MXPA04006001A - Metodo para la recuperacion y purificacion de poxvirus de celulas infectadas. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a un metodo para la recuperacion de poxvirus, en particular virus Vaccina Ankara modificado (MVA), a partir de celulas infectadas. De acuerdo a la presente invencion las celulas infectadas por virus se someten a una homogeneizacion de alta presion para obtener un homogenato que contiene virus. El homogenato que contiene virus puede ser sometido a al menos una etapa de purificacion para obtener una fraccion enriquecida con poxvirus. La invencion ademas se refiere a una fraccion que contiene virus y el homogenato que contiene virus obtenido por el metodo de acuerdo a la presente invencion.

Description

METODO PARA LA RECUPERACION Y PURIFICACION DE POXVIRUS DE CELULAS INFECTADAS La presente invención se refiere a un método para la recuperación de poxvxrus, en particular virus Vaccinia Ankara modificado (MVA, por sus siglas en inglés) , a partir de células infectadas. De acuerdo a la presente invención las células infectadas por poxvirus se someten a una homogeneización de alta presión para obtener un homogenato que contiene poxvirus. El homogenato que contiene poxvirus puede ser sometido a al menos una etapa de purificación para obtener una fracción enriquecida con poxvirus. La invención además se refiere a una fracción que contiene poxvirus y el homogenato que contiene poxvirus obtenido por el método de acuerdo a la presente invención.

Antecedentes de la invención El poxviridae comprende una gran familia de virus de ADN complejos que replican en el citoplasma de células de vertebrados e invertebrados. La familia de poxviridae puede ser dividida en la subfamilia de chordopoxvirinae (poxvirus de vertebrado) y entomopoxvirinae (poxvirus de insectos) . El chordopoxvirinae comprende varios poxvirus de animales (clasificados en diferentes géneros) de una significante importancia económica, tal como virus de camolpox, virus de sheeppox, virus de goatpox o avipoxvirus, en particular fowlpoxvirus . Para la vacunación de ganado contra virus vivo atenuado de sheeppox y goatpox y vacunas inactivadas están disponibles. Para la vacunación de aves de corral, han sido desarrolladas vacunas recombinantes que utilizan virus de fowlpox como un vector. Puesto que los virus de fowlpoxvirus infectan células humanas, se supone que pueden también ser utilizados como un vector para expresar genes heterólogos en humanos e inducir una respuesta inmune correspondiente. Los fowlpoxvirus que contiene genes de VIH en el genoma están descritos en US 5,736,368 y US 6,051,410. En humanos el virus de la viruela, un miembro del género Orthopoxvirus, fue con mucho el poxvirus más importante. El virus de Vaccinia, también un miembro del género de Orthopoxvirus en la familia de Poxviridae, se utilizó como vacuna viva para inmunizar contra smallpox. En forma exitosa la vacunación mundial con virus Vaccinia culminó en la erradicación del virus de la viruela (La erradicación global de smallpox. Reporte final de la comisión global para la certificación de la erradicación de smallpox; History of Public Health, No. , Génova: Organización Mundial de la Salud, 1980) . Desde aquella declaración de la Organización Mundial de la Salud, la vacunación ha sido descontinuada por muchos años excepto para la gente con alto riesgo de infecciones por poxvirus (e.g., trabajadores de laboratorio) . Los programas de vacunación se han vuelto nuevamente de interés en vista del riesgo de que el virus de la viruela sea utilizado en guerras biológicas o por bioterroristas . Más recientemente, los virus Vaccinia han sido también utilizados para ingeniería de vectores virales para la expresión de gen recombinante y para el uso potencial como vacunas vivas recombinantes ( ackett, M. , Smith, G.L. y Moss, B. [1982] P.N.A.S USA 79,7415-7419; Smith, G.L., Mackett, . y Moss, B. [1984] Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 2, 383-407) . Esto vincula secuencias de ADN (genes) , que codifican para antígenos extraños que son introducidos, con la ayuda de técnicas de recombinación de ADN, en el genoma de los virus Vaccinia. Si el gen es integrado en el sitio en el ADN viral que no es esencial para el ciclo de vida del virus, es posible para el virus Vaccinia recombinante nuevamente producido ser infeccioso, es decir capaz de infectar células extrañas y por consiguiente expresar la secuencia de ADN integrada (Solicitudes de Patente EP No. 83,286 y No. 110,385) . Los virus Vaccinia recombinantes preparados de esta manera puede ser utilizados, por un lado, como vacunas vivas para la profilaxis de enfermedades infecciosas, por otro lado, para la preparación de proteínas heterólogas en células eucarióticas . El uso de virus Vaccinia como vector para el desarrollo de vacunas vivas recombinantes ha sido afectado por cuestiones de seguridad y regulaciones. La mayoría de los virus Vaccinia recombinantes descritos en la literatura, están basados en la cepa Western Reserve del virus Vaccinia. Se sabe que esta cepa tiene una alta neurovirulencia y es por consiguiente pobremente adecuada para utilizarse en humanos y animales (Morita et al., Vaccine 5, 65-70 [1987] ) . Por otro lado, el virus Vaccinia Ankara modificado (MVA) se sabe es excepcionalmente seguro. El MVA ha sido generado por pasos en serie de largo plazo de la cepa Ankara del virus Vaccinia (CVA, por sus siglas en inglés) en fibroblastos de embrión de pollo (para revisión ver Mayr, A. , Hochstein- intzel, V. y Stickl,H. [1975] Infection 3,6-14; Patente Suiza No. 568,392) . Ejemplos para cepas de virus MVA depositadas en cumplimiento con los requerimientos del Tratado de Budapest, son las cepas MVA 572, MVA 575 y MVA-BN depositadas en la Colección Europea de Cultivos de Células de Animal (ECACC, por sus siglas en inglés) , Salisbury (UK) con los números de depósito ECACC V94012707, ECACC V00120707 y ECACC V00083008, respectivamente. El MVA se distingue por su gran atenuación, es decir, por infecciosidad o virulencia disminuida mientras mantiene buena inmunogenicidad. El virus de MVA ha sido analizado para determinar alteraciones en el genoma respecto a las cepas CVA tipo silvestre. Seis principales supresiones del ADN genómico (supresión I, II, III, IV, V, y VI) que totalizaron 31,000 pares de base, han sido identificadas (Meyer, H.,Sutter, G. y Mayr A. [1991] J. Gen. Virol. 