CN108623683A

CN108623683A - 抗Pax-5蛋白的单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用

Info

Publication number: CN108623683A
Application number: CN201810541409.2A
Authority: CN
Inventors: 史永勤; 杨清海; 陈惠玲; 陈昌星; 王小亚
Original assignee: Fuzhou Maixin Biotechnology Development Co ltd
Current assignee: Fuzhou Maixin Biotechnology Development Co ltd
Priority date: 2018-05-30
Filing date: 2018-05-30
Publication date: 2018-10-09
Anticipated expiration: 2038-05-30
Also published as: CN108623683B

Abstract

本发明涉及一种可以识别人B细胞特异活化蛋白Pax‑5的单克隆抗体20G4，其分泌细胞株、免疫原的制备方法以及在免疫检测中的用途。Pax‑5又称为B细胞特异活化蛋白，表达于B细胞分化的早期，在97％的Hodgkin's淋巴瘤的里德‑斯泰伯格氏(Reed‑Sternberg)细胞中表达Pax‑5，它一直以来都作为B细胞起源的造血系统肿瘤细胞的标志物使用。本发明提供了一种用于免疫动物的Pax‑5蛋白的免疫原，由此免疫原免疫小鼠后筛选获得的单克隆抗体细胞株20G4，并公开了重链和轻链可变区的DNA和氨基酸序列。

Description

抗Pax-5蛋白的单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医学工程领域，特别涉及一种抗Pax-5蛋白单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用。

背景技术

Pax蛋白是在发育的不同通路中起转录调节作用的转录因子蛋白，该家族蛋白通过一段长约128个氨基酸的，可与简并的保守DNA序列结合的结构域发挥作用，该结构域被称为配对域(paired domain)或配对盒(paired box)， N-端域和C-端域两个球状亚结构域通过一段连接肽连接。该蛋白与TLE4及死亡相关蛋白6(Death associated protein 6)存在互作关系。

Pax-5又称为B细胞特异活化蛋白(B cell-Specific Activator Protein，BSAP)，表达于B细胞分化的早期，在CNS和睾丸中也有表达，因此，它可能不仅与B细胞的分化有关，还与神经发育和精子形成有关。在97％的Hodgkin's 淋巴瘤的里德-斯泰伯格氏(Reed-Sternberg)细胞中表达Pax-5，在多发性骨髓瘤和T细胞淋巴瘤中均不表达。pax5基因相关的染色体区域发生异常会引起急性淋巴细胞性白血病。因此，Pax-5一直以来都作为B细胞起源的造血系统肿瘤细胞的标志物使用，在Hodgkin's淋巴瘤的诊断和鉴别诊断中具有重要的意义，对于小细胞肺癌(宋欣，袁静，陈薇，彭瑞云，李向红.PAX-5 在病理诊断中的应用，2007亚太国际肿瘤生物学和医学学术会议暨首届解放军总医院肿瘤综合防治高峰论坛及第二届中国中青年肿瘤专家论坛)也具有参考价值。

发明专利“胃癌标志物与胃癌检测方法”(201180003932.6)公开了一种利用检测核酸水平上pax5基因的表达于甲基化修饰进行胃癌诊断的方法，发明专利“骨髓涂片异常淋巴细胞染色试剂盒及其使用方法(申请号：201510289585.8)”公开了一个利用商品化Pax-5抗体、CD3抗体及两种组合的通用型抗体对淋巴瘤进行骨髓涂片检测的方法，用于淋巴瘤诊断和疗效评价。

