CN104316684A - 一种用于检测宫颈癌的量子点免疫荧光试剂盒 - Google Patents

一种用于检测宫颈癌的量子点免疫荧光试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN104316684A
CN104316684A CN201410538564.0A CN201410538564A CN104316684A CN 104316684 A CN104316684 A CN 104316684A CN 201410538564 A CN201410538564 A CN 201410538564A CN 104316684 A CN104316684 A CN 104316684A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cervical carcinoma
quantum dot
kit
solution
quantum
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201410538564.0A
Other languages
English (en)
Inventor
许恒毅
傅芬
叶称连
聂丽菊
张婉怡
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanchang University
Original Assignee
Nanchang University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanchang University filed Critical Nanchang University
Priority to CN201410538564.0A priority Critical patent/CN104316684A/zh
Publication of CN104316684A publication Critical patent/CN104316684A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57411—Specifically defined cancers of cervix
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明提供一种用于检测宫颈癌的量子点免疫荧光试剂盒。试剂盒中的主要成分包括能够特异性识别宫颈癌细胞上p16抗原的单克隆抗体p16INK4A，生物素化兔抗鼠IgG，及量子点标记的链霉亲和素复合物，以及连接试剂等。量子点标记的链霉亲和素复合物，可以很好地识别生物素-p16抗原抗体复合物从而形成能够靶向结合宫颈癌细胞的特异性探针，而不与不表达P16抗原的细胞结合。未连接单克隆抗体p16INK4A的量子点与宫颈癌细胞不结合或结合很少。本发明提供的这种试剂盒，在宫颈癌诊断中有应用前景。

Description

一种用于检测宫颈癌的量子点免疫荧光试剂盒
技术领域
本发明属于生物医学领域，涉及一种用于检测宫颈癌的量子点免疫荧光试剂盒，适用于宫颈癌细胞与组织抗原的准确、定量检测以及QD-SA复合物应用中的质量控制，还涉及该试剂盒在定量检测宫颈癌细胞与组织中抗原中的用途。
背景技术
宫颈癌是目前严重威胁女性健康的妇科恶性肿瘤，其发病呈日益年轻化且发病率有逐年上升趋势。有数据统计，全世界每年约有宫颈癌新发病例50万，约有2313万妇女死于该病，其中80%的新发病例是发生在发展中国家，而我国每年宫颈癌新发病例约占全世界发病人数的1/3。因此，提高宫颈癌的早期诊断水平对于宫颈癌的预后有重要意义。传统的宫颈癌诊断方法包括影像学检查（如阴道镜检查）、实验室检查（如肿瘤标志物测定、细胞学检查及HPV检测等）和病理组织活检（如宫颈锥切及宫颈组织活检等）。传统检查方法固然有其实用性，但也存在弊端，因此，建立新的诊断和筛查技术对降低宫颈癌的死亡率至关重要。
量子点是近年发展起来的一种新型纳米发光粒子，相对于传统染料，它具有荧光强度高、荧光寿命长、抗光漂白能力强、激发波谱宽、发射波谱窄及可同时激发多重荧光等独特的光学特性。这些特性使其在生物医学领域，尤其是作为一种新型标记物应用于肿瘤的分子病理及体外成像诊断方面，应用十分广泛。QDs对宫颈癌的检测是通过构建特异性探针来实现的，即QDs与单个抗体、多肽或者其他生物小分子结合，制成高品质的荧光QD探针，靶向结合单个肿瘤细胞，从而实现宫颈癌的早期诊断。
