CN105238762A - 抗pd-1蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗pd-1单克隆抗体和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了抗PD-1蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗PD-1单克隆抗体和应用。本发明所述抗PD-1蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞保藏编号为CGMCC？NO：11085。本发明提供的杂交瘤细胞可稳定分泌产生抗PD-1蛋白单克隆抗体，且与PD-1蛋白特异性结合，而与蛋白芯片上近10000种其他蛋白无交叉反应，显著提高了PD-1蛋白免疫检测的特异性、准确性和可靠性，广泛适用于各种肿瘤组织及其微环境中PD-1的检测。

Description

抗PD-1蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗PD-1单克隆抗体和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及抗PD-1蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗PD-1单克隆抗体和应用。

背景技术

程序性细胞死亡因子1(processeddeath-1，PD-1)是由PDCD1基因编码的一个抑制性共刺激分子，由288个氨基酸残基组成的50-55kDa的I型跨膜糖蛋白，由细胞外IgV结构域、跨膜结构区域以及细胞内尾部结构三部分构成。它可表达于活化的T细胞、B细胞、NK细胞等单核细胞及树突状细胞(DCs)表面，提示PD-1在免疫调节中扮演着更关键的角色。PD-1作为表达在活化T细胞上的负性共刺激分子与肿瘤细胞表达的PD-L1结合，可抑制T细胞增殖，并促进活化T细胞的凋亡；而PD-1抗体则可以阻断PD-1/PD-L1的结合，使效应T细胞发挥其肿瘤杀伤作用。

近年来，大量的研究表明PD-1可以作为一种重要的分子标志物在各种肿瘤中的预后诊断中发挥着重要的作用。在与PD-1相关的滤泡性淋巴瘤研究中，Wahlin等利用组织芯片IHC的方法检测滤泡PD-1阳性细胞比例可以作为独立表征预后良好的判定依据,但Takahashi等的研究认为PD-1并不能作为滤泡性淋巴瘤预后判读的有效指标，Richendollar等指出PD-1阳性T细胞比例越高，其病人的生存期越短，同样的研究也在霍奇金淋巴瘤中有报道。在肝细胞癌中，Shi和Zeng等研究发现瘤内PD-1+T细胞高比例与肝癌病人的无病生存期(DFS)呈反比，而外周微环境中的PD-1的表达水平可以作为独立判定无治疗生存期(TFS)的预后指标。Thompson等研究发现肾细胞肿瘤病人中免疫细胞高表达PD-1蛋白与病人预后呈负相关。另有报道发现乳腺癌中浸润性淋巴组织中PD-1阳性细胞数与组织学分级相关。在利用贝伐单抗(bevacizumab)、弗氧嘧啶(fluorouracil)和伊立替康(irinotecan(FOLFIRI-B))治疗结直肠癌患者后，其外周血淋巴细胞中PD-1的过表达与预后较差相关。

目前在科研上通常通过流式细胞术(FlowCytometry，FC)检测PD-1来标记和分离干细胞和肿瘤干细胞，而临床上通常用免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)病理实验检测肿瘤组织内肿瘤干细胞中PD-1的表达状况。而不论是FC还是IHC，其实验方法的核心为特异性结合PD-1的单克隆抗体，其性能的优劣直接决定着整个检测的灵敏度和特异性。因此，研制出一种结合特异性较高的针对PD-1蛋白的单克隆抗体具有重要的意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供抗PD-1蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗PD-1单克隆抗体和应用，提高所述杂交瘤细胞产生的单抗与PD-1蛋白的结合特异性并应用到相关产品的制备中。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

抗PD-1蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞，保藏编号为CGMCCNO：11085。

本发明所述抗PD-1蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞由以下方法制备获得：

(1)重组表达载体的构建：根据PD-1ORF核苷酸序列(PD-1ORF核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，864bp；PD-1氨基酸序列如SEQIDNO.2所示)设计引物进行PCR扩增，基因两侧分别引入限制性内切酶位点SgfI和MluI，插入表达载体pCMV6-Entry(货号PS100001，Origene公司)，构建PD-1重组表达质粒RC210364；

