CN105131114B - 抗p16蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗p16单克隆抗体和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了一种杂交瘤细胞株(保藏编号为CGMCC No.11088)，以及由此杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体OTI7B10。本发明还涉及单克隆抗体OTI7B10在制备用于检测p16蛋白的免疫检测工具中的应用，含单克隆抗体OTI7B10的免疫组化试剂盒，以及单克隆抗体OTI7B10在制备用于标记肿瘤的试剂盒中的应用。本发明所述单克隆抗体可与p16蛋白特异性结合，而与细胞内其他蛋白无交叉反应，显著提高了p16蛋白免疫检测的特异性、准确性和可靠性。

Description

抗p16蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗p16单克隆抗 体和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种抗p16蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗p16单克隆抗体和应用。

背景技术

人细胞周期依赖性激酶抑制基因(CDKN2A)为抑癌基因，编码两种不同的细胞周期抑制蛋白p16INK4a和p14ARF。p16INK4a简称：p16，是由外显子1α、2和3编码；而p14ARF，简称：p14，是由外显子1β、2和3编码。虽然两者含有共同的外显子2和3，但由于ORF读码框不一样，p16与p14的AA序列完全不一样。研究表明，p16能与CDK4/6结合抑制其激酶的活性，从而发挥细胞周期调控作用。由于p16参于调控细胞周期的作用，所以其在肿瘤发生过程中也发挥着重要的作用，多项研究表明，p16表达量的变化及突变的发生与肺癌、肝癌、恶性胶质瘤、黑素瘤、卵巢癌、膀胱癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌、宫颈癌等多肿瘤的发生相关。

目前临床上主要通过免疫组织化学(IHC)病理实验检测肿瘤组织中p16蛋白的表达状况。IHC实验的核心为特异性结合p16蛋白的单克隆抗体，其性能的优劣直接决定着整个检测的灵敏度和特异性。因此，研制出一种结合特异性较高的针对P16蛋白的单克隆抗体具有重要的意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种抗p16蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗p16单克隆抗体和应用。本发明所述单克隆抗体可与p16蛋白特异性结合，而与细胞内其他蛋白无交叉反应，显著提高了p16蛋白免疫检测的特异性、准确性和可靠性，真实反映肿瘤细胞内p16蛋白表达水平，可应用于肺癌、肝癌、恶性胶质瘤、黑素瘤、卵巢癌、膀胱癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌、宫颈癌等相关肿瘤组织中p16的表达水平。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种单克隆抗体，其与p16蛋白特异性结合。

在本发明的一些具体实施方案中，所述单克隆抗体由保藏编号为CGMCC No.11088的杂交瘤细胞株产生。

本发明还提供了所述单克隆抗体在制备用于检测p16蛋白的免疫检测工具中的应用。

在本发明的一些具体实施方案中，所述免疫检测工具为试剂、试剂盒、芯片或试纸。

本发明还提供了一种免疫组化检测试剂盒，包括所述单克隆抗体。

本发明还提供了所述单克隆抗体在制备用于标记组织细胞的试剂或试剂盒中的应用。

在本发明的一些具体实施方案中，所述单克隆抗体在制备用于标记组织细胞的试剂或试剂盒中的应用中所述组织细胞为肺癌、肝癌、恶性胶质瘤、黑素瘤、卵巢癌、膀胱癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌、宫颈癌或相关肿瘤。所述相关肿瘤为与上述组织、细胞相同的肿瘤。

本发明还提供了一种标记组织细胞的试剂盒，包括所述单克隆抗体。

在本发明的一些具体实施方案中，所述试剂盒中所述组织细胞为肺癌、肝癌、恶性胶质瘤、黑素瘤、卵巢癌、膀胱癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌、宫颈癌或相关肿瘤。所述相关肿瘤为与上述组织、细胞相同的肿瘤。

