CN105274060B - 抗gata3蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗gata3单克隆抗体和应用 - Google Patents

抗gata3蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗gata3单克隆抗体和应用 Download PDF

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本发明涉及生物技术领域,公开了抗GATA3蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗GATA3单克隆抗体和应用。本发明所述抗GATA3蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞保藏编号为CGMCC No.11087。本发明提供的杂交瘤细胞可稳定分泌产生抗GATA3蛋白单克隆抗体,且与GATA3蛋白特异性结合,而与细胞内其他蛋白无交叉反应,显著提高了GATA3蛋白免疫检测的特异性、准确性和可靠性,真实反映肿瘤细胞内GATA3蛋白表达水平,可应用于检测前列腺、膀胱、乳腺、皮肤、肾脏、大血管上皮以及淋巴细胞等相关肿瘤组织中GATA3的表达水平。

Description

抗GATA3蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗GATA3单克 隆抗体和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体涉及抗GATA3蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗GATA3单克隆抗体和应用。
背景技术
GATA3结合蛋白通常简称GATA3,是GATA家族中的多功能转录因子,与乳腺上皮、尿道上皮、表皮、皮肤附属器以及T细胞亚群的发育和功能密切相关,是乳腺和尿道移行细胞肿瘤敏感但不特异的标记物。GATA3阳性的上皮性肿瘤还包括基底细胞癌、皮肤鳞癌、皮肤附属器肿瘤、绒癌、内胚窦瘤、肾嫌色细胞癌、恶性间皮瘤、涎腺和胰腺导管腺癌,除此以外的大多数癌阳性表达<10%。由于GATA3很少表达于神经外胚层和间叶性肿瘤,除外嗜铬细胞瘤/副神经节瘤,因此有助于与神经内分泌肿瘤的鉴别诊断。
目前临床上主要通过免疫组织化学(IHC)病理实验检测肿瘤组织中GATA3蛋白的表达状况。IHC实验的核心为特异性结合GATA3蛋白的单克隆抗体,其性能的优劣直接决定着整个检测的灵敏度和特异性。因此,研制出一种结合特异性较高的针对GATA3蛋白的单克隆抗体具有重要的意义。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于提供抗GATA3蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗GATA3单克隆抗体和应用,提高所述杂交瘤细胞产生的单抗与GATA3蛋白的结合特异性并应用到相关产品的制备中。
为实现上述目的,本发明提供如下技术方案:
抗GATA3蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞,保藏编号为CGMCC No.11087。
本发明所述抗GATA3蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞由以下方法制备 获得:
(1)重组表达载体的构建:根据GATA3ORF核苷酸序列(GATA3 ORF核苷酸序列如SEQID NO.1所示,1332bp;GATA3氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示);
设计引物PCR扩增GATA3ORF第465bp位到第1329bp位序列,基因两侧分别引入限制性内切酶位点SgfI和MluI,插入表达载体pET23a-N-His(购于Origene公司),构建GATA3的重组表达质粒pET-His-rGATA3;
