KR100951409B1

KR100951409B1 - 수지상 세포로의 단핵세포 분화를 억제하는 조성물 및 이를 포함하는 키트

Info

Publication number: KR100951409B1
Application number: KR1020037009204A
Authority: KR
Inventors: 반쉐로쟈끄에프; 팰루카안나캐롤리나; 블랑코빠뜨리끄
Original assignee: 베일러 리서치 인스티튜트
Priority date: 2001-01-09
Filing date: 2002-01-08
Publication date: 2010-04-07
Also published as: MXPA03006100A; US20090263474A1; WO2002067760A3; EP1351707A4; EP1351707B1; JP2004519475A; US20020160974A1; ES2363761T3; CA2433806C; AU2002246955B2; US20040067232A1; KR20030070100A; CN101612402A; DE60239522D1; JP2009132736A; EP2236156A2; HK1061353A1; DK1351707T3; EP1351707A2; WO2002067760A2

Abstract

본 발명은 인터페론 길항제 및 Flt3 리간드(Flt3L)를 투여함으로써 환자의 자가면역 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 하나 또는 그 이상의 인터페론 길항제 및 하나 또는 그 이상의 Flt3L 길항제를 포함하는 조성물들, 자가면역 질환 발현에 대한 환자의 위험을 결정하는 생체외 측정법 및 특히 이 측정법을 사용하는 키트를 제공한다.

자가면역 질환, 인터페론 길항제, Flt3L

Description

수지상 세포로의 단핵세포 분화를 억제하는 조성물 및 이를 포함하는 키트{A COMPOSITION TO INHIBIT MONOCYTE DIFFERENTIATION INTO DENDRITIC CELLS AND A KIT COMPRISING THE SAME}

본 출원은 본 명세서에 그 전체 내용이 참조로서 포함되는 2001.1.9 출원된 미국 가출원 제 60/260,541을 우선권으로 주장한다.

본 발명은 자가 면역 질환 및 이와 관련된 진단 방법에 관한 것이다.

자가 면역 질환은 파괴적이고 불구를 만드는 질병이고, 환자 자신의 면역체계가 환자 자신의 신체 또는 조직을 공격함으로써 자신에게 적대적이 될 경우 발생한다. 자가 면역 질환의 한 예는 다장기 침범(multi-organ involvement) 및 자가 특이 T 세포 및 B 세포의 존재를 포함하는 면역 이상증을 특징으로하는 전신성 홍반성루푸스(systemic lupus erythematosus(SLE))이다. 뉴클레오좀에 적대적인 자가 항체들은 SLE의 특징을 나타내고 고사 세포의 부적절한 처리는 SLE의 성장에 중요한 발병 사건일 수 있다. SLE는 최초의 변형이 면역 작동체, 즉 수지상 세포(dendritic cell)(DCs)를 등록하고 제어하는 세포의 레벨일 수 있다는 것을 나타내는 면역 체계의 체액 및 세포성 림(limbs) 모두의 조절 곤란에 기인한다.

수지상 세포는 T 세포 매개성 면역 반응을 유발하는 세포를 제공하는 특이화된 항원이다(Steinman, R.M.(1991)Ann.Rev.Immunology, Vol.9,pp.271-296 and Banchereau et al.(2000)Ann.Rev.Immunol. 18:767). DCs는 면역 반응을 유발하고 유지하며 사멸 세포를 포획하는 것으로 나타났고 이들의 항원을 CD4⁺T 세포에 제공하여, B 세포를 포함하는 다른 면역 작동체를 활성화한다. 골수 안의 DC 전구세포(progenitor)는 이들이 높은 발병 능력을 가진 면역 세포로서 거주하는 곳인 조직으로 돌아가는 전구체를 순환시킨다. 조직이 피해를 입자마자, DCs는 항원(Ag)을 포획하고 뒤이어 이들이 희귀 Ag-특이 T 세포를 선택하는 림프 기관으로 이동하여, 면역 반응을 개시한다. DCs는 항원을 CD8+T 세포 및 B 세포와 같은 항원-특이 세포뿐만 아니라 대식세포(macrophage), 호산구(eosinophils) 및 NK 세포와 같은 비특이 세포를 포함하는 면역 작동체를 순차적으로 제어하는 CD+4T 세포에 제공한다. CDs는 또한 B 세포를 직접 활성화시킬 수 있고 생체 밖에서 플라스마 세포로의 이들의 분화를 유발한다.

DC 전구체("DCpre")의 3개 하부세트인 (1) CD14⁺단핵세포, (2) CD11c⁺골수성 DCpre 및 (3) CD11c^-형질구양(림프)(plasmacytoid(lymphoid)DCpre는 혈액 내에서 순환한다. 단핵세포는 미성숙 DCs 또는 대식세포(MΦ)의 특징을 나타내는 세포로 분화될 수 있다. 미성숙 DCs는 CD40L 및/또는 LPS로 치료받거나 또는 TNF, IL-1 및 IL-6을 포함하는 사이토카인의 조합으로 배양될 때 성숙한 DCs가 된다. CD11c⁺골수성 DCpre는 국부 사이토카인 환경에 따라 간질(interstitial)DC(intDC), 랑거한스 세포(LC) 또는 MΦ를 발생시킨다.

CD11c^-IL-3Rα⁺림프DC 전구체는 인터페론-알파(IFN-α)의 주요 공급원이다. INF-α의 높은 레벨은 루푸스 혈청에서 대개 발견된다(kim et al., Clin. Exp. Immunol. 70:562-269, 1987). 게다가, INF-α치료는 대개 자가항체들의 출연을 유발하여 결국 SLE를 포함하는 자가 면역 질환의 발현을 유발한다(Ronnblum et al., J. Intern. Med. 227:207-210, 1990). 항-INF-α항체는 SLE 환자에서 보고되었다( Suit et al., Clin. Exp. Rheumatol. 1:133-135).

형질구양 DCs는 차례로 골수성 DCs의 분화 및 B 세포의 성장 및 활성화에 영향을 미치는 IFN-α를 생산하는 것으로 보고되었다. Spit 등(J Exp Med 192(12):1775-84, 2000) 및 Blom 등(J Exp Med 192(12):1785-96.2000)은 CD11c^-형질구양 DCs가 인간의 림프계 기원이라는 것을 보고한다. Siegal 등(Science 284:1835, 1999)은 림프성 DCs(형질구양 DCs)가 비활성화된 단순포진바이러스(herp es simplex virus)에 노출될 경우 상당량의 IFN-α를 생산하는 것을 보고한다. Cella 등(Nature Medicine 5(8):868-70, 1999)은 림프성 DCs(형질구양 DCs)가 독감 바이러스뿐만 아니라 CD40 리게이션에 반응하여 상당량의 IFN-α를 생산하는 것을 보고한다.

SLE 안의 자가항체들(autoAbs)은 3개의 주요 항목 (1) 항핵 및 항이중 가닥 DNA 항체들; (2) 혈관내피세포(endothelial cells) 및 혈소판(항인지질/β2 당단백질)의 표면에 영향을 미치는 자가항체들; 및 (3) 조혈세포의 표면에 있는 분자에 대해 영향을 미치는 자가항체들(review of Cabral and Alarcon-Segovia (1998) Curr. Opin. Rheumatol. 10:409 참조)로 특징지울 수 있다. 세포 및/또는 조직 항원항체 반응에 의해 발생된 직접적인 피해 이외에도, 많은 질병의 증상은 조직 상의 면역 복합체의 침적을 통한 간접 피해에 기인한다. 이 작용기작은 SLE 신장염(nephritis), 관절염(arthritis) 및 혈관염(vasculitis)의 일부 형태에 원인이 되는 것으로 나타나고 있다(Lahita, R.G. 1999. Systemic Lupus Erythematosus. Academic Press; Kammer, G.M.,and G.C. Tsokos. 1999. Lupus, Humana Press). Fc 수용체("FcR") 및 C3b-수용체(C3b-R)기능장애뿐만 아니라 보체 단백질 및 C-반응성 단백질(이들 모두는 항-DNA/뉴클레오좀 복합체의 제거에 필수적이다)을 포함하는 면역 복합체 청소에서의 결점들은 SLE의 발현에 영향을 줄 수 있다(Lahita, R.G. 1999.Academic Press; Kammer,G.M.,and G.C.Tsokos.1999 Humana Press). B 세포들은 이들이 자가 항체의 생산 및 감마글로불린 과다혈증(hypergammaglobulinemia)의 원인이 되기 때문에, SLE 발명에 중요한 역할을 한다.

Hooks 등(N. Engl.J.Med.301:5, 1979)은 SLE를 포함하는 자가 면역 질환을 가진 환자내에서 순환하는 면역 인터페론의 존재를 기술한다. Kim 등은 IFN-α의 레벨이 진료 활동 목록과 관련되어 있다는 것을 개시하였다. Preble 등(J. Exp. Med. 157:214, 1983) 및 von Wussow 등(Arthritis Rheum. 32:914, 1989)은 2-5A 합성 효소 및 MX 단백질, INF-α에 의해 특이적으로 유발되는 두 개의 단백질의 높은 레벨이 혈청 IFN-포지티브 및 혈청 INF-네거티브 SLE 환자들의 단핵 세포에서 발견되었다는 것을 개시하였다. Vallin 등(J. Immunol. 163:6306 1999)은 INF-α유발 인자가 미성숙 DCs의 특징을 가진 백혈구들에 작용한다는 것을 개시한다. Batteux 등(Eur. Cytokine Netw. 10:509, 1999)은 SLE 혈청에 의한 INF-α생산의 유발이 FcγRⅡ(CD32)에 의존한다는 것을 개시한다.

INF-α치료의 한 합병증은 갑상선 기능 장애가 되는 가장 보편적인 자가 면역 이상(경우들의 약 4% 내지 19%) 이다(Ehrenstein et al., Arthritis Rheum. 36:279, 1993; Okanoue et al., J. Hepatol. 25:283, 1996; Ronnblom et al., Ann. Intern. Med. 115:178, 1991; Kalkner et al., Qjm. 91:393, 1998). 또한, Schilling 등(Cancer 68:1536, 1991)은 INF-α치료가 0.15% 내지 0.7%의 빈도를 가진 SLE를 유발할 수 있다는 것을 개시한다. 모든 경우는 항핵 항체 및 항-DNA 항체의 규정농도의 유발 또는 현저한 증가와 관련되어 있다.

타입Ⅰ당뇨병은 INF-α가 질병 발생의 중요한 역할을 하는 다른 자가 면역 질환이다. Foulis 등(Lancet 2:1423, 1987) 및 Huang 등(Diabetes 44:658, 1995)은 이자섬(pancreatic islet)에 의한 INF-α의 발현과 인간의 자가 면역 당뇨병의 발현 사이의 강한 연관관계를 개시한다. 게다가, Chakrabarti 등(J. Immunol. 157:522, 1996)은 이자 랑게한스섬 내의 B 세포에 의한 IFN-α의 발현이 유전자 변형 생쥐 모델에서 당뇨병을 일으킨다는 것을 개시한다. 또한, Fabris 등(Lancet 340:548, 1992) 및 Guerci 등(Lancet 343:1167, 1994)은 IFN-α치료가 인간에게 타입Ⅰ의 당뇨병을 유발할 수 있다는 것을 개시한다.

FMS 같은 티로신 키나아제 3("Flt3")는 또한 KIT(c-kit RTK), FMS(M-CSF RTK) 및 혈소판 유도 성장 인자(PDGF) 수용체를 포함하는 타입Ⅲ 티로신 키나아제 수용체 집단의 부분이다. KIT 및 FMS 수용체들, 주세포 인자 및 M-CSF 각각을 위한 리간드와 유사하게, Flt3 수용체는 Flt3-리간드("Flt3L")라고 불리는 동족 분자에 의해 활성화된다. Flt3는 c-fms 및 c-kit 수용체와 관련된 티로신 키나아제 수용체의 변형 형태이다(Rosnet et al. Oncogene, 6, 1641-1650, 1991). Flt3L은 DCs의 발현 및 항종양 면역 반응의 발생을 활성화하는 것으로 나타난 조혈 사이토카인이다(미국 특허 제 5,554,512, "Flt3 수용기를 위한 리간드"). Flt3L은 전구체, 주세포의 성장 및 분화를 조절하는 것으로 밝혀졌다(Blazar et al.(2001) Biology of Blood and Marrow Transplantation 7:197-207 및 미국 특허 제 5,843,423참조). 단핵세포 배양의 Flt3L 치료는 골수성 및 림프성-관련 DCs의 절대수의 현저한 증가 및 도너 비장 T 세포의 비율의 감소를 낳게 하는 것으로 나타났다(Blazar 등).

본 출원 내에서 언급된 간행물의 모든 공보들은 참고로 전부 본 출원서에 포함된다.

본 발명은 단핵세포의 환자 내의 수지상 세포로의 분화를 감소시키고 자가 면역 질환을 치료하기 위하여 (a) 적어도 타입 Ⅰ인터페론의 활성을 감소시키는 하나의 인터페론 길항제 및 (b) Flt3L의 활성을 감소시키는 적어도 하나의 Flt3 리간드(Flt3L) 길항제를 환자에게 투여하는 것을 포함하여 환자의 자가 면역 질환을 치료하는 방법들에 관한 것이다.

본 발명은 또한 타입Ⅰ인터페론의 활성을 감소시키는 (a) 적어도 하나의 인터페론 길항제 및 (b) Flt3L의 활성을 감소시키는 적어도 하나의 Flt3 리간드(Flt3L)를 포함하는 항원 제시의 능력이 있는 수지상 세포로의 단핵세포 분 화를 억제하는 치료 조성물에 관한 것이다. 이런 조성물들은 SLE를 포함하나 이에 제한되지 않는 자가 면역 질환 및 당뇨, 관절염, AIDS, 건선(psoriasis) 및 갑상선염(thyroiditis)을 포함하나 이에 제한되지 않는 다른 IFN-α조정 자가 면역 질환의 치료를 위한 치료 조성물들을 구성한다.

본 발명은 또한 (a) 환자로부터 혈청 샘플을 얻는 단계; (b) 혈청 샘플에서 IFN-α및 Flt3L 리간드를 정량하는 단계; 및 (c) IFN-α및 Flt3L의 양과 자가 면역 질환을 가진 환자로부터의 혈청에서 IFN-α및 Flt3L의 양을 비교하여, 자가 면역 질환 발현에 대한 환자의 위험을 결정하는 단계를 포함하여 자가 면역 질환 발현에 대한 환자의 위험을 결정하는 생체 밖 측정법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 자가 면역 질환 발현에 대한 환자의 위험을 결정하기 위한 키트 또는 환자의 생물학적 샘플에서 Flt3L 및 IFN-α를 탐지하는데 효과적인 Flt3L 및 IFN-α와 특이적으로 결합하는 조성물의 양을 포함하는 환자 내의 자가 면역 질환의 상태를 모니터링하는 키트에 관한 것이다. 이 키트는 (a) Flt3L와 결합하는 단일클론항체 및 (b) IFN-α와 결합하는 단일클론항체를 포함하는 조성물을 함유한다. 게다가, 조성물은 탐지가능하다. 상기 키트는 하나 또는 그 이상의 샘플들과 결합하는 조성물의 양을 탐지하기 위한 하나 또는 그 이상의 시약들을 포함할 수 있다.

본 발명은 단핵세포의 환자 내의 수지상 세포로의 분화를 감소시키고 자가 면역 질환을 치료하기 위하여 (a) 타입 Ⅰ인터페론의 활성을 감소시키는 하나 또는 그 이상의 인터페론 길항제 및 (b) Flt3L의 활성을 감소시키는 하나 또는 그 이상 의 Flt3 리간드(Flt3L) 길항제를 환자에게 투여하는 것을 포함하여 환자의 자가 면역 질환을 치료하는 방법들에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 단핵세포가 항원 제시를 할 수 있는 수지상 세포(Dcs) 속으로의 분화하는 것을 억제하는데 유용한 (a) 인터페론의 활성을 감소시키는 적어도 하나의 인터페론 길항제, (b) Flt3 리간드의 활성을 감소시키는 적어도 하나의 Flt3 리간드 길항제를 포함하는 조성물을 제공한다. 예를 들어, 조성물의 한 성분은 타입Ⅰ인터페론(예를 들어, IFN-α) 및 그 수용체 사이의 결합 또는 상호작용을 감소시키거나 억제하는 길항제일 수 있다. 이 조성물은 또한 Flt3L 및 그 수용체 사이의 결합 또는 상호작용을 감소시키거나 또는 억제하는 길항제를 포함한다.