王旭利用从人B淋巴细胞性白血病细胞(Raji细胞)中扩增的pax5基因片段转化大肠杆菌，纯化重组蛋白免疫兔子获得了多克隆抗体，该抗体可以在免疫印迹中检测Raji细胞的内源性Pax-5蛋白，对于免疫组化的用途，未做描述(王旭，Pax5基因生物学功能的基础研究，大连大学，2012年硕士学位论文)。因为兔子免疫系统和抗体结构的特殊性，理论上，制备的抗体在亲和力上具有优势，潘红阳等合成了Pax-5蛋白的特异性肽段，免疫兔子并与兔骨髓瘤细胞240E-W3融合获得了Pax-5的兔单抗EPR3730(2)，该抗体在免疫印迹检测Burkitt's淋巴瘤细胞株Ramos和扁桃体组织裂解液的结果表明，阳性条带位于45kDa附近，在正常和肿瘤组织中的B细胞显示IHC阳性(潘红阳，王迪，皇甫虹姣，胡军海，江鑫，王金洁，张昕霞，周韧.XBP1与pax-5 兔单克隆抗体的制备、鉴定及其在免疫组化上的应用.《2013年浙江省病理学术年会论文汇编》)。目前该抗体已经进入商业销售，在制备中选定的抗原肽序列并未确切公开，由其商品信息可知其抗原肽位于第250-350位氨基酸范围之内(商品信息：http://www.abcam.cn/pax5-antibody-ab183575.html)，不同蛋白位置免疫获得的抗体，因蛋白结构和在细胞上定位情况不同，与其他分子互作的不同，甚至免疫组化检测中抗原修复的方式不同都会带来明显的差异，直接影响判读和对疾病诊断和预后评估的判断。

发明内容

为了克服以上技术问题，提供一种适用于免疫学检测，特别是免疫组化检测的，具有特异性和敏感性的Pax-5单克隆抗体。

发明人提供了一种抗Pax-5单克隆抗体，由保藏号为CGMCC NO 15486的杂交瘤细胞株产生。所述细胞株已于2018年3月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为：小鼠杂交瘤细胞系，保藏号为：CGMCC NO 15486，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

进一步地，所述单克隆抗体特异性识别Pax-5蛋白。

进一步地，所述单克隆抗体特异性识别Pax-5蛋白中的SEQID1所示的氨基酸序列。

进一步地，所述单克隆抗体的重链可变区的DNA序列为SEQ ID3所示的核苷酸序列，所述单克隆抗体的轻链可变区的DNA序列为SEQ ID4所示的核苷酸序列。

进一步地，所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID5所示的氨基酸序列；所述单克隆抗体轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID6所示的氨基酸序列。

进一步地，所述单克隆抗体为小鼠IgG1κ亚型。

发明人还提供了一种抗Pax-5单克隆抗体的制备方法，所述单克隆抗体免疫原的制备：选取Pax-5蛋白C末端的第378位至391位氨基酸序列为抗原肽，所述抗原肽与KLH载体蛋白偶联后得到免疫原，所述抗原肽的氨基酸序列为SEQID2所示的氨基酸序列。

发明人还提供了一株分泌抗Pax-5蛋白分子的杂交瘤细胞株，所述细胞株为小鼠杂交瘤细胞株20G4，所述细胞株已于2018年3月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为：小鼠杂交瘤细胞系，保藏号为：CGMCC NO 15486，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

发明人还提供了上述单克隆抗体在Pax-5蛋白免疫检测中的用途。

进一步地，所述免疫检测包括免疫组织化学法，免疫印迹法和酶联免疫法。

区别于现有技术，本发明所产生的有益技术效果为：

(1)本发明获得的单克隆抗体由杂交瘤20G4分泌产生，能特异性识别重组表达的人Pax-5蛋白和B细胞中的内源性Pax-5蛋白，可以特异性检测能够检测高表达Pax-5蛋白B细胞、霍奇金淋巴瘤细胞等肿瘤组织和细胞。

(2)本发明获得的杂交瘤20G4为一种IgG1κ亚型抗体，与天然Pax-5 蛋白的结合有极强特异性和敏感性。

(3)因本发明获得的单克隆抗体杂交瘤20G4由特殊选择的多肽作为免疫原，因此具有限定的识别表位，可与Pax-2及Pax-8等功能与序列相似的分子明确区分，更利于免疫组织化学(IHC)、免疫印记(Western blotting) 中的蛋白检测。

附图说明

图1为Pax-5单克隆抗体20G4杂交瘤细胞提取的总RNA电泳结果；

图2为20G4杂交瘤分泌抗体的免疫印迹检测结果，其中Marker为蛋白分子量标记，1为BSA-Pax5-PEP偶联产物，2为未经多肽偶联的BSA载体蛋白；

图3为不同的引物组合扩增的20G4杂交瘤抗体重链和轻链可变区，其中

M：分子量标记DL2000(TaKaRa)，1-3分别为上游引物Bi6、Bi7、Bi8 与下游引物组合扩增轻链可变区的结果，4-7分别为上游引物Bi3、Bi3b、Bi3c、 Bi3d分别于下游引物Bi4组合扩增重链可变区的结果；

