HU227507B1 - Eljárás poxvírusok kinyerésére és tisztítására fertõzött sejtekbõl - Google Patents

Eljárás poxvírusok kinyerésére és tisztítására fertõzött sejtekbõl Download PDF

Info

Publication number
HU227507B1
HU227507B1 HU0402337A HUP0402337A HU227507B1 HU 227507 B1 HU227507 B1 HU 227507B1 HU 0402337 A HU0402337 A HU 0402337A HU P0402337 A HUP0402337 A HU P0402337A HU 227507 B1 HU227507 B1 HU 227507B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
poxvirus
cells
viruses
mva
infected cells
Prior art date
Application number
HU0402337A
Other languages
English (en)
Inventor
Karl Heller
Jutta Kramer
Original Assignee
Bavarian Nordic As
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bavarian Nordic As filed Critical Bavarian Nordic As
Publication of HUP0402337A2 publication Critical patent/HUP0402337A2/hu
Publication of HUP0402337A3 publication Critical patent/HUP0402337A3/hu
Publication of HU227507B1 publication Critical patent/HU227507B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C12N7/02—Recovery or purification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/275—Poxviridae, e.g. avipoxvirus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24151—Methods of production or purification of viral material

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
  • Meat, Egg Or Seafood Products (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Description

Eljárás poxvírösok klayerésére es tisztításira fertőzött sejtekből
A. találmány tárgyát eljárás képezi poxvírasok, közelebbről módosított vseomiavsrn.s Ankara. (MVA) kinyerésére fertőzött sejtekből A találmány szerinti eljárás szerint a poxvírus5 fertőzött sejteket nagy nyomással homogenizáljuk. miáltal poxvírustartaimú homogenizátumot kapunk. A poxvírustamlmú homogenizátumot legalább egy tisztítási lépésnek vethetjük alá, miáltal poxvírusokhan dúsított trakeiót nyerünk. Ugyancsak a találmány tárgyát képezi a találmány szerinti eljárással kapott poxvírostartalmú frakció és poxvírustartaimú homogenizál mm. ?
A. poxvirídae komplex DNS-virusok nagy családja, amelynek taglal gerinces és geri.nctel.en organizmusok. sejtjeinek citoplazmájában repíikálódnak. A poxvirinae család a chor- ;·. dopoxvirinae (gerinceseket fertőző poxvírusok), és entomopoxviri.nae (rovarokat fertőző poxvírusok) alcsalídokat foglalja magában.
A chordppoxvirinae alcsaládba számos (különböző nemzetségekbe sorolt) állati poxví» rus tartozik, például a teve poxvírusok, birka poxvírusok, kecske poxvírusok, az avípoxvírusok, például baromfi poxvirus, amelyek által okozott fertőzéseknek jelentős gazdasági kihatások is van.
Haszonállatok birka poxvírus és kecske poxvírus elleni immunizálásra atteuuált, élő és maktivált vakcinák, rendelkezésre állnak. Baromfiak vakeinázására rekombináns vakcinákat fejlesztettek ki baromfihimlő vírus vektorként történő alkalmazásával.
Mivel, a baroműlúmlő vírus humán sejteket ts megfertőz, feltételezhető, hogy vektorként is alkalmazható heterológ gének expresszálíatására humán organizmusban, valamint a megfelelő immunválasz kiváltására. Genomjukban HIV-géueket hordozó baromfihimíő vírusok leírását találjuk az US 5 736 368 és US ő 051 410 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokban.
A. poxvimsok közük humán fertőzések szempontjából messze a variola vírus - az örthopoxvírus nemzetség tagja - bírt a legnagyobb jelentőséggel A vacciniavímst, amely szintén a Poxvirídae család. Örthopoxvírus nemzetségének tagja, alkalmazták élő vakcinaként fekete himlő elleni immunizálásra, Á. vaccimavíras alkalmazásával végzett sikeres vakeinázás világszerte a variola vírus eradikációjáboz vezetett. [„The gfehal eradfearion of smallpox. Pinái report of the global eommlssíon fór the certifrcaticn of smallpox eradicatmnA History of
Public Health 4, Genova, World Health Örganization (1980}], Mivel a WHO hivatalosan deklarálta a himlő cradikációját, a vakeirsázást több éve abbahagyták, kivéve poxvlrusfertőzés áh ***Χ ΦΧΧ-Φ φφφ φ
XXX tál fokozottan veszélyeztetett személyeknél (például laboratóriumi személyzetnél). A vakcinázási programok isméi az érdeklődés középpontjába kerítitek a varioia vírus biológiai fegyverként, vagy bioterrorísták által történő alkalmazásának veszélye miatt.
Újabban, a vaeciníavírus alkalmazásának. lehetősége ismét felmerült vírusvektorok 5 géntechnológiai úton történő előállítására, rekombináns gének expresszáltatására, valamint rekombináns, élő vakcinákként. történő alkalmazásra [Mackeít M. Smith G.L. és Moss B,: F.N,A,S> (USA) 79, T4ÍS (1932); Smith öA,, Mackett M. és Moss B.; Biotechnology and Geoetie Engineering Reviews 2,383 (I984)j. Ezekben, idegen antigéneket kódoló DNS-szekveneiákat (génekei) juttatnak vacciniavirusok genomjába. Amennyiben a gén a víms~DNB~ nek a vírus életciklusa számára nem esszenciális helyére integrálódik, az újonnan képződő rekombináns vaeciníavírus íertőzőképes lehet, azaz képes lehet idegen sejtek fertőzésére, és a beépült DNS-szekvencia expresszálására (lásd az EB 33 280 és EF 110,385 számú európai szabadalmi leírásokat). Másrészt, az ily módon előállított rekombináns vacciniavirusok éld vakcinákként is alkalmazhatók fertőző betegségek megelőzésére, vagy heterológ protein pro15 telnek előállítására eukarióta sejtekben.
A vaeciníavírus alkalmazása rekombináns éld vakcinákként aggályokat vet fel a biztonságosság és a szabályozások szempontjából A szakirodalomban leírt ..rekombináns vaceiniavíntsok többsége a Western keserve vaceimavírus törzsön alapul. Ismert, hogy ez a törzs nagyfokú neurovírnlenciát mutat, ezáltal humán, és állati alkalmazásra kevéssé alkalmas [Mo20 rita és mtsai.: 5, dd (1987)]. Másrészt, a módosított Ankara vacemíavirust (MVA) kivételesen biztonságosnak tartják. Az MVA-t az Ankara vaccmíatörzshöl (CVA.) kapták, sorozatos passzáiássai, égy, begy azt bosszú ideig csirkeemhrié fibroblasztokou passzolták [összefoglalót lásd Mayr A., Hoebsteín-Mintzel V. és Sttck.1 If: iníeelíon 1, 6 (1975); lásd továbbá az 568 392 számú svájci szabadalmi bejelentést], Ilyen MVA-vírustörzsek például a Budapesti
Egyezménnyel, összhangban, a „European Colleetlou of Animál Coll Cuiturcs” (ACÁCC) gyéjteményében (Salishury, UK) ECACC Y94Ö1270A ECACC Vöö 12070? és ECACC VÖ0Ö83ÖÖ8 nyilvántartási számon letétbe helyezett MVA 572, MVA 575 és MVA-BN vírustörzsek. Az MVA kiemelkedik nagyfoké attenuáitsága, azaz csökkent vitnleneiája vagy .fertőzőképessége révén; müidemellert, a törzs ímmunogenitását megtartotta. Az MVA-vímst vízs30 gáiták arra nézve, hogy genomjában milyen változások történtek az ereded, vad-típusú CVAtörzshöz képest.. Hat jelentősebb deléeiőt találtak a DNS-genomhan (f, Π., 1S.S (V., V. és VI, deléció), amelyek összességében 31 ÖÖO bázispárt érintenek [Mayer H., Sutié? G. és Mayr A,:
3. Gén. Virul 72, 1Ö31 (1991)]. A keletkező MVA-vírus replíkációja. szigorúan madár gazdasejtekre korlátozott. Az említetteken felül az 'MVA-vímst nagyfokú attenuütság jellemzi.
***Φ ΦΦφΧ
- 3 Különböző állati modellekben tesztelve az MVA avírulensoek bizonyult, .még immtuisznpresszált állatokba» is. Még fontosabb, hogy az MVA-tőrzs kiemelkedően előnyös tulajdonságait kiterjedt klinikai vizsgálatokban is igazolták [Mayr és mtsai,: 2'bL Baki Hyg, 1. Abt Org. B 167, 375 (1.987); Stieki és mtsai.; IMsch, Med, Wschr. 99, 2336 (1974)1. Ezekben a vizsga5 Istókban, amelyeket több mint 120 (XXI ember, ezen belül magas kockázati csoportba tartozó egyének bevonásával végeztek, nem jelentettek az .MVA-vakcína alkalmazásával kapcsolatba hozható mellékhatást Vakcinaként alkalmazható rekombináns MVA-vírusokat már előállítottak, és klinikai kipróbálásnak vetettek alá. A WÖ 98/13 500 számú nemzetközi közzétételi iratban rekombináns MVA-virust írnak le, amely Dengue-víms antigéneket kódoló egy vagy több DNS-szekvenciát tartalmaz és képes expresszálni. Áz idegen DNS-szekvenciákat géntechnológiai úton integrálták a vírus-DNS-he, az MVA-geno.mban természetes utón létrejött deléeio helyére.
Mielőtt poxvirnsokat vagy rekomhmáns poxvlmst alkalmaznánk vakcinázásra, a vírusokat bizonyos mértékben tisztítanunk kell, hogy a készítmény az előírásoknak megfeleljen,