p16基因是一种多肿瘤抑制基因，是人们发现的第一个直接作用于细胞周期，抑制细胞分裂的基因。研究表明，p16基因的缺失、突变和甲基化存在于多种人肿瘤细胞，提示其与肿瘤的发生、发展有着密切的关系。在对p16的进一步研究中，人们用免疫组织化学的方法检测p16蛋白后发现，在90％以上的宫颈癌病例中存在p16蛋白的高表达，且会随着宫颈癌病情的发生发展而呈现逐渐升高的趋势，但在正常细胞内无表达。因此，P16可作为宫颈癌特异性检测的靶向目标，通过构建量子点-链霉亲和素系统-生物素-抗原抗体复合物特异性靶向探针，进而实现宫颈癌的早期检测。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种用于检测宫颈癌的量子点免疫荧光试剂盒，并提供上述量子点试剂盒的用途。该试剂盒可与目前用于检测宫颈癌细胞与组织抗原的生物素化抗体相结合，可以达到快速、经济、灵敏、高效而准确地对肿瘤抗原进行检测。
本发明解决上述技术问题所采取的技术方案是：一种用于检测宫颈癌的量子点免疫荧光试剂盒，其特征是：该试剂盒包括 a）固定液，b）渗透液，c）洗涤液，d）封闭液，e）单克隆抗体P16INK4A，f）生物素-兔抗鼠IgG复合物，g）量子点（QDs）标记的链霉亲和素（SA）复合物探针；采用水溶性CdSe/ZnS核壳型量子点标记的链霉亲和素复合物作为荧光探针，与检测宫颈癌细胞上的生物素化抗原抗体复合物结合，从而间接标记并检测宫颈癌细胞上的P16抗原。所述的固定液是0.01M pH 7.6 TBS缓冲液，与多聚甲醛溶液按体积百分比100：4配制。渗透液是0.01M pH 7.6 TBS缓冲液，与吐温-20按体积百分比100：0.1配制。洗涤液是0.01M pH 7.6 TBS缓冲液，与牛血清白蛋白BSA按质量百分比100：1配制。封闭液是0.02M pH 7.6 TBS缓冲液，与正常兔血清按体积百分比100：10，并与牛血清白蛋白BSA按质量百分比100：5配制。
所述的单克隆抗体P16IN4A在宫颈癌细胞上对应的受体呈高表达（达90%以上），而在其他正常细胞上呈低表达。所述的量子点为CdSe、CdTe、CdSe/ZnS、CdTe/ZnS、CdTe/CdSe、InP、InAs、InGaAs、InGaP、InGaP/ZnS 中的一种纳米粒子或任意几种纳米粒子的组合。
所述的生物素-兔抗鼠IgG复合物制备方法如下：
（1）取15 mg 生物素，3.6 mg N-羟基丁二酰亚胺（NHSS），2.4 mg 乙基3-（3-二甲氨基）碳二亚胺盐酸盐（EDC）溶解于2 mL 0.02 M pH 6.5 PBS缓冲液中；
（2）将5.3 mg兔抗鼠IgG抗体加入到上述溶液中，室温置于混匀仪上搅拌30 min；
（3）将上述溶液减压旋干溶剂，去离子水溶解，在PBS和去离子水中透析1 d；透析结束将得到的溶液置于-20℃储存。
 所述的QD-SA复合物制备方法如下：
（1）取200μL量子点（浓度为8.3μM），采用活泼酯法，按照摩尔比1:500分别加入0.166mgEDC及0.166mgNHS，溶于300μL pH 5.5的硼酸盐缓冲液，室温反应5-10min；
（2）调整溶液pH到8-8.5，按摩尔比40:1加入4.38mg SA，持续混匀2h后，加入终浓度为2%的氨基葡萄糖反应45min终止反应；
（3）偶联所得量子点标记的SA复合物10000r·min-1，离心5min，除去少量沉淀后，用pH 7硼酸盐缓冲液在100K超滤管中洗涤（10倍体积交换），最后重悬于0.2mL pH 7的硼酸盐缓冲液中。步骤2中的氨基葡萄糖，分子式为C6H13O5N，可通过其上的氨基封闭偶联产物中量子点表面残留的羧基，减少偶联产物对肿瘤组织及细胞的非特异性吸附。
针对上述的量子点试剂盒的用途，用于检测宫颈癌细胞，具体步骤如下：
（1）获取对数期生长的HeLa细胞，种植于96孔板内，约1x104个/孔细胞，于37℃、5% CO2培养箱内孵育24h，保证90%以上细胞贴壁；
（2）洗涤液冲洗3次，采用固定液在常温下固定细胞15min，立即用洗涤液冲洗3次；
（3）用渗透液常温下渗透细胞20min，洗涤液冲洗3次后用封闭液封闭细胞上的非特异性结合位点1h；
（4）除去封闭液，加入适量单克隆抗体P16INK4A与细胞在常温下共孵育2h；
（5）洗涤液冲洗3次（每次5min）后，加入生物素化-兔抗鼠IgG复合物与细胞在常温下共孵育1h，用洗涤液冲洗3次（每次5min）；
（6）加入适量QD-SA复合物反应30min，冲洗3次脱去背景色，后立即在倒置荧光显微镜下观察荧光信号并通过荧光信号采集系统进行定量分析。
 针对上述的量子点试剂盒的用途，用于检测宫颈癌石蜡包埋组织，具体步骤如下：
