CN102768276A - 脂环酸芽孢杆菌的间接elisa检测试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种脂环酸芽孢杆菌的间接ELISA检测试剂盒，包括（1）-（10）的组分。同时，本发明还公开了脂环酸芽孢杆菌的间接ELISA检测试剂盒的使用方法。本发明提出的脂环酸芽孢杆菌的间接ELISA检测试剂盒填补了国内没有建立针对脂环酸芽孢杆菌的ELISA检测方法的空白，且具有较高的灵敏度和特异性。

Description

脂环酸芽孢杆菌的间接ELISA检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及一种ELISA试剂盒，具体地，涉及一种脂环酸芽孢杆菌的间接ELISA检测试剂盒。

背景技术

对于脂环酸芽孢杆菌的检测，通常采用细菌分离培养和生化鉴定的方法。该方法检测耗时长、成本高，对操作者的实验水平有较高的要求，这些都无法满足日常生产监测的实际要求。本发明采用的间接ELISA检测方法是免疫荧光方法的改进，具有快速定性和定量、灵敏度高、适用范围广、结果判定客观、成本低和可同时进行数千份样品的检测等优点，因此该方法已经面世，便被迅速推广。从而沙门氏菌、肠出血性大肠杆菌0157:H7、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌等食源性微生物的ELISA检测方法被广泛的应用在实验室和生产检验中。目前，国内外还没有建立针对脂环酸芽孢杆菌的间接ELISA检测方法，与传统检测方法相比，该方法具有检测耗时较短和操作简单的优点。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供了一种脂环酸芽孢杆菌的间接ELISA检测试剂盒，该试剂盒填补了国内还没有建立针对脂环酸芽孢杆菌的ELISA检测方法的空白，且具有较高的灵敏度和特异性。

为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

脂环酸芽孢杆菌的间接ELISA检测试剂盒，包括以下试剂：

（1）包被液：将1.59g Na₂CO₃和2.93g NaHCO₃加水充分溶解后，将pH调到9.6后，加去离子水定容为1L；

（2）PBS缓冲液：将准确称量8g NaCl、0.2g KCl、1.42g Na₂HPO₄和0.27g KH₂PO₄充分溶液在800mL去离子水中，然后滴加HCl将pH值调节到7.4，然后加去离子水定容至1L；

（3）PBST洗涤液：向1L PBS缓冲液中加入500μL Tween-20；

（4）检测抗体稀释液：取10mL 37℃过夜培养的大肠杆菌菌液，12000rpm离心3min收集菌体，用PBS洗涤两次后，加入3mL PBS重悬菌体，超声破碎30min，超声5s、间隔5s；将超声破碎后的液体在4℃，12000rpm离心30min，收集的上清为大肠杆菌裂解，即检测抗体稀释液；

（5）封闭液：1%牛血清白蛋白BSA；

（6）终止液：由10.87mL的浓硫酸与89.13mL的去离子水混合配制成的2M H₂SO₄；

（7）包被抗原：菌体蛋白，浓度为20μg/mL；

（8）检测抗体：脂环酸芽孢杆菌的兔抗血清，即脂环酸芽孢杆菌多克隆抗体，采用检测抗体稀释液稀释，稀释度为1:320；

（9）酶标二抗：辣根过氧化物酶HRP标记山羊抗兔IgG，采用PBS稀释，稀释度为1：10000；

（10）显色液：TMB显色液。

具体地，步骤（7）所述的包被抗原的制备方法，包括以下步骤：

将脂环酸芽孢杆菌接种到10mL的K氏培养液中，在220rpm，42℃条件下进行活化培养后，12,000rpm离心3min收集菌体，用PBS洗涤两次，加入3mL的PBS重悬菌体，在冰浴条件下超声破碎30min，其中超声5s，间隔5s；将超声破碎后的液体在4℃，12,000rpm离心30min，收集的上清即为包被抗原，并用紫外分光光度计测定上清液中总蛋白的浓度。