Poxvirasokat, közelebbről MVA-vírust és rekombináns MVA-vírusokat szokásosan a következő eljárással tisztítunk: első lépésben, poxvtrus-íénözésre fogékony sejtéket tenyésztünk,. MVA esetében, fogékony sejtekként alkalmazhatok. például osítkeembnó íthroblásztokat. A fogékony sejteket fertőzzük a poxvfeusokkal, és az utódvirusok keletkezéséhez elegendő Ideig tenyésztjük. Ezután, a sejteket fogyasztjuk és fel olvasztjuk, hogy a .sejteket tenyésztő edény felszínéről leválasszuk, és részlegesen roncsoljuk. Az intakt és roncsolt sejtek elegyét centrifugáljuk. Ultrahangos kezeléssel homogenizátumot kapunk. A bomogemzátamböl szacharózpárnán történő sentrlfogálással tisztítjuk a vírusokat [Jokhk WKx „The pur.íílealion of four straios of poxvíras”, Viroiogy IS, 9 (1962)], Ebben az eljárásban a kulcsfontosságú lépés a homogsnizácio, ultrahangos kezeléssel (Hedsítötn K.G. és tindberg Eh: Z, Immun Forsch.
137,421 {1969); Stickl H,, Korb W. és HocbsteimMíntzel Ve Zbl, Baki., I Abt. Őrig, 215, 38 (1970)]. Ipari alkalmazás esetén előnyös, ha az eljárás során valamennyi lépés egyszerűen szabályozható és reprodukálható. Az ultrahangos kezelés alkalmazásának hátránya a vírus-sejt sznszpenzíó hotnogenízáláaára azonban az, hogy az ultrahang-kezelés' nehezen reprodukálható, nehezen beállítható, és az eljárás laboratóriumi léptékű alkalmazásról Ipari léptékű alkat3 0 mázsám nehezen bővíthető,
SeM
Célul tűztük ki eljárás kidolgozását pcxvlrusok, közelebbről vacciuiavirusok, például
MVÁ-virusok kinyerésére poxvimssal fertőzött sejtekből, amelyben a fertőződ sejtek homoν * X.y
.. 4 · genizálása ^produkálható, köapyoo kontrollálható, és léptékében könnyen növelhető laboratóriumi léptékű alkalmazásról ipari léptékű alkalmazásra.
A találmány tárgyát eljárás képezi poxviruaok, közelebbről vacciniavímsok, például az 5 Elsttee törzs vagy módosított vaeciniavírus Ankara (MVA) kinyerésére .fertőzött sejtekből. A találmány szerinti eljárásban ágy nyerjük ki a poxvkusokst fertőzött sejtekből, hogy a fertőzött sejteket nagy nyomás alatt homogenizáljuk, miáltal poxvimstartaimé homogenizútmnot kapunk.
Meglepő volt, hogy a találmány szerinti eljárással intakt és fertőző poxvirusok nyerhető tők ki. Nagy nyomás mellett végzek homogenizálást szokásosan alkalmaznak sejtes· és szubcelluláris struktúrák .roncsolására abbéi a célból, hogy proteineket, lipideket izoláljanak eukaríota vagy prokaríota sejtekből. A 3 953 00S számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban eljárást ismertetnek, amelyben mikrobiáhs· sejtekből fimkcionális komponenseket nyertek ki nagy nyomású homogenfzálással. A fenti eljárással élesztő proteineket, bakteriális enzimeket és élesztő lipideket extraháltak, A DE 1991S619 számú német szabadalmi bejelentésben nagy nyomású homogenizálás alkalmazását Írják le HbsAg Izolálására élesztő sejtekből, A 4 255 521 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetett eljárás szerint glükóz ízomerázt extrákéinak, mikroorganizmus sejtekből nagy nyomású felszabadító eljárással. Nagy nyomású homogenizálást alkalmaztak továbbá virusszerü részecskék .20' („vinrs-Hke partielesU VLF) izolálására rekombináns óhccánromyca® awvfenm sejtekből [Milbum és Dunhill: Siotechnology and Bioengmeering 44, 73Ő (1994)], valamint adenovi.rus-vektorok előállítására és tisztítására (6 194 191 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás). A VLP-k és adeuovírusok. burokkal nem rendelkező, meglehetősen kisméretű és egyszerű vírusrészecskók, amelyek celluláris proteiMttuktárákhoz. hasonlóak. Nem megleli 5 po tehát, hogy a nagy nyomású homogenizáld, amely alkalmasnak bizonyult proteinek izolálására sejtekből, adenovírnsok és VLP-k izolálására is alkalmazható eukarióta sejtekből. Ezzel szemben, az intracelluláris éreti poxvirus virionok jlMV, lásd az alábbiakban, Fields és mtsai.; Fields· Vtrology, Lippmcott-Raven, Philadelphia, USA, 1SBNÖ-7SÍ7-0253-4, 83» fejezet, 2654-5. oldal (1996)] morfológiája igen összetett, ami többek, között hpidmembránokat tartalmaz. A poxvirus IMV morfológiája és fizikai tulajdonságai bizonyos vonatkozásban. közelebbi rokonságot mutat a sejt morfológiájával és fizikai sajátságaival., mint a burokkal nem. rendelkező vírusokéval Azt vártuk tehát, hogy a sejtek nagy nyomású homogenízálással történő roncsolására alkalmazott körülmények a poxvlrusok roncsolódását ís eredményezik. Meglepd módon azt találtuk, hogy a nagy nyomású homogenizálás roncsolja a sejteket, do ·'♦*« φφ.χφ
X ΧΦΦ X «.
* < «φ
-5elegendö virosrészeeskét hagy intakt állapotban ahhoz, hogy azok tisztításra érdemesek legyenek Más szóval, nem vártak volna, hogy a nagy nyomású homogenizálás alkalmas lesz poxvírusok kinyerésére fertőzött sejtekből, Az ismert eljárások. szerint, pöxvimsokat ultrahangos homogsnízálással nyernek ki fertőzött sejtekből, ami kíméletes boniogenlzálási módnak te5 kiüthető. Az ultrahangos homegenlzálásí eljárásokkal szemben, a találmány szerinti eljárással a tértözött sejtek reprodukálható módon homogenízálbatók; az eljárás könnyen kontrollálható, és léptékében könnyen növelhető laboratóriumi léptékű alkalmazásról ipari léptékű alkalmazásra.
A leírás szerinti értelemben „pozvirusorC a poxvitídae családba tartozó bármely vírust 10 értünk, A találmány egy előnyős megvalósítási, módja szerint, az eljárást a poxváídae család ehordopoxvifinae alesaládjába tartozó vírusok, előnyösebben oríhopoxyírusok, avípoxvfrusok, eapripoxvirasok vagy suipoxvímsok kinyerésére alkalmazzuk. Legelőnyösebben, az eljárást vaeciniavirus, kecske poxvírus, birka poxvírus, kanári poxvírus és baromfi poxvlrus kinyerésére és tisztítására alkalmazzuk, A találmány szerinti eljárásban alkalmazható vueelma15 vírus törzsek például az Elstteo, Wyeth, Koppenhága, Temple of Haves, NYCBH és Western Reservs törzsek. A találmány szerinti eljárás alkalmazása nem korlátozódik a felsorolt vauéinia vírus törzsekre, hanem az ulkalmazbatő bármely vaeelniavims törzs kinyerésére. Az eljárást előnyösen módosított vacemiavíras Ankara (MVA) törzs tisztítására alkalmazzuk. Tipikus MVA-tőrzs az MVA 575, amely ECACC V0Ö12<17Ö7 nyilvántartási számon lett letétbe helyezve a „Bnropean Collecfion of Animál Cell Csitures' ’ gyűjteményében. A törzs legelőnyösebben MVA-BN vagy annak származéka. Az MVA-BN leírását megtaláljuk a WO 02/42 480 számú nemzetközi közzétételi iratban (PCT/BPQ1/13620), A fenti nemzetközi közzétételi Iratban biológiai, vizsgáló eljárásokat Írnak le, amelyek alkalmasak annak eldöntésére, hogy egy MVA-tőrzs MVA-BN-törzs vagy annak, származéka, továbbá alkalmasak
MVA-BN vagy származékainak kinyerésére. A fenti közzétételi irat teljes terjedelmében a kitanítás részét, képezi, Az MVA-BN ECACC V0Ö83ÖÖ8 nyilvántartási számon lett letétbe helyezve a „European Collecfion of Animál Cell Cuitures” gyűjteményében.
Ά kinyerendő vírusok lehetnek natív vírusok, attennált vírusok vagy rekombináns vírusok.
A leírás szerinti értelemben ,rekombináns víruson” értőnk bármely vírust, amelynek genomjába a vírusgénem részét eredetileg nem képező heterológ gén lett ínszertálvn, A hetetekig gén lehet terápiás hatású gén, legalább egy; immunválaszt indukáló epitópot hordozó antigént vagy pepiidet kódoló gén, antiszensz expressziós kazetta, vagy ribozim gén. Rekombináns vírusok előállítására alkalmas eljárások, szakember számára ismertek, A heterológ gént *
* frfr »·* fr frfrfrfr fr V frfr
- 0 előnyösen a vírusgénem nem esszenciális régiójába inszertáljuk. A találmány egy további előnyös megvalósítási módja szerint, a heterológ nnkkmtid-szekvnneiát az MVA-genom természetes álon létrejött doléciójámtk pozíciójába inszertáljuk (lásd a PCT/E-P9Ő/Ö2 926 számú PCT szabadalmi, bejelentést).
„Alternált víruson” elvan vírust értünk, amely a gazda organizmust megfertőzve alacsonyabb mortalitású és/vagy morbiditásé, mint. a nem atíenuált szelei vírus, ilyen attennáh yaccimavlrus például az MVA-lörzs, közelebbről :MVA-57$ és MVA-BNl
A poxváusok, például vaccímavírus, két különböző tonnában fordul elő: sejtmembránokhoz kapcsolódó formában, a fertőzött sejtek eitoplazmájában {intracelluláris ereit víúonőkként; 1MV), és sejtből kijutott vírusokként (extraeeíhiláris, burokkal rendelkező víríonokként; „artraee/fefor eswfopad vfofomA, EBV) [Vanderplasshen A.., Hoiliushead Smith G,L.: „Intracellnlar and oxtracelíular vaeeinia virions enter cells by different rnecframsms”, I Gén Virol, Tg, §7? (1998)j. Mind az 1MV, mind az EEV fertözökepes, de morfológiájuk eltérő, mivel az EEV iipopmíein burokkal is rendelkezik. Normális körülmények mellett az IMVrészecskék sokkal nagyobb számban fordulnak, elő, mim. az EEV-k, de a találmány szerinti eljárás mindkét forma kinyerésere alkalmazható.
