CN103173414B - 小鼠抗人p504s单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株 - Google Patents
小鼠抗人p504s单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103173414B CN103173414B CN201210528285.7A CN201210528285A CN103173414B CN 103173414 B CN103173414 B CN 103173414B CN 201210528285 A CN201210528285 A CN 201210528285A CN 103173414 B CN103173414 B CN 103173414B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- monoclonal antibody
- variable region
- hybridoma cell
- seq
- cell strain
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 title claims abstract description 26
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 title abstract description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 6
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims description 9
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 8
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 claims description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 abstract description 8
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 7
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 5
- 238000013115 immunohistochemical detection Methods 0.000 abstract description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 abstract 3
- 102100040410 Alpha-methylacyl-CoA racemase Human genes 0.000 description 66
- 238000000034 method Methods 0.000 description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 13
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 12
- 108010044434 Alpha-methylacyl-CoA racemase Proteins 0.000 description 9
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 9
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 9
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 7
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 6
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 6
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 6
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 6
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 3
- 210000000941 bile Anatomy 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 3
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 3
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 3
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 3
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 3
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 3
- 239000001117 sulphuric acid Substances 0.000 description 3
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N CoASH Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N 0.000 description 2
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 2
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 238000011091 antibody purification Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N coenzime A Natural products OC1C(OP(O)(O)=O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005516 coenzyme A Substances 0.000 description 2
- 229940093530 coenzyme a Drugs 0.000 description 2