본 명세서에서 사용된 "SLE-DCs"는 SLE("SLE 혈청")를 가진 환자로부터 얻는 혈청으로 단핵세포들을 배양함으로써 얻어지는 수지상 세포를 의미한다.

본 명세서에서 사용된 "인터페론 길항제"는 항체, 항체의 항원 결합 단편, 폴리펩티드, 펩티도미메틱(peptidomimetic), 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산, 유기 분자 또는 환자 또는 세포 내에서 세포 밖으로 타입Ⅰ인터페론의 활성 또는 기능을 감소시킬 수 있는 이들의 임의의 조합을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 "폴리펩티드"는 기능에 상관없이, 임의의 길이의 펩티드 및 단백질을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 "타입Ⅰ인터페론"은 IFN-α, IFN-β, IFN-varpi, 및 IFN-tau를 포함한다. Oritani 등((2001) Cytokine Growth Factor Rev. 12(4):337-48)은 타입Ⅰ인터페론의 다른 예들의 설명을 제공한다.

인터페론 길항제들은 타입Ⅰ인터페론(IFN-α) 및 항원 제시 세포가 되는 DCs로의 단핵세포의 분화를 감소시킴으로써 항원 제시 세포의 발생을 감소시키는 그 수용체 사이의 상호작용을 방해한다. 항원 제시 세포의 발생의 감소는 하나 또는 그 이상의 다른 작용기작에 의해 성취될 수 있으나, 이것이 일어나는 정확한 작용기작은 본 발명에서 중요하지 않다. 예를 들어, TNF 및/또는 호전적인 항-TNF 수용체 항체는 pDCS의 타입ⅠIFN 비생산 세포로의 분화를 가속함으로써 타입Ⅰ인터페론 분비를 감소시킬 수 있다.

화합물이 본 발명에서 유용한 인터페론 길항제인지를 동정하는데 사용될 수 있는 다양한 측정법이 있다. 이런 측정법들은 당업자에게 공지되어 있다. 한 측정법은 검사되는 화합물이 DCs로의 단핵세포 분화에 적합한 조건들하에서 단핵세포들의 배양액에 첨가될 경우 수지상 세포 분화 측정법이다. 상기 조건들은 단핵세포들이 DCs속으로 분화되도록 유도하기 위하여 SLE 혈청 또는 인터페론 각각의 첨가를 포함한다. 그래서, 만일 화합물이 화합물이 첨가되지 않는 배양액 안의 단핵세포들의 분화와 비교했을 때, 인터페론 및/또는 SLE 혈청이 유도한 DCs로의 단핵세포 분화의 억제를 일으킨다면, 화합물은 인터페론 길항제이다.

인터페론 길항제를 동정하는 다른 측정법은 라벨이 붙은 인터페론을 세포 상의 수용체의 결합의 억제가 측정되는 결합 측정법이다. 만일 화합물이 인터페론의 그 수용체 또는 인터페론 수용체들을 갖는 세포들에 대한 결합을 억제할 수 있다면, 화합물은 인터페론 길항제이다.

또한, 화합물이 인터페론 길항제인지를 결정하는 측정법은 바이러스와 같이 인터페론 생산 및/또는 분비를 정상적으로 유도하는 트리거(triggers)에 반응하여 세포들에 의해 생산되는 인터페론의 억제를 측정하는 것이다. 그래서, 만일 화합물과 트리거(예를 들어, 바이러스)의 존재하에서, 정상적으로 인터페론을 생산할 수 있는 세포가 인터페론을 생산하지 않거나 감소된 양으로 생산하는 경우, 화합물은 인터페론 억제자이다.

화합물이 인터페론 길항제인지를 결정하는 다른 측정법은 종양 세포 생존 측정법이다. 인터페론은 직접 성장 억제 및/또는 종양 세포 사망의 유도에 의해 항종양 활성을 갖는다. 인터페론에 감염되기 쉬운 이런 종양 세포의 예들은 악성 흑색종 세포주(melanoma cell lines)들이다. 이 종양 세포는 생존 측정법은 인터페론 및 인터페론 길항제하에서 배양되는 다른 감염되기 쉬운 악성 흑색종의 생존을 측정한다. 따라서, 만일 종양 세포들이 검사되는 화합물을 갖지 않는 동일한 배양액과 비교해서 검사될 화합물을 포함하는 배양액에서 생존한다면, 화합물은 인터페론 길항제이다.

화합물이 인터페론 길항제인지를 결정하는 다른 측정법은 MXA 단백질 및 인터페론 제어 인자들을 포함하는 인터페론-유도 단백질의 발현(단배질 및/또는 RNA 레벨)을 정량하는 측정법이다. 따라서, 검사될 화합물은 배양 조직 및 단백질에 첨가되고 특이화된 인터페론-유발 단백질들의 RNA 레벨들이 측정된다. 만일 화합물의 첨가가 단백질 및/또는 mRNA 발현의 레벨을 감소시킨다면, 화합물은 인터페론 길항제이다.

화합물이 인터페론 길항제인지를 결정하는 다른 측정법은 생체외 보호 측정 법이다. 정상적으로는, 인터페론을 세포 배양 조직에 첨가하면 세포 배양 조직으로 유입되는 바이러스의 세포용해성 활성으로부터 세포를 보호하여, 배양 조직에서 세포 생존을 증가시킨다. 그래서, 인터페론 길항제의 첨가는 보호를 무력하게 하고 세포 생존은 증가되지 않을 것이다. 따라서, 만일 인터페론의 항바이러스 활성의 억제가 측정되면, 화합물은 인터페론 길항제이다. 억제 측정은 바이러스에 감염되기 쉬운 세포의 사망의 결정을 기초로 한다.

인터페론 길항제의 예는 IFN-α를 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 인터페론 길항제의 다른 예는 가용성 IFN-α수용체이다. 가용성 수용체는 순환 타입Ⅰ인터페론에 결합하는데 유용하여 이것이 천연 수용체와 결합하는 것 및 DCs로의 단핵세포 분화의 발전을 일으키는 것을 억제한다. 본 발명의 다른 실시예에서, 인터페론 길항제는 IFN-α수용체를 결합하는 유기 분자일 수 있으나, 이런 결합, 즉, 비기능적 수용체 리간드 모방체(ligand mimic)의 다운스트림(down-stream) 효과를 일으키지 않는다. 이런 유기 분자는 결합할 수 있는 임의의 IFN-α를 대체하고 이를 통해 수용체를 무력하게 하기 위하여, 수용체 활성화를 일으키지 않고 수용체의 IFN-α결합 포켓과 특이적으로 결합할 수 있다. 본 발명의 다른 실시예에서, 인터페론 길항제는 인터페론 또는 Flt3L 또는 모두를 특이적으로 결합하는 단일클론항체의 상보성 결정 부위(complementarity determining region(CDR))를 포함하는 펩티드를 포함한다. 본 발명의 또 다른 실시예에서, 인터페론 길항제는 융합 펩티드이다.

본 발명에서 유용한 인터페론 길항제는 많은 다른 작용기작에 의해 타입Ⅰ인 터페론의 활성을 감소시킬 수 있고 본 발명은 임의의 특정한 작용기작에 의존하지 않는다. 본 발명의 인터페론 길항제는 생체내에서 활성이 감소되거나 없는 변형된 IFN-α를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 타입Ⅰ인터페론에 의한 항원-제시 세포의 발생을 붕괴시키는 것과 관련하여, 인터페론 길항제는 인터페론의 신호 경로에서 많은 다른 교차점에서 타입Ⅰ인터페론의 활성에 영향을 미칠 수 있다. 약간의 실시예들로서, 길항제는 인터페론 단백질 자체의 활동; 타입Ⅰ인터페론 수용체의 활동; 인터페론의 수용체에의 결합; 타입Ⅰ인터페론 신호전달 및/또는 형질 도입 경로; 정상적으로 타입Ⅰ인터페론을 생산하는 세포로부터 타입Ⅰ인터페론 방출; 및 정상적으로 타입Ⅰ인터페론을 분비하는 세포들로부터 타입Ⅰ인터페론의 분비를 봉쇄할 수 있다. 정상적으로 인터페론을 생산하는 세포들의 분화 또는 발생의 억제는 TNF 및/또는 호전적인 항-TNF 수용체(들) 항체 및/또는 세포에 TNF와 같은 신호를 전달하는 분자들을 투여함으로써 얻을 수 있다. 이런 타입의 화합물들은 본 발명에 의해 제공되는 인터페론 길항제의 예들이다. 게다가, 항원 제시 세포들의 분화 및 성장에 필요한 타입Ⅰ인터페론 공동-인자들의 비활성화는 본 발명의 인터페론 길항제의 다른 가능한 작용기작이다.

본 명세서에서 사용된 "Flt3L 길항제"는 항체, 항체의 항원 결합 절편, 폴리펩티드, 펩티도미메틱, 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산, 유기 분자 또는 Flt3L의 활성을 감소시킬 수 있는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 예를 들어, Flt3L 길항제는 모세포의 수지상 세포들로의 분화를 억제하기 위하여 Flt3 리간드("Flt3L") 및 그 수용체 사이의 상호작용을 간섭할 수 있다. 항원 제시 세포들의 발생의 감소는 하나 이상의 다른 작용기작에 의해 성취될 수 있다. 예를 들어, Flt3L은 SLE 에서 차례로 자가 항원 제시를 일으킬 수 있는 약해지지 않는 DC 활성화에 영향을 미칠 수 있고, 따라서, Flt3L은 치료적 중재를 위한 표적이다. Flt3L은 자가면역 질환의 치료에 유용한 Flt3L 기능의 길항제를 만드는 SLE 자가면역 질환의 발현 또는 유지에 기여하는 것 같다.

한 실시예에서, 인터페론 길항제의 치료적으로 효과적인 양을 확인하기 위한 측정법은 치료될 환자로부터 취한 혈청에 체외에서 결합하는 인터페론 수용체 감소시키는데 필요한 인터페론 길항제의 양을 결정하는 것이다. 이 예에서, 생체외에서 50%로 결합을 감소시키는데 필요한 농도는 생체내에서 치료적으로 효과적일 것이다. Flt3L에 대한 유사한 측정법은 특정 피험자 또는 환자를 위한 Flt3L 길항제의 효과적인 양을 결정하는데 사용될 수 있다.

화합물이 본 발명에서 유용한 Flt3L 길항제인지를 확인하는데 실행될 수 있는 많은 측정법이 있다. 검사되는 화합물이 DCs로의 단핵세포 분화에 적합한 조건하에서 단핵세포의 배양액에 첨가되는 경우, 한 측정법은 수지상 세포 분화 측정법이다. 상기 조건은 단핵세포들이 DCs로의 분화되도록 유도하기 위하여 단핵세포 배양액에 Flt3L를 첨가하는 것을 포함한다. 그래서, 만일 화합물이 화합물이 첨가되지 않는 단핵세포의 배양액과 비교했을 때 DCs로의 단핵세포 분화의 억제가 적어도 50% 발생하는 경우, 화합물은 Flt3L 길항제이다.

화합물이 Flt3L 길항제인지를 결정하는 다른 측정법은 라벨이 달린 Flt3L의 그 수용체에 대한 결합의 억제를 결정하는 측정법이다. 이 측정법에서, 탐지가능한 라벨이 Flt3L에 부착되고 라벨이 달린 Flt3L은 화합물의 존재 및 부존재하에서 그 수용체에 결합하게 된다. 만일 화합물이 존재할 때 Flt3L의 수용체에 대한 결합에 감소를 일으키면, 화합물은 Flt3L 길항제이다.

화합물이 Flt3L 길항제인지를 결정하는데 유용한 다른 측정법은 생체외 확산 측정법이다. 인간 조혈모세포들은 이들의 분화 및/또는 확산을 유발하기 위하여 Flt3L로 배양된다. 검사될 화합물이 약간의 배양 조직에 첨가되고 다른 것은 화합물이 첨가되지 않는다. 확산 및 분화의 양을 결정하기 위하여 화합물을 가진 배양액들과 화합물이 없는 배양액들 사이의 비교가 이루어진다. 만일 Flt3L가 유발한 인간 조혈모세포들의 확산 및/또는 분화의 억제가 있는 경우, 화합물은 Flt3L 길항제이다.

화합물이 Flt3L 길항제인지를 결정하는데 유용한 또 다른 측정법은 생체외 확산 측정법이다. 인간 인자 의존 B 세포주들은 배양 조직에 첨가되는 화합물이 있는 상태 및 없는 상태로 배양된다. 이런 세포주의 예는 Flt3를 발현하도록 처리되는 세포주이다. 첨가되는 화합물을 가진 배양액들이 Flt3L가 유도한 인간 인자 의존 B 세포주들의 확산의 적어도 50% 억제를 나타내면, 화합물은 Flt3L 길항제이다.

검사될 화합물이 Flt3L 길항제인지를 결정하는데 유용한 다른 측정법은 생체내 측정법이다. 쥐들에게 Flt3L을 투여하고 수지상 세포들을 포함하는 이들의 조혈모세포들이 생체내에서 팽창된다. 이런 쥐들에게 검사되는 화합물이 투여되거나 또는 투여되지 않고 쥐들 내의 조혈모 세포의 레벨이 측정된다. 그래서, 쥐들에서 생체내로 수지상 세포를 포함하는 조혈모 세포들의 Flt3L-중재 팽창의 억제는 화합물 은 Flt3L 길항제라는 것을 나타낸다.

Flt3L 길항제의 한 예는 Flt3L과 특이적으로 결합하는 단일클론 항체이다. Flt3L 길항제의 다른 예는 가용성 Flt3L 수용체이다. 가용성 수용체는 Flt3L이 그 중성 수용체와의 결합 및 DCs속으로의 단핵세포 분화의 진행을 억제하기 위하여 순환하는 Flt3L을 결합하는데 유용하다. 본 발명의 한 실시예에서, Flt3L 길항제는 Flt3L 수용체와 결합하나, 이런 결합의 다운-스트림, 즉, 수용체 리간드 모방체를 일으키지 않는 유기 분자일 수 있다. 이런 유기 분자는 다르게 결합할 수 있는 임의의 Flt3L을 대체하는 수용체의 포켓을 결합하는 Flt3L에 특이적으로 결합할 수 있다. 본 발명의 Flt3L 길항제는 또한 상기한 단일클론 항체 또는 그것을 가진 융합 펩티드의 상보성 결정 부위(CDR)를 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "인간 단일클론 항체"(HuMAb)는 인간 B 세포들(즉, 항체가 불멸화 및/또는 활성화된 인간 B 세포 를 배양하거나 또는 HuMAb를 인코딩하는 인간 B 세포 cDNAs로부터 재조합하여 배양함으로써 제조되든지 항체가 그 생화학적 활성을 변하게 할 수 있는 분자 즉, 수용체 또는 리간드, 효소, 독소, 담체 등과 결합하는지 아닌지) 및 하나의 아이소타입(예를 들어, IgG₄)의 본 발명의 HuMAb의 가변 부분을 다른 아이소타입(예를 들어, 인간 IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA, IgD, IgM 또는 IgE)의 인간 항체의 일정한 부위와 재결합함으로써 만들어지는 항체로부터 얻은 HuMAb를 의미한다. 이런 HuMAb를 제조하기 위한 재조합 방법들은 당해 기술분야에 공지되어 있다(미국 특허 제 5,959,085호 참조).

인터페론 길항제 및 Flt3L 길항제를 조합해서 사용하면 DCs의 발생을 감소시키기 위해 각 분자를 더 적게 사용하는 장점을 얻을 수 있다. 이런 시너지효과는 본 발명의 방법들 및 조성물들에서 각 길항제의 치료적으로 효과적인 양을 감소시킬 수 있는 점에서 유익하다.

