЮЕМ/О55/грзі пео- рехкед2, що підтверджує дійсність експресії білка рекомбінантними СЕМ. 2.3. Життєздатність і стабільність рекомбінантних ОЕМ з неактивним геном 054 або 055
РЕМ/О54/гтрзЇ пео-О5Кед2 або ОЕМ/О5З5/грзі пео-О5Кед2 пасеровали в клітинах СЕЕ по 15 разів і перевіряли стабільність вбудованого гена гр5і пео-О5Кеа2. Пересівання проводили через кожні 3-4 дні. Після кожних 5 пасажів бляшки ОЕМ/О54/гтрзЇ пео-О5Кеа?2 або ОЕМ/ОЗ5/грзІі пео- рзКед2 перевіряли на червону флуоресценцію під флуоресцентним мікроскопом і перевіряли структуру їх генома методом ПЛР, ампліфікуючи стикувальні ділянки (стик 1, стик 2 і стик З) за допомогою праймерів, наведених в прикладі 2. У всіх досліджуваних вірусів спостерігалася червона флуоресценція і очікувані розміри продуктів ПЛР, підтверджуючи, що ген грзіпео-
О5Кед2 зберігався у ОЕМ/О54/грзіпео-О5Кеа?2 ії ОЕМ/О55/грзі пео-О5Кед2 протягом щонайменше 15 пасажів. 2.4. Вірулентність ОЕМ з неактивним геном 054 або 055 при введенні іп омо
Інокулювали ОЕМ/ОЗ4/грзі пео-ЮО5Кей2 або ОЕМ/ЛОЗ5/грзі пео-О5Нед2 18-денним ембріонам курчат 5РЕ для дослідження їх патогенності або вірулентності для курячих ембріонів. В курячі ембріони вводили іп мо приблизно 1000 р в 0,1 мл ОЕМ/54/гтрзі пео-О5Вевд2,
РЕМ/О55/грзі пео-О5Кед2, вихідного ОЕМ або 0,1 мл РВЗ через голку 20 розміру в 1,5 дюйма.
Курчат спостерігали щодня на наявність пов'язаних з ОЕМ клінічних ознак типу депресії і смерті протягом 11 днів. Результати представлені в наступній таблиці. вилуп.| ро |0р11|0р2/|031| 04 05 | 506 | ність (95)
РАЗ 77777 / 122| 2 | 0 10101012 0|о0 1 5 щ 78
ОЕМ/ОБА/рзіпео-ОзВеа2 |22| 5 | з | 11 6|51|21|-| - | оо
ОЕМ/О5Б/рзіпео-ОзВеа2 |22| 2 | 6 | 06 4|4|- | - | оо
ОЕМ 77777777 7 122| 0 | 611 81|4|21|0| 01 56 (1) Кількість загиблих птахів у віці від Є до 11 днів
Всі курчата, інокульовані іп омо ОЕМ з неактивним 054 або Ш55, померли через 4 дні після вилуплення, тоді як померли 9595 курчат, інокульованих вихідним ОЕМ. Ці результати показують, що ОЕМ з неактивним 054 або 55 як і раніше володіє патогенністю і вірулентністю для курячих ембріонів при введенні іп омо.
Приклад 3. Конструювання ОЕМ, що містять неактивні гени 054 і 055
Для отримання ОЕМ з неактивними 054 і 055 спочатку конструювали вектор з гомологією, який потім використовували для отримання вірусу шляхом гомологічної рекомбінації в Е. соїї.
Плазмідні конструкції і маніпуляції з ДНК в основному проводилися у відповідності зі стандартними методами молекулярної біології (Моїесшіаг Сіопіпд: А Габрогагу Мапиаї. 4
Едіоп, Соїа 5рііпд Нагбог І абогаїогу, Соїд 5ргіпд Нагбог, Мем Моїк, ОА, 2012).
Клонували фрагмент ДНК в 1,1 т.н. з генома ОЕМ, який фланкує гени О5З ії 056, за допомогою реакцій ПЛР з додаванням сайту розпізнавання 51 у місці вставки. Якщо коротко, використовуючи ДНК, виділену з ОЕМ як матрицю, проводили 2 реакції ПЛР. Використовували наступні пари праймерів: ЗЕО ІЮ МО: 17 (5-ЯСасАТасСтТАаСтТаАТСТААСТТТАС-3) і 5БЕО ІЮ
МО: 18 (5-240ТаССААТААДаИаСсСТОаАСОсссСААТАТОТ-3), ЗЕБЕО ОО МО: 19 (5-
ТСАддсснанйдассАС САИСТАСАСАдСИ-3) і ЗЕО ІО МО: 20 (5- асСаААТТССАТТААТТСТОССОААСтТИ,ИТтТО-3). Проводили ще одну реакцію ПЛР, використовуючи суміш продуктів ПЛР з двох попередніх реакцій ПЛР як матрицю і 5ЕО ІЮ МО: 17 ії 5ЕО ІЮО МО: 20 в якості праймерів. Отриманий ПЛР-фрагмент клонували в вектор РОС18 (СепВапК Асс. 109136) після розщеплення ЕсоК! і 5рпІ, отримуючи риС18-КАРЕМАС-
О5АИББаве!-5й, який містить частину області 053 ії 056 з генома ОЕМ. Потім, використовуючи плазміду рРОС18-КАРЕМАС-ОБ4И55ає!І-5ЯІ, конструювали вектор з гомологією, що містить промотор і ген МР2 ІВОМ зі стандартного провокуючого штаму (МР2-5Т7С). Спочатку розщіпляли рОоС18-КАРЕМАС-ОБ4И55аєІ!-5ИІ за допомогою 51 і дефосфорилювали рекомбінантною лужною фосфатазою 5181 з Зпеулапеїїа 5р. (РАР) (Рипакозпі, Ме ОЕ110). Потім отримували промотор р-актину (Вас) курки (ЗЕБЕО ІЮ МО: 21) ії гени МР2-5ТС шляхом розщеплення раб/46расуР2-5ТО Ж 11 (05 Раї. Мо. 6,764,684) за допомогою ВОоїІ. Нарешті, цю касету з промотором Вас і МР2-5ТС вставляли в розщеплену 5ІИїЇ рОС18-КАРЕМАС-О54И55ае!1-5ГЇ, отримуючи рОС18-КАРЕМАС-О54055де!І-ВасуРа2в5іс (Фіг. 2). Цю плазміду - рОС18-КАРЕМАС-
Зо О55Б5авєІ-Васурагзвіс використовували для конструювання ОЕМЛІЗ4И5З5аеі!/Васура2з5іс (фіг. 2).
Конструювання ОБМЛОЗ4ОЗ5ае!/Васмур2
Конструювання ОЕМ, що несе ген ВасМмР2 в області 054-055, проводили шляхом гомологічної рекомбінації в несучому геном ОЕМ штамі Е. соїї, трансфікованому 0,5 мкг рОС18-
КАРЕМАС-О54055ае!І-ВасмРа2з5іс. Умови трансфекції були описані в прикладі 2. Клони Е. сої, які несуть відповідну вставку, що містить ген ВасУурР2, ідентифікували методом ПЛР за допомогою пари праймерів, ампліфікуючих ділянку між геном ВасмРа і районом сайту вставки в геномі ОЕМ (стик 1, фіг. 2). Використовували праймери ЗЕО ІО МО: 22 (5- аТоСАСТАТаССАТИаАСАТАССИТОИ-3) і ЗЕО ІЮ МО: 23 (-(ЯАаСААСттсаАасСтТаАТОС-3. З клонів Е. сої, які несуть відповідну вставку, виділяли ДНК ОЕМ і трансфікували в клітини СЕР.
Трансфіковані клітини інкубували до тих пір, поки не проявлявся цитопатичний ефект (СРЕ)
ОЕМ. При цьому отримували ОЕМ/О54055ае!/ВасмРа з нокаутом генів 054 і ЮО55, який містить ген Васмгр2.
