CN106754739A - 小鼠抗人p53单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株 - Google Patents

Abstract

一种小鼠抗人P53单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。所述的分泌P53单克隆抗体的杂交瘤细胞株克隆号为6C4，保藏编号为CGMCC No. 6916。本发明还提供了所述杂交瘤细胞株6C4产生的单克隆抗体。该抗体包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:9，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:10。该抗体主要用于各种肿瘤的研究，可作为肿瘤预后的指标之一。

Description

小鼠抗人P53单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细 胞株

技术领域

本发明涉及以原核表达的P53蛋白免疫小鼠获得的分泌P53单克隆抗体的杂交瘤细胞株6C4，属于生物工程技术领域。

背景技术

P53基因是一种肿瘤抑制基因（或抑癌基因），是最早发现的肿瘤抑制基因之一。P53 基因位于人类17号染色体短臂上（17P13），大约长2万个碱基，是一条53KD的由393个氨基酸组成的富含磷酸基的核蛋白（因此命名为P53），其编码的蛋白质分为野生和突变两种亚型。

P53蛋白主要分布于细胞核浆，能与DNA特异结合，其活性受磷酸化、乙酰化、甲基化、泛素化等翻译后修饰调控。P53蛋白在细胞周期捕获，DNA修复，细胞衰老、分化、调亡等过程中都起着重要的作用，它能修复损伤细胞，或者除去严重损伤的细胞从而避免这些细胞对机体的危害作用。有P53基因缺陷的细胞没有这种控制，甚至在不利条件下继续分裂。细胞中P53蛋白被称为基因卫士，在G1期检查DNA损伤点，监视基因组的完整性。如有损伤，P53蛋白阻止DNA复制，以提供足够的时间使损伤DNA修复；如果修复失败，P53蛋白则引发细胞凋亡。

P53基因突变后，由于其空间构象发生改变，失去了对细胞生长、凋亡和DNA 修复的调控作用。如果p53基因的两个拷贝都发生了突变，对细胞的增殖失去控制，导致细胞癌变，P53基因由抑癌基因转变为癌基因。引起肿瘤形成或细胞转化的P53蛋白是P53基因突变的产物，是一种肿瘤促进因子，它可以消除正常P53蛋白的功能。

P53基因是迄今发现与人类肿瘤相关性最高的基因，研究表明，半数以上的实体瘤细胞均存在P53蛋白的基因突变或功能丧失，目前发现的与p53基因突变有关的肿瘤有肝癌、乳腺癌、膀胱癌、胃癌、结肠癌、前列腺癌、软组织肉瘤、卵巢癌、脑瘤、淋巴细胞肿瘤、食道癌、肺癌、成骨肉瘤等。若p53基因常在肿瘤发生的早期发生突变，则有助于肿瘤的早期诊断，另外p53基因突变者多对放化疗反应差，也容易发生转移，可作为治疗疗效和预后判定的指标，所以免疫组化检测突变型P53，对于各种恶性肿瘤的研究具有重要作用。

目前，国内外已经获得了多种小鼠抗人P53的单克隆抗体用于免疫组化检测突变型P53，但制备表达量更多，亲和性更好，稀释度更高，具有更多优良特性的P53单克隆抗体对于各类肿瘤发生机制的研究、量化P53蛋白在肿瘤发生发展中的作用、肿瘤的诊断治疗和预后评价以及检测P53蛋白药物在动物体内分布代谢研究都有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种高亲和性的、可用于科研或临床免疫组化检测P53表达的小鼠抗人P53单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

（1）根据P53的基因序列（BC003596.1）的编码框，设计1对特异引物，Trizol Reagent试剂提取人脂肪组织总RNA，将总RNA逆转录成cDNA并以cDNA为模板PCR扩增P53基因，构建重组表达载体PET28a-P53，转化大肠杆菌BL21感受态，IPTG诱导蛋白表达并亲和纯化蛋白作为抗原。