具体地，步骤（8）所述的脂环酸芽孢杆菌多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

（1）选取健康的雄性大白兔2只，适应一周后，进行免疫，其中一只注射制备的包被抗原，另一只注射PBS作为空白对照。一免2周后进行二免，以后每隔一周免疫一次，一共免疫4次；第一次免疫时将免疫蛋白溶液与弗氏完全佐剂1:1的比例进行乳化，其他三次均为弗氏不完全佐剂，免疫方式为皮下多点注射；

（2）对于后期血清的大量采取选择心脏采血，整个采血过程需要无菌操作；将采取的血样放置于37℃温箱1h，再放置于4℃中放置5h后1,500rpm离心30min，将上清用移液枪吸到另一个灭菌的离心管中，分装后-20℃冰箱中保存备用。

具体地，脂环酸芽孢杆菌的间接ELISA检测试剂盒，所述包被抗原的条件为4℃包被过夜或37℃包被2h。

具体地，脂环酸芽孢杆菌的间接ELISA检测试剂盒，所述酶标二抗的工作条件为37℃孵育60min。

具体地，脂环酸芽孢杆菌的间接ELISA检测试剂盒，所述脂环酸芽孢杆菌的间接ELISA检测试剂盒在检测底物时的反应时间为室温条件下10min。

脂环酸芽孢杆菌的间接ELISA检测试剂盒在脂环酸芽孢杆菌检测中的应用。

脂环酸芽孢杆菌的间接ELISA检测试剂盒的应用包括以下步骤：

（1）从已平衡至室温的密封袋中取出试验所需板条，用包被液按1:10稀释待测样本，每孔加入100ul稀释好的样本，用封口膜封住反应孔，37℃温箱孵育2小时；

（2）取掉封口膜，每孔加满洗涤液，加入后静置2分钟后扣除液体，重复操作3次，最后一次拍干；

（3）每孔加入100 ul封闭液，用封口膜封住反应孔，37℃温箱孵育2小时；

（4）同步骤“2”；

（5）每孔加入100ul 1:320稀释的检测抗体，37℃温箱孵育1小时；

（6）同步骤“2”；

（7）加入工作浓度的酶标二抗，每孔100 ul，用封口膜封口，37℃温箱孵育1小时；

（8）取掉封口膜，每孔加满洗涤液，加入后静置2分钟后扣除液体，重复操作5次，最后一次拍干；

（9）加入显色液TMB 100ul/孔，避光37℃孵箱，避光孵育15分钟；

（10）加入终止液100ul/孔，混匀后即刻置于酶标仪中450nm测量每孔的OD；

（11）判断标准：样本OD值大于0.3 时判为阳性，小于0.2 时判为阴性，若处于0.2~0.3判为可疑；可疑样品需要重复操作进行二次鉴定。

本发明具有以下有益效果：

目前，国内还没有建立针对脂环酸芽孢杆菌的ELISA检测方法，故在此与传统检测方法比较后发现，该方法具有检测耗时较短和操作简单的优点。且相比一般的PCR检测方法，该方法具有活菌检测的效果。

分别以大肠埃希氏菌、沙门氏菌、志贺氏杆菌、金黄色葡萄球菌等菌的超声破碎的上清液进行包被，同时以包被脂环酸芽孢杆菌和不包被的为阳性和阴性对照，进行ELISA检测。结果表明建立的ELISA方法具有较高的特异性。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是本发明的封闭试剂的选择的示意图；

图2是本发明酶标酶标二抗稀释度的选择的示意图；

图3是本发明中TMB在不同反应时间的P/N值比较。

在图2中，1代表 1:1000稀释；2代表1:2000稀释；3代表1:3000稀释；4代表1:4000稀释；5代表1:5000稀释；6代表1:6000稀释。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

