CN105112377B - 一株分泌抗p53单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株分泌抗P53单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，p53基因长度为16‑20kb的DNA，位于17P13.1，其编码的蛋白质长度为393个氨基酸的核磷蛋白，分子量约为53kDa，具有监控细胞和DNA的功能，对发生损伤的细胞启动修复或诱导凋亡。P53作为转录因子、调节核心对多种蛋白的表达进行调控。制备该抗体的抗原为一段优选的、由大肠杆菌表达、具有免疫原活性的重组蛋白，最终获得的抗体属于IgG2a亚型，编码其可变区的序列经基因克隆的方式获得，对多种肿瘤组织的免疫组织化学检测发现，该抗体可以很好的鉴别肿瘤的发生，可用于这些肿瘤的免疫学诊断。

Description

一株分泌抗p53单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用

技术领域

本发明涉及一株分泌抗p53单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。具体而言，本发明提供了一种抗肿瘤细胞表面抗原p53分子的单克隆抗体，对该抗体重链和轻链可变区的氨基酸序列和编码可变区的DNA序列进行了确定，该抗体可以用于通过人工或自动化方式，以免疫组织化学染色（IHC）、酶联免疫吸附（ELISA）或免疫印迹（Western Blot）方式检测细胞中p53的表达状态，从而用于对这些肿瘤进行诊断的方法中，属于生物检测领域。

背景技术

p53是一种肿瘤抑制基因（tumor suppressor gene），1979年首次被报道，其编码的蛋白质在Uniprot数据库中的编号为P04637.4。作为重要的细胞周期调控转录因子（transcriptional factor），它控制着细胞周期，通过调控其网络内160余种基因的表达决定多种细胞的分裂与凋亡。正常细胞通过向p53蛋白发送健康信号以维持细胞分裂，受损细胞不能修复时，P53蛋白将参与启动细胞凋亡（apoptosis）过程。存在P53蛋白缺陷的细胞会失去这种控制，甚至在不利条件下继续分裂。p53基因在正常情况下对细胞分裂起着减慢或监视的作用，在人类50%以上的肿瘤组织中均发现了p53基因的突变，这是肿瘤中最常见的遗传学改变，说明该基因的改变很可能是人类肿瘤产生的主要发病因素。

p53基因突变后，由于其空间构象发生改变，失去了对细胞生长、凋亡和DNA 修复的调控作用，p53基因由抑癌基因转变为癌基因。多种肿瘤，如肝癌、乳腺癌、膀胱癌、胃癌、结肠癌、前列腺癌、软组织肉瘤、卵巢癌、脑瘤、淋巴细胞肿瘤、食道癌、肺癌、成骨 肉瘤等，人类肿瘤中的P53有突变发生，突变主要集中在高度保守的区域内，以175、248、249、273、282位点突变率最高，不同种类肿瘤不同，如结肠癌和乳腺癌有相似的流行病学，但P53突变谱并不一致，结肠癌G:CA:T转换占79%，而且多数CpG，二核苷酸位点，50%以上转换突变发生在第3～5结构域的CpGC位于码子175、248、273；在乳腺癌中，只发现13%的转换在CpG位点。此外，G-T颠换在乳腺癌占1/4，但在结肠癌罕见。淋巴瘤和白血病的P53，突变方式与结肠癌相似，即大部分突变为CPG位点的转换，G→T颠换较低，A:T→G:C在A:T位点突变较高。伯基特淋巴瘤与其它B细胞淋巴瘤和T淋巴细胞恶性病变的p53突变谱相似，在非小细胞肺癌中G:C→T:A最普遍，食道癌颠换率很高，与肺癌不同的是，G:C和A:T位点有相似的突变率。我国启东地区50%为249癌码子的G→C、G→T颠换，而南非肝癌80%为G→T 颠换。骨肉瘤中p53突变率为75%，主要集中在5～9外显子。