A találmány szerinti eljárás homngenizációs lépésében az adott poxvírussal fertőződ sejteket alkalmazunk kiindulást anyagként „Fertőzőit sejteken’'5 a találmány szerinti eljárás homogenízáelős lépésében alkalmazod kiindulási anyagot értünk, azaz az adott, vírussal fertőzőt! intakt sejteket; a fertőzöd sejtek részeit, vagy fragmentumait, amelyekhez a poxvírus kapcsolódott; vagy intakt sejtek és lizáltAxmesolí sejtek elegyét. Fertőzött sejtek részein vagy fragmentumain érijük például lizáltfroncsolt sejtek sejtmembránjait, amelyekhez az adott poxvlros kapcsolódott. A. kiindulási anyag szabad vírusrészccskéket is tartalmazhat, amelyek nem kacsolódnak sejtmembránokhoz, és nem ínfracellulártssk.
A találmány szerinti eljárásban kiindulási anyagként alkalmazható fertőzött sejteket úgy kaphatunk, hogy eukarióta sejteket fertőzünk az adott poxvírussal. Eukarióta sejtekként az adott poxvírusfertőzésre fogékony, és .fertőző vírusok replíkációjáf és termelődését lehetővé tevő sejteket alkalmazunk. Ilyen sejtek poxvírusók tenyésztésében járatos szakember szúrnám ismertek, Ilyen, MVÁ és Elsírna vaecinia-vhustöm szaporítására alkalmas sejtek, például a csirkeemhríé fibroblasztok (CBE) íöexler 1, Heller IC, Wahren B,, Eriié V, és Sutter G,: „Highly attennated modified vaccinia Ankara repficates in báhy hámster kidney cells, a potentűd bőst tor vírus propagation, bút nőt In various humán transformed and prímary cells”, I Gén. Virol. 79, (1998)1. A CEF-sejtek szakember számára ismert körülmények mellet tenyészthetők. Előnyösen, a CEF-sejíekei szémmmentes tápkőzegben, stacioner vagy gördülő
.... 7 palackokban tenyészfiük, A sejteket előnyösen 48-9Ő órán át 37á=2°C-en végezzük. A fertőzéshez a pox vírusokat előnyösen 0,05-1 TCIDsg fertőzési többszörös („nsntóp/mííy pf íp/eert<?»”, MO1) koncentrációban alkalmazzuk, és a fertőzött sejteket 48-72 őrén át, 37±2°C-on inkubaijuk.
A fertőzés folyamatát a citopátiás hatás (“cytoputótó CPB) megfigyelésével követhetjük, amely iipiknsao a fertőzött sejtek lokersketlésébon nyilvánul meg.
A találmány szerinti eljárással poxvfrpsok, például Elstree- vagy MVA-virasok nyerhetők ki a fertőzöd sejtekből A bírás szerinti értelemben “kinyerés” alatt azt értjük, hogy a találmány szerinti eljárással a poxvírassal fertőzött sejtek roncsolhatok és/vagy a poxvímsok a sejtmembránokról - amelyekkel általában kapesokúosak ~ leválaszthatók, olyan mennyiségben, hogy azok további tisztítása gyakorlati nehézségekbe nem ütközik. A fertőzött sejtekből tehát a kinyerés során homogén elegyet (a továbbiakban ”poxvirosíiufalmú homogeuízátnmot”) kapunk, amely szabad poxvímsokat, és elenyésző mennyiségben intakt, nem roncsolt sejteket és sejtmembránokhoz kapcsolódé vírusokat tartalmazó sej körmei éket foglal maga15 ba
Amennyiben a fertőzött sejtek szuszpenzíós tenyészetben fenntarthatok, azok eeatrifngslássa! könnyen összegyőjthetők.
Amennyiben a fertőzött sejtek többé-kevésbe Intakt adherens sejtek, azokat a magas nyomásé hemogenízálás előtt össze kell gyűjtenünk, azaz a tmyésztőeőény feláréi le kell va20 Úsztattunk. Ilyen eljárások-szakember számára ismerték. Alkalmazhatók például mechanikus eljárások (például gumi sejtkaparó alkalmazása), fizikai behatáson alapuló eljárások (például fagyasztás -15eC-nál alacsonyabb hőmérsékleten, majd a tenyésztőedény felolvasztása •s-lő^C-os hőmérsékleten), vagy biokémiai eljárások (enzimes kezelés, például a sejteket leválaszthatjuk tripszinne! a tenyészfőedény faláról). Ha enzimeket alkalmazunk erre a célra, az inkubációs idő szigorúan szabályoznunk kőik mivel ezek az enzimek a vírust is károsíthatják az Inkubáció során.
A találmány szerinti eljárásban, a fertőzött sejteket, közelebbről az összegyűjtőit fertőzőit sejteket nagy nyomású bomogemzálásnak vetjük alá. A leírás szerinti értelemben a „nagy nyomású komogenizálásfe esetenként „HPkfe („f/fgk fWsmre A'oruogenfeoftó.tó’) rövidítéssel jelöljük. A nagy nyomású homogenizáld kettős hatásé. Egyrészt, a nagy nyomású homogenizáld intakt sejtek roncsolódásához vezet. Az IMV-k tehát felszabadulnak, és további tisztítás számára bnzzáferbetóekké válnak. Másrészt, a nagy nyomású hotnogenfeákís hatására a poxφ φ φ φ *
*Φ X φφφ vírusok leválnak a sejtmembránokról, vagy legalább, a sejmternbrán-vírus aggregátumok mérete csökken. Ez szintén megkönnyíti a jmxvírusok további tisAitásáf.
A nagy nyomású homogenizálás elve szakember számára ismert [White MIX, .Marcus
D.; „Disintegration of microorganísms”, Adv. Biotecbnol. Processes 8, 51 (1938)). A HPH rendszerek nagy nyomás alkalmazásán alapulnak amely a. mintái kis mérem, rögzített nyíláson préseli át. nagy sebességgel, szabályozott és reprodukálható körülmények mellett. A leírás szerinti értelemben a Jet”, „nyílás” és „széf5 kifejezéseket egymással felcserélhető módon használjuk.
Mindegyik sejtroncsoló központi része a roncsolófej. A roncsolófej előnyösen a követ10 kezekből áll: (.1) nagy nyomású kamra/henger; (B) nagy nyomást, létrehozó dugattyú, amely a kamrábadiengerbe hatolva megnöveli a nyomást a kamtábas/hengerben; és (Π1) szájf’jet” amelyen át a kamra tartalma kijut, A kilátó kamratartalom eélfelületre, például egy darab fémre jut. amely előnyösen hőcserélő felszínnel rendelkezik, lehetővé téve a kmnratartalom lehűlését, A roncsolt kammtartnlom összegyűjtésére a rendszert a roncsolt minta gyűjtésére atkal15 más eszközzel („gyűjtőkamrával”) látjuk eb Tipikus nagy nyomású homogenizáló egység a „Basic A s” (Constsnt Cell Dísrupűon Systems, Low March, Daventry, Northants, NN .114SD, Egyesült Királyság).
A. találmány egy előnyős megvalósítási módja szerint, a nagy nyomású homogenizáló rendszer alkalmazásával három lépésben érjük el a sejtek ronesolását (1) A mintát a nagy nyomású hengerbe/kamrába juttat)uk. Ezután, a hmgerbenőramrában megnöveljük a nyomást.
Ehhez, a nagy nyomást létrehozó dugattyút a kamrába süllyesztjük. (II) A. dugattyú a mintát nagy sebességgel átkóuyszcriti a nyíláson, A minin gyors átjutása a magas nyomású helyről -az alacsony nyomásúra a sejtek roncsolódásához vezet (111) A minta a célhelyre jut, ás gyorsan eloszllk a hűtött hőcserélő felszínen. Ezután, a termék a gyűjtőkamrába folyik. A hidraulikát űjratökiiik, és a ciklust ismételjük.. Á. folyamat végén a kiürített homogenizátumot a térfogattól függően, megfelelő tartályba. összegyűjtjük.
Ahhoz, hogy a poxvnusokat a találmány szerint· eljárással kinyerhessük, tt nyilásátméronefc ΟΟΟ-Ο,ό mm, 0,15-0,6 mm, 0,15-0,50 mm, előnyösen, 0,15-0,40 mm, 0,20-0,50 mm, még előnyösebben 0,20-0,40 mm, legelőnyösebben 0,25-0,35 mm tarmmánylnm kell lennie.
A kamrábaműtengerben uralkodó nyomást 200-1000 bar, előnyösen 400-1000 bar,
200-800 bar, előnyösebben 400-800 bar, 600-1000 bar, még előnyösebben 600-900 bar, legelőnyösebben 700-900 bar értékre állítjuk be. legelőnyösebben 800 bar nyomást alkalmazunk.
A homogenizálom hőmérséklete a kimeneti nyílásnál előnyösen nem haladja meg a
-;·25Α?-οή és előnyösen 15*C alatt, előnyösebben KÁC alatt marad.
-9A találmány szerinti eljárás léptéke csaknem lineáris módon növelhető, és mind szakaszos, mind folyamatos üzemmódban alkalmazható.
Szakaszos üzemmódban, a homogenizálandó sejttételek egy vagy több alkalommal vethetek alá nagy nyomású homogenizálásnak. Előnyösen, mindegyik tételt egy-három alkalommal, legelőnyösebben· csak egy alkalommal homogettizáhntk,
A homogenizáció sikerességét előnyösen a kiíndclási anyag és a homogenizációs lépest követően kapott, tennék vírustiterének meghatározásával ellenőrizzük [amely a fertőző vlrostészecskék számának felel meg, és amelyet, a szővettenyészet 50%~át fertőző dózis (TC1D50), vagy a plakk-kópző egységek (pia) számának meghatározásával mérhetünk). Más szóval, a vírustitert meghatározzuk a nagy nyomásé homogeoizálás előtt, és azt kővetően. A kiindulási minta több-kevesebb intakt sejtet, és nagy százalékban nagyméretű aggregátumokat tartalmaz, amely utóbbiakat sejtmembránokhoz kapcsolódód poxvírusrészecskék alkotnak. Ra ilyen mintát alkalmazunk a vhusbter meghatározására, a kapott ther alacsonyabb a fertőző részecskék valóságos számánál. Ennek oka az, hogy a vírustiter meghatározására alkalmazott tesztrendszer rendszerint sejttenyészet (például a 2, példában ismertetett rendszer), ahol a fertőzött sejtek vagy a plakkok számát adjuk meg. Áz ilyen rendszerek, nem képesek különbséget tenni az olyan pozitív eredmények közt, amelyek abból adódnak, hogy a sejt egyetlen vírusrészöcskével fertőződik, vagy nagyméretű, s^tmembránboz kapcsolódó vírusokat hordozó aggregátumokkal fertőződik. A nagy nyomásó. bomogenizálást követően, a poxvímsok leválnak a sejtmembránokról és/vagy a sejtmembrán-vírus aggregátumok mérete jelentősen csökken, ami a kisebb aggregátumok számának megnövekedéséhez vezet. Amennyiben ilyen mintában határozzuk meg a titert, az magasabb lesz, még akkor is, ha a fertőző vírusrészecskék mennyisége' valójában nem változott, A homogenizáció sikerességét tehát a kiindulási mintáéval legalább megegyező, vagy azénál magasabb TClDsohni jelzi (A „TCID,! a „.Ohauo ea/ínre in/ecíioíía dmc”, azaz „szövertenyészetet fertőző dózis” .rövidítése), A csatolt példákban a TCIDso-őnl meghatározásának módját részletesen is ismertetjük. 'További lehetőség szerint, a nagy nyomású hömogenizálás minőségi jellemzőit és hatásfokát eiéktronnukroszkóppal is ellenőrizhetjük.
