CN111909266A - 一种再生基因蛋白REG1α单克隆抗体的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种再生基因蛋白REG1α单克隆抗体的制备方法，该方法包括以下步骤：⑴制备免疫接种的小鼠；⑵骨髓瘤细胞培养3~4天，得到培养后的小鼠骨髓瘤细胞；⑶将REG1α蛋白溶解向免疫接种的小鼠腹腔接种免疫，并且获得脾细胞，经分散脾细胞得到脾细胞沉淀物；⑷培养后的小鼠骨髓瘤细胞离心得到骨髓瘤细胞沉淀物；⑸用DMEM高糖培养液分别悬浮脾细胞沉淀物、骨髓瘤细胞沉淀物并混合，经离心得到沉淀物；⑹沉淀物离心、悬浮，即得融合细胞；⑺将融合细胞进行培养、测定，确定杂交瘤细胞；⑻单抗的筛选分离；⑼大量制备单克隆抗体：将杂交瘤细胞系按常规方法进行单克隆抗体生产即得。本发明快速、特异性高。
Description
技术领域
本发明涉及一种单克隆抗体的制备方法，尤其涉及一种再生基因蛋白REG1α单克隆抗体的制备方法。
背景技术
再生家族基因（Reg）家族的异常表达与人类的炎症反应和肿瘤等多种疾病有密切联系，特别是消化系统疾病。临床上，经常能在肿瘤病人的病理标本和血清中检测到异常增高的Reg 蛋白，因此 Reg 蛋白可以作为预测肿瘤进程和进展，特别是消化系统肿瘤的临床标志物，同时也可以作为诊断的标记和治疗的靶基因。Reg1是 Reg 基因家族的 I 型子类成员，Fukui 等发现 Reg1在胃癌组织中的表达可达 37.3%，Reg1阳性患者比阴性患者有更高的增殖细胞核抗原指数；Reg1的表达与淋巴管浸润有关。Yonemura 等认为 Reg1α 基因可作为胃癌的预后指标，其表达与胃癌的浸润性生长及高分化腺癌的血行转移密切相关。最近，来自英国和西班牙的科学家又开发出了针对胰腺导管腺癌一种新型尿检方法，检测了约 500 例尿样，并最终确定 LYVE1、REG1α和 TFF1 三种蛋白可以作为潜在检测指标，这一检测方法的准确率可以达到 90%。
可见，针对REG蛋白的检测在临床上具有多种价值，而针对REG1α蛋白的尿样检测在胰腺导管腺癌的早期检测上具有重要意义。现阶段市场上针对REG1α蛋白的检测的抗体多为兔抗多克隆抗体，其敏感性和特异性相对较低，而临床早期诊断样品主要为血清和尿液，对检测的灵敏度和特异性均有较高的要求，因此，高效价的抗REG1α蛋白的单克隆抗体是提高检测试剂性能的最佳途径。高性能的 REG1α单克隆抗体对于提高检验水平、降低检验成本，提高相关检测试剂性能有很强的实用价值。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种快速、特异性高的再生基因蛋白REG1α单克隆抗体的制备方法。
为解决上述问题，本发明所述的一种再生基因蛋白REG1α单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
⑴制备免疫接种的小鼠：
取重组REG1α蛋白与等量弗氏完全佐剂充分混匀，分别注入卡介苗致敏Balb/c小鼠的腹股沟及颈背部皮下；每只每次剂量为0.2mL，间隔3周，同法重复注入两次，即得免疫接种的小鼠，该免疫接种的小鼠在最后一次免疫后两周取小鼠尾尖血进行小鼠血清中抗REG1α蛋白的抗体滴度的测定，将显示抗体滴度达到1：20000的小鼠作为免疫脾细胞的来源；其中第一次免疫用弗氏完全佐剂，第二次、第三次均采用弗氏不完全佐剂；第二次比第一次蛋白数量加倍，第三次比第二次蛋白数量加倍；