依据以上对p53基因编码序列和蛋白质表达水平的变化可以对肿瘤的发生和预后进行评估。对于p53的检测大体分为基因水平的检测和蛋白质水平的检测两大类，其中对基因的检测多以定量PCR或芯片方式检测p53基因的表达水平，或通过探针法定量PCR的方法检测发生突变的p53基因位点，或以其他检测单核苷酸多态（single nucleotidepolymorphism, SNP）性的方法检测p53基因的SNP情况。对于蛋白的检测，分为常规的ELISA方式、抗体芯片方式，以包括临床常用的免疫组化方式，处于检测目的的不同，检测的蛋白包括野生型P53蛋白，也包括特定的突变体检测。对野生型申请号为“CN201210274649”的发明专利“抗肿瘤蛋白P53单克隆抗体及其用途”公开了一种P53单克隆抗体在为胃癌、肝癌、大肠癌、膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌、淋巴造血系统肿瘤、胶质细胞瘤、软组织肉瘤中作为免疫组化检测试剂的用途，对其检测灵敏度和特异性做了简单测试。除对P53蛋白进行检测外，对于体内的P53蛋白自身抗体的检测也有助于对肿瘤的判断，发明专利“一种血清自身抗体检测试剂盒（CN201410146727）”和“p53自身抗体识别的抗原多肽、试剂盒及在制备检测肿瘤试剂盒中的应用（CN200810222871）”以及“检测抗P53抗体的测定方法（CN97180373）”分别从试剂盒组成、适用的肿瘤范围以及特定抗原的制备方法等方面描述了检测P53特异性自身抗体的做法和用途。为进一步提高对肺癌检测的准确度，发明专利“一种用于肺癌诊断的液相芯片试剂盒”（申请号：CN201310290079）将对P53自身抗体的检测纳入液相抗体芯片之内，与对p62、CTAG和CAGE蛋白自身抗体的检测一并纳入判断范围。

针对以上研究现状，以及目前在检测领域使用较为广泛的抗P53单克隆抗体DO-7在应用中的特征，我们试图通过制备高质量的抗原，进行动物免疫后对大规模组织芯片进行筛选与鉴定，获得在检测灵敏度和特异性更具优势的抗P53单克隆抗体，并建立适宜的免疫检测的试剂盒制备方法。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种制备P53重组蛋白的方法，该重组蛋白由P53蛋白及用于纯化的组氨酸标签组成。

本发明的第二个目的是提供一种可分泌特异性好，亲和力高的P53单克隆抗体细胞株及其制备方法，该抗体能特异结合P53重组抗原和天然抗原。

本发明的第三个目的是提供一种将本抗体用于肿瘤组织切片免疫组织化学检测的使用方法。

解决技术问题所采用的技术手段

本发明针对在乳腺肿瘤、胃肠道肿瘤、肝细胞肿瘤及呼吸道肿瘤等多种肿瘤组织中表达异常的P53蛋白分子，按照公布的蛋白序列（Uniprot数据库中P04637.4）及其对应的mRNA编码（GenBank ID：NM_000546）进行分析，基因合成p53编码序列，为便于纯化，在重组蛋白的C端融合有组氨酸标签，经基因合成后克隆进表达质粒载体pET-28a中进行重组表达，分离纯化表达产物的可溶部分进行亲和纯化后作为免疫原，免疫Balb/c小鼠。经细胞融合、重组P53和天然肿瘤细胞系筛选克隆，获得高效分泌单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞系。

利用该杂交瘤细胞系用小鼠进行腹水制备，Protein A/G柱亲和层析纯化腹水，获得鼠单克隆抗体。用ELISA技术测定该单克隆抗体的亚类为IgG2a型单克隆抗体，亲和常数为3.02×10⁹。免疫印迹（Western blotting）实验显示该抗体能特异识别重组的p53蛋白以及表达P53分子的Jurkat细胞系。

具体地，本发明涉及以下几个方面：

1．一种单克隆抗体，由小鼠杂交瘤细胞系70237-85分泌。所述小鼠杂交瘤细胞系70237-85，该细胞系已于2015年2月5日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC NO.10401。地址为北京市朝阳区北辰西路一号院3号。

2．所述的单克隆抗体，其免疫小鼠用的抗原是将具有序列表中SEQ ID No.1的核苷酸序列编码经由大肠杆菌重组表达而获得的重组P53抗原蛋白。

3．所述的单克隆抗体，其重链和轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.2和SEQ IDNo.3所示的DNA序列所编码。