72,1031-1038). El virus de MVA resultante se vuelve severamente célula hospedera restringida a células de ave. Además, el MVA está caracterizado por su extrema atenuación. Cuando se prueba en una variedad de modelos de animal, el MVA comprobó ser avirulento aún en animales inmunosuprimidos . En forma más importante, las excelentes propiedades de la cepa MVA han sido demostradas en pruebas clinicas extensivas (Mayr et al., Zbl. Bakt.Hyg. I, bt.Org. B 167,375-390 [1987], Stickl et al., Dtsch.med. schr . 99, 2386-2392 [1974]). Durante estos estudios, sobre 120,000 humanos, incluyendo pacientes de alto riesgo, ningún efecto colateral estuvo asociado con el uso de la vacuna de MVA. El MVA recombinante útil como vacunas ya había sido construido y utilizado en pruebas clínicas. En WO 98/13500 se describe un MVA recombinante que contiene y que es capaz de expresar una o más secuencias de ADN que codifican los antígenos del virus del dengue. Las secuencias de ADN extrañas se recombinaron dentro del ADN viral en el sitio de una supresión que ocurre en forma natural en el genoma de MVA. Antes de utilizar poxvirus o poxvirus recombinante para vacunación es necesario purificar el virus hasta un cierto orden de amplitud a fin de cumplir con los requerimientos regulatorios . El modo tradicional de purificar poxvirus, en particular MVA y MVA recombinante, es como sigue: en una primera etapa se cultivan las células susceptibles a infección con el poxvirus respectivo. En el caso de MVA, las células susceptibles son i. a., fibroblastos de embrión de pollo. Las células susceptibles son infectadas con el poxvirus y cultivadas durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la generación de progenie de virus. Las células después son congeladas y descongeladas a fin de desunir las células de la superficie del frasco de cultivo y parcialmente romper las células. La mezcla de células intactas y rotas se hace girar. Se utilizó ultrasonido para producir un homogenato. Se purificó el virus del homogenato por medio de centrifugación con colchón de sacarosa (Joklik WK. "The purification of four strains of poxvirus" Virology 1962; 18:9-18) . La etapa clave en éste proceso es la homogenización al utilizar ultrasonido (Hedstrom, K.G. y Lindberg, U.,Z Immun. Forsch. 1969, 137 : 421-430; Stickl, H., Korb, W. y Hochstein-Mintzel, V., Zbl. Bakt., I. Abt . Orig. (1970), 215,38-50) . En procesos industriales se prefiere que todas las etapas de proceso sean de fácil control y reproducción. Sin embargo, la desventaja en utilizar ultrasonido para homogeneizar la suspensión de virus-célula, es que la etapa de ultrasonido es difícil de reproducir en una manera idéntica, difícil de ajustar y es difícil de llevar a escala el proceso desde la escala de laboratorio a la industrial.

Objeto de la invención Por consiguiente, es un objeto de la invención el proporcionar un método para la recuperación de poxvirus, en particular de virus Vaccinia, tal como la cepa de MVA, a partir de las células infectadas de poxvirus, en donde la homogenización de las células infectadas es reproducible, fácil de controlar y permite en llevar a escala fácilmente desde la escala del laboratorio a la industrial.

Descripción detallada de la invención La presente invención concierne a un método para la recuperación de poxvirus, en particular virus Vaccinia, tal como cepa Elstree o virus Vaccinia Ankara modificado (MVA), a partir de células infectadas. El método de acuerdo a la presente invención para la recuperación de poxvirus a partir de células infectadas comprende la etapa de someter las células infectadas a una homogenización de alta presión para obtener un homogenato que contiene poxvirus. Era inesperado que poxvirus intacto e infeccioso pudiera ser recuperado por el método de acuerdo a la presente invención. La homogenización de alta presión comúnmente es utilizada para la destrucción de estructuras celulares y subcelulares a fin de aislar proteínas o lipidos a partir de células eucarióticas y procarióticas . La OS 3,983,008 describe un método de extracción de componentes útiles a partir de células microbianas al utilizar homogenizaciones de alta presión. Los compuestos extraídos fueron proteínas de levadura, enzimas bacterianas y lipidos de levadura. La DE 19918619 describe el uso de homogenización de alta presión para aislar HbsAg de células de levadura. La US 4,255,521 describe un proceso para la extracción de glucosa isomerasa a partir de células de microorganismos por liberación de alta presión. La homogenización de alta presión también había sido utilizada para el aislamiento de partículas similares a virus (VLP) a partir de Saccharomyces cerevisiae recombinante (Milburn and Dunnill (1994) Botechnology and Bioengineering 44,736-744) y para la producción y purificación de vectores adenovirales (US 6,194,191). Las VLP' s y adenovirus no son envueltas y más bien son virus pequeños y simples que, por consiguiente, reensamblan las estructuras de proteína celular. Por lo tanto, no es de asombrarse que la homogenización de alta presión que ha sido mostrada, que es adecuada para el aislamiento de proteínas de células, pueda también ser utilizada para el aislamiento de Adenovirus y VLPs a partir de células eucarióticas . En contraste, viriones de poxvirus maduros intracelulares (IMV, por sus siglas en inglés, ver enseguida, ver Fields et al., Fields Virology, 1996, Lippincott-Raven publishers, Philadelphia, USA, ISBN 0-7817-0253-4, capítulo 83, páginas 2654-5) tienen una morfología muy compleja que involucra inter alia membranas de lípido. La morfología y propiedades físicas de un IMV poxvirus están en ciertos aspectos más cercanamente relacionados a la morfología y las propiedades físicas de una célula que aquellas de un virus sin envolver. Consecuentemente, se esperaba que las condiciones utilizadas para el rompimiento de las células al utilizar homogenización de alta presión, podrían conducir al rompimiento de poxvirus. Por consiguiente, fue un resultado sorprendente el que la homogenización a alta presión