Перевірка структури генома
Структуру генома ОЕМ/І54И55аеі/ВасМмР2 перевіряли за допомогою З реакцій ПЛР, які ампліфікують стикувальні ділянки (стик 1, стик 2 і стик З; Фіг. 2) на кожному кінці вставленого гена. Пари праймерів, які використовувалися в реакціях ПЛР для стику 1, описані вище. У реакціях ПЛР для стику 2 використовували пару праймерів 5ЕБО ІО МО: 24 (5- аоСАс,асААТССАсСацпАААААСсАС-3 і ЗЕО ІЮО МО: 12. Для стику З використовували ЗЕО ІЮ
МО: 22 і БЕО ІЮО МО: 12. Спостерігалися очікувані розміри продуктів ПЛР, які підтверджують, що рЕМЛИ54О55де/ВасуРа має очікувану структуру геному.
Приклад 4. Експресія гена МР2 за допомогою ОЕМ/ОЗ4О55аєе!/ВасуР2
Експресію білка МР2 рекомбінантним ОЕМ/О54О55ае!/ВасуР2 перевіряли методом чорних бляшок. Якщо коротко, інфіковані ОЕМ/О5455де!/ВасмР2 клітини СЕРЕ фіксували сумішшю метанол: ацетон (1:2) і інкубували з моноклональним антитілом Кб63 проти МР2 ІВОМ (АТС Мо
НВ-9490). Потім інкубували з біотинільованим антитілом проти ДС миші (Месіог І арогайогіев, кат. Мо ВА-9200), а потім з набором МЕСТАЗТАЇІМ АВС-АР (Месіог І абогаїогіе5, кат. Мо АК-5000), і фарбували бляшки, які експресують білок УР2, додаванням розчину МВТ/ВСІР (РКосне Арріїєй зЗсіепсе, кат. Мо 1681451). Як видно з Фіг. 3, в інфікованих ОЕМ/О54О55ае|!/Васмра2 клітинах спостерігалася експресія білка МР2. 60 Приклад 5. Введення ОЕМ/О54О55ае1/ВасмР2 іп омо
Інокулювали ОЕМ/І5455ає|/ВасуРа2 18-денним ембріонам курчат 5РРЕ. Всі групи ембріонів вакцинували іп омо приблизно по 1000 ріи в 0,1 мл рекомбінантного ПОЕМ/ОЗ4О55аде!/ВасмР2, вихідного ОЕМ або 0,1 мл РВЗ через голки 20 калібру в 1,5 дюйма. Курчат спостерігали щодня на наявність пов'язаних з ОЕМ клінічних ознак типу депресії і смерті протягом 35 днів. Через 5 тижнів після вилуплення курчат перевіряли на надбавку у вазі, розтинали і обстежували на наявність макроскопічних пошкоджень. Результати представлені в наступній таблиці.
Не Смерт- | Птахи з | Серед- нмкин піни рот ог б се оо ої МС дете тра
Рв5 и 62 о ж о1010 ее ого о7о00 жо іи588 зоввосувасург 7 1010000 1101 | 0 ме | о яв
ОЕМ (71 7 140161 -1-1-1-| - | 000; - | - (1) Кількість загиблих птахів у віці від З до 8 днів (2) Кількість загиблих птахів у віці від 12 до 35 днів
Смертність у птахів, інокульованих ОЕМ/О54О55ае!/ВасуР2 з нокаутом обох генів 054 і 55, склала 11,895, тоді як смертність при вихідному ОЕМ склала 10095, що свідчить про те, що вірулентність і патогенність ОЕМ істотно знижувалася при інактивації (наприклад, делеції) обох генів 054 їі 055. Крім того, середня вага тіла у тих птахів, що вижили, інокульованих рРЕМ/Л54О55ає!/ВасМмР2, був порівнянний з вагою при РВ5. Ці результати свідчать про ефективність ОЕМ за винаходом для вакцинації іп омо.
Приклад 6. Конструювання ОЕМ/Соаб5МР2, що містять неактивні гени 054 і 0055
В цьому розділі конструювали ОЕМ з делецією обох генів 054 і 055, які містять ген МР2, керований центральною частиною промотора Вас (промотор Соаб5; 5ЕБО ІЮ МО: 25). Для конструювання цих ОЕМ спочатку конструювали вектори з гомологією, які потім використовували для отримання вірусів шляхом гомологічної рекомбінації в Е. соїї.
Конструювання рОС18-КАРЕМАС-О54И055аеї
Клонували фрагмент ДНК в 1,1 т.н. з генома ОЕМ, який фланкує гени О5З ії 056, за допомогою реакцій ПЛР (Фіг. 4). Якщо коротко, використовуючи ДНК, виділену з ОЕМ як матрицю, проводили 2 реакції ПЛР. Використовували наступні пари праймерів: зЕО ІЮО МО: 17 і
ЗБО І МО: 26 (5-20СТттататласСстааттаАСОассСААТАТО-3), ЗЕБО І МОЇ 27 (5-
САТАТТаССаТСААССАССТАСАСАДОС-3) і БО ІЮ МО: 20 (5-дсСпААТТССАТТААТТСТО
ССОААСТатТтТа-3). Проводили ще одну реакцію ПЛР, використовуючи суміш продуктів ПЛР з
З0 двох попередніх реакцій ПЛР як матрицю і 5ЕО ІО МО: 17 ї БЕО ІЮ МО: 20 в якості праймерів.
Отриманий ПЛР-фрагмент клонували в вектор рОС18 після розщеплення ЕсоКіІ і 5рП|, отримуючи рОС18-КАРЕМАС-О54И55аеї (Фіг. 4).
Конструювання ОЕМ/О54О55аеї
Конструювання рекомбінантного ЮЕМ/О54И55де! з делецією обох генів Ш54 і И55, проводили шляхом гомологічної рекомбінації в несучих геном ОЕМ клітинах БЕ. сої, трансфікованих 0,5 мкг рОС18-КАРЕМАС-О54055деіІ, Клони Е. соїї, які несуть відповідну делецію (ОНТОВ/0ЕМ/І54И55аеї), ідентифікували методом ПЛР за допомогою пари праймерів, які ампліфікують ділянку між Ш5З ії 056 (стик 1, Фіг. 4). Використовували праймери 5ЕО ІЮ МО: 221 5БО ІО МО: 20. З клонів Е. соїї виділяли ДНК ОЕМ і трансфікували в клітини СЕК, отримуючи
РЕМ/О54О55авеІ.
Конструювання рОС18-КАРЕМАС-ЦІ 23деІ-СоабУ Р2
Клонували фрагмент ДНК в 1,0 т.н. з генома ОЕМ, який фланкує гени ШІ 24 ї 122, за допомогою реакцій ПЛР з додаванням сайту розпізнавання 51 в місці вставки (Фіг. 5). Якщо коротко, використовуючи ДНК, виділену з ОЕМ як матрицю, проводили 2 реакції ПЛР.
Використовували наступні пари праймерів: ЗЕО ІО МО: 28 (5- вСаСАТаССААТТаТСТААТТССАС-3) і 5ЕО МО: 29 (Е-СССпСаССААТААСасССАСАСПСААдДАА сСсаса-3), 5ЕО І МО: зо (ї5-статаасСсттАТТ,ааСсСасаАтТСтТааААС-3) і 5ЕО ІО МО: 31 (5-аспААТТСАТатТастТАСасСсССАС-3). Проводили ще одну реакцію ПЛР, використовуючи суміш продуктів ПЛР з двох попередніх реакцій ПЛР як матрицю і 5ЕО ІО МО: 28 і 5ЕО ІЮ МО: 31 в якості праймерів. Отриманий ПЛР-фрагмент клонували в вектор рИиС18 після розщеплення
ЕсокіІ і 5рпї, отримуючи рОС18-КАРЕМАС-ЦІ 23ае!1-51. Потім, використовуючи плазміду РОС18-
КАРЕМАС-ЦШІ 23авє!І-51І, конструювали вектор з гомологією, що містить промотор і МР2-516.