（1）临床常规宫颈癌石蜡包埋组织，按常规免疫组化要求切片，并将切片脱蜡水化，按照待测抗原的要求进行抗原修复；
（2）清洗液冲洗3次，蒸馏水冲洗。用含3%H2O2的渗透液常温下渗透细胞20min，洗涤液冲洗3次后用封闭液封闭组织切片上非特异性结合位点1h；
（3）除去封闭液，加入适量单克隆抗体P16INK4A与细胞在常温下共孵育2h；
（4）洗涤液冲洗3次（每次5min）后，加入生物素化-兔抗鼠IgG复合物与细胞在常温下共孵育1h，用洗涤液冲洗3次（每次5min）；
（5）加入适量QD-SA复合物反应30min，冲洗3次脱去背景色，后立即在倒置荧光显微镜下观察荧光信号并通过荧光信号采集系统进行定量分析，之后用树脂封片保存。
本发明技术原理见图1，采用本发明技术方案具有如下有益效果：
1、本发明借助了生物素-连霉亲和素系统的信号放大效应，将量子点荧光信号成倍放大，在较低的肿瘤抗原表达量下也能实现肿瘤细胞的检测；
2、本方案为将抗体分子与生物素偶联，避免了常规方法中将抗体分子偶联于量子点表面导致抗体活性降低和空间位阻大的缺点；
3、相对于传统肿瘤细胞组织免疫染色的方法，量子点因其自身独特的光学性质，使得免疫荧光信号强度高、持续时间长，且结果容易保存及反复观察；
4、本发明在制备QD-SA过程中，引入氨基葡萄糖，通过其上的氨基封闭偶联产物中量子点表面残留的羧基，一方面，中和了偶联产物表面所带电荷，另一方面，封闭羧基转变为中性的羟基，降低了QD-SA偶联物的表面ζ电位，可提高偶联产物的回收效率，同时减少偶联产物对肿瘤组织及细胞的非特异性吸附，降低背景效应；
5、本发明操作简单，易于标准化，外界影响因素相对较小，重复性好，结果判断便利，且可通过采集荧光信号来达到荧光强度定量分析，间接反映肿瘤组织或细胞上抗原的表达情况。
附图说明
图1 常规量子点免疫荧光检测肿瘤原理（A），本发明所涉及量子点免疫荧光检测肿瘤原理（B）；
图2 量子点试剂盒体外检测宫颈癌HeLa细胞图；（A）使用生物素-链霉亲和素信号放大系统的HeLa细胞量子点成像图；（B）不使用生物素-链霉亲和素系统，传统HeLa细胞量子点成像图；（C）不加一抗处理，使用未处理（即不与氨基葡萄糖反应）量子点染色的HeLa细胞非特异性成像图；（D）不加一抗处理，使用氨基葡萄糖处理量子点后的HeLa细胞非特异性染色图；（E）量子点试剂盒体外染色肺癌A549细胞图；标尺：20μm；
图3  量子点试剂盒体外检测宫颈癌石蜡组织切片图及IHC、HE染色图；（A）使用生物素-链霉亲和素信号放大系统的宫颈癌量子点组织成像图及IHC、HE染色图，（B）不使用生物素-链霉亲和素系统，传统宫颈癌量子点组织成像图及IHC、HE染色图；（C）对照组，不加一抗后的量子点、IHC及HE染色图，（D）对照组，量子点试剂盒体外检测健康宫颈石蜡组织切片图及IHC、HE染色图。标尺：100μm。
具体实施方式
为了使本发明更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1  用检测宫颈癌的量子点免疫荧光试剂盒在体外检测宫颈癌HeLa细胞上的应用
运用本发明的技术方案，分别制备生物素化的抗体复合物及量子点标记的链霉亲和素复合物，用于特异性靶向结合肿瘤组织或细胞上的抗原。
长链生物素为购买于美国Thermo Fisher Scientific 公司羧基化长链生物素（产品号：21327）。
羧基功能化的量子点QD550（绿色荧光，9nm）购买于美国Ocean公司。
所述的固定液是0.01M pH 7.6 TBS缓冲液，与多聚甲醛溶液按体积百分比100：4配制。
渗透液是0.01M pH 7.6 TBS缓冲液，与吐温-20按体积百分比100：0.1配制。
洗涤液是0.01M pH 7.6 TBS缓冲液，与牛血清白蛋白BSA（BIOSHARP公司）按质量百分比100：1配制。
封闭液是0.02M pH 7.6 TBS缓冲液，与正常兔血清（武汉BOSTER公司）按体积百分比100：10，并与牛血清白蛋白BSA按质量百分比100：5配制。
1、按照如下步骤制备生物素-兔抗鼠IgG复合物:
（1）取15 mg 生物素（华蓝化学公司），3.6 mg N-羟基丁二酰亚胺（NHSS），2.4 mg 乙基3-（3-二甲氨基）碳二亚胺盐酸盐（EDC）（美国Sigma-Aldrich公司）溶解于2 mL 0.02 M pH 6.5 PBS缓冲液中；
（2）将5.3 mg兔抗鼠IgG抗体（武汉BOSTER公司）加入到上述溶液中，室温置于混匀仪上搅拌30 min；
（3）将上述溶液减压旋干溶剂，去离子水溶解，在PBS和去离子水中透析1 d；透析结束将得到的溶液置于-20℃储存。