Amennyiben a terméket tovább kívánjuk tisztítani, a kapott homogemzátnmot legalább egy tisztítási lépésnek vetjük alá, hogy poxvírusokban dúsított, frakciót kapjunk. Közelebbről, a vaceiniavirus-iartalmő homogenizátumot akkor vetjük alá ilyen lépéseknek, ha. a vacciniavirost tovább kívánjuk tisztítani.
A tisztítást végezhetjük például a következő eljárásokkal:
-10 - szakaszos centrifugálás (például szacharázpáma alkalmazásával) vagy folyamatos áramlása ultmeentrifitgálás (szacharózgradíensek) [Hiiíenhans X, Kőhler R.. és Graschk.au R; X Bioi Stand. 4, (1976); Madalínski W., Bankovskí A. és Korbeekí M.; Acta Virol. 21» (1977)];
- nltrafiltráció (például keresztáramlásos szűrés 500 kDa-nál nagyobb, de Ö, 1 pm-nél kisebb vagy egyenlő pórusáímérőjü membránon);
- oszlop imunatogrlfia (például Ioncserélő, hidrofób kőlcsőnhatásos, mobkulaszürő kromatográfia vagy azok kombinációja) [Hedström K.G. és Lindberg IX; Z, Inmrnn. Forscb. 137.421 (1969); Stiekl R, K.orb W. és Hochstem-Mmízel V.; Zbl Baki, 1. Abk Qri.g. 215, 38 (1970); vagy
- a fentiek valamilyen kombinációja (Masuda N., Ellen R..P. és Grove ΙΧΆ,: X Bacteriol 147(3), 1095(1981)].
A találmány szerinti megoldással összhangban, szakember számára ismert bármely egyéb tisztító eljárás is alkalmazható.
Előnyösen, a tisztítási eljárás uitrafilírálás. Legelőnyösebben, az ulfrafrltrálás keresztáramtásos szűrés, A keresztáramlásos szűrés elve szakember számára ismert. Lásd például Ríebards G.1X és Gokhmnts IX: ,,Evahudion of a eross-fiow filfraüon teebnique fór extraetíon of pollovfrnaes Írom inocnlated oysíer tissue homogén.&tesw, X Virol. Methods 4(3), 147 (1982)],
Bár egyetlen tisztítási lépés elegendő a. biológiai gyógyászati készítményekre vonatkozó előírások betartásához, két vagy több fenti tisztítási lépést kombinálhatunk egymással, hogy még tisztább készítményt kapjunk.
A találmány legelőnyösebb megvalósítási módja szerint, az első tisztítási tépés keresztáramlásos szűrés, amelyet legalább egy oszlopkmmatográfiás lépés követ. Legelőnyösebben, az oszlopkromatográfiás lépés ioncserélő kromatográfia vagy hidrofób köicsöhhatásos kromatográfia.
A fenti módon kapott, vírusban dúsított frakciót adott esetben fagyasztva-szárítjuk. A íágyasztva-szárítás kivitelezése szakember számára ismert (Oay .1. és McLellan M.: „Cryopreservaíion and freeze-dryíng protocols”, Methods i.u Molecular Blology 38, Humana Press
Szintén a találmány tárgyát képezi a találmány szerinti, poxvfrusok kinyerésére kítóllesztett eljárással, azaz a fertőzött sejtek nagy nyomású homogenízálásával kapod poxvírusokban dúsított frakció és/vagy poxvírnstarfalmú homogorúzáíam, Közelebbről, a találmány tárgyát képezi a találmány szerinti, poxvírusok kinyefósém/tisztdására. kifejlesztett eljárással Φφ .%·
Κ φ** * ♦♦ *φ*φ * * ** * * 3 * * * X .χ * <· Φ * φ ♦*Φ« Φφφ >ν $ ·· η amelyben a HPH-val kapott poxvímstarialmó. homogemzátumöt legalább egy tisztítási lépésnek vetjük alá - nyert poxvirusokban dúsított frakció. A poxvints bármely fent említett poxvirus lehet. Közelebbről, a találmány szerinti poxvhns vacciníavírus» például vakeinázá&ra alkalmas bármely törzs, közelebbről Blstree-tőrzs vagy módosított vaccíniavtrus Ankara, leg5 előnyösebben MVA-BN.
A találmány szerinti, HPH-lépést magában foglaló eljárással kapott poxvfrusíartalmú homogenizátumbsn és/vagy poxvímsokban dúsított frakcióban a szabad 1MV- poxvirusok aránya az EEV-poxvírt»okhoz képest igen magas. A leírás szerinti értelemben „szabad ÍMV~ n” („free mrruceZ/aZar amrimn víriex’’} a sejtmembránokról & fertőzött sejtek ronesolását kőve10 időn, azt megelőzően, vagy annak során leválasztott ÍMV-ket értünk, amelyek ezáltal tovább tisztíthatóak. Valamennyi poxvírus előállitására alkalmazott eljárásban, a kiindulási anyag a fertőzött sejteket és a tenyészet félülászőját egyaránt tartalmazza. A kiindulási anyag tehát tartalmazza a fertőzött sejtekben előforduló ÍMY-poxvírusökat, valamint az elsősorban a feíülászóban található EEV-poxvírnsokak A sejtek ronesolására és azt kővető homogenizálására szokásosan alkalmazott eljárások (például nltrahangkezelés) nem roncsolják a sejteket és/vagy választják le az IMV-poxvn'nso.kat a sejttömaelékrol olyan hatékonyan, mist a nagy nyomású botnogeoizáiás. Más szóval, az IMY-k többsége seítmentbtáuokhoz és sejttörmelékhez kapcsoltan marad. Az. 1MV és EEV aránya tehát alacsonyabb, mint a találmány szerinti eljárással kapott teonékbezc Az ultrahangkezelés alkalmazásán alapuló eljárásokban ezek az arányok
2Ő nem változóak meg jelentős mértékben a további tisztítási lépések során, mivel a sejfrörmelék, amelyhez az 1MV még mindig kapcsolódik, rendszerint eltávolításra kerül. Szemben a poxvírusok kinyerésére alkalmazott ismert eljárásokkal, a találmány szerinti eljárás alkalmazásával igen hatékonyan roncsolhatjuk a fertőzött sejtéket, és az IMV-ket igen hatékonyan szabadíthatják fel a sejtmembránokról. A tisztítható, szabad IMV-k mennyisége összességében tehát magasabb, mint az a technika állása szerint Ismert eljárásukkal elérhető, következésképp, a szabad IMV-k EEV-pox vírusokhoz viszonyított aránya is magasabb.
A találmány szerinti eljárással kapott poxvfrustartalnm homogenizátum és/vagy poxvímsokban dúsított frakció alkalmazható vakcinaként
Amennyiben a poxvirusíartalmú homogenizátam és/vagy poxvirusokban ddsitoti frak.30 ció módosítatlan poxvírusokat vagy attennált poxvírusokat, például az Elsiree- vagy M'VAvaeemiavírustörzset tartalmaz, az alkalmazható poxvíms-fertőzések ellent vakcínázáso, például, vaccíníavínrsokat, például az Blstree- vagy MVA-törzset, előnyösen MVA-BN-törzset. tartalmazó virustartahnú homogenizátum és/vagy vírusokban dúsított frakció alkalmazható fekete irisnlő ellem vakeínázásra.
a zx, r** <x t í : -xo **** *.φχ φχ χ χχ <
.. i ·?..
ί· ΦΧ
Amennyiben a-pexvirusiart&lmú homogenizátsm és/vagy pox vírusokban dúsítod frakció egy vagy több heterológ gént tartalmazó és expresszáló poxvírusokaí tartalmaz, a poxvfrustarialmú bomogenizátum és/vagy poxvímsokban dúsított frakció állatok vagy ember vakéiúszására is alkalmazható a heterológ gén(ek) által exptesszált proteinnel szemben.
Ahhoz, hogy a találmány szerinti eljárással kapott poxvlrustartabnő homogenízátumból és/vagy poxvírusokban dúsított frakcióból vakcinát állítsunk elő, azt fiziológiásán elfogadható formává kell alakítanunk. Ezt végezhetjük fekete himlő elleni vakcinázásra alkalmazott poxvímsvakcmák előállítása terén szerzett tapasztalatok alapján [például Stlokl H. és mtsai. által leírtak szerint; Dtseh. Med. Wschr. 99, 2386 (1974)]. Például, a poxvírustartalmú homogealzátumot és/vagy poxvhnsókban dúsított frakciót 5x1 Ös TCfOjíVml literben, körülbelül 1.0 mmol/l Tris, 140 mmol/l NaCI (pH-7,4) összetételű pofrerhen föntmlázva, -80°C~on tároljuk. Egy adag vakcinát előállíthatunk például ügy, hogy például lOMö* TCID5.3 vírust lioülixálunk íoszíát-pofferes fiziológiás konybasóoldathan (PBS-ben), 2% pepton és 1% humán albumra jelenlétében, ampullákban, előnyösen üvegampullákban. A vakcina adagokat előállíthatjuk úgy is, hogy a vírust lépcsőzetes módon fagyasztva-szárítjuk a készítményhez,
A készítmény tartalmazhat, további adalékokat, például marmííoí, doxlránf, cukrot, glicint, lakiózt, vagy polivinilpinokdont, vagy más adalékokat, például antíoxídánsokat, inért gázt, stabiHzálószert, vagy m vivő beadásra alkalmas rekombináns proteineket (például humán szérumalbnnúnt), Fagyasztva· szárifásra alkalmas virustartalmú készítmény tipikusan a. .következőket tartalmaz: 10 mmol/l Tris-puffer, 140 rmnol/1 NaCI, 13,9 g/l dextrán (molekulatömeg; 36 00040000), 45 gd szacharóz, 0,108 g/l L-glutaminsav-káíinmsó (monobidráf) (pH~7,4), Ezután, az üvegampulíát lezárjuk, és néhány hónapig 4°C és szobahőmérséklet közti .hőmérsékleten tárolhatjuk, Amennyiben azonban arra hosszabb ideig nincs szükség, az ampullát előnyösen 2(ri€ alatti hőmérsékleten tároljuk.
