CN113249340B - 一株双色荧光蛋白标记鸭瘟病毒及其构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一株双色荧光蛋白标记鸭瘟病毒及其构建方法和应用，属于分子生物学技术领域。本发明构建了一株双色荧光蛋白标记鸭瘟病毒，将红色荧光蛋白(RFP)与病毒囊膜蛋白gC融合，将青色荧光蛋白(CFP)与病毒衣壳蛋白UL35融合。采用rDEV‑UL35CFP‑gCmRFP感染细胞，UL35‑CFP和gC‑mRFP都以融合蛋白的形式表达，说明可同时可视化监测鸭瘟病毒囊膜糖蛋白和衣壳蛋白。因此，所述标记重组病毒为可视化研究病毒定位、病毒蛋白的运输、病毒组装、复制及病毒‑宿主之间的相互作用以及免疫检测奠定了基础。

Description

一株双色荧光蛋白标记鸭瘟病毒及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一株双色荧光蛋白标记鸭瘟病毒及其构建方法和应用。
背景技术
鸭瘟(Duckplague)又名鸭病毒性肠炎(Duck virus enteritis,DVE)，在鸭、鹅和其他雁形目禽类中急性、热性、败血性传染病，病原体为鸭疱疹病毒1型病毒(DEV)。根据2012国际病毒分类委员会的分类将DEV归类于疱疹病毒科、α-疱疹病毒亚科的马立克氏病毒属[1]。
疱疹病毒是一类较大的双链DNA病毒，由被膜、衣壳、核心、囊膜四个部分组成。DEV病毒粒子呈球形，直径为120～180nm。一般来说，DEV基因组长约158kb，由独特长区(UL)、IRS(内部重复序列)、TRS(末端重复序列)和独特短区(US)组成，含78个开放阅读框(ORF)，编码不同的功能蛋白。其中有11个囊膜糖蛋白(gB/UL 27，gC/UL 44，gD/US6，gE/US8，gG/US4，g[Abbreviations DEV:duck enteritis virus；CEFs:chicken embryoembryoblasts；RFLPs:restriction fragment length polymorphisms；mRFP:redfluoreScentprotein；CFP:cyan fluoreScentprotein]H/UL22，gI/US7，gK/UL53，gL/UL1，gM/UL10 and gN/UL49.5)和7个衣壳蛋白(UL38/VP19C，UL18/VP23，VP26/UL35，UL21，UL25，UL19/VP5，UL6)[2,3]。虽然在某些人类疱疹病毒中，这些蛋白的功能得到了广泛的研究，但对于DEV蛋白知之甚少。生物信息学分析表明，DEV UL44编码的gC蛋白由431个aa组成，预测分子量为47.35kDa[4]，但是实际上，Hu Y等的研究表明gC分子量为55kDa，我们推测翻译后的修饰使得gC分子量增加。研究表明gC在DEV感染细胞过程中起着吸附作用，在病毒出芽方面也发挥作用，gC缺失病毒蚀斑面积会增大[5,6]。VP26是单纯疱疹病毒1型最小的衣壳蛋白[7]，DEV UL35基因编码VP26蛋白，由117个aa组成，预测分子量为12.9kDa。DEV VP26被证实是细胞外成熟DEV病毒粒子的组成部分。亚细胞定位表明DEV感染细胞中，VP26首先定位于细胞质，之后转移至细胞核内，并以点状形式聚集于细胞核内[8]。
参考文献
[1]King AMQ,Adams MJ,Carstens EB,Lefkowitz EJ.Virus taxonomy:classification and nomenclature of viruses:Ninth Report of the InternationalCommittee on Taxonomy of Viruses.http://ictvonline.org/virusTaxonomy.asp？version＝2012&bhcp＝1.2012.
[2]Li Y,Huang B,Ma X,Wu J,Li F,Ai W,Song M,Yang H.Molecularcharacterization of the genome of duck enteritis virus.Virology,2009,391:151-161.
[3]Cardone G,Heymann JB,Cheng N,Trus BL,Steven AC.Procapsid assembly,maturation,nuclear exit:dynamic steps in the production ofinfectiousherpesvirions.Adv Exp Med Biol,2012,726:423-439.
[4]Sun K.F.,Cheng A.C.and Wang M.S.,Bioinformatic analysis andcharacteristics of glycoprotein C encoded by the newly identified UL44 geneof duckplague virus,2014,Genetics andMolecular Research 13(2):4505-4515.
[5]Hu Y,Liu X,Zou Z,Jin M.Glycoprotein C plays a role in theadsorption of duck enteritis virus to chicken embryo fibroblasts cells and ininfectivity[J].Virus Res,2013,174(1-2):1-7.
[6]Wang J,Osterrieder N.Generation of an infectious clone of duckenteritis virus(DEV)and ofa vectored DEV expressing hemagglutinin ofH5N1avianinfluenza virus.Virus Res,2011,159(1):23-31.
[7]McNabb D S and Courtney R J.Identification and characterizationofthe herpes simplex virus type 1virion protein encoded by the UL35 openreading frame.J Virol,1992,66(5):2653–2663.
[8]Cai MS,Cheng AC,Wang MS,Chen WP,Zhang X,Zheng SX,Pu Y,Lou KP,ZhangY,Sun L,Wang LL,Zhu DK,Luo QH,Chen XY.Characterization of the duck plaguevirus UL35 gene.Intervirology.2010；53(6):408-416.