 2、按照如下步骤制备QD-SA复合物：
（1）取200μL8.3μM量子点，采用活泼酯法，按照摩尔比1:500分别加入0.166mgEDC及0.166mgNHS，溶于300μL pH 5.5的硼酸盐缓冲液，室温反应5-10min；
（2）调整溶液pH到8-8.5，按摩尔比40:1加入4.38mg SA（华蓝化学公司），持续混匀2h后，加入终浓度为2%的氨基葡萄糖反应45min终止反应；
（3）偶联所得量子点标记的SA复合物10000r·min-1，离心5min，除去少量沉淀后，用pH 7硼酸盐缓冲液在100K超滤管中洗涤（10倍体积交换），最后重悬于0.2mL pH 7的硼酸盐缓冲液中。
     3、实验组：获取对数期生长的HeLa细胞（江西省南昌大学第一附属医院实验中心馈赠），种植于96孔板内，约1x104个/孔细胞，于37℃、5% CO2培养箱内孵育24h，保证90%以上细胞贴壁。洗涤液冲洗3次，采用固定液在常温下固定细胞15min，立即用洗涤液冲洗3次。用渗透液常温下渗透细胞20min，洗涤液冲洗3次后用封闭液封闭细胞上的非特异性结合位点1h。除去封闭液，加入适量单克隆抗体P16INK4A（中杉金桥公司）与细胞在常温下共孵育2h。洗涤液冲洗3次（每次5min）后，加入生物素化-兔抗鼠IgG复合物与细胞在常温下共孵育1h，用洗涤液冲洗3次（每次5min）。加入适量QD-SA复合物反应30min，冲洗3次脱去背景色，后立即在倒置荧光显微镜（Nikon公司）下观察荧光信号并通过荧光信号采集系统进行定量分析。每组重复3次。
     4、对照组：做四组对照组，取相同量的HeLa细胞种植于96孔板内，前期处理同实验组，第一组为不使用生物素-链霉亲和素系统，直接用QD-IgG对孵育了一抗的HeLa细胞进行染色；第二组为细胞内不加入单克隆抗体P16INK4A，而使用相同体积相同浓度的1XPBS液替代，同时使用未用氨基葡萄糖处理的QD-SA对HeLa细胞进行染色，余处理同实验组；第三组为细胞内不加入单克隆抗体P16INK4A，而使用相同体积相同浓度的1XPBS液替代，同时使用氨基葡萄糖处理过的QD-SA对HeLa细胞进行染色，余处理同实验组；第四组则另取相同数量的肺癌A549细胞作为另一组对照，所有处理都与实验组相同。
     5、结果：结果发现使用了本发明生物素-链霉亲和素信号放大系统的HeLa细胞每一个都有高强度的绿色荧光（图2A），而未使用生物素-链霉亲和素信号放大系统的HeLa细胞荧光强度明显更暗（图2B），未加单克隆抗体P16INK4A处理的HeLa细胞见明显更少或者无绿色荧光（图2C、2D），但是使用了氨基葡萄糖处理组七非特异性染色明显较弱（图2D），肺癌A549细胞只有比较少且暗的绿色荧光，多数没有绿色荧光（图2E）。可见本发明提供的量子点试剂盒能够很好地识别表达p16的宫颈癌细胞，在宫颈癌检测上具有很高的应用价值。
实施例2  用检测宫颈癌的量子点免疫荧光试剂盒在体外检测宫颈癌石蜡包埋组织的应用
     1、按照如下步骤制备生物素-兔抗鼠IgG复合物:
（1）取15 mg 生物素，3.6 mg N-羟基丁二酰亚胺（NHSS），2.4 mg 乙基3-（3-二甲氨基）碳二亚胺盐酸盐（EDC）溶解于2 mL 0.02 M pH 6.5 PBS缓冲液中；
（2）将5.3 mg兔抗鼠IgG抗体加入到上述溶液中，室温置于混匀仪上搅拌30 min；
（3）将上述溶液减压旋干溶剂，去离子水溶解，在PBS和去离子水中透析1 d；透析结束将得到的溶液置于-20℃储存。
 2、按照如下步骤制备QD-SA复合物：
（1）取200μL 8.3μM量子点，采用活泼酯法，按照摩尔比1:500分别加入0.166mgEDC及0.166mgNHS，溶于300μL pH 5.5的硼酸盐缓冲液，室温反应5-10min；
（2）调整溶液pH到8-8.5，按摩尔比40:1加入4.38mg SA，持续混匀2h后，加入终浓度为2%的氨基葡萄糖反应45min终止反应；
（3）偶联所得量子点标记的SA复合物10000r·min-1，离心5min，除去少量沉淀后，用pH 7硼酸盐缓冲液在100K超滤管中洗涤（10倍体积交换），最后重悬于0.2mL pH 7的硼酸盐缓冲液中。
 3、实验组：临床常规宫颈癌石蜡包埋组织，按常规免疫组化要求切片，并将切片脱蜡水化，按照待测抗原的要求进行抗原修复。清洗液冲洗3次，蒸馏水冲洗。用含3%H2O2的渗透液常温下渗透细胞20min，洗涤液冲洗3次后用封闭液封闭组织切片上非特异性结合位点1h。除去封闭液，加入适量单克隆抗体P16INK4A与组织在常温下共孵育2h。洗涤液冲洗3次（每次5min）后，加入生物素化-兔抗鼠IgG复合物与组织在常温下共孵育1h，用洗涤液冲洗3次（每次5min）。加入适量QD-SA复合物反应30min，冲洗3次脱去背景色，后立即在倒置荧光显微镜下观察荧光信号并通过荧光信号采集系统进行定量分析，之后用树脂封片保存。每组重复3次。