rompiera las células pero dejando intacta una cantidad suficiente de poxvirus que podría ser además purificado. En otras palabras, no se podría haber asumido que la homogenización de alta presión pudiera ser utilizada en un método para la recuperación de poxvirus a partir de células infectadas. En efecto, el método conocido para la recuperación de poxvirus a partir de células infectadas utiliza ultrasonido para la homogenización, el cual es un modo bastante generoso de homogenización. En contraste a los métodos de recuperación que utilizan ultrasonido, el método de acuerdo a la presente invención permite una homogenización reproducible de células infectadas; el método es fácil de controlar y fácil de llevar el proceso a escala desde una escala de laboratorio a una industrial. En el contexto de la presente invención, el término "poxvirus" se refiere a cualquier virus que pertenezca a la familia de poxviridae. El método de acuerdo a la presente invención, preferiblemente se lleva a cabo con poxviridae de la subfamilia de chordopoxvirinae, más preferiblemente de los géneros orthopoxvirus, avipoxvirus, capripoxvirus y suipoxvirus. Más preferiblemente, la invención concierne a un método para la recuperación y purificación de poxvirus seleccionados del grupo que consiste de virus Vaccinia, goatpoxvirus, , sheeppoxvirus, canarypoxvarus y fowlpoxvirus. Particularmente preferido es el virus Vaccinia. Ejemplos para cepas de virus vaccinia utilizadas en el método de acuerdo a la presente invención son las cepas Elstree, yeth, Copenhagen, Temple of Heaven, NYCBH, Western Pveserve. La invención no está restringida a aquellas cepas de virus vaccinia específicamente mencionadas sino que puede a su vez ser utilizada con cualquier cepa de virus vaccinia. Un ejemplo preferido para una cepa de virus Vaccinia es la cepa de virus Vaccinia Ankara modificado (MVA) . Una cepa de MVA típica es MVA 575 que ha sido depositada en la Colección Europea de Cultivos de Célula Animal bajo el número de depósito ECACC V00120707. Más preferida es MVA-BN o un derivado de la misma. MVA-BN ha sido descrita en WO 02/42480 (PCT/EP01/13628) . Dicha solicitud internacional describe ensayos biológicos que permiten evaluar si una cepa de MVA es MVA-BN o un derivado de la misma y métodos que permiten obtener MVA-BN o un derivado de la misma. El contenido de esta solicitud está incluido en la presente solicitud para referencia. MVA-BN ha sido depositada en la Colección Europea de Cultivos de Célula Animal con el número de depósito ECACC V00083008. Los virus a ser recuperados pueden ser virus nativos, virus atenuados o virus recombinantes . El término "virus recombinante" se refiere a cualquier virus que tenga insertado dentro del genoma viral un gen heterólogo que no sea parte en forma natural del genoma viral. Un gen heterólogo puede ser un gen terapéutico, un gen que codifica para un antígeno o un péptido que comprende al menos un epitope para inducir una respuesta inmune, un cásete de expresión antisentido o un gen de ribozoma. Los métodos para obtener virus recombinantes son conocidos para una persona experimentada en la técnica. El gen heterólogo preferiblemente ésta insertado dentro de una región no esencial del genoma de virus. En otra modalidad preferida de la invención, la secuencia de ácido nucleico heteróloga es insertada en un sitio de supresión que ocurre naturalmente del genoma de MVA (descrito en PCT/EP96/02926) . Un "virus atenuado" es un virus que durante la infección del organismo hospedero resulta en una baja mortalidad y/o morbilidad comparado con el virus padre no atenuado. Un ejemplo para un virus Vaccinia atenuado es la cepa MVA, en particular MVA-575 y MVA-BN. Poxvirus, tal como virus Vaccinia, se conoce que existen en dos formas diferentes: poxvirus unido a las membranas celulares en el citoplasma de las células infectadas (viriones maduros intracelulares (IMV) ) y virus que han sido exteriorizados (viriones envueltos extracelulares (EEV) ) (Vanderplasschen A, Hollinshead M, Smith GL "Intracellular and extracellular vaccinia virions enter cells by different mechanisms" J. Gen. Virol. (1998), 79,877-887) . Los IMVs y EEVs son ambos infecciosos pero morfológicamente diferentes ya que EEV contiene una envoltura de lipoproteina adicional. Bajo circunstancias normales las partículas de IMV son más abundantes que EEV, pero en el método de acuerdo a la invención, se pueden obtener ambos tipos de partículas. Los materiales de partida para la etapa de homogenización de acuerdo a la presente invención son células infectadas con el poxvirus respectivo. El término "células infectadas" utilizado para definir el material de partida para la homogenización de acuerdo a la presente invención, se refiere a células intactas infectadas con el virus respectivo, a partes y fragmentos de células infectadas a las cuales el poxvirus respectivo está unido o a una mezcla de células intactas y células lisadas/rotas . Ejemplos para una parte o un fragmento de células infectadas son membranas celulares de células rotas/lisadas a las cuales el poxvirus respectivo está unido. El material de partida puede también contener partículas de virus libres que ni están unidas a la membrana celular ni están localizadas intracelularmente . A fin de obtener las células infectadas que son el material de partida para el método de acuerdo a la presente invención, se infectan células eucarióticas con el poxvirus respectivo. Las células eucarióticas son células que son susceptibles de infección con el poxvirus respectivo y permiten replicación y producción de virus infeccioso. Dichas células son conocidas por la persona experimentada en la técnica para todos los poxvirus. Para MVA y cepas de virus vaccinia Elstree, un ejemplo para este tipo de células son fibroblastos de embrión de pollo (CFE) (Drexler I., K., ahren B., Erfle V. y Sutter G. "Highly attenuated modified vaccinia Ankara replicates in baby hámster kidney cells, a potencial host for virus propagation, but not in various human transformed and primary cells" J. Gen. Virol. (1998), 79,347-352) . Células CEF pueden ser cultivadas bajo condiciones conocidas por la persona experimentada en la técnica. Preferiblemente las células CEF son cultivadas