본 발명의 한 실시예에서, 인터페론 길항제 또는 Flt3L 길항제 각각 또는 모두는 폴리펩티드일 수 있다. 폴리펩티드는 펩티도미메틱, 합성 폴리펩티드, 천연 폴리펩티드의 유도체, 변형된 폴리펩티드, 라벨이 달린 폴리펩티드 또는 합성 펩티드를 포함하는 폴리펩티드일 수 있다. 폴리펩티드는 천연에서 광학이성질체가 발견되지 않는 합성 폴리펩티드, 즉, D-아미노산 또는 L-아미노산의 전체 또는 일부분일 수 있다. 이런 펩티드에서의 자연적이지 않은 연관의 사용은 반감기를 증가시킬 수 있고 천연적으로 효소를 발생시킴으로써 열화로부터 펩티드를 보호한다.

본 발명의 다른 실시예에서, 자가면역 질환은 후천성 면역 결핍증(AIDS), 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 관절염, 재생불량성빈혈(aplastic anemia), 베체트병(Behcet's disease), 당뇨병(diabetes), 이식편대숙주병(graft-versus-host disease), 그레이브스병(Grave's disease), 용혈성 빈혈 (hemolytic anemia), 저감마글로불린혈증(hypogammaglobulinemia), 과 IgE 증후군(hyper IgE syndrome), 특발성 혈소판 감소성 자반증(idiopathic thrombocytopenic purpura(ITP)), 다발성 경화증(multiple sclerosis(MS)), 중증근무력증(myasthenia gravis), 건선(Psorias is), 루푸스(lupus) 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

당뇨병(diabetes)은 당뇨병(diabetes mellitus), 타입I 당뇨병, 타입Ⅱ 당뇨 병, 유년발병형당뇨병(juvenile on-set diabetes) 또는 이들의 임의의 조합일 수 있으나 이에 한정 되지 않는다. 관절염은 류마티즈염성 관절염, 연소성 류마티스양 관절염, 건선성 관절염(psoriatic arthritis), 또는 이들의 조합일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 루푸스는 전신성 홍반성루푸스(SLE) 또는 약물 유발 루푸스일 수 있다.

본 발명의 한 실시예에서, 대상은 포유류이다. 포유류는 인간 또는 영장류일 수 있다. 상기 대상은 인간 환자 또는 인간 면역 질환의 증상을 나타내는 동물일 수 있고 쥐과 혈질전환 질환 모델 또는 영장류 질환 모델 또는 인간 면역 시스템으로 재구성된 SCID 쥐에서 발생된 인간 질환의 모델과 같은 인간 질병의 동물 모델이다. 포유류는 인간, 영장류, 설치류, 개, 고양이, 멧돼지일 수 있고 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 다른 양태에서, 대상은 쥐과, 소과, 영장류, 말과, 멧돼지 또는 개과이다. 본 발명의 다른 양태에서, 대상은 SLE를 겪고 있다.

본 발명의 한 실시예에서, 인터페론 길항제는 항-INF-α 또는 이들의 항원-결합 단편을 포함한다. 본 발명의 다른 실시예에서, 인터페론 길항제는 TNF이다. 본 발명의 다른 실시예에서, Flt3L 길항제는 항-Flt3L 항체 또는 이들의 항체 결합 단편을 포함한다.

본 발명의 한 실시예에서, 항체는 단일클론 항체, 키메릭 항체(chimeric antibody), 항-이디오타입(anti-idiotypic)항체, 인간화된 항체, 프라마타이즈 항체(primatized antibody) 및 이들의 조합을 포함하는 조성물의 요소일 수 있다.

본 발명의 다른 실시예에서, 인터페론 길항제 및 Flt3L 길항제는 한 분자의 일부분이다. 본 발명의 한 실시예에서, 인터페론 길항제의 효과적인 양은 환자의 혈청에서의 인터페론의 양에 대해 약 1 내지 10배 몰농도 과량이다. 본 발명의 다른 양태에서, Flt3L 길항제의 효과적인 양은 환자의 혈청에서의 Flt3L의 양에 대해 약 1 내지 10배 몰농도 과량이다.

본 발명의 방법은 골수성 DC 성숙의 IFN-α이 항원제시 활동을 갖는 DCs로 유입하는 것을 억제하는 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 조성물의 투여는 경막하(硬膜下)주사를 통한 정맥주사, 구강, 국부, 피부, 피하, 비경구 또는 에어로졸에 의할 수 있다. 본 발명의 조성물을 환자에게 투여하는 것은 국소(intralesional), 복강내(intraperitoneal), 근육내 또는 정맥 주사; 주입; 리포좀-중재 전달; 또는 국부, 비강, 구강, 안부 또는 귀 전달을 포함한다. 다른 실시예에서, 투여는 기관지내(intrabronchial)투여, 항문 또는 수막강내(intrathecal )투여를 포함한다. 본 발명의 조성물은 시간당, 일당, 주당, 월당, 년당(예를 들어, 시간 방출 형태)으로 전달될 수 있고 또는 1회 전달일 수 있다. 전달은 시간주기 동안의 연속된 전달, 즉, 정맥 전달일 수 있다. 전달의 바람직한 경로 및 시기는 당업자가 쉽게 결정할 수 있다.

본 발명의 한 실시예에서, 인터페론 길항제는 타입Ⅰ인터페론과 그 수용체의 결합을 감소시킨다. 다른 실시예에서, 인터페론 길항제는 환자 내의 세포상의 수용체에 결합하는 인터페론을 따라 신호변환을 방해한다. 다른 실시예에서, 인터페론 길항제는 환자 내의 세포들에 의한 인터페론의 생산을 감소시킨다. 다른 실시예에서, 인터페론 길항제는 환자 내의 세포들에 의한 인터페론 분비를 감소시킨다. 또 다른 실시예에서, 인터페론 길항제는 환자 내에서 인터페론의 생체이용율(bioavail ity)을 감소시킨다. 다른 실시예에서, 인터페론 길항제는 TNF이다.

본 발명의 다른 실시예에서, 조성물은 담체를 더 포함한다. 본 발명의 실시예에서, 담체는 수성 담체, 리포좀 또는 지질 담체를 포함한다.

본 발명의 조성물을 포함하는 화합물들은 적어도 부분적으로 비천연형인 펩티도미메틱 화합물(들)일 수 있다. 펩티도미메틱 화합물은 Flt3L 또는 Flt3L 수용체 또는 타입Ⅰ인터페론 또는 타입Ⅰ인터페론 수용체의 아미노산 서열의 적은 분자 모방체(mimic)일 수 있다. 화합물은 모방에 의해 증가된 안정성, 유효성, 잠재성 및 생체이용율을 가질 수 있다. 또한, 화합물은 감소된 독성을 가질 수 있다. 펩티도미메틱 화합물은 증가된 점막 장내 투과율(mucosal intestinal permeability)을 가질 수 있다. 화합물은 합성하여 제조될 수 있다. 본 발명의 화합물은 L-,D- 또는 비천연형 아미노산, α,α-이중치환된 아미노산, N-알킬 아미노산, 락트산(알라닌의 등전자 유사체)을 포함할 수 있다. 화합물의 펩티드 주쇄는 PSI-[CH=CH]로 치환된 적어도 하나의 결합을 가질 수 있다. 화합물은 트라이플로로티로신, p-Cl-페닐알라닌, p-Br-페닐알라닌, 폴리-L-프로파글리신, 폴리-D,L-알릴 글리신 또는 폴리-L-알릴 글리신을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 한 실시예는 화합물이 결합, 펩티드 주쇄 또는 적절한 미믹과 치환된 아미노산 성분을 갖는 화합물인 폴리펩티도미메틱 화합물이다. 적절한 아미노산 모방체일 수 있는 비천연형 아미노산의 예들은 β-알라닌, L-α-아미노 뷰트릭산, L-γ-아미노 뷰트릭산, L-α-아미노 아이소뷰트릭산, L-ε-아미노 카프로산, 7-아미노 헵탄산, L-아스파르트산, L-글루탐산, 시스테인(아세트아미도메틸), N-ε-Boc-N-α-CBZ-L-라이신, N-ε-Boc-N-α-Fmoc-L-라이신, L-메티오닌 술폰, L-노르류신, L-노발린, N-ε-Boc-N-δCBZ-L-오르니틴, N-δ-Boc-N-α-CBZ-L-오르니틴, Boc-p-나이트로-L-페닐알라닌, Boc-하이드록시프롤린, Boc-L-티오프롤린을 포함한다.

한 실시예에서, 화합물은 자유 아미노기들이 유도화(derivitization)에 의해 비활성화되는 펩티드이다. 예를 들어, 펩티드는 아릴 유도체, 알킬 유도체 또는 무수물 유도체일 수 있다. 펩티드는 아세틸화될 수 있다. 펩티드는 전체 전하를 중성화시키기 위하여 유도된다.

본 발명의 조성물의 한 실시예는 타입Ⅰ인터페론 또는 Flt3L 각각을 코딩하는 mRNA를 연결할 수 있는 리보자임(ribozyme)이다. Cech 등., 미국 특허 제 4,987,071호; Altman 등., 미국 특허 제 5,168,053호; Hampel 등., 미국 특허 제 5,254,678호; Hampel 등., 유럽 특허 제 360,257호를 참조하라. 한 실시예에서, 본 발명의 치료적 조성물은 유전자 재조합 리보자임이고 타입Ⅰ인터페론 mRNA 및/또는 Flt3L mRNA를 절단하도록 처리된 리보자임이다. 본 발명의 다른 양태에서, 조성물은 IFN-α을 코딩하는 mRNA 및 Flt3L을 코딩하는 mRNA 모두를 결합할 수 있는 재조합 핵산을 포함할 수 있다. 또한, 발명은 Flt3L 또는 타입Ⅰ인터페론 각각을 코딩하는 mRNA를 결합하고 이런 mRNA가 단백질로 번역되는 것을 억제할 수 있는 안티센스 핵산을 제공한다.

본 발명은 수지상 세포가 SLE 및 다른 자가 면역 질환 등의 원인 병리론(etiopathogenesis)에서 중요한 인자라는 것, 수지상 세포들 및/또는 이들의 생성물이 SLE의 치료 및 다른 자가면역 질환들에 대한 주요 표적이라는 것을 규정한다. 자가면역 질환의 예로서, SLE는 림프성 DCs가 IFN-α를 포함하는 다량의 시토키닌을 분비하여 뒤이어 골수성 DCs가 자가면역 반응을 유발하고 유지하도록 활성화하는 질병이다. DC 서브세트들 사이의 상호작용은 (1) 자가항체들의 넓은 스펙트럼을 가진 변형, 주로 핵항원에 대한 깊은(profound) B 세포, (2)자가반응 CD4+T세포 및 (3) SLE를 가진 환자의 혈청에서 발견된 타입Ⅰ인터페론의 높은 레벨에 대한 설명을 제공한다. 이런 관찰은 SLE 및 다른 자가면역 질환의 원인병리론에서 수지상 세포가 분명히 관여한다는 것을 입증한다.

도 1은 제어되지 않은 IFN-α방출의 결과 및 본 명세서에서 기술된 SLE 발병학에서의 역할의 결과를 나타낸다. 부상을 일으키는 SLE는 형질구양(림프성)DCs가 제어되지 않는 방법으로 IFN-α를 분비하도록 유발하는 성분이다. 유발 성분은 바이러스, 박테리아, 곰팡이 및 CpG DNA뿐만 아니라 약물과 같은 이들의 생성물을 포함한다. 제어되지 않는 IFN-α분비는 만성 바이러스 감염과 같은 영구 형질구양(림프성)DC 활성제 또는 예를 들어, FcR 동질이상 또는 보체 성분의 부제를 통해 순환으로부터 적절하게 제거되지 않은 면역 복합체로 개시된다. 형질구양 DCs는 T세포에 유발 성분을 제공할 수 있는 성숙된 DCs로 분화한다. 분비된 IFN-α(가능하면 다른 시토키닌과 함께)는 SLE 혈액에서 증가된 양으로 제공된 고사 세포를 포획하는 단핵세포를 포함하는 골수성 DCs의 전구체를 순환시키는 활성을 유발한다. 골수성 DCs는 고사세포들을 처리하고 이들의 항원들을 자가반응 T 세포들 및/또는 B 세 포들에 제공한다. 고사세포들로 채워진 DCs와 함께 자가반응 T 세포들은 이제 자가반응 B 세포들을 더욱 활성화시킨다. 이들은 DCs의 도움으로 플라즈마 세포들 속으로 분화된다. IFN-α는 SLE 내의 혈액 B 세포들을 순환시키는 부분 배중심 표현형(CD38의 유발)을 작동시킬 수 있기 때문에 자가반응 B 세포들의 발생에 직접 영향을 미친다.

건강한 도너들의 혈액으로부터 얻은 단핵세포들, 골수성 DCs의 최대로 많은 전구체들을 사용하여, SLE를 가진 환자들로부터의 혈청을 사용하는 면역성 DC를 유발하기 위한 방법을 개발해왔다. 이런 DCs는 고사세포들을 포획할 수 있고 이들의 항원을 자가 CD4+ T 세포에 제공할 수 있는 항원 제시 세포들이고, 이들의 활성 및 확산을 유발시킨다. 이런 일련의 사건들은 SLE에서의 발병 사건을 설명한다. 이런 DCs의 형성은 루푸스 혈청에서 타입Ⅰ인터페론을 봉쇄함으로써 방지될 수 있고 DCs는 타입Ⅰ인터페론으로 DC 전구체들을 배양함으로써 재생산될 수 있다. 형질구양(림프성)DCs의 생성물들은 골수성 DCs의 분화를 유도하여, 항원제시를 지지하고, 궁극적으로는 발병학적 과정을 일으킨다.

본 발명의 한 실시예에서, 본 발명의 치료적 조성물은 두 성분인 (1)Flt3L 길항제 및 (2)인터페론 길항제를 포함한다. 본 발명의 다른 실시예에서, 이런 성분들은 하나의 화합물 또는 Flt3L 및 IFN-α각각 또는 다른 타입Ⅰ인터페론에 대항하는 길항적 또는 경쟁적 펩티드를 포함하는 융합 단백질과 같은 분자로 함께 융합될 수 있다. 즉, 융합 펩티드는 Flt3L의 활성의 경쟁적 억제자인 펩티드인의 부분 및 IFN-α의 활성 경쟁적 억제자인 펩티드를 포함한다. 본 발명의 다른 양태에서, 조 성물은 각 Flt3L 및 IFN-α에 적대적인 단일클론 항체들, 각 항체(CDR 단편)의 항원-결합 단편 또는 항체들의 활성(항원-결합) 단편들을 포함하는 융합 단백질을 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 양태에서, 조성물은 Flt3L 및 그 수용체 사이의 상호작용을 방해할 수 있고 IFN-α의 활성을 방해할 수 있는 작은 유기 분자를 포함할 수 있다. 본 발명의 한 양태에서, 조성물은 Flt3L 및 IFN-α를 특이적으로 결합하는 단일클론 항체들의 상보성 결정 부위(CDRs)를 포함할 수 있다.

IFN-α또는 Flt3L과 같은 타입Ⅰ인터페론의 길항제로서 유용한 폴리펩티드들이 개별 수용체의 결합 부위로부터 유도된 폴리펩티드일 수 있다. 또한, 비기능성 IFN-α또는 Flt3L(수용체 결합에 대해 경쟁하나, 수용체 함유 세포에서 반응을 일으키지 않는 폴리펩티드)가 합성될 수 있다. 이런 비기능성 펩티드의 한 실시예는 수용체에 최대 용량으로 결합하나, 세포를 보유하는 수용체를 활성화시키는 어떤 능력도 없는 펩티드이다. 폴리펩티드의 정상적으로 발생하는 아미노산 서열에 대한 치환 또는 부가 또는 결실이 있을 수 있다. 보존적 아미노산 치환은: 알라닌과 치환되는 발린; 아르기닌 대신 라이신; 아스파라긴 대신 글루타민; 아스파라타드 대신 글루타메이트; 시스테인 대신 세린; 글구타민 대신 아스파라긴; 글루타메이트 대신 아르파라데이트; 글리신 대신 프롤린; 히스티딘 대신 아르기닌; 아이소루신 대신 루신; 라이신 대신 아르기닌, 메티오닌 대신 루신, 페닐알라닌 대신 루신; 프롤린 대신 글리신, 세린 대신 테오닌; 테오닌 대신 세린; 트립토판 대신 트로신; 트로신 대신 페닐알라닌 및 발린 대신 루신을 포함할 수 있다.