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一株双色荧光蛋白标记鸭瘟病毒及其构建方法和应用，红色荧光蛋白与病毒囊膜蛋白gC融合、青色荧光蛋白与病毒衣壳蛋白UL35融合，可视化研究病毒定位、病毒蛋白的运输、病毒组装、复制及病毒-宿主之间的相互作用奠定了基础。
本发明提供了一株双色荧光蛋白标记鸭瘟病毒的构建方法，包括以下步骤：
1)用mRFP-F1(gly)和mRFP-R1引物对从pLVX-mRFP-C1质粒上PCR扩增得到linker-mRFP，将所述linker-mRFP插入pMD19-T-simple载体中，筛选得到pT-linker-mRFP；
2)用kan_RFP-for(PstI)和kan_RFP-rev(PstI)引物对从pEP-kan-S质粒中PCR扩增得到含linker-mRFP1-Pst I-同源臂a-Kan-Pst I-mRFP2的片段P1，利用Pst I酶切位点将所述片段P1克隆至所述pT-linker-mRFP，筛选正向插入克隆pT-linker-mRFP-P1；
3)用CFP-F1(gly-SacI)和CFP-R1引物对从pCMV-C-CFP质粒上PCR扩增得到linker-CFP，将所述linker-CFP插入pMD19-T-simple载体中，筛选得到pT-linker-CFP；
4)用kan_CFP-for(Sac I)和kan_CFP-rev(Sac I)引物对从pEP-kan-S质粒上PCR扩增，得到含CFP1-Sac I-同源臂b-I-SceI-Kan-Sac I-CFP2的片段P2，利用Sac I酶切位点将所述片段P2克隆至所述pT-linker-CFP，得到pT-linker-CFP-P2；
5)用mRFP-gC(c)-F1和mRFP-gC(c)-R1)引物对从pT-linker-mRFP-P1模板PCR扩增得到含linker-mRFP1-Pst I-同源臂a-Kan-Pst I-mRFP2序列的PCR产物，取所述PCR产物转化至pDEV-dGFP/GS1783感受态细胞，通过Bgl II酶切筛选阳性克隆pDEV-kan.gCmRFP；
6)将所述pDEV-kan.gCmRFP导入大肠杆菌中，培养，诱导表达Ⅰ-SceⅠ核酸内切酶后孵育进行Red重组去除Kan基因，筛选阳性克隆pDEV-gCmRFP转化至GS1783细胞中，制备感受态细胞，得到pDEV-gCmRFP/GS1783感受态细胞；
7)用CFP-UL35(c)-F1和CFP-UL35(c)-R1从pT-linker-CFP-P2上扩增含CFP1-SacI-同源臂b-I-SceI-Kan-Sac I-CFP2的PCR产物，将所述PCR产物转化至所述pDEV-gCmRFP/GS1783感受态细胞，筛选阳性克隆pDEV-kan.UL35CFP-gCmRFP；
8)将所述pDEV-kan.UL35CFP-gCmRFP导入大肠杆菌中培养，诱导表达Ⅰ-SceⅠ核酸内切酶后孵育进行Red重组去除Kan基因，筛选的阳性克隆pDEV-UL35CFP-gCmRFP进行拯救，得到双色荧光蛋白标记鸭瘟病毒；
步骤1)～2)和步骤3)～4)之间没有时间顺序的限制。
优选的，步骤1)中所述mRFP-F1(gly)的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；
所述mRFP-R1的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；
步骤1)中所述筛选的方法为用m13(+)和mRFP-R1引物对进行菌落PCR扩增，选择产生mRFP上单一酶切位点Pst I的片段的重组载体；
所述m13(+)的核苷酸序列如SEQ ID No.21所示；
所述mRFP-R1的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。
优选的，步骤2)中所述kan_RFP-for(PstI)的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；
kan_RFP-rev(PstI)的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。
优选的，步骤3)中CFP-F1(gly-SacI)的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示；
所述CFP-R1的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示；
步骤3)中所述筛选的方法为用所述m13(+)和CFP-R1引物对进行菌落扩增，选择产生CFP上单一酶切位点Sac I的片段的重组载体。
优选的，步骤4)中kan_CFP-for(Sac I)的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示；
kan_CFP-rev(Sac I)的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示。
优选的，步骤5)中mRFP-gC(c)-F1的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示；
mRFP-gC(c)-R1)的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示。
优选的，步骤6)或步骤8)中所述培养为在32℃条件下220r·min-1振荡培养过夜；
所述诱导表达Ⅰ-SceⅠ核酸内切酶的方法为将培养得到的菌液转接于CAM-LB培养基中，振荡培养2～4h，加入与所述菌液等体积的2％L-阿拉伯糖，继续培养1h；
所述孵育的方法将诱导表达后的菌体接入42℃水浴摇床培养30min然后再在32℃培养1h；
步骤6)中阳性克隆pDEV-gCmRFP筛选用引物为gC(c).mRFP-JD-F和gC(c).mRFP-JD-R；
所述gC(c).mRFP-JD-F的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示；
所述gC(c).mRFP-JD-R的核苷酸序列如SEQ ID No.16所示。
优选的，步骤7)中所述CFP-UL35(c)-F1的核苷酸序列如SEQ ID No.17所示；
所述CFP-UL35(c)-R1的核苷酸序列如SEQ ID No.18所示；
步骤8)中阳性克隆pDEV-UL35CFP-gCmRFP筛选用引物包括CFP-UL35-JD-F和CFP-UL35-JD-R；所述CFP-UL35-JD-F的核苷酸序列如SEQ ID No.19所示；
所述CFP-UL35-JD-R的核苷酸序列如SEQ ID No.20所示。
本发明提供了所述构建方法得到的双色荧光蛋白标记鸭瘟病毒，包含红色荧光蛋白与病毒囊膜蛋白gC融合基因和青色荧光蛋白与病毒衣壳蛋白UL35融合基因。
本发明提供了所述标记鸭瘟病毒在制备可视化病毒定位、病毒蛋白的运输、病毒组装与复制、病毒宿主相互作用或免疫检测的试剂或试剂盒中的应用。