1 材料和方法

1.1 菌株及血清

脂环酸芽孢杆菌购自德国菌种保藏中心（编号：DSM3299T）；脂环酸芽孢杆菌的阳性血清和阴性血清为自制血清。

1.2 主要试剂

辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG购自上海生工生物工程有限公司，96孔可拆卸的酶标板购自Nunc公司；BSA购自Sigama公司；其他试剂均为进口分装或国产分析纯。

1.3 实验动物

健康成年的大白兔2只，雄性，购自中国农科院兰州兽医研究所实验动物中心。

1.4 ELISA相关溶液的配制

（1）包被液：将1.59g Na₂CO₃和2.93g NaHCO₃加水充分溶解后，将pH调到9.6后，加去离子水定容为1L；

（2）PBS缓冲液：将准确称量8g NaCl、0.2g KCl、1.42g Na₂HPO₄和0.27g KH₂PO₄充分溶液在800mL去离子水中，然后滴加HCl将pH值调节到7.4，然后加去离子水定容至1L；

（3）PBST洗涤液：向1L PBS缓冲液中加入500μL Tween-20；

（4）检测抗体稀释液：取10mL 37℃过夜培养的大肠杆菌菌液，12000rpm离心3min收集菌体，用PBS洗涤两次后，加入3mL PBS重悬菌体，超声破碎30min，超声5s、间隔5s；将超声破碎后的液体在4℃，12000rpm离心30min，收集的上清为大肠杆菌裂解，即检测抗体稀释液；

（5）封闭液：1%牛血清白蛋白BSA；

（6）终止液：由10.87mL的浓硫酸与89.13mL的去离子水混合配制成的2M H₂SO₄；

（7）包被抗原：菌体蛋白，浓度为20μg/mL；

（8）检测抗体：脂环酸芽孢杆菌的兔抗血清，即脂环酸芽孢杆菌多克隆抗体，采用检测抗体稀释液稀释，稀释度为1:320；

（9）酶标二抗：辣根过氧化物酶HRP标记山羊抗兔IgG，采用PBS稀释，稀释度为1：10000；

（10）显色液：TMB显色液。

1.5 包被抗原的制备

将脂环酸芽孢杆菌接种到10mL的K氏培养液中，在220rpm，42℃条件下进行活化培养后，12,000rpm离心3min收集菌体，用PBS洗涤两次，加入3mL的PBS重悬菌体，在冰浴条件下超声破碎30min，其中超声5s，间隔5s。将超声破碎后的液体在4℃，12,000rpm离心30min，收集的上清即为包被抗原。并用紫外分光光度计测定上清液中总蛋白的浓度。

1.6 脂环酸芽孢杆菌多克隆抗体的制备

1.6.1 免疫方案

选取健康的雄性大白兔2只，适应一周后，进行免疫，其中一只注射制备的包被抗原，另一只注射PBS作为空白对照。一免2周后进行二免，以后每隔一周免疫一次，一共免疫4次。第一次免疫时将免疫蛋白溶液与弗氏完全佐剂1:1的比例进行乳化，其他三次均为弗氏不完全佐剂，免疫方式为皮下多点注射。

1.6.2 血清的采取与分离

对于后期血清的大量采取选择心脏采血，整个采血过程需要无菌操作。将采取的血样放置于37℃温箱1h，再放置于4℃中放置5h后1,500rpm离心30min，将上清用移液枪吸到另一个灭菌的离心管中，分装后-20℃冰箱中保存备用。

1.7 ELISA最佳反应条件的确立

1.7.1 抗原包被浓度及抗血清稀释度的确定

抗原的最佳包被浓度和血清的最佳稀释浓度是利用棋盘滴定法来确定。用包被液将定量的抗原稀释到浓度分别为80μg/mL、40μg/mL、20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL和0.625μg/mL。