(2)GATA3重组蛋白的表达与纯化:将GATA3重组表达质粒转化E.coli细胞,裂解离心获得可溶性蛋白,经镍柱亲和层析柱纯化,获得纯化的GATA3重组蛋白;
(3)单克隆抗体的筛选与制备:采用上述纯化的GATA3重组蛋白免疫BALB/c小鼠,取小鼠脾脏细胞与SP2/0细胞进行融合,有限稀释法获得单克隆,ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞,获得能分泌抗GATA3特异性抗体的杂交瘤细胞株;通过无血清培养基制备抗体,通过亲和层析柱纯化获得抗GATA3单克隆抗体。分别通过Western Blot、免疫组化实验验证该单克隆抗体的灵敏度和特异性。
同时,采用OriGene高密度蛋白芯片检测所述单抗的特异性试验表明,本发明所述单克隆抗体仅和GATA3蛋白特异性结合,而与近10000种其他蛋白无交叉反应。
经过上述方法制备后,筛选出能够稳定分泌抗GATA3单克隆抗体的杂交瘤细胞,命名为OTI5C11,亚型鉴定为IgG2b,并于2015年7月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所,保藏编号为CGMCC No.11087。
同时,本发明还提供一种抗GATA3蛋白单克隆抗体,由保藏编号为CGMCC No.11087的杂交瘤细胞分泌产生。制备抗GATA3蛋白单克隆抗体可采用本技术领域常规方法,如用杂交瘤细胞株诱导小鼠腹水。
本发明所述保藏编号为CGMCC No.11087的杂交瘤细胞染色体稳定,其分泌产生的抗GATA3蛋白单克隆抗体为IgG2b型,效价较高。将所述单克隆抗体于成人肾癌、膀胱癌组织中可见到特异性细胞核染色。结果与GATA3在细胞内的定位及组织表达特异性一致,表明单克隆抗体可用于免疫组织化学检测GATA3蛋白的水平。
因此,本发明还提供了保藏编号为CGMCC No.11087的杂交瘤细胞在制备抗GATA3蛋白单克隆抗体中的应用以及所分泌的抗GATA3蛋白单克隆抗体在制备检测GATA3蛋白的免疫检测产品中的应用。
作为优选,所述免疫检测产品为试剂盒、试纸或芯片。
本发明还提供一种检测GATA3蛋白的免疫组化检测试剂盒,包括保藏编号为CGMCCNo.11087的杂交瘤细胞分泌产生的抗GATA3蛋白单克隆抗体。所述免疫检测试剂盒可检测组织细胞中GATA3蛋白的表达状况。
此外,本发明还提供保藏编号为CGMCC No.11087的杂交瘤细胞分泌产生的抗GATA3蛋白单克隆抗体在制备标记肿瘤细胞试剂盒中的应用。
本发明所述肿瘤细胞具体是指肿瘤细胞的增殖与GATA3的表达密切相关的所有肿瘤。作为优选,所述肿瘤细胞包括以下组织细胞的肿瘤:
乳腺、前列腺、膀胱、皮肤、肾脏、大血管上皮、淋巴细胞。
本发明提供的杂交瘤细胞可稳定分泌产生抗GATA3蛋白单克隆抗体,且与GATA3蛋白特异性结合,而与细胞内其他蛋白无交叉反应,显著提高了GATA3蛋白免疫检测的特异性、准确性和可靠性,真实反映肿瘤细胞内GATA3蛋白表达水平,可应用于检测前列腺、膀胱、肾脏、乳腺、皮肤、大血管上皮以及淋巴细胞等相关肿瘤组织中GATA3的表达水平。
生物保藏信息说明
OTI5C11,分类命名为GATA3蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株,于2015年7月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所,保藏编号为CGMCC No.11087。
附图说明
图1所示为实施例1中克隆位点图;
图2所示为实施例2重组GATA3蛋白Western blot检测结果图,以anti-His检测重组GATA3蛋白在E.Coli细胞中的表达,其中泳道1为转染空载体的E.Coli细胞裂解液为抗原的检测结果、泳道2为转染pET-His-rGATA3质粒的E.Coli细胞裂解液抗原的检测结果;
图3所示为实施例2重组GATA3蛋白SDS-PAGE结果图,用镍亲和层析柱纯化重组GATA3蛋白,纯化后的蛋白通过SDS-PAGE胶电脉、考马斯亮蓝染色;