本发明还提供了一种杂交瘤细胞株，其保藏编号为CGMCC No.11088。

与现有技术相比，本发明提供了一种杂交瘤细胞株(保藏编号为CGMCCNo.11088)，以及由此杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体OTI7B10。本发明还提供了单克隆抗体OTI7B10在制备用于检测p16蛋白的免疫检测工具中的应用，含单克隆抗体OTI7B10的免疫组化试剂盒，以及单克隆抗体OTI7B10在制备用于标记肿瘤的试剂盒中的应用。本发明所述单克隆抗体可与p16蛋白特异性结合，而与细胞内其他蛋白无交叉反应，显著提高了p16蛋白免疫检测的特异性、准确性和可靠性，真实反映肿瘤细胞内p16蛋白表达水平，可应用于肺癌、肝癌、恶性胶质瘤、黑素瘤、卵巢癌、膀胱癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌、宫颈癌等相关肿瘤组织中p16的表达水平。

生物保藏说明

用于保藏的杂交瘤细胞株OTI7B10的分类命名为：p16蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株；

保藏单位全称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

保藏单位简称：CGMCC；

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；

保藏日期：2015年07月03日；

保藏编号：CGMCC No.11088。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示实施例1克隆位点设计如图，其中底纹部分为ORF区；

图2示实施例2重组p16蛋白Western blot检测结果图，以anti-His检测重组p16蛋白在E.Coli细胞中的表达，其中泳道L为转染空载体的E.Coli细胞裂解液为抗原的检测结果、泳道R为转染pET-His-rp16质粒的E.Coli细胞裂解液抗原的检测结果；

图3示实施例2重组p16蛋白SDS-PAGE结果图，用镍亲和层析柱纯化重组P16蛋白，纯化后的蛋白通过SDS-PAGE胶电脉、考马斯亮蓝染色；

图4示实施例3以单克隆抗体OTI7B10识别293T细胞过表达的p16全长蛋白以及肿瘤细胞系MCF7内源p16蛋白的Western blot检测结果图；

图5示实施例4福尔马林固定、石蜡包埋的人结肠癌免疫组化结果图(一抗为p16单克隆抗体OTI7B10)；

图6示实施例4福尔马林固定、石蜡包埋的人宫颈癌免疫组化结果图(一抗为P16单克隆抗体OTI7B10)；

图7示实施例4福尔马林固定、石蜡包埋的人肝癌免疫组化结果图(一抗为p16单克隆抗体OTI7B10)；

图8示实施例5OriGene蛋白芯片鉴定结果图(一抗为p16单抗OTI7B10，1:100；二抗为DyLight649-conjugated AffiniPure Fragment Goat-anti-Mouse IgG，1:400)。

具体实施方式

本发明公开了一种抗p16蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗p16单克隆抗体和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供了一种杂交瘤细胞株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为CGMCC)，保藏日期为2015年07月03日，保藏编号为CGMCC No.11088。

本发明还提供了一种特异性结合p16蛋白的单克隆抗体OTI7B10，由上述杂交瘤细胞株产生。

本发明所述单克隆抗体的制备方法如下：

(1)重组表达载体的构建：根据p16ORF核苷酸序列(p16ORF核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，468bp；p16氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)

设计引物PCR扩增p16ORF第1bp位到第417bp位序列，基因两侧分别引入限制性内切酶位点SgfI和MluI，插入表达载体pET23a-N-His，构建p16的重组表达质粒pET-His-rP16；上游扩增引物序列，SEQ ID NO.3:CACGCGATCGCCATGGAGCCGGCGGCGGGGAG下游扩增引物序列SEQ ID NO.4:ACCGACGCGTATCGGGGATGTCTGAGGGACCT

(2)p16重组蛋白的表达与纯化：将p16重组表达质粒转化E.coli细胞，裂解离心获得可溶性蛋白，经镍柱亲和层析柱纯化，获得纯化的p16重组蛋白；

(3)单克隆抗体的筛选与制备：采用上述纯化的p16重组蛋白免疫Balb/c小鼠，取小鼠脾脏细胞与SP2/0细胞进行融合，有限稀释法获得单克隆，ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞，获得能分泌抗p16特异性抗体的杂交瘤细胞株，命名为OTI7B10，亚型鉴定为IgG1；通过无血清培养基制备抗体，通过亲和层析柱纯化获得p16单克隆抗体OTI7B10。分别通过Western Blot、免疫组化实验验证该单克隆抗体的灵敏度和特异性。