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 230000024835 cytogamy Effects 0.000 description 2
- KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N dephosphocoenzyme A Natural products OC1C(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 150000002190 fatty acyls Chemical group 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 2
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- -1 polyoxyethylene Polymers 0.000 description 2
- PAHGJZDQXIOYTH-UHFFFAOYSA-N pristanic acid Chemical compound CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C(O)=O PAHGJZDQXIOYTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.NCC(O)=O IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 206010004446 Benign prostatic hyperplasia Diseases 0.000 description 1
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M Nitrite anion Chemical compound [O-]N=O IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 208000015634 Rectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000006265 Renal cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 201000011199 bladder lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 210000005252 bulbus oculi Anatomy 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 201000010989 colorectal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 229960000935 dehydrated alcohol Drugs 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000002991 immunohistochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000012151 immunohistochemical method Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000010208 microarray analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 229940005654 nitrite ion Drugs 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 201000010279 papillary renal cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000000505 pernicious effect Effects 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 206010038038 rectal cancer Diseases 0.000 description 1
- 201000001275 rectum cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 1
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 1
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
一种小鼠抗人P504S单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。所述的分泌P504S单克隆抗体的杂交瘤细胞株克隆号为4A12，保藏编号为CGMCC No.6857。本发明还提供了所述杂交瘤细胞株4A12产生的单克隆抗体。该抗体包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：9，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：10。本发明还提供了一种DNA分子SEQ ID NO：7，它编码重链可变区氨基酸序列SEQ ID NO：9；一种DNA分子SEQ ID NO：8，它编码轻链可变区氨基酸序列SEQ ID NO：10。该抗体可用于科研或临床免疫组化检测P504S表达。
Description
技术领域
本发明涉及以原核表达的P504S蛋白免疫小鼠获得的分泌P504S单克隆抗体的杂交瘤细胞株4A12，属于生物工程技术领域。
背景技术
P504S即α-甲基酰基辅酶A消旋酶(alpha-methylacyl-CoA racemase，AMACR)，是一种胞浆蛋白，属于CAIB-BAIF CoA转换酶家族，最初在小鼠肝线粒体中发现，同时存在于人类和小鼠的过氧化物酶和线粒体中。P504S基因定位于染色体5p13，是一个1621-bp的cDNA，编码由382个氨基酸残基构成的蛋白P504S(也叫AMACR)。
P504S蛋白是存在于线粒体和过氧化物酶体中的一种酶，它参与支链脂肪酸(包括降植烷酸)和胆汁酸的代谢，在支链脂肪酸和其衍生物以及胆汁酸中间代谢产物的β-氧化中起着关键的作用。P504S主要催化α-甲基支链脂酰基辅酶A由R型催化转化为S型，只有S型α-甲基支链脂酰基辅酶A才能通过过氧化物酶体进行代谢，因而P504S在支链脂肪酸和胆汁酸的代谢中发挥着重要作用。
