CN103384824B - 癌症诊断方法及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种方法，其用于诊断癌症或与其相关的残余病症，或者用于预后癌症，或者用于监测针对癌症的抗肿瘤治疗的有效性，或者用于对患有癌症的个体进行随访监测，所述癌症特别是结肠直肠癌，胃癌，乳腺癌，肺癌或前列腺癌，肝癌，卵巢癌，肾癌，甲状腺癌，膀胱癌或胰腺癌。本发明的方法包括：将成体干细胞与待分析个体的血衍生物样品接触，以及通过免疫荧光、免疫组织化学、ELISA或RT-PCR手段验证至少一种上皮标志物在所述干细胞中的表达。

Description

癌症诊断方法及其用途
本发明涉及用于诊断癌症(carcinoma)或与癌症有关的残余病症或用于预后癌症的方法。
另外，本发明的方法能用于监测针对癌症的治疗的有效性或用于对患有癌症的个体进行随访监测。
癌症是以高发病率为特征的源自上皮的肿瘤。
某些类型的癌症，例如结肠直肠癌，乳腺癌，肺癌，肝癌或前列腺癌等，代表目前在人群中最普遍的一些肿瘤。
特别地，结肠直肠癌被估计为第二/第三大由于瘤形成而造成的死亡原因。以上流行病学数据相当令人不安，特别是当考虑到近年来在这种肿瘤类型的诊断、手术和治愈性治疗(curativetreatment)所取得的重要进展之后尤为如此。
结肠直肠癌通常是一种进展缓慢的癌症，因此，其早期诊断对于患病个体的存活是极其重要的。
筛查一直是结肠和直肠癌症的早期诊断以及确定最佳的治愈性治疗的一个重要工具。最常用的筛查方法是测试粪便中的潜血。
在这种类型的检查中被测试为阳性的个体可以进行进一步的检查(例如结肠镜检查或不透明灌肠)，其目的是确定出血的性质。
出血可能实际上是由相对于结肠直肠癌不同的或继发的病况所引起。例如，出血可能与以下病况相关：痔疮，憩室炎和憩室病，慢性炎症性疾病，阑尾炎，肠缺血或肠易激，肠结核，子宫内膜异位症或外来物体的存在，或者甚至是消化系统的第一段的病理学，例如食道胃十二指肠炎，伴有粘膜糜烂现象，溃疡病或血管发育不良。结肠直肠癌筛查的有前景的新进展以粪便DNA测试为代表，但是，其还不是常规临床实践。该测试能够鉴定和量化与肿瘤有关的突变DNA序列(但是，只有一小部分肿瘤与这些突变有关)。在这种类型的测试中量化的DNA与粪便中存在的肿瘤细胞数量正好成正比。这些细胞来源于伴随着结肠直肠癌的发病和演变的脱落过程。
结肠镜检查，不透明灌肠，PET和CT扫描是一些相关的技术，并且是筛查技术的补充。特别地，它们用于定性和定量评估结肠直肠病变区域和病变周边区域。
这些技术，虽然是侵入性的并且相当昂贵，但是至关重要，特别是对详细规划外科干预的目的尤为如此；目前这仍然是针对结肠和直肠癌症的最好的治疗方法。
在手术治疗后，通常对患病个体进行辅助疗法，以防止复发。
这些疗法包括进行化疗，合并或不合并，放疗。
化-放疗方法，可以在手术前或手术后的阶段进行。在手术前阶段，化-放疗可能有助于减小肿瘤大小，并且因此，减小了手术干预的严重性。
在这方面，常常决定采取保守方法，其目的是避免在手术干预过程中切除肛门括约肌以及肛门举肌。
另外，手术前的化-放疗对于在这种类型的非常具有侵入性的干预过程中增加存活率是有用的。
最近，已经建立了一种遗传搜索(被称为K-RAS测试)，其对于在诊断过程中预测结肠直肠肿瘤对针对每个患病个体制定的定制疗法的可能的响应是非常有用的。
该测试包括确定K-RAS蛋白，其负责转导与增殖有关的信号，并且，因此是一个重要的癌基因。特别地，该测试确定K-RAS蛋白是否已经突变。
尽管在结肠直肠癌的诊断和临床治疗上取得了巨大的进步，但是目前患上早期结肠直肠肿瘤的个体仍有30％死亡，这是因为该疾病在仅仅数年(4-5年)期间蔓延(这是由该疾病的微观残余的存留所造成的)。