本发明还提供了单克隆抗体OTI7B10在制备用于检测p16蛋白的免疫检测工具中的应用。

具体地，所述免疫检测工具为试剂盒、芯片或试纸。

在具体的实施例中，本发明提供了一种免疫组化检测试剂盒，包括上述单克隆抗体OTI7B10，可检测组织细胞中p16的表达状况。

本发明还提供了上述单克隆抗体在制备用于标记肿瘤的试剂盒中的应用。其中所述肿瘤具体是指肿瘤细胞的增殖与p16的表达密切相关的肿瘤，包括但不限于肺癌、肝癌、恶性胶质瘤、黑素瘤、卵巢癌、膀胱癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌、宫颈癌等相关肿瘤。

与现有技术相比，本发明提供了一种杂交瘤细胞株(保藏编号为CGMCCNo.11088)，以及由此杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体OTI7B10。本发明还提供了单克隆抗体OTI7B10在制备用于检测p16蛋白的免疫检测工具中的应用，含单克隆抗体OTI7B10的免疫组化试剂盒，以及单克隆抗体OTI7B10在制备用于标记肿瘤的试剂盒中的应用。本发明所述单克隆抗体可与p16蛋白特异性结合，而与细胞内其他蛋白无交叉反应，显著提高了p16蛋白免疫检测的特异性、准确性和可靠性，真实反映肿瘤细胞内p16蛋白表达水平，可应用于肺癌、肝癌、恶性胶质瘤、黑素瘤、卵巢癌、膀胱癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌、宫颈癌等相关肿瘤组织中p16的表达水平。

本发明提供的一种单克隆抗体及其用途、产生所述单克隆抗体的杂交瘤细胞株、含有该单克隆抗体的诊断工具中所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1、p16重组表达质粒的构建

以从美国傲锐东源生物科技有限公司获得的质粒RC220937(含p16ORF 468bp)为模板，设计两条引物并分别引入酶切位点SgfI和MluI，克隆ORF第1bp至468bp到表达载体pET23a-N-His，建立p16重组表达质粒。克隆位点设计如图1所示。

实施例2、p16重组蛋白的表达与纯化

1、转化E.coli细胞：将100ul感受态细胞置于冰上融化后加入质粒DNA轻混匀，冰浴30min后42℃热激90s，然后将其继续冰浴1-2min。在超净台内加入500ul新鲜无抗LB培养基，于37℃摇床孵育45min后取适量菌液均匀涂布于含抗生素的平板上，将培养皿倒置于37℃恒温培养箱中培养过夜。

2、裂解细胞：挑取单克隆于新鲜培养基中，37℃、200rpm培养至OD值达到0.4～0.6时加入IPTG(终浓度1mM)诱导培养7h。离心收集菌体，然后用裂解缓冲液重悬菌体，超声破碎20min后于4℃下12000rpm离心20min，收集上清。取少量上清蛋白用anti-His抗体用WB验证p16蛋白的表达，见图2。

3、镍柱亲和层析柱纯化：用缓冲液平衡镍柱，将上清用0.45μm滤膜过滤后上样并收集流出，用缓冲液淋洗去除未结合的蛋白，最后用含不同浓度咪唑的洗脱液洗脱，分别收集后进行SDS-PAGE鉴定，将符合要求的洗脱蛋白合并并加入10％甘油，纯化后的重组p16蛋白用SDS-PAGE鉴定，见图3。

由图2结果可见，转染pET-N-His-rp16质粒的E.coli细胞裂解液中WB检测后在16kD处有明显的特异条带，分子量与预期分子量，16.4kD大小一致。表明细胞中重组p16蛋白特异表达。

由图3结果可见，纯化的蛋白在PAGE胶16kD处有明显的特异条带，分子量与预期分子量，16.4kD大小一致。表明已获得了纯度较好的p16重组蛋白。

实施例3、p16单克隆抗体的制备与筛选

根据标准方法用重组产生的纯化的p16蛋白片段用于对Balb/c小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)进行免疫。具体方法如下：

1、动物免疫：经过纯化的p16抗原以完全弗氏佐剂乳化，采用皮下或腹腔注射方法免疫6-8周龄Balb/c小鼠，免疫剂量为50μg/只，间隔两周后进行第二次免疫，以不完全弗氏佐剂乳化，免疫剂量为50μg/只。免疫两次后取尾血以ELISA法梯度稀释测定血清效价；根据结果确定是否加强免疫，选取抗体效价最高的小鼠进行细胞融合。