en un medio libre de suero en frascos fijos o frascos rotativos. La incubación preferiblemente toma lugar de 48 a 96 horas a 37 °C ± 2°C. Para la infección, los poxvirus preferiblemente son utilizados en una multiplicidad de infecciones (MOI) de 0,05 a 1 TCID50 y la incubación preferiblemente toma lugar de 48 a 72 horas a 37°C ± 2°C. El progreso de la infección se puede observar al mirar en los efectos citopaticos (CPE) , que aparecen típicamente por medio de redondeo significante de las células infectadas. La presente invención permite la recuperación de poxvirus, tal como Elstree o MVA a partir de células infectadas. Por el término "recuperación" significa que el método de la presente invención permite la ruptura de células infectadas por poxvirus y/o unidas al poxvirus de las membranas celulares a las cuales están usualmente unidos, de tal modo que una extensión de purificación adicional del poxvirus se vuelva factible. Por consiguiente, el producto de la recuperación de poxvirus a partir de células infectadas (referidas como "homogenato que contiene poxvirus" en la presente solicitud) es una mezcla homogénea de poxvirus libre y detritos celulares que contienen solamente cantidades menores de células sin quebrar, intactas, y virus unidos a las membranas celulares. Si las células infectadas son células que pueden ser cultivadas en cultivos de suspensión, las células infectadas pueden fácilmente ser cosechadas por centrifugación . Si las células infectadas son más o menos células adherentes intactas, estas podrían ser cosechadas, i.e., retiradas del frasco de cultivo, antes de someterlas a la homogenización de alta presión. Dichos métodos son conocidos por las personas experimentadas en la técnica. Técnicas útiles son métodos mecánicos (e.g., al utilizar un raspador de célula, de caucho), métodos físicos (e.g., congelamiento por debajo de -15 °C y descongelamiento de los recipientes de cultivo por arriba de +15 °C) o métodos bioquímicos (tratamiento con enzimas, e.g., tripsina, para unir las células del recipiente de cultivo) . Si las enzimas son utilizadas para este propósito, el tiempo de incubación deberá de ser controlado, puesto que estas enzimas pueden también dañar el virus durante la incubación. En el método de acuerdo a la presente invención, las células infectadas, más específicamente las células infectadas cosechadas, son después sometidas a una etapa de homogenizacion de alta presión. En la presente especificación, el término "homogenizacion de alta presión" es algunas veces abreviado como "HPH". La homogenizacion de alta presión tiene un doble defecto. Por un lado, la homogenizacion de alta presión conduce a la ruptura de células intactas. Por consiguiente, los IMVs son liberados y se vuelven disponibles para una purificación adicional. Por otro lado, la homogenizacion de alta presión tiene el efecto de que los poxvirus son desunidos de las membranas celulares o a menos que el tamaño de los agregados de célula-membrana -virus sea reducido. Nuevamente, esto simplifica la purificación adicional del poxvirus. La persona experimentada en la técnica está familiarizada con el principio general de homogenizacion a alta presión ( hite MD, Marcus D., "Disintegration of microorganisms" , Adv. Biotechnol. Processes 1988;8:51-96). Los sistemas de HPH están basados en el uso de alta presión para forzar una muestra a través de. un pequeño orificio fijo a alta velocidad bajo condiciones controladas y repetibles. En la presente descripción, los términos "chorro", "orificio" y "boquilla", son utilizados en forma intercambiable . El corazón de cada rompedor de célula es una cabeza de ruptura. La cabeza de ruptura preferiblemente consiste de (I) una cámara de alta presión/cilindro, (II) un pistón de alta presión que se mueve dentro de la cámara/cilindro y por lo tanto incrementa la presión en la cámara/cilindro y (III) una boquilla/chorro a través de la cual el contenido de la cámara es expulsado. El contenido de la cámara expulsado se dirige a una superficie objetivo tal como una pieza de metal que preferiblemente tiene una superficie de intercambio de calor que permite el enfriamiento. Para recolectar el contenido de la cámara roto, el sistema está provisto con medios para recolección de la muestra rota ("cámara de recolección" terminada). Una unidad típica de homogenizacion de alta presión es Basic +Z de Constant Cell Disruption Systems (Lo March, Daventry, Northants, NN114SD, Reino Unido) . En una modalidad preferida existen tres pasos para efectuar la ruptura de la célula utilizando el sistema de homogenizacion de alta presión. (I) Una muestra se introduce dentro del cilindro/cámara de alta presión. Después, la presión en el cilindro/cámara se forma. Para este fin, el pistón de alta presión desciende. (II) El pistón después fuerza la muestra a través de la boquilla a alta velocidad. La transferencia rápida de la muestra desde una región de alta presión a una de baja presión, provoca la ruptura de la célula. (III) La muestra impacta el objetivo y se dispersa en forma radial a través de la superficie de intercambio de calor enfriada. El producto después fluye dentro de una cámara para recolección. La hidráulica es recargada y el ciclo continúa. Al final del proceso, el homogenato expulsado se recolecta en un frasco apropiado, dependiendo del volumen. Para la recuperación de poxvirus de acuerdo a la presente invención, la boquilla deberá de tener un diámetro en el intervalo de 0.10 a 0.6 mm, 0.15 a 0.6 mm, 0.15 a 0.50 mm, preferiblemente en el intervalo de 0.15 a 0.40 mm, 0.20 a 0.50 mm, más preferiblemente de 0.20 a 0.40 mm, más preferiblemente de 0.25 mm a 0.35 mm. Ejemplos para diámetros más preferidos son 0.25 mm a 0.35 mm. La presión en la cámara/cilindro de presión se establece a un valor en el intervalo de 200 a 1000 bars, preferiblemente de 400 a 1000 bars, 200 a 800 bars, más preferiblemente de 400 a 800 bars, de 600 a 1000 bars, aún más preferiblemente de 600 a 900 bars, más preferiblemente de 700 a 900 bars. La presión más preferida es de 800 bars. La temperatura del homogenato en la salida preferiblemente no deberá de exceder de +25 °C, y deberá de estar preferiblemente por debajo de los 15 °C, más preferiblemente por