⑵将X-63小鼠细胞系、NS-1小鼠细胞系、SP2/0小鼠细胞系中的一种作为骨髓瘤细胞，并将该骨髓瘤细胞在常规培养液中培养3~4天，得到培养后的小鼠骨髓瘤细胞；
⑶按第三次免疫蛋白的剂量将REG1α蛋白溶解后向所述步骤⑴所得的免疫接种的小鼠腹腔接种免疫，并且在3~4天后取小鼠的脾脏获得脾细胞，分散脾细胞，然后按体积比1 mL：30 mL加入DMEM高糖培养液，轻轻吸打数次，再将脾细胞离心去上清液，得到脾细胞沉淀物；
⑷将所述步骤⑵所得的培养后的小鼠骨髓瘤细胞离心去上清液，得到骨髓瘤细胞沉淀物；
⑸用DMEM高糖培养液分别悬浮所述脾细胞沉淀物、所述骨髓瘤细胞沉淀物，并将脾细胞与骨髓瘤细胞按5~10：1的数量比混合所述脾细胞沉淀物、所述骨髓瘤细胞沉淀物，充分分散后离心去上清液，得到沉淀物；
⑹所述沉淀物中按体积比1 mL：2 mL加入质量浓度为50%的聚乙二醇PEG1000，静置1~2分钟后离心去上清液，并缓慢加入所述沉淀物体积的25~35倍的HAT培养液进行悬浮，最后补加HAT培养液至所述沉淀物体积的140~160倍，即得融合细胞；
⑺将所述步骤⑹所得的融合细胞按100μL/孔加入至96孔培养板中，且每孔中再加入100 μL浓度为1~2×105个/mL的含小鼠腹腔巨噬细胞的HAT培养液作为饲养细胞，然后将所述培养板置于体积浓度为3~7%的二氧化碳培养箱中，在温度为35~38℃条件下培养；培养3~4天后即观察所述培养板孔中是否出现杂交细胞集落，根据细胞生长情况从第六天开始，每隔2~3天用每孔100 μL HAT液换液一次；
当孔中出现杂交细胞集落，达到每个细胞集落细胞数30~50个时即可每孔取培养上清液100μL进行抗REG1α蛋白抗体的检测；再在原培养板每孔中补加半量HT培养液；继续在温度为37℃、5%的二氧化碳培养箱中培养；直至检测培养上清的抗REG1α蛋白抗体阳性，则确定为所需的杂交瘤细胞；
⑻单抗的筛选分离：
将所述杂交瘤细胞转移到另一块96孔板中进行克隆，筛选得到克隆孔均呈抗体阳性且抗体滴度稳定的杂交瘤细胞系；
⑼大量制备单克隆抗体：
将所述杂交瘤细胞系转移到细胞培养瓶中培养，然后按常规方法采用大瓶旋转培养法或同系小鼠体内诱生法进行单克隆抗体生产即得。
所述步骤⑴或所述步骤⑺中抗体滴度的测定方法是指酶联免疫吸附ELISA测定法或放射免疫测定RIA。
所述步骤⑵中常规培养液是指将77mL的无血清DMEM培养基、20mL的新生牛血清、1mL的丙酮酸钠、1mL的 L-谷胺酰氨、各0.5mL的双抗混合而成的含有20%小牛血清和双抗的DMEM高糖完全培养液。
所述步骤⑶和所述步骤⑸中的DMEM高糖培养液是指将13.4gDMEM培养粉溶于1L三蒸水中，搅拌并用NaHCO3调pH值至7.2后，经过滤除菌，即得。
所述步骤⑹和所述步骤⑺中的HAT培养液是指将75mL的无血清DMEM培养基、20mL的小牛血清、1mL的丙酮酸钠、1mL L-谷胺酰氨、各0.5mL的双抗、1mL 的100倍HT母液和1mL的100倍A母液混合而成的含有HAT（即次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶）以及20%小牛血清和双抗的DMEM高糖培养液。
所述步骤⑺中HT培养液是指将76mL的无血清DMEM培养基、20mL的小牛血清、1mL的丙酮酸钠、1mL 的L-谷胺酰氨、各0.5mL的双抗、1mL的100倍HT母液混合而成的含有HT（HTSupplement，次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷），20%小牛血清和双抗的DMEM高糖培养液。