Спочатку розщіплювали рОС18-КАРЕМАС-ЦІ 23авє!-е1їіЇ за допомогою ЗІ і дефосфорилювали за допомогою РАР. Промотор Соаб5 отримували з плазміди рОІСОА (05 Раї. Мо. 6,866,852) шляхом розщеплення Ваїї! ї Храї і лігували з фрагментом ХраїІ!-ЕсокКіІ (6,3 т.н.) і фрагментом
ЕсоВІ-Вай (0,1 тн) з р45/46бБбасмР2-5ТС Ж 11 (05 Раї Мо. 6764684), отримуючи ріб/46СОАБМУР2-БТС Ж 11. Потім з р45/46СОА5МР2-5ТС й 11 вирізали касету з промотором
Соаб5 і МР2-5ТС шляхом розщеплення Ва і лігували з розщепленою 51ї руС18-КАРЕМАС-
ПІ 23ае!І-5ІЇ, отримуючи рОС18-КАРЕМАС-ЦІ 23деІ-Соаб5МР2. Цю плазміду використовували для конструювання ОЕМ/О540О55аейШІ 23/Соаб УР.
Конструювання рОоС18-КАРЕМАС-ШІ 26-Соаб у Р2
Клонували фрагмент ДНК в 1,0 т.н. з генома ОЕМ, який фланкує гени ШІ 26 ї ШІ 27, за допомогою реакцій ПЛР з додаванням сайту розпізнавання 51! в місці вставки (Фіг. б). Якщо коротко, використовуючи ДНК, виділену з ОЕМ як матрицю, проводили 2 реакції ПЛР.
Використовували наступні пари праймерів: ЗЕО ІО МО: 32 (5- с,естопАСАСТоССАсСасатаААдас-3) і БЕО ІЮ МО: 33 (5-ССЧСОаССААТААааССААСААТасСА ттОавасо-3), 5ЕО ІЮ МО: 34 (5-ТсЯаСсСсттТАТТВвСССасССаИатАТОаААТТасас-3) і 5ЕО ІЮ МО: 35 (5-2СХ2сПАаСТоСтТасСсААССАСАСЦАССОС-3). Проводили ще одну реакцію ПЛР, використовуючи суміш продуктів ПЛР з двох попередніх реакцій ПЛР як матрицю і 5ЕО ІЮ МО: 32 і 5БЕО ІЮО МО: 35 в якості праймерів. Отриманий ПЛР-фрагмент клонували в вектор рРОС18 після розщеплення заї ії Засі, отримуючи рОС18-КАРЕМАС-ШІ 26-51І. Потім, використовуючи плазміду РОС18-КАРЕМАС-ЦІ 26-51її, конструювали вектор з гомологією, який містить промотор і ген МР2 ІВОМ зі стандартного провокуючого штаму. Спочатку розщіплювали руС18-КАРЕМАС-
ОЇ 26-51ї за допомогою 51 і дефосфорилювали за допомогою РАР. Потім з РОС18-КАРЕМАС-
ПІ 23аві-Соаб5МР2 вирізали касету з промотором Соа5 і МР2-5ТСО шляхом розщеплення 9ІЇ і лігували з розщепленою 50 рОС18-КАРЕМАС-ШІ 26-51, отримуючи рОС18-КАРЕМАС-ЦІ 26-
Соаб5МР2. Цю плазміду використовували для конструювання ПОЕМ/ОЗ4О55аеймйиїі 26/СоабзмР2.
Конструювання рОоС18-КАРЕМАС-ШІ 45-СоабУ Р2
Клонували фрагмент ДНК в 1,0 т.н. з генома ОЕМ, який фланкує гени ЦІ 45 ї ЦІ 46, за допомогою реакцій ПЛР з додаванням сайту розпізнавання 51їЇ в місці вставки (Фіг. 7). Якщо коротко, використовуючи ДНК, виділену з ОЕМ як матрицю, проводили 2 реакції ПЛР.
Використовували наступні пари праймерів: ЗЕО ІО МО: 36 (5-
Коо) Сс,естоаАСАТАСААСасСастТСАТСТАА-3) і ЗЕО ІЮ МО: 37 (5- ТаОВССААТААаСОССИтТтТАТТ
СТТТАТТАТ-39), 5ЕО ІЮ МО: 38 (5-ССИасСсСТтТАТТааССААТСТаАтТТСАТСОССАА-3) і БЕО ІЮ МО: за (5-асадастоСасстТААТСАСААТССИатАТТОИ-3). Проводили ще одну реакцію ПЛР, використовуючи суміш продуктів ПЛР з двох попередніх реакцій ПЛР як матрицю і ЗЕО ІЮ МО: 36 ії 5ЕО ІО МО: 39 в якості праймерів. Отриманий ПЛР-фрагмент клонували в вектор РОС18 після розщеплення заї ії Засі, отримуючи рОС18-КАРЕМАС-ШІ 45-511І. Потім, використовуючи плазміду РОС18-КАРЕМАС-ЦІ 45-51її, конструювали вектор з гомологією, який містить промотор і ген МР2 ІВОМ зі стандартного провокуючого штаму. Спочатку розщіплювали рОС18-КАРЕМАС-
М 45-51 за допомогою 51 і дефосфорилювали за допомогою РАР. Потім з РОС18-КАРЕМАС-
ПІ 23аві-Соаб5МР2 вирізали касету з промотором Соа5 і МР2-5ТС шляхом розщеплення 5ІЇ і лігували з розщепленою 50 рОС18-КАРЕМАС-ШІ 45-51, отримуючи рОС18-КАРЕМАС-ЦІ 45-
Соаб5МР2. Цю плазміду використовували для конструювання ПОЕМ/ОЗ4О55аемйиі 45/Соаб5мР2.
Конструювання рОоС18-КАРЕМАС-ШІ 50-Соаб у Р2
Клонували фрагмент ДНК в 1,0 т.н. з генома ОЕМ, який фланкує гени ШІ 50 і 01 51, за допомогою реакцій ПЛР з додаванням сайту розпізнавання 51 в місці вставки (Фіг. 8). Якщо коротко, використовуючи ДНК, виділену з ОЕМ як матрицю, проводили 2 реакції ПЛР.
Використовували наступні пари праймерів: ЗЕО ІО МО: 40 (5- сСаСАТаСасСААСТАТАТАТИТОССОССТ 0-3) і 5ЕБЕО ІЮ МО: 41 (5-00Б0ССААТААСааССС
ААДАдДСаИТАСАТТТТИат-3), ЗЕО ІЮ МО: 42 (5-СЧКСОаССТТАТТаасСсСсСААТТТАТТТАСТАТТ-3) і БЕО
ІО МО: 43 (5-ЯССПСААТТСТаспйАТАТОАТАТАСССИЯТТО,С-3). Проводили ще одну реакцію ПЛР, використовуючи суміш продуктів ПЛР з двох попередніх реакцій ПЛР як матрицю і 5ЕО ІЮ МО: 40 ії 5ЕО ІЮО МО: 43 в якості праймерів. Отриманий ПЛР-фрагмент клонували в вектор РОС18 після розщеплення ЕсокіІ і ЗрІїЇ, отримуючи руС18-КАРЕМАС-ИЦІ 50-51їІ. Потім, використовуючи плазміду РОС18-КАРЕМАС-ЦІ 50-51їЇ, конструювали вектор з гомологією, який містить промотор і ген МР2 ІВОМ зі стандартного провокуючого штаму. Спочатку розщіплювали рОС18-КАРЕМАС-
МІ 50-51 за допомогою 51 і дефосфорилювали за допомогою РАР. Потім з РОС18-КАРЕМАС-
ПІ 23аві-Соаб5МР2 вирізали касету з промотором Соа5 і МР2-5ТСО шляхом розщеплення 9ІЇ і лігували з розщепленою 501 рОС18-КАРЕМАС-ШІ 50-51ї, отримуючи рОС18-КАРЕМАС-ШІ 50-
СоабБМРа2. Цю плазміду використовували для конструювання ОБМ/О54О55аемиШІ 50/СоабУ РО.