本发明构建了一株双色荧光蛋白标记的重组鸭瘟病毒，将红色荧光蛋白(RFP)与病毒囊膜蛋白gC融合，将青色荧光蛋白(CFP)与病毒衣壳蛋白UL35融合。通过重组病毒蚀斑大小，rDEV-dGFP、rDEV-gCmRFP、rDEV-UL35CFP-gCmRFP蚀斑面积分别较rDEV-EF1增加了100％、113％和41％。重组病毒的生长曲线结果，不论是上清还是细胞，rDEV-dEF1GFP和rDEV-gCmRFP与对照毒株有基本相似的增殖曲线，而rDEV-UL35CFP-gCmRFP滴度较亲本毒株rDEV-EF1至少下降了100倍。将重组病毒感染细胞中蛋白表达的检测，结果表明采用rDEV-UL35CFP-gCmRFP感染细胞，UL35-CFP和gC-mRFP都以融合蛋白的形式表达。rDEV-UL35CFP-gCmRFP感染CEFs不同时间取样进行共聚焦显微镜观察蛋白定位，gC-mRFP存在于细胞质和细胞膜部分，UL35-CFP早期定位于细胞质和细胞核(24h.p.i.,48h.p.i,72h.p.i)，晚期迁移至细胞核内特定的点状区域，因此，所述标记重组病毒为可视化研究病毒定位、病毒蛋白的运输、病毒组装、复制及病毒-宿主之间的相互作用奠定了基础。
附图说明
图1为本发明中涉及的两个转移载体的构建示意图；
图2为BACs突变体构建流程；
图3为重组突变体克隆的Pst I酶切鉴定结果图，其中1.pDEV-EF1/XbaI；2.pDEV-kan.dGFP/XbaI；3.pDEV-dGFP/XbaI；4.pDEV-dGFP/BglII；5.pDEV-kan.gCmRFP/BglII；6.pDEV-gCmRFP/BglII；7.pDEV-kan.UL35CFP-gCmRFP/BglII；8.pDEV-UL35CFP-gCmRFP/BglII；
图4为重组BACs克隆的PCR鉴定，其中1.pDEV-EF1(2579bp,dgfp-JD-F/R)；2.pDEV-kan.dGFP(1682bp，dgfp-JD-F/R)；3.pDEV-dGFP(643bp，dgfp-JD-F/R)；4.pDEV-dGFP(1870bp，gC(c).mRFP-JD-F/R)；5.pDEV-kan.gCmRFP(3999bp，gC(c).mRFP-JD-F/R)；6.pDEV-gCmRFP(2569bp，gC(c).mRFP-JD-F/R)；7.pDEV-gCmRFP(293bp，CFP-UL35-JD-F/R)；8.pDEV-kan.UL35CFP-gCmRFP(2085bp，CFP-UL35-JD-F/R)；9.pDEV-UL35CFP-gCmRFP(1084bp，CFP-UL35-JD-F/R)；
图5为DEV-EF1，rDEV-dGFP，rDEV-gCmRFP，rDEV-UL35CFP-gCmRFP on CEFs各重组病毒在CEFs上的蚀斑面积测定及比较结果；
图6为病毒生长曲线；
图7为Westernblotting方法检测重组病毒rDEV-gCmRFP感染细胞中gC和mRFP蛋白的表达，M.ECL marker；1.rDEV-dEF1GFP；2.和3.均表示rDEV-gCmRFP；
图8为Western blotting方法检测重组病毒rDEV-UL35CFP-gCmRFP感染细胞中gC-mRFP和UL35-CFP蛋白的表达，其中1.rDEV-EF1；2.rDEV-dGFP；3.rDEV-gCmRFP；4.rDEV-UL35CFP-gCmRFP；M.ECL marker；
图9为gC-mRFP和UL35-CFP蛋白在rDEV-UL35CFP-gCmRFP感染细胞中的定位；其中A.gC-mRFP；B.UL35-CFP；C.merge；
图10为Westernblot分析gC-mRFP的亚细胞定位，其中，1-3细胞质组分：1.rDEV-dGFP；2.rDEV-gCmRFP；3.rDEV-UL35CFP-gCmRFP；4-6膜组分:4.rDEV-dGFP；5.rDEV-gCmRFP；6.rDEV-UL35CFP-gCmRFP；M.ECL marker。
具体实施方式
本发明提供了一株双色荧光蛋白标记鸭瘟病毒的构建方法，具体流程参见图2，包括转移载体pT-linker-mRFP-P1和pT-linker-CFP-P2的构建方法(见图1)和重组BACs克隆的构建方法；
所述转移载体pT-linker-mRFP-P1的构建方法，包括以下步骤：
用mRFP-F1(gly)和mRFP-R1引物对从pLVX-mRFP-C1质粒上PCR扩增得到linker-mRFP，将所述linker-mRFP插入pMD19-T-simple载体中，筛选得到pT-linker-mRFP；所述mRFP-F1(gly)的核苷酸序列优选如SEQ ID No.5所示；所述mRFP-R1的核苷酸序列优选如SEQ ID No.6所示。
在本发明中，所述PCR扩增用酶为KOD FX酶(TOYOBO)，所述PCR扩增按照说明书进行操作即可。所述PCR扩增的反应程序优选为94℃，2min；98℃，10sec；68℃，1min，30个循环。本发明对所述pLVX-mRFP-C1的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的pLVX-mRFP-C1质粒来源即可。在本发明实施例中，所述pLVX-mRFP-C1购自Biovector公司。
在本发明中，所述柔性linker的氨基酸序列优选为GGGGSGGG(SEQ ID No.22)。所述筛选的方法为用m13(+)和mRFP-R1引物对进行菌落PCR扩增，选择产生mRFP上单一酶切位点Pst I的片段的重组载体。所述m13(+)的核苷酸序列优选如SEQ ID No.21所示。单一酶切位点Pst I的片段优选为CTGCAG，为候选P1片段克隆提供酶切位点。
得到pT-linker-RFP后，本发明用kan_RFP-for(PstI)和kan_RFP-rev(PstI)引物对从pEP-kan-S质粒中PCR扩增得到含linker-mRFP1-Pst I-同源臂a-Kan-Pst I-mRFP2的片段P1，利用Pst I酶切位点将所述片段P1克隆至pT-linker-RFP，筛选正向插入克隆pT-linker-mRFP-P1。
在本发明中，所述kan_RFP-for(PstI)的核苷酸序列优选如SEQ ID No.7所示；kan_RFP-rev(PstI)的核苷酸序列优选SEQ ID No.8所示。所述PCR扩增用酶为KOD FX酶(TOYOBO)，所述PCR扩增按照说明书进行操作即可。所述PCR扩增的反应程序优选为94℃，2min；98℃，10sec；68℃，1min，30个循环。本发明对所述pEP-kan-S的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的pEP-kan-S质粒来源即可。在本发明实施例中，所述pEP-kan-S由德国柏林自由大学Dr.N.Osterrieder赠送。片段P1中mRFP1和mRFP2表示mRFP被插入序列分为前后两段。
所述pT-linker-CFP-P2的构建方法，包括以下步骤：
用CFP-F1(gly-SacI)和CFP-R1引物对从pCMV-C-CFP质粒上PCR扩增得到linker-CFP，将所述linker-CFP插入pMD19-T-simple载体中，筛选得到pT-linker-CFP。
在本发明中，所述CFP-F1(gly-SacI)的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示；所述CFP-R1的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示。所述PCR扩增用酶为KOD FX酶(TOYOBO)，所述PCR扩增按照说明书进行操作即可。所述PCR扩增的反应程序优选为94℃，2min；98℃，10sec；68℃，1min，30个循环。本发明对所述pCMV-C-CFP的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的pCMV-C-CFP质粒来源即可。
