KR20140034124A - 암종의 진단방법 및 그의 용도 - Google Patents

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필리포 바스티아
도나토 알토마레
레오 알프레도 디
마리아 테레사 로텔리
미쉘 바론
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티에이치디 에스.피.에이.
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Abstract

본 발명은 암종 또는 암종과 관련된 잔여 질병을 진단하거나, 암종의 예후를 관측하거나, 또는 암종에 대한 항종양 치료법의 효능을 모니터링하거나, 또는 암종, 특히, 직장결장암종, 위장의 암종, 유선암종, 폐 암종 또는 전립선의 암종, 간의 암종, 난소의 암종, 신장의 암종, 갑상선의 암종, 방광의 암종 또는 췌장의 암종에 걸린 개체에 있어서 추적 관찰을 위한 모니터링을 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 성체 줄기세포를 분석하고자 하는 개체의 헤모-유도체 샘플과 접촉시키고 면역형광법, 면역조직화학법, ELISA 또는 RT-PCR에 의해, 줄기세포 중의 적어도 1종의 상피 마커의 발현을 검증하는 것으로 이루어진다.

Description

암종의 진단방법 및 그의 용도{METHOD FOR THE DIAGNOSIS OF A CARCINOMA AND USES THEREOF}
본 발명은 암종 또는 암종과 관련된 잔여 질병의 진단방법 또는 암종의 예후를 예측하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명의 방법은 암종의 치료법의 효능을 모니터링하거나 암종에 걸린 개체를 추적 관찰하는데도 이용될 수 있다.
암종은 발생빈도가 높은 것을 특징으로 하는 상피 기원의 종양이다.
결장직장암종, 유선암종,페암종, 간암종 또는 전립선암종과 같은 몇몇 유형의 암종들은 현재 전세계적으로 가장 흔한 종양들이다.
특히, 결장직장암종은 신생물(종양)에 의한 사망 원인의 2/3를 차지하는 것으로 파악되고 있다. 전술한 역학적 데이터는 그러나, 특히, 이러한 유형의 종양의 진단 및 수술, 및 치료법에 있어서의 최근 몇 년간의 상당한 발전과 연관지어 보면, 다소 어리둥절한 상황이다.
결장직장암종은 대체로 서서히 진행됨을 특징으로 하는 암이며, 따라서, 그의 조기 진단은 이 질병에 걸린 개체의 생존에 있어서 매우 중요하다.
스크리닝은 이제껏 직장 및 결장의 암종을 조기 진단하는데 있어서 뿐만 아니라, 가장 효과적인 치료법을 결정하는데도 중요한 수단으로 이용되어 왔다. 가장 흔히 사용되는 스크리닝법은 분변잠혈 검사법이다.
이러한 유형의 검사에서 양성으로 판정받은 개체는 출혈의 특성을 규정할 목적으로 추가 검진(예컨대 대장 내시경 또는 불투명 관장제(opaque clisma))을 받을 수 있다.
출혈은 실제로 결장직장암종과 관련한 증상과는 다른 원인에 기인하거나 또는 2차적인 증상에 기인한 것일 수 있다. 예를 들어, 출혈은: 치핵, 게실염 및 게실증, 만성 염증성 질환, 충수염, 장허혈, 또는 과민성대장증후군, 장결핵, 자궁내막증 또는 이물질의 존재와 연관이 있거나, 또는 심지어는 점막의 미란 현상, 궤양성 질환 또는 혈관형성이상을 수반하는 식도위장 십이지장염과 같은 소화기관의 1차관의 병리현상에 기인할 수도 있다.
직장결장암종을 스크리닝하는데 있어서 유망한 새로운 발전사항은 분변 DNA 검사인데, 이 방법은 그러나 아직 임상적으로 널리 시행되고 있지는 않다. 이 검사법은 종양과 연관된 돌연변이된 DNA 서열을 동정하여 정량화할 수 있다 (그러나, 이러한 돌연변이와 연관된 종양은 소수에 불과하다). 이러한 유형의 검사법에서 정량화된 DNA는 분변 중에 존재하는 신생물 세포의 수에 직접적으로 비례한다. 이 세포들은 직장결장암의 발병과 진행의 양자 모두를 수반하는 박락(exfoliation) 과정으로부터 유래한다.
대장 내시경, 불투명 관장제, PET 및 CT 스캔은 스크리닝 기술을 보조하거나 이러한 기술에 보충적인 기술이다. 특히, 이들은 결장직장 병변의 부위와 병변을 둘러싸고 있는 부위의 양자 모두를 정성적으로, 그리고 정량적으로 평가하는 기능을 한다.
이 검사 기술들은 비록 침습적이고, 실시하는데 많은 비용이 들지만, 특히 외과수술에 의한 개제를 구체적으로 기획하기 위해서는 필수적인 기술이며; 오늘날 이 기술들은 결장 및 직장의 암에 대한 가장 우수한 치료적 접근법으로 여겨지고 있다.
외과수술 처치 후, 재발 방지를 위해 대상 개체에게 대체로 보조요법을 실시한다.
이러한 치료법들은 화학요법에 의한 약물 투여로 이루어지며 방사능요법이 병용되거나 병용되지 않을 수 있다.
화학-방사능치료 접근법은 외과수술전 또는 수술후 단계에서 실시될 수 있다. 외과수술 전 단계에서는 화학-방사능 치료법이 종양 크기를 줄일 목적에서 유용할 수 있으며, 그 결과, 외과수술 개재의 심각성도 감소될 수 있다.
이와 관련하여, 외과수술을 실시하는 동안 항문 괄약근과 항문 거상근의 절제를 회피할 목적에서, 흔히 보존적 접근법이 채택되고 있다.