所述双抗是指青霉素160w单位溶于8mL无血清DMEM培养基中、链霉素100w单位溶于5mL无血清DMEM培养基中所得的溶液。
所述步骤⑻中的克隆方法是指一种经有限稀释该杂交瘤使一孔中只含有一个单一杂交瘤细胞的方法，或一种从软琼脂培养基中分离集落的软琼脂方法，或一种采用显微操作器，挑取单一杂交瘤细胞的方法，或一种采用细胞分离仪分离单一的杂交瘤细胞的“分选仪克隆”方法。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、本发明在进行抗体检测筛选过程中进行抗体阳性和标签蛋白同步检测，可以保证抗体的特异性，迅速压缩检测筛选周期，快速筛选获得所需的杂交瘤细胞系。因此，可以极大地减少检测筛选的工作量和时间、试剂及人工成本。
2、本发明在杂交瘤细胞集落的细胞数达到30~50个时即进行检测，减少了阳性杂交瘤细胞由于数量相对无阳性细胞数量少，后期检测由于竞争优势掩盖而造成的漏检；另外此时细胞活力强，生长速度和状态良好，可以在初次筛选无阳性结果时进行二次筛选，从而最大程度地避免漏检，提高检测效率。
3、本发明在筛选早期即进行滴度测定，可以保证更好地筛选获得高效价的抗体。
4、本发明的抗REG1α单克隆抗体特异性强、抗体效价高，可用于检测血清和尿液中的REG1α蛋白，具有灵敏准确、抗干扰的特点。
5、采用本发明的单抗制备方法，可大大降低单抗筛选的工作量，缩短单抗筛选时间，降低生产成本，对于提高REG1α蛋白的检测水平和缩短检测时间具有很强的实用价值。
具体实施方式
一种再生基因蛋白REG1α单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
⑴制备免疫接种的小鼠：
取重组REG1α蛋白与等量弗氏完全佐剂充分混匀，分别注入卡介苗致敏Balb/c小鼠的腹股沟及颈背部皮下；每只每次剂量为0.2mL，间隔3周，同法重复注入两次，即得免疫接种的小鼠，该免疫接种的小鼠在最后一次免疫后两周取小鼠尾尖血进行小鼠血清中抗REG1α蛋白的抗体滴度的测定，将显示抗体滴度达到1：20000的小鼠作为免疫脾细胞的来源；其中第一次免疫用弗氏完全佐剂，第二次、第三次均采用弗氏不完全佐剂；第二次比第一次蛋白数量加倍，第三次比第二次蛋白数量加倍。
其中：抗体滴度的测定方法是指酶联免疫吸附ELISA测定法或放射免疫测定RIA。
⑵将X-63小鼠细胞系、NS-1小鼠细胞系、SP2/0小鼠细胞系中的一种作为骨髓瘤细胞，并将该骨髓瘤细胞在常规培养液中培养3~4天，得到培养后的小鼠骨髓瘤细胞；该小鼠骨髓瘤细胞在融合时可以得到2×107或更多的融合细胞。
其中：常规培养液是指将77mL的无血清DMEM培养基、20mL的新生牛血清、1mL的丙酮酸钠、1mL的 L-谷胺酰氨、各0.5mL的双抗混合而成的含有20%小牛血清和双抗的DMEM高糖完全培养液。
双抗是指青霉素160w单位溶于8mL无血清DMEM培养基中、链霉素100w单位溶于5mL无血清DMEM培养基中所得的溶液。
⑶按第三次免疫蛋白的剂量将REG1α蛋白溶解后向步骤⑴所得的免疫接种的小鼠腹腔接种免疫，并且在3~4天后取小鼠的脾脏获得脾细胞，分散脾细胞，然后按体积比1 mL：30 mL加入DMEM高糖培养液，轻轻吸打数次，再将脾细胞离心去上清液，得到脾细胞沉淀物。
其中：获取脾细胞可用注射冲洗法或剪碎研磨过筛，本发明采用研磨过筛法，获得的脾细胞量明显多于注射冲洗法。