debajo de 10 °C. El método de acuerdo a la presente invención se puede llevar a escala casi lineal y puede ser corrido ya sea como proceso por lotes o como continuo. En el proceso por lotes, cada lote de las células a ser homogeneizado se puede someter a la etapa de homogenización de alta presión una vez o varias veces. Preferiblemente, cada lote se somete a la etapa de homogenización de una a tres veces, más preferiblemente solamente una vez. El éxito de la etapa de homogenización puede preferiblemente ser verificado por determinación del titulo del virus (equivalente al número de partículas de virus infecciosas, medidas ya sea en la dosis infecciosa del cultivo de tejido (TCID50) o unidades que forman placa (pfu) ) del material de partida como se definió anteriormente y del material obtenido después de la etapa de homogenización. En otras palabras, la titulación del virus se determina antes y después de la homogenización de alta presión. El material de partida comprende más o menos células intactas y un mejor alto porcentaje de agregados grandes que comprenden partículas de poxvirus unidas a las membranas celulares. Si dicho material es utilizado para la determinación del título viral, el título obtenido es menor que el número actual de partículas infecciosas. Esto es debido al hecho de que los sistemas de prueba utilizados para la determinación del título viral son usualmente sistemas de cultivo celular (tal como el sistema que se describe en el Ejemplo 2) en el cual el número de células infectadas o el número de placas se cuenta. Dicho sistema no puede distinguir entre un resultado positivo que es debido a la infección de una célula por sólo una partícula de virus y la infección de células, e.g., por un agregado largo de virus unidos a membranas celulares. Después de la homogenización de alta presión, los poxvirus se vuelven a desunir de las membranas celulares y/o el tamaño de los agregados de membranas celulares-virus , es significativamente reducido, lo cual conduce a un gran número de agregados más pequeños. Si este material es utilizado para la determinación del título, los resultados obtenidos son mayores, aún si la cantidad actual de las partículas del virus infecciosas no han cambiado. Por consiguiente, el éxito de la homogenización preferiblemente se refleja por al menos un TCIDso/ml igual o mayor ("TCID" es la abreviación de "dosis infecciosa del cultivo de tejido") del homogenato comparado con el material de partida. En la sección de ejemplos, se muestra en detalle como el valor de TCID50/ml puede ser determinado. Alternativamente, la calidad y el éxito de la homogenización de alta presión, puede ser determinado por microscopía de electrón. Para purificación adicional el homogenato se somete a al menos una etapa de purificación para obtener una fracción enriquecida con poxvirus. En particular, estas etapas se pueden llevar a cabo para un homogenato que contiene virus vaccinia, si se propone además purificar el virus vaccinia. La etapa de purificación inter alia puede ser - centrifugación por lotes (e.g., utilizando colchones de sacarosa) o ultracentrifugación de flujo continuo (gradiente de sacarosa) (Hilfenhaus, J. , Kohler, R. y Gruschkau, H., J. Biol. Stand. (1976) 4,285-293; Madalinski, W., Bankovski, A. and Korbecki, M., Acta Virol. (1977) 21, 104-108), ultrafiltración (e.g., filtración de flujo cruzado utilizando una membrana con un tamaño de poro mayor que 500 kDa, pero igual o menor que 0,1 µp?) , cromatografía de columna (e.g., intercambio iónico, interacción hidrofóbica, exclusión de tamaño o una combinación) (Hedstróm, K.G. and Lindberg, U.,Z. Immun. Forsch. 1969 137:421-430; Stickl, H., Korb, W. and Hochstein- intzel, V., Zbl . Bakt., I Abt. Orig. (1970), 215, 38-50) o - una combinación de todos los anteriores (Masuda, N., Ellen, R.P and Grove, D.A., J. Bacteriol. (1981), 147 (3) , 1095-1104) . Cualesquier otros métodos de purificación conocidos por los experimentados en la técnica, están también dentro del alcance de la presente invención. Preferiblemente la etapa de purificación es una etapa de ultrafiltración . Más preferiblemente la ultrafiltración es una filtración de flujo cruzado. El principio de filtración de flujo cruzado es conocido por los experimentados en la técnica. Ver, e.g., Richards, G.P. and Goldmintz, D., J. Virol. Methods (1982), 4 (3), páginas 147-153 "Evaluation of a cross-flow filtration technique for extraction of polioviruses from inoculated oyster tissue homogenates". Aunque una etapa de purificación podría ser suficiente para cumplir con los requerimientos reglamentarios para productos biofarmacéuticos, dos o más de las etapas de purificación mencionadas anteriormente pueden ser combinadas a fin de obtener un producto aún más puro . En la modalidad más preferida, la primera etapa de purificación es una filtración de flujo cruzado seguida por al menos una etapa de cromatografía en columna. Más preferiblemente, la etapa de cromatografía de columna es una de intercambio iónico o interacción hidrofóbica. La fracción obtenida enriquecida con virus opcionalmente es criodesecada . Los métodos de criodesecación son conocidos por los experimentados en la técnica (Day J. and McLellan M. , Methods in molecular Biology (1995), 38, Human Press, "Cryopreservation and freeze-drying protocols") . La invención además concierne a la fracción enriquecida con poxvirus y/o el homogenato que contiene poxvirus obtenidos por el método para la recuperación de poxvirus de acuerdo a la presente invención, i.e., el método que comprende la etapa de someter las células infectadas a homogenización de alta presión. En particular la invención concierne a la fracción enriquecida con poxvirus obtenida por el método de recuperación/purificación de acuerdo a la presente invención, i.e., el método en el cual el homogenato que contiene poxvirus obtenido por HPH se somete a por lo menos una etapa de purificación. El poxvirus puede ser cualquier poxvirus como se definió anteriormente. En particular, el poxvirus de acuerdo a la presente invención es un virus vaccinia como, cualesquier cepas que sean adecuadas para vacunación, en particular la cepa Elstree o virus vaccinia Ankara modificado, más preferiblemente MVA-BN.