뿐만 아니라, 수술전 화학-방사능 치료법은 이러한 유형의 매우 침습적인 개재에 있어서 생존율을 증가시키는데도 유용하다.
최근 유전자 조사(K-RAS 검사로 알려짐)가 개발되었는데, 이 검사법은 진단 중에 직장결장 종양의 가능한 반응을 예측하여 각 개체에 알맞은 맞춤식 치료법을 제공해줄 목적에서 매우 유용하다.
이 검사법은 증식과 연관이 있는 시그널을 변환시키는 역할을 함으로써 중요한 종양유전자이기도 한 K-RAS 단백질을 검출하는 것을 포함한다. 특히, 이 검사법은 K-RAS 단백질이 돌연변이 됐는지의 여부를 판정한다.
직장결장암종의 진단 및 임상적 처치와 관련하여 눈부신 발전이 이루어져 왔지만, 현재에도 조기 단계의 직장결장종양 환자의 30%가 사망하는데, 이는 이 질병의 미세한 잔사(microscopic residues)의 존속으로 인해 이 질병이 단지 수년 (4-5년) 동안만 전파되기 때문이다.
이와 관련하여, 본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 종래기술에 따른 스크리닝법 또는 진단법의 단점이 극복된, 암종 또는 잔류 질환의 진단(특히 조기 진단) 방법을 제공하는 것이다.
특히, 종래기술에 따른 방법에 비해, 더 신속하게 수행가능하고 덜 침습적이며 더욱 특이적이고 민감한, 암종 또는 그와 관련된 잔류 질환의 진단방법을 가능케 하는 것이 요망되고 있다.
전술한 문제점은 본 명세서에 첨부된 특허청구범위에 설명된 바와 같은, 암종 또는 그와 관련된 잔류 질환을 진단하거나, 암종의 예후를 예측하거나 또는 암종에 걸린 환자를 추적 모니터링하거나, 또는 항종양 치료법의 효능을 모니터링하는 방법에 의해 해결된다.
본 발명의 방법은 분리된 줄기세포를 검사하고자 하는 개체로부터 기원하는 혈액-유도물 샘플과 접촉시키는 것을 포함한다.
이어서, 전술한 접촉에 의해 줄기세포에 의해 적어도 1종의 상피 마커의 발현이 유도되었는지를 검정한다. 적어도 1종의 상피 마커를 발현하는 줄기세포들은 헤모-유도체(haemo-derivatives)의 샘플과 접촉한 후 상피 표현형을 발현하는 줄기세포이다.
개체의 헤모-유도체 샘플 처리 후 줄기세포에 의해 적어도 1종의 상피 마커가 발현되었다 함은, 그 개체가 암종에 걸렸거나 암종과 관련된 잔여 질병(residual disease)에 걸렸음을 가리킨다. 실제로, 질병 또는 잔여 질병이 존재한다는 것은 상피 관점에서, 줄기세포의 분화를 촉진하는 인자가, 상기 영향을 받은 개체의 혈액 내에 존재함을 시사하는 것이다.
나아가, 개체의 헤모-유도체 샘플과 접촉된 줄기세포에 의한 적어도 1종의 상피 마커의 발현을 검사하는 것은 암종 또는 암종과 연관된 잔여 질병에 대한 치료법의 효능, 진전 및/또는 결과의 척도이기도 하다.
마지막으로, 개체의 혈액-유도체 샘플과 접촉된 줄기세포에 의한 적어도 1종의 상피 마커의 발현은 암종의 발달을 가리키는 척도이며 따라서 암종의 예후를 알리는 것이기도 하다.
암종에 대한 치료 (외과수술 또는 화학-방사능 치료법)를 받는 개체의 혈액-유도체 샘플과 접촉된 줄기세포에 의한 적어도 1종의 상피 마커의 발현 여부를 검사함으로써 치료의 후속 경과를 모니터링할 수 있다.
본 발명의 방법은 신속하게 수행될 수 있고 공지의 방사선촬영법이나 내시경법에 비해 덜 침습적이다. 실제로 이 방법은 소량의 혈액 샘플만으로도 암종 또는 암종과 관련된 잔여 질병의 진단, 또는 암종의 예후 또는 암종에 대한 항종양 치료법의 효능의 모니터링이 가능하며 또는, 이 방법은 암종에 걸린 개체의 후속 경과를 추적 모니터링하여 적절한 치료를 받게 할 수 있다.
또한, 이 방법은 전통적인 스크리닝법과 관련하여 높은 특이성과 민감성을 갖는다는 특징이 있다.
전술한 바와 같이, 분변잠혈 검사법과 분변 DNA 검사법은 거짓 양성과 거짓 음성 결과 (예컨대, 치핵에 걸린 대상자가 전술한 검사법으로 양성으로 나올 수 있다)가 쉽게 나올 수 있다. 분변잠혈 검사법은 비종양 질병에 걸린 개체의 경우에도, 양성 결과를 낼 수 있는 반면, 분변 DNA 검사법 (무엇보다도 임상 용도로는 아직 표준화되지 않음)의 경우 거짓 음성 결과가 높게 나올 수 있는데, 이는 조사하고자 하는 돌연변이가 암종례에서 적은 비율로만 발현되기 때문이다 (예컨대 직장결장 종양의 60%).
이에 더하여, 분변 DNA 검사법은 정교하고도 고가의 실험방법을 필요로 한다.
본 발명의 방법은 아픈 대상자 각각을 정확한 위험군으로 정확하고도 높은 신뢰도로 분류하여, 그 결과, 임상의가 특정 환자에 대해 가장 적합한 치료법을 동정하는 것을 용이하게 해준다.
첨부된 도면을 참조로 본 발명을 이하에 더욱 상세히 설명한다.