(2)PD-1重组蛋白的表达与纯化：将PD-1重组表达质粒转化HEK293T，裂解离心取上清，DDK亲和层析柱纯化，获得纯化的PD-1重组蛋白；

(3)单克隆抗体的筛选与制备：采用上述纯化的PD-1重组蛋白免疫BALB/c小鼠，取小鼠脾脏细胞与SP2/0细胞进行融合，有限稀释法获得单克隆，ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞，获得能分泌抗PD-1特异性抗体的杂交瘤细胞株；通过无血清培养基制备抗体，通过亲和层析柱纯化获得PD-1单克隆抗体。通过免疫组化实验验证该单克隆抗体的灵敏度和特异性。

经过上述方法制备后，筛选出能够稳定分泌抗PD-1单克隆抗体的杂交瘤细胞，命名为UMAB199，亚型鉴定为IgG2a，并于2015年7月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNO：11085。

同时，本发明还提供一种抗PD-1蛋白单克隆抗体，由保藏编号为CGMCCNO：11085的杂交瘤细胞分泌产生。制备抗PD-1蛋白单克隆抗体可采用本技术领域常规方法，如通过无血清培养基制备抗体，通过亲和层析柱纯化获得PD-1单克隆抗体。

本发明所述保藏编号为CGMCCNO：11085的杂交瘤细胞染色体稳定，其分泌产生的抗PD-1蛋白单克隆抗体为IgG2a型，效价较高。所述单克隆抗体的免疫组化检测结果显示，其能够特异性识别肺癌淋巴细胞浸润组织、淋巴瘤组织、正常淋巴结和扁桃体组织中的PD-1蛋白。

同时，采用OriGene高密度蛋白芯片检测所述单抗的特异性试验表明，本发明所述单克隆抗体仅和PD-1蛋白特异性结合，而与近10000种其他蛋白无交叉反应。

因此，本发明还提供了保藏编号为CGMCCNO：11085的的杂交瘤细胞在制备抗PD-1蛋白单克隆抗体中的应用以及所分泌的抗PD-1蛋白单克隆抗体在制备检测PD-1蛋白的免疫检测产品中的应用。

作为优选，所述免疫检测产品为试剂盒、试纸或芯片。

本发明还提供一种免疫组化检测的试剂盒，包括保藏编号为CGMCCNO：11085的杂交瘤细胞分泌产生的抗PD-1蛋白单克隆抗体。所述免疫检测试剂盒可检测肿瘤组织及其微环境中PD-1的表达状况。

此外，本发明还提供保藏编号为CGMCCNO：11085的杂交瘤细胞分泌产生的抗PD-1蛋白单克隆抗体在制备标记肿瘤组织及其微环境中淋巴细胞的试剂盒中的应用。

作为优选，所述肿瘤包括结肠癌、淋巴瘤、肺癌、肝癌，肾癌和乳腺癌。

作为优选，所述淋巴瘤包括滤泡性淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。

本发明提供的杂交瘤细胞可稳定分泌产生抗PD-1蛋白单克隆抗体，且与PD-1蛋白特异性结合，而与蛋白芯片上近10000种其他蛋白无交叉反应，显著提高了PD-1蛋白免疫检测的特异性、准确性和可靠性，广泛适用于各种肿瘤组织及其微环境中PD-1的检测。

生物保藏信息说明

UMAB199，分类命名为程序性死亡分子1(PD-1)单克隆抗体杂交瘤细胞株，于2015年7月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNO：11085。

附图说明

图1所示为实施例1中克隆位点图；

图2所示为实施例2中PD-1蛋白Westernblot检测结果图，以anti-DDK检测PD-1蛋白在HEK293T细胞中的表达，其中泳道L为转染空载体的HEK293T细胞裂解液为抗原的检测结果、泳道R为转染pCMV6-PD-1质粒的HEK293T细胞裂解液抗原的检测结果；

图3所示为实施例2中PD-1蛋白SDS-PAGE结果图；

图4所示实施例4肺癌淋巴细胞浸润组织免疫组化检测结果图(一抗为UMAB199分泌产生的PD-1单抗，1:500)；

图5所示实施例4淋巴瘤组织免疫组化检测结果图(一抗为UMAB199分泌产生的PD-1单抗，1:500)；

图6所示实施例4淋巴结组织免疫组化检测结果图(一抗为UMAB199分泌产生的PD-1单抗，1:500)；

图7所示实施例4扁桃体组织免疫组化检测结果图(一抗为UMAB199分泌产生的PD-1单抗，1:500)；

图8所示实施例5origene蛋白芯片鉴定结果图(一抗为UMAB199分泌产生的PD-1单抗,1:100；二抗为Alexa647-标记的驴抗鼠IgG，1:500)。