El homogenato- que contiene poxvirus y/o fracción enriquecida con poxvirus obtenidos por el proceso de acuerdo a la presente invención que comprende una etapa de HPH, está caracterizado por una razón muy elevada de poxvirus IMV libre a poxvirus EEV. El término "IMV libre" se utiliza para IMVs que han sido desunidos de las membranas celulares después, antes o durante el rompimiento de las células infectadas y que por lo tanto pueden además ser purificadas. En todos los procesos industriales para la preparación de poxvirus, el material de partida comprende las células infectadas asi como el cultivo sobrenadante. Por consiguiente, el material de partida comprende poxvirus IMV contenidos en las células infectadas asi como poxvirus EEV que se encuentran principalmente en el sobrenadante. Los métodos conocidos para el rompimiento de células y la subsecuente homogenización (e.g., al utilizar ultrasonido) no hacen un rompimiento en forma eficiente de las células y/o desunión de los poxvirus IMV de los detritos celulares como la homogenización de alta presión. En otras palabras, la mayoría de IMV permanece unido a las membranas celulares y detritos. Por consiguiente, la razón de IMV libre a EEV es menor que en el método de acuerdo a la presente invención. En el método que utiliza ultrasonido, esta razón no cambia significativamente durante las etapas de purificación adicional puesto que los detritos celulares a los cuales los IMVs están todavía unidos, usualmente son retirados. En contraste a los métodos de recuperación conocidos para poxvirus, el método de recuperación de acuerdo a la presente invención resulta en un rompimiento muy efectivo de las células infectadas y los IMVs son muy efectivamente desunidos de las membranas celulares. Por lo tanto, la cantidad total de los IMVs libres que se vuelve disponible para purificación adicional, es mayor que para los métodos conocidos en la técnica previa y consecuentemente también la razón de IMV libre a poxvirus EEV es mayor. El homogenato que contiene poxvirus y/o la fracción enriquecida con poxvirus obtenidos por el método de acuerdo a la presente invención, son utilizados como vacunas . Si el homogenato que contiene poxvirus y/o la fracción enriquecida con poxvirus comprende poxvirus sin modificar o poxvirus atenuado, tal como las cepas de virus vaccinia Elstree o MVA, pueden ser utilizados para vacunación contra infecciones de poxvirus. E.g., un homogenato que contiene virus y/o la fracción enriquecida con virus que comprende virus vaccinia, tal como las cepas Elstree o MVA, en particular MVA-BN pueden ser utilizadas como una vacuna contra infecciones por smallpox.

Si el homogenato que contiene poxvirus y/o la fracción enriquecida con poxvirus comprende un poxvirus que contiene y expresa uno o más genes heterologos, el homogenato que contiene poxvirus y/o la fracción enriquecida con poxvirus puede además ser utilizada para vacunar animales incluyendo humanos que están contra la proteina expresada por los genes heterologos. Para la preparación de una vacuna, el homogenato que contiene poxvirus y/o la fracción enriquecida con poxvirus obtenida por el método de acuerdo a la presente invención, son convertidos en una forma fisiológicamente aceptable. Esto se puede hacerse en base a la experiencia en la preparación de vacunas de poxvirus utilizadas para vacunación contra smallpox (como se describe por Stickl, H. et al. [1974] Dtsch. med. Wschr. 99,2386-2392). Por ejemplo, el homogenato que contiene poxvirus y/o la fracción enriquecida con poxvirus son almacenados a -80 °C con un titulo de 5xl08 TCID50/ml formulado en aproximadamente lOmM Tris, 140mM NaCl pH 7.4. Para la preparación de dosis de vacuna, e.g.,103-109 TCID50 del virus son liofilizados en solución salina amortiguada con fosfato (PBS) en presencia de 2% de peptona y 1% de albúmina humana en una ampolleta, preferiblemente una ampolleta de vidrio. Alternativamente, las dosis de vacuna pueden ser producidas al secar por congelamiento paso por paso el virus en una formulación. Esta formulación puede contener aditivos adicionales tal como manitol, dextrano, azúcar, glicerina, lactosa o polivinilpirrolidona u otros aditivos tal como antioxidantes o gas inerte, estabilizadores o proteínas recombinantes (e.g., albúmina de suero humano) adecuado para administración in vivo. Una formulación típica que contiene virus adecuada para criodesecasión comprende lOmM de solución tampón Tris, 140 mM NaCl, 18.9 g/1 Dextran (PM 36000-40000), 45 g/1 Sacarosa, 0.108 g/1 monohidrato de sal monopotásica del ácido L-glutámico pH 7.4. La ampolleta de vidrio es después sellada y puede ser almacenada entre 4°C y temperatura ambiente durante varios meses. Sin embargo, siempre no exista la necesidad de que la ampolleta sea almacenada preferiblemente a temperaturas por debajo de -20 °C. Para la vacunación, el producto liofilizado o criodesecado puede ser disuelto en 0.1 a 0.5 mi de una solución acuosa, preferiblemente una solución salina fisiológica o solución tampón Tris, y administrado ya sea en forma sistémica o local, i.e., parenteralmente, intramuscularmente o por cualquier otra vía de administración conocidas por los practicantes experimentados. El modo de administración, la dosis y el número de administraciones, puede ser optimizada por aquellos experimentados en la técnica en una manera conocida. La administración más preferida para los vectores de poxvxrus es subcutánea o intramuscular. La invención además se refiere a un método para la vacunación de animales incluyendo humanos, que