CN107286240B - 抗ctrp4单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗CTRP4单克隆抗体及其应用，该抗体由杂交瘤细胞株33或35分泌获得，其中杂交瘤细胞株33的保藏编号为：CGMCC NO.14307，杂交瘤细胞株35的保藏编号为：CGMCC NO.14308。这两株细胞株分泌的单克隆抗体能够与CTRP4蛋白特异性结合，高准确性和特异性地识别内源性CTRP4蛋白，可以通过免疫印迹法、免疫荧光法、免疫组化检测CTRP4在组织和细胞中的表达。

Description

抗CTRP4单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及免疫学中免疫球蛋白技术领域的单克隆抗体，具体是一种抗CTRP4的单克隆抗体及其应用。

背景技术

CTRP4是C1q/TNF相关蛋白超家族(C1q and tumor necrosis factor relatedprotein superfamilies，CTRPs)的第4号成员。该家族是由Lodish等于2004年在克隆脂联素种内的同源基因时被发现命名的，目前已发现15个成员(CTRP1～CTRP15)，与脂联素、瘦素和抵抗素等一起被统称为脂肪细胞因子超家族。CTRP4是我们实验室与国家人类基因组北方中心合作通过生物信息学和高通量筛选平台发现的一个新的脂肪细胞因子。2011年我们在国际上发表了第一篇报道C1q/TNF相关蛋白4(CTRP4/C1q/TNF related protein 4，CTRP4)的文章，通过N末端测序确定CTRP4带有经典的信号肽序列，是一个新的分泌蛋白。我们确定重组CTRP4的真核蛋白和原核蛋白具有同样的生物学功能。

体外研究表明，分泌形式的CTRP4蛋白能够上调肿瘤细胞中的炎症信号水平，同时其自身表达也受炎症信号的上调，另外对CTRP4的功能研究显示CTRP4能增强肿瘤细胞的增殖水平，在抗肿瘤药物处理下也会上调，促进肿瘤细胞的抗药性。体内研究表明，CTRP4在体内具有明确的抗炎和抗癌作用作用。因此这是一个功能重要而复杂的分子。

探寻特异的生物标志物分子用于疾病的早期诊断一直是医学科研工作者努力的目标之一。目前，分子标志物因其对多种疾病的诊断、治疗和预后具有十分重要的作用，日益引起学术界的广泛关注。而血液中蛋白的变化因其操作简单、快捷，且创伤小，易被患者接受，是目前诊断多种疾病主要辅助检查之一，应用广泛。

CTRP4的研究仍有许多工作要做，而准确识别和分离CTRP4是研究工作中的重要环节。研究初期我们制备了CTRP4的多克隆抗体，但是该抗体的缺点是特异性差，免疫印迹实验不能识别内源性蛋白。研究发现CTRP4在一些疾病中的表达具有较大差异，并且这种差异在血液中会明显显现出来，因此需要制备一种特异性好的抗体检测疾病中CTRP4的表达变化，这对相关疾病的诊断可能具有重要价值。

发明内容

CTRP4是我们发现的一个新基因，因此国内外任何试剂公司都没有商品化的单克隆抗体，为了更准确、特异地检测CTRP4的表达丰度，本发明提供了一种抗CTRP4单克隆抗体。经过实验检测，该单克隆抗体的特异性非常好，可以特异识别内源性的CTRP4蛋白，可以通过免疫印迹法、免疫荧光法、免疫组化检测CTRP4在组织和细胞中的表达。

本发明提供的抗CTRP4蛋白的单克隆抗体，特异性识别CTRP4蛋白，是由第一杂交瘤细胞株或第二杂交瘤细胞株分泌获得，其中第一杂交瘤细胞株的保藏编号为：CGMCCNO.14307，第二杂交瘤细胞株的保藏编号为：CGMCC NO.14308。

一种杂交瘤细胞株，保藏编号为CGMCC NO.14307。

一种杂交瘤细胞株，保藏编号为CGMCC NO.14308。

一种衍生抗体，由小鼠体内接种保藏编号为CGMCC NO.14307的杂交瘤细胞株或接种保藏编号为CGMCC NO.14307的杂交瘤细胞株，使其产生含抗体的腹水，取出腹水进行纯化制备而成。