在这方面，作为本发明的基础的技术问题涉及，提供一种诊断(特别是早期诊断)癌症或与其相关的残余病症的方法，其消除了现有技术的筛查方法或诊断方法的缺点。
特别地，需要一种可快速实施的、侵入性小的并且比传统方法更特异和灵敏的癌症或与其相关的残余病症的诊断方法。
该技术问题通过一种用于诊断癌症或与其相关的残余病症，或用于预后癌症，或用于监测患有癌症的个体的随访，或用于监测抗肿瘤治疗的有效性的方法来解决，这些都详细记述于所附的权利要求书中。
本发明的方法包括，将分离的干细胞与源自待评估个体的血衍生物(haemo-derivative)样品接触。
随后验证接触是否诱导干细胞表达至少一种上皮标志物。表达所述至少一种上皮标志物的干细胞是，在接触血衍生物样品后表达上皮表型的干细胞。
在用个体的血衍生物样品处理后，干细胞表达至少一种上皮标志物表示，个体患有癌症或具有与其相关的残余病症。事实上，疾病或残余病症的存在意味着，在患者血液中存在一种因子，其促进干细胞在上皮方向上分化。
另外，与个体的血衍生物样品接触的干细胞的至少一种上皮标志物的表达的确定指示着，针对癌症或针对与癌症相关的残余病症的治疗的有效性、演变和/或结果。
最后，与个体的血衍生物样品接触的干细胞的至少一种上皮标志物的表达指示着癌症演变，从而指示着其预后。
与来自经历过针对癌症的治疗(手术或化-放疗)的个体的血衍生物样品接触的干细胞的至少一种上皮标志物的表达的确定使得能够对治疗进行随访监测。
本发明的方法可快速地进行，并且，相对于已知的射线照相法或内窥镜检查是非侵入性的。事实上，只要一份简单的血液样品，该方法就能诊断癌症或与其相关的残余病症，或者能够预后癌症，或者监测针对癌症的抗肿瘤治疗的有效性，或者其能够对患有癌症和经过治疗性治疗的个体进行随访监测。
另外，该方法的特征在于，相对于经典的筛查方法具有很高的特异性和灵敏度。
正如已经指出的，粪便潜血测试和粪便DNA测试很容易引起假阳性和假阴性(例如，患有痔疮的受试者在上述测试中可能出现阳性结果)。即使一个个体患有非肿瘤病症，粪便潜血测试也可能给出阳性结果，同时，粪便DNA测试(特别地，其在临床使用中尚未标准化)可能引起大量的假阴性，因为所搜索的突变仅仅表达于较小比例的癌症病例中(例如，在60％的结肠直肠肿瘤中)。此外，粪便DNA测试需要复杂的和昂贵的实验室方法。
本发明的方法能够将每个患病受试者精确和可靠地归类到正确的风险类别，因而，有利于临床人员在该阶段为特定患者确定最合适的治疗方法。
下面借助附图对本发明进行详细举例说明，其中：
图1-9示出，在来自健康个体(图1-3)和患有癌症的个体(图4-9)的血清存在的情况下培养的骨髓细胞的免疫荧光图像。图7-9分别为图4-6的放大图。
图1，图4和图7中的黑色信号确定了细胞核标志物TO-PRO(其标记所有的细胞核)的位置，而在图2，5和8中，灰色信号确定标志物CK-19。图3，6和9报告细胞核信号和CK-19信号的叠加。图像清晰地示出，仅接触患有癌症的个体的血清的细胞(图4-9)为CK-19阳性(图5和8)；图2实际上完全缺乏信号。另外，证据显示，CK-19信号是细胞质的。
本发明的方法用于在个体中诊断癌症或与其相关的残余病症，或者用于在个体中确定癌症的预后，或用于患有癌症的个体的随访监测，或用于监测针对癌症的抗肿瘤治疗的有效性。本发明的方法包括以下步骤：
(i)将分离的干细胞与分离的血衍生物样品接触，和
(ii)验证或评估至少一种上皮标志物在所述干细胞中的表达。