     4、对照组：做三组对照组，临床常规宫颈癌石蜡包埋组织，前期处理同实验组，第一组为不使用生物素-链霉亲和素系统，直接用QD-IgG对孵育了一抗的宫颈癌组织进行染色；第二组为不加入单克隆抗体P16INK4A，而使用相同体积相同浓度的1XPBS液替代，余处理同实验组。第三组则另取临床常规处理正常宫颈组织石蜡包埋组织作为另一组对照，所有处理都与实验组相同。
5、结果：通过荧光显微镜成像，可观察到宫颈癌P16抗原的体外标记成像，宫颈癌组织结构和抗原分布清晰，与原始IHC和HE染色对比可看到量子点对P16的识别部位一致（图3A）；而不使用生物素-链霉亲和素系统组其荧光强度明显更弱（图3B）；对照组中不加单克隆抗体P16INK4A组，可见视野内没有出现明显的QDs绿色荧光（图3C），且对照组中正常宫颈组织也未见明显绿色荧光（图3D），证实量子点试剂盒对宫颈癌组织成像的高度特异性及有效性。
实施例3 利用本发明试剂盒检测实际患者是否为宫颈癌患者的具体实施过程
本发明用于检测宫颈癌的量子点免疫荧光试剂盒，包括 a）固定液，b）渗透液，c）洗涤液，d）封闭液，e）单克隆抗体P16INK4A，f）生物素-兔抗鼠IgG复合物，g）量子点（QDs）标记的链霉亲和素（SA）复合物探针即QD-SA；
所述的固定液是0.01M pH 7.6 三羟基氨基甲烷-盐酸（TBS）缓冲液，与多聚甲醛溶液按体积百分比100：4配制；
所述的渗透液是0.01M pH 7.6 TBS缓冲液，与吐温-20按体积百分比100：0.1配制；
所述的洗涤液是0.01M pH 7.6 TBS缓冲液，与牛血清白蛋白BSA按质量百分比100：1配制；
所述的封闭液是0.02M pH 7.6 TBS缓冲液，与正常兔血清按体积百分比100：10，并与牛血清白蛋白BSA按质量百分比100：5配制；
羧基功能化的量子点QD550（绿色荧光，9nm）购买于美国Ocean公司。
1、按照如下步骤制备生物素-兔抗鼠IgG复合物:
（1）取15 mg 生物素，3.6 mg N-羟基丁二酰亚胺（NHSS），2.4 mg 乙基3-（3-二甲氨基）碳二亚胺盐酸盐（EDC）溶解于2 mL 0.02 M pH 6.5 PBS缓冲液中；
（2）将5.3 mg兔抗鼠IgG抗体加入到上述溶液中，室温置于混匀仪上搅拌30 min；
（3）将上述溶液减压旋干溶剂，去离子水溶解，在PBS和去离子水中透析1 d；透析结束将得到的溶液置于-20℃储存。
 2、按照如下步骤制备QD-SA复合物：
（1）取200μL 8.3μM量子点，采用活泼酯法，按照摩尔比1:500分别加入0.166mgEDC及0.166mgNHS，溶于300μL pH 5.5的硼酸盐缓冲液，室温反应5-10min；
（2）调整溶液pH到8-8.5，按摩尔比40:1加入4.38mg SA，持续混匀2h后，加入终浓度为2%的氨基葡萄糖反应45min终止反应；
（3）偶联所得量子点标记的SA复合物10000r·min-1，离心5min，除去少量沉淀后，用pH 7硼酸盐缓冲液在100K超滤管中洗涤（10倍体积交换），最后重悬于0.2mL pH 7的硼酸盐缓冲液中。
3、实验组：收集临床上宫颈癌组织20例及正常宫颈组织15例，都由医院有经验病理科医生证实以后的组织。每个组织由病理科医生分别作成至少3张切片，厚度为4μm，分别采用3种方式对这些组织进行染色，一种为本发明所涉及的量子点试剂盒对其进行染色，一种为不是使用生物素-链霉亲和素信号放大系统对其进行染色，另一种则是传统的免疫组化染色，具体实施过程同实施例2。
4、结果：显示采用生物素-链霉亲和素信号放大系统对于宫颈癌的检测明显有更高的灵敏度及特异性，且相对于传统的免疫组化，量子点检测试剂盒有简便、快速、灵敏度高等优势。
                  表 1 不同染色方式对宫颈癌检测的效率比较
(a) 病理（+) 病理（-)
QD-SA染色（+） 20 3
QD-SA 染色（-） 0 12
总数    20 15
灵敏度           100%  
特异度             80%  
(b) 病理（+) 病理（-)
QD-IgG染色（+） 18 3
QD-IgG 染色（-） 2 12
总数    20 15
灵敏度           90%  
特异度             80%  
(c) 病理（+) 病理（-)