图4为B细胞淋巴瘤的染色结果对比图；20G4染色结果为+++，而SP34 染色结果为++；

图5为扁桃体B淋巴细胞样本1的染色结果对比图，20G4染色结果为+++，而SP34染色结果为++。

具体实施方式

为详细说明技术方案的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施例并配合附图详予说明。

实施例1多肽合成及与载体蛋白的化学偶联

从Uniprot数据库(http://www.uniprot.org)中选择编号为P15391的 Pax-5蛋白序列作为标准序列，其序列如序列表SEQID1所示，通过BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)工具比较其与其他同家族蛋白的序列差异，并以DNASTAR8.0软件(www.dnastar.com)的Protean模块进行二级结构、抗原性和表面可及性分析。

选定Pax-5蛋白C末端的第378位到391位氨基酸作为抗原肽，并在该序列的C末端添加一个半胱氨酸用于和载体蛋白的偶联，该抗原肽命名为 Pax5-PEP，其序列如序列表中SEQID2所示。

(1)将20mg SMCC((N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯, 4-(N-Maleimidomethyl)cyclohexanecarboxylicacid N-hydroxysuccinimide ester)溶于2mlDMF(N,N-二甲基甲酰胺,Dimethylformamide)。

(2)将0.8ml KLH(钥孔血蓝蛋白，keyhole limpet hemocyanin)加入到25ml三角瓶中，补加1×PBS(pH 7.2)使载体蛋白终浓度为15mg/ml。

(3)将溶解好的SMCC溶液缓慢滴加到120mg KLH中，室温搅拌反应1h。

(4)用1L 1×PBS(pH 7.4)溶液于4℃下透析6小时，除去游离的SMCC。

(5)将透析后的KLH蛋白倒入50ml离心管中，通过离心管的刻度确定其体积，根据反应前加入的KLH蛋白的量来计算透析后蛋白的浓度，然后根据其浓度将2.5mg KLH-SMCC溶液转移到5ml离心管中。

(6)将3.0mg多肽用0.6ml 1×PBS(pH 7.2)溶液溶解。

(7)用Ellman试剂检测多肽中的巯基：在96孔板中加入100μlEllman 试剂(上海索宝生物科技有限公司)储备液，再加入10μl多肽溶液，用分光光度计在λ＝412nm下测其紫外吸收值，如果OD值>0.15继续实验；0.05<OD 值<0.15，需要补加多肽，直至达到要求；OD值<0.05返回多肽合成步骤重新质控。

(8)将多肽液滴加到KLH-SMCC管中，室温下用垂直混匀器混匀反应4 小时。

(9)用Ellman试剂检测多肽中的巯基：在96孔板中加入100μl Ellman 试剂储备液，再加入10μl交联后的多肽溶液，用分光光度计在λ＝412nm下测定紫外吸收值。OD值<0.03说明多肽和KLH蛋白交联率已达到80％以上，可以进行免疫实验；OD值>0.03则再补加SMCC活化好的KLH蛋白继续交联。

按上述方法制备抗原肽与牛血清白蛋白(BSA)的交联蛋白，所得的交联产物命名为BSA-Pax5-PEP，用于对抗体的筛选，亲和力测定和免疫印迹分析。

实施例2：20G4杂交瘤细胞系的建立

一、免疫

将实施例1中得到的免疫原用弗氏完全佐剂(Sigma公司)乳化，免疫 4-6周龄雌性Balb/c小鼠或者ICR小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，腹部皮下注射每只小鼠6点，剂量为60μg/只。每14天加强免疫一次，抗原使用弗氏非完全佐剂(Sigma公司)乳化，剂量为30μg/只。第3次加强免疫后7天以间接ELISA(波长450nm)检测小鼠血清中抗免疫原的多抗效价，效价最高的小鼠以尾静脉注射冲击免疫，抗原用生理盐水混匀，剂量为50μg/只。