抗血清和阴性血清的稀释采用检测抗体预中和液作为血清稀释液，按照2倍递次稀释，血清稀释分别为10、20、40、80、160、320、640和1280倍。

1.7.2 抗原的最佳包被条件

分别以37℃ 2h和4℃过夜进行包被，对脂环酸芽孢杆菌的阳性和阴性血清进行ELISA检测，通过P/N来确定最佳的包被条件。

1.7.3 封闭液的优化

其他条件一致的情况下，分别用5%胎牛血清、10%胎牛血清、5%脱脂奶粉、10%脱脂奶粉、0.5%牛血清白蛋白和 1%牛血清白蛋白进行封闭，以未封闭的作为阴性对照，根据P/N值来确定最优的封闭液。

1.7.4 酶标二抗最优工作浓度的确定

将 HRP 标记的兔抗猪抗体作 1:1000、1:2000、1：3000、1:4000、1:5000、1:6000 稀释后，在其它条件一致的情况下，根据 P/N 值确定酶标二抗的最优工作浓度。

1.7.5 酶标二抗作用时间的确定

将酶标二抗按照最优的稀释比例稀释后，分别在37℃条件下孵育15min、30min、45min、60min，根据P/N值确定最佳作用时间。

1.7.6 底物反应时间的确定

室温条件下分别于底物溶液避光反应5min、10min、15min、20min、30min，根据P/N值来确定最佳的反应时间。

1.8 特异性实验

分别以大肠埃希氏菌、沙门氏菌、志贺氏杆菌、金黄色葡萄球菌等菌的超声破碎的上清液进行包被，每种细菌裂解液包被1行（12孔）重复，同时以包被脂环酸芽孢杆菌和不包被的为阳性和阴性对照，各1行重复。用优化的条件进行检测是否会出现交叉反应。

1.9 判定标准的确定

在最佳反应条件下，以50份增菌培养后经PCR检测和常规培养法检测脂环酸芽孢杆菌阴性的苹果汁包被酶标板进行ELISA检测，读取OD值。计算出阴性样本OD值的平均值X和标准差SD，根据统计学原则，样本的S/P值≥X+3SD时，为阳性；S/P值≤X+2SD时，为阴性；介于二者之间则为可疑。S/P=(样品OD-标准阴性血清OD)/(标准阳性血清 OD-标准阴性血清OD)。

1.10 送检样品的检测与验证

将送检的50份样品和3份人工污染脂环酸芽孢杆菌的果汁样品，用建立的ELISA检测方法、PCR、多重PCR和分离培养法分别进行检测，并比较其实验结果结果。

2 试验结果

2.1抗原包被浓度及抗血清稀释度的确定

通过方阵滴定法当OD值为1.0时对应的抗原的稀释度和血清的稀释度即为最优抗原包被浓度和最佳的血清稀释度。包被抗原的最佳浓度为20μg/mL，抗血清的稀释度为1:320（见表1）。

2.2抗原的最佳包被条件

通过实验计算得到P/N值发现在4℃包被过夜要优于37℃包被2h（见表2），但是对结果没有明显的影响，因此在实验时间比较紧迫的条件下37℃包被2h也符合试验要求的。

2.3 最佳封闭液的选择

1%牛血清白蛋白封闭时P/N值最高，所以选择1%的牛血清白蛋白为封闭液（图1）。

2.4酶标二抗最优工作浓度及反应时间的确定

通过P/N值确定了酶标二抗的最优工作浓度为1:3000稀释（见图2），反应条件为37℃孵育60min。

2.5 底物反应时间的确定

通过计算P/N值确定了底物反应的最佳时间为室温条件下10min（见图3）。 

2.6 特异性试验的结果

分别以大肠埃希氏菌、沙门氏菌、志贺氏杆菌、金黄色葡萄球菌等菌的超声破碎的上清液进行包被，同时以包被脂环酸芽孢杆菌和不包被的为阳性和阴性对照，进行ELISA检测。结果表明建立的ELISA方法具有较高的特异性（表3）。