IHC（+） 16 5
IHC（-） 4 10
总数    20 15
灵敏度           80%  
特异度             67%  
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种用于检测宫颈癌的量子点免疫荧光试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括 a）固定液，b）渗透液，c）洗涤液，d）封闭液，e）单克隆抗体P16INK4A，f）生物素-兔抗鼠IgG复合物，g）量子点（QDs）标记的链霉亲和素（SA）复合物探针即QD-SA。
2.根据权利要求1所述的用于检测宫颈癌的量子点免疫荧光试剂盒，其特征在于：所述的固定液是0.01M pH 7.6 三羟基氨基甲烷-盐酸（TBS）缓冲液，与多聚甲醛溶液按体积百分比100：4配制。
3.根据权利要求1所述的用于检测宫颈癌的量子点免疫荧光试剂盒，其特征在于：所述的渗透液是0.01M pH 7.6 TBS缓冲液，与吐温-20按体积百分比100：0.1配制。
4.根据权利要求1所述的用于检测宫颈癌的量子点免疫荧光试剂盒，其特征在于：所述的洗涤液是0.01M pH 7.6 TBS缓冲液，与牛血清白蛋白BSA按质量百分比100：1配制。
5.根据权利要求1所述的用于检测宫颈癌的量子点免疫荧光试剂盒，其特征在于：所述的封闭液是0.02M pH 7.6 TBS缓冲液，与正常兔血清按体积百分比100：10，并与牛血清白蛋白BSA按质量百分比100：5配制。
6.根据权利要求1所述的用于检测宫颈癌的量子点免疫荧光试剂盒，其特征在于：所述的量子点为CdSe、CdTe、CdSe/ZnS、CdTe/ZnS、CdTe/CdSe、InP、InAs、InGaAs、InGaP、InGaP/ZnS 中的一种或任意几种纳米粒子的组合。
7.根据权利要求1所述的用于检测宫颈癌的量子点免疫荧光试剂盒，其特征在于：所述的生物素-兔抗鼠IgG复合物制备方法如下：
（1）取15 mg 生物素，3.6 mg N-羟基丁二酰亚胺（NHSS），2.4 mg 乙基3-（3-二甲氨基）碳二亚胺盐酸盐（EDC）溶解于2 mL 0.02 M pH 6.5 PBS缓冲液中；
（2）将5.3 mg兔抗鼠IgG抗体加入到上述溶液中，室温置于混匀仪上搅拌30 min；
（3）将上述溶液减压旋干溶剂，去离子水溶解，在PBS和去离子水中透析1 d；透析结束将得到的溶液置于-20℃储存。
8. 根据权利要求1所述的用于检测宫颈癌的量子点免疫荧光试剂盒，其特征在于：所述的QD-SA复合物制备方法如下：
（1）取200μL 8.3μM 量子点，采用活泼酯法，按照摩尔比1:500分别加入0.166mgEDC及0.166mgNHS，溶于300μL pH 5.5的硼酸盐缓冲液，室温反应5-10min；
（2）调整溶液pH到8-8.5，按摩尔比40:1加入4.38mg SA，持续混匀2h后，加入终浓度为2%的氨基葡萄糖反应45min终止反应；
（3）偶联所得量子点标记的SA复合物10000r·min-1，离心5min，除去少量沉淀后，用pH 7硼酸盐缓冲液在100K超滤管中洗涤，最后重悬于0.2mL pH 7的硼酸盐缓冲液中。
CN201410538564.0A 2014-10-14 2014-10-14 一种用于检测宫颈癌的量子点免疫荧光试剂盒 Pending CN104316684A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410538564.0A CN104316684A (zh) 2014-10-14 2014-10-14 一种用于检测宫颈癌的量子点免疫荧光试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410538564.0A CN104316684A (zh) 2014-10-14 2014-10-14 一种用于检测宫颈癌的量子点免疫荧光试剂盒

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN104316684A true CN104316684A (zh) 2015-01-28

Family

ID=52371942