본 발명은 항원-제시 세포들의 발생을 촉진하는 타입Ⅰ인터페론의 능력을 봉 쇄하는 것을 포함하여 자가면역 질환을 치료하기 위한 신규한 방법을 제공한다. 게다가, 본 발명은 또한 자가면역 질환 발현의 환자의 상대적 위험을 측정 및/또는 환자의 질병 추이를 관찰하는 생체외 진단 방법을 제공한다. 본 발명은 (a) 타입Ⅰ인터페론(타입Ⅰ인터페론과 그 수용체 사이의 결합을 감소시킴)의 활성을 감소시키는 인터페론 길항제 및 (b) 환자의 자가면역 질환을 치료하는데 유용한 조성물의 제조에서 Flt3L(Flt3L 및 그 수용체 사이의 결합을 감소시킴)의 활성을 감소시키는 Flt3 리간드(Flt3L) 길항제의 사용을 제공한다.

본 발명의 한 실시예에서, 적어도 하나의 인터페론 길항제 및 적어도 하나의 Flt3L 길항제들은 환자에게 수회로 투여될 수 있다. 다른 실시예에서, 이것이 동시에 투여된다. 예를 들어, 한 길항제는 아침 및 저녁에 투여될 수 있다. 길항제들의 투여의 시기 및 주기는 동일할 필요가 없다.

본 명세서에 나타낸대로, 타입Ⅰ인터페론 또는 타입Ⅰ인터페론-함유 혈청은 DCs를 포함하나 이에 제한되지 않는 항원 제시 세포의 발생에 필수적인 인자이다. 본 발명에서 이런 항원 제시 세포들은 포획된 고사 세포들로부터의 항원을 제시함으로써 자가 CD4+T 세포의 확산을 유발하는 것으로 나타난다. 본 발명에서, 분화의과정, 항원 포획 및 항원 제시는 타입Ⅰ인터페론의 활성을 막음으로써 감소된다. 이 치료의 방법은 질병의 발전(치료적 활용)뿐만 아니라 적절한 유전적 내력 및 질병 발현의 높은 위험(예방적 활용)을 가진 환자 내의 질환 발현을 억제함으로써 자가면역 질환을 치료하는데 사용될 수 있다.

타입Ⅰ인터페론 단백질 및/또는 Flt3L의 봉쇄는 항원-제시 세포를 발생시키는 이들의 능력을 중화시키는 항체(항체들)의 사용을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 타입Ⅰ인터페론 수용체 또는 Flt3L 수용체의 봉쇄는 항체들, 펩티드들 또는 항원-제시 세포들의 발생을 유도하는 리간드 및 이들의 수용체 사이의 상호작용을 특이적으로 방해하는 화합물들의 사용을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서 억제제(즉, 본 발명의 조성물)로 유용한 길항제를 전달하는 방법은 단백질 및 단백질을 인코딩하는 벡터를 포함하나 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 한 실시예에서, 타입Ⅰ인터페론 및/또는 Flt3L의 기능을 막는 펩티드를 인코딩하는 핵산들이 환자에게 투여된다. 예를 들어, 벡터를 기초로한 바이러스(유전자 운반 벡터의 예)는 펩티드의 번역이 생체 내에서 발생하도록 하기 위하여 이들 핵산을 인체로 전달하는데 사용될 수 있다. 유전자 운반 벡터는 숙주 세포 내에서 복제할 수 있는 임의의 구조일 수 있고, 플라스미드, DNA 바이러스, 레트로바이러스뿐만 아니라 고립된 핵산 분자들을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 벡터를 기초로한 레트로바이러스 또는 아데노바이러스가 사용될 수 있다. 아데노바이러스들은, 특히 인간 유전자 치료에 대한 발현 벡터로서 관심이 증가되고 있다(Berkner, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158:39-66(1992)). 이런 벡터들은 긴 반복단위("LTRs"), 프로모터들(예를 들어, CMV 프로모터들, SV40 프로모터, RSV 프로모터), 인핸서 등과 같은 바이러스성 게놈의 전부 또는 일부를 포함한다. 어떤 경우에는, 벡터는 하나 이상의 바이러스의 요소들을 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 아데노바이러스의 실시예들은 당업계에서 공지되어 있고 예를 들어, Ad12(아속 A), Ad3 및 Ad7(아속 B), Ad2 및 Ad5(아속 C), Ad8(아속 D), Ad4(아속 E), Ad40(아속 F)(Wigand et al, In: Adenovirus DNA, Doerfler, Ed., Martins Nijhoff Publishing, Boston, pp. 408-441(1986))인 40개 이상의 다른 인간 아데노바이러스들을 포함한다. 아데노바이러스를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다(Berkner et al, Nucleic Acids Res., 11:6003-6020(1983); van Doren et al, Mol. Cell. Biol., 4:1653-1656(1984);Ghosh-Choudhury et al, Biochem, Biophys. Res. Commun., 147:964-973(1987);McGrory et al, Virol., 163:614-617(1988); and Gluzman et al, In:Eurkaryotic Viral Vectors, Ed. Gluzman, Y. pages 187-192, Cold Spring Harbor Laboratory(1982)). 얻어진 벡터들은 숙주 세포 속으로 유도(예를 들어, 트렌스펙션 또는 변형 또는 감염 또는 주입 등)되고, 이것은 환자 내에서 생체내 또는 생체외 일 수 있다. 유전자 전달 벡터의 리포솜-중재 전달 또한 본 발명에서 실행될 수 있다.

자가면역 질환을 치료하는 본 발명을 실행하기 위해 세포속으로 유전자를 전달하기 위하여 사용될 수 있는 바이러스 벡터들의 다른 실시예들은 몰로니 머린 루키미아 바이러스(Moloney murine leukemia virus(MoMuLV))와 같은 레트로바이러스; JC, SV40, 폴리오마(Polyoma), 아데노바이러스와 같은 파포바바이러스(papovavirus es); 에프스타인-바 바이러스(Epstein-Barr Virus(EBV); 소 유두종(bovine papilloma) 바이러스 타입Ⅰ과 같은 유두종 바이러스; 우두 및 소아마비; 및 렌티바이러스 벡터(lentiviral vector) 및 다른 인간과 동물 바이러스를 포함하나 이에 제한되지 않는다.

타입Ⅰ인터페론 및 FLT3L 시그널링 및/또는 본 발명에서 유용한 변환 경로의 봉쇄는 관련 시그널링 및/또는 변환 경로를 특이적으로 표적화하는 화학물질의 사용을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서 유용한 타입Ⅰ인터페론 분비 및/또는 생산의 봉쇄는 (1) 특이적 화학물질을 사용하는 세포에 의한 타입Ⅰ인터페론 합성을 봉쇄하는 단계; (2) 타입Ⅰ인터페론을 생산하는 이들의 능력을 감소시키기 위해서 타입Ⅰ인터페론을 제조하는 세포들을 표적화하는 단계 및 (3) 생산 및 분비를 감소 또는 억제하기 위하여 세포에 의한 타입Ⅰ인터페론 제조 및/또는 방출을 신호하기 위하여 필요한 수용체들을 표적화하는 단계를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 한 양태에서, 이들 세포들은 형질구양 수지상 세포들이다. 본 발명의 다른 양태에서, 본 발명의 조성물에 의해 표적화되는 타입Ⅰ인터페론을 제조하는 세포들은 분화(예를 들어, 골수 전구체 및 혈액 전구체)의 여러 단계에서 섬유아 세포(fibroblasts), 내피세포(endothelial cells) 및 형질구양 수지상 세포를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 상기한 그 활성을 감소시키는 조성물에 의한 세포의 표적화는 이런 분화가 발생할 수 있는 곳 어디서나 조혈(hematopoietic) 전구체로부터의 형질구양 수지상 세포들을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 조성물에 의해 타입Ⅰ인터페론 생산 및/또는 분비를 신호하는데 필요한 수용체를 표적화하는 것은 세포에 만노오스(mannose) 수용체 및/또는 CD32의 활성을 봉쇄하는 조성물을 사용하는 것을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

한 양태에서, 본 발명은 환자의 자가면역 질환의 상태를 감시하거나 환자가 자가면역 질환을 성장시킬 위험이 있는지를 확인하는데 유용한 생체외 진단 방법을 제공한다. 진단 방법은 (1) 검사될 피험자의 혈청의 양을 확보하는 단계; (2) 임의의 공지된 방법(예를 들어, Flt3L 및 IFN-α에 특이적인 항체들을 가진 ELISA를 사용)을 사용하여 피험자의 혈청에서 Flt3L 및 IFN-α의 레벨을 결정하는 단계; (3) 피험자의 혈청에서 측정된 Flt3L의 레벨 및 IFN-α의 레벨과 연령 및 성별이 일치하는 정상이고, 건강한 피험자의 혈청 샘플에 존재하는 가를 결정하는 각 인자의 레벨을 비교하는 단계; (4) 검사될 피험자로부터 측정한 레벨이 건강한 피험자의 레벨보다 높거나 낮은지를 확인하여 피험자의 자가면역 질환의 상태를 관찰하거나 또는 자가면역 질환의 발현에 대한 피험자의 위험을 판단하는 단계를 포함한다.

본 발명은 (a) 피험자의 혈청 샘플을 확보하는 단계; (b) 혈청 샘플에서 IFN-α및 Flt3 리간드(Flt3L)를 정량하는 단계; 및 (c) 단계 (b)에서 측정된 IFN-α및 Flt3L의 양을 건강한 피험자의 혈청 및 자가면역 질환을 가진 피험자의 혈청에서 측정된 IFN-α및 Flt3L의 양과 비교하여 자가면역 질환의 발현에 대한 피험자의 위험을 결정하는 단계를 포함하여 자가면역 질환의 발현에 대한 피험자의 위험을 결정하는 생체외 측정법에 관한 것이다. 자가면역 질환의 발현에 대한 높은 위험은 자가면역 질환을 가진 피험자에 대해 측정된 양의 30% 범위 내의 상기 단계(b)에서의 양에 의해 나타난다. 이 위험은 양이 20%일 때 증가한다. 본 발명의 다른 양태에서, 피험자들은 연령이 일치될 수 있다.

본 발명은 또한 자가면역 질환의 발현을 결정하거나 피험자의 생물학적 샘플에서 Flt3L 및 IFN-α를 특이적으로 결합하고 탐지할 수 있는 조성물을 포함하는 피험자의 자가면역 질환의 상태를 관찰하기 위한 키트에 관한 것이다. 탐지가능한 마커는 형광 마커, 방사성 마커, 효소 마커, 비색 마커, 화학발광(Chemiluminesce nt) 마커 또는 이들의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 이 키트는 또한 진단 측정법이 상대적으로 동일한 세포들의 수 또는 혈청의 부피가 비교되는 것을 보장하기 위하여 샘플들 사이의 표준화 또는 정상화를 위한 구성요소를 또한 포함할 수 있다.

본 발명은 (a) 피험자의 혈청 샘플을 확보하는 단계; (b) 혈정 샘플에서 IFN-α및 Flt3 리간드(Flt3L)을 정량하는 단계; 및 (c) 단계 (b)에서 측정된 IFN-α및 Flt3L의 양을 건강한 피험자의 혈청 및 자가면역 질환을 가진 피험자의 혈청에서 측정된 IFN-α및 Flt3L의 양과 비교하여 자가면역 질환의 발현에 대한 피험자의 위험을 결정하는 단계를 포함하여 자가면역 질환의 발현에 대한 피험자의 위험을 결정하는 생체외 측정법을 제공한다.

게다가, 본 발명은 또한 (a) 피험자로부터 혈청 샘플을 얻는 단계; (b) 단핵세포를 가진 혈청을 단핵세포 분화에 적절한 조건하에서 인비트로로 단핵세포와 혼합하는 단계; (c) 항원을 제시할 수 있는 수지상 세포들로의 단핵세포의 분화를 유도하는 피험자의 혈청의 능력을 측정하는 단계; 및 (d) 단계(c)에서 측정된 능력을 (i) 건강한 피험자의 혈청의 능력 및 (ii) 자가면역 질환을 가진 피험자의 혈청의 능력을 비교하여, 자가면역 질환의 발현에 대한 피험자의 위험을 결정하는 단계를 포함하여 자가면역 질환의 발현에 대한 피험자의 위험을 결정하는 생체외 측정법을 제공한다.

다른 양태에서, 본 발명은 자가면역 질환의 발현에 대한 환자의 위험이 결정 되고 관찰될 수 있는 생체외 진단 방법이다. 이 진단 방법은 자가면역 질환의 발현에 대한 환자의 위험을 판단하기 위하여 생체외로 수지상 세포로의 단핵세포 분화를 유발하는 환자의 혈청의 능력을 측정한다. 이런 점에서, 만일 환자의 혈청이 공지된 보통의 기준(여러 연령-일치, 성별-일치된 건강한 개인들의 혈청을 사용하여 결정될 수 있음)보다 더 효과적으로 단핵세포의 분화를 수지상 세포로 유발한다면, 측정법은 자가면역 질환을 가진 환자들의 질환 발생을 예측하는데 사용되고 환자가 자가면역 질환의 발현의 위험이 있는지에 대한 상세한 진단 평가에 필수적이다. 또한, 진단 측정법은 환자의 질환의 상태를 관찰하는데 유용하고, 만일 환자가 이미 자가면역 질환을 가진 것으로 진단된다면, 환자는 집 또는 다른 편리한 위치에서, 자가면역 질환의 발전 또는 진보를 관찰하고 이에 따라 치료 섭생법을 조절하기 위해서 본 발명의 진단 방법을 사용할 수 있다.

조성물의 유효량은 사용되는 실제 조성물에 의존하게 된다. 실제 유효량은 화합물의 크기, 생물 분해성, 생물 활성 및 생체 이용율을 기초로 한다.

만일 화합물이 빠르게 열화하지 않고, 생체이용이 가능하고 매우 활성이 높다면, 작은 양으로도 유효하다. 이 유효량은 당업자에 의해 결정될 수 있다; 또한 이는 화합물의 형태, 크기, 생물 활성에 의존할 수 있다. 당업자는 생체 측정법으로 생물 활성을 결정하기 위하여 화합물에 대한 실험적 활성 검사을 일상적으로 실행하고 그리하여 유효량을 결정한다.

본 발명은 적절한 희석제, 방부제, 용해제, 유화제, 보조제 및/또는 담체와 함께 폴리펩티드 조성물 및 화합물의 치료적으로 유효량을 포함하는 약학적 조성물 을 제공한다. 이런 조성물들은 액체이거나 동결건조될 수 있고 또는 건조된 제제일 수 있고 다양한 버퍼 함량(예를 들어, Tris-HCl, 초산염, 인산염)의 희석제, pH 및 이온결합세기, 표면에 흡수를 막는 알부민 또는 겔라틴과 같은 첨가제, 세제(예를 들어, TWEENTM20, TWEENTM80, Pluronic F68, 담즙산염), 용해제(예를 들어, 글리세롤, 폴리에틸렌 글리세롤), 항산화제(예를 들어, 아스코르브산, 소듐 메타바이설파이드), 방부제(예를 들어, 티메로살(Thimerosal), 벤질알콜, 파라벤(p araben)), 벌킹(bulking) 물질 또는 탄력성 변형제(예를 들어, 락토오스, 만니톨(mannitol), 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리머의 화합물에 대한 공유 결합, 금속 이온에 의한 복합체 또는 화합물의 폴리락틴산(Polylactic acid), 폴리글리콜산, 하이드로겔 등 또는 리포좀, 마이크로 에멀젼, 미셀, 유니라멜라 또는 멀티라멜라 기공, 적혈구 고스트(erythrocyte ghost), 또는 스페로플라스트(spheroplast)와 같은 폴리머 화합물의 미립자 조합제로의 첨가를 포함한다. 이런 조성물등은 물리적 상태, 용해도, 안정성, 생체내 분비의 속도 및 화합물 또는 조성물의 생체내 제거의 속도에 영향을 미칠 것이다. 조성물들의 선택은 조성물의 물리적 및 화학적 성질들에 의존할 것이다.