具体实施方式：

本发明公开了抗PD-1蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗PD-1单克隆抗体和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

下面就本发明提供的抗PD-1蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗PD-1单克隆抗体和应用做进一步说明。

实施例1：PD-1重组表达质粒的构建

以Origene公司PD-1的cDNA克隆质粒SC117011为模板，设计两条引物并分别引入酶切位点SgfI和MluI，克隆入表达载体pCMV6-Entry，建立PD-1全长蛋白的重组真核表达质粒。克隆位点设计如图1所示。

实施例2：PD-1重组蛋白的表达与纯化

1、转染HEK293T细胞：HEK293T细胞以1:3传至培养皿中继续培养；取7.5mLDMEM(无血清及抗生素)至50mL管中，加入300μLPEIMegaTran1.0混匀；加入75μgPD-1重组质粒DNA至混匀液中，混匀并静置30分钟；分别取515μL至各培养皿中于37℃5％CO₂培养箱中培养。转染24小时后，每皿细胞添加25μL2M丁酸钠至终浓度5mM。

2、裂解细胞：转染48小时后，进行细胞裂解。吸去培养基，加入1mLPBS进行漂洗，吸去PBS。加入1mL裂解缓冲液，使用前加入蛋白酶抑制剂PI和PMSF。置于冰盒中在摇床上振荡，收集所有培养皿中得裂解液，4度离心，收集上清。

3、DDK亲和层析柱纯化：以0.45μM，33mmPVDF膜滤器过滤离心后的裂解液上清并转入15mL管，加入混合好的Beads1mL，封口后放入360度混匀器中，于4℃结合2小时；取出15mL管，将裂解液倒入BIO-RAD层析柱中，并接住穿透液，滴尽后穿透液取样WB检测，见图2；以裂解缓冲液冲洗柱料1-2次，滴尽后再用TBST冲洗Beads3次，滴尽后用0.1MGlycinepH3.5洗脱，第一次200μL，滴尽不收集，第二、三次各500μL，第三次250μL，收集至一个1.5mLTube中，并迅速加入NaH₂PO₄(pH＝11.0)中和至pH7.0左右，每管加入甘油至终浓度为10％，Tween-80至终浓度为0.1％。纯化后的PD-1蛋白用SDS-PAGE鉴定，见图3。

由图2结果可见，标签抗体anti-DDK能检测到转染pCMV6-PD-1的重组质粒的HEK293T细胞裂解液中PD-1重组蛋白(R)，由于PD-1是I型跨膜糖蛋白，因此其蛋大小为45～55kDa之间多条带，与预期相符，表明PD-1重组蛋白正确表达。

由图3结果可见，经过DDK亲和层析柱纯化，Glycine洗脱可得到高纯度的PD-1重组蛋白。

实施例3：抗PD-1单克隆抗体杂交瘤细胞及其单克隆抗体的制备筛选

根据标准方法用重组产生的纯化的全长PD-1重组蛋白(以下简称为PD-1抗原)用于对B6/C57小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)进行免疫。具体方法如下：

1、动物免疫：经过纯化的PD-1抗原以完全弗氏佐剂乳化，采用皮下或腹腔注射方法免疫6-8周龄BALB/c小鼠，免疫剂量为50μg/只，间隔两周后进行第二次免疫，以不完全弗氏佐剂乳化，免疫剂量为50μg/只。免疫两次后取尾血以ELISA法梯度稀释测定血清效价；根据结果确定是否加强免疫，选取抗体效价最高的小鼠进行细胞融合。

2、细胞融合：骨髓瘤细胞采用BALB/c来源的sp2/0，融合时处于对数生长期；取已免疫小鼠脾脏，制成淋巴细胞单细胞悬液；小鼠脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞以1:5-1:10混合，滴加37℃的50％PEG(PH8.0)1mL，加入不完全培养基及其余终止液，离心弃上清后加入HAT培养基悬浮混匀，MC定容到50mL，分装到3.5cm培养皿中，放于湿盒中，置于37℃、5％CO₂恒温培养箱中进行培养。