4．所述的单克隆抗体，其重链和轻链可变区氨基酸序列分别为SEQ ID No.4和SEQID No.5所示的氨基酸序列。

5．所述的单克隆抗体，其为小鼠IgG2a亚型单克隆抗体。

6．所述的单克隆抗体，其识别重组P53和肿瘤细胞内的P53蛋白分子。

7．所述的单克隆抗体，其用于免疫组织化学法、免疫印迹法和酶联吸附测定法检测肿瘤及正常组织细胞中的P53蛋白的表达情况。

8．所述的单克隆抗体在免疫组化病理诊断剂上的应用。

9．所述的重组P53抗原蛋白，该重组蛋白由全长为393氨基酸的P53蛋白及用于重组蛋白纯化的六个组氨酸标签组成。

本发明的优点及有益效果

（1）本发明获得的杂交瘤（70237-85）分泌产生的单克隆抗体，能识别重组蛋白P53和表达P53的淋巴瘤Jurkat细胞中的天然蛋白，并且能够检测高表达P53蛋白的食管鳞状细胞癌、胃腺癌、肠腺癌、宫颈鳞状细胞癌、血管瘤、纤维肉瘤、真皮纤维瘤等多种肿瘤组织。

（2）本发明获得的杂交瘤（70237-85）为一种IgG2a类抗体，与P53蛋白的结合有极强特异性和敏感性。

（3） 本发明获得的杂交瘤（70237-85）产生的单克隆抗体可应用于免疫组织化学（IHC）、免疫印记（Western blotting）、间接ELISA、抗体芯片制备等检测与筛查，特异性和灵敏度高。在以目前普遍使用的商品化DO-7细胞株的对比实验中，本发明细胞株制备的抗体在食管鳞状细胞癌、胃腺癌、肠腺癌、宫颈鳞状细胞癌、血管瘤、纤维肉瘤、真皮纤维瘤等多种肿瘤组织的诊断中，特异性同对照抗体DO-7无差异，敏感性等同于对照，甚至在宫颈鳞状细胞癌和纤维肉瘤中敏感性稍高于对照抗体。因此，本发明的P53单克隆抗体具有更广的应用范围，可显著提高诊断的准确度。

附图说明

图1：pET28a-P53中P53蛋白的表达和纯化，其中1.蛋白分子量标记；2：诱导表达后超生破碎的全菌蛋白；3：经镍柱纯化后的P53蛋白。

图2：70237-85单克隆抗体在肿瘤细胞系中的检测结果，其中1：空白对照，未加入70237-85抗体；2：按1：1000加入浓度为1mg/mL的70237-85单抗，加入1：5000稀释的HRP标记羊抗鼠二抗；3：分子量标记。目标蛋白约为53kDa。

图3：70237-85单克隆抗体的免疫组织化学检测结果，应用纯化的70237-85 P53抗体同商品化抗体DO-7在卵巢浆液性乳头状癌组织上的检测结果，左边为纯化的70237-85P53抗体，右边为对照抗体DO-7。

具体实施方式

下面结合图表和具体实施的方式对本发明做进一步阐述，以使本领域技术人员可以更清楚地得知本发明的技术方案，并非对本发明的限制。

实施例1 重组P53蛋白的基因克隆和表达纯化

1.1 基因克隆

P53的重组蛋白按照GenBank中登录号NM_000546的参考序列所定义的编码区序列（Coding sequence，CDS）DNA序列及Uniprot 数据库中P04637对应的氨基酸序列设计和合成DNA序列，基因合成由北京华大基因研究中心有限公司完成，在基因5’和3’端分别加入NcoI和XhoI酶切位点。pET28a也用NcoI和XhoI进行酶切，电泳回收，以T4 DNA连接酶连接。连接产物转化大肠杆菌感受态细胞BL21（DE3），挑取平板上的克隆接种，提取质粒DNA，进行PCR鉴定。PCR显示融合蛋白基因阳性的克隆进行测序分析，序列完全正确的克隆即采用。

大量表达和鉴定

划线活化菌株，挑一个单克隆接种到5mL含有卡那霉素的LB液体培养基中，过夜培养。第二天扩大培养到500mL含有卡那霉素 LB液体培养基中，37℃，200rpm继续培养。培养至OD=0.6-0.8，IPTG诱导（125μL（0.8M）IPTG/250mL菌液），4h后收菌。用400mL大离心桶，6000rpm，离心5min。弃上清。沉淀用20~30mL 10mMTris-HCl（pH8.0）溶液吹散，超声。取100μL 超声（500W，30次，每次10秒，间隔15秒）后的菌悬液，13000rpm，离心10min，取50μL上清至另一离心管，加50μL 2×溴酚蓝缓冲液，100℃煮5min，电泳，上清去除干净后沉淀用50μl10mMTris-HCl（pH8.0）溶液吹散，加入50μL 2×溴酚蓝上样缓冲液，100℃煮5min，电泳，电泳检测P53蛋白主要以包涵体形式表达。