도 1 내지 도 9는 건강한 개체 (도 1 -3) 및 암종에 걸린 개체 (도 4-9)로부터의 혈청 존재하에 배양된 골수 세포의 면역형광 이미지이다. 도 7 내지 도 9는 각각 도 4 내지 도 6을 확대한 도면이다.
도 1, 4 및 7 핵 마커 TO-POR (모든 세포 핵을 마크한다)의 국소화를 나타내며, 도 2, 5 및 8에서 회색 시그널은 마커 CK-19를 나타낸다. 도 3, 6 및 9는 핵 시그널과 CK-19 시그널을 포개서 나타낸 도면이다. 이들 이미지들은 암종에 걸린 개체의 혈청과 접촉된 세포 (도 4-9)들만이 CK-19에 대해 양성이고 (도 5 및 도 8); 도 2는 실제로 이러한 시그널이 전혀 없음을 명확히 보여준다. 또한, CK-19 시그널은 세포질에 대한 것이다.
본 발명의 방법은 개체에 있어서 암종 또는 그와 관련된 잔여 질병을 진단하는데, 또는 개체에 있어서 암종의 예후를 설명하는데, 또는 암종에 걸린 개체의 치료 후속 경과를 모니터링하는데, 또는 암종에 대한 항종양 치료의 효능으르 모니터링하는데 적용된다.
본 발명의 방법은 다음의 단계들, 즉:
(i) 분리된 줄기세포를 혈액-유도체의 분리된 샘플과 접촉시키는 단계, 및
(ii) 상기 줄기세포 중에 적어도 1종의 상피 마커가 발현되었는지를 검정 또는 평가하는 단계
를 포함한다.
본 발명의 방법은 종양에 걸린 개체에서 암종, 예컨대 원발성(primary) 병변이 예컨대 골수에 내재하는 것들과 같은 줄기세포의 상피세포 내로의 분화를 유도하는 시그널을 낼 수 있다는 과학적 근거에 기초한 것이다. 이들 세포들은 DECs (Disseminated Epithelial Cells: 파종성 상피세포)로 명명되었다. DESs는 원발성 종양의 특징을 갖지 않으므로 (예컨대, 이들은 동일한 돌연변이를 나타내지 않는다), 이들은 상피세포로 분화된 (중간엽 파생의) 체류 세포(resident cells)로부터 유래하며; 특히, 이러한 분화는 원발성 종양 세포가 방출하는 시그널에 의해 가이드되는 것으로 나타났다.
본 발명의 방법을 이용하여 조기 단계에서 암종을 진단할 수 있고, 또는 진행된 단계의 암종을 진단하는 것도 가능하다. 암종은 다음, 즉: 직장결장암종, 위장의 암종, 유선 암종, 폐암종, 전립선 암종, 난소의 암종, 간의 암종, 신장의 암종, 갑상선의 암종, 방광의 암종 또는 췌장의 암종 중 어느 하나인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 방법은 잔여 질병, 특히 암종과 연관된 미세한 잔여 질병의 진단에 관한 것이기도 하다.
본 발명에서 잔여 질병(residula disease)라 함은 임상적으로 동정할 수 없거나, 또는 통상적인 장비를 이용한 진단법 (예컨대 CT 스캔, 자기공명법, 초음파 검사법 등)으로는 동정해 낼 수 없는, 암종의 존속 (예컨대 미세한 전이 또는 파종성 종양 세포)을 의미하는 것이다.
암종에 걸린 개체에 대한 후속 처치는 암종 또는 암종과 관련된 잔여 질병에 걸린 개체들이 받은 치료법 (외과수술 또는 화학-방사능 치료법)에 후속되는 단계에 관한 것이다.
본 발명의 방법은 시험관내(in vitro)에서 수행된다; 특히, 본 발명의 방법은 헤모-유도체(달리 정의하자면 혈액의 유도체)의 분리된 샘플에 대하여 수행된다. 검사에 이용되는 헤모-유도체 샘플은 혈청 또는 혈장이다.
본 발명의 목적상, 본 발명에 설명되는 줄기세포는 좋기로는, 성체 줄기세포(adult stem cells)인 것이 좋고, 더욱 좋기로는 다능성 줄기세포인 것이 좋으며, 더더우구 좋기로는 중간엽 줄기세포, CD133+ 세포 (즉, 단백질 CD133을 발현하는 세포), CD44+ 세포, CD90+ 세포, CD29+ 세포, CD105+ 세포, CD117+ 세포, CD56+ 세포 및 CD73+ 세포로부터 선택되는 것이 바람직하다.
본 발명의 방법에 의해 그 발현이 측정되는 최소한의 상피 세포는, 적어도 시토케라틴이다.
시토케라틴은 종양학적 진단 분야에서 특히 유용한 필라멘트 단백질이다. 이들은 상피세포에 의해 발현되므로 악성 상피 종양의 존재여부를 판정하는데 유용한 마커이다.
본 발명의 방법에 사용되는 시토케라틴은: 시토케라틴 18, 19, 20 및 21 (CK-18, CK-19, CK-20 및 CK-21)로부터 선택되는 것이 바람직하며, 더욱 좋기로는 시토케라틴은 CK-19인 것이 좋다.
줄기세포를 헤모-유도체의 샘플과 접촉시키는 단계인 단계 (i)은 세포 성장에 적합한 지지체 (예컨대 디쉬, 플라스크 등) 상에 줄기세포를 접종하는 단계와 사용되는 줄기세포에 적합한 배양 배지로 개체의 헤모-유도체 샘플을 희석하는 단계를 포함한다. 배양 배지는 에컨대, 알파-MEM 또는 StemSpan일 수 있으며, 성장인자를 보강시키는 것이 바람직하다. 배양 배지 중의 헤모-유도체 샘플의 희석배수는 1:2 내지 1:20 범위이며, 좋기로는 1:4 내지 1:8인 것이 바람직하다.