本发明还提供了上述单克隆抗体或者衍生抗体在制备CTRP4特异性免疫识别试剂中的应用。

本发明还提供了上述抗CTRP4蛋白的单克隆抗体或者衍生抗体在制备CTRP4的中和试剂中的应用。

本发明还提供了一种免疫检测试剂盒，含有上述抗CTRP4蛋白的单克隆抗体，或含有保藏编号为CGMCC NO.14307的杂交瘤细胞株或/和接种保藏编号为CGMCC NO.14307的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。

优选地，上述免疫检测试剂盒用于辅助诊断脑组织疾病。我们的单抗在脑组织的免疫荧光、免疫组化和免疫印迹法中都可以特异检测到CTRP4的表达。

优选地，因为CTRP4是一种分泌蛋白，因此通过上述单抗制成的免疫检测试剂盒可以检测到血液中CTRP4的表达。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供的抗CTRP4蛋白的单克隆抗体，能够与内源性CTRP4蛋白高特异性结合，有效检测CTRP4在组织和细胞中的表达。适用于制备以免疫印迹、免疫荧光、免疫组化等多种方法为基础的检测试剂，可方便快速准确地完成检测，为更好地研究分子标志物CTRP4蛋白提供有效工具。

保藏信息：

第一杂交瘤细胞株：于2017年06月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC No.14307，建议的分类命名：小鼠单克隆抗体细胞株，参椐的生物材料(株)：CTRP4-33。

第二杂交瘤细胞株：于2017年06月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC No.14308，建议的分类命名：小鼠单克隆抗体细胞株，参椐的生物材料(株)：CTRP4-35。

附图说明

图1为实施例中制备抗CTRP4蛋白的单克隆抗体的技术路线。

图2为1-3号小鼠免疫完成后，对抗体免疫效价的检测结果，其中横坐标是稀释倍数，纵坐标是OD值。

图3是通过免疫印迹法对CTRP4不同杂交瘤细胞株的筛选检测结果，标注的数字为不同细胞株的编号。

图4是第16、33和35号杂交瘤细胞株制备的抗体纯化后的电泳图。

图5是三株杂交瘤细胞株制备的抗体Western blot检测结果，其中1表示33号杂交瘤细胞株制备的单抗，2表示16号杂交瘤细胞株制备的单抗，3表示35号杂交瘤细胞株制备的单抗。

图6是用CTRP4-33在神经细胞的免疫荧光检测结果，其中A是细胞核染色，B是CTRP4蛋白染色，C是神经元染色，D是B和C染色重叠。

图7是用CTRP4-33在小鼠脑组织的免疫荧光检测结果，其中A是细胞核染色，B是CTRP4蛋白染色，C是脑多形性胶质细胞染色，D是B和C重叠。

图8是用CTRP4-35在小鼠脑组织的免疫荧光检测结果，其中A是细胞核染色，B是CTRP4蛋白染色，C是脑多形性胶质细胞染色，D是B和C重叠。

图9是用CTRP4-33免疫组化法检测CTRP4在小鼠脑组织的分布，显示CTRP4在海马部位特异性高表达。

图10是用CTRP4-33免疫印迹法检测CTRP4在小鼠脑组织的分布，显示其在嗅球和海马部位高表达，并且表达量与年龄相关。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术方案进一步说明，意识本领域技术人员能够更好地理解本发明。

实施例1单克隆抗体的制备及筛选

1.重组人CTRP4-His蛋白的表达和纯化

实验室以已知的克隆人源CTRP4基因序列为基础，先常规方法构建了重组人CTRP4-GST蛋白(CTRP4与谷胱甘肽融合)，但后续在大肠杆菌中该融合蛋白并未表达。因此又构建了pET-32a-c(+)-CTRP4原核表达载体。

pET-32a-c(+)-CTRP4表达的重组蛋白为C端带有His标签且去除信号肽的CTRP4蛋白。分别在不同的温度、诱导剂浓度及时间下诱导表达蛋白，发现随着温度的降低，可溶形式的蛋白表达量增加。经过Western Blot鉴定，预期大小的条带系重组人CTRP4-His蛋白。最后选用了最佳诱导表达条件：24℃、10小时、IPTG终浓度为0.4mmol/L的条件进行蛋白的大量诱导表达。