本发明的方法基于以下科学原理：在患有肿瘤的个体中，癌症(例如原发病灶)能够释放信号，该信号诱导干细胞(例如定居于骨髓中的那些)分化为上皮细胞。这些细胞被称为DEC-弥散性上皮细胞)。DEC不具有原发性肿瘤的特性(例如它们不具有相同的突变)，因此它们源自常驻细胞(间充质衍生的)，其已经分化为上皮细胞；特别地，已经表明这种分化由原发肿瘤细胞释放的信号引导。
本发明的方法能够诊断早期阶段的癌症或晚期阶段的癌症。癌症优选为下述之一：结肠直肠癌，胃癌，乳腺癌，肺癌，前列腺癌，卵巢癌，肝癌，肾癌，甲状腺癌，膀胱癌或胰腺癌。
另外，本发明的方法涉及诊断残余病症，优选地，与癌症有关的微观残余病症。残余病症意欲指，临床上无法识别或普通仪器诊断(例如CT扫描，核磁共振，超声检查等)无法识别的癌症残留(例如，微转移或散播的肿瘤细胞)。
患有癌症的个体的随访涉及，患有癌症或与其相关的残余病症的个体接受治疗(手术或化-放疗)后的阶段。
本发明的方法在体外进行，特别地，其实施于分离的血衍生物(或者可以定义为血液的衍生物)样品。用于测试的血衍生物样品是血清或血浆。
为了本发明的目的，涉及的干细胞优选地为成体干细胞，以及更优选地为多能干细胞，以及进一步优选地选自间充质干细胞，CD133+细胞(即表达蛋白CD133的细胞)，CD44+细胞，CD90+细胞，CD29+细胞，CD105+细胞，CD117+细胞，CD56+细胞和CD73+细胞。
其表达由本发明的方法测定的所述至少一种上皮标志物是至少一种细胞角蛋白。
细胞角蛋白是丝蛋白(filamentprotein)，其在肿瘤诊断领域中特别有用。它们由上皮细胞表达，因此在检测恶性上皮肿瘤的存在中是有用的标志物。
本发明方法中使用的细胞角蛋白优选地选自：细胞角蛋白18，19，20和21(CK-18，CK-19，CK-20和CK-21)，更优选地，细胞角蛋白是CK-19。
包括将干细胞与血衍生物样品接触的步骤(i)包括，将干细胞接种于适于细胞生长的支持物(例如培养皿，培养瓶等)的阶段，以及在适合于所使用的干细胞的培养基中稀释个体的血衍生物样品的阶段。培养基可以是例如，alpha-MEM或StemSpan，优选富含生长因子。
血衍生物样品在培养基中的稀释度为1∶2至1∶20，优选1∶4至1∶8。
在培养基中稀释后，血衍生物样品被添加至干细胞。干细胞在含有血衍生物样品的区域内培养48至180小时，优选90至150小时。
在这段时间内，仅当血衍生物样品含有一种或多种合适的分化信号时，干细胞才会分化为上皮细胞。分化信号由癌释放进入循环，因此仅当个体患有癌症时，才存在于血衍生物样品中。
这段时间过去后，就可以继续进行试验，包括验证培养物中分化的干细胞(分化为上皮细胞)的存在，评估经历分化的干细胞(如果有的话)中至少一种上皮标志物的表达。
在确定至少一种上皮标志物的表达之前，优选从细胞中去除稀释于培养基的血衍生物样品。
使用本领域已知的常用检测方法来测定表达。这些方法的非限制性实例包括：免疫荧光法，免疫细胞化学、ELISA(酶联免疫吸附试验)，RT(逆转录酶)-PCR(聚合酶链式反应)；优选，RT-PCR为实时测试。用于本发明方法中的优选方法为，免疫荧光法和RT-PCR。
本发明的方法可以在单一的血衍生物样品和成组的血衍生物样品上实现。例如，可以将干细胞分配入具有6，12，24，36，48或96孔的多孔板中。适宜培养基中的经稀释的血衍生物样品被加入各个孔中，与细胞接触预定的时间。
测定至少一种上皮标志物的阶段因此可以在不同的孔中同时进行。采用这种方式，本发明的方法可以应用于成组的血衍生物样品，甚至来自于不同患者的样品。
多孔系统的使用使得既能够在显微镜下手动读取阳性信号，也能够进行自动化读取，例如使用ELISA读取仪或荧光计。
在步骤(ii)中采用ELISA来测定至少一种上皮标志物的表达的情况下，已经与血衍生物样品接触的干细胞经历裂解阶段。