DMEM高糖培养液是指将13.4gDMEM培养粉溶于1L三蒸水中，搅拌并用NaHCO3调pH值至7.2后，经孔径为0.22微米的滤膜过滤除菌，即得。
⑷将步骤⑵所得的培养后的小鼠骨髓瘤细胞离心去上清液，得到骨髓瘤细胞沉淀物。
⑸用DMEM高糖培养液分别悬浮脾细胞沉淀物、骨髓瘤细胞沉淀物，并将脾细胞与骨髓瘤细胞按5~10：1的数量比混合脾细胞沉淀物、所述骨髓瘤细胞沉淀物，充分分散后离心去上清液，得到沉淀物。
⑹沉淀物中按体积比1 mL：2 mL加入质量浓度为50%的聚乙二醇PEG1000，静置1~2分钟后离心去上清液，并缓慢加入沉淀物体积的25~35倍的HAT培养液进行悬浮，最后补加HAT培养液至沉淀物体积的140~160倍，即得融合细胞。
其中：HAT培养液是指将75mL的无血清DMEM培养基、20mL的小牛血清、1mL的丙酮酸钠、1mL L-谷胺酰氨、各0.5mL的双抗、1mL 的100倍HT母液（H为次黄嘌呤、T为胸腺嘧啶核苷）和1mL 的100倍A母液（氨基喋呤）混合而成的含有HAT（即次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶）以及20%小牛血清和双抗的DMEM高糖培养液。
⑺将步骤⑹所得的融合细胞按100μL/孔加入至96孔培养板中，且每孔中再加入100 μL浓度为1~2×105个/mL的含小鼠腹腔巨噬细胞的HAT培养液作为饲养细胞，然后将培养板置于体积浓度为3~7%的二氧化碳培养箱中，在温度为35~38℃条件下培养；培养3~4天后即观察培养板孔中是否出现杂交细胞集落，根据细胞生长情况从第六天开始，每隔2~3天用每孔100 μL HAT液换液一次。
当孔中出现杂交细胞集落，达到每个细胞集落细胞数30~50个时即可每孔取培养上清液100μL进行抗REG1α蛋白抗体的检测，一般为融合后7~9天开始首次检测；再在原培养板每孔中补加半量HT培养液；继续在温度为37℃、5%的二氧化碳培养箱中培养；直至检测培养上清的抗REG1α蛋白抗体阳性，则确定为所需的杂交瘤细胞。
其中：HT培养液是指将76mL的无血清DMEM培养基、20mL的小牛血清、1mL的丙酮酸钠、1mL 的L-谷胺酰氨、各0.5mL的双抗、1mL的100倍HT母液混合而成的含有HT（HTSupplement，次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷），20%小牛血清和双抗的DMEM高糖培养液。
⑻单抗的筛选分离：
将杂交瘤细胞转移到另一块96孔板中进行克隆，筛选得到克隆孔均呈抗体阳性且抗体滴度稳定的杂交瘤细胞系。
其中：克隆方法是指一种经有限稀释该杂交瘤使一孔中只含有一个单一杂交瘤细胞的方法，或一种从软琼脂培养基中分离集落的软琼脂方法，或一种采用显微操作器，挑取单一杂交瘤细胞的方法，或一种采用细胞分离仪分离单一的杂交瘤细胞的“分选仪克隆”方法。
本发明优选简单或易于操作的有限稀释方法来进行克隆。克隆过程中采用含有20%小牛血清的DMEM培养液，并用ELISA检测克隆细胞孔上清培养液中抗体及滴度，同步采用标签蛋白包被酶标板检测克隆细胞上清，剔除有交叉的克隆细胞。。将杂交瘤细胞转移到另一块96孔板中，再对抗体阳性、无交叉反应、滴度高的孔继续进行克隆3~4次，直至再次克隆时所有克隆孔均呈抗体阳性，最终筛选具有一个稳定抗体滴度的克隆作为产生抗REG1α蛋白抗体的杂交瘤细胞系。
⑼大量制备单克隆抗体：