3、筛选和克隆：融合7-10天内挑选细胞克隆，使用纯化的PD-1重组蛋白进行ELISA测试。标记细胞株号。对阳性孔细胞进行有限稀释，每次有限稀释后5-6天测定ELISA值，挑取OD280阳性值较高的单克隆孔进行有限稀释，直至ELISA测定96孔板全板结果为阳性。挑取阳性值高的单克隆定株。其对应融合板细胞株为UMAB199。

4、细胞上清单抗的制备与纯化：将细胞株UMAB199用含15％血清的DMEM培养基培养于10cm培养皿中培养，扩培至约4×10⁷个时，800rpm离心5min，弃上清并将细胞转移到2L转瓶中，加入无血清培养基，使细胞密度约为3×10⁵个/ml。继续培养1～2周后，当细胞死亡率达到60％-70％时(此时细胞密度大概为1-2×10⁶个/ml)，收取细胞悬液6000rpm高速离心20min，取上清，亲和层析法进行上清纯化，根据抗体亚型选择相应柱料，细胞株UMAB199产生的单抗亚型为IgG2a，采用proteinG进行纯化。纯化后的单抗浓度测定、分装(100uL/管，浓度为1mg/ml)、保存在4-8℃。

实施例4：UMAB199分泌产生的单克隆抗体为一抗的免疫组化检测

(1)、实验方法：

1、分别取肺癌(含大量淋巴细胞浸润)和淋巴瘤组织、淋巴结和扁桃体组织块进行石蜡包埋，使用SAKURA组织切片机进行切片，组织厚度为4μm。

2、脱蜡与水化：分析纯二甲苯3×10min，无水乙醇3×10min，95％乙醇5min，85％乙醇5min，75％乙醇5min，去离子水浸泡3min×3次

3、加入抗原修复液(1mMEDTA,pH8.5的10mMTris-HCL缓冲液)高压锅高压热修复2.5min，待高压锅温度降至约90℃时，打开高压锅，取出标本，然后自然冷却至室温。去离子水浸泡3min×3次。

4、使用3％过氧化氢灭活组织内源性过氧化物酶，室温静置10min。去离子水浸泡5min×3次。

5、加上封闭液(PBS+5％脱脂奶粉+5％正常山羊血清)，37℃孵育60min。

6、去除封闭液，勿冲洗，加入PD-1单抗(UMAB199分泌产生)，稀释比：1:150，使用封闭液进行稀释。置于湿盒中，37℃孵育60min。PBST(0.1％Tween-20)洗涤2次，每次洗涤5min。PBST(0.02％Tween-20)洗涤1次，每次洗涤5min。

7、滴加聚合物HRP染色试剂盒中试剂PV6000(CatlogNo.PV-6000)，37℃孵育15分钟。使用PBS洗涤3次，每次5min。

8、应用DAB溶液(中杉金桥ZLI-9019)显色，显色3～10min。蒸馏水洗涤。

9、苏木精复染细胞核2min，蒸馏水漂洗，1％盐酸分化。蒸馏水漂洗3次，室温静置1min。

10、脱水和透明：75％乙醇5min，100％乙醇5minx3次，85％乙醇5min，95％乙醇5min，100％乙醇3×5min；二甲苯3×5min，中性树胶封片。

11、镜检，见图4、图5、图6和图7。

(2)、实验结果：

由图4结果可见，PD-1蛋白在肺癌淋巴细胞浸润组织中的淋巴细胞呈特异性细胞膜表达，如图箭头所示淋巴细胞。

由图5结果可见，PD-1蛋白在淋巴瘤组织中的淋巴细胞上呈特异性细胞膜表达，如图箭头所示淋巴细胞。

由图6结果可见，PD-1蛋白在正常淋巴结组织中的淋巴细胞上呈特异性细胞膜表达，如图箭头所示淋巴细胞。

由图7结果可见，PD-1蛋白在正常扁桃体组织中的淋巴细胞上呈特异性细胞膜表达，如图箭头所示淋巴细胞。

结果表明本发明UMAB199产生的单克隆抗体能够特异性识别肺癌淋巴细胞浸润组织、淋巴瘤组织、正常淋巴结和扁桃体组织中的PD-1蛋白。

实施例5：UMAB199分泌产生的单克隆抗体的特异性蛋白芯片检测

OriGene高密度蛋白芯片上包含10000个HEK293T细胞蛋白过表达裂解物，每种蛋白裂解液在芯片上具有两个拷贝的重复。蛋白裂解液被印迹在硝酸纤维素膜上。每一钟蛋白裂解液的定位可以通过Excel文件进行准确定位。蛋白芯片上蛋白分为40个亚矩阵，每个亚矩阵上有一些参照，通过参照，可以定量每个芯片点上蛋白的含量，监控每次免疫反应数据的重复性，以及定位阳性信号的方向。以下为使用OriGene蛋白(OriGeneCatPA100001)芯片进行UMAB199分泌产生的单克隆抗体鉴定实验的方法：