大量洗涤包涵体纯化

取20~30mL 10mM Tris-HCl（pH8.0）溶液重悬超声离心得到的沉淀（500mL菌液所得），12000rpm，离心10min，上清转入另一管中保存。以20~30mL 10mM Tris-HCl（pH8.0）溶液重悬沉淀，12000rpm，离心10min，弃上清。重复重悬及离心过程一次。用20~30mL 含2M尿素的10mM Tris-HCl（pH8.0）溶液重悬沉淀，室温静置30min。12000rpm，离心10min，上清转入另一离心管中。20~30mL 10mM Tris-HCl（pH8.0）溶液重悬沉淀，再次重复10mM Tris-HCl洗涤过程。最后加入1~2mL的10mMTris-HCl（pH8.0）溶液重悬沉淀，再加5~10mL含8M尿素的10mM Tris-HCl（pH8.0）溶液重新溶解沉淀，电泳检测蛋白的纯化效果。

实施例2 杂交瘤细胞系的建立

一、免疫

将实施例1制备的包涵体抗原蛋白用弗氏完全佐剂（Sigma公司）乳化，免疫4-6周龄雌性Balb/c小鼠（购自北京维通利华实验动物技术有限公司），腹部皮下注射每只小鼠6点，剂量为60μg/只。每14天加强免疫一次，抗原使用弗氏非完全佐剂（Sigma公司）乳化，剂量为30μg/只。第3次加强免疫后7天以间接ELISA（波长450nm）检测小鼠血清中抗免疫原的多抗效价，效价最高的小鼠以尾静脉注射冲击免疫，抗原用生理盐水混匀，剂量为50μg/只。

二、细胞融合

无菌制备免疫达标的小鼠脾细胞悬液，与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0（ATCC）以5:1比例混合，离心1500 rpm，5min。弃上清后离心管放入37℃水浴中，在1分钟内缓慢加入1mL的PEG1500（Roche公司），并搅动细胞。在温水中静置1min后，加入10mL无血清的IMDM（Sigma公司），混匀，离心1000 rpm，5min。弃上清后，加入10mL血清（PAA公司）小心的将细胞吹打起来，并加入5mL混合10xHAT（Sigma公司）的胸腺细胞，混匀。再加入25mL含有2.1%硝基纤维素（Sigma公司）的半固体培养基充分混匀，然后均匀的倒入20个细胞培养皿中。将细胞培养皿放入到湿盒中，放入37℃ 5%CO₂培养箱中培养。

三、挑克隆

融合后7天克隆细胞团大小密度适中，在解剖镜下，吸取圆、实、大的克隆团打入事先准备好培养基的96孔培养板中，放入37℃ 5% CO₂培养箱中培养。

四、ELISA筛选阳性杂交瘤细胞

3天后，细胞量大约占底面积2/3，取100μL上清用免疫原和合成多肽分别进行ELISA筛选。阳性克隆完全换液，加入200μL含饲养细胞和1%HT（Sigma公司）的完全培养基。两天后进行第二次ELISA筛选，阳性克隆转入事先准备好培养基（含饲养细胞和HT）的24孔板培养。五天后取100μL上清进行第三次ELISA筛选，阳性克隆逐次转入6孔板和细胞培养瓶扩大培养并冻存。

实施例3 腹水诱生法制备单克隆抗体

3.1腹水制备

对数生长期细胞用无血清培养基洗涤并悬起，计数5×10⁵，1mL。悬浮的细胞腹腔注射事先用石蜡油致敏的小鼠。7天后开始收集腹水。取出的腹水于4℃离心4000 rpm，10min。小心吸出中间的腹水收集于离心管中，4℃或-20℃保存。

单克隆抗体的纯化

用HiTrap rProtein A FF（GE公司）亲和层析法按说明书从腹水中纯化抗体。SDS-PAGE胶鉴定纯度，Bradford法测定浓度。纯化的抗体保存于-20℃。