（2）采用经典的细胞融合技术制备P53单克隆抗体，亲和层析纯化抗体蛋白，SDS-PAGE测定抗体纯度，直接ELISA 法测定纯化抗体的滴度。

（3）通过免疫组织化学分析P53单克隆抗体染色人乳腺癌石蜡切片。

（4）根据抗体基因的恒定区序列合成特异性引物，PCR扩增单克隆抗体P53重链可变区和轻链可变区，回收目的片段，克隆到pGEM-T载体中，转化大肠杆菌TGl细胞后筛选阳性克隆，抽提质粒后测序确定了单克隆抗体P53的重链和轻链可变区序列。

本发明提供的以原核表达的P53蛋白为抗原、免疫小鼠获得的分泌P53单克隆抗体的杂交瘤细胞株，名称为6C4，该细胞株6C4已于2012年11月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），保藏编号为CGMCC No. 6916。

本发明还提供了所述杂交瘤细胞株6C4 CGMCC No. 6916产生的单克隆抗体。该抗体包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:9，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:10。

本发明的优点和有益效果：

本发明应用重组人的P53蛋白为免疫抗原，免疫Balb/c小鼠, 采用经典的细胞融合技术，通过ELISA筛选，获得一株能稳定分泌抗P53的杂交瘤细胞株，命名为6C4，亚型鉴定为IgG1，将杂交瘤细胞株扩大培养后收集上清，采用Protein A亲和层析法对P53单抗进行纯化。SDS-PAGE结果显示，纯化后抗体纯度在95%以上; ELISA 滴度测定结果显示，单抗的滴度均在1∶10000以上。人乳腺癌石蜡切片经抗P53抗体免疫组化染色，可于光镜下观察到细胞核出现均匀着色的棕褐色颗粒，背景清晰，无非特异性着色。从实验结果上来看，本发明制备了高效价，高特异性的P53单克隆抗体，用该抗体检测证实，其对细胞中的P53蛋白具有高识别能力，可用于科研或临床免疫组化检测P53表达。P53阳性者说明预后不良，同时可作为细胞凋亡中的一个调控因子。

附图说明

图1 SDS-PAGE 分析纯化后的P53单克隆抗体。

图2 ELISA 法测定P53单克隆抗体滴度。

图3免疫组织化学检测分析P53单克隆抗体染色人乳腺癌石蜡切片。

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常施方法。

实施例1：杂交瘤细胞株6C4及其产生的单克隆抗体的获得

1、抗原制备

（1）获得目的基因

在该实施例中，根据P53的基因序列（BC003596.1）的编码框，设计1对特异引物：

引物1 ：5'- CGCGGATCCATGGAGGAGCCGCAGTCAG-3' (SEQ ID NO:1)

引物2 ：5'- CCGCTCGAGGGCCCTTCTGTCTTGAACATG-3'；(SEQ ID NO:2)

Trizol Reagent试剂提取人脂肪组织总RNA，将总RNA逆转录成cDNA并以cDNA为模板PCR扩增P53基因。

（2）构建重组表达载体

将步骤（1）获得的PCR产物双酶切后回收，在T4 DNA连接酶作用下连接入表达载体PET28a，构建重组质粒PET28a-P53。

（3）获得含重组表达质粒的表达菌种

将步骤（2）获得的连接产物转化大肠杆菌BL21感受态，用含有硫酸卡那霉素的固体培养基筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确，进入下步操作。以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。

（4）诱导表达和蛋白纯化

将步骤（2）提取的质粒转化BL21感受态，用含有硫酸卡那霉素的固体培养基筛选，挑选单克隆至10ml含有硫酸卡那霉素的LB液体培养基中培养，37℃，220rpm培养10h，取5ml液体培养基转移至250ml的大瓶中继续培养，培养至OD值为0.8，加入0.2mM IPTG诱导表达，16℃诱导过夜，收集菌液超声，取上清用Ni-NTA琼脂糖亲和层析法纯化P53蛋白。