二、细胞融合

无菌制备免疫达标的小鼠脾细胞悬液，与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0(ATCC) 以5:1比例混合，离心1500rpm，5min。弃上清后离心管放入37℃水浴中，在1分钟内缓慢加入1ml的PEG1500(Roche公司)，并搅动细胞。在温水中静置1min后，加入10ml无血清的IMDM(Sigma公司)，混匀，离心1000rpm， 5min。弃上清后，加入10ml血清(PAA公司)小心的将细胞吹打起来，并加入5ml混合10xHAT(Sigma公司)的胸腺细胞，混匀。再加入25ml含有2.1％硝基纤维素(Sigma公司)的半固体培养基充分混匀，然后均匀的倒入20个细胞培养皿中。将细胞培养皿放入到湿盒中，放入37℃5％CO₂培养箱中培养。

三、挑克隆

融合后7天克隆细胞团大小密度适中，在解剖镜下，吸取圆、实、大的克隆团打入事先准备好培养基的96孔培养板中，放入37℃5％CO₂培养箱中培养。

四、ELISA筛选阳性杂交瘤细胞

3天后，细胞量大约占底面积2/3，取100μl上清用免疫原和合成多肽分别进行ELISA筛选。阳性克隆完全换液，加入200μl含饲养细胞和1％HT(Sigma 公司)的完全培养基。两天后进行第二次ELISA筛选，阳性克隆转入事先准备好培养基(含饲养细胞和HT)的24孔板培养。五天后取100μl上清进行第三次ELISA筛选，阳性克隆逐次转入6孔板和细胞培养瓶扩大培养并冻存。

实施例3腹水诱生法制备单克隆抗体

一、腹水制备

对数生长期细胞用无血清培养基洗涤并悬起，计数约5×10⁵，1ml。悬浮的细胞腹腔注射事先用石蜡油致敏的小鼠。7天后开始收集腹水。取出的腹水于4℃离心4000rpm，10min。小心吸出中间的腹水收集于离心管中，4℃或-20℃ 保存。

二、单克隆抗体的纯化

用HiTraprProtein A FF(GE公司)亲和层析法按说明书从腹水中纯化抗体。SDS-PAGE胶鉴定纯度，Bradford法测定浓度。纯化的抗体保存于-20℃。

实施例4单克隆抗体特性鉴定

一、亚类鉴定

用100mM PBS(pH7.4)稀释包被羊抗鼠IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司)至0.5μg/ml,每孔加100μl，4℃，过夜。倾空液体，用含0.05％Tween 的PBS(PBS-T)洗3次，每孔加入200μl封闭液(含2％BSA和3％蔗糖的PBS)，37℃孵育1h。倾空液体，用PBS-T清洗3次。每孔加入0.1ml杂交瘤上清， 37℃孵育1h。倾空液体用PBS-T清洗3次。用封闭液1：1000稀释HRP标记的羊抗鼠(κ,λ)抗体或1：2000稀释HRP标记的羊抗鼠(IgM，IgG1，IgG2a， IgG2b，IgG3，IgA)抗体(Southern Biotech公司)0.1ml每孔分别加入适当的孔中，37℃孵育1h。倾空液体，用PBS-T清洗3次。每孔加50μl含0.15％ ABTS(Southern Biotech公司)和0.03％H₂O₂的柠檬酸缓冲液(PH4.0)进行显色反应，10-20min内测定405nm波长下的OD值。

结果显示，本发明单克隆抗体为IgG1κ亚型鼠源单克隆抗体。

二、亲和常数测定

取实施例1中制备的BSA-Pax5-PEP偶联产物，包被浓度为2μg/ml,100μl/ 孔，4℃包被过夜，PBS-T洗3次。每孔加200μl封闭液37℃封闭2h，PBS-T 洗3次。实施例4中纯化的单克隆抗体，从1：200开始2倍梯度稀释，最后 1孔留空白对照，37℃孵育1h，PBS-T洗3次。HRP标记的羊抗鼠二抗1：20000 稀释，每孔100μl，37℃孵育1h，PBS-T洗3次。每孔加入100μl含0.1％TMB (Sigma公司)和0.03％H₂O₂的柠檬酸-磷酸缓冲液显色10min，加50μl0.5M 硫酸溶液终止反应。用酶标仪测定波长450nm的吸光值。画出OD值对应抗体稀释倍数的曲线，找到最大结合OD值的一半时对应的稀释倍数A，利用下列公式计算出该抗体的亲和常数为2.22×10⁹。