제어되거나 유지되는 분비 조성물은 친유성 축적소(예를 들어, 지방산, 왁스, 오일)의 제제를 포함한다.

또한 본 발명에 의해 파악되는 것은 폴리머(예를 들어, 폴록사머(poloxamers 또는 폴록사민(poloxamines))로 코팅된 미립자 조성물 및 조직 특이 수용체, 리간드 또는 항원에 대항하는 항체 또는 조직 특이 수용체 또는 임의의 다른 조직 또는 세포 표적화 펩티드의 리간드에 결합된 치료 조성물이다. 본 발명의 치료 조성물의 다른 실시예들은 미립자 형태의 보호층, 프로테아제 억제제 또는 비경구적, 폐, 비강, 경구를 포함하는 다양한 경로의 투여에 대한 흡수 인핸서를 포함한다.

투여할 때, 화합물들은 순환으로부터 빠르게 제거되고 따라서 상대적으로 짧은 기간의 약리학적인 활성을 유도할 수 있다. 결과적으로, 생물 활성 화합물들의 상대적으로 다량의 빈번한 주사는 치료적 유효성을 유지하도록 요구될 것이다. 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리에틸렌 글리콜의 코폴리머 및 폴리프로필렌 글리콜, 카르복시메틸 셀룰로오스, 덱스트란, 폴리바이닐 알콜, 폴리바이닐피롤리돈 또는 폴리프롤린과 같은 가용성 폴리머의 공유 결합에 의해 변형되는 화합물들은 상응하는 비변형 화합물들의 반감기보다 다음의 정맥 주사 후에 혈액에서 실질적으로 긴 반감기를 나타내는 것으로 알려졌다. 이런 변형체들은 수용액에서 화합물의 용해도를 증가시킬 수 있고, 덩어리를 제거하고, 화합물의 물리적 및 화학적 안정성을 증가시키고, 화합물의 면역성 및 반응성을 크게 감소시킨다. 그 결과, 원하는 생체내 생물학적 활성이 변형되지 않은 화합물보다 더 적게 또는 적은 양으로 이런 폴리머 화합물 부가물들의 투여에 의해 성취될 수 있다.

폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 화합물에 대한 결합은 PEG가 포유류(Carpenter et al., 1971)내에서 매우 낮은 독성을 갖기 때문에 특히 유용하다. 예를 들어, 아데노신 디아미나제(adenosine deaminase)의 PEG 부가물은 미국에서 중증 복합성 면역결핍증(severe combined immunodeficiency syndrome)의 치료를 위해 인간에 사용하는 것이 승인되었다. PEG의 결합에 의해 가져다주는 두 번째 장점은 이형 화합물의 면역성 및 항원성을 효과적으로 감소시키는 것이다. 예를 들어, 인간 펩티드의 PEG 부가물은 중증 면역 반응을 일으키는 위험없이 다른 포유류 종들에서 질병의 치료에 유용할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드 또는 조성물은 폴리펩티드를 제조할 수 있는 폴리펩티드 또는 세포들에 대한 숙주 면역 반응을 줄이거나 막기 위하여 미세 캡슐화(microencapsulation) 장치에 배달될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드 또는 조성물은 리포좀과 같이 막에서 미세 캡슐화되어 배달될 수 있다.

예로서, PEG와 같은 폴리머들은 아미노 말단 아미노산의 알파 아미노 그룹, 리신 측쇄의 엡실론 아미노 그룹, 시스테인 측쇄의 설프히드릴(Sulfhydryl) 그룹, 아스파라틸 및 그루타밀 측쇄의 카복실 그룹, 카복실-말단 아미노 산의 알파-카복실 그룹, 티로신 측쇄와 같은 치료 조성물의 펩티드의 하나 또는 그 이상의 반응성 아미노산 잔여물 또는 어떤 아스파라긴, 세린 또는 트레오닌 잔여물에 부착된 글리코실 사슬의 활성화된 유도체에 쉽게 결합할 수 있다.

단백질과의 직접적인 반응에 적합한 PEG의 다양한 활성화된 형태들이 기술되었다. 단백질 아미노 그룹과의 반응에 유용한 PEG 시약은 카복실산의 활성 에스터 또는 카보네이트 유도체, 특히 리빙 그룹이 N-하이드록시석신이미드(N-hydroxysuccinimide), p-나이트로페놀(p-nitrophenol), 이미다졸(imidazole) 또는 1-하이드록시-2-나이트로벤젠-4-설포네이트(1-hydroxy-2-nitrobenzene-4-sulfonate )인 것을 포함한다. 말레이미도(maleimido) 또는 할로아세틸(haloacetyl)그룹을 포함하는 PEG 유도체들은 단백질 제거 설프히드릴 그룹의 변형에 유용한 시약이다. 이와 마찬가지로, 아미노 히드라진 또는 히드라지드 그룹들을 포함하는 PEG 시약은 단백질에서 탄수화물의 과요오드산염 산화에 의해 발생되는 알데하이드와의 반응에 유용하다.

한 바람직한 실시예에서, 약학적 담체는 액체일 수 있고 약학적 조성물은 용액의 형태일 수 있다. 다른 동일하게 바람직한 실시예에서, 약학적으로 허용가능한 담체는 고체 및 조성물은 가루 또는 정제의 형태이다. 다른 실시예에서, 약학적 담체는 겔이고 조성물은 좌약 또는 크림 형태이다. 다른 실시예에서, 활성 성분은 약학적으로 허용가능한 경피 패치이다.

고체 담체는 향료, 윤활유, 가용화제, 현탁화제, 충전제, 글리단트(glidants), 압축 보조제, 결합제 또는 정제-분리제로 작용할 수 있는 하나 또는 그 이상의 물질들을 포함할 수 있다; 이것은 또한 미세 캡슐화된 물질일 수 있다. 분말에서, 담체는 정교하게 분리된 활성 성분과 혼합되는 정교하게 분리된 고체이다. 정제에서, 활성 성분은 적절한 부분에서 필수 압축 성분들을 가지며 원하는 모양과 크기로 압축된 담체와 혼합된다. 가루 및 정제는 바람직하게는 활성 성분의 99%를 함유한다. 예를 들어, 적절한 고체 담체는 인산 칼슘, 스테아르산 마그네슘, 활석, 설탕, 락토오스, 텍스트린, 전분, 젤라틴, 셀룰로오스, 폴리바이닐피롤리딘, 저용융 왁스 및 이온교환수지를 포함한다.

액체 담체들은 용액, 현탁액, 유탁액, 시럽, 엘릭서 및 가압된 조성물을 제조하는데 사용된다. 활성 성분은 물, 유기 용매, 이들의 혼합물과 같이 약학적으로 허용가능한 액체 담체 또는 약학적으로 허용가능한 오일 또는 지방에서 용해되거나 부유될 수 있다. 액체 담체는 용해제, 유화제, 버퍼, 방부제, 감미료, 향신료, 현 탁화제, 농축제(thickening agent), 염료, 점도 조절제, 안정제, 또는 삼투성 조절제와 같은 다른 적절한 약학적 첨가제들을 포함할 수 있다. 경구 및 비경구 투여를 위한 액체 담체의 적절한 예들은 물(셀룰로오스 유도체, 바람직하게는 카르복시메틸 나트륨 셀룰로오스 용액과 같은 첨가제를 부분적으로 포함하는 첨가제), 알콜(모노하이드릭 알콜 및 폴리하이드릭 알콜, 예를 들어, 글리콜을 포함) 및 이들의 유도체 및 오일(예를 들어, 분별증류된 야자유 및 콩기름(arachis oil)을 포함한다. 비경구 투입을 위해, 담체는 에틸 올레산염 및 아이소플로필 미리스테이트(isopropyl myristate)와 같은 오일 에스터일 수 있다. 무균 액체 담체들은 비경구 투여를 위한 무균의 액상 조성물에서 유용하다. 가압된 조성물들을 위한 액체 담체는 할로겐화된 탄화수화 또는 다른 약학적으로 허용가능한 추진제일 수 있다.

무균 용액 또는 현탁액인 액체 약학적 조성물은 예를 들어, 근육내(intramuscular), 경막내(intrathecal), 경막외(epidural), 복막내(intraper itoneal) 또는 피하(subcutaneous) 주사로 활용될 수 있다. 무균 용액들은 정맥으로 투여될 수 있다. 활성 성분은 무균수, 식염수 또는 다른 적절한 무균 주사 매체를 사용하여 투여할 때 용해되거나 부유될 수 있는 무균 고체 조성물로서 제조될 수 있다. 담체들은 필요하고 안정한 접합제, 현탁화제, 윤활제, 향신료, 감미료, 방부제, 염료 및 코팅제를 포함한다.

본 발명의 치료적 조성물의 활성 성분(즉, Flt3L 길항제 및 인터페론 길항제)은, 예를 들어, 등장액, 답즙염, 아카시아, 젤라틴, 충분한 염분 또는 글루코 스, 소르비탄 모노올레이트, 폴리소베이트80(소비톨 및 에틸렌 산화물로 공중합된 이것의 무수물) 등을 만들기 위해 무균 용액 또는 다른 용질 또는 현탁화제를 포함하는 현탁액의 형태로 경구 투여될 수 있다.

활성 성분은 또한 각각 액체 또는 고체 조성물 형태로 경구 투여될 수 있다. 경구 투여에 적합한 조성물들은 알약, 캡슐, 과립, 정제 및 가루와 같은 고체 형태 및 용액, 시럽, 엘리서제 및 현탁액과 같은 액체 형태를 포함할 수 있다. 비경구 투여에 유용한 형태는 무균 용액, 유탁액 및 현탁액을 포함한다.

본 발명의 관행은, 만일 달리 제시 되지 않는다면, 당해 기술분야 내의 분자 생물학, 미세 생물학, 재조합 DNA 기술 및 면역학을 사용할 수 있다. 이런 기술들은 문헌에서 설명된다: 예를 들어, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Maunal, Second Edition(1989); DNA Cloning, Vols. Ⅰand Ⅱ(D.N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization(B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Animal Cell Culture(R. K. Freshney ed. 1986); Immobilized Cells and Enzymes(IRL press, 1986); Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning(1984); the series, Methods In Enzymolog(S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); and Handbook of Experimental Immunology, Vols. Ⅰ-Ⅳ(D. M. Weir and C. C. Blackwell eds., 1986, Blackwell Scientific Publications) 참조.

본 명세서에서 사용된 단어 "또는"의 의미는 특정 목록의 임의의 한 구성요소 및 그 목록의 구성요소들의 임의의 조합을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 단수형인 "a", "an" 및 "the"는 내용이 다른 것을 명확히 가리키지 않으면 복수의 참조를 포함한다.

본 발명은 다음의 실시예들을 참조하여 더 기술될 것이다; 그러나, 본 발명이 이런 실시예들에 한정되지 않는다는 것을 알아야 한다. 오히려, 본 발명을 실시하기 위한 현재의 최고 모드를 기술하는 본 공개공보의 면에서, 많은 변형 및 변이가 본 발명의 범위 및 취지를 벗어나지 않고 당업자에게 제공될 수 있다. 청구항의 균등범위 내에 있는 모든 변화들, 변형들 및 변이들이 이들의 범위 내에서 고려될 수 있다.

도 1은 림프(형질구양)DCs 및/또는 이들의 생성물, 예를 들어, 타입Ⅰ인터페론 또는 이들 사이의 관계 및 골수성 DCs의 분화를 나타내는 SLE 내에서 수지상 세포 서브세트들 사이의 상호작용에 대한 개략도이다. 골수성 DCs의 분화는 SLE 발명에 영향을 미치는 자가반응 T세포 및 B세포의 분화를 유도하는 항원 제시의 캐스케이드(cascade)를 개시한다.

도 2a-2e는 자가(AS)혈청을 가지고 배양할 때가 아니고 SLE를 가진 환자로부터의 혈청으로 배양할 때 수지상 세포 형태를 뭉치게하고 획득하는 정상적인 도너로부터의 정제된 단핵세포를 나타내는 사진이다. 단핵세포들은 AS 혈청(도 2c) 또는 SLE 혈청(도 2a-2b)로 배양된다. 도 2d는 SLE 혈청들에 의해 유발되는 흐릿한 세포의 집단을 도시한다. 도 2e에서, SLE 혈청으로 24시간 동안 배양된 사이토스펀(cytospun) 단핵세포의 김사(Giemsa) 염색은 성숙된 DCs의 전형적인 형 태를 가진 세포들을 나타낸다("SLE-DCs"=SLE 혈청 유발 DCs).

도 3은 성숙한 DCs의 표현형을 얻은 SLE 혈청으로 배양된 단핵세포의 플로우 사이토메트리(flow cytometry) 분석의 결과를 나타내는 그래프이다. 각 그래프는 아래의 각 그래프에 열거된 세포 표면 마커들에 특이적인 라벨을 붙인 항체의 탐지가 증가된 것을 나타낸다. 자가 혈청(상부 패널)이 아닌 SLE 혈청(하부 패널)로 배양된 단핵세포들은 CD14 발현을 낮추는 조절을 하고, HLA-DR 및 CD86, CD80 및 CD40과 같은 상호 자극 분자들을 증가시키는 조절을 하며 CD83의 발현, 성숙된 DCs의 마커를 획득한다.

수평축은 아이소타이프(isotype) 대조 표준(점선) 및 특이 항체(실선)에 대한 로그 스케일에서의 형광 강도를 나타낸다. 수직축은 상대 세포 빈도를 나타낸다.

도 4a-4e는 SLE 혈청으로 배양된 단핵세포가 가용성 항원을 포획하는 것을 나타내는 플로우 사이토메트리 결과의 그래프이다. 증가된 단핵세포들은 SLE 혈청(도 4d 및 4e)(SLE 1 및 SLE2는 SLE를 가진 두 명의 다른 환자의 혈청을 나타낸다) 또는 AS 혈청(도 4c)으로 배양되었고 이들의 세포내분열 활성은 4℃(얇은 선) 및 37℃(굵은 선)에서 FITC-덱스트란(FITC-DX) 섭취를 사용하여 결정되었다. GM-CSF 및 IFN-α("GM-IFNα")뿐만 아니라 GM-CSF 및 IL-4("GM/IL4")(도 4a)(생체 밖 DC 배양을 위한 기준)로 배양된 단핵세포들은 FITC-DX 섭취의 필적할만한 레벨을 나타낸다. AS 혈청으로 배양된 단핵세포들은 FITC-DX를 섭취하지 않는다.

도 5는 AS 혈청이 아닌 SLE 혈청으로 배양된 단핵세포들이 동종이계 순수 CD4+T 세포의 확산을 유도한다. GM/IFNα, GM/IL4, SLE1, SLE2 및 AS 혈청으로 배양된 단핵세포들은 세척되고 5일 동안 1x10⁵순수 CD4+CD45RA+동종이계 T 림프구로 선별된 양(1000세포 및 5000세포)으로 배양된다. T 세포 확산은 티미드 인코퍼레이션(thym idine incorporation)(cpm x 10³, 수직축)에 의해 결정되었다.

도 6은 AS 혈청 내에 배양된 SLE-DCs 또는 DCs에 의해 유발된 T 세포에 의해 생산된 T 세포 사이토카인의 레벨의 그래프이다. 사이토카인 분비는 ELISA 측정법에 의해 측정되었고 IL-10 및 IFN-γ는 수직축의 pg x 10³/mL로 나타난다.

도 7a, 7b 및 7c는 SLE-DCs에 의한 자가 고사 세포(autologous apoptotic cells)의 포획을 도시하는 사진이다. 김사(Giemsa)로 SLE 혈청(도 7a 및 7b) 및 AS 혈청(도 7c)을 갖는 하루된 단핵세포 배양 조직의 사이토스핀(cytospins)을 염색하였다. 화살표는 SLE 혈청을 갖는 배양 조직에서 세포 단편의 포획을 나타낸다.

