CN104650223A - 抗脂环酸芽孢杆菌单克隆抗体的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种抗脂环酸芽孢杆菌单克隆抗体的制备方法，该方法包括以下步骤：⑴制备免疫接种的小鼠；⑵骨髓瘤细胞培养3~4天，得到培养后的小鼠骨髓瘤细胞；⑶将脂环酸芽孢杆菌向免疫接种的小鼠腹腔接种免疫，并且获得脾细胞，经分散脾细胞得到脾细胞沉淀物；⑷培养后的小鼠骨髓瘤细胞离心得到骨髓瘤细胞沉淀物；⑸用DMEM高糖培养液分别悬浮脾细胞沉淀物、骨髓瘤细胞沉淀物并混合，经离心得到沉淀物；⑹沉淀物离心、悬浮，即得融合细胞；⑺将融合细胞进行培养、测定，确定杂交瘤细胞；该杂交瘤细胞进行克隆、筛选得到杂交瘤细胞系；⑻制备单克隆抗体：将杂交瘤细胞系按常规方法进行单克隆抗体生产即得。本发明快速、特异性高。
Description
技术领域
本发明涉及一种单克隆抗体的制备方法，尤其涉及抗脂环酸芽孢杆菌单克隆抗体的制备方法。
背景技术
中国是苹果第一大生产国，浓缩苹果汁也大量出口，但由于存在能引起果汁风味改变甚至腐败的脂环酸芽孢杆菌家族成员（Alicyclobacillus），使得该菌的检测成为我国果汁出口贸易的壁垒，严重影响了果汁产品的出口创汇。目前，对于该菌属的检测和鉴定主要是常规的传统检测方法以及现代检测方法，通常采用两种方法相结合来进行检测和鉴定。传统方法包括待测菌的形态特征、生长温度范围等生理生化特性等，但传统方法检测指标多、程序复杂、耗时等缺点致使检测结果滞后，无法快速指导生产并向生产线反馈信息以采取相应的防范和控制措施。另外，各种推荐的方法不近相同，结果也存在一定的差异。
因此，如果创建一种既快速又特异性好的检测方法，就能够为果汁生产厂家提供一种从原料到产品的全程检测，从而及时指导生产，控制脂环酸芽孢杆菌的污染。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种快速、特异性高的抗脂环酸芽孢杆菌单克隆抗体的制备方法。
为解决上述问题，本发明所述的抗脂环酸芽孢杆菌单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
⑴制备免疫接种的小鼠：
取复壮后的脂环酸芽孢杆菌模式菌株ATCC 49025与等量佐剂充分混匀，分别注入小鼠颈背部两侧、腹股沟部皮下；每只每次剂量为0.2ml，首次注射含菌数量为1×108，间隔3周，同法重复注入两次，即得免疫接种的小鼠，该免疫接种的小鼠在最后一次免疫后两周进行小鼠血清中抗脂环酸芽孢杆菌抗体滴度的测定，将显示抗体滴度达到1：20000的小鼠作为免疫脾细胞的来源；其中第一次免疫用弗氏完全佐剂，第二次、第三次均采用弗氏不完全佐剂；第二次比第一次含菌数量加倍，第三次比第二次含菌数量加倍；
⑵将X-63小鼠细胞系、NS-1小鼠细胞系、SP2/0小鼠细胞系中的一种作为骨髓瘤细胞，并将该骨髓瘤细胞在常规培养液中培养3~4天，得到培养后的小鼠骨髓瘤细胞；
⑶按每只每次剂量为0.2ml、含菌数量为4×108的脂环酸芽孢杆菌向所述步骤⑴所得的免疫接种的小鼠腹腔接种免疫，并且在3~4天后取小鼠的脾脏获得脾细胞，分散脾细胞，然后按体积比1 ml：30 ml加入DMEM高糖培养液，轻轻吸打数次，再将脾细胞离心去上清液，得到脾细胞沉淀物；
⑷将所述步骤⑵所得的培养后的小鼠骨髓瘤细胞离心去上清液，得到骨髓瘤细胞沉淀物；
⑸用DMEM高糖培养液分别悬浮所述脾细胞沉淀物、所述骨髓瘤细胞沉淀物，并将脾细胞与骨髓瘤细胞按5~10：1的数量比混合所述脾细胞沉淀物、所述骨髓瘤细胞沉淀物，然后离心去上清液，充分分散，得到沉淀物；