实施例4 单克隆抗体特性鉴定

4.1亚类鉴定

用100mM PBS（pH7.4）稀释包被羊抗鼠IgG（北京中杉金桥生物技术有限公司）至0.5 μg/mL,每孔加100μL，4℃，过夜。倾空液体，用含0.05wt% Tween的PBS（PBS-T）洗3次，每孔加入200μL封闭液（含2wt%BSA和3wt%蔗糖的PBS），37℃孵育1h。倾空液体，用PBS-T清洗3次。每孔加入0.1mL杂交瘤上清，37℃孵育1h。倾空液体用PBS-T清洗3次。用封闭液1：1000稀释HRP标记的羊抗鼠（κ,λ）抗体或1：2000稀释HRP标记的羊抗鼠（IgM，IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3，IgA）抗体（Southern Biotech公司）0.1mL每孔分别加入适当的孔中，37℃孵育1h。倾空液体，用PBS-T清洗3次。每孔加50μL 含0.15wt% ABTS（Southern Biotech公司）和0.03wt% H₂O₂的柠檬酸缓冲液（PH4.0）进行显色反应，10-20min内测定405nm波长下的OD值。结果显示，本发明单克隆抗体为IgG2a型鼠源单克隆抗体。

亲和常数测定

包被重组P53蛋白，包被浓度为4μg/mL, 100μL/孔，4℃包被过夜，PBS-T洗3次。每孔加200μL封闭液37℃封闭2h，PBS-T洗3次。实施例4中纯化的单克隆抗体，从1：200开始2倍梯度稀释，最后1孔留空白对照，37℃孵育1h，PBS-T洗3次。HRP标记的羊抗鼠二抗1：20000稀释，每孔100μL，37℃孵育1h，PBS-T洗3次。每孔加入100μL含0.1wt% TMB（Sigma公司）和0.03wt% H₂O₂的柠檬酸-磷酸缓冲液显色10min，加50μL 0.5M硫酸溶液终止反应。用酶标仪测定波长450nm的吸光值。画出OD值对应抗体稀释倍数的曲线，找出≥1/2“平台OD值”对应的稀释倍数A。利用下列公式计算出亲和常数为3.02×10⁹。

单抗反应特异性和应用效果

选择可表达P53蛋白的肿瘤细胞系Jurakt细胞，取培养的细胞约10⁶，离心去除培养基后，以磷酸缓冲液重悬细胞，再次离心去除上清，加入200μL 磷酸缓冲液重悬，超生破碎细胞后，以BCA方法继续蛋白定量。用免疫印迹的方法检测本发明的单克隆抗体的识别天然P53蛋白的特异性，免疫印迹实验过程如下：细胞裂解物上样70μg/泳道，进行12%聚丙烯酰胺凝胶电泳。按常规方法在Bio-Rad电转移系统中将凝胶蛋白带转移到PVDF膜上（Millipore 公司）。将膜置于含5wt%脱脂奶粉的TBS-T封闭液中4℃过夜。加入浓度为1mg/mL单克隆抗体70237-85（1：1000稀释）4℃孵育过夜。用TBS-T洗膜后，加入1：5000稀释的羊抗鼠二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司），室温孵育1小时。再次TBST洗膜，加入ECL超敏显色液（北京普利莱基因技术有限公司），以ChemiDoc MP多色荧光成像系统（Bio-Rad）进行化学发光图像数据的采集。

实施例4 抗体的可变区序列测定

培养新鲜的杂交瘤细胞，取上清进行抗原结合特性验证，要证实用于克隆的细胞株的确能分泌需要的抗体，证实完成后，离心收集10⁶以上杂交瘤细胞。 Trizol法提取杂交瘤细胞总RNA，取9μL总RNA，加入2.5 μL oligo(dT)12–18 primer (10 mM), 及5μL dNTPs，混合均匀，70℃保温5分钟后置冰上5分钟，或依照使用的逆转录酶进行变性操作。随后加入5μL RT buffer (5X)，2.5 μL DTT (0.1 M) 及 1μL逆转录酶，42℃反应1小时。70℃孵育15分钟以终止反应，获得的cDNA 保存在-20℃。将获得的第一链cDNA进行PCR扩增，在50μL反应体系中加入引物各25 pmol，引物的序列按照沈倍奋主编的《重组抗体》（科学出版社，2005年出版）一书中鼠单抗引物序列设计和合成。其余dNTPs及缓冲液均按照常规加入，最后加入cDNA模板加入1μL和1U热启动Taq DNA聚合酶。设置PCR扩增程序，通常为94℃40秒，52℃40秒，72℃40秒，进行20至25个循环，最后72℃延伸3分钟，产物可置于4℃备用或直接电泳。取20μL PCR产物进行电泳分析，在1.5% 琼脂糖凝胶上分离，轻链（κ 轻链）的长度在320-340bp之间，重链的长度在340-370bp之间，有该区域特异产物时切胶回收，克隆至T载体或表达载体测序。