일단 배양 배지에 희석시킨 후, 헤모-유도체 샘플을 줄기세포에 첨가한다. 줄기세포는 헤모-유도체 샘플을 함유하는 조건에서 48 내지 180 시간, 좋기로는 90 내지 150 시간 동안 배양한다.
이 기간 동안, 줄기세포는 오직 헤모-유도체 샘플이 1 이상의 적합한 분화 시그널을 함유하는 경우에만, 상피세포로 분화한다.
분화 시그널은 암종에 의한 순환(circulation) 내로 방출되며 따라서, 해당 개체가 암종에 걸렸을 때만 헤포-유도체 샘플 내에 존재한다.
일단 이 기간이 경과하면, 배양체 내의 분화된 줄기세포(상피세포로 분화된)의 존재 여부를 판정하여, 분화를 겪은 줄기세포(존재한다면) 중에서 적어도 1종의 상피 마커가 발현되었는지를 평가한다.
적어도 1종의 상피 마커가 발현되었는지를 판정하는 공정 전에, 배양 배지에 희석된 헤모-유도체 샘플을 상기 세포로부터 제거하는 것이 바람직하다.
발현 여부는 이 분야에 알려진 일반적인 검사법을 이용하여 검사한다. 이러한 검사방법의 예로는: 면역형광법, 면역세포화학, ELISA(효소-결합 면역흡수 분석법), RT(역전사효소) - PCR(폴리머라제 연쇄반응)을 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다; 좋기로는 RT-PCR이 실시간 검사법이므로 바람직하다. 본 발명에 사용하기에 바람직한 방법은 면역형광법과 RT-PCR이다.
본 발명의 방법은 단일 헤모-유도체 샘플과 헤모-유도체 샘플들의 그룹 양자 모두에 대해 실시할 수 있다. 예컨대, 줄기세포를 6, 12, 24, 36, 48 또는 96 웰을 갖는 멀티-웰 플레이트 상에 분배할 수 있다. 이어서 적절한 배양 배지에 희석된 헤모-유도체 샘플을 상기 웰 각각에 첨가하여, 전술한 시간 동안 세포들과 접촉하도록 방치한다.
따라서, 적어도 1종의 상피 마커를 검사하는 단계는, 이들 여러가지 웰 중에서 동시적으로 실시될 수 있다. 이러한 방식으로 본 발명의 방법은 심지어 여러 명의 환자로부터 유래하는 복수개의 헤모-유도체 샘플로 된 그룹에 대하여도 실시할 수 있다.
멀티-웰 시스템을 이용하면 현미경 상의 양성 시그널을 수동으로 판독하는 것과, 예컨대 ELISA 판독기 또는 형광측정기를 이용하여 자동으로 판독하는 것의 양자 모두가 가능하다.
적어도 1종의 상피 마커의 발현 여부를 판정하는 단계인 단계 (ii)가 ELISA를 이용하여 수행될 경우, 헤모-유도체 샘플과 접촉되어 있던 줄기세포들은 용혈(lysis) 단계 처리를 받게 된다.
용혈 단계는 세포막의 온전성의 파괴를 일으키는 적절한 용액으로 세포를 처리하는 것을 포함하며 세포의 총단백질을 회수하는 것, 즉 세포 단백질의 용해물(lysate)을 수집하는 것을 가능케 해준다.
전술한 세포 단백질의 용해물은 세포의 특징과 용해 순간의 그의 생물학적 활성을 나타내고, 분화된 줄기세포, 즉, 암종 또는 암종과 관련된 잔여 질병에 걸린 개체의 헤모-유도체 샘플과 접촉된 후 상피 세포로 분화되었던 줄기세포에 의해 발현된 적어도 1종의 상피 마커가 존재할 경우 이러한 상피 마커를 함유한다.
단백질 용해물 중 적어도 1종의 상피 마커의 존재 여부를 검정 및 정량화하기 위해헤모-유도체 샘플과 접촉된 세포로부터 수득된 단백질 용해물 샘플을 ELISA를 이용하여 분석한다.
ELISA를 이용하여 적어도 1종의 상피 마커의 발현 여부를 검사하는 것은 예컨대, 멀티-웰 플레이트, 좋기로는 96개 웰을 갖는 플레이트를 이용하여 실시하는 것이 바람직하다.
플레이트 내의 항체를 흡착시키기 위해, 상기 플레이트를, 상기한 적어도 1종의 상피 마커 (1차 항체)에 대한 항체로 전처리할 수 있다. 별법으로, 1차 항체의 흡착은 본 발명의 방법이 진행되는 동안 즉흥적으로 실시할 수 있다.
단백질 용해물의 분취물(aliquot)을 플레이트 상에 흡착된 1차 항체와 접촉시킨다.
상기 항체는 적어도, 헤모-유도체 샘플과 접촉된 후 분화된 줄기세포에 의해 발현될 수 있는 상피세포에 결합할 것이다.
상기 결합의 판정은 적어도 1종의 상피 마커 (제2의 일차 항체)에 대한 새로운 항체를 사용하거나 또는 1차 항체에 대한 항체를 사용함으로써 수행한다. 피검 샘플의 발색을 측정하기 위하여, 이들 두 가지 항체들 모두 적절한 기질 (이 방법을 수행하는 동안 즉흥적으로 첨가된다)과 반응할 수 있는 효소(예컨대 디아미노벤지딘 또는 알칼라인 포스파타제 또는 HRP)와 결합하는 것이 바람직하다.
발색 강도는 적절한 장비를 이용하여 측정하며 암종 또는 암종과 연관된 잔여 질병에 걸린 개체의 헤모-유도체 샘플과 접촉 후 상피세포 중 분화된 줄기세포에 의해 발현된 적어도 1종의 상피 마커의 양을 가리키는 지침이 된다.