2、单抗的制备和纯化

(1)、免疫动物

一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行三次免疫注射。

首次免疫，纯化的重组蛋白P53（用适量生理盐水稀释）+完全弗氏佐剂，100μg/只，颈背部皮下多点注射；

二次免疫（间隔两周），纯化的重组蛋白P53（用适量生理盐水稀释）+不完全弗氏佐剂，100μg/只，颈背部皮下多点注射；

三次免疫（间隔两周），纯化的重组蛋白P53（用适量生理盐水稀释），不完全弗氏佐剂，100μg/只，颈背部皮下多点注射；

三次免疫后7~10天采血，用建立的ELISA法检测效价，选择效价最高者用于细胞融合。

加强免疫（融合前3天），用纯化的重组蛋白50μg腹腔注射。3天后，取脾脏融合。

(2)、细胞融合

采用眼球摘除放血法处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。将准备好的同系骨髓瘤细胞SP2/0与小鼠脾细胞按一定比例混合（1:5~1:10），并加入促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。采用HAT选择性培养基，进行杂交瘤细胞的选择性培养和筛选。

用ELISA方法检测杂交瘤细胞培养上清：以纯化的P53蛋白（10μg/ml）包被酶标板，每孔100μl，4℃包板过夜。甩掉包被液，加入200μl 5%的脱脂奶粉，37℃封闭1h后，洗涤3次，加杂交瘤细胞培养检测上清100μl（阴性对照为PBS 100μl），37℃孵育1小时。洗涤3遍后，加酶标记二抗（羊抗鼠 IgG-HRP），37℃孵育1小时，去掉酶标二抗，洗涤3遍，加底物显色剂50μl，室温静置5分钟，加终止液50μl。用酶标仪检测450nm波长处的OD值。OD值明显高于阴性对照2倍以上者定为阳性。最后筛选得到一株分泌性能最佳的抗P53杂交瘤细胞株，命名为6C4，亚型鉴定为IgG1。

将选出的阳性杂交瘤细胞株6C4克隆化培养（有限稀释法），获得能产生高效价单克隆抗体的杂交瘤细胞克隆。将杂交瘤细胞株扩大培养，并冻存保种。所述的阳性杂交瘤细胞为抗人P53杂交瘤细胞系6C4，该细胞系已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 6916。

(3)单克隆抗体的大量制备与纯化

将步骤（2）获得的细胞株6C4接种至Balb/c小鼠腹腔，制备腹水，然后从腹水中提取抗体。

单克隆抗体P53的纯化：采用Protein A亲和层析法。首先制备protein A亲和柱，用PBS平衡柱子后，取抗P53的腹水过柱，然后用PBS洗至OD值接近于零，以50mmol/LPH2.5的甘氨酸-HCl溶液（PH）洗脱，收集峰值区的洗脱液，经透析浓缩后备用。SDS-PAGE结果显示，纯化后抗体纯度在95%以上(参见图1)。

(4) 直接ELISA 法测定纯化抗体的滴度

以纯化的P53蛋白（10μg/ml）包被酶标板，每孔100μl，4℃包板过夜。甩掉包被液，加入200μl 5%的脱脂奶粉，37℃封闭1h后，洗涤3次，将纯化的抗体按1: 200，1:400，1:800，1:1600，1:3200，1:6400，1:12800 进行稀释，以每孔100μl 加入酶标板中（阴性对照为PBS100μl），37℃孵育1小时。洗涤3遍后，加酶标记二抗（羊抗鼠 IgG-HRP），37℃孵育1小时，去掉酶标二抗，洗涤3遍，加底物显色剂50μl，室温静置5分钟，加终止液50μl。用酶标仪检测450nm波长处的OD值。ELISA 滴度测定结果显示，单抗的滴度均在1:10000以上（参见图2）。

实施例2：单克隆抗体鉴定及应用

1、小鼠抗P53单克隆抗体的鉴定

裂解提取cos-7细胞裂解液，上样至10%的SDS-PAGE胶孔中，20μg/孔，电泳后将凝胶中的蛋白转移至PVDF膜上，封闭后，用抗P53抗体进行免疫染色，加入实施例1步骤（3）制备并纯化的P53单克隆抗体，工作浓度设为1:40000，4℃过夜，加入HRP标记的羊抗鼠抗体，工作浓度1: 5000，于37℃反应 lh，结果出现一条分子量为55KDa的条带（参见图3），与文献报道相符，证明此抗体为抗P53的特异性抗体；图片显示抗体1:40000稀释后条带依然清晰，证明本单抗效价极高。