Vakcinázáshoz, a liofilizált, lagyasztva-szárhott terméket 0,1-0,5 ml vizes oldatban, előnyösen fiziológiás sóotáatban vagy Tris-pufrerben oldjuk, és szisztémás úton vagy lokálisan, például, parenterálisan, húramoszknlárisan vagy szakember számára ismert egyéb módon adagoljuk. A beadás módja, a dózis és az adagolások száma szakember számára ismert módon optimalizálható, A. poxvírus-vektorokat legelőnyösebben szubkután vagy íntramuszkulárisan adjuk be,
A találmány tárgyát képezi továbbá eljárás állatok vagy ember vakcínázásám, amelyben a vakcinázásra szoruló állaioi vagy embert a találmány szerinti eljárással előállított poxvlmstartalmó. homogenizátummal vagy poxvírusokban dúsított frakcióval oltjuk.
Φφ φ.*φ
- 13 A találmány tárgyát többek között az alább felsoroltak képezik:
A találmány tárgyát képezi eljárás poxvírosok kinyerésére fertőzött sejtekből, amelyben a fertőzött sejteket nagy nyomású homogenizáljak vetjük alá, miáltal poxvírustertalmú homogenizátumot kapunk.
A találmány tárgyát képezi továbbá a fenti eljárás, ahol orthopoxvirusokat, avipoxvírusokat, suipoxvírusokat vagy et^ripox vírusokat nyerünk ki
Ugyancsak a találmány tárgyát képezi a fenn eljárás vaeciniavírus, kecske poxvírus, birka poxvírus, kanári poxvírus vagy baromfi. poxvírus kinyerésem.
lö A felsoroltakon felni, a találmány tárgyát képezi a fenti eljárás, ahol a vaeciniavírus módosított vaeciniavírus Ankara (MVA), közelebbről az ECACC gyűjteményében VöOObaOOö nyilvántartási számon letétbe helyezett MVA-BN,
Szintén a találmány tárgyát képezi a fenti eljárás, ahol a poxvírus rekombináns poxvínis,
A találmány tárgyát képem továbbá a fenti eljárás, amelyben a fertőzött sejteket nagy nyomású kamrában helyezzük el, a kamrában a nyomást megnöveljük, és a fertőzött sejteket egy száj adókon át kiürítjük a kamrából.
A találmány tárgyát képezi, a fenti eljárás, ahol a kamrában 200-ÍÖÖÖ bar nyomást hozunk létre.
Színién a találmány tárgyát képezi a fenti eljárás, ahol a sejteket 0,10-0,6 mm átmérőjű száiadékon át ürítjük ki.
Ugyancsak a találmány tárgyát képezi a fenti eljárás, amelyben a poxvírusmrtalmú homogenizátumot legalább égy tisztítási lépésnek vetjük alá, miáltal poxvlrusokhan dúsított frakciói kapunk.
Á találmány tárgyát képezi a fenti eljárás, ahol az említett tisztítási lépésként uitmríltráciöt alkalmazunk.
A felsoroltakon felül, a találmány tárgyát képezi a fend eljárás, ahol ultrafilttáeiés eljárásként keresztáramlásos szűrési alkalmazunk.
Ugyancsak a találmány tárgyát képem a fenti eljárás, ahol a keresztáramlásos szűrést 20 5ÖÜ kDa-nál nagyobb, de 0,1 pm-nél kisebb vagy 0,1 pm pórosátméröjű szűrő alkalmazásával végezzük.
Szintén a találmány tárgyát képezi a fenti eljárás, ahol az ulirafüiráciös lépést követően a filtrátumot legalább egy oszlopkromatográfíás lépésnek vetjük alá.
* X ír φ φ φ $·ίχ·:
~ 14Α .fenti eljárás, ahol a kapott poxmrustartáimú hootogemsáünnot vagy poavímsokban dúsított frakciót fagyaaztva-száritjnk.
Ugyancsak a találmány tárgyát képezi a fenti eljárással kapott poxvirustartatmú homogenizátom vagy poxvírusokban dúsított frakció,
A felsoroltakon felül, a találmány tárgyát. képezi a poxvírnstatta.lmú bomogenizátum vagy poxvimsokban dúsított frakció alkalmazása vakcinaként.
A. találmány tárgyát képezi továbbá a poxvirustartáimú homogonixátmn vagy poxvírusokbaa dúsított frakció alkalmazása vakcina előállítására.
Szinten a találmány tárgyát képezi eljárás állatik és/vagy ember vakcinázására, amelyben poxvírustartalmú homogenízátomot vagy poxvírusokban dúsított frakciót vagy a fenti vakcinát juttatunk az állati /emberi szervezetbe.
Agalöak^íÓyfe^^söúkAWfec^lgltá^
Az 1. ábrán MVA-BN-vírusokkal fertőzött, virusszuszpenzto előállítása céljából fagyasztásos-olvasztásos ciklusnak alávetett CEE-sepek láthatok. A szuszpenxió vírustiterél a 2, példában ismertetettek szerint, a sejt-vúns szuszpenxió további tisztítása nélkül határoztok meg („0 érték’*). A vírus-sejt sznszpenzíót a technika állása szerint ismert módon, ultrahangos kezeléssel („Soniííer alkalmazásával) vagy a találmány szerinti bomogenízálási eljárással (,,ΗΡΙΤ j homogenizáltok az 1. példában leírtak szerint, A HEH-lépésben SÖO bar nyomást alkalmaztunk, a szájadék. átmérője 0,25 mm volt, A bomogenizáctos lépés végén a vírusiítert ismét meghatároztok.
A találmány szerinti, megoldást a továbbiakban konkrét .megvalósítási példákon keresztül kívánjuk szemléltetni. Szakember számára világos, hogy az ismertetett példák csupán a találmány szerinti megoldás szemléltetését szolgálják, anélkül azonban, hogy igényünket azokra kori átoznánk.
/. pékár $fe?Qdry&seíUzuszgenz^
Ctorgőpalackban tenyésztett csiikecmbríó-fíhmbíasztokat (CBF) fertőztünk MVA-BN(ECA.CC VOÖO83OOS) vírusokkal. A fertőzött sejteket íagyasztásos-olvaszlásos ciklusnak vetettük. alá, miáltal víma-sejt szuszpenziót kaptunk.
„Basic Z-C’ homogenizátort (Constant Disraptinn Systems; Low Marcb, Daventty, Nottanis, NN í 14SD, Egyesült Királyság) 50-50 ml nyers vírus-sejt szuszpenzíóvai töltöttünk meg úutstásonként.. Az optimális bomogenízálási körülmények megállapítására, a hatásfokot \ ***$ 3*** χ Χ-Χ-Φ* * ' * Λ ί > ·φ·φφ
- 150,18--0,40 mm szájadékátmérő és 200--1000 bar nyomás mellett teszteltünk, A nyers szuszpenziőt nagy nyomású honrogenizálásnak vetettük alá egy, két vagy három ütemben, A feomogenizátort a gyártó utasításai szerint eljárva működtettük, Az eljárna hatásfokát a liter meghatározásával értékeltük a 2, példában ismertetettek szerint,
Előzetes vizsgálatokban azt találtak, hogy 0,4 mm~él nagyobb nyálásáímérd nem befolyásolja előnyösen a homogeoizáető hatásfokát. Megállapítottuk; hogy 0,18 mm, 0,25 mm és <1,35 mm szájadékáttnétö alkalmazása mellett a legjobb eredményt úgy érhetjük el, hogy a vírus-sejt szuszpenziét egy alkalommal §00 bar nyomásnak tesszük ki,,
A találmány szerinti eljárás hatásfokát a technika állása szerint szokásosan alkalmazott 10 keresztáramlásos nltrahangkezelésével hasonlítottuk össze, Eredményeinket az i, ábrán foglaltok össze. Az ultrahangos kezeléshez viszonyítva, a találmány szerinti eljárással magasabb vímstitert értünk el, és homogénebb szuszpenziét kaptunk, tehát az így kapott szuszpenziét alkalmasabbnak találtuk további feldolgozásra..
2. /fo/i/n
Médosjtptt.yaeemjayhus AuknmXMVAi.thrálá^
Módosított vneciniavtrua Ankara (MVA) titrálását. TCiDso alapú eljárással végeztük 10-es léptékű hígítást sor alkalmazásával, 96 lyuké raíkrotítráló lemezen, A vizsgálat végén, a sejteket anti-vacdnlavlrus-dienanyog és megfelelő alöhívéeldat hozzáadásával tettük látható20 vá.
Két-három (2-3) napos elsődleges CEF- (csirke embrió fibroblaszt) sej leket IxKŐseg/ml denzitásig hígítottunk 7% AFMMápközeghen, Tizes léptékű hígításokat készítettünk hígításonként 8 párhuzamos alkalmazásával, A hígítást kővetően, '100 pl sejtszuszpenziót oltottunk ki 96-lyukú lemezekre. Ezután, a sejteket egy éjszakán át, 3?f‘C-on inkubáltuk
5% C()2-att.noszíerában,
A vimstartalmá oldatot totális hormszemmoi nem tartalmazó REMI-tápközegben hígítottuk 10-ea léptékben (!0~* - Hfo), Ezután, 100» 100 ni vírusmintái adtunk a sejteket tartalmazó lyukakhoz, A. 9é~lyukú lemezeket.5 napig, 3?°€-on mkobákuk 5% CÖ?-atmoszférában, hogy a fertőzéshez és vírasreplíkációhoz elegendő időt hagyjunk, öt (5) nappal a fertőzést kővetően a sejteket vaceíniavíms-speclfikus d len anyagokkal megfestettük. A specifikus ellenanyagok kimutatására tonnaperosldázzal (HEP) jelölt második ellenanyagot alkalmaztunk. Az MVA-specifikns ellenanyag nyálban terrndt, políklonáhs anfi-vaccnűavlrus-ellcnauyag IgO-ífakeíója volt (Quartet, Berlin, Németország, #9503-2057).
A második ellenanyag nyúl. IgG ellen kecskében termelt pokklonális ellenanyag volt* amely HRP-vel led .konjugálva (Promega, Mannheim, Németország, #W4Ö11.}> A szímeakeiői ismert módon hívtok elő,
A TClDjs számításánál mindegyik szíoreakdőt adó lyukai pozitívnak minősítettünk, A 5 titer Spexmvm (1} és Kaerher (2} képletével számítottuk ki. Mivel valamennyi vizsgálati paramétereket konstans szinten tartottunk, a következő egyszerűsített képletet alkalmaztuk:
Vírustiter [TCS>sí/ml]:::: f ahol a:::: az utolsó oszlop hígitási faktora, ahol mind a nyolc lyuk pozitív; xfy:: a pozitív lyukak szánra a-H oszlopban; xg~ a pozitív 'lyukak száma a*2 oszlopban; és Xc~ a pozitív lyukak száma a-B oszlopban.
φφ f ?*** φ Φφφ )ί φ
X* *
Α.