在本发明中，所述筛选的方法为用所述m13(+)和CFP-R1引物对进行菌落扩增，选择产生CFP上单一酶切位点Sac I的片段的重组载体。所述菌落PCR用酶为KOD FX酶(TOYOBO)，所述PCR扩增按照说明书进行操作即可。所述PCR扩增的反应程序优选为94℃，2min；98℃，10sec；68℃，1min，30个循环。所述CFP上单一酶切位点Sac I为gagctc，为后续片段P2的克隆提供基础。
得到pT-linker-CFP后，本发明用kan_CFP-for(Sac I)和kan_CFP-rev(Sac I)引物对从pEP-kan-S质粒上PCR扩增，得到含CFP1-Sac I-同源臂b-I-SceI-Kan-Sac I-CFP2的片段P2，利用Sac I酶切位点将所述片段P2克隆至pT-linker-CFP，得到pT-linker-CFP-P2。
在本发明中，所述kan_CFP-for(Sac I)的核苷酸序列优选如SEQ ID No.11所示；所述kan_CFP-rev(Sac I)的核苷酸序列优选如SEQ ID No.12所示。所述PCR扩增用酶为KODFX酶(TOYOBO)，所述PCR扩增按照说明书进行操作即可。所述PCR扩增的反应程序优选为94℃，2min；98℃，10sec；68℃，1min，30个循环。本发明对所述pEP-kan-S的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的pEP-kan-S质粒来源即可。
所述重组BACs克隆的方法，优选包括以下步骤：
用mRFP-gC(c)-F1和mRFP-gC(c)-R1)引物对从所述pT-linker-mRFP-P1模板PCR扩增得到含linker-mRFP1-Pst I-同源臂a-Kan-Pst I-mRFP2序列的PCR产物，取所述PCR产物转化至pDEV-dGFP/GS1783感受态细胞，通过Bgl II酶切筛选阳性克隆pDEV-kan.gCmRFP。
在本发明中，所述mRFP-gC(c)-F1的核苷酸序列优选如SEQ ID No.13所示；所述mRFP-gC(c)-R1)的核苷酸序列优选如SEQ ID No.14所示。所述PCR扩增用酶为KOD FX酶(TOYOBO)，所述PCR扩增按照说明书进行操作即可。所述PCR扩增的反应程序优选为94℃，2min；98℃，10sec；68℃，1min，30个循环。所述转化的方法优选为电转化，所述电转化的参数为1800v，0.2mm电击杯，本发明对所述pDEV-dGFP/GS1783的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的pDEV-dGFP/GS1783的来源即可。所述筛选优选为选择经过Bgl II酶切后形成线性质粒的重组质粒为阳性克隆pDEV-kan.gCmRFP。
得到pDEV-kan.gCmRFP后，本发明将所述pDEV-kan.gCmRFP导入大肠杆菌中，培养，诱导表达Ⅰ-SceⅠ核酸内切酶后孵育进行Red重组去除Kan基因，筛选阳性克隆pDEV-gCmRFP转化至GS1783细胞中，制备感受态细胞，得到pDEV-gCmRFP/GS1783感受态细胞。
在本发明中，所述培养优选在32℃条件下220r·min-1振荡培养过夜；所述培养用培养基为CAM-LB液体培养基。所述诱导表达Ⅰ-SceⅠ核酸内切酶的方法优选为将培养得到的菌液转接于CAM-LB培养基中，振荡培养2～4h，加入等量2％L-阿拉伯糖，继续培养1h。所述孵育的方法将诱导表达后的菌体接入42℃水浴摇床培养30min然后再在32℃培养1h。所述筛选优选采用引物进行PCR扩增，扩增产物进行测序。阳性克隆pDEV-gCmRFP筛选用引物为gC(c).mRFP-JD-F和gC(c).mRFP-JD-R。所述gC(c).mRFP-JD-F的核苷酸序列优选如SEQ IDNo.15所示；所述gC(c).mRFP-JD-R的核苷酸序列优选如SEQ ID No.16所示。所述PCR扩增用酶为KOD FX酶(TOYOBO)，所述PCR扩增按照说明书进行操作即可。所述PCR扩增的反应程序优选为94℃，2min；98℃，10sec；68℃，1min，30个循环。本发明对所述制备感受态细胞的方法，没有特殊限制，采用本领域所熟知的制备感受态的方法即可。
得到pT-linker-CFP-P2和pDEV-gCmRFP/GS1783感受态细胞后，本发明用CFP-UL35(c)-F1和CFP-UL35(c)-R1从pT-linker-CFP-P2上PCR扩增含CFP1-Sac I-同源臂b-I-SceI-Kan-Sac I-CFP2的PCR产物，将所述PCR产物转化至所述pDEV-gCmRFP/GS1783感受态细胞，筛选阳性克隆pDEV-kan.UL35CFP-gCmRFP。
在本发明中，所述CFP-UL35(c)-F1的核苷酸序列优选如SEQ ID No.17所示；所述CFP-UL35(c)-R1的核苷酸序列优选如SEQ ID No.18所示。所述PCR扩增用酶为KOD FX酶(TOYOBO)，所述PCR扩增按照说明书进行操作即可。所述PCR扩增的反应程序优选为94℃，2min；98℃，10sec；68℃，1min，30个循环。所述转化的方法优选为电转化，所述电转化的参数为1800v，0.2mm电击杯。
在本发明中，所述筛选的方法优选采用引物扩增目标片段进行测序验证。阳性克隆pDEV-UL35CFP-gCmRFP筛选用引物优选包括CFP-UL35-JD-F和CFP-UL35-JD-R；所述CFP-UL35-JD-F的核苷酸序列优选如SEQ ID No.19所示；所述CFP-UL35-JD-R的核苷酸序列优选如SEQ ID No.20所示。所述PCR扩增用酶为KOD FX酶(TOYOBO)，所述PCR扩增按照说明书进行操作即可。所述PCR扩增的反应程序优选为94℃，2min；98℃，10sec；68℃，1min，30个循环。
得到pDEV-kan.UL35CFP-gCmRFP后，本发明将所述pDEV-kan.UL35CFP-gCmRFP导入大肠杆菌中培养，诱导表达Ⅰ-SceⅠ核酸内切酶后孵育进行Red重组去除Kan基因，筛选的阳性克隆pDEV-UL35CFP-gCmRFP进行拯救，得到双色荧光蛋白标记鸭瘟病毒。
在本发明中，所述去除Kan基因的方法同上述去除Kan基因的方法，在此不做赘述。所述筛选优选采用引物进行PCR扩增进行测序。阳性克隆pDEV-UL35CFP-gCmRFP筛选用引物优选包括CFP-UL35-JD-F和CFP-UL35-JD-R；所述CFP-UL35-JD-F的核苷酸序列优选如SEQID No.19所示；所述CFP-UL35-JD-R的核苷酸序列优选如SEQ ID No.20所示。所述PCR扩增用酶为KOD FX酶(TOYOBO)，所述PCR扩增按照说明书进行操作即可。所述PCR扩增的反应程序优选为94℃，2min；98℃，10sec；68℃，1min，30个循环。本发明对所述拯救的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的拯救病毒的方法即可。
本发明提供了所述构建方法得到的双色荧光蛋白标记鸭瘟病毒，包含红色荧光蛋白与病毒囊膜蛋白gC融合基因和青色荧光蛋白与病毒衣壳蛋白UL35融合基因。
在本发明中，rDEV-UL35CFP-gCmRFP蚀斑面积较亲本毒株(rDEV-EF1)增加了41％，与rDEV-dGFP、rDEV-gCmRFP蚀斑面积的增加(分别为100％、113％)有较大程度的降低。rDEV-UL35CFP-gCmRFP滴度较rDEV-EF1至少下降了100倍。rDEV-UL35CFP-gCmRFP感染细胞，分别以融合蛋白UL35-CFP和gC-mRFP的形式表达。