三、单抗反应特异性和应用效果

取实施例1中制备的BSA-Pax5-PEP偶联产物用免疫印迹的方法检测本发明的单克隆抗体的识别特异性，免疫印迹实验过程如下：与BSA偶联的 BSA-Pax5-PEP及作为对照的BSA蛋白各上样约50ng，进行12％聚丙烯酰胺凝胶电泳。预染蛋白分子量标记PageRuler^TM Prestained Protein Ladder (Thermo Scientific，货号26616)。按常规方法在Bio-Rad电转移系统中将凝胶蛋白带转移到PVDF膜上(Millipore公司)。将膜置于含5％脱脂奶粉的 TBS-T封闭液中4℃过夜。加入由20G5杂交瘤培养上清(1：4稀释)4℃孵育过夜。用TBS-T洗膜后，加入1：5000稀释的羊抗鼠二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)，室温孵育1小时。再次TBST洗膜，加入ECL超敏显色液 (北京普利莱基因技术有限公司)，以ChemiDocMP多色荧光成像系统(Bio-Rad) 进行化学发光图像数据的采集。结果可见图2：20G4杂交瘤分泌抗体的免疫印迹检测结果，该株抗体可与偶联至BSA载体蛋白的抗原特异结合，与载体蛋白无结合，其条带位置在70kDa附近。

实施例5抗体的可变区序列测定

培养新鲜的20G4杂交瘤细胞，取上清进行抗原结合特性验证后，离心收集10⁶以上杂交瘤细胞。Trizol法提取杂交瘤细胞总RNA，提取的总RNA电泳结果见附图1。取9μl总RNA，加入2.5μLoligo(dT)12–18primer(10mM)，及5μldNTPs，混合均匀，70℃保温5分钟后置冰上5分钟，或依照使用的逆转录酶进行变性操作。随后加入5μl的5×逆转录酶缓冲液，2.5μl DTT(0.1 M)及1μl逆转录酶(北京华大蛋白质研发中心有限公司)，42℃反应1小时。70℃孵育15分钟以终止反应，获得的cDNA保存在-20℃。将获得的第一链 cDNA进行PCR扩增，在50μl反应体系中加入引物各25pmol，重链可变区和轻链可变区扩增使用的引物参照文献(Dübel S,Breitling F,Fuchs P, Zewe M,Gotter S,Welschof M,Moldenhauer G,Little M.Isolation of IgG antibody Fv-DNA from various mouse and rathybridoma cell lines using the polymerase chain reaction with a simple set ofprimers.J Immunol Methods.1994,75(1):89-95.)设计和合成(生工生物工程(上海) 股份有限公司)。用于扩增重链可变区的引物如下，其中Bi3、Bi3b、Bi3c、 Bi3d为重链可变区上游引物，可分别与重链下游引物Bi4组合扩增重链的可变区基因。

Bi3：5’-GAGGTGAAGCTGCAGGAGTCAGGACCTAGCCTGGTG-3’

Bi3b:5’-AGGTSMAACTGCAGSAGTCWGG-3’

Bi3c:5’-AGGTSMAGCTGCAGSAGTCWGG-3’

Bi3d:5’-AGGTSCAGCTGCAGSAGTCWGG-3’

Bi4:5’-CCAGGGGCCAGTGGATAGACAAGCTTGGGTGTCGTTTT-3’

用于扩增轻链可变区的引物如下，其中Bi6、Bi7、Bi8为kappa上游引物，可分别与轻链下游引物Bi5组合扩增Kappa轻链的可变区基因。

Bi6:5’-GGTGATATCGTGATRACMCARGATGAACTCTC-3’

Bi7:5’-GGTGATATCWTGMTGACCCAAWCTCCACTCTC-3’

Bi8:5’-GGTGATATCGTKCTCACYCARTCTCCAGCAAT-3’

Bi5:5’-GGGAAGATGGATCCAGTTGGTGCAGCATCAGC-3’

其余dNTPs及缓冲液均按照常规加入，最后加入cDNA模板1μl和1U热启动Taq DNA聚合酶(TaKaRa)。设置PCR扩增程序为94℃40秒，52℃40秒， 72℃40秒，进行20至25个循环，最后72℃延伸3分钟，产物可置于4℃备用或直接电泳。取20μl PCR产物进行电泳分析，在1.0％琼脂糖凝胶上分离切胶回收，重链和轻链可变区基因在不同引物组合下的扩增结果见附图3，选条带清晰的位置，切胶回收，克隆至T载体测序。