Конструювання ОБМ/І54О55аеі/СоабвМР2іс
Конструювання рекомбінантних ОЕМ з делецією генів 054 і О55 і несучих ген Соаб5МРа2 в районі Ш123, Ц0126/0127, ЦП145/0146 або 1150/0151 проводили шляхом гомологічної рекомбінації в штамі Е. соїї, трансфікованому ЮЕМ/О54И55аеї і 0,5 мкг однією з рисС18-
КАРЕМАС-ЦІ 23авІ-СоабУР2, рОоС18-КАРЕМАС-ЦІ 26-Соаб УР, роС18-КАРЕМАС-ЦІ 45-
Соаб5МР2 або рОоС18-КАРЕМАС-ОІ 50-Соаб5МР2. Умови трансфекції були описані в прикладі 2.
Після трансфекції клони Е. соїї, які несуть відповідні вставки, що містять ген Соаб5МР2 , ідентифікували методом ПЛР за допомогою пари праймерів, які ампліфікують ділянку між геном
СоабмМРа і районом сайту вставки в геномі ОЕМ (стик 1, Фіг. 5-8). Використовували праймери
ЗЕО ІЮО МО: 23 і 5ЕО ІЮ МО: 28 для сайту вставки Ш/ 23, 5ЕО ІЮ МО: 32 для сайту вставки 0126/0127, 5ЕО ІЮО МО: 36 для сайту вставки ШІ 45/01 46 або 5ЕО ІЮ МО: 40 для сайту вставки
ШО 50/01 51. З клонів Е. соїї, які несуть відповідні вставки, виділяли модифіковані ДНК ОЕМ і трансфікували в клітини СЕРЕ за допомогою Мисіеотесіог ІЇ. Трансфіковані клітини вносили в середовище ІМ (5), висівали в 96-ямкові планшети для тканинних культур, а потім інкубували при 37"С в 4-595 СбО»2г протягом 5-7 днів, поки не проявлявся цитопатичний ефект (СРЕ) ОЕМ.
Після цього виділлли ЮОЕМ5 з неактивними генами 054 і 055, які несуть ген Соаб5МР2 (БЕМ/І54И55аеЦІ 23/СоабУ РО, рЕМ/Л5З4ОО55аєйІ 26/СоабУ Р, рЕМЛБ4И55аецй 45/Соаб5УР2 і ВЕМ/О54О55дейиі 50/СоабМУРа).
Перевірка структури генома
Структури геномів у 0ЕМ/Л54И55дейШІ 23/Соаб5МР2, рЕМ/ІВ4И55аейІ 26/СоабУ РО, рЕМЛІБ4И55децйі 45/Соаб5МР2 і СЕМ/ЛОЗ4О55аеиОІ 50/Соа5МР2 перевіряли за допомогою З реакцій ПЛР, які ампліфікують стикувальні ділянки (стик 1, стик 2 і стик З; Фіг. 5-8) на кожному кінці вставлених генів. Пари праймерів, які використовувалися в реакціях ПЛР для стику 1, описані вище. У реакціях ПЛР для стику 2 використовували пари праймерів ЗЕО ІЮО МО: 24 ії
ЗЕО ІЮО МО: 31 (сайт вставки 023), 5ЕО ІЮО МО: 35 (сайт вставки ШІ 26/0127), 5ЕО ІЮО МО: 39 (сайт вставки 0145/0146 ) або 5ЕО ІЮ МО: 43 (сайт вставки ШІ 50/51). Для стику З використовували пари праймерів 5ЕО ІЮ МО: 28/5БО ІО МО: 31 (сайт вставки ПІ 23), 5ЕО І
МО: 32/5БО ІЮО МО: 35 (сайт вставки ШІ 26/01 27), 5ЕО ІЮ МО: 36/56 ІЮО МО: 39 (сайт вставки
ШІ 45/0146) або 5ЕО ІЮО МО: 40/5ЕБО ІЮ МО: 43 (сайт вставки ШІ 50/01 51). Спостерігалися
Зо очікувані розміри продуктів ПЛР, які підтверджують, що ОЕМ/І54О55ае/Ш1 23/СоабМРа, реЕМЛБ4Ив5аециі 26/Соаб5МУРа, рЕМИЗ4И55демйі 45/СоабМР2 і рЕМ/ЛЗ4О55децЦШІ 50/Соаб5УРаІ2 мають очікувані структури генома.
Приклад 7. Експресія гена МР2 за допомогою ОЕМ/Соаб5МУРІ2, що містять неактивні гени 54 і 55
Експресію білка МР2 під дією рЕМ/ИБВ4И55демйі 23/Соаб5МРаг, рЕМЛБВ4О55дей ШІ 26/Соа5МР2, ОЕМ/ЛО5З4И55аеи0145/Соа5МР2 ої 0 бЕМЛЗ4О55аешйиі 50/
Соа5МРІ2 перевіряли методом чорних бляшок і методом вестерн-блот. Метод чорних бляшок був описаний в прикладі 4. Як видно 3 Фіг 9, в клітинах, інфікованих рЕМ/54О55аемцицІ 23/СоабУ РО, рЕМ/ЛЗ4ОО55аєйІ 26/СоабУ Р, рЕМ/5З4ОО55аєйші 45/
Соаб5МР2 або ОЕМ/О54И55дейШІ 50/Соаб5МР2, спостерігалася експресія білка МР2. Вестерн- блот проводили, використовуючи клітини СЕР, інфіковані ОЕМ/І54О55дециШІ 23/Соаб5МР2, рЕМЛІБ4И55аецйі 26/Соа5МР2, ЕМО З4ИО55аецйШІ 45/Соа5МР2 або БЕМ/ИЗ4И55аейиші 50/
Соаб5МР2, і моноклональне антитіло Кб3 проти МР2 ІВОМ. Якщо коротко, СЕЕ в 12-ямкових планшетах інфікували одним з рекомбінантних вірусів або вихідним ОЕМ. Через 4 дні після інокуляції клітини збирали за допомогою трипсину і центрифугували при 913хд протягом 5 хвилин. Осад промивали РВЗ і ресуспендували в 25 мкл РВ5. Після додавання такого ж обсягу буфера для зразка 2х505 (130 мМ трис-СІ (рн 6,8), 695 5ОБ5, 2095 гліцерину, 1095 2- меркаптоетанолу і 0,0195 бромфенолового синього) клітинну суспензію кип'ятили протягом 5 хв.
Зразки поділяли методом 505-РАСЕ в 12,595 поліакриламідному гелі і переносили на РМОБ- мембрану (ІттобБіоп-Р, Мійїроге). Мембрану повністю висушували, а потім інкубували з моноклональним антитілом К63. Після відмивання антитіла К63 додавали біотинільоване антитіло проти ДС миші, а потім за допомогою набору МЕСТАЗТАІЇМ АВС-АР. Білок, який зв'язався з моноклональним антитілом Кб3, візуалізували додаванням розчину МВТ/ВСІР. На всіх доріжках з рекомбінантними клітинами спостерігалися смуги білка в 40 кД, що є очікуваним розміром білка УРА (Фіг. 10), підтверджуючи, що клітини, інфіковані рекомбінантними вірусами, експресують білок МР2.
Приклад 9. Стабільність ОЕМ/Соа5УРа, що містять неактивні гени 054 і 0055 рЕМ/О54И055деи01 23/Соаб5МР2, бЕМ/О540055деиШ1 26/Соаб5МР2, / ВЕМ/О54О55аеййшІ 45/
Соаб5МР2 і ОЕМ/О54ИО5Б5аеицІ 50/Соаб5МР2 пасували в клітинах СЕРЕ по 15 разів і перевіряли бо стабільність вбудованого гена ВасуР2. Пересівання проводили через кожні 3-4 дні. Після кожних 5 пасажів клітини, інфіковані рЕМИВ4О55аеїШІ 23/Соаб5МРа, рЕМЛБ4И55дейі 26/Соа5МР2, ЕМО З4ИО55аецйШІ 45/Соа5МР2 або БЕМ/ИЗ4И55аєиШІ 50/
Соа5МУРа, перевіряли на експресію гена МР2 методом чорних бляшок і перевіряли структуру їх генома методом ПЛР, ампліфікуючи стикувальні ділянки (стик 1, стик 2 і стик З; Фіг. 5-8) за допомогою праймерів, наведених в прикладі 7. При цьому не спостерігалося реверсії генів 054 і 55 і делеції за геном Соаб5МУРа , що свідчить, що ці віруси стабільні в клітинах СЕР.