도 8a 및 8b는 동종이계 고사 세포의 포획 및 자가 CD4+T 세포에 대한 이들의 항원의 제시를 나타내는 그래프이다. 도 8a는 7AAD 레벨에서의 증가에 의해 나타낸 것과 같이 SLE-DCs가 고사체를 포함하는 DNA를 포획한 것을 나타내는 플로우 사이토메트리 결과를 도시한다. 충전된 DCs는 자가 CD4+T 세포 확산(티미딘 인코퍼레이션에 의해 측정, 수직축)의 자극기로 사용된다(도 8b).

도 9a-9b는 SLE 질환 활성과 SLE-DCs의 IFN-α유발 활성과의 관계를 나타내는 그래프이다. 도 9a는 유발 활성 및 SLEDAI 사이의 상관관계를 나타낸다. 도 9b는 유발 능력 및 혈청에서의 IFN-α레벨 사이의 상관관계를 나타낸다. 각 그래프 상의 각 점은 환자로부터 취한 혈청을 나타낸다.

도 10은 SLE 환자로부터 얻은 혈청에서의 IFN-α의 봉쇄를 나타내는 그래프이다. 세포들을 제시하는 항원은 그래프 상에서 나타내는 것과 같이 아이소타이프 대조 표준 또는 IFN-α를 중화시키는 항체를 첨가하거나 또는 첨가함이 없이 SLE 혈청에 의해 발생된다. 세포들은 세척되고 자극 세포로서 정해진 양으로, 5일 동안 정화된 동종이계 CD4+T 세포(1 x 10⁵)를 가지고 배양된다. T 세포 확산은 티미딘 인코퍼레이션(thymidine incorporation)(cpm x 10³, 수직축)에 의해 결정되었다.

도 11은 SLE를 가진 환자가 IFN-α의 높은 혈청 레벨을 갖는 것을 나타낸다. SLE를 가진 45명의 환자 및 28명의 일반 환자로부터 혈청 샘플들을 취하였다.

도 12는 SLE를 가진 환자들의 원형 혈액 단일핵 세포(PBMCs)가 바이러스 발생에 반응하여 IFN-α를 생체 밖으로 분비하는 것을 나타내는 그래프이다. 전체 PBMCs는 인플루엔자 바이러스(10㎍/mL)를 가지고 또는 없이 96-웰 플레이트에서 배양되었다. 상청액을 24시간 동안 배양한 후에 채취하였고 ELISA에 의해 IFN-α분비를 측정하였다. "모든(All)-"은 바이러스 없는 대조표준 배양액에서의 레벨을 나타낸다. "+"는 바이러스를 가진 배양액을 나타낸다. "ND"는 정상 도너를 나타낸다.

도 13a 및 13b는 IFN-α가 단핵세포들 상에 BAFF/Blys(TNF 군의 B 세포 활성인자)/Bly(B 림프구 자극기)발현 및 PBMCs 상에 BCMA(B 세포 성숙 항원)발현을 생체 밖으로 유발하는 것을 나타내는 그래프이다. 도 13a는 지시된 조건(IFN-αU/mL)하에서 72시간 동안 배양된 단핵세포들 내의 상대적 BAFF 발현(ng/ng 18S 리보소말 RNA)을 나타낸다. NI는 동일한 도너로부터의 대조표준 미배양 단핵세포들을 나타낸다. 도 13b는 정해진 시간 동안 1000U/mL IFN-α로 미배양(NI)되거나 배양된 PBMC 안에서 상대적 BCMA 발현(ng/ng18S)을 나타낸다. 상대적 RNA 발현은 ABI PRISM 7700 서열 탐지 시스템(ABI)을 사용하는 실시간 PCR에 의해 측정된다. 참조(18S 리보소말 RNA)에 적대적인 표적 발현(BAFF 또는 BCMA)의 비율은 정상화된 발현 레벨을 나타낸다.

도 14a-14c는 형질구양 DCs(pDCs)에 의한 IFN-α분비의 TNF 제어를 나타내는 그래프이다. 도 14a는 내생 TNF의 중화가 CD123+pDC에 의해 지속된 IFN-α분비를 초래한다는 것을 나타낸다. 정해진 조건하에서 발생된 배양 상층액의 ng/mL IFN-α의 레벨을 나타낸다. 도 14b-14c는 TNF의 pDCs로의 첨가가 바이러스 유발 IFN-α분비를 억제하는 것을 나타낸다. 도 14b는 수직축 상에서 배양 상층액 속으로 분비된 IFN-α의 억제를 백분율을 나타낸다. 도 14c는 수직축 상에서 ng/mL의 배양 상층액에서 IFN-α의 레벨을 나타낸다.

도 15는 TNF이 골수성 DCs에 유리한 형질구양 DCs의 분화를 막는 것을 나타내는 플로우 사이토메트리 실험의 그래프이다. 이 모양은 CD34+조혈모세포로부터 pDC의 발생의 TNF 억제를 나타낸다. CD34+CD45RA-조혈모는 배양의 첫주 후에 Flt3L(100ng/mL), TPO(30ng/mL) 및 IL-6(25ng/mL)또는 TNF 100ng/mL에서 배양되었다. 그런 후에, 세포들은 세척되고 Flt3L(100ng/mL)만으로 추가 3주간 동안 배양하였다. pDC 분화는 CD11c 음성 CD123 양성 염색에 의해 동정되는 pDC를 가진 세포 표면 마커 발현의 플로우 사이토메트리 분석에 의해 결정되었다.

도 16은 인터페론 길항제로서 작용하는 외생 TNF에 의해 억제될 수 있는 형질구양 DC 개체발생에서 경로를 나타내는 개략도이다.

도 17은 SLE를 가진 환자의 혈청 내의 Flt3L(pg/mL) 레벨이 증가된 것을 나타내는 그래프이다.

도 18은 SLE 환자 내의 Flt3L의 형질 레벨 및 SLEDAL에 의해 측정되는 질병 활성과의 상관관계를 나타내는 그래프이다. 통계적 의미는 선형회귀분석(linear regression) 및 상관관계분석(Pearson analysis)에 의해 결정되었다.

도 19a-19d는 Flt3L로 채워진 배지들로 배양된 단핵세포들이 DC 형태를 가진 세포 속으로 분화하는 것을 나타낸다.

도 20은 Flt3L(100ng/mL)로 채워진 배지들로 배양된 단핵세포들이 나이브(naive) CD4+T 세포를 만들 수 있다는 것을 보여주는 그래프이다.

도 21은 Flt3L 및 IFN-α의 활성을 봉쇄함으로써 변할 수 있는 DC의 서브세트의 발현 및 분화의 여러 경로들을 보여주는 개략도이다.

도 22는 SLE에서의 사이토카인 및 DCs 사이의 상호작용을 나타내고 본 발명의 치료 조성물을 위한 사이토카인 및/또는 세포 표적을 동정하는 개략도이다.

실시예 1: SLE 혈청들은 수지상 세포와 같은 성질을 가진 세포로 분화하는 단핵세포들을 유도한다.

정상 단핵세포들을 생체외에서 SLE 혈청들에 노출하였다: 12-24 시간 내에, 단핵세포들의 집단이 발견되었고; 24-48 시간 내에, 덩어리 세포들이 DC 배양액의 정교한 세포질 투사 잔상을 나타내었다(도 2a 및 2b). 단지 SLE 혈청은 12-24 시간 내에 뭉치기 위해 단핵세포들을 유발하였고 흐릿한 세포 형태를 획득한다(도 2c의 AS와 비교한 도 2a-2b).

SLE 혈청: 동의 후에, SLE를 위한 미국류마티즘병학협회의 진단 기준을 만족하는 환자의 혈액을 획득하였다. 전혈을 EDTA 또는 헤파린을 함유하는 튜브속에 수집하였고 4℃, 100xg에서 원심분리기로 즉시 분리하였다. 혈장을 거둬들여 트롬빈(Jones Pharma Incorporated, MO)으로 처리하였고 사용할 때까지 -80℃로 저장하였다. 질병 활동은 혈액 표본이 획득된 날과 동일한 결정된 SLE 질병 활동 인덱스(SLEDAI)스코어(Lahita, R.G. 1999. Systemic Lupus Erythematosus. Academic Press 3rd edition)를 사용하여 평가하였다.

세포 배양 및 표현형 분석: Ficoll-Paque^TM그레디언트 후에, 단핵세포들을 면역 자기 감소(immunomagnetic depletion, Dynabeads)에 이어 정화된 항-CD3, 항-CD19, 항-CD56 및 항-글리코포린 A 항체를 사용하여 T-세포, B-세포 및 NK 세포들의 감소시킴으로 혈액 단핵구 세포로부터 분리시켰다. 농축 CD14⁺단핵세포들을 100ng/mL의 GM-CSF 및 1000UI/mL의 IFN-α; 또는 100ng/mL의 GM-CSF 및 20ng/mL의 IL-4; 또는 루푸스 혈청; 또는 자가 혈청을 사용하여 3일 동안 6 웰 플레이트(6 well plate)(1x10⁶/웰)에서 배양하였다. 3일째 날에, 세포들을 거둬들였고 항-CD14-PE 항체, 항-CD83-PE 항체, 항-HLA-DR-PrCP(페리디닌 엽록소 단백질(peridnine chlorophyll protein) 항체, 항-만노오스-수용체-PE 항체, 항-CD80PE(피코에리트린(phycoerythrin))항체, 항-CD86-PE 항체, 항-CD40 PE 항체, 항-CD16-PE 항체, 항-CD32 PE 항체, 항-CD64-PE 항체 및 항-CD1a-FITC 항체로 염색하였다.

정상 도너로부터의 농축된 CD14+ 단핵세포는 20% 루푸스 혈청 또는 자가 혈청으로 배양하였다(1x10⁶/웰). 단핵세포들은 SLE-DCs에서 배양하였고 3일째 날에, 세포들을 거둬들였고 어떤 세포 표면 분자들의 발현을 위한 플로사이토메트리(flow cytometry)에 의해 평가하였다. 플로사이토메트리 분석은 CD14의 축소-제어(reg)를 나타냈고, MHC 군Ⅱ의 발현의 증가, 공동자극분자(costimulatory molecule): CD40, CD86 및 CD80, CD83뿐만 아니라 만노오스 수용체, CD32 및 CD36(도 3)의 발현을 증가 시켰다. 대식세포(MΦ)보다는 DCs의 외형 및 표현형에 의한 단핵세포 분화의 세포에 대한 유도는 SLE 혈청에서 성장한 이런 DCs에 한정되었다. 사실은, 자가 또는 동종이계 혈청도 이런 표현형(도 2c)을 유도하지 못한다.

다음의 항원에 대한 단일클론 항체(mAbs)를 사용하였다:CD14, HLA-DR(Becton Dickison); CD86, CD40, HLA-ABC, CD1a(Dako, Carpinteria, CA); CD80, CD83(Beckman Coulter/Immunotech, New York).

SLE 혈청-유도 세포들이 항원 포획 수용체들을 나타내었고 항원을 포획하는 능력이 DCs의 중요한 특성이기 때문에, 배양액에서 분화된 세포들이 용액 항원들을 포획할 수 있는 지를 정하였다. 이를 위하여, SLE 혈청 배양 단핵세포를 FITC-Dextran으로 배양하였다.

배양액에서 분화된 세포들의 세포 내분열 활동은 37℃에서 1시간 동안 100㎍/mL FITC-Dextran으로 세포를 배양함으로써 결정하였다. 대조표준으로서, 다소의 세포들을 얼음 위에 FITC-Dextran로 배양하였다. 세포들을 차가운 PBS/FCS로 세척하였고 플로사이토메트리로 분석하였다.

그래서, 외형, 표현형 및 항원 포획은 SLE 혈청이 단핵세포들이 항원을 포획할 수 있는 세포들, 즉, CD14, 만노오스 수용체 및 CD36(미성숙 DCs 및 MΦ의 특성)과 같은 발현 항원 포획 분자 및 HLA-DR, 공동-자극 분자들 및 CD83, 성숙 DCs의 마커를 포함하는 항원 제시에 중요한 발현 분자들, 로 분화되게 하는 것을 나타내었다.

SLE 혈청으로 배양된 단핵세포가 모든 항원 제시 세포들 사이의 DCs에 독특한 특성, 순수한 CD4+ T 세포의 확산을 유발할 수 있는지를 결정하였다.

도 5에 나타난대로, 자가 혈청으로 배양된 단핵세포는 동종이계 CD4+T 림프구의 제한된 확산을 유발한 반면에 SLE 혈청으로 배양된 단핵세포들은 인비트로로 DCs의 표준 특성인 GM-CSF/IL-4 DCs와 유사한 강한 T 세포 확산을 유발하였다. 도 6은 각각 SLE-DCs 또는 AS 혈청으로 배양된 DCs에 의해 유발된 T 세포들에 의해 제조된 T 세포 시토키닌의 레벨을 나타낸다. SLE-DCs는 IL-10(무시해도 좋은 레벨은 제외)이 아닌 IFN-γ를 제조하기 위하여 T 세포들을 유발하여서, 타입Ⅰ극성(Th1)을 나타낸다. SLE 혈청, AS 혈청, GM-CSF/IFN-α또는 GM-CSF/IL-4로 배양된 단핵세포들을 세척하고 동종이계 CD4+T세포로 플레이트 하였다. 배양 및 PHA로 하루 재자극 5일 후에 상청액들을 거둬들였다. 시토키닌 방출을 ELISA 측정법으로 측정하였 고 IL-10 및 IFN-γ은 수직축 상에 pg x 10³/mL에 나타난다. 그래서, 활성화된 CD4+T 림프구는 높은 레벨의 인터페론-γ, 낮은 레벨의 IL-10 및 타입Ⅰ분극과 일치하는 IL-4를 분비하였다.

T-세포 확산 및 시토키닌 측정법: DCs를 cRPMI 플러스 10% 인간 AB 혈청에서 5일 동안 계량된 양에서 1x10⁵ 새로 분리된 CD4+ 동종이계 T 세포들 또는 신규 CD4+CD45RA+동종이계 T 림프구로 배양하였다. 자가 T 세포 확산을 측정하기 위하여, GM-CSF/IFN-α또는 GM-CSF/IL4 또는 루푸스-세포를 4시간 동안 DNA-몸체로 맥동하였고 계량된 양으로 1 x 10⁵ 자가 T 세포로 배양하였다. 세포들은 웰 당 0.5μCi[³H]티미딘으로 마지막 16시간 동안 맥동하였다(New England Nuclear, Boston, MA). 시토키닌 분석을 위하여, 상청액을 배양 5일 후에 거둬들였고, 세포들을 24시간 동안 새로운 보존액에서 재자극하였다. 시토키닌의 분비는 ELISA 키트로 측정하였다(R&D 시스템, Minneapolis,MN).

실시예 2: SLE-DCs는 포획된 고사 세포의 항원을 제공한다

면역 시스템에 의한 고사 세포의 비정상이고 적절하지 않은 처리는 SLE 발병 사건의 하나로서 여겨진다. 그래서, SLE-DCs가 포획된 고사 세포들의 항원을 제공할 수 있는 가를 결정하였다. 이를 위하여, SLE-DCs는 배양액에서 고사 세포 절편을 포획할 수 있다는 것으로 나타내었다(도 7a-7b).

SLE-DCs는 흑종 세포로부터 분화된 고사 몸체를 포함하는 DNA를 포획할 수 있다. 도 8a 및 8b는 동종이계 자가 세포의 포획 및 이들 항원들의 자가 CD4+T세포의 제시를 나타낸다. SLE-DCs는 고사 몸체(도 8a)를 포함하는 DNA를 포획하였고 CD4+T세포 확산의 도입에 의해 나타난대로 이들의 항원들을 자가 CD4+T 세포들에 제공하였다(도. 8b). AS 혈청, SLE 혈청 및 GM-CSF/IL-4에 의해 유도된 HLA-DR+단핵세포들은 7AAD 레이블된 DNA-몸체(감마-방사(150Gy))에 의해 죽은 흑종 세포주)를 포획하였다. 고사 몸체들의 포획을 허용하기 위하여, 항원 제시 세포들을 살해된 세포들과 혼합하고 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 그런 후에, 이 충전된 SLE-DCs은 플로시토메트리로 분류하였고 자가 CD4+T세포들로 배양하였다. T세포 확산은 5일 후에 결정된다.