裂解阶段包括，用合适的溶液处理细胞，该溶液导致细胞膜完整性的破坏，且使得能够回收细胞的总蛋白，即，其使得能够收集包含细胞蛋白的裂解物。
所述的细胞蛋白裂解物代表细胞特性及其在裂解时的生物学活性，并且包含，如果存在的话，分化的干细胞(即，在接触患有癌症或与其相关的残余病症的个体的血衍生物样品后已经分化为上皮细胞的干细胞)表达的至少一种上皮标志物。
对获自接触了血衍生物样品的细胞的蛋白裂解物样品进行ELISA分析，目的是验证和量化蛋白裂解物中至少一种上皮标志物的存在(从而其表达)。
至少一种上皮标志物的表达的通过ELISA的测定可例如在多孔板(优选具有96孔的板)上实现。所述平板可用抗所述至少一种上皮标志物的至少一种抗体(初级抗体)进行预处理，其目的是使抗体吸附在平板上。或者初级抗体的吸附可在本发明方法的进行过程中同时实现。
将蛋白裂解物的等分试样与吸附于平板上的初级抗体接触。
所述抗体将结合由接触血衍生物样品后分化的干细胞表达的所述至少一种上皮标志物。
所述结合的测定通过使用新的抗所述至少一种上皮标志物的抗体(第二初级抗体)或者通过使用抗初级抗体的抗体(次级抗体)来实现。优选，这两种抗体都连接酶(例如二氨基联苯胺或碱性磷酸酶或HRP)，其能够与合适的底物(在实施该方法时即时加入)反应，从而测定被分析的样品的显色。
显色的强度采用合适的仪器来测定，其指示着由任何在接触来自患有癌症或与其相关的残余病症的个体的至少一份血衍生物样品后分化为上皮细胞的干细胞表达的所述至少一种上皮标志物的量。
步骤(ii)中，验证接触血衍生物样品后的干细胞中至少一种上皮标志物的表达可通过PCR手段，优选RT-PCR，进一步优选实时RT-PCR来实现。
在这种情况下，为了扩增DNA或者cDNA(通过逆转录对应于感兴趣的基因的信使而获得)，可使用一对或多对寡核苷酸，寡核苷酸对中的各个寡核苷酸能够键合至两条DNA纤丝中的一个。在寡核苷酸对键合至各DNA纤丝后，就可以使用经典PCR扩增它们中间的DNA序列。寡核苷酸对中的各个寡核苷酸优选由15-30个核苷酸组成。所述寡核苷酸可以基于感兴趣的基因序列，使用例如目前可用于从感兴趣的序列产生寡核苷酸的算法而设计。感兴趣的基因优选是编码细胞角蛋白的基因，优选编码细胞角蛋白18，19，20或21的基因。
在通过免疫荧光法实现验证至少一种上皮标志物在与血衍生物样品接触的干细胞中的表达的步骤(ii)时，所述干细胞被沉积在玻片上(采用或不采用固定剂)。然后，将它们与所述至少一种上皮标志物的特异性抗体接触，该抗体可缀合荧光染料或酶。在特异性抗体是游离的(即，未缀合的)的情况下，为了进行验证，使用抗所述特异性抗体的缀合有荧光染料或酶的第二抗体。所述抗体将结合至与来自患有癌症或与其相关的残余病症的个体的血衍生物样品接触后的干细胞表达的所述至少一种上皮标志物(如果有的话)。
在实施该制备过程后，在显微镜下显示来自分化的干细胞的至少一种上皮标志物的表达。
在本发明的方法中，在将干细胞与分离的血衍生物样品接触后，干细胞中至少一种上皮标志物的表达指示着，癌症或与其相关的残余病症的存在。
另外，所述表达还指示着癌症进展程度，从其能够推断病理学预后。
本发明的方法使得能够对患有癌症或与其相关的残余病症以及接受过治疗性治疗(例如以消除肿瘤)的个体进行随访。当使用在患有癌症的个体接受治疗性治疗(能够消除肿瘤)后的步骤中获得的血衍生物样品来测定干细胞样品中至少一种上皮标志物的表达时，能够监测所述疾病的任何可能的再次出现。
在其中在治疗性治疗所述患有癌症的个体之后的阶段中测定至少一种上皮标志物的表达的情况下，这种可能性确保了快速的治疗性干预。