2、细胞融合：骨髓瘤细胞采用Balb/c来源的sp2/0，融合时处于对数生长期；取已免疫小鼠脾脏，制成淋巴细胞单细胞悬液；小鼠脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞以1:5-1:10混合，滴加37℃的50％PEG(PH 8.0)1mL，加入不完全培养基及其余终止液，离心弃上清后加入HAT培养基悬浮混匀，MC定容到50mL，分装到3.5cm培养皿中，放于湿盒中，置于37℃、5％CO₂恒温培养箱中进行培养。

3、筛选和克隆：融合7-10天内挑选细胞克隆，使用p16纯化重组蛋白进行ELISA测试。标记细胞株号。对阳性孔细胞进行有限稀释，每次有限稀释后5-6天测定ELISA值，挑取OD280阳性值较高的单克隆孔进行有限稀释，直至ELISA测定96孔板全板结果为阳性。挑取阳性值高的单克隆定株。其对应融合板细胞株为OTI7B10。

4、腹水单抗的制备与纯化：10-12周龄的雄性Balb/c小鼠腹腔注射0.5ml降植烷，一周后每只小鼠用1mL注射器腹腔注射经PBS洗涤重悬的单克隆细胞悬液，细胞用量为5×10⁶/只，每株抗体打2只小鼠。待小鼠腹水积聚后收集腹水，离心取上清，亲和层析法进行腹水纯化，根据抗体亚型选择相应柱料，细胞株OTI7B10产生的单抗为IgG1，采用protein G进行纯化。纯化后的单抗浓度测定、WB检测、分装、冻存在-20℃。其中WB检测结果见图4。

由图4结果可见，OTI7B10可特异地识别293T细胞过表达的全长p16以及MCF7细胞中内源的p16蛋白，表明单克隆抗体OTI7B10能特异地Western blot检测完整的p16蛋白。

实施例4、单克隆抗体OTI7B10为一抗的免疫组化检测

(1)、实验方法：

1、取福尔马林固定的成人结肠癌、宫颈癌、肝癌等组织块进行石蜡包埋，使用Finesse组织切片机进行切片，组织厚度为6μm。

2、脱蜡与水化：分析纯二甲苯3×10min，无水乙醇3×10min，95％乙醇5min，85％乙醇5min，75％乙醇5min，去离子水浸泡3min×3次

3、加入抗原修复液(1mM EDTA,10mM Tris buffer(pH8.5))高压锅高压热修复3min，待高压锅温度降至约90℃时，打开高压锅，取出标本，然后自然冷却至室温。去离子水浸泡3min×3次。

4、使用3％过氧化氢灭活组织内源性过氧化物酶，室温静置10min。去离子水浸泡5min×3次。

5、加上封闭液(PBS+5％脱脂奶粉+5％正常山羊血清)，37℃孵育60min。

6、去除封闭液，勿冲洗，加入p16单抗(OTI7B10)，稀释比：1:150，使用封闭液进行稀释。置于湿盒中，37℃孵育60min。PBST(0.1％Tween-20)洗涤2次，每次洗涤5min。PBST(0.02％Tween-20)洗涤1次，每次洗涤5min。

7、滴加Polink-试剂盒2(Catlog No.D37-15)试剂1，37℃孵育10-20分钟。使用PBS洗涤3次，每次5min。滴加Polink-2试剂盒(Catlog No.D37-15)试剂2，37℃孵育10-20分钟，使用PBS洗涤3次，每次5min。

8、应用DAB溶液(中杉金桥ZLI-9019)显色，显色3～10min。蒸馏水洗涤。

9、苏木精复染细胞核2min，蒸馏水漂洗，1％盐酸分化。蒸馏水漂洗3次，室温静置1min。

10、脱水和透明：75％乙醇5min，100％乙醇5min x 3次，85％乙醇5min，95％乙醇5min，100％乙醇3×5min；二甲苯3×5min，中性树胶封片。

11、镜检，见图5-7。

(2)、实验结果：

由图5-7结果可见，在成人结肠癌、宫颈癌组织中可见到特异性细胞质与核染色。结果与p16在细胞内的定位及组织表达特异性一致，表明单克隆抗体OTI7B10可用于免疫组织化学检测p16蛋白的水平。