2.7 ELISA判定标准

通过对50份脂环酸芽孢杆菌阴性的菌液进行间接ELISA测定，如表5.4。其平均值X为0.144，标准差SD为0.027，即当样本S/P≥X＋3SD=0.144+3×0.027=0.225 时判为阳性，S/P≤X＋2SD=0.144+2×0.027=0.198 时判为阴性，S/P处于两者之间判为可疑，如表4。

2.8送检样品的检测结果

用建立的间接ELISA检测方法检测的50份送检样品和3份人工污染脂环酸芽孢杆菌的果汁共53份待检样品，建立的间接ELISA方法能够检出3份人工污染果汁。但与其他三种方法不同的是，该间接ELISA还从送检样品中检测出两份脂环酸芽孢杆菌，根据常规方法的实验结果，可判定该两份的检出结果均为假阳性结果，具体实验结果如表5所示。

3 讨论 

     首先通过方阵滴定的方法确定ELISA抗原包被浓度和血清稀释度，确定包被抗原的浓度约在20mL左右，方阵滴定时将脂环酸芽孢杆菌裂解液上清用包被液从80μg/mL到0.625μg/mL第次稀释，试验结果表明20μg/mL为最佳包被浓度。同时方阵滴定的结果显示1:320的血清稀释度为最佳。包被后，采用封闭液对裸露的吸附位点进行封闭，以期降低非特异性的背景色，提高ELISA检测的特异性和灵敏度。本实验认为封闭液以含1.0% BSA PBST的效果为最佳。

    由于显色时间的长短会影响显色的深浅和结果的判读，故本试验从5min、10mn、15min、20mjn、30min设置5个时间梯度来确定合适的显色时间。试验结果表明，随着显色时间的延长，阴阳血清的OD值都会随之升高，而当显色为10min时，P/N值最大，因此在本实验中认为10min为最佳显色时间。

为了确定该ELISA方法的临界值，该研究采用建立的ELISA方法对50份阴性菌液进行检测，计算出阴性样本OD值的平均值X和标准差SD，根据统计学原则，样本的S/P值≥X+3SD时，为阳性；S/P值≤X+2SD时，为阴性；介于二者之间则为可疑。S/P=(样品OD-标准阴性血OD)/(标准阳性血清OD-标准阴性血清OD)。实验结果表明，其平均值 X 为0.144，标准差SD为0.027，即当样本S/P≥X＋3SD=0.144+3×0.027=0.225 时判为阳性，S/P≤X＋2SD=0.144+2×0.027=0.198 时判为阴性，S/P处于两者之间判为可疑。基于上述判定标准，在最佳反应条件下，53份待检样品增菌培养后，通过间接ELISA、单重PCR检测、多重PCR和分离培养法来检测是否存在脂环酸芽孢杆菌。实验结果表明，建立的间接ELISA方法能够检出3种人工污染样品，但送检样品的检测结果与其他三种方法存在差异，说明该方法在实际检测中的准确性不足。

目前，国内还没有建立针对脂环酸芽孢杆菌的ELISA检测方法，故在此与传统检测方法比较后发现，该方法具有检测耗时较短和操作简单的优点。且相比一般的PCR检测方法，该方法具有活菌检测的效果。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.脂环酸芽孢杆菌的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，包括以下试剂：

（1）包被液：将1.59g Na₂CO₃和2.93g NaHCO₃加水充分溶解后，将pH调到9.6后，加去离子水定容为1L；

（2）PBS缓冲液：将准确称量8g NaCl、0.2g KCl、1.42g Na₂HPO₄和0.27g KH₂PO₄充分溶液在800mL去离子水中，然后滴加HCl将pH值调节到7.4，然后加去离子水定容至1L；

（3）PBST洗涤液：向1L PBS缓冲液中加入500μL Tween-20；

（4）检测抗体稀释液：取10mL 37℃过夜培养的大肠杆菌菌液，12000rpm离心3min收集菌体，用PBS洗涤两次后，加入3mL PBS重悬菌体，超声破碎30min，超声5s、间隔5s；将超声破碎后的液体在4℃，12000rpm离心30min，收集的上清为大肠杆菌裂解，即检测抗体稀释液；