P504S在前列腺癌组织的mRNA和蛋白水平上均有大量表达，表达水平显著高于正常人。近年来，有研究者运用微生物信息和克隆杂交繁殖技术，克隆出P504S基因，编码P504S(AMACR)蛋白；运用高产量cDNA微阵列分析、Northern blot及定量实时PCR等方法证明了P504S(AMACR)选择性地在前列腺癌中过表达，而在正常及良性增生的前列腺组织中几乎不表达。因此，P504S可作为一种前列腺癌的特异性标记物和早期前列腺癌病变的诊断指标。应用P504S免疫组化染色后，能够容易地辨别出恶性的前列腺癌，从而提高前列腺癌诊断的准确性。
P504S可以作为前列腺癌诊断的阳性指标，但P504S的高表达也并非仅仅见于前列腺癌。目前的研究发现，P504S主要在前列腺、肾、结肠及直肠癌中有特异性表达。在结肠直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、乳头状肾细胞癌、肺癌、膀胱癌、淋巴瘤和黑色素瘤等肿瘤中均可见P504S过量表达。
P504S在临床上是一个应用意义极大的分子。随着人们对肿瘤发生、发展机制研究的不断深入，P504S越来越成为人们关注的焦点。
制备P504S抗体并将其应用于免疫组化染色，会大大提高诊断前列腺癌的准确度。目前，国内外已经获得了多种P504S的单克隆抗体，但一直以来都需要表达量更多，亲和性更好，稀释度更高，具有更多优良特性的单克隆抗体。获得活性高的P504S的单克隆抗体对于临床诊断和科学研究具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种高亲和性的、可用于科研或临床免疫组化检测P504S表达的小鼠抗人P504S单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
(1)根据P504S的基因序列(NM_001167595.1)的编码框，设计一对特异引物，TrizolReagent试剂提取人脂肪组织总RNA，将总RNA逆转录成cDNA并以cDNA为模板PCR扩增P504S基因，构建重组表达载体PET28a-P504S，转化大肠杆菌BL21感受态，IPTG诱导蛋白表达并亲和纯化蛋白作为抗原。
(2)采用经典的细胞融合技术制备P504S单克隆抗体。亲和层析纯化抗体蛋白，SDS-PAGE测定抗体纯度，直接ELISA法测定纯化抗体的滴度。
(3)通过免疫组织化学分析P504S单克隆抗体染色人前列腺癌石蜡切片。
(4)根据抗体基因的恒定区序列合成特异性引物，PCR扩增单克隆抗体P504S重链可变区和轻链可变区，回收目的片段，克隆到pGEM-T载体中，转化大肠杆菌TGl细胞后筛选阳性克隆，抽提质粒后测序确定了单克隆抗体P504S的重链和轻链可变区序列。
本发明提供的以原核表达的P504S蛋白为抗原、免疫小鼠获得的分泌P504S单克隆抗体的杂交瘤细胞株，名称为4A12，分类命名为小鼠抗人P504S杂交瘤细胞系，该细胞株4A12已于2012年11月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCCNo.6857。
本发明还提供了所述杂交瘤细胞株4A12，CGMCC No.6857产生的单克隆抗体。该抗体包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：9，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：10。
本发明还提供了一种DNA分子SEQ ID NO：7和DNA分子SEQ ID NO：8，DNA分子SEQ ID NO：7编码重链可变区氨基酸序列SEQ ID NO：9；DNA分子SEQ ID NO：8编码轻链可变区氨基酸序列SEQ ID NO：10。
本发明的优点和有益效果：
本发明应用重组人的P504S蛋白为免疫抗原，免疫Balb/c小鼠，采用经典的细胞融合技术，通过ELISA筛选，获得一株能稳定分泌抗P504S的杂交瘤细胞株，命名为4A12，亚型鉴定为IgG1，将杂交瘤细胞株扩大培养后收集上清，采用Protein A亲和层析法对P504S单抗进行纯化。SDS-PAGE结果显示，纯化后抗体纯度在95％以上；ELISA滴度测定结果显示，单抗的滴度均在1∶10000以上。人前列腺癌石蜡切片经抗P504S抗体免疫组化染色，可于光镜下观察到胞浆内呈均匀着色的棕黄色颗粒，背景清晰，无非特异性着色。从实验结果上来看，本发明制备了高效价，高特异性的P504S单克隆抗体，用该抗体检测证实，其对细胞中的P504S蛋白具有高识别能力，可用于科研或临床免疫组化检测P504S表达。
附图说明
图1SDS-PAGE分析纯化后的P504S单克隆抗体。
图2ELISA法测定P504S单克隆抗体滴度。
图3是免疫组织化学检测分析P504S单克隆抗体染色人前列腺癌石蜡切片。
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常施方法。
实施例1：杂交瘤细胞株4A12及其产生的单克隆抗体的获得
1、抗原制备
(1)获得目的基因
在该实施例中，根据P504S的基因序列(NM_001167595.1)的编码框，设计1对特异引物：
引物1：5′-TTAGGATCCATGGCACTGCAGGGCATCTC-3′(SEQ ID NO：1)
引物2：5′-GGCTCGAGTTATTTCTGGA TGTTGC-3′；(SEQ ID NO：2)
Trizol Reagent试剂提取人脂肪组织总RNA，将总RNA逆转录成cDNA并以cDNA为模板PCR扩增P504S基因。
(2)构建重组表达载体
将步骤(1)获得的PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入表达载体PET28a，构建重组质粒PET28a-P504S。
(3)获得含重组表达质粒的表达菌种
将步骤(2)获得的连接产物转化大肠杆菌BL21感受态，用含有硫酸卡那霉素的固体培养基筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确，进入下步操作。以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。
(4)诱导表达和蛋白纯化
将步骤(2)提取的质粒转化BL21感受态，用含有硫酸卡那霉素的固体培养基筛选，挑选单克隆至10ml含有硫酸卡那霉素的LB液体培养基中培养，37℃，220rpm培养10h，取5ml液体培养基转移至250ml的大瓶中继续培养，培养至OD值为0.8，加入0.2mMIPTG诱导表达，16℃诱导过夜，收集菌液超声，取上清用Ni-NTA琼脂糖亲和层析法纯化P504S蛋白。
2、单抗的制备和纯化
(1)、免疫动物