헤모-유도체 샘플과 접촉된 줄기세포 중 적어도 1종의 상피 마커의 발현을 검정하는 단계인 단계 (ii)는, PCR 좋기로는 RT-PCR, 더욱 좋기로는 실시간 RT-PCR에 의해 수행할 수 있다.
이 경우, DNA 또는 cDNA (목적하는 유전자에 대응하는 메신저의 역전사에 의해 수득됨)의 증폭을 위해, 2개의 DNA 필라멘트들 중 하나에 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드를 1쌍 이상을 이용할 수 있다. 각각의 DNA 필라멘트에 올리고뉴클레오타이드가 결합한 후, 전통적인 PCR을 이용하여 이들 사이에 끼어든 DNA 서열을 증폭할 수 있을 것이다.
각각의 올리고뉴클레오타이드 쌍은 좋기로는 15-30 뉴클레오타이드로 구성되는 것이 바람직하다. 목적하는 서열로부터 출발하는 올리고뉴클레오타이드를 생성하기 위해, 예컨대 현재 이용가능한 알고리듬을 이용함으로써, 목적하는 유전자 서열에 기반하여 상기 올리고뉴클레오타이드를 설계할 수 있다. 목적하는 유전자는 시토케라틴, 좋기로는 시토케라틴 18, 19, 20 또는 21을 코딩하는 것이 바람직하다.
헤모-유도체 샘플과 접촉된 줄기세포 중 적어도 1종의 상피 마커의 발현을 검정하는 단계인 단계 (ii)는 면역형광법에 의해 실시되며, 상기 줄기세포를 고정제(fixative agent)의 존재 하 또는 부재 하에 슬라이드 상에 착상시킨다. 이어서, 이들을 가능하게는 플루오로크롬 또는 효소와 컨쥬게이트될 수 있는, 적어도 1종의 상피 마커에 대한 특이 항체와 접촉시킨다. 상기 특이 항체가 유리되어 있는 경우 (즉, 컨쥬게이트되지 않은 경우), 검정을 진행하기 위해, 플루오로크롬 또는 효소에 컨쥬게이트된, 특이 항체에 대한 2차 항체를 사용한다. 상기 항체는 암종 또는 상기 암종과 연관된 잔여 질병에 걸린 개체의 헤모-유도체 샘플과 접촉 후 줄기세포에 의해 발현된 적어도 1종의 상피 마커(존재할 경우)와 결합할 것이다.
일단 이 절차가 수행되면, 분화된 줄기세포에 의한 적어도 1종의 상피 마커의 발현이 현미경으로 관찰된다.
본 발명의 방법에서, 분리된 헤모-유도체 샘플과 상피 세포 접촉 후, 줄기세포들 중 적어도 1종의 상피 마커가 발현되었다는 것은 암종 또는 그 암종과 연관된 잔여 질병이 존재함을 가리키는 것이다.
또한, 상기 발현은 암종의 진행 정도를 나타내는 척도이기도 하며, 이로부터, 질병의 예후를 가늠할 수 있다.
본 발명의 방법은 암종 또는 그와 관련된 잔여 암종에 걸린 개체의 추적 관찰을 가능케 하여 해당 종양을 제거할 수 있도록 적절히 치료받게 할 수 있다. 줄기세포 샘플에 의한 적어도 1종의 상피 마커의 발현 여부 검사가, 암종에 걸린 개체가 받은 치료적 처치(종양을 제거할 수 있는)에 후속되는 단계에서 수득된 헤모-유도체 샘플을 이용하여 수행되는 경우, 질병의 궁극적인 재발 여부를 모니터링하는 것이 가능하다.
이러한 가능성은 암종에 걸린 상기 개체의 치료적 처치에 후속적인 단계 동안, 적어도 1종의 상피 마커의 발현이 검사되는 경우, 신속한 치료적 개재가 이루어질 수 있도록 보장해준다.
이러한 상황에서, 상기 개체가 받은 치료적 처치의 후속 단계 (및 종양이 제거된 단계)에서 수득된 헤모-유도체 샘플에서, 줄기세포의 상피세포로의 분화를 유도할 수 있는 새로운 시그널이 있을 수 있는데, 이는 그 개체가 종양 또는 그와 관련된 잔여 질병에 새롭게 걸렸음을 나타내는 것이다.
마지막으로, 본 발명의 방법은 치료적 항종양 처치, 특히 화학/방사능 치료법의 효능을 모니터링하는데도 사용된다.
이 경우 본 발명의 방법은 줄기세포의 적어도 1종의 상피 마커의 발현 수준을, 이들 줄기세포가 아픈 개체의 헤모-유도체 샘플과 접촉된 후 개체가 처치받은 치료 단계의 다양한 단계에서의 수준과 비교하는 것을 포함한다.
상기 발현 수준의 변경은 치료 자체의 진행을 가리키는 것이다.
예컨대, 초기 단계에 비해 치료적 처치의 진전된 단계에서의 발현 수준이 저하되었다면 이는 치료가 효과가 있음을 가리키는 것이다. 본 발명의 방법은 특이성이 60% 내지 100%, 좋기로는 70% 내지 90%임을 특징으로 한다.
방법의 민감성과 관련하여, 민감성은 60% 내지 100%, 좋기로는 70% 내지 90%로 가변적이다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 방법은 연구 기술의 병합 목적에서, 현재 이용되는 다른 진단법/예후측정법과 병용될 수도 있다.
예컨대, 본 발명의 방법은: 각각의 개개 환자에 대한 치료/예후 접근법을 즉석에서 설명할 수 있도록, 대장내시경 검사, 불투명 관장제, 분변 DNA 검사법 및 기타 가능한 다른 연구조사법과 병합하여 적용할 수 있다.