实施例5、单克隆抗体OTI7B10的特异性检测

OriGene高密度蛋白芯片上包含10,000个HEK293T细胞蛋白过表达裂解物，每种蛋白裂解液在芯片上具有两个拷贝的重复。蛋白裂解液被印迹在硝酸纤维素膜上。每一钟蛋白裂解液的定位可以通过Excel文件进行准确定位。蛋白芯片上蛋白分为40个亚矩阵，每个亚矩阵上有一些参照，通过参照，可以定量每个芯片点上蛋白的含量，监控每次免疫反应数据的重复性，以及定位阳性信号的方向。以下为使用OriGene蛋白(OriGene Cat PA100001)芯片进行OTI7B10抗体鉴定实验的实验方法：

1、将一张蛋白芯片放在50mL离心管中，使用40mL去离子水浸润芯片，置于摇床上，室温混合30分钟。弃掉去离子水，使用10mLPBST平衡芯片。室温处理10分钟。

2、向50mL离心管中加入40mL5％脱脂牛奶(用PBST进行稀释)置于摇床上，室温封闭30分钟。

3、使用封闭液(5％脱脂牛奶)稀释一抗OTI7B10，稀释比列为1:100。

4、将洁净的封口膜粘贴到实验台上，滴加250-300μL一抗在封口膜上。

5、将蛋白芯片从封闭液中抽出，将蛋白芯片NC膜的一面朝下，从芯片的一边接触抗体，慢慢滑下，依靠液体表面张力，抗体将慢慢浸润芯片NC膜，直至整张NC膜浸润在一抗溶液中。整个操作过程避免产生气泡。将芯片移到4℃环境下，静置，一抗孵育过夜。在芯片上加盖培养皿盖，其上黏附一张湿纸巾，以防止长时间孵育导致抗体蒸发。

6、第二天将芯片移至50mL离心管中，使用PBST漂洗芯片两次，去除多余的抗体。使用40mL PBST(0.1％Tween-20)洗涤芯片，置于摇床上混合均匀，洗涤三次，每次洗涤5min。

7、使用封闭液(5％脱脂牛奶)稀释二抗Dy Light 649-conjugated AffiniPureFragment Goat-anti-Mouse IgG，稀释比例为1:400。

8、按照上述步骤4，步骤5进行二抗孵育操作。室温孵育1小时。在芯片上方用铝箔纸遮盖，以防止发生信号漂白。

9、按照上述步骤6，使用PBST洗涤芯片。

10、使用去离子水冲洗芯片，以去除残余的盐分和变性剂。

11、室温干燥芯片，确保芯片完全干燥。

12、使用芯片扫描仪读取荧光信号。

13、根据BSA-Cy3以及BSA-Cy5确定芯片方向以及阳性信号的位点。

14、根据阳性信号位点找出对应蛋白裂解液ID，根据裂解液数据库信息，查找到对应蛋白名称，NCBI录入号(accession number)，蛋白ID，蛋白大小等信息。

结果如图8所示，单抗OTI7B10在OriGene蛋白芯片上能特异地识别CDKN2A蛋白，表明单抗OTI7B10的特异性较好。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种单克隆抗体，其特征在于，其与p16蛋白特异性结合，

由保藏编号为CGMCC No.11088的杂交瘤细胞株产生。

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体在制备用于检测p16蛋白的免疫检测工具中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述免疫检测工具为试剂、试剂盒、芯片或试纸。

4.一种免疫组化检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的单克隆抗体。

5.如权利要求1所述的单克隆抗体在制备用于标记组织细胞的试剂或试剂盒中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述组织细胞来源于肺癌、肝癌、恶性胶质瘤、黑素瘤、卵巢癌、膀胱癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌、宫颈癌或相关肿瘤。

7.一种标记组织细胞的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的单克隆抗体。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述组织细胞来源于肺癌、肝癌、恶性胶质瘤、黑素瘤、卵巢癌、膀胱癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌、宫颈癌或相关肿瘤。

9.一种杂交瘤细胞株，其特征在于，其保藏编号为CGMCC No. 11088。