一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行三次免疫注射。
首次免疫。纯化的重组蛋白P504S(用适量生理盐水稀释)+完全弗氏佐剂，100μg/只，颈背部皮下多点注射；
二次免疫(间隔两周)。纯化的重组蛋白P504S(用适量生理盐水稀释)+不完全弗氏佐剂，100μg/只，颈背部皮下多点注射；
三次免疫(间隔两周)。纯化的重组蛋白P504S(用适量生理盐水稀释)，不完全弗氏佐剂，100μg/只，颈背部皮下多点注射；
三次免疫后7～10天采血，用建立的ELISA法检测效价，选择效价最高者用于细胞融合。
加强免疫(融合前3天)，用纯化的重组蛋白50μg腹腔注射。3天后，取脾脏融合。
(2)、细胞融合
采用眼球摘除放血法处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。将准备好的同系骨髓瘤细胞SP2/0与小鼠脾细胞按一定比例混合(1∶5～1∶10)，并加入促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。采用HAT选择性培养基，进行杂交瘤细胞的选择性培养和筛选。
用ELISA方法检测杂交瘤细胞培养上清：以纯化的P504S蛋白(10μg/ml)包被酶标板，每孔100μl，4℃包板过夜。甩掉包被液，加入200μl 5％的脱脂奶粉，37℃封闭1h后，洗涤3次，加杂交瘤细胞培养检测上清100μl(阴性对照为PBS100μl)，37℃孵育1小时。洗涤3遍后，加酶标记二抗(羊抗鼠IgG-HRP)，37℃孵育1小时，去掉酶标二抗，洗涤3遍，加底物显色剂50μl，室温静置5分钟，加终止液50μl。用酶标仪检测450nm波长处的OD值。OD值明显高于阴性对照2倍以上者定为阳性。最后筛选得到一株分泌性能最佳的抗P504S杂交瘤细胞株，命名为4A12，亚型鉴定为IgG1。
将选出的阳性杂交瘤细胞株4A12克隆化培养(有限稀释法)，获得能产生高效价单克隆抗体的杂交瘤细胞克隆。将杂交瘤细胞株扩大培养，并冻存保种。所述的阳性杂交瘤细胞为抗人P504S杂交瘤细胞系4A12，该细胞系已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.6857。
(3)单克隆抗体的大量制备与纯化
将步骤(2)获得的细胞株4A12接种至Balb/c小鼠腹腔，制备腹水，然后从腹水中提取抗体。
单克隆抗体P504S的纯化：采用Protein A亲和层析法。首先制备protein A亲和柱，用PBS平衡柱子后，取抗P504S的腹水过柱，然后用PBS洗至OD值接近于零，以50mmol/LPH2.5的甘氨酸-HCl溶液(PH)洗脱，收集峰值区的洗脱液，经透析浓缩后备用。SDS-PAGE结果显示，纯化后抗体纯度在95％以上(参见图1)。
(4)直接ELISA法测定纯化抗体的滴度
以纯化的P504S蛋白(10μg/ml)包被酶标板，每孔100μl，4℃包板过夜。甩掉包被液，加入200μl 5％的脱脂奶粉，37℃封闭1h后，洗涤3次，将纯化的抗体按1∶200，1∶400，1∶800，1∶1600，1∶3200，1∶6400，1∶12800进行稀释，以每孔100μl加入酶标板中(阴性对照为PBS100μl)，37℃孵育1小时。洗涤3遍后，加酶标记二抗(羊抗鼠IgG-HRP)， 37℃孵育1小时，去掉酶标二抗，洗涤3遍，加底物显色剂50μl，室温静置5分钟，加终止液50μl。用酶标仪检测450nm波长处的OD值。ELISA滴度测定结果显示，单抗的滴度均在1∶10000以上(参见图2)。
实施例2：单克隆抗体免疫组化应用检测
用P504S单抗，按常规法作病理切片，对人前列腺癌石蜡切片进行免疫组化染色。
具体方法为：
(1)脱蜡
切片依次置于二甲苯I、II、III脱蜡每次5分钟，移至无水乙醇I、II中各浸泡4分钟，移至95％酒精中浸泡4分钟，移至85％酒精中浸泡4分钟，再移至70％酒精中浸泡4分钟，流水冲洗2分钟。
(2)抗原修复
将已冲洗干净组织切片放入高压锅内，加入约3000ml左右的柠檬酸盐抗原修复液(pH6.0)，高火加热煮沸后调至低火保持沸腾喷气3分钟，关掉电磁炉开关，两分钟后将高压锅移至冷水中冷却，待高压锅内抗原修复液完全冷却后，打开高压锅将组织切片用流水冲洗干净移至蒸馏水中浸泡2分钟。
(3)阻断
3％H2O2中浸泡10分钟，流水冲洗蒸馏水冲洗。取出切片，擦干组织周围的水，用免疫组化笔在组织块周围画一圆圈注意圈接头要接好，防止抗体跑出圈外造成假阴性。PBS缓冲液冲洗。
(4)滴加一抗
甩去待测组织切片上多余的PBS，滴加一抗，其中一抗为实施例1步骤(3)制备并纯化的P504S单克隆抗体，稀释度为1∶1500。放置在孵育盒内4℃冰箱中过夜孵育约12小时。
(5)滴加二抗
将孵育盒从冰箱取出，恢复至室温后取出切片，用PBS洗3次，每次5分钟。滴加通用型二抗-HRP聚合物。将切片放入孵育湿盒中，盖上盖子，连孵育盒一起放入37℃恒温箱中孵育30分钟。
(6)显色、衬染、封片
取出切片，擦掉组织周围的多余的PBS，加入DAB显色液中显色3～5分钟，在显微镜下控制染色的强度。待强度适中后将切片置自来水中终止显色，再用流水冲洗5-10分钟，苏木素染液复染1分钟，0.5％盐酸酒精分化3秒钟，流水冲洗5-10分钟，脱水、透明、封片、镜检。
结果判定：按照国外学者对组织中P504S的判定标准，P504S蛋白阳性反应为出现明显棕黄色颗粒，定位于细胞浆。人前列腺癌组织(参见图3)经抗P504S抗体免疫组化染 色，可于光镜下观察到胞浆内呈均匀着色的棕黄色颗粒，背景清晰，无非特异性着色。，说明此P504S小鼠单克隆抗体可以特异性的应用于免疫组织化学实验。
实施例3：单克隆抗体可变区测序
根据抗体基因的恒定区序列合成以下引物：
zh08 5′-GGGGATATCCACCATGRACTTCGGGYTGAGCTKGGTTTT-3′(SEQID NO：3)
zhr11 5′-GACHGATGGGGSTGTYGTGCTAGCTGNRGAGACDGTGA-3′(SEQIDNO：4)
zl01 5′-GGGGATATCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTAT-3′(SEQ lDNO：5)
zlr05 5′-GGATACAGTTGGTGCAGTCGACTTACGTTTKATTTCCARCTT-3′(SEQID NO：6)
Trizol Reagent试剂分别提取5×106杂交瘤细胞4A12的总RNA，将总RNA逆转录成cDNA。用zh08和zhr11为引物进行PCR扩增单克隆抗体P504S重链可变区，用zl01和zlr05为引物进行PCR扩增单克隆抗体P504S轻链可变区，PCR反应均采用热启动，反应条件：94℃5分钟；94℃45秒，60℃45秒，72℃1分10秒，30个循环；72℃7分钟。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后回收纯化目的片段(轻链长度391bp，重链长度420bp)。克隆到pGEM-T(Promega)载体中，转化大肠杆菌TGl细胞后在IPTGIX-gal平板上进行筛选，取白色菌斑接种于含有氨韦青霉素的LB液体培养基中扩增。筛选阳性克隆，用QIAGEN的质粒抽提试剂盒抽提质粒并进行测序，确定了单克隆抗体P504S的重链和轻链可变区序列。