이 충전된 SLE-DCs들은 자가 CD4+T세포들로 배양되었다. 도 8b에 나타난대로, 충전된 SLE-DCs들을 자가 CD4+T세포들로 배양하였다. 그래서, SLE 혈청들은 자가 세포들로부터 처리된 항원을 포획 또는 제공할 수 있는 활성 DCs로 분화될 수 있는 단핵세포들을 유발하였다.

실시예 3: 활성 SLE 혈청들을 포함하는 IFN-α는 SLE-DCs가 되는 단핵세포들을 유발한다

모든 SLE 혈청들이 DCs 로의 단핵세포 분화를 유발할 수 있는지를 결정하기 위하여 실험들을 수행하였다. 단핵세포들은 혼합된 백혈구 반응 또는 혼합된 림프구 반응(MLR)을 나타내는 이들의 능력을 위해 검사되는 19 개의 다른 SLE 혈청들로 배양하였다. 표1에 나타낸 것처럼, 자가 혈청으로 배양된 단핵세포들은 매우 낮은 T 세포 확산(네거티브 제어)을 유발할 수 있고 DCs를 제조하는 GM-CSF/IL-4 로 배 양된 단핵세포들은 100% MLR(포지티브 제어)를 끌어내었고, 평균 확산은 7.5%(±6.4%, n=5)였다. SLE 혈청으로 배양된 단핵세포들이 동일한 방법으로 배양될 때, 19 혈청의 컷-오프 포인트로서(자가 혈청 배양 단핵세포들의 평균+2SD) 고려되는 20% 확산은 단핵세포가 41%±15%의 평균 확산으로 알로스티뮬로토리(allost mulatory)DCs가 되게 유발한다. 피부근염(dermatomyositis)이 있는 환자의 혈청들로부터 이 스킹(skewing)을 재생할 수 없고 피부근염이 있는 환자는 SLE 환자와 동일한 스테로이드 섭생법으로 치료되기 때문에, SLE 혈청들의 효과는 스테로이드와는 무관한 것으로 결론을 내렸다. 게다가, 두 개의 새롭게 진단된 치료되지 않은 환자들의 혈청들은 단핵세포들을 SLE-DCs로 유효하게 분화시켰다. 중요한 것은, SLE-SDCs를 유발하는 이런 11 혈청들 중에서, IFN-α를 위해 검사된 7 혈청은 190pg/mL IFN-α이상을 함유하고, 반면에 다른 혈청들의 대부분은 측정법(12pg/mL)에서 탐지될 수 있는 더 적은 IFN-α를 함유하는 SLE-DCs를 유발할 수 없다(표 1). 게다가, SLE 혈청의 능력을 유발하는 DCs는 질환 활성과 관련되었다. 도 9a-9b에서, 그래프는 SLE 질환 활성의 SLE-DCs의 유발 작용에 대한 관계를 나타낸다. 단핵세포들은 활성 루푸스(SLE 질환 활성 인텍스(SLEDI)>6)또는 비활성 루푸스(SLEDI<6)를 가진 환자들로부터 취한 11 다른 SLE 혈청들로 배양하였고 발생된 세포들을 이들의 T 세포 확산을 유발하는 능력을 위해 검사하였다. 대조표준으로서, 단핵세포들은 GM-CSF 및 IL-4로 배양하였다. 수직축은 유도된 알로스티뮬로토리 능력을 나타낸다. 따라서, DCs에 대한 단핵세포 분화를 빗나가게 하는 SLE 혈청들의 능력은 질환 특이적이고 IFN-α의 레벨과 연관되었다.

표 1: SLE 혈청을 함유하는 IFN-α는 혼합된 림프구 반응을 자극하는 능력을 획득하기 위한 단핵세포들을 유발한다.

혈청	MLR	IFN-α레벨 pg/ml	SLEDAI
SLE 1	53%	ND	20
SLE 2	58%	>500	8
SLE 3	27%	192	12
SLE 4	28%	ND	24
SLE 5	33%	>500	12
SLE 6	5%	<12.5	2
SLE 7	45%	733	14
SLE 8	34%	410	17
SLE 9	26%	>500	10
SLE 10	4%	<12.5	6
SLE 11	12.5%	25	6
SLE 12	70%	>500	12
SLE 13	4%	<12.5	4
SLE 14	50%	ND	4
SLE 15	10%	<12.5	6
SLE 16	16%	78	6
SLE 17	30%	>500	8
SLE 18	60%	>500	17
SLE 19	7.5%	<12.5	14
SLE 20	4%	<12.5	2
AS(n=8)	7%	<12.5
연소성관절염 (n=2)	3%	<12.5
근피부염 (n=3)^*	4%	<12.5
GM/IL4	100%

단핵세포들을 다른 SLE 혈청(표1, 1열)로 배양하였고 발생된 세포들을 자가 T 세포 확산(혼합 림프구 반응{2열, 표1, MLR})을 유발하는 이들의 능력을 시험하였다. 대조표준으로서, 단핵세포들을 GM-CSF 및 IL-4로 배양하였고 100% 표준으로 사용하였다. SLE 혈청으로 배양된 단핵세포들의 알로스티뮬로토리 활성은 GM-CSF 및 IL-4와 비교된 T세포 확산의 퍼센트로서 표현되고 혈청 내의 IFN-α의 레벨(3열, 표1) 및 질환 활성(SLEDI, 4열, 표1)과 관련된다. SLEDAI는 유기체들의 평가를 포함하는 임상 및 실험 기준의 9 그룹으로 이루어진다: CNS, 혈관, 신장, 근골격, 장막, 피부, 면역 및 혈액. ND는 완료되지 않은 것을 나타내고, AS는 건강한 도너로부터의 자가 혈청을 나타내고, SLE는 SLE를 가진 환자의 혈청을 나타낸다.

실시예 4: SLE-DCs를 유발하는 SLE 혈청의 능력은 IFN-α를 봉쇄함으로써 없어진다

항원-제시 세포들의 발생을 위한 단핵세포들의 분화를 빗나가게 하는 DCs의 능력은 SLE 혈청에서의 IFN-α의 레벨과 관련되었다. SLE-DCs의 표현형은 GM-CSF 및 IFN-α에 의해 유도되는 표현형의 잔상이어서, SLE 혈청들은 항체를 중화시키는 항-IFN-α로 미리 배양하였다. 이런 혈청들로 배양된 세포들은 MLR를 유도하는 이들의 능력에 의해 측정된 대로 단핵세포들의 DCs 로의 분화를 유발하는 이들의 능력을 검사하였다. 작용 DCs를 유도하는 SLE 혈청들의 능력은 아이소타이프(도 10에 나타남)제어 및 항체의 IL-4, CD40-L 및 IL-10에 대한 항체들의 다른 봉쇄가 아닌, IFN-α의 중성화에 의해 억제되었고, 이것은 IFN-α가 SLE-DCs의 유도에 필수적이라는 것을 나타낸다. 도 10은 SLE 환자들로부터 얻은 단핵세포 배양 혈청 안의 IFN-α의 봉쇄를 나타낸다. 인터페론 봉쇄 항체의 첨가는 동종이계 CD4+T 세포들의 확산을 유도하는 능력의 많은 감소를 초래한다. 이 결과는 SLE 혈청의 DCs 유도 활성은 IFN-α에 의존하고 단핵세포들을 배양하는데 사용된 SLE 혈청 안의 IFN-α를 봉쇄함으로써 없어진다. 정제된 단핵세포들을 SLE 혈청 또는 IFN-α봉쇄Ab(SLE ab)의 포화 농도에서 30분 동안 미리 배양된 혈청 또는 동기준표본 제어(SLE ctrl)의 상응하는 농도로 배양하였다. 3일 후에, 세포들을 동종이계 CD4+T 세포들의 확산을 유발하는 이들의 능력에 대해 측정하였다.

실시예 5: SLE를 가진 환자들은 IFN-α의 높은 혈청 레벨을 갖는다.

소아 SLE 환자 안의 IFN-α의 혈청 레벨을 결정하였다. 도 11에서 도시된대로, SLE 환자들로부터 취한 혈청은 건강한 피실험자(대조표준)로부터 얻은 혈청보다 훨씬 높은 IFN-α의 레벨을 갖는다. 혈청을 SLE를 가진 환자들로부터 얻었다. 혈청을 인간 인터페론을 위한 국제 참고 기준(국립건강협회에 의해 승인)에 기초한 ELISA 키트(바이오소스, 제조자의 권고에 따름)를 사용하여 IFN-α에 대해 측정하였다. 비색계 반응은 HRP 및 TNB를 사용하여 성장하였다. 450nm에서의 흡수를 마이크로플레이트 리더(microplate reader)로 결정하였다. 측정의 증가된 범위 프로토콜은 10 내지 5000pg/mL의 범위에서 혈청 레벨의 결정을 허용하는 것을 사용하였다.

실시예 6: PBMC SLE 환자들은 바이러스 발생에 반응하여 IFN-α를 분비할 수 있다.

감기 바이러스에 노출되었을 때, SLE 환자들의 PBMCs는 감기 바이러스에 노출된 건강한 성인의 PBMCs로부터 분비된 IFN-α의 레벨과 비교해서 높은 레벨의 IFN-α를 분비하였다(도 12 참조).

실시예 7: IFN-α는 단핵세포들 상의 BAFF/Blys 발현 및 PBMC 상의 BCMA 발현을 유발한다.

BAFF/Blys-L(TNF 군에 속하는 B-세포 활성 인자)을 지정하는 TNF 과의 새로운 구성요소는 DCs 및 T-세포들 상에서 발견되고 B-세포들 상의 두 개의 수용체에즉, BCMA 및 TACI를 결합하고 이들의 확산 및 면역글로블린 분비를 유동한다. 따라 서, IFN-α가 개별 세포 유형 상의 각 분자들(즉, BCMA 및 TACI)의 발현을 제어할 수 있는지를 결정하였다. 도 13a-13b에서 도시된대로, 다른 인자들이 아닌 IFN-α는 실시간 PCR에 의해 결정된대로 단핵세포들에서 BAFF/Blys의 높은 레벨을 유발한다. 게다가, IFN-α는 정상 PBMCs 상의 BCMA 발현을 유발한다.

실시예 8: 분화 생체외 진단 방법으로 단핵세포의 유발에 대한 환자 혈청의 스크리닝

환자의 혈청을 타입Ⅰ인터페론을 중성화함으로써 분화가 봉쇄될 수 있는 수지상 세포들에 대한 단핵세포 분화를 유발하는 능력에 대해 검사하였다.

실시예 1에서 상세하게 약술된 순서에 따라, 환자 혈청을 얻었다. 실시예 1에서 약술된 순서에 따라, 환자 혈청의 약수(aliquot)를 정상 환자들의 정제된 단핵세포들의 약수에 첨가하였다. 3일 후에, 단핵세포들의 수지상 세포들에 대한 분화의 등급은 당업계에서 공지된 임의의 방법들로 측정하였다. 예시의 측정 방법들은 직접 형태 분석, 플로우사이토메트리에 의한 표현형 분석, FITC-덱스트린 섭취에 의해 측정가능한 항원 포획 및 티미딘 혼합에 의해 측정가능한 동종이계 순수 CD4+T 세포들의 유발을 포함한다. 이 생체외 진단 방법은 환자로부터 얻은 혈청의 샘플로 얻은 결과를 분류하기 위하여 표준의 공지된 집단을 포함한다. 간략하게, 정상 환자의 혈청, 즉, 자가면역 질환으로 고생하지 않은 것으로 공지된 환자는 측정법을 실시하였고 얻어진 결과들은 자가면역 질환의 발현에 대한 낮은 위험을 나타내는 표준으로서 사용한다. 유사하게는, SLE와 같은 자가면역 질환을 가진 것으로 알려진 환자의 혈청을 취해서 측정법에서 사용하고 얻어진 결과들을 자가면역 질환의 발현에 대한 높은 위험을 나타내는 기준으로서 사용한다. 타입Ⅰ인터페론에 의해 봉쇄될 수 있는 수지상 세포에 대한 단핵세포 분화의 높은 등급을 지지하는 환자 혈청은 환자를 자가면역 질환의 발현에 대한 높은 위험에 처하게 한다. 단핵세포 분화의 "높은 등급"은 환자의 혈청을 사용하는 측정법에서의 단핵세포 분화의 양을 높은 위험, 낮은 위험 및 임의의 다른 중간 위험 정도에 대해 미리 정해진 기준들과 비교하여 결정한다. 자가면역 질환의 발현에 대한 위험의 각 레벨은 측정법에서 관찰된 단핵세포 분화의 레벨과 연합된다. 만일 환자 혈청이 타입Ⅰ인터페론에 의해 봉쇄될 수 있는 수지상 세포들에 대한 단핵세포 분화의 높은 정도를 뒷받침하지 않으면, 자가면역 질환의 발현에 대한 위험의 환자의 레벨은 적거나 위험이 없다. 자가면역 질환으로 진단된 환자룰 위해, 본 측정법에서 환자의 혈정의 주기적 평가는 질환 격발 또는 진행을 관찰하기 위한 방법을 제공한다.

실시예 9: TNF는 pDCs에 의한 타입Ⅰ인터페론 분비를 억제한다

카도와키 등(Kadowaki et al.)(J. Exp. Med. 2000, 192:1785-96)은 자가분비 TNF-α가 이들의 성숙을 성숙한 pDCs로 유도하여 IFN-α를 생산할 수 없게 하는 동안에 자가분비 IFN-α가 pDCs 생존을 뒷받침한다는 것을 기술한다. 그래서, 중성화 TNF 항체들을 정상 pDCs에 첨가하는 것이 바이러스 발생에 반응하여 이들의 IFN-α생산을 유지하는 지를 결정하기 위하여 연구들이 실행되었다.

이 연구들을 위하여, pDCs는 CD11c 음성 및 CD123 양성 세포들의 플로우사이토메트리 분류에 의해 CD34+조혈 전구체들의 배양조직으로부터 분리하였다. 분리된 DCs를 정제된 감기 바이러스(5μL)로 웰/200μL 당 50,000 세포들의 농도로 배양하 였고 대조표준 항체 또는 중성 항-TNF 항체(제 1 배양) 각각으로 배양하였다. 제 1 배양의 24시간 후에, 플레이트를 원심분리하였고, 상청액을 거둬들였고 세포들을 감기 바이러스(제 2 배양)의 새로운 양(5μL)을 새로운 배지에서 재배양하였다. 제 2 배양의 추가 24시간 후에, 상청액을 거둬들였고 IFN-α레벨의 존재를 평가하였다.

도 14a-14c는 형질구양 DCs(pDCs)에 의한 IFN-α분비의 TNF 제어를 나타낸다. Flt3L(100ng/mL) 및 혈소판증식인자(Thrombopoietin(TPO))(30ng/mL)로 CD34+조혈 전구체 세포를 인비트로로 배양함으로써 발현되는 정제된 DCs를 각각 대조표준 항체(5㎍/mL) 또는 중성 항-TNF 항체(5㎍/mL) 또는 외인성 TNF(100ng/mL)를 가진 정제된 감기 바이러스(5μL)로 웰 당 50,000 세포들의 농도에서 배양하였다. 배양 24시간 후에, 플레이트를 원심분리하였고, 상청액을 거둬들었고 세포들을 감기 바이러스(제 2 배양)의 새로운 양으로 새로운 배지에서 재배양하였다. 배양의 추가 24시간 후에, 상청액을 IFN-α레벨의 평가를 위하여 거둬들였다. 도 14a에 도시된대로, 중성 항-TNF 항체의 첨가는 제 2 배양액에서 IFN-α의 3배 증가된 분비를 초래하였다. 역으로, TNF 첨가는 pDCs의 제 1 배양에서 IFN-α분비의 70% 이상의 억제를 초래하였다. 도 14c에 도시된대로, 제 1 배양 상청액에서 IFN-α의 농도는 100ng/mL에서 40ng/mL로 감소하였다.