图4所示为实施例3以杂交瘤细胞OTI5C11分泌产生的单克隆抗体识别293T细胞过表达的GATA3全长蛋白以及肿瘤细胞系MCF7内源GATA3蛋白的Western blot检测结果图;
图5所示为实施例4福尔马林固定、石蜡包埋的人前列腺组织免疫组化结果图(一抗为杂交瘤细胞OTI5C11分泌产生的抗GATA3单克隆抗体),图中箭头所指为特异性细胞核染色;
图6所示为实施例4福尔马林固定、石蜡包埋的人肾癌组织免疫组化结果图(一抗为杂交瘤细胞OTI5C11分泌产生的抗GATA3单克隆抗体),图中箭头所指为特异性细胞核染色;
图7所示为实施例4福尔马林固定、石蜡包埋的人膀胱癌组织免疫组化结果图(一抗为杂交瘤细胞OTI5C11分泌产生的抗GATA3单克隆抗体),图中箭头所指为特异性细胞核染色;
图8所示实施例5origene蛋白芯片鉴定结果图(一抗为杂交瘤细胞OTI5C11分泌产生的抗GATA3单克隆抗体,1:100;二抗为Dy Light 649-conjugated Affini PureFragment Goat-anti-Mouse IgG,1:400)。
具体实施方式:
本发明公开了抗GATA3蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗GATA3单克隆抗体和应用,本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及应用已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
下面就本发明提供的抗GATA3蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗GATA3单克隆抗体和应用做进一步说明。
实施例1:GATA3重组表达质粒的构建
以从美国傲锐东源生物科技有限公司购得的质粒RC 201618(含GATA3ORF1332bp)为模板,设计两条引物并分别引入酶切位点SgfI和MluI,克隆ORF第465bp至1329bp到表达载体pET23a-N-His,建立GATA3重组表达质粒。克隆位点设计如图1所示。
实施例2:GATA3重组蛋白的表达与纯化
1、转化E.coli细胞:将100ul感受态细胞置于冰上融化后加入质粒DNA轻混匀,冰浴30min后42℃热激90s,然后将其继续冰浴1-2min。在超净台内加入500ul新鲜无抗LB培养基,于37℃摇床孵育45min后取适量菌液均匀涂布于含抗生素的平板上,将培养皿倒置于37℃恒温培养箱中培养过夜。
2、裂解细胞:挑取单克隆于新鲜培养基中,37℃、200rpm培养至OD值达到0.4~0.6时加入IPTG(终浓度1mM)诱导培养7h。离心收集菌体,然后用裂解缓冲液重悬菌体,超声破碎20min后于4℃下12000rpm离心20min,收集上清。取少量上清蛋白用anti-His抗体做WB鉴定,见图2。
3、镍柱亲和层析柱纯化:用缓冲液平衡镍柱,将上清用0.45μm滤膜过滤后上样并收集流出,用缓冲液淋洗去除未结合的蛋白,最后用含不同浓度咪唑的洗脱液洗脱,分别收集后进行SDS-PAGE鉴定,将符合要求的洗脱蛋白合并并加入10%甘油,纯化后的重组GATA3蛋白用SDS-PAGE鉴定,见图3。
由图2结果可见,转染pET-N-His-rGATA3质粒的E.coli细胞裂解液中WB检测后在26kD处有明显的特异条带,分子量与预期分子量大小一致。表明细胞中重组GATA3蛋白特异表达。
由图3结果可见,纯化的蛋白在PAGE胶26kD处有明显的特异条带,分子量与预期分子量大小一致。表明已获得了纯度较好的GATA3重组蛋白。
实施例3:抗GATA3单克隆抗体杂交瘤细胞及其单克隆抗体的制备筛选
根据标准方法用重组产生的纯化的GATA3蛋白片段用于对B6/C57小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)进行免疫。具体方法如下:
1、动物免疫:经过纯化的GATA3抗原以完全弗氏佐剂乳化,采用皮下或腹腔注射方法免疫6-8周龄BALB/c小鼠,免疫剂量为50μg/只,间隔两周后进行第二次免疫,以不完全弗氏佐剂乳化,免疫剂量为50μg/只。免疫两次后取尾血以ELISA法梯度稀释测定血清效价;根据结果确定是否加强免疫,选取抗体效价最高的小鼠进行细胞融合。