重组CTRP4-His蛋白C-端含有6个组氨酸，采用Ni²⁺柱亲和层析进行纯化。首先采用了50mM咪唑洗脱杂蛋白，200mM咪唑洗脱目的蛋白，但是纯化效果不理想，洗脱的目的蛋白有较多杂蛋白。改用100mM咪唑洗脱杂蛋白，再用500mM咪唑洗脱目的蛋白，得到的蛋白纯度可以达到90％以上。纯化的目的蛋白下文简称为“CTRP4”。

2.CTRP4单克隆抗体制备、纯化、鉴定

单抗制备的技术路线参见图1。

2.1免疫

用“CTRP4”，按60μg蛋白/只小鼠的量，皮下初次免疫4只SPF BALB/c雌性小鼠，编号为：#1、#2、#3、#4。

两周后，皮下第一次加强免疫，免疫量为30μg蛋白/只。

两周后，皮下第二次加强免疫，免疫量为30μg蛋白/只。

三周后，皮下第三次加强免疫，免疫量为30μg蛋白/只。

三周后第五天，皮下第四次加强免疫，免疫量为30μg蛋白/只。

10天以后，用“CTRP4”包板，ELISA测定免疫小鼠效价。

步骤：用“CTRP4”，2μg/mL，4℃包被过夜；2％牛奶，37℃封闭2h；血清从200倍开始2倍梯度稀释，空白对照(blank)为PBS，阴性对照(negative)为阴性血清200倍稀释。

结果参见图2和表1(效价为1/2最大OD值所对应的稀释倍数)：

表1

10天以后，即融合前，用“CTRP4”免疫原50μg，腹腔冲击#1小鼠，做细胞融合实验。

2.2细胞融合实验

概述：取小鼠脾细胞与SP2/0细胞，采用PEG法进行融合。融合完细胞用半固体培养基(含HAT)进行筛选培养。

实验器材：灭菌的手术器械，包括三把剪刀、三把镊子、一个细胞筛、一个注射器的内芯和一个平皿，湿盒，2个500mL烧杯，2个50mL离心管，3个15mL离心管。

实验试剂：IMDM培养基，IMDM完全培养基(含15％血清)，2.2％甲基纤维素(厂家：SIGMA，货号：M0262-100G)，新生牛血清10mL，PEG1500(厂家：Roche，货号：78364)，HAT(厂家：Sigma，货号：H0262-10VL)，HT(厂家：Sigma，货号：H0137-10VL)。

融合实验步骤：

(1)将状态良好的SP2/0细胞轻柔地从培养瓶壁上吹打下来，吸入到50mL离心管中。

(2)小鼠摘眼球取血，然后拉颈处死，放入75％的酒精中浸泡5min。

(3)在平皿中倒入少量无血清的IMDM，将细胞筛及注射器内芯放入平皿中。用剪刀和镊子取下小鼠的脾脏，放到细胞筛上。用注射器的内芯轻轻地将脾充分碾碎，将碾好的细胞吸入到装SP2/0的离心管中，离心1500rad/min，5min。

(4)用剪刀和镊子取下小鼠的胸腺，碾碎。将碾好的胸腺细胞放到15mL离心管中，再加入1mL的HAT，放在孵箱中备用。

(5)将离心好的细胞，倒掉上清，用无血清的IMDM将细胞小心轻柔地吹匀，离心(1500rad/min，5min)。

(6)将离心好的细胞上清尽量倒掉。拍打离心管底充分悬浮细胞，将离心管放入37℃温水中，在1分钟内缓慢加入1mL的PEG，加完后，在温水中静置1min。然后2min内缓慢加入2mL的无血清的IMDM，接着2min内缓慢加入8mL无血清的IMDM。离心1000rad/min，5min。

(7)倒掉上清，加入10mL的血清，小心的将细胞吹匀，倒入前面准备好的胸腺细胞。再加入25mL灭过菌的半固体培养基，充分混匀。然后均匀倒入30个细胞培养皿中。将细胞培养皿放入湿盒中，然后放入孵箱中培养。

2.3挑克隆

挑10板×93个细胞单克隆，培养于96孔细胞培养板(事先用胸腺细胞铺板，100μL/孔)。

2.4单克隆细胞第一次筛选

概述：挑克隆培养一周后，用“CTRP4”包板，对挑选的克隆采用ELISA方法，做第一次筛选，得到41株阳性杂交瘤细胞株。

实验试剂：包被液(碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，pH9.6)、PBS缓冲液pH7.4、封闭液(含2％牛奶的PBS)、洗液PBST(含0.05％吐温的PBS)、显色液:1％A液+10％B液(A液：含1％TMB的DMSO；B液：含0.1％H₂O₂的柠檬酸缓冲液)、终止液(2M硫酸)、二抗(山羊抗小鼠IgG/HRP)。