⑹所述沉淀物中按体积比1 ml：2 ml加入质量浓度为50%的聚乙二醇PEG1000，静置1~2分钟后离心去上清液，并缓慢加入所述沉淀物体积的25~35倍的HAT培养液进行悬浮，最后补加HAT培养液至所述沉淀物体积的140~160倍，即得融合细胞；
⑺将所述步骤⑹所得的融合细胞按100μL/孔加入至96孔培养板中，且每孔中再加入100 μL浓度为1~2×105个/mL的含小鼠腹腔巨噬细胞的HAT培养液作为饲养细胞，然后将所述培养板置于体积浓度为3~7%的二氧化碳培养箱中，在温度为35~38℃条件下培养10~14小时；培养3~4天后即观察所述培养板孔中是否出现杂交细胞集落，当孔中出现杂交细胞集落后，每隔2~3天用每孔半量HAT培养液换液一次；7~9天后每孔取培养上清液100μL，分别进行抗脂环酸芽孢杆菌抗体及其抗体滴度的测定；再在原培养板每孔中补加半量HT培养液；继续在温度为37℃、5%的二氧化碳培养箱中培养；直至ELISA检测培养上清的抗脂环酸芽孢杆菌抗体阳性，且细胞上清的抗体滴度达到1：1000以上时，则确定为所需的杂交瘤细胞；
将所述杂交瘤细胞转移到另一块96孔板中，采用有限稀释法进行克隆，筛选得到克隆孔均呈抗体阳性且抗体滴度稳定的杂交瘤细胞系；
⑻制备单克隆抗体：
将所述杂交瘤细胞系转移到细胞培养瓶中培养，然后按常规方法采用大瓶旋转培养法或同系小鼠体内诱生法进行单克隆抗体生产即得。
所述步骤⑴或所述步骤⑺中抗体滴度的测定方法是指酶联免疫吸附ELISA测定法。
所述步骤⑵中常规培养液是指将77mL的无血清DMEM培养基、20mL的新生牛血清、1mL的丙酮酸钠、1mL的 L-谷胺酰氨、各0.5mL的双抗混合而成的含有20%小牛血清和双抗的DMEM高糖完全培养液。
所述步骤⑶和所述步骤⑸中的DMEM高糖培养液是指将13.4gDMEM培养粉溶于1L三蒸水中，搅拌并用NaHCO3调pH值至7.2后，经过滤除菌，即得。
所述步骤⑹和所述步骤⑺中的HAT培养液是指将75mL的无血清DMEM培养基、20mL的小牛血清、1mL的丙酮酸钠、1mL L-谷胺酰氨、各0.5mL的双抗、1mL 的100倍HT母液和1mL 的100倍A母液混合而成的含有HAT（即次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶）以及20%小牛血清和双抗的DMEM高糖培养液。
所述步骤⑺中HT培养液是指将76mL的无血清DMEM培养基、20mL的小牛血清、1mL的丙酮酸钠、1mL 的L-谷胺酰氨、各0.5mL的双抗、1mL的100倍HT母液混合而成的含有HT（HT Supplement，次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷），20%小牛血清和双抗的DMEM高糖培养液。
所述双抗是指青霉素160w单位溶于8mL无血清DMEM培养基中、链霉素100w单位溶于5mL无血清DMEM培养基中所得的溶液。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、由于本发明检测待测菌不需要进行生理生化特性、形态特征、生长温度等的鉴定，因此，具有快捷迅速、灵敏准确、抗干扰的特点。
2、由于本发明为细胞株分泌的抗体，用ELISA方法就可以对待测菌或样品进行检测和鉴定，且液氮保存即可，因此，安全简便、成本低廉、实验结果可长期保存。
3、由于本发明的单克隆抗体是以一个淋巴细胞接受一个抗原决定簇刺激，经刺激后扩增的淋巴细胞产生均一的同质抗体，因此，特异性高。