实施例5. 组织芯片染色和鉴定

5.1 芯片制备过程

对各样本先进行HE切片染色，以确定肿瘤部位。对肿瘤靶位点画圈，预备打孔。制作空白受体蜡块时，将塑料架置于模具上，将融化的石蜡（熔点在65～70℃）倒入模具，冷却至室温后将模具放入- 20℃冰箱6 min，将蜡块从模具中取出。在组织样品机上选择1mm直径的样品针在受体蜡块上打孔，孔深3～4 mm，用另一直径1mm的打孔针在蜡块的标记部位打孔采集组织芯，其长度比受体蜡块的孔深浅0.1mm左右。将采集到的组织芯直接插入或用镊子小心夹取插入受体蜡块的空孔内。如此反复直至完成全部样品点的制备。最后用载玻片将所有组织芯按平，使组织芯片蜡块平坦光滑。将制成的组织芯片蜡块再放入蜡块制作模具，放入60℃烤箱内1 h ，使组织芯与受体腊块的蜡融为一体，然后轻轻从烤箱中取出模具，让半融状态的石蜡在室温条件下冷却约30 min，再放入-20℃ 冰箱冷冻6 min后将组织芯片蜡块从模具中取出，切片或放入4℃冰箱内保存备用。修片后进行连续切片，厚度定为4μm，将连续切片漂在凉水中, 让其自然展开，再将分开的切片转移到45℃的温水中展片30秒，用经2 wt% APES 丙酮液处理过的载玻片裱贴切片，将制成的组织芯片放入60℃烤箱内烤片2小时，取出，室温冷却，放入- 4℃ 冰箱保存。

染色及分析

常规二甲苯脱蜡3次，每次6分钟，100%、100%、95%、85%梯度乙醇中水化，每次3分钟，最后自来水冲洗。进行抗原修复，然后将切片放入湿盒中，PBS冲洗3×3分钟。滴加3%H₂O₂孵育10分钟 ，PBS冲洗3×3分钟。甩去PBS，滴加封闭液（动物非免疫血清）室温孵育10分钟。甩干切片，滴加适当比例稀释的一抗（首次稀释根据抗体浓度来设计抗体的稀释比例）室温（25℃）孵育1小时，PBS冲洗3×3分钟，滴加二抗室温孵育20-30分钟，PBS冲洗3×3分钟，甩去PBS，用新鲜配置的DAB显色液显色3-10分钟。苏木素复染25秒，PBS返蓝30秒。按照85%（3分钟）-95%（3分钟）-100%（3分钟）-100%（3分钟）的酒精梯度依次脱水，最后二甲苯透明3分钟，中性树胶封片。

数据统计

根据各抗体在样本点的着色情况，统计各指标的着色率（着色样本数/样本总数），见表1。

表1 本发明p53抗体70237-85同商品抗体DO-7在不同肿瘤上的检测差异比较

SEQUENCE LISTING

<110> 福州迈新生物技术开发有限公司

<120> 一株分泌抗p53单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用

<130> 5

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 393

<212> PRT

<213> 氨基酸序列

<400> 1

Met Glu Glu Pro Gln Ser Asp Pro Ser Val Glu Pro Pro Leu Ser Gln

1 5 10 15

Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn Asn Val Leu

20 25 30

Ser Pro Leu Pro Ser Gln Ala Met Asp Asp Leu Met Leu Ser Pro Asp

35 40 45

Asp Ile Glu Gln Trp Phe Thr Glu Asp Pro Gly Pro Asp Glu Ala Pro

50 55 60

Arg Met Pro Glu Ala Ala Pro Pro Val Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro

65 70 75 80

Thr Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ser Trp Pro Leu Ser Ser Ser