2、细胞融合:骨髓瘤细胞采用BALB/c来源的sp2/0,融合时处于对数生长期;取已免疫小鼠脾脏,制成淋巴细胞单细胞悬液;小鼠脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞以1:5-1:10混合,滴加37℃的50%PEG(PH 8.0)1mL,加入不完全培养基及其余终止液,离心弃上清后加入HAT培养基悬浮混匀,MC定容到50mL,分装到3.5cm培养皿中,放于湿盒中,置于37℃、5%CO2恒温培养箱中进行培养。
3、筛选和克隆:融合7-10天内挑选细胞克隆,使用GATA3纯化 重组蛋白进行ELISA测试。标记细胞株号。对阳性孔细胞进行有限稀释,每次有限稀释后5-6天测定ELISA值,挑取OD280阳性值较高的单克隆孔进行有限稀释,直至ELISA测定96孔板全板结果为阳性。挑取阳性值高的单克隆定株。其对应融合板细胞株为OTI5C11。
4、腹水单抗的制备与纯化:10-12周龄的雄性BALB/c小鼠腹腔注射0.5ml降植烷,一周后每只小鼠用1mL注射器腹腔注射经PBS洗涤重悬的单克隆细胞悬液,细胞用量为5×106/只,每株抗体打2只小鼠。待小鼠腹水积聚后收集腹水,离心取上清,亲和层析法进行腹水纯化,根据抗体亚型选择相应柱料,细胞株OTI5C11产生的单抗亚型为IgG2b,采用protein G进行纯化。纯化后的单抗浓度测定、WB检测特异性、分装、冻存在-20℃。其中WB检测特异性结果见图4。
由图4结果可见,OTI5C11分泌产生的单抗可特异地识别293T细胞过表达的全长GATA3以及MCF7细胞中内源的GATA3蛋白,表明所述单克隆抗体能特异地Western blot检测完整的GATA3蛋白。
实施例4:OTI5C11分泌的单克隆抗体为一抗的免疫组化检测
(1)、实验方法:
1、取福尔马林固定的成人前列腺、肾癌、膀胱癌等组织块进行石蜡包埋,使用Finesse组织切片机进行切片,组织厚度为6μm。
2、脱蜡与水化:分析纯二甲苯3×10min,无水乙醇3×10min,95%乙醇5min,85%乙醇5min,75%乙醇5min,去离子水浸泡3min×3次
3、加入抗原修复液(1mM EDTA,10mM Tris buffer(pH8.5))高压锅高压热修复3min,待高压锅温度降至约90℃时,打开高压锅,取出标本,然后自然冷却至室温。去离子水浸泡3min×3次。
4、使用3%过氧化氢灭活组织内源性过氧化物酶,室温静置10min。去离子水浸泡5min×3次。
5、加上封闭液(PBS+5%脱脂奶粉+5%正常山羊血清),37℃孵育60min。
6、去除封闭液,勿冲洗,加入抗GATA3单抗(OTI5C11分泌产生),稀释比:1:200,使用封闭液进行稀释。置于湿盒中,37℃孵育60min。PBST(0.1%Tween-20)洗涤2次,每次洗涤5min。PBST(0.02%Tween-20)洗涤1次,每次洗涤5min。
7、滴加Polink-试剂盒2(Catlog No.D37-15)试剂1,37℃孵育10-20分钟。使用PBS洗涤3次,每次5min。滴加Polink-2试剂盒(Catlog No.D37-15)试剂2,37℃孵育10-20分钟,使用PBS洗涤3次,每次5min。
8、应用DAB溶液(中杉金桥ZLI-9019)显色,显色3~10min。蒸馏水洗涤。
9、苏木精复染细胞核2min,蒸馏水漂洗,1%盐酸分化。蒸馏水漂洗3次,室温静置1min。
10、脱水和透明:75%乙醇5min,100%乙醇5min x 3次,85%乙醇5min,95%乙醇5min,100%乙醇3×5min;二甲苯3×5min,中性树胶封片。
11、镜检,见图5-7。
(2)、实验结果:
由图5-7结果可见,在成人前列腺、肾癌、膀胱癌组织中可见到特异性细胞核染色,图中箭头所指。结果与GATA3在细胞内的定位及组织表达特异性一致,表明本发明所述杂交瘤细胞OTI5C11分泌产生的单克隆抗体可用于免疫组织化学检测GATA3蛋白的水平。