공지의 검사 기법으로부터 유래된 임상 데이터와 본 발명의 방법을 종합함으로써 개개인에 대한 치료적 접근법에 대한 규정을 더욱 용이하게, 그리고 개선시킬 수 있으며 이는 암종을 치료하는데 있어서 매우 유리한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 적어도 1종의 상피 마커 (1차 항체를 정의함)에 대한 적어도 1종의 항체 또는 적어도 1종의 상피 마커의 cDNA 또는 DNA의 증폭을 위한 적어도 1쌍의 올리고뉴클레오타이드; 및/또는 적어도 1종의 줄기세포 샘플; 및/또는 상기 줄기세포를 배양하기 위한 수단을 포함하는 키트에 관한 것이다. 상피 마커에 대한 상기 항체는 시토케라틴, 좋기로는 시토케라틴 18, 시토케라틴 19, 시토케라틴 20 또는 시토케라틴 21에 대한 것이며; 더욱 좋기로는 항체가 시토케라틴 19에 대한 것이 바람직하다.
상피 마커에 대한 상기 항체는 흔히 이용되는 면역형광기술 (예컨대 텍사스 레드(Texas Red), 플루오레신(Fluorescein)(FITC), 피코에리스린 (Ficoerythrin) (PE), 테트라메틸 로다민 이소티오시아네이트 (Tetramethyl Rhodamine Isothiocyanate) (TRITC))에 의해 검사하기에 적합한 플루오로크롬과 직접 컨쥬게이트될 수 있으며, 또는, 상기 항체는 예컨대 단백질과 같은 적절한 분자와 컨쥬게이트되는데, 이에 의해 예컨대 면역조직화학 (예를 들면 상기 분자는 다미노벤지리딘 또는 알칼라인 포스파타제 또는 HRP일 수 있다)과 같은 흔한 비색 분석을 이용하여 측정할 수 있다.
별법으로, 1차 항체는 유리되어 있는 것일 수 있다. 이 경우, 측정을 위해, 전술한 바와 같이 컨쥬게이트된 (1차 항체에 대한) 2차 항체가 이용된다. 후자의 경우, 키트는 2차 항체, 즉 1차 항체에 대한 항체를 더 포함한다. 상기 2차 항체는 측정을 위해 플루오로크롬 또는 효와 컨쥬게이트된다.
키트는 본 발명의 방법을 수행하기 위해, 1회용의 멸균 또는 멸균가능한, 예컨대 멀티-웰 플레이트일 수 있는 기구를 더 포함할 수 있는데, 상기 플레이트는 적어도 1종의 상피 마커에 대한 적어도 1종의 항체에 의해 전처리된 것이다 (또는 전처리 되지 않은 것이다). 키트는 또한 검사법을 수행하기 위한 유용한 물질, 적어도 1종의 상피형 마커의 cDNA/DNA의 역전사 및 증폭을 수행하는데 적합한 용액을 더 포함할 수 있으며, 상기 용액은 예컨대 역전사효소, DNA 증폭을 위한 효소, 염, 뉴클레오타이드의 혼합물, 계면활성제 또는 환원제를 포함할 수 있다.
또한, 상기 물질은 예컨대 세포 용해 또는 세척, 고정화, 블로킹, 중화 또는 검사를 위한 용액일 수 있다.
상기 키트는 개체가 암종에 걸렸는지 또는 암종과 관련된 잔여 질병에 걸렸는지를 진단하거나, 또는 암종에 걸린 개체의 예후를 설명하는데도 유용하다.
또한, 상기 키트는 암종에 걸린 개체에 행하여진 치료적 처치 또는 그 후속 처치의 효능을 모니터링하는데도 이용될 수 있다. 달리 설명하면, 키트는 본 발명의 방법을 실시하는데 이용된다.
실시예
세포
골수로부터 유래된 단핵 인간세포(BM-MNCs)를 STEMCELL Technologies사로부터 구입하였다.
BM-MNCs가 도착하자마자, 이것을 10% 혈청 (중간엽 줄기세포의 소태아혈청, StemCell Technologies사) 및 페니실린/스트렙토마이신 1x (StemCell Technologies사)를 함유하는 배양 배지 중 250㎕의 Dnase I (1mg/ml)를 이용하여 해동하였다.
상기 혈청 샘플을 이용한 자극 실험을 셋업하기 전에 세포들을 최소한 3일간 배양하였다.
상기 세포를 배양 및 증폭시키는데 사용된 확장 배지는 성장 인자 (StemSpan CC100-StemCell Technologies)가 보강된 Alpha MEM 또는 StemSpan SFEM (무혈청 확장 배지, StemCell Technologies사)로 구성되었다.
인간 혈청을 이용한 BM - MNC 자극 분석
결장직장 암종에 걸린 개체 및 건강한 공여자들로부터 기원하는 혈액 샘플들로부터 혈청을 수득하였다.
암종에 걸린 19명의 19 개체들을 본 발명의 방법으로 검사하였는데, 더욱 구체적으로 설명하면, 상기 개체들은 서로 다른 단계의 선암종에 걸린 환자들이었다.
표 1은 암종에 걸린 18명의 개체에 대한 임상 데이터를 요약한 것이다.
표 1은 또한 건강한 개체 공여자들과 관련한 실험 데이터도 수록하고 있다. 특히, 12 명의 건강한 샘플들을 분석하였다 (S 1-12).
표 1에는 다음 사항이 보고되어 있다:
1) 종양의 조직학적 진단;
2) 국제 종양 단계분류법 (pTNM으로 표시됨, 여기서 T는 내장층의 침습 정도를, N은 림프절의 상태를, M은 전이 여부를 나타낸다); 및
3) CK-19에 대한 양성(positivity) 여부 (BM-MNC CK-19+로 표시됨), 즉, CK-19를 발현하는 세포의 존재 여부.