单克隆抗体P504S可变区的DNA序列和氨基酸序列：
单克隆抗体P504S重链可变区DNA序列(5′→3′，377bp)(SEQ ID NO：7)；
单克隆抗体P504S的轻链可变区DNA序列(5′→3′，391bp)(SEQ lD NO：8)；
单克隆抗体P504S重链可变区的推断氨基酸序列(125氨基酸)(SEQ ID NO：9)；
单克隆抗体P504S轻链可变区的推断氨基酸序列(130氨基酸)(SEQ 10ID NO：10)。
Claims (2)
1.一种以原核表达的P504S蛋白免疫小鼠获得的分泌P504S单克隆抗体的杂交瘤细胞株4A12，保藏编号为CGMCC No.6857。
2.根据权利要求1所述的杂交瘤细胞株4A12产生的重链可变区氨基酸序列为SEQID NO：9，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：10的免疫球蛋白。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210528285.7A CN103173414B (zh) | 2012-12-07 | 2012-12-07 | 小鼠抗人p504s单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210528285.7A CN103173414B (zh) | 2012-12-07 | 2012-12-07 | 小鼠抗人p504s单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103173414A CN103173414A (zh) | 2013-06-26 |
| CN103173414B true CN103173414B (zh) | 2015-04-22 |
Family
ID=48633606
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201210528285.7A Expired - Fee Related CN103173414B (zh) | 2012-12-07 | 2012-12-07 | 小鼠抗人p504s单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103173414B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117624370B (zh) * | 2024-01-12 | 2024-09-13 | 武汉爱博泰克生物科技有限公司 | 人amacr的单克隆抗体及应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101077886A (zh) * | 2006-05-25 | 2007-11-28 | 上海普洛康裕药物研究院有限公司 | 重组蛋白amacr及其在制备前列腺癌诊断标记物上的应用 |
-
2012
- 2012-12-07 CN CN201210528285.7A patent/CN103173414B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101077886A (zh) * | 2006-05-25 | 2007-11-28 | 上海普洛康裕药物研究院有限公司 | 重组蛋白amacr及其在制备前列腺癌诊断标记物上的应用 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| A Variant of the Alpha-Methyl-Acyl-CoA Racemase Gene Created by a Deletion in Exon 5 and its Expression in Prostate Cancer;James N. Mubiru et al;《The Prostate》;20050502;第65卷(第2期);117-123 * |
| Comparative analysis of three- and two-antibody cocktails to AMACR and basal cell markers for the immunohistochemical diagnosis of prostate carcinoma;Parag Deepak Dabir et al;《Diagnostic Pathology》;20120716;第7卷;1-6 * |
| siRNA蛋白抑制对LNCaP细胞增殖的影响作用;季涌 等;《中华泌尿外科杂志》;20060430;第27卷(第supp1期);63-66 * |
| 一种特异性强的兔抗人AMACR蛋白单克隆抗体的制备;许超 等;《细胞·生命·健康——第十一届中国细胞生物学学术大会暨2009西安细胞生物学国际会议论文集》;20091231;268 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103173414A (zh) | 2013-06-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103923214B (zh) | 抗肝癌干细胞单克隆抗体及其应用 | |
| CN108467432A (zh) | 抗E-cadherin蛋白的单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用 | |
| CN103173413A (zh) | 小鼠抗人β-Catenin单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株 | |
| CN102634486A (zh) | Gpc3单克隆抗体杂交瘤细胞株7d11及其制备方法和应用 | |
| CN113072642B (zh) | 抗oct3/4蛋白单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用 | |
| CN101463344B (zh) | 抗人Her2单克隆抗体杂交瘤细胞系、单克隆抗体、试剂盒及其用途 | |
| CN110903389A (zh) | 抗gfap蛋白单克隆抗体、细胞系及其制备方法和应用 | |