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410538564.0A Pending CN104316684A (zh) 2014-10-14 2014-10-14 一种用于检测宫颈癌的量子点免疫荧光试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104316684A (zh)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105131114A (zh) * 2015-10-26 2015-12-09 无锡傲锐东源生物科技有限公司 抗p16蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗p16单克隆抗体和应用
CN105510595A (zh) * 2015-12-01 2016-04-20 邹检平 基于量子点CdTe检测人血清中VEGF浓度的试剂盒及其使用方法
CN105886596A (zh) * 2016-04-26 2016-08-24 南京师范大学 一种宫颈癌细胞检测试剂盒
CN110297090A (zh) * 2019-05-31 2019-10-01 荆州市第一人民医院 一种用于评价子宫内膜腺癌恶性程度的试剂盒
CN111808173A (zh) * 2019-04-12 2020-10-23 国家纳米科学中心 多肽-量子点复合物、其制备方法及应用
CN112204400A (zh) * 2018-05-30 2021-01-08 杰宜斯科技有限公司 具有多官能配体的量子点珠以及使用其的目标抗原检测方法和生物诊断设备
CN112204400B (zh) * 2018-05-30 2024-05-28 杰宜斯科技有限公司 具有多官能配体的量子点珠以及使用其的目标抗原检测方法和生物诊断设备

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102743762A (zh) * 2012-07-19 2012-10-24 武汉理工大学 一种受体介导量子点示踪靶向给药系统及其制备方法和应用
CN103830745A (zh) * 2014-03-11 2014-06-04 南通大学 一种基于量子点的多功能纳米siRNA载体系统的制备及其应用
CN103983622A (zh) * 2014-04-16 2014-08-13 南昌大学 基于两种量子点之间能量转移的赭曲霉毒素a检测方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102743762A (zh) * 2012-07-19 2012-10-24 武汉理工大学 一种受体介导量子点示踪靶向给药系统及其制备方法和应用
CN103830745A (zh) * 2014-03-11 2014-06-04 南通大学 一种基于量子点的多功能纳米siRNA载体系统的制备及其应用
CN103983622A (zh) * 2014-04-16 2014-08-13 南昌大学 基于两种量子点之间能量转移的赭曲霉毒素a检测方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HONG XU ET AL: ""Quantum Dot-Based, Quantitative, and Multiplexed Assay for Tissue Staining", 《APPL. MATER. INTERFACES》, 3 April 2013 (2013-04-03) *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105131114A (zh) * 2015-10-26 2015-12-09 无锡傲锐东源生物科技有限公司 抗p16蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗p16单克隆抗体和应用
CN105131114B (zh) * 2015-10-26 2018-07-06 无锡傲锐东源生物科技有限公司 抗p16蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗p16单克隆抗体和应用
CN105510595A (zh) * 2015-12-01 2016-04-20 邹检平 基于量子点CdTe检测人血清中VEGF浓度的试剂盒及其使用方法
CN105886596A (zh) * 2016-04-26 2016-08-24 南京师范大学 一种宫颈癌细胞检测试剂盒
CN112204400A (zh) * 2018-05-30 2021-01-08 杰宜斯科技有限公司 具有多官能配体的量子点珠以及使用其的目标抗原检测方法和生物诊断设备