基于上述标记鸭瘟病毒的性能，本发明提供了所述标记鸭瘟病毒在制备可视化病毒定位、病毒蛋白的运输、病毒组装与复制、病毒宿主相互作用或免疫检测的试剂或试剂盒中的应用。
下面结合实施例对本发明提供的一株双色荧光蛋白标记鸭瘟病毒及其构建方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
菌株：含有鸭瘟病毒细菌人工染色体感染性克隆pDEV-EF1的pDEV-EF1/GS1783由本实验室构建并保存，参见文献Chen,L.；Yu,B.；Hua,J.；Ye,W.；Ni,Z.；Yun,T.；Deng,X.；Zhang,C.Construction ofa full-length infectious bacterial artificialchromosome clone ofduck enteritis virus vaccine strain.Virol.J.2013,10,328；Chen,L.；Yu,B.；Ni,Z.；Hua,J.；Ye,W.；Yun,T.；Zhang,C.Construction andcharacterization ofa recombinant duck enteritis virus expressing E proteinofduck Tembusu virus.ActaAgriculturae Zhejiangensis2015,27(11),1889-1895.(inChinese)。
细胞：9-11日龄SPF鸡胚购自浙江荐量生物技术公司。按常规方法制备鸡胚成纤维细胞(CEFs)。
本文所用引物见表1：
Figure GDA0003651311010000091
注：加在引物上的限制性酶位点用下划线标出，斜体的序列表示原始DEV基因组中没有的附加碱基。
实施例1
1.pT-linker-mRFP-P1的构建：以mRFP-F1(gly)和mRFP-R1作为引物对(见表1)，从pLVX-mRFP-C1(Clontech)质粒模板上，PCR扩增前缀有柔性linker(GGGGSGGG)的mRFP基因插入pMD19-T-simple载体(Takara)，以m13(+)和mRFP-R1引物对进行菌落PCR扩增筛选正向插入克隆pT-linker-mRFP；选mRFP上单一酶切位点Pst I(CTGCAG)；
设计引物kan_RFP-for(PstI)和kan_RFP-rev(PstI)(见表1)，以pEP-kan-S为模板，用于扩增片段P1，P1片段引入PstI-同源臂a-kan-Pst I；利用PstI酶切位点将片段P1克隆至pT-linker-RFP，筛选正向插入克隆pT-linker-mRFP-P1(正向插入，该克隆含有linker-mRFP1-PstI-同源臂a-Kan-PstI-mRFP2片段，mRFP1和mRFP2表示mRFP被插入序列分为前后两段)。
2.pT-linker-CFP-P2的构建：
设计引物对CFP-F1(gly-Sac I)和CFP-R1(见表1)，从pCMV-C-CFP质粒(碧云天生物)模板上，PCR扩增前缀有柔性linker(GGGGSGGG)的CFP基因linker-CFP插入pMD19-T-simple载体(Takara)，用m13(+)和CFP-R1引物对扩增筛选正向插入克隆pT-linker-CFP；选CFP上单一酶切位点(Sac I)gagctc；
设计kan_CFP-for(Sac I)和kan_CFP-rev(Sac I)引物对(见表1)，以pEP-kan-S为模板，用于扩增片段P1，P1片段引入Sac I-同源臂b-I-SceI-kan-Sac I；
利用Sac I酶切位点将片段P2克隆至pT-linker-CFP，筛选正向插入克隆pT-linker-CFP-P2(该克隆含有CFP1-Sac I-同源臂b-I-SceI-Kan-Sac I-CFP2片段，CFP1和CFP2表示CFP被插入序列分为前后两段)。
3.重组BACs克隆的构建
构建pDEV-UL35CFP-gCmRFP克隆通过三次“Red E/T两步重组”完成：
采用“Red E/T两步重组”法构建pDEV-gCmRFP。用mRFP-gC(c)-F1和mRFP-gC(c)-R1(表1)引物对，从pT-linker-mRFP-P1模板扩出含linker-mRFP1-PstI-同源臂a-Kan-PstI-mRFP2序列的PCR产物，取100ng纯化的PCR产物(1856bp)电转至pDEV-dGFP/GS1783感受态细胞，通过Bgl II酶切筛选阳性克隆pDEV-kan.gCmRFP，同时用gC(c).mRFP-JD-F和gC(c).mRFP-JD-R引物对扩增片段进行测序验证。
将含pDEV-kan.gCmRFP的菌体于液体培养基，于32℃220r·min-1培养过夜，次日转接于2mL CAM-LB中，振荡培养2～4h，加入等量2％L-阿拉伯糖，继续培养1h诱导表达Ⅰ-SceⅠ核酸内切酶，然后再转入42℃水浴摇床培养30min进行Red重组去除Kan基因，最后32℃培养1h。将细菌悬液作10-3～10-5稀释后涂布于CAM平板，32℃孵育24～48h，挑取菌落同时点种于CAM和Kan平板。Xba I酶切分析Cam阳性和Kan阴性的菌落，以筛选正确重组的克隆。
最后，构建pDEV-UL35CFP-gCmRFP，用CFP-UL35(c)-F1和CFP-UL35(c)-R1(表1)从pT-linker-CFP-P2模板扩出PCR片段(含CFP1-Sac I-同源臂b-I-SceI-Kan-Sac I-CFP2)，取100ng纯化的PCR产物(1898bp)电转至pDEV-gCmRFP/GS1783感受态细胞，阳性克隆pDEV-kan.UL35CFP-gCmRFP通过Bgl II酶切筛选和用CFP-UL35-JD-F和CFP-UL35-JD-R引物对(表1)扩增重组插入片段进行测序获得。
最后通过同源臂b进行第二步Red重组去除Kan基因，筛选获取阳性克隆pDEV-UL35CFP-gCmRFP。
对比例1
“Red E/T两步重组”法从pDEV-EF1基因组删除pEF1-GFP构建pDEV-dGFP的过程。
将pDEV-EF1/GS1783菌株接种于氯霉素(CAM)抗性的LB培养基中，32℃220r·min-1培养至OD600为0.5～0.7，42℃水浴摇床摇15min以诱导Red重组酶表达，按常规方法制备电转化感受态细胞。以pEP-kan-S质粒为模板，用引物DEV-dEF1-gfp-for和DEV-dEF1-gfp-rev(表1)(部分序列分别与dEF1-gfp在pDEV-EF1基因组中的上下游序列同源)，从pEP-kan-S模板中扩增出含有KAN基因的PCR片段，胶回收纯化片段，取200ng电转化至pDEV-EF1/GS1783感受态细胞中，涂布于CAM/卡那霉素(Kan)双抗性平板上，于32℃培养36h。挑取阳性克隆提取质粒，Xba I酶切筛选正确重组的克隆(pDEV-kan.dGFP)进行第二次重组。
第二步Red重组将pDEV-kan.dGFP质粒中的Kan抗性基因删除。具体方法为:接种pDEV-kan.dGFP菌落于液体培养基，于32℃220r·min-1培养过夜，次日转接于2mL CAM-LB中,振荡培养2～4h，加入等量2％L-阿拉伯糖，继续培养1h诱导表达Ⅰ-SceⅠ核酸内切酶，然后再转入42℃水浴摇床培养30min进行Red重组，最后32℃培养1h。将细菌悬液作10-3～10-5稀释后涂布于CAM平板，32℃孵育24～48h，挑取菌落同时点种于CAM和Kan平板。Xba I酶切分析Cam阳性和Kan阴性的菌落，以筛选正确重组的克隆(pDEV-dGFP)。