Приклад 10. Введення іп омо ОЕМ/Соаб5МР, які містять неактивні гени 054 і 055
У цьому дослідженні вивчали безпеку і ефективність захисту іп омо від вірулентного ІВОМ.
Інокулювали рРЕМ/ЛІЗ4И55аеййцІ 23/Соаб5МР2, рРЕМ/ЛІЗ4И55аемйиїІ 26/СоабмМР2, рЕМ/ЛБВ4И55дей ШІ 45/Соа5уР2 або РЕМ/ЛІ5З4И55аемйОІ 50/Соа5МР2 або вихідний ОЕМ 18- денним ембріонам курчат 5РРЕ. Всі групи ембріонів вакцинували іп омо приблизно по 1000 ріи в 0,1 мл рекомбінантних вірусів, вихідного ОЕМ або 0,1 мл РВ5 через голки 20 калібру в 1,5 дюйма. Курчат спостерігали щодня на наявність пов'язаних з ОЕМ клінічних ознак типу депресії і смерті протягом 42 днів. Щотижня у віці від 1 до 5 тижнів у них брали кров і перевіряли вагу для оцінки гуморального імунітету проти ІВОМ і для перевірки вірулентності вірусів. Визначали антитіла проти ІВОМ за допомогою комерційного набору ІВОМ ЕГІЗА КИ (0 5СКЕЕМ ІВО МР;
ІОМеб). Всім курчатам, крім групи 1, вводили перорально 103 середніх інфекційних доз для ембріонів (ЕІЮ5о) стандартного провокуючого штаму (ЗТС) вірулентного вірусу ІВОМ. Курчат спостерігали щодня на наявність пов'язаних з ІВО клінічних ознак типу депресії і смерті. Через 7 днів після зараження курчат розтинали і обстежували на наявність макроскопічних пошкоджень бурси типу набряку, зміни забарвлення, атрофії, крововиливу і жовтих або желатинозних ексудатів. Також під час розтину вимірювали вагу тіла і бурси для розрахунку індексу В/В, тобто співвідношення між вагою бурси і вагою тіла у заражених птахів, поділеного на таке ж співвідношення у птахів, які не піддавалися зараженню.
Результати цього дослідження свідчать про безпеку, стабільність і ефективність експресії іп мімо.
ПЕРЕЛЕК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«110» СЕВА САНТЕ АНІМАЛЬ «1905 ВІРУС КАЧИНОГО ЕНТЕРИТУ ТА ЙОГО ЗАСТОСУВАННЯ «1305 ва270 «1650» 43 «1705 Патентна версія 3,3 «2105 1 «11» 30 «212» ДНК «213» Штучна «ей» «23» праймер «4005 1 адсстастоаа счасодсово ахсуєтотахт 30 «2105 2 «211» 30 «212: ДНК «213» Штучна «220» «2235 праймер «4005 2 ссатадсяст дсостсадаа даастсоаєса зо «2105 3. «1» 1319 «212» ДНК «2135 Штучна ке» «ві» грі пео «4005 3
Чдасстдотоа гдасдодсодо аїсастостат атттсттоас ассттттсдо сассдссста 60 ааватстссадсо ЕсСстсатате атотаадоас чзЕКЕсаттас отасттасоа аосазаааст 120 аааассадода дстатіїаає досаасадії зассадстод тасодсавзасс асагастсос 180 заазастдсда ааадосаасої дсстдсосто даадсасодсс сосавазасо тодсататот 240 астсакоатає акастассасє ссстаааааа ссовастссо соастосоїаа аотатоассакт 300 дсссоєстоа стазасоосїу сдааотоасті ссстасаєсо асодтоаадоа їсасаасста 360 саадзасаст ссукдатсся дахсссатоос одаїсогоста аадасстссс додіЧЕтсох 420 тассасассо тгасотодіос асттдастос сссуодсоста аадассотаа осадостсуї 480 їссазостату асосодадоасо їсстаацасє Сладоаздасє аассаєдатс даасаачату 540 чдастасасас заціхсстссо ассасстоаао тасзоаваст аєтсаостатє дастадасас 600 засадчасаат садстоастст сатассоссо гаттссддст дссаососац доачсасссудЯ 560 сто ї саацассдас стутссоаота сесестоватоаа астосадцдас садасаайсоає 720 чзастатсата зстдоссасо асаддосаєтс сттосоасаяас сатастсуас пастоссаста 780 задсооадаза одастдастоа статстоддоса азасоссода осаддчатстс стоссатстс 840 ассстасесс єдссуасаза утіаєссаєса єододстдасоає аатосддсЯдо стосатасаає 900 їтдасссодс тасстоассса ттсоассасс ааосоузааса гсосаїтсуад суаосасята 9650 сісодаатада адссосатстє ассдаєсасво атоасстода судавалосає саодчадстсо 1020 сассадссда аскотєсосс апддсссаваод сосоосатосс содасоадсдад датсксотсо 10850 тдасссатад садатодасстос гсоссдаата Ксатостодда ааатодссоє сеттІстодат 1140 тсатсааста гадссочсто дасасодсоч ассастаєтса доадсатадся седастассс 1200 дкдататєттос хаааозвастт досадосоааат саастодсса сЕтсстсоата стттасадта 1260 тїсассасесс содасесасад сосатсасст тстатсасст єсттоасовЯа тІсттістра 1319 «210» 4 -21ї1 30 «2125 ДНК «2132 Штучна «вгйх «га3» праймер «40025 4 асчаастстє седдадсоасад сассаєсдчасс 30 «21025 5 «211: 30 «212» ДНК «213з Штучна «220» «223» праймер «4005 5 їсодадчачу ссаїссстїаа дзастотаахє 30 «-210з: 6 «211» 30 -2122 ДНК «213» Штучна «ай»
«223» праймер «-400» 6 тасадстстє азаодатодсс тсстссоваа 30 «2105 7 «211» 30 «212» ДНК «213» Штучна «220» «223» праймер «40025 7 дсадсдазаа ааатосттта сттотадаааї 30 «2105 8 -2115 Д70 «21255 ДНК «213» Штучна «220» «223» праймер «4300» 8 атаддсаасаа тадааївоастаЯає датастадеє тттгтоддас асосєттаса пдасстадєда 60 таасчасадва 70 «-2105. 3 «2115 70 «212» ДНК «213» Штучна «220» «223» праймер «4005 39 їїааастаат одудаасосутт доаасттсаа дЕсттдосас ссааасаїсо дсадтдаааа 60 азатасттта 70 «2105 10 «2115 70 «212» ДНК «213» Штучна «220» «223» праймер -400» 10 акоасатасад асустасдає сасосодуста оссоєдчасстї таттсєастат досстодасда 60 тдаєсвасаад 70
«2115 Д 7/0 «2125 ДНК «213» Штучна «20» «2232 праймер «414005 їсатассава сааадосата доасасадссс асадуїтсааа аасааадава осадідаааа 60 азатоасттта 70 «2105 12 «11» 30 «212з ДНК «213» Штучна «20 «223» праймер «4005 12 аадтдсатаа аєтазаоасава садстатаса 30 -2105. ВЗ «211» 23 «212» ДНК «213» Штучна «220» «223» праймер «4005 13 їсадзадвас тсотсавода ддс 23 «2105 14 «11» 25 «212з3 ДНК «213» Штучна «20» «223» праймер «00» 14 діссатаєтто асосодзато тдас 25 «2105 15 «2115 29 «212» ДНК «2135 Штучна «220» «223» праймер «й002» 15 саттттаасс от тєаауіса асатсссо9с 23
«21025 16 «211» 27 «2122» ДНК «213» Штучна «20» «223» праймер «400» 16 астдачцатає годассатса аатсста 7 «2105 17 «2115 26 «212» ДНК «213» Штучна «220» «223» праймер «4005 17 дсодсатаста дстдасстаа стІтас 26 «210» 18 «211» 30 «212» ДНК «2135 Штучна «20» «223» праймер «-4005 18 чоасЧдассваї аавосстдас дасаатаєтох 30 «2105. 19 «211» З «217» ДНК «213» Штучна «20» «223» праймер «1005 19 тсавдасстта гЕдассасса Ядстасасаза 30 «2105 20 «211» 30 «212 ДНК «213» Штучна «220» «223» праймер «00» 20 чдсаааттссда їсааттстсс соаастотта 30