CN112204400B (zh) * 2018-05-30 2024-05-28 杰宜斯科技有限公司 具有多官能配体的量子点珠以及使用其的目标抗原检测方法和生物诊断设备
CN111808173A (zh) * 2019-04-12 2020-10-23 国家纳米科学中心 多肽-量子点复合物、其制备方法及应用
CN111808173B (zh) * 2019-04-12 2024-02-23 国家纳米科学中心 多肽-量子点复合物、其制备方法及应用
CN110297090A (zh) * 2019-05-31 2019-10-01 荆州市第一人民医院 一种用于评价子宫内膜腺癌恶性程度的试剂盒

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Chen et al. Quantum dots-based immunofluorescence technology for the quantitative determination of HER2 expression in breast cancer
CN104316684A (zh) 一种用于检测宫颈癌的量子点免疫荧光试剂盒
Kunju et al. Diagnostic usefulness of monoclonal antibody P504S in the workup of atypical prostatic glandular proliferations
CN105368853A (zh) 一种与非小细胞肺癌辅助诊断相关的标志物及其应用
CN109061165A (zh) 一种乳头溢液cea检测的免疫层析试纸、检测方法和应用
CN103330948B (zh) 一种稀土金属纳米簇的肿瘤靶向活体快速荧光成像方法
CN104650234A (zh) 抗akr1b10蛋白单克隆抗体及其应用
KR20120086616A (ko) 티로신 산화물이 결합된 바이오 물질을 포함하는 단백질 검출용 조성물
CN102936501A (zh) 量子点-有机染料复合物关/开型镉离子比率荧光探针及其制备方法
CN103384824B (zh) 癌症诊断方法及其用途
KR101969847B1 (ko) 동일 검체에서 여러 항원을 검출하기 위한 순차적 다중 면역염색법
Yan et al. Construction of specific magnetic resonance imaging/optical dual-modality molecular probe used for imaging angiogenesis of gastric cancer
CN105503768B (zh) alpha‑酮戊二酸的荧光/紫外分子探针的制备方法及其在生物样本中的应用
CN112083160A (zh) 一种宫颈癌检测量子点免疫荧光试剂盒的制备及应用
CN108548923A (zh) 肺小细胞癌早期特异性自身抗体panel诊断试剂盒
CN104198722A (zh) 一种肺癌新肿瘤标志物gsta1及其筛选方法和应用
CN104849449B (zh) 酶标抗体‑金纳米探针在二氨基联苯胺催化显色及暗场成像的应用
Nannan et al. A multimodal imaging study to highlight elastin-derived peptide pro-tumoral effect in a pancreatic xenograft model
Xu et al. Exploration of aminopeptidase N as new biomarker for early diagnosis of thyroid cancer
CN106568750B (zh) 一种基于荧光能量共振转移法的gfap检测方法
CN108444959A (zh) 一种用于鉴别与检测肝癌细胞的点亮型荧光探针
CN101995396B (zh) 一种均相多指标荧光/化学发光测定方法及其用途
CN105652013B (zh) 结直肠癌预后判断标记物、表达评估方法、试剂盒及应用
CN108414756A (zh) 一种同时检测尿液中四个膀胱癌标志物的蛋白芯片的制备方法
CN104458375B (zh) 核酸适体及其衍生物的用途及对组织冰冻切片的快速成像方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20150128

RJ01 Rejection of invention patent application after publication