以pDEV-dGFP为模板，用鉴定引物对dgfp-JD-F and dgfp-JD-R(序列见表1)进行PCR扩增，送产物至上海博尚生物技术有限公司测序。
对比例2
rDEV-gCmRFP的构建方法
1)用mRFP-F1(gly)和mRFP-R1引物对从pLVX-mRFP-C1质粒上PCR扩增得到linker-mRFP，将所述linker-mRFP插入pMD19-T-simple载体中，筛选得到pT-linker-mRFP；
2)用kan_RFP-for(PstI)和kan_RFP-rev(PstI)引物对从pEP-kan-S质粒中PCR扩增得到含linker-mRFP1-Pst I-同源臂a-Kan-Pst I-mRFP2的片段P1，利用Pst I酶切位点将所述片段P1克隆至pT-linker-RFP，筛选正向插入克隆pT-linker-mRFP-P1；
3)用mRFP-gC(c)-F1和mRFP-gC(c)-R1)引物对从pT-linker-mRFP-P1模板PCR扩增得到含linker-mRFP1-Pst I-同源臂a-Kan-Pst I-mRFP2序列的PCR产物，取所述PCR产物转化至pDEV-dGFP/GS1783感受态细胞，通过Bgl II酶切筛选阳性克隆pDEV-kan.gCmRFP；
4)将所述pDEV-kan.gCmRFP导入大肠杆菌中，培养，诱导表达Ⅰ-SceⅠ核酸内切酶后孵育进行Red重组去除Kan基因，筛选阳性克隆pDEV-gCmRFP转化至GS1783细胞中，制备感受态细胞，得到pDEV-gCmRFP/GS1783感受态细胞；
5)病毒拯救得到rDEV-gCmRFP。
实施例2
重组病毒的拯救
用碱裂解法分别提取实施例1、对比例1和对比例2制备的BAC的DNAs，根据Promega磷酸钙转染试剂盒说明书转染鸡胚成纤维细胞CEFs，于37℃5％CO2继续培养，待出现70～80％病变后收取病毒，拯救的病毒分别命名为rDEV-dGFP、rDEV-gCmRFP和rDEV-UL35CFP-gCmRFP。
重组BAC克隆的构建
分别提取各突变体克隆及Kan中间体DNA，经过Xba I或Bgl II酶切鉴定(图3)，电泳图谱(图3中右图)与以参考序列GenBank(EU082088.2)进行预测的结果(图3中左图)基本一致，且以引物对dgfp-JD-F/R和CFP-UL35-JD-F/R进行PCR扩增片段测序结果也与预期一致(图4)，说明外源基因按照预期结果插入。
实施例3
重组病毒蚀斑大小的测定
将rDEV-EF1、rDEV-dGFP、rDEV-gCmRFP和rDEV-UL35CFP-gCmRFP病毒冻存液用不同稀释度进行稀释，接种于6孔板中的单层CEFs上，2h后，换上含有1.5％甲基纤维素的DMEM培养基，放于37℃的CO2培养箱培养48h，在荧光显微镜下每种病毒各拍100张蚀斑照片，用Image J软件来测量不同病毒的蚀斑面积，计算各病毒的平均值，将rDEV-EF1蚀斑面积设成100％，其他病毒蚀斑面积以之为标准换算成百分比。用SPSS11.5软件对这些数据进行统计学分析。
重组病毒蚀斑大小的测定结果
4株病毒感染CEFs细胞48h后，各拍摄病毒蚀斑照片100个，并用Image J软件测量各个蚀斑面积并计算平均值。将各病毒的蚀斑面积与rDEV-EF1进行比较，发现rDEV-dGFP、rDEV-gCmRFP、rDEV-UL35CFP-gCmRFP蚀斑面积分别较rDEV-EF1增加了100％、113％和41％(图5)。
实施例4
生长曲线检测
以常规病毒学方法测定rDEV-EF1、rDEV-dGFP、rDEV-gCmRFP和rDEV-UL35CFP-gCmRFP的体外增殖特性。CEFs细胞单层接种0.02MOI病毒后，依次吸附90min，PBS(pH 7.2)洗涤2次，以冰浴的CBS缓冲液(40mmol/L柠檬酸钠、10mmol/L氯化钾、135mmol/L氯化钠，pH值3.0)处理3min，PBS(pH值7.2)洗涤2次，加入1mL维持液继续培养。接种后6、12、24、36、48、60、72、84、96和108h分别收集细胞培养上清和细胞，细胞用PBS(pH值7.2)洗涤2次，重悬于1mL无血清DMEM培养液中，用组织研磨器Tissuelyser-24裂解细胞，离心收集上清即为细胞裂解液。收集的上清和细胞裂解液冻存于-80℃直至进行滴度测定。分别取100μL细胞培养上清和细胞裂解液按照常规的方法测定TCID50，每个稀释度重复接种3孔。计算上述各时间点收获的病毒毒价，绘制病毒在体外的多步生长曲线。
重组病毒的生长曲线结果
测定重组病毒rDEV-dEF1GFP、rDEV-gCmRFP、rDEV-UL35CFP-gCmRFP的生长曲线，并与rDEV-EF1进行了比较，结果表明(如图6所示)，无论是上清还是细胞，rDEV-dEF1GFP和rDEV-gCmRFP与对照毒株有基本相似的增殖曲线，而rDEV-UL35CFP-gCmRFP滴度较rDEV-EF1至少下降了100倍。
实施例5
重组病毒感染细胞中UL35-CFP和gC-mRFP蛋白的表达分析
分别接种rDEV-EF1、rDEV-dGFP、rDEV-gCmRFP和rDEV-UL35CFP-gCmRFP于CEFs细胞中，培养72h，PBS(pH值7.0)洗涤三次，收获细胞。细胞样品于SDS-PAGE电泳完毕，采用半干转移法将蛋白转移至PVDF膜上，取出PVDF膜，放入封闭液中4℃封闭过夜。转膜细胞样品准备两份，分别以兔抗GFP多克隆抗体为一抗(碧云天生物技术有限公司)检测UL35-CFP蛋白的表达，以兔抗mRFP多克隆抗体(Abcam)和鼠抗gC多克隆抗体(本实验室制备)为一抗检测gC-mRFP蛋白的表达，HRP标记的山羊抗兔IgG(1：5000稀释)或HRP标记的山羊抗鼠IgG(1：5000稀释)作为二抗于37℃孵育1h，最后用ECL方法进行显色。
用细胞膜和细胞质蛋白提取试剂盒(碧云天生物技术有限公司)抽提病毒感染的亚细胞组分，然后用Westernblot方法检测gC-RFP在细胞内的定位。
重组病毒感染细胞中蛋白表达的检测结果
gC和mRFP分子量分别为55kDa和27kDa，因而，gC-mRFP蛋白分子量应该为82kDa。
UL35和CFP分子量分别为12.9kDa和27kDa，因此，UL35-CFP融合蛋白分子大约为39.9kDa。首先，检测了rDEV-gCmRFP感染细胞中gC和mRFP的表达情况。结果表明，当以mRFP多抗作为一抗检测时，与对照毒株rDEV-dGFP感染细胞相比，rDEV-gCmRFP感染细胞中检测到了分子量位于75～90kDa间的两条分子量差异极小的特异性条带，根据分子量推测，为融合蛋白gC-mRFP(图7中左图)。当用鼠抗gC多克隆抗体进行检测时，对照毒株rDEV-dGFP感染细胞中也出现了两条分子量差异极小的特异性条带，分子量约55kDa，为gC单体蛋白；而rDEV-gCmRFP感染细胞中与用mRFP多抗作为一抗检测时出现的结果一致(图7中右图)，说明分子量位于75～90kDa间的两条分子量差异极小的特异性条带是gC-mRFP融合蛋白。检测到了两条gC或gC-mRFP蛋白带，推测两条带的产生要么是蛋白翻译后修饰所致，要么DEVUL44(gC)也与MDVUL44一样，存在着可变体。
分别用兔抗GFP多抗(也识别CFP)和兔抗mRFP多克隆抗体检测了rDEV-UL35CFP-gCmRFP病毒感染细胞中UL35-CFP和gC-mRFP的表达。