2、免疫组化应用检测

用P53单抗，按常规法作病理切片，对人乳腺癌石蜡切片进行免疫组化染色。

具体方法为：

(1) 脱蜡

切片依次置于二甲苯I、II、III脱蜡每次5分钟，移至无水乙醇I、II中各浸泡4分钟，移至95%酒精中浸泡4分钟，移至85%酒精中浸泡4分钟，再移至70%酒精中浸泡4分钟，流水冲洗2分钟。

(2) 抗原修复

将已冲洗干净组织切片放入高压锅内，加入约3000ml左右的EDTA抗原修复液（pH7.4），高火加热煮沸后调至低火保持沸腾喷气3分钟，关掉电磁炉开关，两分钟后将高压锅移至冷水中冷却，待高压锅内抗原修复液完全冷却后，打开高压锅将组织切片用流水冲洗干净移至蒸馏水中浸泡2分钟。

(3) 阻断

3%H₂O₂中浸泡10分钟，流水冲洗蒸馏水冲洗。取出切片，擦干组织周围的水，用免疫组化笔在组织块周围画一圆圈注意圈接头要接好，防止抗体跑出圈外造成假阴性。PBS缓冲液冲洗。

(4) 滴加一抗

甩去待测组织切片上多余的PBS，滴加一抗，其中一抗为实施例1步骤（3）制备并纯化的P53单克隆抗体，稀释度为1 : 300。放置在孵育盒内4℃冰箱中过夜孵育约12小时。

(5) 滴加二抗

将孵育盒从冰箱取出，恢复至室温后取出切片，用PBS洗3次，每次5分钟。滴加通用型二抗-HRP聚合物。将切片放入孵育湿盒中，盖上盖子，连孵育盒一起放入37℃恒温箱中孵育30分钟。

(6) 显色、衬染、封片

取出切片，擦掉组织周围的多余的PBS，加入DAB显色液中显色3～5分钟，在显微镜下控制染色的强度。待强度适中后将切片置自来水中终止显色，再用流水冲洗5～10分钟，苏木素染液复染1分钟，0.5%盐酸酒精分化3秒钟，流水冲洗5～10分钟，脱水、透明、封片、镜检。

结果判定：按照国外学者对组织中P53的判定标准，P53蛋白阳性反应为黄到棕黄色或棕褐色细小颗粒，定位于细胞核。人乳腺癌（参见图3）经抗P53抗体免疫组化染色，可于光镜下观察到胞核内呈均匀着色的棕褐色颗粒，背景清晰，无非特异性着色，说明此P53小鼠单克隆抗体可以特异性的应用于免疫组织化学实验。

实施例3：单克隆抗体可变区测序

根据抗体基因的恒定区序列合成以下引物：

zh08 5'-GGGGATATCCACCATGRACTTCGGGYTGAGCTKGGTTTT-3'(SEQ ID NO:3)

zhr11 5'-GACHGATGGGGSTGTYGTGCTAGCTGNRGAGACDGTGA-3'(SEQ ID NO:4)

zl01 5'-GGGGATATCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTAT-3'(SEQ lD NO:5)

zlr05 5'-GGATACAGTTGGTGCAGTCGACTTACGTTTKATTTCCARCTT-3' (SEQ ID NO:6)

Trizol Reagent试剂分别提取5×10⁶杂交瘤细胞6C4的总RNA，将总RNA逆转录成cDNA。用zh08和zhr11为引物进行PCR扩增单克隆抗体P53重链可变区，用zl01和zlr05为引物进行PCR扩增单克隆抗体P53轻链可变区，PCR反应均采用热启动，反应条件: 94℃ 5分钟；94℃ 45 秒，60℃ 45 秒，72℃ 1分10 秒，30个循环；72℃ 7 分钟。PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离后回收纯化目的片段（轻链长度392 bp，重链长度310 bp）。克隆到pGEM-T(Promega)载体中，转化大肠杆菌TGl细胞后在 IPTGIX-gal平板上进行筛选，取白色菌斑接种于含有氨韦青霉素的 LB 液体培养基中扩增。筛选阳性克隆，用 QIAGEN 的质粒抽提试剂盒抽提质粒并进行测序，确定了单克隆抗体P53的重链和轻链可变区序列。