4、采用本发明后，可大大降低从原料、主要生产工段、生产用水、超滤出的苹果清汁等环节的脂环酸芽孢杆菌的污染，并及时指导生产，控制脂环酸芽孢杆菌的污染，对于提高企业对该菌的检测水平和缩短检测时间具有很强的实用价值。
具体实施方式
抗脂环酸芽孢杆菌单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
⑴制备免疫接种的小鼠：
取复壮后的脂环酸芽孢杆菌模式菌株ATCC 49025与等量佐剂充分混匀，分别注入小鼠颈背部两侧、腹股沟部皮下；每只每次剂量为0.2ml，首次注射含菌数量为1×108，间隔3周，同法重复注入两次，即得免疫接种的小鼠，该免疫接种的小鼠在最后一次免疫后两周进行小鼠血清中抗脂环酸芽孢杆菌抗体滴度的测定，将显示抗体滴度达到1：20000的小鼠作为免疫脾细胞的来源；其中第一次免疫用弗氏完全佐剂，第二次、第三次均采用弗氏不完全佐剂；第二次比第一次含菌数量加倍，第三次比第二次含菌数量加倍。
其中：抗体滴度的测定方法是指酶联免疫吸附ELISA测定法。
⑵将X-63小鼠细胞系、NS-1小鼠细胞系、SP2/0小鼠细胞系中的一种作为骨髓瘤细胞，并将该骨髓瘤细胞在常规培养液中培养3~4天，得到培养后的小鼠骨髓瘤细胞。
其中：常规培养液是指将77mL的无血清DMEM培养基、20mL的新生牛血清、1mL的丙酮酸钠、1mL的 L-谷胺酰氨、各0.5mL的双抗混合而成的含有20%小牛血清和双抗的DMEM高糖完全培养液。
双抗是指青霉素160w单位溶于8mL无血清DMEM培养基中、链霉素100w单位溶于5mL无血清DMEM培养基中所得的溶液。
⑶按每只每次剂量为0.2ml、含菌数量为4×108的脂环酸芽孢杆菌向步骤⑴所得的免疫接种的小鼠腹腔接种免疫，并且在3~4天后取小鼠的脾脏获得脾细胞，分散脾细胞，然后按体积比1 ml：30 ml加入DMEM高糖培养液，轻轻吸打数次，再将脾细胞离心去上清液，得到脾细胞沉淀物。
其中：DMEM高糖培养液是指将13.4gDMEM培养粉溶于1L三蒸水中，搅拌并用NaHCO3调pH值至7.2后，经孔径为0.22微米的滤膜过滤除菌，即得。
⑷将步骤⑵所得的培养后的小鼠骨髓瘤细胞离心去上清液，得到骨髓瘤细胞沉淀物。
⑸用DMEM高糖培养液分别悬浮脾细胞沉淀物、骨髓瘤细胞沉淀物，并将脾细胞与骨髓瘤细胞按5~10：1的数量比混合脾细胞沉淀物、骨髓瘤细胞沉淀物，然后离心去上清液，充分分散，得到沉淀物。
其中：DMEM高糖培养液同步骤⑶。
⑹沉淀物中按体积比1 ml：2 ml加入质量浓度为50%的聚乙二醇PEG1000，静置1~2分钟后离心去上清液，并缓慢加入沉淀物体积的25~35倍的HAT培养液进行悬浮，最后补加HAT培养液至沉淀物体积的140~160倍，即得融合细胞。
其中：HAT培养液是指将75mL的无血清DMEM培养基、20mL的小牛血清、1mL的丙酮酸钠、1mL L-谷胺酰氨、各0.5mL的双抗、1mL 的100倍HT母液（H为次黄嘌呤、T为胸腺嘧啶核苷）和1mL 的100倍A母液（氨基喋呤）混合而成的含有HAT（即次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶）以及20%小牛血清和双抗的DMEM高糖培养液。
双抗同步骤⑵。