实施例6.组织芯片染色和鉴定

一.芯片制备过程

对各样本先进行HE切片染色，以确定肿瘤部位。使用3DHISTECH公司的全自动组织芯片仪制作组织芯片。将制成的组织芯片蜡块再放入蜡块制作模具，放入68℃烤箱内10分钟,使组织芯与受体腊块的蜡融为一体，然后轻轻从烤箱中取出模具，让半融状态的石蜡在室温条件下冷却约30min，再放入 -20℃冰箱冷冻6min后将组织芯片蜡块从模具中取出，切片或放入4℃冰箱内保存备用。修片后进行连续切片，厚度定为3μm，将连续切片漂在40％酒精中,让其自然展开，再将分开的切片转移到50℃的温水中展片30秒，用经多聚赖氨酸处理过的载玻片裱贴切片，将制成的组织芯片放入68℃烤箱内烤片 2小时，取出，室温冷却，放入-4℃冰箱保存。

二.IHC染色及分析

常规二甲苯脱蜡3次，每次6分钟，100％、100％、95％、85％梯度乙醇中水化，每次3分钟，最后自来水冲洗。进行抗原修复，然后将切片放入湿盒中，PBS冲洗3×3分钟。滴加3％H₂O₂孵育10分钟，PBS冲洗3×3分钟。甩干切片，滴加适当比例稀释的一抗(首次稀释根据抗体浓度来设计抗体的稀释比例)室温(25℃)孵育1小时，PBS冲洗3×3分钟，滴加二抗室温孵育15-30 分钟，PBS冲洗3×3分钟，甩去PBS，用新鲜配置的DAB显色液显色3-10分钟。苏木素复染25秒，PBS返蓝30秒。按照85％(3分钟)-95％(3分钟) -100％(3分钟)-100％(3分钟)的酒精梯度依次脱水，最后二甲苯透明3分钟，中性树胶封片。

免疫组化染色结果分为：阳性和阴性。阳性表达必须在细胞和组织特定的抗原部位才能视为阳性。在组织染色分布清晰及细胞定位准确的情况下，染色结果根据染色强度的差异进行进一步划分，具体如下：

1、样本为弱阳性；标记为“+”；

2、样本为中度阳性；标记为“++”；

3、样本为高度阳性；标记为“+++”。

4、样本为阴性，标记为“-”。

三.数据统计

1、组织芯片检测结果：

将本抗体(20G4)和市售抗体(兔单抗SP34)在不同人体组织芯片(包括B细胞淋巴瘤89例、T细胞淋巴瘤54例)上的进行同步检测并比较检测结果。

Pax5的免疫组化试验过程采取双盲设计，统计结果如下表所示。

本抗体(20G4)和市售临床抗体(兔单抗SP34)的阳性符合率为90％，阴性符合率为100％，总符合率为94％，本抗体在B淋巴细胞瘤上的阳性率为 95％高于SP34的85.39％，证明本抗体特异性高于市售临床抗体(兔单抗SP34)，可提高了B细胞淋巴瘤的诊断率。同时，有41例肿瘤组织样本，本抗体的染色强度大于市售抗体的染色强度，本抗体(20G4)的敏感性、特异性、亲和性都高于市售临床抗体(兔单抗SP34)。

图4为B细胞淋巴瘤的染色结果对比图；20G4染色结果为+++，而SP34 染色结果为++

2、正常组织芯片检测结果：

正常组织芯片包括30种正常组织样本，正常组织样本主要选自新鲜、及时固定的手术标本；每种组织包括3个不同病例样本。30种正常组织包括：大脑、心脏、小脑、食管、肾上腺、胃、卵巢、小肠、胰腺、结直肠、甲状旁腺、肝脏、垂体、唾液腺、睾丸、肾、甲状腺、前列腺、乳腺、子宫、脾、膀胱、扁桃体、骨骼肌、胸腺(幼儿)、皮肤、骨髓、外周神经、肺、间皮细胞。