1、将一张蛋白芯片放在50mL离心管中，使用40mL去离子水浸润芯片，置于摇床上，室温混合30分钟。弃掉去离子水，使用10mLPBST平衡芯片。室温处理10分钟。

2、向50mL离心管中加入40mL5％脱脂牛奶(用PBST进行稀释)置于摇床上，室温封闭30分钟。

3、使用封闭液(5％脱脂牛奶)稀释一抗UMAB199，稀释比列为1：100。

4、将洁净的封口膜粘贴到实验台上，滴加250-300μL一抗在封口膜上。

5、将蛋白芯片从封闭液中抽出，将蛋白芯片NC膜的一面朝下，从芯片的一边接触抗体，慢慢滑下，依靠液体表面张力，抗体将慢慢浸润芯片NC膜，直至整张NC膜浸润在一抗溶液中。整个操作过程避免产生气泡。将芯片移到4℃环境下，静置，一抗孵育过夜。在芯片上加盖培养皿盖，其上黏附一张湿纸巾，以防止长时间孵育导致抗体蒸发。

6、第二天将芯片移至50mL离心管中，使用PBST漂洗芯片两次，去除多余的抗体。使用40mLPBST(0.1％Tween-20)洗涤芯片，置于摇床上混合均匀，洗涤三次，每次洗涤5min。

7、使用封闭液(5％脱脂牛奶)稀释二抗Alexa647-标记的驴抗鼠IgG，稀释比例为1：500。

8、按照上述步骤4，步骤5进行二抗孵育操作。室温孵育1小时。在芯片上方用铝箔纸遮盖，以防止发生信号漂白。

9、按照上述步骤6，使用PBST洗涤芯片。

10、使用去离子水冲洗芯片，以去除残余的盐分和变性剂。

11、室温干燥芯片，确保芯片完全干燥。

12、使用芯片扫描仪读取荧光信号。

13、根据BSA-Cy3以及BSA-Cy5确定芯片方向以及阳性信号的位点。

14、根据阳性信号位点找出对应蛋白裂解液ID，根据裂解液数据库信息，查找到对应蛋白名称，NCBI录入号(accessionnumber)，蛋白ID，蛋白大小等信息。结果见图8。

图8结果显示，在蛋白芯片上仅有PD-1蛋白与UMAB199分泌产生的单克隆抗体结合，表明本发明所述单抗可与PD-1蛋白特异性结合，而与其他近10000种蛋白无交叉反应。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.抗PD-1蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞，其特征在于，保藏编号为CGMCCNO：11085。

2.保藏编号为CGMCCNO：11085的杂交瘤细胞在制备抗PD-1蛋白单克隆抗体中的应用。

3.抗PD-1蛋白单克隆抗体，其特征在于，由保藏编号为CGMCCNO：11085的杂交瘤细胞分泌产生。

4.保藏编号为CGMCCNO：11085的杂交瘤细胞分泌产生的抗PD-1蛋白单克隆抗体在制备检测PD-1蛋白的免疫检测产品中的应用。

5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述免疫检测产品为试剂盒、试纸或芯片。

6.一种免疫组化检测的试剂盒，其特征在于，包括保藏编号为CGMCCNO：11085的杂交瘤细胞分泌产生的抗PD-1蛋白单克隆抗体。

7.保藏编号为CGMCCNO：11085的杂交瘤细胞分泌产生的抗PD-1蛋白单克隆抗体在制备标记肿瘤组织及其微环境中淋巴细胞的试剂盒中的应用。

8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述肿瘤包括结直肠癌、淋巴瘤、肺癌、肝癌，肾癌和乳腺癌。

9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，所述淋巴瘤包括滤泡性淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。