实验步骤：

(1)用包被液稀释“CTRP4”至终浓度为2μg/mL，100μL/孔，4℃，过夜；后用洗液洗涤3次。

(2)2％牛奶封闭液封闭，200μL/孔，37℃孵箱，2h；后用洗液洗涤3次。

(3)加入一抗(细胞培养上清)、阴性对照(SP2/0培养上清)、空白对照(PBS)、阳性对照(阳性血清PBS 200倍稀释)，均为100μL/孔，37℃孵箱，1h；后用洗液洗涤3次。

(4)加入PBS稀释20000倍的二抗，100μL/孔，37℃孵箱，1h；取出后用洗液洗涤3次。

(5)显色，显色液100μL/孔，显色时间为5min左右。

(6)每孔加入50μL终止液终止。

(7)双波长(450，630)测吸光值，记录保存数据。

实验数据见表2(共41株)：

表2

注：*代表对免疫蛋白筛选呈阳性的杂交瘤细胞株，共41株。▲为阳性对照读数，△为空白对照读数，☆为阴性对照读数(下同)。

2.5单克隆细胞第二次筛选

将41株阳性的细胞株，用“CTRP4”及标签His,Myc及天然样本”包板，采用ELISA方法，做第二次筛选，得到22株阳性杂交瘤细胞株。

表3

编号	CTRP4	天然样本	c-myc*his	编号	60948	天然样本	c-myc*his
								1	0.129	0.106	0.068	23	0.329*	0.073	0.02
2	0.265*	0.074	0.03	24	0.796*	0.193	0.032
								3	0.575*	0.133	0.037	25	0.497*	0.118	0.046
4	0.769*	0.159	0.052	26	0.152	0.103	0.083
								5	0.747*	0.43	0.045	27	0.614*	0.074	0.022
6	0.216	0.063	0.04	28	0.739*	0.138	0.041
								7	0.624*	0.298	0.033	29	0.218	0.084	0.081
8	0.188	0.08	0.03	30	0.777*	0.752	0.903
								9	0.853*	0.101	0.017	31	0.552*	0.115	0.025
10	0.051*	0.735	0.029	32	0.415*	0.061	0.023
								11	0.234	0.108	0.026	33	0.767*	0.141	0.045
12	0.781*	0.228	0.093	34	0.371*	0.078	0.026
								13	0.857*	0.543	0.037	35	0.249*	0.164	0.023
14	0.682*	0.18	0.025	36	0.476*	0.194	0.062
								15	0.281*	0.076	0.027	37	0.204	0.133	0.102
16	0.519*	0.066	0.027	38	0.314*	0.059	0.015
								17	0.395*	0.088	0.024	39	0.796*	0.069	0.022
18	0.241*	0.221	0.754	40	0.683*	0.036	0.017
								19	0.334*	0.07	0.024	41	0.092	0.061	0.119
20	0.432*	0.055	0.028	阴	0.023	0.037	0.018
								21	0.151	0.061	0.024	空	0.017	0.049	0.018
22	0.661*	0.18	0.023	阳	0.637	0.16	0.199

2.6单克隆细胞亚类鉴定

概述：将筛选出来的30株阳性细胞株进行亚类鉴定，最后得到22株IgG类型的阳性杂交瘤细胞株。

实验试剂：

包被抗体：(Southern Biotech)；封闭液：含有2％BSA和3％蔗糖的PBS；显色液:0.2mL A液+10mL B液(内含10μL 30％H₂O₂)、各型亚类二抗:(均购自Southern Biotech)。