将本抗体(20G4)和市售抗体(兔单抗SP34)在正常组织芯片上的进行同步检测，检测结果阴性与阳性一致，说明本抗体在正常组织的特异性同市售抗体相当。

图5为扁桃体B淋巴细胞样本1的染色结果对比图；20G4染色结果为+++， SP34染色结果为++。

本发明对未分化B细胞中的Pax-5蛋白，按照公布的序列进行分析，依据其与DNA结合的结构、抗原性、组成氨基酸的亲疏水性以及二级结构，选择具有区别于其他类似蛋白、长度适宜且具有特殊抗原性的区域作为抗原肽。将抗原肽与KLH载体蛋白进行化学交联以提高其免疫原性，得到免疫原。同时免疫原与牛血清白蛋白(BSA)化学偶联，用于抗体的交叉筛选，减少识别 KLH抗体的干扰。

筛选获得的抗体上清利用阳性组织切片进行筛查，获得基本的染色特异性、敏感度和特异性评价数据，对于初选合格的杂交瘤细胞株用小鼠进行腹水制备，Protein A/G柱亲和层析纯化腹水，获得鼠单克隆抗体。用ELISA技术测定该单克隆抗体的亚类为IgG1κ亚型单克隆抗体，并通过对杂交瘤细胞的mRNA逆转录后扩增出编码其重链和轻链可变区的基因序列。对于最终获得的单克隆抗体以多种组织样本和多种抗体进行IHC方法检测，确定用途。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、 “包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者终端设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者终端设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括……”或“包含……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者终端设备中还存在另外的要素。此外，在本文中，“大于”、“小于”、“超过”等理解为不包括本数；“以上”、“以下”、“以内”等理解为包括本数。

需要说明的是，尽管在本文中已经对上述各实施例进行了描述，但并非因此限制本发明的专利保护范围。因此，基于本发明的创新理念，对本文所述实施例进行的变更和修改，或利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，直接或间接地将以上技术方案运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围之内。

序列表

<110> 福州迈新生物技术开发有限公司

<120> 抗Pax-5蛋白的单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用

<130> 10

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 391

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

Met Asp Leu Glu Lys Asn Tyr Pro Thr Pro Arg Thr Ser Arg Thr Gly

1 5 10 15

His Gly Gly Val Asn Gln Leu Gly Gly Val Phe Val Asn Gly Arg Pro

20 25 30

Leu Pro Asp Val Val Arg Gln Arg Ile Val Glu Leu Ala His Gln Gly

35 40 45

Val Arg Pro Cys Asp Ile Ser Arg Gln Leu Arg Val Ser His Gly Cys

50 55 60

Val Ser Lys Ile Leu Gly Arg Tyr Tyr Glu Thr Gly Ser Ile Lys Pro

65 70 75 80

Gly Val Ile Gly Gly Ser Lys Pro Lys Val Ala Thr Pro Lys Val Val

85 90 95

Glu Lys Ile Ala Glu Tyr Lys Arg Gln Asn Pro Thr Met Phe Ala Trp

100 105 110

Glu Ile Arg Asp Arg Leu Leu Ala Glu Arg Val Cys Asp Asn Asp Thr

115 120 125

Val Pro Ser Val Ser Ser Ile Asn Arg Ile Ile Arg Thr Lys Val Gln

130 135 140

Gln Pro Pro Asn Gln Pro Val Pro Ala Ser Ser His Ser Ile Val Ser

145 150 155 160

Thr Gly Ser Val Thr Gln Val Ser Ser Val Ser Thr Asp Ser Ala Gly

165 170 175

Ser Ser Tyr Ser Ile Ser Gly Ile Leu Gly Ile Thr Ser Pro Ser Ala

180 185 190

Asp Thr Asn Lys Arg Lys Arg Asp Glu Gly Ile Gln Glu Ser Pro Val

195 200 205

Pro Asn Gly His Ser Leu Pro Gly Arg Asp Phe Leu Arg Lys Gln Met

210 215 220

Arg Gly Asp Leu Phe Thr Gln Gln Gln Leu Glu Val Leu Asp Arg Val

225 230 235 240

Phe Glu Arg Gln His Tyr Ser Asp Ile Phe Thr Thr Thr Glu Pro Ile

245 250 255

Lys Pro Glu Gln Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Met Ala Ser Leu Ala Gly