在这种情况下，在所述个体接受治疗性治疗的随后阶段(并且该阶段已消除肿瘤)中获得的血衍生物样品中，可能存在能够诱导干细胞分化为上皮细胞的新的信号，这指示着，个体重新受到了肿瘤或与其相关的残余病症的侵袭。
最后，本发明的方法也可用于监测治疗性抗肿瘤治疗特别是化/放疗的有效性。
在这种情况下，该方法包括，比较至少一种上皮标志物在干细胞中的表达水平，所述干细胞已经与患病个体在个体接受治疗性治疗的各个阶段中的血衍生物样品接触。
所述表达水平的变化指示着治疗本身的进展。例如，治疗性治疗后期的表达水平相对于初期的降低指示着治疗有效性。本发明方法的特征在于，特异性为60％至100％，优选为70％至90％。
对于该方法的灵敏度，其范围为60％至100％，优选70％至90％。
在另一实施方案中，本发明的方法与目前使用的其他诊断/预后方法组合使用，目的是将研究技术结合起来。
例如本方法可以与下列方法结合应用：结肠镜检查，不透明灌肠，粪便DNA测试和其他可能的试验，目的是能够为每个单独的患者确定专门的治疗/预后方法。
源于已知研究技术和本发明方法的临床数据的获得有利于和促进了个性化治疗方法的确定，这在治疗癌症中是非常有利的。
本发明的另一个方面涉及一种试剂盒，其包括：抗至少一种上皮标志物的至少一种抗体(定义为初级抗体)或者用于扩增至少一种上皮标志物的cDNA或DNA的至少一对核苷酸；和/或至少一个干细胞样品；和/或用于培养所述干细胞的装置。所述抗上皮标志物的抗体抗细胞角蛋白，优选地，细胞角蛋白18，细胞角蛋白19，细胞角蛋白20或细胞角蛋白21；更优选地，所述抗体抗细胞角蛋白19。
所述抗上皮标志物的抗体可以直接缀合适合于通过常规免疫荧光技术手段测定的荧光染料(例如得克萨斯红，荧光素(FITC)，藻红素(PE)，四甲基罗丹明异硫氰酸酯(TRITC))，或者所述抗体缀合合适的分子，例如蛋白质，所述蛋白质能够用常规比色法测定，例如通过免疫组织化学测定(例如，所述分子可以是二氨基联苯胺或碱性磷酸酶或HRP)。
可选地，初级抗体是游离的。在这种情况下，使用如上所述的缀合的次级抗体(抗初级抗体)进行测定。在后一种情况下，所述试剂盒还包括次级抗体，即，抗初级抗体的抗体。所述次级抗体缀合有用于测定的荧光染料或酶。
该试剂盒可进一步包括用于执行该方法的装置(其可以是一次性使用的，无菌的或可灭菌的)，例如，已用抗所述至少一种上皮标志物的至少一种抗体预处理(或者未预处理)的多孔板。
该试剂盒可进一步包括用于进行所述测定方法的物质，例如适合于实施至少一种上皮型标志物的cDNA/DNA的逆转录或扩增的溶液，其包含例如，逆转录酶，用于扩增DNA的酶，盐，核苷酸混合物，表面活性剂或还原剂。
另外，所述物质可以是例如，用于细胞裂解或洗涤、固定、封闭、中和或测定的溶液。
所述试剂盒可用于诊断个体是否患有癌症或具有与癌症相关的残余病症，或者用于确定患有癌症的个体的预后。
另外，所述试剂盒可用于监测治疗性治疗的有效性或对患有癌症的个体进行随访监测。换句话说，所述试剂盒用于实现本发明的方法。
实施例
细胞
来源于骨髓的单核人类细胞(BM-MNC)购自STEMCELLTechnologies。
抵达后，对BM-MNC进行解冻，使用含有250μlDNA酶I(1mg/ml)的、包含10％血清(用于间充质干细胞的胎牛血清，StemCellTechnologies)和1x青霉素/链霉素(StemCellTechnologies)的培养基。
在用血清样品开始刺激实验之前，细胞被培养至少3天。
用于培养和扩增细胞的扩增培养基由富含生长因子(StemSpanCC100-StemCellTechnologies)的AlphaMEM或StemSpanSFEM(无血清扩增培养基，StemCellTechnologies)组成。
采用人血清的BM-MNC刺激试验。