Claims (14)

  1. SZABADÁLM1 IGÉNYPONTOK.
    1. Eljárás pexvírusok kinyerésére fertőzött sejtekből, nzzn/yelZenjez^, hogy a fertőzött sejteket nagy nyomású honmgenizálásnak vetjük alá, ««által poxvímstmtalmú homogenízátu5 mot kapunk.
  2. 2. Az I. igénypont szerinti eljárás, nzznl/oGonezre, hogy ortbopoxvfrusokat, avípoxvírusokat, süípoxvfinsekat vagy capripoxvímsokat nyerünk ki
  3. 3. Az 1. vagy 2, igénypont szerinti eljárás, aszal /e//emezve, hogy vacciniavírusokat, kecske poxvírusokaí, birka pox.vi.r«sokat, kanári poxvírusokat vagy baromfi poxvírusokaí
    10 nyerünk ki.
  4. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, öze/ jNánnervo, hogy vaceiniavínssként Bístree vagy módosított vaceimavlnís Ankara (MVA) vírusokat, közelebbről az ECÁCC gyűjteményében V000830Ö8 nyilvántartási számon letétbe helyezett MVA-BN-vísmsoknt nyerünk, ki
  5. 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti, eljárás, nazu//e/fenezw, hogy rekombi15 náns pox.vírusokat nyeritek ki.
  6. 6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, uzzn/jellemezve, hogy a fertőzőit sejteket nagy nyomású kamrában helyezzük el, a 'kamrában a nyomást megnöveljük, és a fertőzött sejteket egy szájadékon át kiürítjük a kamrából.
  7. 7. A 6. Igénypont szerinti eljárás, nzzu/ jü/fenezve, hogy a kamrában nyomást .20020 1000 bar-ra növeljük,
  8. 8. A 6-7. igénypontok, bármelyike szerinti eljárás, nzzn/ jeZ/emezve, hogy a sejteket 0,1 0-0,6 mm átmérőjű szájadékon át töltjük ki a kamrából
  9. 9. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, nzzn/jkrimezve, hogy a poxvírastartalmú homegenízátumot legalább sgy tisztítási lépésnek vetjük alá, miáltal poxvfmsokban
    25 dúsított frakciót kapunk.
  10. 10. A 0. igénypont szerinti eljárás, uzzu/yuhkínezve, hogy a tisztítási lépések egyikeként ultrafiltráeíót alkalmazunk.
    l l. A 10. igénypont szerinti eljárás, nézni /e/fe.meeve, hogy ultrafiltrációs eljárásként keresztáramlásos szűrést alkalmazunk.
    30 12. A 11. igénypont szerinti eljárás, nzzn/jeriomszví?, hogy a keresztáramlásos szűrést
    50ÖkDa-náI nagyobb, de 0,1 pm-rsél kisebb vagy legfeljebb 0,1 pm pőrusátmérőjő. szűrő alkalmazásával végezzük.
  11. 13. A 10-1.2. igénypontok bármelyike szerinti -eljárás, nzzn/je/femezve, hogy az altrafiltráeiós lépést követően a Sltrátumot legalább egy oszlopkromatográfiás lépésnek vetjük alá.
    ί ?***
    X φφφ ϊ
    •ί φ
    -1S
  12. 14, Άζ 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, omol yW/mazve. hogy a kapott poxvimstartaimú Iwsogemzátnrnoi vagy poxvirosokhan dúsított frakciót fagynsztva-szárítjnk,
  13. 15. Az 1-14« Igénypontok bármelyike szerinti eljárással előállított poxvírastmtalmú 5 homogenizálom vagy poxvímsokban dúsított .frakció.
    1.6. A IS, igénypont szerinti poxvímstarialmú homogemzálnm vagy poxvírasokban dúsított· fmkotó, vakcinaként történő alkalmazásra.
  14. 17. A 15. igénypont szerinti poxvírustartalmú homogenizátom vagy poxvintsokban dúsított frakció alkalmazása vakcina előállítására.
HU0402337A 2001-12-20 2002-12-13 Eljárás poxvírusok kinyerésére és tisztítására fertõzött sejtekbõl HU227507B1 (hu)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DKPA200101928 2001-12-20
PCT/EP2002/014179 WO2003054175A1 (en) 2001-12-20 2002-12-13 Method for the recovery and purification of poxviruses from infected cells