260 265 270

Gly Leu Asp Asp Met Lys Ala Asn Leu Ala Ser Pro Thr Pro Ala Asp

275 280 285

Ile Gly Ser Ser Val Pro Gly Pro Gln Ser Tyr Pro Ile Val Thr Gly

290 295 300

Arg Asp Leu Ala Ser Thr Thr Leu Pro Gly Tyr Pro Pro His Val Pro

305 310 315 320

Pro Ala Gly Gln Gly Ser Tyr Ser Ala Pro Thr Leu Thr Gly Met Val

325 330 335

Pro Gly Ser Glu Phe Ser Gly Ser Pro Tyr Ser His Pro Gln Tyr Ser

340 345 350

Ser Tyr Asn Asp Ser Trp Arg Phe Pro Asn Pro Gly Leu Leu Gly Ser

355 360 365

Pro Tyr Tyr Tyr Ser Ala Ala Ala Arg Gly Ala Ala Pro Pro Ala Ala

370 375 380

Ala Thr Ala Tyr Asp Arg His

385 390

<210> 2

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 2

Cys Gly Ala Ala Pro Pro Ala Ala Ala Thr Ala Tyr Asp Arg His

1 5 10 15

<210> 3

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 3

gaggtgcagc tgcaggagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggagcttc aatgaagata 60

tcctgcttgg cttctggtta ctcactcact ggcgacacca tgaactgggt gaagcagagc 120

catggaaaga accttgagtg gattggactt attaattctt acaatggaga tactatctac 180

aaccagaact tcaagggcaa ggccacatta actttagaca agtcatccag cacagcctac 240

atggagttcc tcagtctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aaaagaaggg 300

tatgattacg actcctggtc tgcttactgg ggccaaggga ctctggtcac tgtctctgca 360

<210> 4

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 4

gatatcatgc tgacccaatc tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60

atctcttgca gatctagtca gagccttttc cacagtaatg gaaacaccta tttacattgg 120

tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag cgcctgatct acaaggtttc caaccgattt 180

tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240

atcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ctcaaagttc acgtcttcca 300

ttcaggttcg gctcggggac aaagttggaa ataaaa 336

<210> 5

<211> 120

<212> PRT

<213> 小鼠(mus musculus)

<400> 5

Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Met Lys Ile Ser Cys Leu Ala Ser Gly Tyr Ser Leu Thr Gly Asp

20 25 30

Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Leu Ile Asn Ser Tyr Asn Gly Asp Thr Ile Tyr Asn Gln Asn Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Leu Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Phe Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Glu Gly Tyr Asp Tyr Asp Ser Trp Ser Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

115 120

<210> 6

<211> 112

<212> PRT

<213> 小鼠(mus musculus)

<400> 6

Asp Ile Met Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Phe His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ile Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser

85 90 95

Ser Arg Leu Pro Phe Arg Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Claims

1.一种抗Pax-5蛋白单克隆抗体，由保藏号为CGMCC NO 15486的杂交瘤细胞株产生。

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体特异性识别Pax-5蛋白。

3.根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体特异性识别Pax-5蛋白中的SEQID1所示的氨基酸序列。

4.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链可变区的DNA序列为SEQID3所示的核苷酸序列，所述单克隆抗体的轻链可变区的DNA序列为SEQ ID4所示的核苷酸序列。

5.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID5所示的氨基酸序列；所述单克隆抗体轻链可变区的氨基酸序列为SEQID6所示的氨基酸序列。

6.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体为小鼠IgG1κ亚型。

7.一种抗Pax-5单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述单克隆抗体的制备方法，包括免疫原的制备：选取Pax-5蛋白C末端的第378位至391位氨基酸序列为抗原肽，所述抗原肽与KLH载体蛋白偶联后得到免疫原，所述抗原肽的氨基酸序列为SEQID2所示的氨基酸序列。

8.一株分泌抗Pax-5蛋白分子的杂交瘤细胞株，所述细胞株为小鼠杂交瘤细胞株20G4，所述细胞株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC NO15486。

9.权利要求1-6任一所述的单克隆抗体，在Pax-5蛋白免疫检测中的用途。

10.根据权利要求9所述的免疫检测，其特征在于，所述免疫检测包括免疫组织化学法，免疫印迹法和酶联免疫法。