| CN102634487B (zh) | Gpc3单克隆抗体杂交瘤细胞株8g6及其制备方法和应用 | |
| CN104894074B (zh) | 分泌s100a9单克隆抗体的杂交瘤细胞株、单克隆抗体及其应用 | |
| CN105646705A (zh) | 小鼠抗人gfap单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株 | |
| CN103173414B (zh) | 小鼠抗人p504s单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株 | |
| CN109485724A (zh) | 抗Desmin蛋白单克隆抗体、细胞系及其制备方法和应用 | |
| CN103289962B (zh) | 小鼠抗人cd23单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株 | |
| CN105646711A (zh) | 小鼠抗人ck8单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株 | |
| CN103173412B (zh) | 小鼠抗人cd20单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株 | |
| CN103173417B (zh) | 小鼠抗人cea单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株 | |
| CN103173416A (zh) | 小鼠抗人ck19单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株 | |
| CN108034638A (zh) | 小鼠抗人Desmin单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株 | |
| CN110256562A (zh) | Pd-1纳米抗体、制备方法及其应用 | |
| CN106754740A (zh) | 小鼠抗人mdr‑1单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株 | |
| CN101759781B (zh) | 一种细菌表层黏附蛋白及其用途 | |
| CN102776154A (zh) | 小鼠抗人β-Tubulin单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株 | |
| CN104610441A (zh) | 用于制备磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(gpc3)单抗的人工半抗原、制备方法及获得的单克隆抗体 | |
| CN103173418B (zh) | 小鼠抗人pcna单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株 | |
| CN103173415A (zh) | 小鼠抗人egfr单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C56 | Change in the name or address of the patentee |
Owner name: TIANJIN SUNGENE BIOTECH CO., LTD. Free format text: FORMER NAME: TIANJIN SUNGENE BIOTECHNOLOGY CO., LTD. |
|
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder |
Address after: 300457, Tianjin Binhai New Area Tanggu economic and Technological Development Zone Fourth Avenue 80 days big science and Technology Park C5-106/311 Patentee after: TIANJIN SUNGENE BIOTECH Co.,Ltd. Address before: 300457, Tianjin Binhai New Area Tanggu economic and Technological Development Zone Fourth Avenue 80 days big science and Technology Park C5-106/311 Patentee before: TIANJIN SUNGENE BIOTECH Co.,Ltd. |
|
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: Mouse anti-human P504S monoclonal antibody and hybridoma cell strain for secreting monoclonal antibody Effective date of registration: 20170508 Granted publication date: 20150422 Pledgee: Zheshang Bank, Limited by Share Ltd, Tianjin branch Pledgor: TIANJIN SUNGENE BIOTECH CO.,LTD. Registration number: 2017120000022 |
|
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| DD01 | Delivery of document by public notice | ||
| DD01 | Delivery of document by public notice |
Addressee: Liu Chen Document name: payment instructions |
|
| DD01 | Delivery of document by public notice | ||
| DD01 | Delivery of document by public notice |
Addressee: Liu Chen Document name: Patent termination notice |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20150422 Termination date: 20211207 |