Figure pct00001
각각의 혈청 샘플을 0.22㎛의 포어를 갖는 적절한 필터 (Corning Costar)로 멸균시켰다.
각 웰에 도합 총 약 100000개의 세포들을 접종하였다 (약 100000 cellule/cm2). 250 ㎕의 세럼을 1250 ㎕의 배양 배지에 첨가하였다 (즉, 혈청을 1:6으로 희석함).
5% CO2를 함유하는 분위기 하, 37℃에서 120 시간 배양한 후, 세포들을 회수하고 면역형광법에 의해 CK19 시그널을 검사하였다.
모든 실험은 이중으로 반복 수행하였다.
면역형광법
BM-MNCs을 이들이 배양된 지지체로부터 탈착시켜 100 ㎕의 PBS에 재현탁시켰다. 이어서, 이들을 편광 슬라이드(polarized slides) 상에 분포시킨 다음 주변 온도에서 밤새 건조시켰다.
이어서 이들을 주변온도에서 10분간, 96% 에탄올 중의 슬라이드에 고정시켰다.
TBS (트리스 완충염수)로 세척한 후, 항체와의 비특이적인 상호반응을 감소시키기 위해 (즉, 배경 노이즈를 감소시키기 위해), 전술한 바와 같이 고정된 세포들을 블로킹 단계로 처리하였다.
블로킹 단계는 TBS (Sigma사) 중 3% 농도의 염소 혈청 중에서 15분간 주변 온도에서 수행하였다.
BM-MNCs 상의 특이적 단백질을 검사할 목적으로, 1차 항체로는 인간 시토케라틴-19(항인간 시토케라틴, DAKO)에 대한 쥐의 모노클로날 항체를 사용하였다.
항체는 PBS 중에서 1:50의 희석 비율로 사용하였고 (초기 농도 21 mg/l, 최종 농도 0.42 mg/l) 모노클로날 항체와 슬라이드 상에 고정된 세포와의 반응을 4℃에서 밤새 수행하였다.
이어서, 비결합 항체를 제거하기 위하여 세포들을 TBS로 세척하였다. 이어서, 이들을 PBS에 1:100으로 희석 (초기 농도 2 mg/ml, 최종 농도 0.02 mg/ml)시킨 2차 항체(Alexa Fluor 488, Invitrogen사)와 함께 주변 온도에서 30분간 인큐베이션시켰다.
동일초점 현미경을 이용하여 양상 시그널(즉, 형광 세포)을 판독하였다. 현미경으로 세포들을 관찰하기 전에, 세포 핵을 마킹하기 위해, 증류수에 1:700의 비율로 희석한 TO-PRO (InVitrogen)를 첨가하였다.
이미지들을 모아, Interactive LCS software (Leica, Wetzlar, Germany)로 분석하였다.
얻어진 결과를 표 1(BM-MNC CK-19+) 및 도 4-9에 요약하였는데, 이들 결과는 암종에 걸린 개체들의 혈청 모두가 상피세포에서 중간엽 세포의 분화를 유도할 수 있는 종양 기원의 시그널을 함유함을 분명히 입증하고 있다.
건강한 개체로부터 기원하는 혈청은 상피 관점에서 중간엽 줄기세포의 시험관내 분화를 유도하지 몫한다. 총 12명의 개체 중 3명의 정상 개체의 혈청만이 매우 약한 양성을 나타내었다 (샘플 S-6, 8 및 10 참조).
건강한 개체의 혈청으로 처리된 중간엽 줄기세포들은 현미경 관찰시 마킹된 핵만을 나타냈을 뿐이다 (도 1-3, 블랙 시그널). 시토케라틴 19와 연관지을만한 세포질 시그널은 전혀 관찰되지 않았다 (도 1 (핵 마킹), 도 2 (CK-19 마킹) 및 도 3 (2개의 마킹을 포갬) 참조).
암종에 걸린 개체의 혈청으로 처리된 중간엽 줄기세포들은 시토케라틴 19와 연관지을만한 강한 세포질 시그널 (도 4-6 및 이들의 확대도인 도 7-9, 회색 시그널)을 나타내었는데, 상기 시그널은 세포 핵을 둘러싸고 있다 (도 4 및 7 (핵 마킹), 도 5 및 8 (CK-19 마킹) 및 도 6 및 9 (2개의 마킹을 포갬 참조).
방법의 특이성 및 민감성 계산
방법의 특이성을 다음 방정식을 이용하여 구하였다:
특이성 = 진짜 음성/총 건강한 대상 = 진짜 음성/(진짜 음성 + 거짓 양성)
방법의 민감성은 다음 방정식을 이용하여 구하였다.
민감성 = 진짜 양성/아픈 대상자의 수 = 진짜 양성/(진짜 양성 + 거짓 음성)
본 발명의 방법에 있어서, 민감성은 94.8%로 계산되었고, 특이성은 75%로 계산되었다.