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HUP0402337A2 HUP0402337A2 (hu) 2005-01-28
HUP0402337A3 HUP0402337A3 (en) 2010-01-28
HU227507B1 true HU227507B1 (hu) 2011-07-28

Family

ID=8160920

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0402337A HU227507B1 (hu) 2001-12-20 2002-12-13 Eljárás poxvírusok kinyerésére és tisztítására fertõzött sejtekbõl

Country Status (23)

Country Link
US (1) US7056723B2 (hu)
EP (1) EP1407006B9 (hu)
JP (2) JP5322252B2 (hu)
KR (1) KR100947976B1 (hu)
CN (1) CN1289663C (hu)
AT (1) ATE302268T1 (hu)
AU (1) AU2002352247B2 (hu)
BR (1) BRPI0215003B1 (hu)
CA (1) CA2467099C (hu)
DE (1) DE60205631T2 (hu)
DK (1) DK1407006T3 (hu)
EA (1) EA006485B1 (hu)
ES (1) ES2247404T3 (hu)
HK (1) HK1071765A1 (hu)
HU (1) HU227507B1 (hu)
IL (2) IL161526A0 (hu)
MX (1) MXPA04006001A (hu)
NO (1) NO335975B1 (hu)
NZ (1) NZ533586A (hu)
PL (1) PL205929B1 (hu)
SI (1) SI1407006T1 (hu)
UA (1) UA77735C2 (hu)
WO (1) WO2003054175A1 (hu)