将杂交瘤细胞系转移到细胞培养瓶中培养，然后按常规方法采用大瓶旋转培养法或同系小鼠体内诱生法进行单克隆抗体生产即得。
其中：用常规培养液培养上述得到的杂交瘤细胞，大量生产单克隆抗体，可采用大瓶旋转培养法或同系小鼠体内诱生法。
大瓶培养法可通过培养上述杂交瘤细胞纯化得到抗REG1α蛋白单克隆抗体。同系鼠（本发明用Balb/c小鼠）体内诱生法可通过上述产生抗REG1α蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞（5×105~5×106）注入经降植烷处理的雌性小鼠（4至8周龄）腹腔内，2~3周后收集腹水，离心除去固体成分，其上清液即含有抗REG1α蛋白单克隆抗体。如果需要进一步纯化，可采用硫酸铵沉淀和凝胶层析方法纯化。
REG1α 重组抗原购自Abcam公司；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、无血清DMEM培养基、100倍HT母液、100倍A母液、DMEM培养粉均为SIGMA 公司产品；小牛血清为兰州民海生物制品公司产品。
Claims (8)
1.一种再生基因蛋白REG1α单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
⑴制备免疫接种的小鼠：
取重组REG1α蛋白与等量弗氏完全佐剂充分混匀，分别注入卡介苗致敏Balb/c小鼠的腹股沟及颈背部皮下；每只每次剂量为0.2mL，间隔3周，同法重复注入两次，即得免疫接种的小鼠，该免疫接种的小鼠在最后一次免疫后两周取小鼠尾尖血进行小鼠血清中抗REG1α蛋白的抗体滴度的测定，将显示抗体滴度达到1：20000的小鼠作为免疫脾细胞的来源；其中第一次免疫用弗氏完全佐剂，第二次、第三次均采用弗氏不完全佐剂；第二次比第一次蛋白数量加倍，第三次比第二次蛋白数量加倍；
⑵将X-63小鼠细胞系、NS-1小鼠细胞系、SP2/0小鼠细胞系中的一种作为骨髓瘤细胞，并将该骨髓瘤细胞在常规培养液中培养3~4天，得到培养后的小鼠骨髓瘤细胞；
⑶按第三次免疫蛋白的剂量将REG1α蛋白溶解后向所述步骤⑴所得的免疫接种的小鼠腹腔接种免疫，并且在3~4天后取小鼠的脾脏获得脾细胞，分散脾细胞，然后按体积比1 mL：30 mL加入DMEM高糖培养液，轻轻吸打数次，再将脾细胞离心去上清液，得到脾细胞沉淀物；
⑷将所述步骤⑵所得的培养后的小鼠骨髓瘤细胞离心去上清液，得到骨髓瘤细胞沉淀物；
⑸用DMEM高糖培养液分别悬浮所述脾细胞沉淀物、所述骨髓瘤细胞沉淀物，并将脾细胞与骨髓瘤细胞按5~10：1的数量比混合所述脾细胞沉淀物、所述骨髓瘤细胞沉淀物，充分分散后离心去上清液，得到沉淀物；
⑹所述沉淀物中按体积比1 mL：2 mL加入质量浓度为50%的聚乙二醇PEG1000，静置1~2分钟后离心去上清液，并缓慢加入所述沉淀物体积的25~35倍的HAT培养液进行悬浮，最后补加HAT培养液至所述沉淀物体积的140~160倍，即得融合细胞；
⑺将所述步骤⑹所得的融合细胞按100μL/孔加入至96孔培养板中，且每孔中再加入100 μL浓度为1~2×105个/mL的含小鼠腹腔巨噬细胞的HAT培养液作为饲养细胞，然后将所述培养板置于体积浓度为3~7%的二氧化碳培养箱中，在温度为35~38℃条件下培养；培养3~4天后即观察所述培养板孔中是否出现杂交细胞集落，根据细胞生长情况从第六天开始，每隔2~3天用每孔100 μL HAT液换液一次；