（5）封闭液：1%牛血清白蛋白BSA；

（6）终止液：由10.87mL的浓硫酸与89.13mL的去离子水混合配制成的2M H₂SO₄；

（7）包被抗原：菌体蛋白，浓度为20μg/mL；

（8）检测抗体：脂环酸芽孢杆菌的兔抗血清，即脂环酸芽孢杆菌多克隆抗体，采用检测抗体稀释液稀释，稀释度为1:320；

（9）酶标二抗：辣根过氧化物酶HRP标记山羊抗兔IgG，采用PBS稀释，稀释度为1：10000；

（10）显色液：TMB显色液。

2.权利要求1的步骤（7）所述的包被抗原的制备方法，包括以下步骤：

将脂环酸芽孢杆菌接种到10mL的K氏培养液中，在220rpm，42℃条件下进行活化培养后，12,000rpm离心3min收集菌体，用PBS洗涤两次，加入3mL的PBS重悬菌体，在冰浴条件下超声破碎30min，其中超声5s，间隔5s；将超声破碎后的液体在4℃，12,000rpm离心30min，收集的上清即为包被抗原，并用紫外分光光度计测定上清液中总蛋白的浓度。

3.权利要求1的步骤（8）所述的脂环酸芽孢杆菌多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

（1）选取健康的雄性大白兔2只，适应一周后，进行免疫，其中一只注射制备的包被抗原，另一只注射PBS作为空白对照，

一免2周后进行二免，以后每隔一周免疫一次，一共免疫4次；第一次免疫时将免疫蛋白溶液与弗氏完全佐剂1:1的比例进行乳化，其他三次均为弗氏不完全佐剂，免疫方式为皮下多点注射；

（2）对于后期血清的大量采取选择心脏采血，整个采血过程需要无菌操作；将采取的血样放置于37℃温箱1h，再放置于4℃中放置5h后1,500rpm离心30min，将上清用移液枪吸到另一个灭菌的离心管中，分装后-20℃冰箱中保存备用。

4.根据权利要求1所述的脂环酸芽孢杆菌的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述包被抗原的条件为4℃包被过夜或37℃包被2h。

5.根据权利要求1所述的脂环酸芽孢杆菌的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述酶标二抗的工作条件为37℃孵育60min。

6.根据权利要求1所述的脂环酸芽孢杆菌的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述脂环酸芽孢杆菌的间接ELISA检测试剂盒在检测底物时的反应时间为室温条件下10min。

7.权利要求1、4、5、6任意一项所述脂环酸芽孢杆菌的间接ELISA检测试剂盒在脂环酸芽孢杆菌检测中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

（1）从已平衡至室温的密封袋中取出试验所需板条，用包被液按1:10稀释待测样本，每孔加入100ul稀释好的样本，用封口膜封住反应孔，37℃温箱孵育2小时；

（2）取掉封口膜，每孔加满洗涤液，加入后静置2分钟后扣除液体，重复操作3次，最后一次拍干；

（3）每孔加入100 ul封闭液，用封口膜封住反应孔，37℃温箱孵育2小时；

（4）同步骤“2”；

（5）每孔加入100ul 1:320稀释的检测抗体，37℃温箱孵育1小时；

（6）同步骤“2”；

（7）加入工作浓度的酶标二抗，每孔100 ul，用封口膜封口，37℃温箱孵育1小时；

（8）取掉封口膜，每孔加满洗涤液，加入后静置2分钟后扣除液体，重复操作5次，最后一次拍干；

（9）加入显色液TMB 100ul/孔，避光37℃孵箱，避光孵育15分钟；

（10）加入终止液100ul/孔，混匀后即刻置于酶标仪中450nm测量每孔的OD；

（11）判断标准：样本OD值大于0.3 时判为阳性，小于0.2 时判为阴性，若处于0.2~0.3判为可疑；可疑样品需要重复操作进行二次鉴定。

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