이 연구는 어떻게 미성숙 pDCs가 TNF(또는 호전적 항-TNF 수용체 결합제)에서의 배양에 의한 IFN-α분비를 막을 수 있는가를 도 16에서 요약된 제한되지 않는 이론을 제공한다. TNF로 배양된 pDCs는 성숙한 pDCS가 되도록 촉진되어 IFN-α를 분비하지 않는다.

실시예 10: TNF는 pDC 개체발생을 억제한다

연구들이 pDC 위의 TNF의 효과가 이들의 성숙/IFN-α제조에 제한되는지 또는 TNF, 골수성 수지상 세포 분화의 제어에 관여하는 주요 친염증성 사이토카인이 조혈 전구체로부터 pDCs의 분화에 영향을 미치는지를 결정하기 위하여 실행되었다. 이 연구를 위하여, CD34+CD45RA-조혈 전구체들을 플로우사이토메트리로 순도 90%이상으로 분류하였고 연속적으로 Flt3L(100ng/mL, R&D), 혈소판증식인자(TPO, 30ng/mL, R&D) 및 인터루킨-6(IL-6, 25ng/mL, R&D) 또는 종양 괴사 인자(TNF, 100ng/mL, R&D)의 존재하에서, 2/5 x 10⁵ 내지 5 x 10⁵/웰 사이의 농도에서 1주일 동안 배양하였다. 그런 후에, 세포들을 세척하고 단지 Flt3L(100ng/mL)로 약 3주 동안 추가로 배양하였다.

도 15는 TNF가 골수성 DCs에 유리하게 혈질구양 DCs의 분화를 봉쇄하는 것을 나타내는 플로우사이토메트리 실험의 결과를 나타낸다. pDC 분화를 CD11c 음성 CD123 양성 염색으로 동정되는 pDC를 가진 세포 표면 마커 발현의 플로우사이토메트리 분석으로 결정하였다. 그래서, 1주일 후에 TNF를 첨가하면 CD123+CD11c-pDCs 속으로의 전구체 세포 분화를 완전히 금지하고 CD123-DC11c+골수성 DCs에 대한 분화를 빗나가게 했다. 그래서, TNF 및/또는 호전적 항-TNF 수용체 항체들, 이들 모두는 선구체 세포 상의 TNF 수용체를 자극하고, pDCs의 분화 및 선구체 세포들을 골수성 DCs 분화로 재조정한다.

이 연구는 어떻게 IFN-α생산 및 분비가 선구체 세포들을 TNF(또는 호전적 항-TNF 수용체 결합제)에 노출시킴으로써 봉쇄할 수 있는지를 도 19에 나타낸 제한되지 않는 이론을 제공한다. 이런 노출은 인터페론을 만들 수 있는 pDCs의 발전의 억제를 유도하여 인터페론 생산 및 분비를 봉쇄한다.

실시예 11: Flt3L의 레벨은 SLE에 걸린 피험자의 혈청에서 증가된다.

상기의 예들에서 기술한대로, 감소되지 않는 DC 유발은 SLE에서 굉장한 자가면역 반응을 일으키는 것으로 알려지고 있고, IFN-α및 Flt3L을 함께 표적화함으로써 제어될 수 있다. 그러나, 본 명세서에서 "DC-포이틴"(DC-poietins)으로 명명된 다른 사이토카인은 DC가 생체 안에서 항원 제시 세포들로 분화하도록 준비 및/또는 활성화시킬 수 있다. DCs의 이런 준비 또는 활성화는 많은 다른 방식으로 발생할 수 있다. 예를 들어, 이런 DC-포이틴은 면역성 반응을 증가시키고 자가면역 반응을 악화시킨다. 다른 예로서, DC-포이틴은 피험자의 자가면역 반응에 기여하는 새롭게 성숙된 DCs의 실질적 발생을 증가시킬 수 있거나 성숙한 DCs의 활성을 증가시킬 수 있다.

하나의 제한되지 않는 DC-포이틴은 Flt3L이 인간 및 쥐 모델의 생체 안에서 , 골수성 및 형질구양에서, 많은 수의 DCs를 유동하는 것으로 보여진다(Maraskovsk y et al(1997)Adv. Exp. Med. Biol. 417:33-40;(1996)J. Exp. Med. 184(5):1953-62;(2000)Blood96(3):878-84). 게다가, 본 발명에서 나타낸대로, Flt3L로 CD34+조혈모 세포를 배양하는 것은 형질구양 DCs뿐만 아니라 CD11c+골수성 DCs과 단핵세포들을 생산한다.

SLE에 걸린 환자(83개 혈액 샘플)뿐만 아니라 건강한 대조표준(35개 혈액 샘플)에서 Flt3L의 혈청들의 레벨들은 상업적으로 이용가능한 ELISA(R&D)를 사용하여 결정하였다. 도 17에 도시된대로, SLE 환자들은 건강한 피험자들로부터 취한 혈청들에서 측정한 것보다 <12.5 내지 582pg/mL의 혈청의 범위에서 Flt3L(p<0.002)의 현저하게 높은 혈청 레벨을 갖는다. SLE 환자들의 83개 혈액 샘플들 및 건강한 환자들(간강한 대조표준)의 35개 혈액 샘플들을 상업적으로 이용가능한 ELISA를 사용하여 검사하였다. 혈청 샘플들에서 Flt3L의 레벨의 차이는 매개변수적 및 비매개변수적 분석 모두를 사용하여 통계적으로 분명해진다.

실시예 12: Flt3L의 혈청 레벨은 자가면역 질환 활성과 관련된다.

Flt3L의 혈청 레벨들은 SLE 질환 활성 지수(SLEDAI)로 측정된대로 질병 활성과 관련된다는 것을 결정하였다. 도 18에 도시된대로, Flt3L의 높은 혈청 레벨을 가진 이들 각자가 높은 SLE 질환 활성을 보였다는 것을 나타내는 현저한 양성 상관관계가 있었다. 따라서, Flt3L의 증가된 레벨의 발생은 피험자의 자가면역 위험 또는 활성 자가면역 질환의 지표이다.

실시예 13: Flt3L는 DCs 속으로의 단핵세포 분화를 허용한다.

건강한 도너의 원형 혈액 단일핵 세포(PBMCs)로부터 분리된 단핵세포들을 각각 CD14 비드를 사용하는 양성 선택에 의해 분리되거나 접착으로 풍성해지고 연속적으로 Flt3L(100ng/mL) 및 IL-3(10ng/mL) 및/또는 IFN-α(1000u/mL)로 완전한 배양기(10% 가열-비활성 태아 소 혈청으로 충전된 RPMI1640)에서 2일 동안 배양하였다. 대조표준 배양액을 GM-CSF 및 IL-4로 수행하였다. 도 19a는 Flt3L/IFN-α(1000u/mL)로 배양된 세포들을 나타낸다. 도 19b는 GM-CSF(100ng/mL)/ IL-4(5ng/mL)로 배양된 세포들을 나타낸다. 도 19c는 IFNα(1000u/mL)/IL-3(10ng/mL)로 배양된 세포들을 나타낸다. 도 19d는 Flt3L/IFN-α(1000u/mL)/IL-3(10ng/mL)로 배양된 세포들을 나타낸다. 배양 2일 후에, 시이토스펀(cytospun) 단핵세포들을 김사(Giemsa)로 염색하였다. Flt3L 및 IFN-α로 배양된 단핵세포들을 형태구조(도 19a-19d), 표현형(CD14로우, DC-SIGN+, CD40+, HLA-DR+, CD11c+) 및 작용, 즉, 수지상 세포 작용의 특질인 동종이계 CD4+T 세포들의 확산을 유도하는 능력에 의해 결정된대로 DCs의 특징을 나타내는 세포로 분화된다. 도 20에서, 10⁵ 정제된 동종이계 CD4+T세포들을 항원 제시 세포들의 계량된 수(수평축)로 5일 동안 배양하였다. T 세포 확산을 Flt3L로 채워진 배지로 배양한 후에 티미딘 혼합(수직축, cpm x 10³)에 의해 측정하였다. 도 21은 Flt3L 및 IFN-α의 활성을 봉쇄함으로써 변경될 수 있는 DC의 서브세트의 발전 및 분화에서의 여러 경로들을 요약한 도표를 나타낸다. 이런 치료 표적들은 1) TNF 또는 FLt3L 길항제 또는 인터페론을 만들 수 있는 세포들의 분화를 억제함으로써 억제된 인터페론 생산이라는 최종 결과로 TNF 및 Flt3L 길항제의 조합에 의해 봉쇄될 수 있는 조혈 전구체 세포로부터 pDC로의 분화 경로 2) pDCs가 세포들을 생산하는 비인터페론이 되어 인터페론의 레벨을 감소시키는 최종 결과로 TNF에 의해 가속화될 수 있는 pDCs 성숙 경로, 3) 만일 그렇지 않았다면 고사 세포들을 포획 및 제공할 수 있고 자가반응 B 세포들 및 자가반응 T 세포들의 분화를 유도함으로써 자가면역 질환을 일으킬 수 있는 수지상 세포들의 분화가 억제되는 최종 결과로 인터페론 길항제 또는 Flt3L 길항제 또는 인터페론 길항제 및 Flt3L 길항제의 조합에 의해 봉쇄될 수 있는 단핵세포들로부터 수지상 세포들로의 분화 경로를 포함한다.

실시예 14: SLE 혈청에서 Flt3L의 중성화가 수지상 세포들로의 SLE 혈청 유발 단핵세포 분화를 억제한다.

단핵세포들을 SLE를 가진 환자들로부터 얻은 혈청들로 배양한다. Flt3L(항-Flt3L 단일클론 항체)를 특이적으로 결합하는 단일클론 항체의 효과적인 양을, 포화 농도, 즉, 약 1-10배 몰농도 과량 사이의 범위의 농도로, 단핵세포 분화를 위한 적절한 배양 조건하에서 단핵세포 배양액에 첨가한다. 배양 3일 후에, 단핵클론 항체들을 수용하지 않는 동일한 단핵세포 배양액에서 보다 적은 수의 단핵세포들이 DCs로 분화하였다. 따라서, 배양액에서 Flt3L의 활성을 중성화하는 Flt3L에 대한 단일클론 항체는 DCs로의 SLE-유발 단핵세포 분화를 억제한다.

실시예 15: Flt3L 길항제 및 인터페론 길항제의 조성물의 SLE 혈청들에서 성장한 단핵세포들에 대한 첨가는 항원 제시 DCs로의 단핵세포 분화를 억제한다.

피험자의 자가면역 질환을 치료하는 방법은 본 명세서에서 예시되고, 본 발명의 치료 조성물은 피험자에서 자가반응 T 세포 및 자가 항체들을 생산하는 자가반응 B 세포들의 자극을 일으키는 항원 제시 세포들의 발생을 감소 또는 억제하기 위하여 피험자에게 투여한다.

치료 조성물을 (a) 항-Flt3L 단일클론 항체의 양 및 (b) 치료되는 환자의 혈청들에서 각각, Flt3L 및 IFN-α의 레벨의 약 1-10배와 동일한 항-IFN-α단일클론 항체의 양으로 제조한다. Flt3L에 대한 단일클론 항체들을 제조하는 방법들이 공지되었는데, 예를 들어, 한 방법은 미국 특허 제 5, 843, 423의 실시예 6인 "Flt3 리간드로 조혈 세포들을 자극하는 방법들"이다. IFN-α에 대한 단일클론 항체를 제조하는 방법들이 공지되고, 예를 들어, 이들의 방법들은 미국 특허 제 5,919,453에 개시되어 있다.

혈청들은 자가면역 질환을 가진 피험자로부터 얻을 수 있고 치료 조성물의 투여를 보증하기 위해서 Flt3L 및 IFN-α의 충분한 레벨이 혈청들에 존재하는 것을 보증하기 위하여 검사될 수 있다.

조성물의 두 요소들의 혈청 레벨이 Flt3L 및/또는 IFN-α의 약 1 내지 10배 몰부피 과량의 범위내인 것을 보장하기 위하여 주사 또는 정맥 주사 방법을 통해 매일 투여된다. 피험자의 상태의 관찰은 APCs의 발생의 레벨을 결정하기 위하여 치료 기간 내내 수행할 수 있다. 피험자의 혈청에 DCs의 존재는 치료 내내 관찰한다. 이 치료는 자가면역 질환이 완화됐을 때 종료하고 Flt3L 및/또는 IFN-α의 레벨이 2개의 연속적 혈액 분석에 대해 증가하는 경향을 보일 때 및/또는 자가면역 질환의 증상이 악화될 때 다시 시작한다.

본 발명의 내용중에 포함되어 있음

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(a) 타입Ⅰ인터페론의 활성을 감소시키며, 안티 IFN-α항체 또는 이들의 항원 결합 단편으로 이루어지는 적어도 하나의 인터페론 길항제, 및

(b) Flt3L 리간드(Flt3L)의 활성을 감소시키며, 안티 Flt3L 항체 또는 이들의 항원 결합 단편으로 이루어지는 적어도 하나의 Flt3L 길항제를 포함하며, 후천성 면역 결핍증(AIDS), 강직성척추염(Ankylosing spondylitis), 관절염(arthritis), 재생불량성빈혈(aplastic anemia), 베체트병(be hcet's disease), 당뇨(diabetes), 이식편대숙주병(graft-versus-host disease), 그래브씨병(graves' disease), 용혈성 빈혈(hemolytic anemia), 저감마글로불린혈증(Hypogammaglobulinemia), 과 IgE 증후군(hyper IgE syndrome), 특발성 혈소판 감소성 자반증(idiopathic thrombocytopenicpurpura(ITP)), 다발성 경화증(mult iple sclerosis(MS)), 중증근무력증(Myasthenia gravis), 건선(psoriasis), 루푸스 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 자가면역 질환을 치료하기 위한, 항원 제시를 할 수 있는 수지상 세포로의 단핵세포 분화를 억제하는 조성물.
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제 28 항에 있어서,

조성물이 담체를 더 포함하는 조성물.
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제 28 항 또는 제 30 항에 있어서,

안티 IFN-α항체가 단일클론 항체, 키메릭(chimeric)항체, 항이디오타입 항체(anti-idiotypic) 항체, 인간화된 항체 또는 프리마티이즈(primatized)항체이고, 안티 Flt3L 항체가 단일클론 항체, 키메릭(chimeric)항체, 항이디오타입 항체(anti-idiotypic) 항체, 인간화된 항체 또는 프리마티이즈(primatized)항체인 조성물.
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제 28 항에 있어서,

조성물이 TNF를 더욱 포함하는 조성물.
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환자의 생물학적 샘플 내에서 Flt3L 및 IFN-α를 탐지하기에 효과적인 양으로 Flt3L 및 IFN-α와 특이적으로 결합하며, Flt3L과 결합하는 단일클론 항체 및 IFN-α과 결합하는 단일클론 항체로 이루어지는 조성물을 포함하며, 자가면역 질환 발현에 대한 환자의 위험을 측정하거나 환자 내의 자가면역 질환의 상태를 감시하기 위한 키트.
제 47 항에 있어서,

생물학적 샘플이 혈액 샘플 또는 혈청 샘플인 키트.
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제 47 항에 있어서,

키트가 하나 또는 그 이상의 샘플들과 결합하는 조성물의 양을 측정하기 위한 하나 또는 그 이상의 시약들을 더 포함하는 키트.
제 47 항에 있어서,

조성물이 식별가능한 마커로 식별화되는 키트.
제 51 항에 있어서,

식별가능한 마커가 형광 마커, 방사성 마커, 효소 마커, 비색 마커, 화학발광 마커 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 키트.
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제 28 항에 있어서,

안티 IFN-α항체는 인간화된 항체이고 안티 Flt3L 항체는 인간화된 항체인 조성물.
제 47 항에 있어서,

Flt3L과 결합하는 단일클론 항체는 인간화된 항체이고, IFN-α과 결합하는 단일클론 항체는 인간화된 항체인 조성물.
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