85 90 95

Val Pro Ser Gln Lys Thr Tyr Gln Gly Ser Tyr Gly Phe Arg Leu Gly

100 105 110

Phe Leu His Ser Gly Thr Ala Lys Ser Val Thr Cys Thr Tyr Ser Pro

115 120 125

Ala Leu Asn Lys Met Phe Cys Gln Leu Ala Lys Thr Cys Pro Val Gln

130 135 140

Leu Trp Val Asp Ser Thr Pro Pro Pro Gly Thr Arg Val Arg Ala Met

145 150 155 160

Ala Ile Tyr Lys Gln Ser Gln His Met Thr Glu Val Val Arg Arg Cys

165 170 175

Pro His His Glu Arg Cys Ser Asp Ser Asp Gly Leu Ala Pro Pro Gln

180 185 190

His Leu Ile Arg Val Glu Gly Asn Leu Arg Val Glu Tyr Leu Asp Asp

195 200 205

Arg Asn Thr Phe Arg His Ser Val Val Val Pro Tyr Glu Pro Pro Glu

210 215 220

Val Gly Ser Asp Cys Thr Thr Ile His Tyr Asn Tyr Met Cys Asn Ser

225 230 235 240

Ser Cys Met Gly Gly Met Asn Arg Arg Pro Ile Leu Thr Ile Ile Thr

245 250 255

Leu Glu Asp Ser Ser Gly Asn Leu Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu Val

260 265 270

Arg Val Cys Ala Cys Pro Gly Arg Asp Arg Arg Thr Glu Glu Glu Asn

275 280 285

Leu Arg Lys Lys Gly Glu Pro His His Glu Leu Pro Pro Gly Ser Thr

290 295 300

Lys Arg Ala Leu Pro Asn Asn Thr Ser Ser Ser Pro Gln Pro Lys Lys

305 310 315 320

Lys Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Gln Ile Arg Gly Arg Glu

325 330 335

Arg Phe Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu Lys Asp

340 345 350

Ala Gln Ala Gly Lys Glu Pro Gly Gly Ser Arg Ala His Ser Ser His

355 360 365

Leu Lys Ser Lys Lys Gly Gln Ser Thr Ser Arg His Lys Lys Leu Met

370 375 380

Phe Lys Thr Glu Gly Pro Asp Ser Asp

385 390

<210> 2

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gtgcaactgc aggagtctgg acctagcctc gtgaaacctt ctcaaactct gtccctcacc 60

tgttctgtca ctggcgactc cagcaccagt ggttactgga actggatccg gaaattccca 120

gggaataaat ttgagtacgt gggatacgta aactccagtg ctgctacttt ccacaatcct 180

tctctcaaaa gtcgaatctc catcactcga gacacatcca agaaccagta ctacctgcag 240

ttgagttctg tgactactga agacacagcc acttattact gtgcaagggg gctctctagg 300

gacttctgga gtccaggaac ctcagtcacc gtctcctcag ccaaaacgac acccaagctt 360

<210> 3

<211> 363

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gatatcttga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagtttcc 60

atttcttgca gatctagtca gagccttgca cacacgaatg gaaacaccta tttacattgg 120

tacctccaga agtcaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagattc caaccgattt 180

tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240

agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ctgaaattac atctgttcct 300

tggacgttcg gtggaggcac caagctggga atcaaacgag ctgatgctgc accaactgga 360

tcc 363

<210> 4

<211> 120

<212> PRT

<213> 重链氨基酸

<400> 4

Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr

1 5 10 15

Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Asp Ser Ser Thr Ser Gly Tyr

20 25 30

Trp Asn Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Lys Phe Glu Tyr Val Gly

35 40 45

Tyr Val Asn Ser Ser Ala Ala Thr Phe His Asn Pro Ser Leu Lys Ser

50 55 60

Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Tyr Leu Gln

65 70 75 80

Leu Ser Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg

85 90 95

Gly Leu Ser Arg Asp Phe Trp Ser Pro Gly Thr Ser Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser Ala Lys Thr Thr Pro Lys Leu

115 120

<210> 5

<211> 121

<212> PRT

<213> 轻链氨基酸

<400> 5

Asp Ile Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Ala His Thr

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Ser Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Asp Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Glu Ile

85 90 95

Thr Ser Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Gly Ile Lys

100 105 110

Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Gly Ser

115 120

Claims (2)

1.一种单克隆抗体，其特征在于：由小鼠杂交瘤细胞系70237-85分泌；所述小鼠杂交瘤细胞系70237-85，该细胞系已于2015年2月5日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC NO.10401；

其免疫小鼠用的抗原是序列表中SEQ ID No.1所示的重组P53抗原蛋白。

2.一种如权利要求1所述的单克隆抗体在制备免疫组化病理诊断剂上的应用。