«21025 21 «211» 1505 «212» ДНК «213» Штучна «220» «23» рготогег «300» 21 тасадстсад тасатдсаєд стсаєтуссс аїсостаєсс стдсстстсс гастадсЯасю 60 ссссдададчу їдастїсавоа дадассусад дассасстса чдадосоодао дапддастаса 120 сасусадасс ссусієсссс тссссаасаа адсастутдо ааїсазавад дододадодо 180 ддасодачод дсосуєсаса сссссудсссс асассстсас стсуаоотоа дссссасаєє 240 стоастїсасі сессссаїсі ссессссстс сссассссса аїтітотаїєї гатістатттк 300 тсааттаєтт гогосадсоа тодадосооо додадодо99 дсодсососса досододсоя 360 чосадодсса дочасодадс додасоадос доададотос досдосадсс аассададся 420 дсасастссо дзаадстїссії тстаєдаєча дусодсодаса озсдосадесс татаааавоє 480 дааосасоса осодасдода дісостасас дстдссссо ссссдтоссс састссоєсо 540 ссассвсосЯ ссоасссодєсс содстстдає тдассоасоагє астсссасад дсоадсодас 600 часасадссс тЕсСтсстссо дастосаатт адсоусстсодє їтаакддасою стсоттсстє 660 їхстосоадсе дсоєдаааос стсазаддяс хссодоваао ссстксотос додододаос 720 досссдад99 стосотосої дсатосогос охддудоваосо ссососусад стссосастя 780 сссдосадсеі акозасусто содасосодос дсода99св дтдсостссо садтоотасосє 840 дачадчаасо судссддо99 содтуссссо сдоасосодоа ододастосда одододоОаасава 900 ддстоасасос бодаєогосоа сотаад9999 созосадозча отосодасоас досодісода 960 стЧтаасссс ссесстусаєс сесстссссо ааойхєтусєтда дсасоддсссо асттсадато 1020 садодстссо тасодадсЯає дасоасодоаЯс тсоссососс ддодсододад досоддсадо 1080 тадовасосс ддосадуосо ддассасстс додоссодода чдадсесо999 дадодосасо 1140 дсоддссссса дадсодссадс адстоаєсоаад осусаасоао ссдсзоссає госстсттає 1200 часаатсока соачадудсо сачадастсс стєтаасссса заєстотосо дадссоазає 1260 стаддачоасо ссдссосасс сестстадсо восасоддос даадсодчкос дососсодса 1320 дуаадчазаї дддосддоадад сдсстсато сдісоссоса ссассокссс сткстссатс 13850 тссадсстсо одостдтссо сададудасо дстасстсса одддадоасод досаддвасод 1440 даттсдоаст седосотато ассодсодаод тттататстт сесттсстоа єтсстссоса 1500 чесссс 1506 «2105 22 «211» 24 «212» ДНК «213» Штучна «220х «223» праймер «4005 22 зЕссастата ссатоасата дао 24 «9105 23 «211» 20 «212» ДНК «2135 штучна «220» «23» праймер «4005 23 чвадсаастсс дадстдатсс 20 «2105» 24 -2115 Б24 «2125 ДНК -2135 штучна «220» «223» праймер «4005 24 дссаддазаї ссзоддааза адас 24 «2105 25 «2115 Д 274 «21225 ДНК «213» штучна «220» «223» рготостег «А0О» 25 стаксстотос адсдатоддо зсадодод99 до99да9со9с9 сассадосод досодддасоа4я 60 засдачддас дадосоодос дадусодада дотосоодсад садссаатса дадсодсося 120 стссдавачі тІссттттаї досоадоасод содасодсодас чассстатаа ааадсдазоє 180 зсасоадсодоа саодааісос тосоасоастоє стїсудссссу бассссосіс сассоссуєс 0 240 тсдсассосс сассссодсІ стдастдасс дсох 274
«2105 25 «2115 28 «212» днк «213» Штучна «2205 «223» праймер «400» 26 І чсттосотад стодіїтдасо асаатата 28 «2105 27 «211» 25 «2125 ДНК «213» штучна «220» «223» праймер «3002 27 сахтаєсоассЯ Есаассадся асасаддс 28 «2105 28 «211» 25 «2125 ДНК «2132» Штучна «220» «223» праймер «400» 28 асасатасса аттосстаатї їссад 25 «210» 29 «2115 30 «212» ДНК «2135 Штучна «220» «223» праймер «400» 29 сссдассааїє азодссасадч ааазачсасо зо «2102 30 «211» 29 «2123 ДНК «213» Штучна «220» «223» праймер «40025 30 стдтдосстї аттодссодо асстоддаас 29
«2105 31 «211» 23 «212» ДНК «213» штучна «220» «223» праймер «-4005 31 чзсдааєссає одсастасосс сад 23 «2105 32 «2115 25 «212» ДНК «213» Штучна «220» «223» праймер «4005 32 садІсдасасє тсссаддоді даавас 25 «2105 33 «211» 30 «212» ДНК «213» Штучна «220» «223» праймер «400» 33 сдассаатаа доссаадаає осастсасс 30 «210» 34 -2115. 30 «2125 ДНК 2135 Штучна «220» «2232 праймер «-4005 34 каассттасс доссодссота соааєтосос 30 «23105 35 -2115. Д Ц25 «92122 ДНК «213» Штучна «20» «2232 праймер «4005 35 дсоадстсст дсаассасєва ассас 25
«2105 36 «2115 28 «212» ДНК «213» Штучна «220» «223» праймер «4005 36 счассдасат адзасасост тсатстаа 28 «2105 37 «-2115 30 «212» днк «2135 Штучна «220» «223» праймер «4005 37 тддссаатаа садссоатїтат тотітаттах 30 «2105 38 «2115 30 «212: ДНК «213» Штучна «20» «223» праймер «4005 38 садассттасє дассаатсто астсасссагй 0 «2105 39 «211» 30 «212з ДНК «213» Штучна «220» «223» праймер «400» 39 дсдадстссо сстаатсаса ассоддтатто 30 «2105 40 «2115 27 «2122 ДНК «2135 Штучна «220» «223» праймер «4005 40 ссодсатасос застататат дісчаєс 27
«210» 41 «2115 30 «2125 ДНК -213» Штучна «220» Й квгЗ3» праймер «400» 41 дудссааєза дасссадаац тасастетах зо «210» 42 «211» 30 «212» ДНК «2132 Штучна «220» , «223» праймер «400» 42 чдодссттасі доасссваїії атттастатії 30 «2105 43 «211» 28 «212» ДНК «213» Штучна «гг» «223» праймер «-400з 43 чдсдааттсто датаєдатат ассаттос 28
Claims (26)
1. Вірус качиного ентериту (ОЕМ), який містить неактивні гени 054 і 055.
2. ОЕМ за п. 1, в якому гени 054 і 055, незалежно один від одного, піддавалися мутації, делеції або перериванню.
3. ОЕМ за п. 1 або 2, в якому є делеція щонайменше 20 95 кодуючої послідовності Кожного з генів 054 ії Ш55, більш переважно щонайменше 50 95, щонайменше 60 95, щонайменше 70 95, щонайменше принаймні 80 95 або щонайменше 90 965.
4. ОЕМ за будь-яким з пп. 1-3, в якому є делеція міжгенної ділянки між генами Ш54 і О55.
5. ОЕМ за будь-яким з попередніх пунктів, який містить делецію нуклеотидної області, яка включає щонайменше 50 95 гена 054, всю міжгенну ділянку між геном 054 і геном 55 і щонайменше 50 95 гена 055.
6. ОЕМ за будь-яким з попередніх пунктів, який додатково містить неактивний ген ШІ 23, 057 і/або ЦІ 4.