comprende inocular un animal, incluyendo un humano, en necesidad de la misma, con un homogenato que contiene poxvxrus o una fracción enriquecida con poxvxrus, obtenidos por el método de acuerdo a la presente invención. LA INVENCIÓN La invención inter alia comprende lo siguiente, solo o en combinación: Método para la recuperación de poxvirus a partir de células infectadas que comprende la etapa de someter las células infectadas a una homogenización de alta presión para obtener un homogenato que contiene poxvirus . El método anterior caracterizado en que el poxvirus se selecciona del grupo que consiste de orthopoxvirus, avipoxvirus, suipoxvirus y capripoxvirus . El método anterior caracterizado en que el poxvirus se selecciona del grupo que consiste de virus vaccinia, goatpoxvirus, sheeppoxvirus, canarypoxvirus y fo lpoxvirus . El método anterior caracterizado en que el virus vaccinia es cepa del virus vaccinia Ankara modificado (MVA) , en particular MVA-BN con el número de depósito ECACC V00083008. El método anterior caracterizado en que el poxvirus es un poxvirus recombinante . El método anterior caracterizado en que la homogenización de alta presión se lleva a cabo al poner las células infectadas en una cámara de alta presión, incrementar la presión en la cámara y expulsar las células infectadas a través de una boquilla. El método anterior caracterizado en que la presión en la cámara se incrementa a un valor en el intervalo de 200 a 1000 bars. El método anterior caracterizado en que la boquilla tiene un diámetro en el intervalo de 0.10 a 0.6 mm. El método anterior caracterizado en que el homogenato que contiene poxvirus es sometido a al menos una etapa de purificación para obtener una fracción enriquecida con poxvirus . El método anterior caracterizado en que la al menos una etapa de purificación es una etapa de ultrafiltración . El método anterior caracterizado en que la ultrafiltración es una filtración de flujo cruzado.

El método anterior caracterizado en que en la etapa de filtración de flujo cruzado se utiliza una membrana que tiene un tamaño de poro más grande que 500 kDa pero igual o más pequeño que 0.1 ym. El método anterior caracterizado en que subsecuente a la ultrafiltración al menos una etapa de cromatografía por columna se lleva a cabo. El método anterior caracterizado en que el homogenato que contiene poxvirus o fracción enriquecida obtenidos con poxvirus, es secado por criodesecación. Homogenato que contiene poxvirus o fracción enriquecida con poxvirus obtenidos por un método como se definió anteriormente. Homogenato que contiene poxvirus o fracción enriquecida con poxvirus como se mencionó para la vacuna. Uso del homogenato que contiene poxvirus o fracción enriquecida con poxvirus como se definió anteriormente para la preparación de una vacuna. El método para la vacunación de un animal, incluyendo un humano, en necesidad de la misma, caracterizado por la administración de un homogenato que contiene poxvirus o fracción enriquecida con poxvirus o una vacuna como se definió anteriormente para el cuerpo animal. Leyendas de las figuras Figura 1: Células CEF infectadas con MVA-BN fueron sometidas a un ciclo de congelamiento-descongelamiento para obtener una suspensión de virus-célula. El titulo del virus de la suspensión se determinó como se describe en el ejemplo 2 sin purificación adicional de la suspensión de célula-virus ("valor 0") . La suspensión de virus-célula se sometió a un método de homogenización conocido del arte previo al utilizar ultrasonido ("Sonifier") o al método de homogenización de acuerdo a la presente invención ("HPH") como se describe en el ejemplo 1. En la etapa de HPH la presión fue de 800 bars y la boquilla tenia un diámetro de 0.25 mm. Al final de la etapa de homogenización, el titulo del virus se determinó nuevamente.

Ejemplo (s) El siguiente ejemplo (s) ilustrará adicionalmente la presente invención. Deberá de ser bien entendido por una persona experimentada en la técnica que el ejemplo (s) proporcionado de ningún modo puede ser interpretado en el sentido de que limita la aplicabilidad de la tecnología provista por la presente invención para este ejemplo (s) .

Ejemplo 1: Homogenización de suspensiones de células poxvirus por medio del uso de un homogeneizador de alta presión Fibroblastos de embrión de pollo (CEF) cultivados en frascos rotatorios, han sido infectados con VA-BN (ECACC V00083008). Las células infectadas se sometieron a congelamiento y descongelamiento para obtener una suspensión de virus-célula. Un homogeneizador Basic Z+ de Constant Cell Disruption Systems (Low March, Daventry, Northants, NN114SD, Reino Unido) se cargó con 50 mi de la suspensión virus-célula cruda para cada corrida. ? fin de identificar las condiciones óptimas de homogenización, se probaron diámetros de boquilla en el intervalo de 0.18 a 0.40 mm y presiones en el intervalo de 200 a 1000 bars. La suspensión cruda se sometió a una homogenización de alta presión, dos o tres veces. El homogeneizador se utilizó de acuerdo a las instrucciones del fabricante. La evaluación del método se ejecutó por verificación del titulo como se describe en el ejemplo 2. En estudios preliminares se encontró que diámetros de chorro mayores que 0.4 mm no tienen influencia positiva en los resultados de homogenización. Con los diámetros de boquilla de 0.18 mm, 0.25 mm y 0.35 mm se obtuvieron los mejores resultados al someterse la suspensión virus-célula una vez a la presión de 800 bars. En estas condiciones no se observaron mayores diferencias en términos del título.