结果表明当用兔抗GFP多抗作为一抗时，与rDEV-dGFP和rDEV-gCmRFP感染的细胞相比，rDEV-UL35CFP-gCmRFP感染细胞中出现了分子量为40kDa的特异性条带(图8中左图)。用兔抗mRFP多克隆抗体作为一抗时，rDEV-gCmRFP和rDEV-UL35CFP-gCmRFP感染细胞较rDEV-EF1和rDEV-dGFP感染细胞在80多KDa的位置多出了特异性的蛋白条带(图8中右图)。这些结果表明rDEV-UL35CFP-gCmRFP感染细胞，UL35-CFP和gC-mRFP都以融合蛋白的形式存在。
实施例6
共聚焦显微镜检测蛋白定位
将病毒接种于6孔板的细胞爬片上，在接种后不同时间(6h、12h、24h、48h、72h、84h和96h)，置于共聚焦荧光显微镜下(LeicaTCS-SP5)观察蛋白在病毒的细胞内定位。
共聚焦显微镜观察蛋白定位结果
rDEV-UL35CFP-gCmRFP感染CEFs不同时间取样，在共聚焦显微镜下进行观察。结果表明，在病毒感染24之前基本看不到荧光，gC-mRFP在病毒感染整个周期定位于细胞质和膜，而UL35-CFP早期定位于细胞质和细胞核(24h.p.i.，48h.p.i，72h.p.i)，晚期迁移至细胞核内特定的点状区域(84h.p.i，96h.p.i)(图9)。
对rDEV-UL35CFP-gCmRFP感染细胞中的亚细胞组分用mRFP抗体作为一抗进行Westernblot分析，发现gC-mRFP存在于细胞质和细胞膜部分(图10)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江省农业科学院
<120> 一株双色荧光蛋白标记鸭瘟病毒及其构建方法和应用
<160> 22
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 88
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agtaaaacct ctacaaatgt ggtatggctg attatgatca gttaagcccg gttaacgtgc 60
cggcacagga tgacgacgat aagtaggg 88
<210> 2
<211> 91
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaaatacctg gttacccagg ccgtgccggc acgttaaccg ggcttaactg atcataatca 60
gccatacaac caattaacca attctgatta g 91
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccgcctacta tcaaaccc 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atcagcgtga gactacga 18
<210> 5
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggcggaggcg gatctggcgg aggcatggcc tcctccgagg acgt 44
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggcgccggtg gagtggcggc c 21
<210> 7
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aactgcagga cggcgagttc atctacaagg tgaagctgcg cggcaccaac ttcccctcag 60
gatgacgacg ataagtaggg 80
<210> 8
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aactgcagca accaattaac caattctgat tag 33
<210> 9
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggaggcggtg ggtccggagg tggtatggtg agcaagggcg aggagctctt c 51
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cttgtacagc tcgtccatgc c 21
<210> 11
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
aagagctctt caccggggtg gtgcccatcc tggtcgagct ggacggcgac gtaaacggag 60
gatgacgacg ataagtaggg 80
<210> 12
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
aagagctcca accaattaac caattctgat tag 33
<210> 13
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gtcgtttatt tatcaaaagc tttattaaac attttatatt aaaccagtat tcaggcgccg 60
gtggagtggc ggcc 74
<210> 14
<211> 77
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
taattatggc cgtttgtttc tattattcgc gagataaagc agacaatatt attggcggag 60
gcggatctgg cggaggc 77
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tgctgatagg acttgcaatc gc 22
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cgaacactga ctgcaacagt acg 23
<210> 17
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
atactcaata aaagctttta tgaatcttta ttgaatcata ctcatttatt ttacttgtac 60
agctcgtcca tgcc 74
<210> 18
<211> 77
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tcaagcgcac cttttctcca cgcatcatac gcgacgcgcc agacgatcag cgaggaggcg 60
gtgggtccgg aggtggt 77
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gttcgcacat caataatagc 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
cttactacca tacgcagagc 20
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
cgccagggtt ttcccagtca cgac 24
<210> 22
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
1 5

Claims (7)

1.一株双色荧光蛋白标记鸭瘟病毒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）用mRFP-F1(gly)和mRFP-R1引物对从pLVX-mRFP-C1质粒上PCR扩增得到linker-mRFP，将所述linker-mRFP插入pMD19-T-simple载体中，筛选得到pT-linker-mRFP；