7. ОБМ за п. 6, який містить: (ї) делецію нуклеотидної області, яка включає щонайменше 50 95 гена 054, всю міжгенну ділянку між геном 054 і геном 055 і щонайменше 50 95 гена 055, а також (і) делецію щонайменше 50 95 послідовності гена ЦІ 23.
8. ОЕМ за п. 6, який містить: (ї) делецію нуклеотидної області, яка включає щонайменше 50 95 гена 054, всю міжгенну ділянку між геном 054 і геном 055 і щонайменше 50 95 гена 055, а також (і) делецію щонайменше 50 95 послідовності гена О57.
9. ОЕМ за п. 6, який містить: (ї) делецію нуклеотидної області, яка включає щонайменше 50 95 гена 054, всю міжгенну ділянку між геном 054 і геном 055 і щонайменше 50 95 гена 055, а також (ії) делецію щонайменше 50 95 послідовності гена ЦІ 4.
10. ОЕМ за будь-яким з попередніх пунктів, який додатково містить чужорідну нуклеїнову кислоту.
11. ОЕМ за п. 10, в якому чужорідна нуклеїнова кислота розташовується в неактивному гені 054 або 055.
12. ОЕМ за п. 11, який містить делецію нуклеотидної області, яка включає щонайменше 50 95 гена 054, всю міжгенну ділянку між геном 054 і геном 055 і щонайменше 50 95 гена 055, а чужорідна нуклеїнова кислота розташовується на місці делеції даної області.
13. ОЕМ за п. 10, в якому чужорідна нуклеїнова кислота розташовується в сайті вставки, вибраному з гена ЦІ 4, гена ЦІ 44, міжгенної ділянки ШІ 27-01 26, гена ЦІ 23, міжгенної ділянки ШІ 45-ЦІ 46, міжгенної ділянки ШІ. 50-Ц1І 51, гена 057, міжгенної ділянки 057-058 або гена 0510.
14. ОЕМ за будь-яким з пп. 10-13, в якому чужорідна нуклеїнова кислота кодує антиген або молекулу імуностимулятора, переважно антиген з пташиного патогена.
15. ОЕМ за п. 14, в якому антигеном є антигенний білок або пептид пташиного параміксовірусу типу 1, переважно Е-білок вірусу хвороби Мем/сазЦе (МОМ) або його фрагмент, антигенний пептид вірусу хвороби зитброго, переважно білок УР2 вірусу інфекційного бурситу (ІВОМ) або його фрагмент, антигенний пептид вірусу інфекційного ларинготрахеїту (І-ТМ), переважно білок 98 або його фрагмент, антигенний пептид Мусоріазта даїїзеріїсит, переважно білок 40К або його фрагмент, або антигенний пептид вірусу пташиного грипу, переважно поверхневий білок гемаглютинін (НА) або його фрагмент.
16. ОЕМ за п. 15, в якому антигенним пептидом є білок МР2 ІВОМ або його імуногенний фрагмент або білок гемаглютинін (НА) вірусу грипу або його імуногенний фрагмент.
17. Молекула нуклеїнової кислоти, яка містить геном ОЕМ за будь-яким з попередніх пунктів.
18. Клітина хазяїна, яка містить ОЕМ за будь-яким з пп. 1-16 або молекулу нуклеїнової кислоти зап. 17.
19. Спосіб отримання або реплікації ОЕМ за будь-яким з пп. 1-16, який включає інфікування компетентних клітин молекулою нуклеїнової кислоти за п. 17 або вірусом ОЕМ за п. 1 і витягання рем.
20. ОЕМ за будь-яким з пп. 1-16 або нуклеїнова кислота за п. 17, призначені для вакцинації або імунізації домашніх птахів, переважно курчат.
21. ОЕМ за будь-яким з пп. 1-16 або нуклеїнова кислота за п. 17, призначені для вироблення захисного імунітету у домашніх птахів, переважно у курчат.
22. ОЕМ за п. 20 або 21, який вводиться за допомогою ін'єкції.
23. ОЕМ за будь-яким з пп. 20-22, який вводиться іп омо або в 1-й день, або на 2-й день після Зо вилуплення.
24. Композиція, яка містить ОЕМ за будь-яким з пп. 1-16, нуклеїнову кислоту за п. 17 або клітину- хазяїна за п. 18 і фармацевтично або ветеринарно прийнятний ексципієнт або носій.
25. Композиція за п. 24, яка додатково містить ад'ювант.
26. Вакцинаційний набір для імунізації птахів, який включає наступні компоненти: а) ефективну кількість композиції за п. 24 або 25 і р) засіб для введення композиції птахам. нн птериту: іл. їга ія ТВ ша он ооо ння Мн Штам МБО ПЕК п5е НН те 5? Штам СКК пн ОО НН Штам си нин Штам си це ща ж щя 3Зудя вк Пт Штам КАРЕМАС пн а и а ПН Фіг, 1 Зо
Вірує качиного ентериту пн п їх рон В Як Іо Пі нини син ВОСТВЧКАРЕУАЄ ОВ ХК ВеемРя СУХУ ово пон: НИК ВИЗ е УР Проектор ВАЄ «М, ме ца? ОПО дое ВК п В В С С С кс І ОХ УРо Промотор аю й ння і нн я Стик її о Єлик: Стик Фіг 2 ВЕПЕНИНИ КК о г п Я МЕН КК но: п ОО КЕ КВ МЕТИ по Ж У ОО в еВ
Фіг. З Вірус хачиного ентериту нин пн ке ех їв зв паль ШШЕШШШШТТТТТТ ТТ ТТТТьтуьуьхтхоММИЙ я ПП ТД ння ИСТЕ КАРКАС ен КОТ рення сн ВА сен МВ доню сен ее нн вн нн і звивини чі І стик фіг. 4 їх ЩЕ їх ТНХ їх в ЩІ Вірус вачиного ентериту СТ ТТ МВ Бан) Іе тн хх доза зрза ще
МИ... каже пи АЖ псесрснннн ПИИН в еесетннс и КАреУАЄч ов аю ПОП ОМ ІМ ЖРХ ірнжвклою сот МІХ о ПЕ. М. ДА ПЕУД ВВ СИХ окон й ЗЛИМ, о. св ет В а НН ВО ПИ с на ЗА МЕМ Ка ШБУ УРХ Провина сові Стик сляка уттте яння яти. ст ; г а іх КЕ Вірус хачиного ентериту нн нн І аВлех що ЧК вм са; по ХХХ їх дн дн, вче КАРЕМАЮЬМЯ УР ПОТ КК НХР 0 Прожоторсюве МІЯ Я ШИ СМ Же МК КУА и сов, пон Кан і НА о ся, ен нн С ОХ пос НН с я ПИВ НВ В поки ких ТУЮ ЄтА: 0 Промо сов бутик ї Стик? фТи Стик
Фіг. б : (З Кк» ї5 Та фа лтльно нн нн нн аЖЯТ. 00 Ше 0000 В ВЕНА Мк Зе КАТЕ нях ОО БИ УРИ: Промотор-стюх пежваияни с «аЕ СІ СБ хх НВ тя хе Нео СТ У З ПІІ с пе он ПО О ОО не нн ЗУ УВІ рюрното ОВО діючяжнннхм. Жетеинннннніння блмкї лика «ВЕУ ллилалотототтн ниж їтик З пом Ех, їде зЖ че МкаеКАНЕеАЄЗ ЯВНУ УтІ КОЛІТ ОВ ек я БУ СРХ 0 Промотор СО Он нн З о о НН НН прохамуєа ШО УКХ Промотов СМ і сфтнннню думу Стикоі Стик фену стик а
Фіг. 8 ОКО КВ КОКО ХВО Ва ЗО ово в що п ВИН ВЕД ПЕжАНЕИ Пила панна жУвЕ ЗПлеилаАТУКУ ДИНІ ДлЛленратуви фіг. З І 2 3 й 5 6 59 кДа -- т і кДа Я ПИШИ ПЕ Кх фіг, 10
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP16176834.6A EP3263129A1 (en) | 2016-06-29 | 2016-06-29 | Duck enteritis virus and the uses thereof |
| PCT/EP2017/065987 WO2018002133A1 (en) | 2016-06-29 | 2017-06-28 | Duck enteritis virus and the uses thereof |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA123682C2 true UA123682C2 (uk) | 2021-05-12 |
Family
ID=56321768