从源自患有结肠直肠癌的个体以及源自健康供体的血液样品获得血清。
使用本发明的方法测试了19名患有癌症的个体，并且更详细地，这些个体患有不同阶段的腺癌。
表1总结了关于18个患有癌症的个体的临床数据。
表1还报告了有关健康供体的实验数据。特别地，分析了12个健康样品(S1-12)。
该表格报告了：
1)肿瘤的组织学诊断；
2)国际肿瘤分期(由pTNM分期表示，其中T是内脏膜侵袭程度，N是淋巴结状态，M是转移的存在或不存在)；以及
3)CK-19阳性情况(以BM-MNCCK-19+表示)，即表达CK-19的细胞的存在。
表1
每份血清样品使用具有0.22μm的孔的适当的过滤器(CorningCostar)进行灭菌。
在每个孔中接种总共约100000个细胞(约个100000细胞/cm2)。在1250μl培养基中加入250μl血清(即，血清按1∶6稀释)。
在37℃下、含5％CO2的气氛中孵育120小时后，回收细胞，并通过免疫荧光法测定CK19信号。
所有进行的实验都以一式两份进行。
免疫荧光法
将BM-MNC从支持其培养的支持物上分离下来，重悬于100μlPBS中。随后，它们被均匀地分布于极化玻片上并在室温下干燥过夜。
然后，使用96％的乙醇将它们固定于玻片上，在室温下进行10分钟。
在TBS(Tris缓冲盐溶液)中洗涤后，如上所述固定的细胞接受封闭步骤，其目的是减少抗体的非特异性相互作用(即，减少背景噪声)。
封闭步骤在室温下进行15分钟，使用在TBS(Sigma)中的3％的山羊血清。
使用抗人细胞角蛋白19的鼠单克隆抗体(抗人细胞角蛋白，DAKO)作为初级抗体，其目的是确定BM-MNC上的特定蛋白质。
抗体在PBS中以1∶50的稀释度使用(初始浓度21mg/l，最终浓度0.42mg/l)，单克隆抗体和固定于玻片上的细胞之间的反应在4℃下过夜进行。
在此之后，用TBS洗涤细胞，以消除非键合的抗体。然后，在室温下将它们与以1∶100稀释于PBS中(初始浓度2mg/ml，最终浓度0.02mg/ml)的次级抗体(AlexaFluor488，Invitrogen)温育30分钟。
使用共聚焦显微镜读取阳性信号(即荧光细胞)。在显微镜下观察细胞之前，加入以1∶7000稀释于蒸馏水中的TO-PRO(InVitrogen)，以标记细胞核。
使用InteractiveLCS软件(Leica，Wetzlar，Germany)来采集和分析图像。
总结于表1(BM-MNCCK-19+)和图4-9的结果清楚地证实，所有患有癌症的个体的血清都包含源自肿瘤的信号，其能够诱导间充质细胞分化为上皮细胞。
来源于健康个体的血清则不能诱导间充质干细胞在上皮方向上的体外分化。所有的12个个体中，只有3个正常个体的血清表现出很轻微的阳性(参见样品S-6，8和10)。
用健康个体血清处理的间充质干细胞在显微镜下仅显示标记的细胞核(图1-3，黑色信号)。没有观察到与细胞角蛋白19相关的细胞质信号(参见图1(标记细胞核)，图2(标记CK-19)以及图3(两种标记的叠加))。
用患有癌症的个体的血清处理的间充质干细胞显示与细胞角蛋白19相关的强烈的细胞质信号(图4-6和相关的放大的图7-9，灰色信号)，其围绕细胞核(图4和7(标记细胞核)，图5和8(标记CK-19)以及图6和9(两种标记的叠加))。
该方法的特异性和灵敏度的计算。
本方法的特异性使用下面的公式计算：
特异性＝真阴性/总健康个体数＝真阴性/(真阴性+假阳性)。
本方法的灵敏度使用下面的公式计算：
灵敏度＝真阳性/总患者数＝真阳性/(真阳性+假阴性)。
对于本发明的方法，计算出的灵敏度为94.8％，特异性为75％。

Claims (21)