所述mRFP-F1(gly)的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；
所述mRFP-R1的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；
2）用kan_RFP-for(PstI)和kan_RFP-rev(PstI)引物对从pEP-kan-S质粒中PCR扩增得到含linker-mRFP1-Pst I-同源臂a-Kan-Pst I- mRFP2的片段P1，利用Pst I酶切位点将所述片段P1克隆至所述pT-linker-mRFP，筛选正向插入克隆pT-linker-mRFP-P1；
所述kan_RFP-for(PstI)的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；
所述kan_RFP-rev(PstI)的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示；
3）用CFP-F1(gly-SacI)和CFP-R1引物对从pCMV-C-CFP质粒上PCR扩增得到linker-CFP，将所述linker-CFP插入pMD19-T-simple载体中，筛选得到pT-linker-CFP；
所述CFP-F1(gly-SacI)的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示；
所述CFP-R1的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示；
4）用kan_CFP-for(Sac I)和kan_CFP-rev(Sac I)引物对从pEP-kan-S质粒上PCR扩增，得到含CFP1-Sac I-同源臂b-I-SceI-Kan-Sac I-CFP2的片段P2，利用Sac I酶切位点将所述片段P2克隆至所述pT-linker-CFP，得到pT-linker-CFP-P2；
所述kan_CFP-for(Sac I)的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示；
所述kan_CFP-rev(Sac I)的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示；
5）用mRFP-gC(c)-F1和mRFP-gC(c)-R1)引物对从pT-linker-mRFP-P1模板PCR扩增得到含linker-mRFP1-Pst I-同源臂a-Kan-Pst I- mRFP2序列的PCR产物，取所述PCR产物转化至pDEV-dGFP/GS1783感受态细胞，通过Bgl II酶切筛选阳性克隆pDEV-kan.gCmRFP；
所述mRFP-gC(c)-F1的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示；
所述mRFP-gC(c)-R1)的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示；
所述pDEV-dGFP是从pDEV-EF1基因组删除pEF1-GFP构建得到；
所述删除pEF1-GFP所用引物为DEV-dEF1-gfp-for和DEV-dEF1-gfp-rev；所述DEV-dEF1-gfp-for的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述DEV-dEF1-gfp-rev的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
6）将所述pDEV-kan.gCmRFP导入大肠杆菌中，培养，诱导表达Ⅰ-SceⅠ核酸内切酶后孵育进行Red重组去除Kan基因，筛选阳性克隆pDEV- gCmRFP转化至GS1783细胞中，制备感受态细胞，得到pDEV-gCmRFP /GS1783感受态细胞；
7）用CFP-UL35 (c)-F1和CFP-UL35 (c)-R1从pT-linker-CFP-P2上扩增含CFP1-Sac I-同源臂b-I-SceI-Kan-Sac I -CFP2的PCR产物，将所述PCR产物转化至所述pDEV-gCmRFP /GS1783感受态细胞，筛选阳性克隆pDEV-kan.UL35CFP-gCmRFP；
所述CFP-UL35 (c)-F1的核苷酸序列如SEQ ID No.17所示；
所述CFP-UL35 (c)-R1的核苷酸序列如SEQ ID No.18所示
8）将所述pDEV-kan.UL35CFP-gCmRFP导入大肠杆菌中培养，诱导表达Ⅰ-SceⅠ核酸内切酶后孵育进行Red重组去除Kan基因，筛选的阳性克隆pDEV- UL35CFP-gCmRFP进行拯救，得到双色荧光蛋白标记鸭瘟病毒；
步骤1）~2）和步骤3）~4）之间没有时间顺序的限制。
2.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，步骤1）中所述筛选的方法为用m13(+)和mRFP-R1引物对进行菌落PCR扩增，选择产生mRFP上单一酶切位点Pst I的片段的重组载体；
所述m13(+)的核苷酸序列如SEQ ID No.21所示；
所述mRFP-R1的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。
3.根据权利要求2所述构建方法，其特征在于，步骤3）中所述筛选的方法为用所述m13(+)和CFP-R1引物对进行菌落扩增，选择产生CFP上单一酶切位点Sac I的片段的重组载体。
4.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，步骤6）或步骤8）中所述培养为在32℃条件下220 r·min-1振荡培养过夜；
所述诱导表达Ⅰ-SceⅠ核酸内切酶的方法为将培养得到的菌液转接于CAM-LB培养基中，振荡培养2~4 h，加入与所述菌液等体积的2% L-阿拉伯糖，继续培养1 h；
所述孵育的方法将诱导表达后的菌体接入42℃水浴摇床培养30 min然后再在32℃培养1 h；
步骤6）中阳性克隆pDEV-gCmRFP筛选用引物为gC(c).mRFP-JD-F 和gC(c).mRFP-JD-R；
所述gC(c).mRFP-JD-F的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示；
所述gC(c).mRFP-JD-R的核苷酸序列如SEQ ID No.16所示。
5.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，步骤8）中阳性克隆pDEV- UL35CFP-gCmRFP筛选用引物为CFP-UL35-JD-F和 CFP-UL35-JD-R；所述CFP-UL35-JD-F的核苷酸序列如SEQ ID No.19所示；
所述CFP-UL35-JD-R的核苷酸序列如SEQ ID No.20所示。
6.权利要求1~5任意一项所述构建方法得到的双色荧光蛋白标记鸭瘟病毒，其特征在于，包含红色荧光蛋白与病毒囊膜蛋白gC融合基因和青色荧光蛋白与病毒衣壳蛋白UL35融合基因。
7.权利要求6所述标记鸭瘟病毒在制备可视化病毒定位、病毒蛋白的运输、病毒组装与复制、病毒宿主相互作用或免疫检测的试剂或试剂盒中的应用。
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