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7445924B2 (en) 2000-11-23 2008-11-04 Bavarian Nordic A/S Modified Vaccinia Ankara virus variant and cultivation method
NZ524661A (en) * 2000-11-23 2005-03-24 Bavarian Nordic As Modified vaccinia ankara virus variant
KR101044538B1 (ko) 2002-09-05 2011-06-27 버베리안 노딕 에이/에스 무혈청 조건하에서 일차세포의 배양 및 바이러스의 증식방법
US7951576B2 (en) * 2004-11-05 2011-05-31 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods for preparing cells and viruses
US7625570B1 (en) * 2005-03-10 2009-12-01 The Regents Of The University Of California Methods for purifying adeno-associated virus
JP2010526546A (ja) * 2007-05-14 2010-08-05 バヴァリアン・ノルディック・アクティーゼルスカブ ワクシニアウイルス系及び組換えワクシニアウイルス系ワクチンの精製
US8003363B2 (en) 2007-05-14 2011-08-23 Bavarian Nordic A/S Purification of vaccinia virus- and recombinant vaccinia virus-based vaccines
CN102257134B (zh) * 2008-02-12 2014-03-05 赛诺菲巴斯德有限公司 使用离子交换和凝胶过滤色谱进行痘病毒纯化的方法
CA2760465A1 (en) * 2009-05-12 2010-11-18 Transgene Sa Method for orthopoxvirus production and purification
FR2953686B1 (fr) 2009-12-14 2012-11-02 Agronomique Inst Nat Rech Procede pour reduire la teneur bacterienne d'un milieu alimentaire et/ou biologique d'interet, contenant des gouttelettes lipidiques
US10087423B2 (en) 2010-07-20 2018-10-02 Bavarian Nordic A/S Method for harvesting expression products
CN102353792A (zh) * 2011-07-07 2012-02-15 贵州大学 一种基于gpv p32蛋白的间接elisa试剂盒及制备方法
FR3042121A1 (fr) 2015-10-08 2017-04-14 Jean-Marc Limacher Composition anti-tumorale
US11306292B2 (en) 2017-05-15 2022-04-19 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stable virus-containing composition
WO2018211419A1 (en) 2017-05-15 2018-11-22 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stable virus-containing composition
AU2019336940A1 (en) 2018-09-06 2021-03-11 Bavarian Nordic A/S Storage improved poxvirus compositions
WO2021180943A1 (en) 2020-03-12 2021-09-16 Bavarian Nordic A/S Compositions improving poxvirus stability
WO2024003238A1 (en) 2022-06-29 2024-01-04 Bavarian Nordic A/S Epstein-barr-virus vaccine
WO2024003239A1 (en) 2022-06-29 2024-01-04 Bavarian Nordic A/S RECOMBINANT MODIFIED saRNA (VRP) AND VACCINIA VIRUS ANKARA (MVA) PRIME-BOOST REGIMEN
CN115197966A (zh) * 2022-08-15 2022-10-18 深圳源兴基因技术有限公司 一种利用生物反应器大规模生产重组痘苗病毒载体的方法

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB877898A (en) 1956-12-06 1961-09-20 Apv Co Ltd A new or improved method of liberating enzymes
JPS5328989B2 (hu) 1974-05-27 1978-08-17
CH621573A5 (en) 1976-08-05 1981-02-13 Vnii Biosinteza Belkovykh Vesc Process for the continuous disintegration of microorganism cells and system for carrying out this process
JPS54154594A (en) 1978-05-25 1979-12-05 Sumitomo Chem Co Ltd Extraction of glucose isomerase
WO1991001367A1 (en) 1989-07-20 1991-02-07 Bioeng, Inc. Supercritical fluid disruption of and extraction from microbial cells
UA68327C2 (en) * 1995-07-04 2004-08-16 Gsf Forschungszentrum Fur Unwe A recombinant mva virus, an isolated eukaryotic cell, infected with recombinant mva virus, a method for production in vitro of polypeptides with use of said cell, a method for production in vitro of virus parts (variants), vaccine containing the recombinant mva virus, a method for immunization of animals
TW426733B (en) 1995-10-06 2001-03-21 Merck & Co Inc Method of disrupting cultured cells using an impinging jet device
AU4556597A (en) * 1996-09-24 1998-04-17 Bavarian Nordic Research Institute A/S Recombinant mva virus expressing dengue virus antigens, and the use thereof in vaccines
US5721120A (en) 1996-10-02 1998-02-24 Merck & Co., Inc. Method of disrupting cultured cells using an impinging jet device
NZ299720A (en) * 1996-11-08 1999-07-29 Howick Engineering Ltd Epicyclic input/output annuli of same pcd, with planetary input/output gear sets, and with only one set having aligned teeth
EP0968284B1 (en) * 1996-11-20 2006-12-13 Introgen Therapeutics, Inc. An improved method for the production and purification of adenoviral vectors
US6000551A (en) 1996-12-20 1999-12-14 Eastman Chemical Company Method for rupturing microalgae cells
FR2787465A1 (fr) * 1998-12-21 2000-06-23 Transgene Sa Procede d'inactivation des virus enveloppes dans une preparation virale de virus non enveloppes
EP1155120B1 (fr) * 1999-02-22 2006-07-05 Transgene S.A. Procede d'obtention d'une preparation virale purifiee
DE19918619A1 (de) 1999-04-23 2000-10-26 Rhein Biotech Proz & Prod Gmbh Verfahren zum Gewinnen von rekombinantem HBsAg
US6951752B2 (en) * 2001-12-10 2005-10-04 Bexter Healthcare S.A. Method for large scale production of virus antigen

Also Published As

Publication number Publication date
NO20043181L (no) 2004-07-19
HUP0402337A2 (hu) 2005-01-28
NZ533586A (en) 2005-02-25
US20040265986A1 (en) 2004-12-30
EP1407006B1 (en) 2005-08-17
HK1071765A1 (en) 2005-07-29
NO335975B1 (no) 2015-04-07
JP5322252B2 (ja) 2013-10-23
JP2010046093A (ja) 2010-03-04
US7056723B2 (en) 2006-06-06
MXPA04006001A (es) 2005-08-19
SI1407006T1 (sl) 2006-04-30
CA2467099C (en) 2013-01-29
ATE302268T1 (de) 2005-09-15
WO2003054175A1 (en) 2003-07-03
ES2247404T3 (es) 2006-03-01
EA200400833A1 (ru) 2004-12-30
EP1407006B9 (en) 2006-10-18
KR100947976B1 (ko) 2010-03-15
UA77735C2 (en) 2007-01-15
DE60205631D1 (de) 2005-09-22
PL205929B1 (pl) 2010-06-30
DK1407006T3 (da) 2005-12-12
BR0215003A (pt) 2004-11-09
CN1289663C (zh) 2006-12-13
IL161526A (en) 2009-11-18
HUP0402337A3 (en) 2010-01-28
JP2005512565A (ja) 2005-05-12
DE60205631T2 (de) 2006-06-08
IL161526A0 (en) 2004-09-27
CN1606616A (zh) 2005-04-13
EA006485B1 (ru) 2005-12-29
AU2002352247B2 (en) 2008-08-07
AU2002352247A1 (en) 2003-07-09
PL369498A1 (en) 2005-04-18
CA2467099A1 (en) 2003-07-03
KR20040070263A (ko) 2004-08-06
EP1407006A1 (en) 2004-04-14
BRPI0215003B1 (pt) 2017-03-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU227507B1 (hu) Eljárás poxvírusok kinyerésére és tisztítására fertõzött sejtekbõl
RU2551982C2 (ru) Способ получения поксвирусов и композиции поксвирусов
JP3826055B2 (ja) 組換えアビポックスウイルスによる免疫方法
US7767209B2 (en) Modified vaccinia virus Ankara (MVA) mutant and use thereof
JP5166505B2 (ja) 組換えｍｖａおよびその生産方法
JPH025860A (ja) 組換えワクシニアウイルスｍｖａ
CN103189506A (zh) 包含痘苗病毒载体和仙台病毒载体的初免-加强疫苗用病毒载体
JP2012533311A (ja) ニワトリ胚消化のための酵素組成物
JP2005512565A5 (hu)
US20090214587A1 (en) Recombinant virus and use thereof
CN104812894B (zh) 新型mva病毒及其用途
AU2009201629B2 (en) Production of ALVAC on avian embryonic stem cells
EP1642982B1 (en) Recombinant dna viruses comprising a dna that is complementary to an rna virus replicon, and applications thereof
Becker et al. Poxviruses

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees