CN102353792A - 一种基于gpv p32蛋白的间接elisa试剂盒及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于GPVP32蛋白的iELISA试剂盒及制备方法，其组成包括：50~200μL重组蛋白包被、50~200μL阳性对照、50~200μL阴性对照、50~200μL封闭液、50~200μL酶标二抗、50~200μL底物液、50~200μL终止液和25mL-100mL洗涤液。本发明对养羊场山羊痘疫苗免疫提供一种有效评价手段，减少生产中疫苗免疫的盲目性，降低生产成本。

Description

一种基于GPV P32蛋白的间接ELISA试剂盒及制备方法

技术领域

本发明涉及一种基于GPV P32蛋白的间接ELISA试剂盒及制备方法。

背景技术

山羊痘是由山羊痘病毒（Goat poxvirus, GPV）引起的一种严重危害养羊业的急性、烈性传染病，国际兽医卫生组织将其列为A类传染病，我国农业部也将其列为                                                

类传染病，因此我国兽医卫生系统对该病的预防也提出了较高的要求。

山羊痘是可以通过疫苗免疫得到良好控制的一种疾病，但由于某些不可预知的原因，导致免疫失败现象时有发生。血清学检测是制定和实施山羊痘防制措施的一个关键环节，目前常用的血清学检测方法有病毒中和试验(VNT)、琼脂免疫扩散试验(AGID)、酶联免疫吸附试验(ELISA)等，其中，ELISA方法因其具有方便、快捷等优点有潜在开发前景。

P32蛋白是GPV囊膜蛋白，在病毒感染早期即可诱导体液免疫和细胞免疫，可用于GP早期诊断，此外，P32蛋白作为羊痘病毒种属特异性蛋白，能区分GPV和其它痘病毒属成员，可用于鉴别诊断，因此建立基于P32蛋白的ELISA检测试剂盒具有可行性。

目前，对山羊痘的控制主要通过疫苗接种来完成，但随着我国畜牧业的发展，牲畜交易的广泛性，跨省市交易时有发生，而不同地区羊群免疫的不确定性导致了本病的不时暴发。目前，我国尚未建立商品化的山羊痘血清抗体检测试剂盒，使该病的临床控制缺乏了一种关键实时监测手段，因此，建立一种快捷可行的山羊痘血清抗体检测方法是十分必要和迫切。

本发明通过毕赤酵母菌表达系统获得P32蛋白，建立了基于该蛋白的山羊痘血清抗体快速检测间接ELISA试剂盒，将为我国养羊业山羊痘的综合防控提供重要监测手段。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于，选取核苷酸同源性较高的GPV-LD株，通过P32基因真核表达载体的构建与表达，建立基于表达产物GPV P32蛋白的间接ELISA方法，并进行条件优化，制备成商品化间接ELISA试剂盒。该间接ELISA试剂盒的发明，将为山羊痘疫苗免疫效果的评价，提供一种有效的手段，减少了生产中山羊痘疫苗免疫的盲目性，为山羊痘疫病的免疫防控提供技术支撑。

本发明的间接ELISA试剂盒的组成包括：50~200μL重组蛋白包被、50~200μL阳性对照、50~200μL 阴性对照、50~200μL封闭液、50~200μL酶标二抗、50~200μL显色液及50~200μL终止液和25mL-100 mL洗涤液。

所述重组蛋白为GPV P32基因通过毕赤酵母菌表达系统获得P32蛋白，并通过用His·Bind Purification Kit进行重组蛋白纯化，经SDS-PAGE分析后得到纯化目的蛋白，使用包被缓冲液稀释为0.833 μg/100μL ~3 μg/100μL。

所述包被缓冲液为：Na₂CO₃ 1.59g、NaHCO₃ 2.93g溶于去离子水中，定容至1000mL，调至 pH 9.5～9.8。

所述阳性对照为通过山羊痘分离毒临床感染山羊获得的高免血清，使用时用血清稀释液按1:10～1:800倍稀释；阴性对照为未感染且未免山羊痘疫苗的山羊血清，稀释度为1:10～1:800。

所述血清稀释液为BSA，其浓度为0.3g/100mL~ 1g/100mL。

所述封闭液为脱脂乳，浓度为3g/100mL~5g/100mL的溶液；酶标二抗为兔抗羊IgG-HRP，使用浓度为1:2000～1:5000。

所述显色液为邻苯二胺（OPD）底物液，具体配方为：在0.1mol/L枸橼酸盐缓冲液（pH5.0）中含20 mmol/L OPD和12 mmol/L H₂0₂，或10 mmol/L OPD和5.5mmol/L H₂0₂；检测波长为492nm。

所述枸橼酸盐缓冲液（pH5.0）：一水柠檬酸 5.11g，无水磷酸氢二钠 7.3g，加水定容至1000mL。

所述终止液为：1.2 mol/L~2mol/L硫酸；洗涤液为PBST缓冲液： NaCl 8.0g、KCl 0.2g、KH₂PO₄ 0.2g、Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g、Tween-20 0.5mL溶于800mL蒸馏水，调整pH为7.4，定容至1000mL。

所述的基于GPV P32蛋白的间接ELISA试剂盒，制备方法步骤包括：

第一，纯化重组GPV P32蛋白的获得；

第二，重组GPV P32蛋白及血清的最佳工作浓度测定结果

采用矩阵法设计不同稀释度P32蛋白与不同稀释度阳性、阴性血清反应，测定其OD值，并计算其P/N值。综合阴性血清OD值高低以及P/N值大小这两个因素，确定重组GPV P32蛋白及血清的最佳工作浓度；

第三，最适封闭液及封闭时间的确定

采用不同封闭液和不同封闭时间后，测定各孔的OD值，并计算P/N值，确定最佳封闭液及封闭时间；

第四，基于重组GPV P32蛋白间接ELISA判定标准的确定

通过已建最佳间接ELISA条件测定20份已知阴性血清的OD值并计算其P/N值；通过计算样品P/N的平均值、标准差和临界值，为了降低假阳性及假阴性结果设一个可疑区，即被检血清P/N值大于等于临界值+标准差为阳性，P/N值小于等于临界值-标准差为阴性。

本发明有益效果：本发明将改变山羊痘血清抗体无ELSIA检测试剂盒使用的局面；本发明所建立试剂盒适用于检测山羊痘免疫血清抗体和山羊痘病毒感染抗体，能够体现免疫羊群机体疫苗免疫效果和非免疫羊群山羊痘病毒隐性感染情况，对养羊场山羊痘疫苗免疫提供一种有效评价手段，减少生产中疫苗免疫的盲目性，降低生产成本。本发明与现有技术相比，具有以下的技术优势和积极效果：

（1）敏感性高：本发明基于ELISA技术，比传统病毒中和试验(VNT)、琼脂免疫扩散试验(AGID)检测敏感性高100倍-200倍；

（2）特异性好：本发明使用毕赤酵母菌表达重组GPV P32蛋白作为抗原，与使用全病毒相比，能更好的反映机体山羊痘血清抗体水平，减少了与其他疾病血清抗体交叉影响；

（3）高通量：本发明基于ELISA技术，可应用于大批量样本的检测，方便、快捷，操作简单，成本低。

附图说明

图1为本发明的GPV P32蛋白的iELISA试剂盒制备生产流程图。

具体实施方式

本发明的实施例：

基于GPV P32蛋白的iELISA试剂盒原料及配方为：

山羊痘标准阳性血清和标准阴性血清，1:50倍稀释待用；包被缓冲液：Na₂CO₃ 1.59g、NaHCO₃ 2.93g溶于去离子水中，定容至1000mL，调至 p H 9.6；酶标二抗：兔抗羊IgG-HRP，按1:2000倍稀释待用；1×PBST缓冲液： NaCl 8.0g、KCl 0.2g、KH₂PO₄ 0.2g、Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g、Tween-20 0.5mL溶于800mL蒸馏水，调整pH为7.4，定容至1000mL；封闭缓冲液：脱脂乳5%；磷酸-柠檬酸缓冲液：一水柠檬酸5.11g、无水 Na₂HPO₄ 7.3 g、无离子水定容至1 000 mL；显色液：40 mg OPD溶于100 mL磷酸-柠檬酸缓冲液和12 mmol/L H₂0₂；终止液：1.25 mol/L H₂SO₄溶液。

所述的基于GPV P32蛋白的iELISA试剂盒制备步骤包括：

第一，纯化重组GPV P32蛋白的获得

通过毕赤酵母菌表达系统获得含有重组GPV P32蛋白的粗蛋白，通过His·Bind Purification Kit（按照NOVEGEN公司试剂盒说明书操作）进行重组蛋白纯化，经SDS-PAGE分析后得到纯化目的蛋白；

第二，重组GPV P32蛋白及血清的最佳工作浓度测定结果

采用矩阵法设计不同稀释度（0.1μg/100μL、0.5μg/100μL、1μg/100μL、1.5μg/100μL、2.0μg/100μL、2.5μg/100μL、3.0μg/100μL、3.5μg/100μL）P32蛋白与不同稀释度（1∶10、1∶50、1∶100、1∶200、1∶300和1∶500）阳性、阴性血清反应，测定其OD值，并计算其P/N值。综合阴性血清OD值高低以及P/N值大小这两个因素，确定重组GPV P32蛋白包被量为1.5μg/100μL，血清稀释度为1∶50时，阴性对照背景值较低，且P/N值为最大，达到最佳反应条件；

第三，最适封闭液及封闭时间的确定

采用不同封闭液（不封闭、1%明胶、0.1%BSA、1%BSA、5%脱脂乳）和不同封闭时间（0.5h、1.0h、1.5h、2.0h）后，测定各孔的OD值，并计算P/N值，结果显示，最适封闭液为5%脱脂乳，1.0h封闭，P/N值最高，达到最佳反应条件；

第四，基于重组GPV P32蛋白间接ELISA判定标准的确定

通过已建最佳间接ELISA条件测定20份已知阴性血清的OD值并计算其P/N值（即阳性血清OD值/阴性血清OD值）。通过计算样品P/N值的平均为1.453，标准差为0.234，故X+3SD=2.155为间接ELISA的临界值，为了降低假阳性及假阴性结果设一个可疑区，即被检血清P/N值大于等于2.389（临界值+标准差）为阳性，P/N值小于等于1.921（临界值-标准差）为阴性，2.389~1.921之间判定为可疑；

第五，基于重组GPV P32蛋白间接ELISA试剂盒的最佳使用步骤与方法确定

（1）以1.5μg/100μL重组GPV P32蛋白包被ELISA反应板，4℃作用16h后，应用PBS洗涤ELISA反应板5次；（2）以5g/100mL的脱脂乳溶液封闭ELISA反应板，37℃，封闭1h-3h后，应用PBS洗涤ELISA反应板5次；（3）将待检血清用PBS做1∶50倍稀释，按100μL加入ELISA反应板，37℃作用1h后，应用PBS洗涤ELISA反应板5次；（4）将兔抗羊IgG-HRP用PBS做1:2000倍稀释，按100μL加入ELISA反应板，37℃作用1h后，应用PBS洗涤ELISA反应板5次；（5）将50 OPD底物液加入ELISA反应板，避光室温显色15min，加入50μL终止液，立即在酶标仪492nm波长下读取OD值。（6）试验结果判定标准为S/N值(即待检样本OD值/阴性对照OD值)≥2.389为阳性，S/N值≤1.921为阴性；

第六，该ELISA试剂盒敏感性检测

将阳性血清从50倍起连续二倍稀释，进行ELISA检测，结果显示，阳性血清稀释800倍时P/N值为2.732，仍为阳性结果，而阴性血清OD₄₉₂值始终低于1.5，说明此ELISA方法具有较高的敏感性；

第七，该ELISA试剂盒特异性试验结果

应用本试验建立的ELISA方法分别检测山羊痘阳性血清、绵羊痘阳性血清、口蹄疫阳性血清、山羊传染性脓疱皮炎阳性血清，结果显示，本研究所建立的ELISA方法与山羊口蹄疫阳性血清、传染性脓疱皮炎阳性血清无交叉反应，只与山羊痘阳性血清、绵羊痘阳性血清发生特异性的反应，实验结果说明该方法具有良好的特异性；

第八 该ELISA试剂盒重复性检测

（1）批内重复性试验

取同一批制备的重组GPV P32蛋白包被ELISA反应板，取3份山羊痘阳性血清和1份阴性血清，每份样本重复8孔，按已建立的ELISA程序测定OD₄₉₂，对结果进行统计学分析，分别计算各组的平均数

、标准差S及变异系数C·V，结果见下表：

 批内重复性试验结果

 由表中试验数据可见，各组血清的变异系数位于2.5%~8.8%之间，均小于15%，说明所建立的ELISA方法具有良好的批内重复性；

（2）批间重复性试验

取8个不同批次纯化的重组GPV P32蛋白包被ELISA板，按已建立的ELISA程序测定，取3份山羊痘阳性血清和1份阴性血清，每份样本分别在8个批次纯化蛋白包被孔测定结果，分别计算各组的平均数

、标准差S及变异系数C·V，结果见下表：

批间重复性试验结果

 

由表中数据可见，各组数据的变异系数位于4.3%~13%之间，均小于15%，试验结果说明所建立的ELISA方法具有良好的批间重复性；

第九，ELISA 方法的临床应用

取采集自不同地区山羊规模化养殖场的180份临床待检血清，分别应用免疫琼脂扩散试验和间接ELISA方法检测其山羊痘血清抗体水平，结果显示，两种方法阳性抗体检出数分别为95份和145份，阳性率分别为52.8%和80.6%，实验结果说明，本研究所建立的间接ELISA方法比传统免疫琼扩试验的敏感性高，具有更好的临床应用性；

通过第一至第九步骤的比较及验证，证实基于GPV P32蛋白的间接ELISA试剂盒建立成功。

Claims (7)

1.一种基于GPV P32蛋白的间接ELISA试剂盒，其特征在于：其组成包括：50~200μL重组蛋白包被、50~200μL阳性对照、50~200μL 阴性对照、50~200μL封闭液、50~200μL酶标二抗、50~200μL显色液及50~200μL终止液和25mL-100 mL洗涤液。

2.根据权利要求1所述的一种基于GPV P32蛋白的间接ELISA试剂盒，其特征在于：重组蛋白包被为：重组蛋白使用包被缓冲液稀释为0.833 μg/100μL ~3 μg/100μL；重组蛋白为GPV P32基因通过毕赤酵母菌表达系统获得P32蛋白，并通过用His·Bind Purification Kit进行重组蛋白纯化，经SDS-PAGE分析后得到纯化目的蛋白；包被缓冲液为：Na₂CO₃ 1.59g和NaHCO₃ 2.93g溶于去离子水中，定容至1000mL，调至 pH 9.5～9.8。

3.根据权利要求1所述一种基于GPV P32蛋白的间接ELISA试剂盒，其特征在于：阳性对照为通过山羊痘分离毒临床感染山羊获得的高免血清，使用时用血清稀释液按1:10～1:800倍稀释；阴性对照为未感染且未免山羊痘疫苗的山羊血清，稀释度为1:10～1:800；血清稀释液为BSA，其浓度为0.3g/100mL~ 1g/100mL。

4.根据权利要求1所述一种基于GPV P32蛋白的间接ELISA试剂盒，其特征在于：封闭液为脱脂乳，浓度为3g/100mL~5g/100mL的溶液；酶标二抗为兔抗羊IgG-HRP，使用浓度为1:2000～1:5000。

5.根据权利要求1所述一种基于GPV P32蛋白的间接ELISA试剂盒，其特征在于：显色液为OPD底物液，具体配方为：在0.1mol/L枸橼酸盐缓冲液pH 5.0中含20 mmol/L OPD和12 mmol/L H₂O₂，或10 mmol/L OPD和5.5mmol/L H₂O₂；

枸橼酸盐缓冲液pH 5.0为：一水柠檬酸 5.11g和无水磷酸氢二钠 7.3g，加水定容至1000mL。

6.根据权利要求1所述一种基于GPV P32蛋白的间接ELISA试剂盒，其特征在于：终止液为1.2 mol/L~2mol/L硫酸；洗涤液为PBST缓冲液： NaCl 8.0g、KCl 0.2g、KH₂PO₄ 0.2g、Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g和Tween-20 0.5mL溶于800mL蒸馏水，调整pH为7.4，定容至1000mL。

7.一种如权利要求1-6任一项所述基于GPV P32蛋白的间接ELISA试剂盒的制备方法，其特征在于：它包括以下步骤：

第一，纯化重组GPV P32蛋白的获得；

第二，重组GPV P32蛋白及血清的最佳工作浓度测定结果

采用矩阵法设计不同稀释度P32蛋白与不同稀释度阳性、阴性血清反应，测定其OD值，并计算其P/N值；

综合阴性血清OD值高低以及P/N值大小这两个因素，确定重组GPV P32蛋白及血清的最佳工作浓度；

第三，最适封闭液及封闭时间的确定

采用不同封闭液和不同封闭时间后，测定各孔的OD值，并计算P/N值，确定最佳封闭液及封闭时间；

第四，基于重组GPV P32蛋白间接ELISA判定标准的确定

通过已建最佳间接ELISA条件测定20份已知阴性血清的OD值并计算其P/N值；通过计算样品P/N的平均值、标准差和临界值，为了降低假阳性及假阴性结果设一个可疑区，即被检血清P/N值大于等于临界值+标准差为阳性，P/N值小于等于临界值-标准差为阴性。

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