A液是含有15mg/ml ABTS的H₂O；B液为pH4.0的柠檬酸缓冲液。

实验步骤：

(1)用100mM PBS(pH7.4)稀释包被抗体至0.5μg/mL，每孔加0.1mL，4℃，过夜。

(2)PBS-T洗3次，每孔加入200μL封闭液，37℃孵育2h。

(3)PBS-T洗3次，每孔加入100μL杂交瘤上清，37℃孵育1h。

(4)PBS-T洗3次，用封闭液1：1000(κ,λ)或1：2000(其它的)稀释的HRP标记的抗体0.1mL每孔，分别加入适当的孔中，37℃孵育1h。

(5)PBS-T洗3次，每孔加50μL底物溶液，10～20min内于双波长(450，630)测吸光值，记录保存数据(见表4)。

表4实验数据

注：※表示IgG类型的阳性杂交瘤细胞株。

表5单克隆细胞株相关信息

表5中不同编号的杂交瘤细胞株通过免疫印迹法筛选，结果见图3，最终挑选出条带清晰、杂蛋白少的第16、33和35号杂交瘤细胞株，对其表达的蛋白进行电泳分析，SDS-PAGE显示两条蛋白条带，分子量约为50KD和25KD，表达的抗体有典型的重链及轻链结构，检测纯化后抗体纯度达95％以上(参见图4)。

2.7小鼠腹腔接种法大规模制备单抗

将第16、33和35号杂交瘤细胞株分别进行组织培养，至对数生长期后收集清洗稀释后分别注射小鼠腹腔，7～14天后采集腹水，分离的上清液里即含有抗CTRP4蛋白的单克隆抗体。三株杂交瘤细胞株制备的抗体分别标记为CTRP4-16、CTRP4-33、CTRP4-35。

2.8单克隆抗体的特异性检测

2.8.1体外特异性结合实验

实验方法：Western blot。

实验材料：抗原：CTRP4蛋白过表达材料

一抗：三株杂交瘤细胞对应制备的单克隆抗体。

二抗：HRP标记羊抗鼠抗体。

实验条件参见表6，实验结果参见图5。

表6

结合附图5，其中1表示33号杂交瘤细胞株制备的单抗CTRP4-33，2表示16号杂交瘤细胞株制备的单抗CTRP4-16，3表示35号杂交瘤细胞株制备的单抗CTRP4-35。

从图5可以看出，1和3的电泳条带清晰，表明抗体特异性高。

2.8.2体内特异性结合实验

用CTRP4-33在神经细胞进行免疫荧光检测，结果参见图6，用CTRP4-33和CTRP4-35分别在小鼠脑组织进行免疫荧光检测，结果参见图7和图8。体内免疫荧光实验表明，通过这两种抗体，CTRP4蛋白能够清晰地被标记出来，CTRP4-35的标记效果更佳，优于CTRP4-33。

通过单抗检测小鼠脑组织中CTRP4的表达发现，CTRP4在脑组织中的表达与其年龄相关，年轻鼠表达量高，老年鼠表达量下降，特别在老年鼠海马组织CTRP4表达量明显下降。AD模型鼠脑组织特别是嗅球组织CTRP4的表达下降，这是CTRP4的表达可能与AD的发生发展有密切关系的一个有力证据。

用CTRP4-33免疫组化法检测CTRP4在小鼠脑组织的分布，显示CTRP4在海马部位特异性高表达。参见图9。

用CTRP4-33免疫印迹法检测CTRP4在小鼠脑组织的分布，显示其在嗅球和海马部位高表达，并且表达量与年龄相关。参见图10，其中A为嗅球组织，B为海马组织。A图中，编号1～3为老年鼠，4～6为青年鼠，7～9为AD鼠。B图中，编号1～3为AD鼠，4～6为青年鼠，7～9为老年鼠。M是分子量标志。

从实验结果来看，AD(阿尔茨海默病)鼠的嗅球组织中CTRP4表达量减少，与老年鼠表达量近似。

本文中应用了具体个例对发明构思进行了详细阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离该发明构思的前提下，所做的任何显而易见的修改、等同替换或其他改进，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种抗CTRP4蛋白的单克隆抗体，特异性识别CTRP4蛋白，其特征在于，由第一杂交瘤细胞株或第二杂交瘤细胞株分泌获得，其中第一杂交瘤细胞株的保藏编号为：CGMCCNO.14307，第二杂交瘤细胞株的保藏编号为：CGMCC NO.14308。

2.一种杂交瘤细胞株，保藏编号为CGMCC NO.14307。

3.一种杂交瘤细胞株，保藏编号为CGMCC NO.14308。

4.权利要求1所述的单克隆抗体在制备CTRP4特异性免疫识别试剂中的应用。

5.权利要求1所述的抗CTRP4蛋白的单克隆抗体在制备CTRP4的中和试剂中的应用。

6.一种免疫检测试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的单克隆抗体，或含有权利要求2和/或权利要求3所述的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。

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