1.用于测定至少一种上皮标志物的表达的试剂和分离的成体干细胞在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于诊断结肠直肠癌，或者用于结肠直肠癌的预后，或者用于监测针对结肠直肠癌的抗肿瘤治疗的有效性，或者用于对患有结肠直肠癌的个体进行随访监测，其中所述诊断、预后或者监测包括：
(i)将所述分离的成体干细胞与来自所述个体的分离的血清或血浆样品接触；
(ii)使用所述试剂来确定所述干细胞中所述至少一种上皮标志物的表达的诱导。
2.权利要求1的用途，其中所述干细胞是多能干细胞。
3.权利要求1或2的用途，其中所述干细胞选自：间充质干细胞，CD133+细胞，CD44+细胞，CD90+细胞，CD29+细胞，CD105+细胞，CD117+细胞，CD56+细胞和CD73+细胞。
4.权利要求1或2的用途，其中所述上皮标志物为细胞角蛋白。
5.权利要求1或2的用途，其中所述上皮标志物为CK-18，CK-19，CK-20或CK-21。
6.权利要求5的用途，其中所述上皮标志物为CK-19。
7.权利要求1的用途，其中将干细胞与血清或血浆样品接触的所述步骤(i)包括：将所述干细胞接种于支持物上的步骤和将所述样品在用于干细胞的培养基中稀释的步骤，其中所述血清或血浆样品在细胞培养基中的所述稀释在1:2至1:20之间变化。
8.权利要求7的用途，其中所述血清或血浆样品在细胞培养基中的所述稀释在1:4至1:8之间变化。
9.权利要求7或8的用途，其中所述干细胞在稀释于培养基的样品中生长一段时间，所述时间段在48到180小时之间变化。
10.权利要求9的用途，其中所述时间段为90至150小时。
11.权利要求1或2的用途，其中所述确定至少一种上皮标志物的表达的诱导的步骤通过下列来进行：免疫荧光法，免疫组织化学，ELISA或RT-PCR。
12.权利要求11的用途，其中所述PCR是实时PCR。
13.权利要求11的用途，其中所述试剂是抗上皮标志物的至少一种抗体，并且所述通过ELISA测定至少一种上皮标志物的表达的步骤包括以下步骤：
●裂解已接触所述血清或血浆样品的干细胞；
●将先前步骤中获得的蛋白裂解物的等分试样与所述抗上皮标志物的至少一种抗体接触；以及
●测定所述至少一种上皮标志物和所述抗体的结合。
14.权利要求11的用途，其中所述试剂是抗上皮标志物的至少一种抗体，并且所述通过免疫荧光法测定至少一种上皮标志物的表达的步骤包括以下步骤：
●将已接触所述血清或血浆样品的干细胞固定于玻片上；
●将先前步骤中固定的细胞与所述抗上皮标志物的至少一种抗体接触；以及
●测定由分化的干细胞表达的所述至少一种上皮标志物与所述抗体的结合。
15.权利要求7的用途，其中所述确定至少一种上皮标志物的表达的诱导的步骤通过下列来进行：免疫荧光法、免疫组织化学、ELISA或RT-PCR，并且在从细胞去除所述稀释于培养基的所述血清或血浆样品后实现。
16.权利要求1或2的用途，其中监测针对癌症的抗肿瘤治疗的有效性包括，比较患病个体在所述个体所接受的治疗性治疗的不同阶段的分离的样品中，至少一种上皮标志物的表达水平。
17.权利要求1或2的用途，其中所述诊断、预后或者监测的特征在于，其特异性为60％至100％。
18.权利要求17的用途，其中所述诊断、预后或者监测的特征在于，其特异性为70％至90％。
19.权利要求1或2的用途，其中所述诊断、预后或者监测的特征在于，其灵敏度为60％至100％。
20.权利要求19的用途，其中所述诊断、预后或者监测的特征在于，其灵敏度为70％至90％。
21.权利要求13的用途，其中，所述抗体吸附在适当的支持物上。
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