⑺将步骤⑹所得的融合细胞按100μL/孔加入至96孔培养板中，且每孔中再加入100 μL浓度为1~2×105个/mL的含小鼠腹腔巨噬细胞的HAT培养液作为饲养细胞，然后将培养板置于体积浓度为3~7%的二氧化碳培养箱中，在温度为35~38℃条件下培养10~14小时；培养3~4天后即观察培养板孔中是否出现杂交细胞集落，当孔中出现杂交细胞集落后，每隔2~3天用每孔半量HAT培养液换液一次；7~9天后每孔取培养上清液100μL，分别进行抗脂环酸芽孢杆菌抗体及其抗体滴度的测定；再在原培养板每孔中补加半量HT培养液；继续在温度为37℃、5%的二氧化碳培养箱中培养；直至ELISA检测培养上清的抗脂环酸芽孢杆菌抗体阳性，且细胞上清的抗体滴度达到1：1000以上时，则确定为所需的杂交瘤细胞。
将杂交瘤细胞转移到另一块96孔板中，采用有限稀释法进行克隆，筛选得到克隆孔均呈抗体阳性且抗体滴度稳定的杂交瘤细胞系。
其中：HT培养液是指将76mL的无血清DMEM培养基、20mL的小牛血清、1mL的丙酮酸钠、1mL 的L-谷胺酰氨、各0.5mL的双抗、1mL的100倍HT母液混合而成的含有HT（HT Supplement，次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷），20%小牛血清和双抗的DMEM高糖培养液。
抗体滴度的测定方法同步骤⑴。HAT培养液同步骤⑹。双抗同步骤⑵。
⑻制备单克隆抗体：
将杂交瘤细胞系转移到细胞培养瓶中培养，然后按常规方法采用大瓶旋转培养法或同系小鼠体内诱生法进行单克隆抗体生产即得。
脂环酸芽孢杆菌模式菌株ATCC 49025购自美国标准品储藏中心；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、无血清DMEM培养基、100倍HT母液、100倍A母液、DMEM培养粉均为SIGMA 公司产品；新生牛血清、小牛血清均为兰州明海生物制品公司产品。
Claims (7)
1.抗脂环酸芽孢杆菌单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
⑴制备免疫接种的小鼠：
取复壮后的脂环酸芽孢杆菌模式菌株ATCC 49025与等量佐剂充分混匀，分别注入小鼠颈背部两侧、腹股沟部皮下；每只每次剂量为0.2ml，首次注射含菌数量为1×108，间隔3周，同法重复注入两次，即得免疫接种的小鼠，该免疫接种的小鼠在最后一次免疫后两周进行小鼠血清中抗脂环酸芽孢杆菌抗体滴度的测定，将显示抗体滴度达到1：20000的小鼠作为免疫脾细胞的来源；其中第一次免疫用弗氏完全佐剂，第二次、第三次均采用弗氏不完全佐剂；第二次比第一次含菌数量加倍，第三次比第二次含菌数量加倍；
⑵将X-63小鼠细胞系、NS-1小鼠细胞系、SP2/0小鼠细胞系中的一种作为骨髓瘤细胞，并将该骨髓瘤细胞在常规培养液中培养3~4天，得到培养后的小鼠骨髓瘤细胞；
⑶按每只每次剂量为0.2ml、含菌数量为4×108的脂环酸芽孢杆菌向所述步骤⑴所得的免疫接种的小鼠腹腔接种免疫，并且在3~4天后取小鼠的脾脏获得脾细胞，分散脾细胞，然后按体积比1 ml：30 ml加入DMEM高糖培养液，轻轻吸打数次，再将脾细胞离心去上清液，得到脾细胞沉淀物；
⑷将所述步骤⑵所得的培养后的小鼠骨髓瘤细胞离心去上清液，得到骨髓瘤细胞沉淀物；
⑸用DMEM高糖培养液分别悬浮所述脾细胞沉淀物、所述骨髓瘤细胞沉淀物，并将脾细胞与骨髓瘤细胞按5~10：1的数量比混合所述脾细胞沉淀物、所述骨髓瘤细胞沉淀物，然后离心去上清液，充分分散，得到沉淀物；
⑹所述沉淀物中按体积比1 ml：2 ml加入质量浓度为50%的聚乙二醇PEG1000，静置1~2分钟后离心去上清液，并缓慢加入所述沉淀物体积的25~35倍的HAT培养液进行悬浮，最后补加HAT培养液至所述沉淀物体积的140~160倍，即得融合细胞；