单克隆抗体P53可变区的 DNA 序列和氨基酸序列：

单克隆抗体6C4重链可变区基因序列(5'→3'，310bp) (SEQ ID NO:7)；

单克隆抗体6C4的轻链可变区基因序列(5'→3'，392bp) (SEQ 1D NO:8)；

单克隆抗体6C4重链可变区的推断氨基酸序列 (103氨基酸) (SEQ ID NO:9) ；

单克隆抗体6C4轻链可变区的推断氨基酸序列(130 氨基酸) (SEQ 10 NO:10)。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津三箭生物技术股份有限公司

<120> 小鼠抗人P53单克隆抗体及分泌该抗体的杂交瘤细胞株

<130> DNA

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> 引物

<400> 1

cgcggatcca tggaggagcc gcagtcag 28

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物

<400> 2

ccgctcgagg gcccttctgt cttgaacatg 30

<210> 3

<211> 39

<212> DNA

<213> 引物

<400> 3

ggggatatcc accatgract tcgggytgag ctkggtttt 39

<210> 4

<211> 38

<212> DNA

<213> 引物

<220>

<221> misc_feature

<222> (27)..(27)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 4

gachgatggg gstgtygtgc tagctgnrga gacdgtga 38

<210> 5

<211> 38

<212> DNA

<213> 引物

<400> 5

ggggatatcc accatggaga cagacacact cctgctat 38

<210> 6

<211> 42

<212> DNA

<213> 引物

<400> 6

ggatacagtt ggtgcagtcg acttacgttt katttccarc tt 42

<210> 7

<211> 310

<212> DNA

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 7

cgacttttgt tggtcactat ctggtgtggg tgtaggctgc catctcgtca ccaattcagg 60

gaagggtctg gagtggctgg cacacatttg gtgggatgat gacaagagct ataacccagc 120

cctgaagagt cgactgacaa tctccaagga tacctccacc aatcaggtat tcctcaagat 180

cgccagtgtg gacactgcag atactgccac atattattgt gctcggatga ctacggctac 240

gtttgcttac tggggccagg ggactctggt cacagtctcc ccagctagca caacaccccc 300

catcagtcaa 310

<210> 8

<211> 392

<212> DNA

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 8

ggaggtatgc tgctctgggt caggttccac tggtgacatt gtgctgacac agtctcctgc 60

ttccttagct gtatctctgg ggcagagggc caccatctca tacagggcca gcaaaagtgt 120

cagtacatct ggctatagtt atatgcactg gaaccaacag aaaccaggac agccacccag 180

actcctcatc tatcttgtat ccaacctaga atctggggtc cctgccaggt tcagtggcag 240

tgggtctggg acagacttca ccctcaacat ccatcctgtg gaggaggagg atgctgcaac 300

ctattactgt cagcacatta gggagcttac acgttcggag gggggaccaa gctggaaatc 360

aaacgtaagt cgactgcacc aaactgtata ca 392

<210> 9

<211> 103

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 9

Asp Phe Cys Trp Ser Leu Ser Gly Val Gly Val Gly Cys His Leu Val

1 5 10 15

Thr Asn Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp

20 25 30

Asp Asp Lys Ser Tyr Asn Pro Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser

35 40 45

Lys Asp Thr Ser Thr Asn Gln Val Phe Leu Lys Ile Ala Ser Val Asp

50 55 60

Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Met Thr Thr Ala Thr

65 70 75 80

Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Pro Ala Ser

85 90 95

Thr Thr Pro Pro Ile Ser Gln

100

<210> 10

<211> 130

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 10

Glu Val Cys Cys Ser Gly Ser Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr

1 5 10 15

Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile

20 25 30

Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met

35 40 45

His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr

50 55 60

Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

65 70 75 80

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu

85 90 95

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg Glu Leu Thr Arg Ser

100 105 110

Glu Gly Gly Pro Ser Trp Lys Ser Asn Val Ser Arg Leu His Gln Thr

115 120 125

Val Tyr

130

Claims (2)

1.一种以原核表达的P53蛋白免疫小鼠获得的分泌P53单克隆抗体的杂交瘤细胞株6C4，保藏编号为CGMCC No. 6916。

2.根据权利要求1所述的杂交瘤细胞株6C4产生的重链可变区氨基酸序列为SEQ IDNO:9，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:10的免疫球蛋白。