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UAA201900802A UA123682C2 (uk) | 2016-06-29 | 2017-06-28 | Вірус качиного ентериту та його застосування |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10821170B2 (uk) |
| EP (2) | EP3263129A1 (uk) |
| JP (1) | JP6990814B2 (uk) |
| CN (1) | CN109789199B (uk) |
| BR (1) | BR112018077210A8 (uk) |
| CA (1) | CA3029108A1 (uk) |
| MX (1) | MX2018016306A (uk) |
| PE (1) | PE20190397A1 (uk) |
| RU (1) | RU2771165C2 (uk) |
| UA (1) | UA123682C2 (uk) |
| WO (1) | WO2018002133A1 (uk) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| PE20180463A1 (es) | 2015-06-30 | 2018-03-06 | Ceva Sante Animale | Virus de la enteritis del pato y usos del mismo |
| CN113249340B (zh) * | 2020-08-19 | 2022-07-19 | 浙江省农业科学院 | 一株双色荧光蛋白标记鸭瘟病毒及其构建方法和应用 |
| CN112852760A (zh) * | 2021-03-04 | 2021-05-28 | 温氏食品集团股份有限公司 | 重组鸭肠炎病毒及其应用 |
| CN114196639B (zh) * | 2021-11-18 | 2023-09-19 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） | 表达3型鸭甲型肝炎病毒p1和3c基因的重组鸭瘟病毒及其构建方法和用途 |
| CN114480301B (zh) * | 2022-01-21 | 2024-04-19 | 中国农业大学 | 预防或治疗禽病毒感染症的疫苗 |
Family Cites Families (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU623333B2 (en) | 1986-01-27 | 1992-05-14 | Syntro Corporation | Attenuated herpesviruses, herpesviruses which include foreign dna encoding an amino acid sequence and vaccine containing same |
| BE1004877A3 (fr) | 1991-05-27 | 1993-02-16 | Solvay | Virus de l'avipox recombinant, culture de cellules infectees par ce virus et vaccins pour la volaille derives de ce virus. |
| US5853733A (en) | 1993-02-26 | 1998-12-29 | Syntro Corporation | Recombinant herpesvirus of turkeys and uses thereof |
| FR2728795B1 (fr) | 1994-12-30 | 1997-03-21 | Rhone Merieux | Vaccin vivant recombinant aviaire, utilisant comme vecteur un virus herpes aviaire |
| FR2757061B1 (fr) | 1996-12-16 | 1999-03-26 | Rhone Merieux | Vaccin vivant recombinant aviaire, utilisant comme vecteur le virus de la laryngotracheite infectieuse aviaire |
| AU2002307749A1 (en) | 2001-05-09 | 2002-11-25 | M's Science Corporation | Composition and method for treating cancer using herpes virus |
| US6764684B2 (en) | 2001-09-28 | 2004-07-20 | Zeon Corporation | Avian herpesvirus-based recombinant infectious bursal disease vaccine |
| US6866852B2 (en) | 2002-01-31 | 2005-03-15 | Zeon Corporation | Recombinant herpesvirus of turkeys and use thereof |
| ES2417019T3 (es) * | 2003-11-13 | 2013-08-05 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Procedimiento de caracterización del virus de la enfermedad de la bursitis infecciosa |
| JP2005287422A (ja) | 2004-03-31 | 2005-10-20 | Nippon Zeon Co Ltd | 組み換えヘルペスウイルス及び多価ワクチン |
| CN102657861A (zh) * | 2010-08-16 | 2012-09-12 | 郑州金森生物科技工程有限公司 | 单纯疱疹病毒ⅰ型基因重组减毒活疫苗及其制备方法 |
| CN102373180B (zh) * | 2011-09-26 | 2013-06-19 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 | 表达禽流感病毒血凝素(ha)基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株及其构建方法和应用 |
| CN102732545B (zh) | 2012-05-08 | 2014-09-24 | 四川农业大学 | 鸭瘟病毒转移载体pUC-ΔgC-EGFP及gC缺失重组株DPV-ΔgC-EGFP |
| WO2014036735A1 (zh) | 2012-09-10 | 2014-03-13 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 | 鸭病毒性肠炎病毒疫苗株作为表达载体在制备预防鸡形目禽类疾病的重组病毒疫苗中的应用 |
| AR097029A1 (es) * | 2013-07-26 | 2016-02-17 | Intervet Int Bv | Aceleración de la respuesta inmune inducida por virus vectorial en aves, composición, uso, método para la vacunación y método para acelerar la respuesta inmune |
| CN104312982A (zh) | 2014-09-17 | 2015-01-28 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 | 表达增强型绿色荧光蛋白基因的鸭瘟病毒重组疫苗株rDEVTK-EGFP及其构建方法和应用 |
| CN104480142A (zh) * | 2014-12-16 | 2015-04-01 | 青岛蔚蓝生物股份有限公司 | 一种鸭瘟病毒基因缺失转移载体及其应用 |
| PE20180463A1 (es) | 2015-06-30 | 2018-03-06 | Ceva Sante Animale | Virus de la enteritis del pato y usos del mismo |
| CN105385663A (zh) | 2015-11-26 | 2016-03-09 | 中国兽医药品监察所 | 鸭肠炎病毒gE、gI双基因缺失病毒株的构建及其应用 |
-
2016
- 2016-06-29 EP EP16176834.6A patent/EP3263129A1/en not_active Withdrawn
-
2017
- 2017-06-28 US US16/313,174 patent/US10821170B2/en active Active
- 2017-06-28 EP EP17736602.8A patent/EP3478318A1/en active Pending
- 2017-06-28 PE PE2018003339A patent/PE20190397A1/es unknown
- 2017-06-28 BR BR112018077210A patent/BR112018077210A8/pt unknown
- 2017-06-28 MX MX2018016306A patent/MX2018016306A/es unknown
- 2017-06-28 CN CN201780040729.3A patent/CN109789199B/zh active Active
- 2017-06-28 JP JP2019521512A patent/JP6990814B2/ja active Active
- 2017-06-28 UA UAA201900802A patent/UA123682C2/uk unknown
- 2017-06-28 CA CA3029108A patent/CA3029108A1/en active Pending
- 2017-06-28 RU RU2019102170A patent/RU2771165C2/ru active
- 2017-06-28 WO PCT/EP2017/065987 patent/WO2018002133A1/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN109789199A (zh) | 2019-05-21 |
| JP2019524154A (ja) | 2019-09-05 |
| RU2019102170A3 (uk) | 2020-09-08 |
| US10821170B2 (en) | 2020-11-03 |
| WO2018002133A1 (en) | 2018-01-04 |
| MX2018016306A (es) | 2019-08-29 |
| EP3263129A1 (en) | 2018-01-03 |
| EP3478318A1 (en) | 2019-05-08 |
| CA3029108A1 (en) | 2018-01-04 |
| RU2019102170A (ru) | 2020-07-29 |
| CN109789199B (zh) | 2022-11-18 |
| US20190151439A1 (en) | 2019-05-23 |
| BR112018077210A8 (pt) | 2022-05-17 |
| JP6990814B2 (ja) | 2022-01-12 |
| RU2771165C2 (ru) | 2022-04-27 |
| BR112018077210A2 (pt) | 2019-04-09 |
| PE20190397A1 (es) | 2019-03-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11730807B2 (en) | Multivalent recombinant avian herpes viruses and vaccines for immunizing avian species | |
| UA123682C2 (uk) | Вірус качиного ентериту та його застосування | |
| US10711255B2 (en) | Duck enteritis virus and the uses thereof | |
| KR20200002834A (ko) | 이종 조류 병원체 항원을 암호화하는 재조합 갈리드 헤르페스바이러스 3형 백신 | |
| US20230372474A1 (en) | Recombinant hvt and uses thereof | |
| RU2714423C2 (ru) | Рекомбинантные вирусы mdv1 и их применение |