⑺将所述步骤⑹所得的融合细胞按100μL/孔加入至96孔培养板中，且每孔中再加入100 μL浓度为1~2×105个/mL的含小鼠腹腔巨噬细胞的HAT培养液作为饲养细胞，然后将所述培养板置于体积浓度为3~7%的二氧化碳培养箱中，在温度为35~38℃条件下培养10~14小时；培养3~4天后即观察所述培养板孔中是否出现杂交细胞集落，当孔中出现杂交细胞集落后，每隔2~3天用每孔半量HAT培养液换液一次；7~9天后每孔取培养上清液100μL，分别进行抗脂环酸芽孢杆菌抗体及其抗体滴度的测定；再在原培养板每孔中补加半量HT培养液；继续在温度为37℃、5%的二氧化碳培养箱中培养；直至ELISA检测培养上清的抗脂环酸芽孢杆菌抗体阳性，且细胞上清的抗体滴度达到1：1000以上时，则确定为所需的杂交瘤细胞；
将所述杂交瘤细胞转移到另一块96孔板中，采用有限稀释法进行克隆，筛选得到克隆孔均呈抗体阳性且抗体滴度稳定的杂交瘤细胞系；
⑻制备单克隆抗体：
将所述杂交瘤细胞系转移到细胞培养瓶中培养，然后按常规方法采用大瓶旋转培养法或同系小鼠体内诱生法进行单克隆抗体生产即得。
2.如权利要求1所述的抗脂环酸芽孢杆菌单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤⑴或所述步骤⑺中抗体滴度的测定方法是指酶联免疫吸附ELISA测定法。
3.如权利要求1所述的抗脂环酸芽孢杆菌单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤⑵中常规培养液是指将77mL的无血清DMEM培养基、20mL的新生牛血清、1mL的丙酮酸钠、1mL的 L-谷胺酰氨、各0.5mL的双抗混合而成的含有20%小牛血清和双抗的DMEM高糖完全培养液。
4.如权利要求1所述的抗脂环酸芽孢杆菌单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤⑶和所述步骤⑸中的DMEM高糖培养液是指将13.4gDMEM培养粉溶于1L三蒸水中，搅拌并用NaHCO3调pH值至7.2后，经过滤除菌，即得。
5.如权利要求1所述的抗脂环酸芽孢杆菌单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤⑹和所述步骤⑺中的HAT培养液是指将75mL的无血清DMEM培养基、20mL的小牛血清、1mL的丙酮酸钠、1mL L-谷胺酰氨、各0.5mL的双抗、1mL 的100倍HT母液和1mL 的100倍A母液混合而成的含有HAT以及20%小牛血清和双抗的DMEM高糖培养液。
6.如权利要求1所述的抗脂环酸芽孢杆菌单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤⑺中HT培养液是指将76mL的无血清DMEM培养基、20mL的小牛血清、1mL的丙酮酸钠、1mL 的L-谷胺酰氨、各0.5mL的双抗、1mL的100倍HT母液混合而成的含有HT，20%小牛血清和双抗的DMEM高糖培养液。
7.如权利要求3、5或6所述的抗脂环酸芽孢杆菌单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述双抗是指青霉素160w单位溶于8mL无血清DMEM培养基中、链霉素100w单位溶于5mL无血清DMEM培养基中所得的溶液。
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