实施例5:OTI5C11分泌产生的单克隆抗体的特异性蛋白芯片检测
OriGene高密度蛋白芯片上包含10,000个HEK293T细胞蛋白过表达裂解物,每种蛋白裂解液在芯片上具有两个拷贝的重复。蛋白裂解液被印迹在硝酸纤维素膜上。每一钟蛋白裂解液的定位可以通过Excel文件进行准确定位。蛋白芯片上蛋白分为40个亚矩阵,每个亚矩阵上有一些参照,通过参照,可以定量每个芯片点上蛋白的含量,监控每次免疫反应数据的重复性,以及定位阳性信号的方向。以下为使用 OriGene蛋白(OriGene CatPA100001)芯片进行OTI5C11抗体鉴定实验的实验方法:
1、将一张蛋白芯片放在50mL离心管中,使用40mL去离子水浸润芯片,置于摇床上,室温混合30分钟。弃掉去离子水,使用10mLPBST平衡芯片。室温处理10分钟。
2、向50mL离心管中加入40mL5%脱脂牛奶(用PBST进行稀释)置于摇床上,室温封闭30分钟。
3、使用封闭液(5%脱脂牛奶)稀释一抗OTI5C11,稀释比列为1:100。
4、将洁净的封口膜粘贴到实验台上,滴加250-300μL一抗在封口膜上。
5、将蛋白芯片从封闭液中抽出,将蛋白芯片NC膜的一面朝下,从芯片的一边接触抗体,慢慢滑下,依靠液体表面张力,抗体将慢慢浸润芯片NC膜,直至整张NC膜浸润在一抗溶液中。整个操作过程避免产生气泡。将芯片移到4℃环境下,静置,一抗孵育过夜。在芯片上加盖培养皿盖,其上黏附一张湿纸巾,以防止长时间孵育导致抗体蒸发。
6、第二天将芯片移至50mL离心管中,使用PBST漂洗芯片两次,去除多余的抗体。使用40mL PBST(0.1%Tween-20)洗涤芯片,置于摇床上混合均匀,洗涤三次,每次洗涤5min。
7、使用封闭液(5%脱脂牛奶)稀释二抗Dy Light 649-conjugated AffiniPureFragment Goat-anti-Mouse IgG,稀释比例为1:400。
8、按照上述步骤4,步骤5进行二抗孵育操作。室温孵育1小时。在芯片上方用铝箔纸遮盖,以防止发生信号漂白。
9、按照上述步骤6,使用PBST洗涤芯片。
10、使用去离子水冲洗芯片,以去除残余的盐分和变性剂。
11、室温干燥芯片,确保芯片完全干燥。
12、使用芯片扫描仪读取荧光信号。
13、根据BSA-Cy3以及BSA-Cy5确定芯片方向以及阳性信号的 位点。
14、根据阳性信号位点找出对应蛋白裂解液ID,根据裂解液数据库信息,查找到对应蛋白名称,NCBI录入号(accession number),蛋白ID,蛋白大小等信息。
结果如图8所示,单抗OTI5C11在OriGene蛋白芯片上能特异地识别GATA3蛋白,而与其他近10000种蛋白无交叉反应,表明单抗OTI5C11的特异性较好。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.抗GATA3蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞,其特征在于,保藏编号为CGMCC NO:11087。
2.保藏编号为CGMCC NO:11087的杂交瘤细胞在制备抗GATA3蛋白单克隆抗体中的应用。
3.抗GATA3蛋白单克隆抗体,其特征在于,由保藏编号为CGMCC NO:11087的杂交瘤细胞分泌产生。
4.保藏编号为CGMCC NO:11087的杂交瘤细胞分泌产生的抗GATA3蛋白单克隆抗体在制备检测GATA3蛋白的免疫检测产品中的应用。
5.根据权利要求4所述应用,其特征在于,所述免疫检测产品为试剂盒、试纸或芯片。
6.一种检测GATA3蛋白的免疫组化检测试剂盒,其特征在于,包括保藏编号为CGMCCNO:11087的杂交瘤细胞分泌产生的抗GATA3蛋白单克隆抗体。
7.保藏编号为CGMCC NO:11087的杂交瘤细胞分泌产生的抗GATA3蛋白单克隆抗体在制备标记肿瘤细胞试剂盒中的应用。
8.根据权利要求7所述应用,其特征在于,所述肿瘤细胞包括以下组织细胞的肿瘤:
乳腺、前列腺、膀胱、皮肤、肾脏、大血管上皮、淋巴细胞。
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