El método de acuerdo a la presente invención se comparó con el tratamiento de ultrasonido a través de flujo directo conocido de la técnica previa. Los resultados se resumen en la figura 1. La comparación del tratamiento de ultrasonido del método de acuerdo a la presente invención, resultó en un titulo del virus mayor y una mejor homogeneidad de la suspensión, de modo que es más adecuada para procesamiento adicional corriente arriba.

Ejemplo 2: Titulación de Virus Vaccinia Ankara Modificado (MVA) La titulación del virus Vaccinia Ankara Modificado (MVA) se llevó a cabo en un ensayo a base de TCID50 utilizando 10 veces diluciones en un formato de 96 pozos. En el punto final del ensayo, se visualizaron células infectadas utilizando un anticuerpo de virus antivaccinia y una solución de manchado apropiada. 2 o 3 dias después las células primarias de CEF (fibroblastos de embrión de pollo) se diluyeron a 1 x 105 células/ml en 7% de RPMI . Se hicieron 10 veces diluciones con 8 replicados por dilución. Seguida de la dilución, se sembraron 100 µ? por pozo de placas de 96 pozos. Después, las células se incubaron durante la noche a 37 °C y 5% de C02- Diluciones de las soluciones que contienen virus se hacen en etapas de 10 veces (10"1 a 10"12 conforme sea apropiado) utilizando RPMI sin suero bovino fetal. Después, 100 µ? de cada muestra de virus se adicionaron a los pozos que contienen las células. Las placas de 96 pozos se incubaron a 37 °C con 5% de C02 durante 5 dias para permitir la infección y la replicación viral. Las células se mancharon 5 dias después de la infección con un anticuerpo especifico del virus vaccinia. Para la detección del anticuerpo especifico, se utilizó una peroxidasa de rábano (HRP) acoplada al anticuerpo secundario. El anticuerpo especifico de VA es un anticuerpo de virus antivaccinia, fracción IgG, policlonal de conejo (Quartett, Berlin, Alemania #9503-2057). El anticuerpo secundario es anticuerpo IgG de anti-conejo, acoplado a policlonal de cabra (Promega, Mannheim, Alemania, #W4011 6) . La reacción de color se lleva cabo de acuerdo a técnicas conocidas . Cada pozo con células que son positivas en la reacción de color se marca como positivo para el cálculo del TCID50. El titulo se calcula al utilizar la fórmula de Spearman [1] y Kaerber [2] . Debido a que todos los parámetros del ensayo se mantienen constantes, se utilizó la siguiente fórmula simplificada: : Titulo del virus [TCDIso/ml] a = factor de dilución de la última columna, en la cual todos los ocho pozos son positivos xa = número de pozos positivos en la columna a+1 xb = número de pozos positivos en la columna a+2 xc = número de pozos positivos en la columna a+3

Claims (17)

1. Reivindicaciones 1. Método para la recuperación de un poxvirus a partir de células infectadas que comprende la etapa de someter las células infectadas a una homogenización de alta presión para obtener un homogenato que contiene poxvirus.
2. 2. Método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado en que el poxvirus se selecciona del grupo que consiste de orthopoxvirus, avipoxvirus, suipoxvirus y capripoxvirus .
3. 3. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado porque el poxvirus se selecciona del grupo que consiste de virus vaccinia, goatpoxvirus, sheeppoxvirus, canarypoxvirus y fowlpoxvirus .
4. 4. Método de acuerdo con la reivindicación 3, caracterizado porque el virus vaccinia es Elstree o cepa del virus vaccinia Ankara modificado (MVA) , en particular MVA-BN con el número de depósito ECACC V00083008.
5. 5. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el poxvirus es un poxvirus recombinante .
6. 6. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones. 1 a 5, caracterizado porque la homogenización de alta presión se lleva cabo al poner las células infectadas en una cámara de alta presión, incrementar la presión en la cámara y expulsar las células infectadas a través de una boquilla.
7. 7. Método de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado en que la presión en la cámara se incrementa hasta un valor en el intervalo de 200 a 1000 bars .
8. 8. Método de acuerdo con cualquiera de una de las reivindicaciones 6 a 7, caracterizado porque la boquilla tiene un diámetro en el intervalo de 0.10 a 0.6 mm.
9. 9. Método. de acuerdo con cualquiera de una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el homogenato que contiene poxvirus se somete a al menos una etapa de purificación para obtener una fracción enriquecida con poxvirus .
10. 10. Método de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizado porque una de las al menos una etapa de purificación es una etapa de ultrafiltració .
11. 11. Método de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizado porque la ultrafiltración es una filtración de flujo cruzado.
12. 12. Método de acuerdo con la reivindicación 11, caracterizado porque en la etapa de filtración de flujo cruzado se utiliza una membrana que tiene un tamaño de poro mayor que 500 kDa pero igual o menor que 0.1 ]i .
13. 13. Método de acuerdo con cualquiera de una de las reivindicaciones 10 a 12, caracterizado porque subsecuente a la ultrafiltración al menos una etapa de cromatografía por columna se lleva a cabo.
14. 14. Método de acuerdo con cualquiera de una de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado en que el homogenato que contiene poxvirus o la fracción enriquecida con poxvirus, es criodesecada .
15. 15. Fracción enriquecida con poxvirus u homogenato que contiene poxvirus obtenidos por el método de acuerdo con cualquiera de una de las reivindicaciones 1 a 14.
16. 16. Fracción enriquecida con poxvirus u homogenato que contiene poxvirus de acuerdo con la reivindicación 15 como vacuna.
17. 17. Usó de la fracción enriquecida con poxvirus u homogenato que contiene poxvirus de acuerdo con la reivindicación 15 para la preparación de una vacuna.