当孔中出现杂交细胞集落，达到每个细胞集落细胞数30~50个时即可每孔取培养上清液100μL进行抗REG1α蛋白抗体的检测；再在原培养板每孔中补加半量HT培养液；继续在温度为37℃、5%的二氧化碳培养箱中培养；直至检测培养上清的抗REG1α蛋白抗体阳性，则确定为所需的杂交瘤细胞；
⑻单抗的筛选分离：
将所述杂交瘤细胞转移到另一块96孔板中进行克隆，筛选得到克隆孔均呈抗体阳性且抗体滴度稳定的杂交瘤细胞系；
⑼大量制备单克隆抗体：
将所述杂交瘤细胞系转移到细胞培养瓶中培养，然后按常规方法采用大瓶旋转培养法或同系小鼠体内诱生法进行单克隆抗体生产即得。
2.如权利要求1所述的一种再生基因蛋白REG1α单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤⑴或所述步骤⑺中抗体滴度的测定方法是指酶联免疫吸附ELISA测定法或放射免疫测定RIA。
3.如权利要求1所述的一种再生基因蛋白REG1α单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤⑵中常规培养液是指将77mL的无血清DMEM培养基、20mL的新生牛血清、1mL的丙酮酸钠、1mL的 L-谷胺酰氨、各0.5mL的双抗混合而成的含有20%小牛血清和双抗的DMEM高糖完全培养液。
4.如权利要求1所述的一种再生基因蛋白REG1α单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤⑶和所述步骤⑸中的DMEM高糖培养液是指将13.4gDMEM培养粉溶于1L三蒸水中，搅拌并用NaHCO3调pH值至7.2后，经过滤除菌，即得。
5.如权利要求1所述的一种再生基因蛋白REG1α单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤⑹和所述步骤⑺中的HAT培养液是指将75mL的无血清DMEM培养基、20mL的小牛血清、1mL的丙酮酸钠、1mL L-谷胺酰氨、各0.5mL的双抗、1mL 的100倍HT母液和1mL 的100倍A母液混合而成的含有HAT以及20%小牛血清和双抗的DMEM高糖培养液。
6.如权利要求1所述的一种再生基因蛋白REG1α单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤⑺中HT培养液是指将76mL的无血清DMEM培养基、20mL的小牛血清、1mL的丙酮酸钠、1mL 的L-谷胺酰氨、各0.5mL的双抗、1mL的100倍HT母液混合而成的含有HT，20%小牛血清和双抗的DMEM高糖培养液。
7.如权利要求3、5或6所述的一种再生基因蛋白REG1α单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述双抗是指青霉素160w单位溶于8mL无血清DMEM培养基中、链霉素100w单位溶于5mL无血清DMEM培养基中所得的溶液。
8.如权利要求1所述的一种再生基因蛋白REG1α单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤⑻中的克隆方法是指一种经有限稀释该杂交瘤使一孔中只含有一个单一杂交瘤细胞的方法，或一种从软琼脂培养基中分离集落的软琼脂方法，或一种采用显微操作器，挑取单一杂交瘤细胞的方法，或一种采用细胞分离仪分离单一的杂交瘤细胞的“分选仪克隆”方法。
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20201110 |