Claims (21)

  1. (i) 분리된 성체 줄기세포를 헤모-유도체의 분리된 샘플과 접촉시키는 단계;
    (ii) 상기 줄기세포 중 적어도 1종의 상피 마커의 발현여부를 검정하는 단계
    를 포함하는,
    암종 또는 암종과 관련된 잔여 질병을 진단하거나, 암종의 예후를 관측하거나, 또는 암종에 대한 항종양 치료법의 효능을 모니터링하거나, 또는 암종에 걸린 개체에 대한 추적관찰을 위한 모니터링을 수행하기 위한 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 암종은 결장직장 암종, 위장의 암종, 유선암종, 폐 암종, 전립선의 암종, 간의 암종, 난소의 암종, 신장의 암종, 갑상선의 암종, 방광의 암종 또는 췌장의 암종으로부터 선택되는 것인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 헤모-유도체의 분리된 샘플은 혈청 또는 혈장인 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 줄기세포는 다능형 줄기세포이고, 좋기로는 중간엽 줄기세포, CD133+ 세포, CD44+ 세포, CD90+ 세포, CD29+ 세포, CD105+ 세포, CD117+ 세포, CD56+ 세포 및 CD73+ 세포로부터 선택되는 것인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 상피 마커는 시토케라틴, 좋기로는 CK-18, CK-19, CK-20 또는 CK-21, 더욱 좋기로는 CK-19인 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 줄기세포를 헤모-유도체의 샘플과 접촉시키는 단계인 단계 (i)은 상기 줄기세포를 지지체에 접종하는 단계 및 샘플을 줄기세포용 배양 배지에 희석하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 헤모-유도체의 샘플을 세포용 배양 배지에 희석하는 것은 1:2 내지 1:20, 좋기로는 1:4 내지 1:8의 비율로 수행되는 것인 방법.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 배양 배지에 희석된 상기 샘플을 상기 줄기세포에 첨가하는 것인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 줄기세포는 48 내지 180 시간, 좋기로는 90 내지 150 시간 동안 배양 배지에 희석된 샘플에서 성장되는 것인 방법.
  10. 전술한 항들 중 어느 하나의 항에 있어서, 적어도 1종의 상피 마커의 발현을 검정하기 위한 상기 단계는 면역형광법, 면역조직화학법, ELISA 또는 RT-PCR에 의해 수행되며; 좋기로는 상기 PCR은 실시간 PCR인 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, ELISA를 이용하여 수행되는, 적어도 1종의 상피 마커의 발현을 검정하기 위한 상기 단계는 다음 단계들, 즉:
    ● 헤모-유도체의 샘플과 접촉되어 있던 줄기세포들을 용해시키는 단계;
    ● 전단계에서 수득된 단백질 용해물의 분취물을 상피 마커에 대한 적어도 1종의 항체와 접촉시키는 단계로서, 상기 항체는 좋기로는 적절한 지지체 상에 흡착되어 있는 것인 단계; 및
    ● 적어도 1종의 상피 마커와 상기 항체 사이의 결합을 검사하는 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  12. 제10항에 있어서, 면역형광법을 이용하여 수행되는, 적어도 1종의 상피 마커의 발현을 검정하기 위한 상기 단계는 다음 단계들, 즉:
    ● 헤모-유도체의 샘플과 접촉되어 있던 줄기세포들을 고정시키는 단계;
    ● 전단계에서 고정된 상기 세포들을 상피 마커에 대한 적어도 1종의 항체와 접촉시키는 단계; 및
    ● 분화된 줄기세포에 의해 발현되는 적어도 1종의 상피 마커와 상기 항체 사이의 결합을 검사하는 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 하나의 항에 있어서, 적어도 1종의 상피 마커의 발현을 검사하는 상기 단계는 배양 배지에 희석된 헤모-유도체의 상기 샘플을 상기 세포들로부터 제거한 후에 실시하는 것인 방법.
  14. 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, 암종에 대한 항종양 치료법의 효능을 모니터링하는 것은 아픈 개체가 받은 치료적 처치법의 다양한 단계들에 있어서의, 아픈 환자들의 분리된 샘플 중의 적어도 1종의 상피 마커의 발현 수준들을 비교하는 것을 포함하는 것인 방법.
  15. 전술한 항들 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 방법은 60% 내지 100%, 좋기로는 70% 내지 90%의 특이성을 갖는 것이 특징인 방법.
  16. 전술한 항들 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 방법은 60% 내지 100%, 좋기로는 70% 내지 90%의 민감성을 갖는 것이 특징인 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 하나의 항에 기재된 방법을 수행하기 위한 키트로서:
    ● 상피 마커에 대한, 좋기로는 플루오로크롬이나 효소와 컨쥬게이트되어 있는, 적어도 1종의 항체 또는 상피형의 적어도 1종의 마커의 증폭을 위한 적어도 1쌍의 올리고뉴클레오타이드; 및/또는
    ● 줄기세포의 샘플; 및/또는
    ● 상기 줄기세포를 배양하기 위한 배지
    를 포함하는 것인 키트.
  18. 제17항에 있어서, 상기 항체는 시토케라틴에 대한 것이고, 좋기로는 시토케라틴18, 시토케라틴 19, 시토케라틴 20 또는 시토케라틴 21에 대한 것이며, 더더욱 좋기로는 시토케라틴 19에 대한 것인 키트.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 키트는 적어도 1종의 상피 마커에 대한 상기 항체에 대한 2차 항체를 더 포함하고, 여기서 상기 2차 항체는 플루오로크롬 또는 효소와 컨쥬게이트되어 있는 것인 키트.
  20. 제17항 내지 제19항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 키트는 1회용의 멸균 또는 멸균가능한 기구, 좋기로는 멀티-웰 플레이트를 더 포함하며, 상기 플레이트는 좋기로는 적어도 1종의 상피 마커에 대한 적어도 1종의 항체에 의해 전처리된 것인 키트.
  21. 제17항 내지 제20항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 키트는 검사 단계를 수행하는데 유용한 물질을 더 포함하며, 상기 물질은: 역전사효소, DNA의 증폭을 위한 효소, 염, 뉴클레오타이드 혼합물, 계면활성제 또는 환원제를 포함하는, 상피형의 적어도 1종의 마커의 증폭을 수행하기 위한 용액; 또는 세포 용해를 위한 용액, 세척 용액, 고정화 용액, 블로킹 용액, 중화 용액 또는 검사용 용액으로부터 선택되는 것인 키트.
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