KR101536697B1 - 베체트병 진단용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 마크로파지 만노오즈 수용체 1(Macrophage mannose receptor 1, CD206)의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 베체트병 진단용 조성물 및 키트와 이를 이용한 정보제공방법에 대한 것으로, 본 발명에 의하는 경우 베체트병의 증상 또는 처방 약물의 영향을 받지 않고 베체트병의 발병여부를 알 수 있고, 더불어 비활동성 베체트병과 활동성 베체트병을 구분하여 진단할 수 있다.

Description

베체트병 진단용 조성물{COMPOSITION FOR DIAGNOSIS OF BEHCET＇S DISEASE}
본 발명은 베체트병 진단용 조성물, 키트 및 베체트병 진단을 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다.
베체트병(Behcet's disease)은 희귀난치성 염증성 질환으로 구강 및/또는 생식기의 반복적인 아프타성 궤양, 포도막염(uveitis) 및 피부 병변을 증상으로 한다. 임상 증상은 관절, 중추신경계(central nervous system), 위장, 신장, 비뇨생식기, 폐, 심혈관 증상이 동반된 심각한 만성적 염증이 다면적으로 나타난다. 이러한 증상은 전신성의 혈관염과 관련된 것으로, 베체트병의 중심적인 병리 생리학적 특징이다. 베체트병의 정확한 발병은 불명확하게 남아있으나, 자가면역(autoimmune)과 자가염증성(autoinflammatory) 반응이 중요한 원인이 된다.
베체트병에서 세포의 침입형태는 대식세포(macrophage)와 수지상세포(dendritic cell) CD4+ 및 CD8+ T세포를 포함하고, 호중구(neutrophil)가 그 뒤를 잇는다. Th1/Th2-형태 면역 반응이 세포(매개)성 면역(cell-mediated immunity)과 베체트병의 염증에서 조사되었다. 헬퍼 T 세포(Th) 1과 Th17의 지배적인 반응이 베체트병 환자에게서 관찰됨이 많이 보고되고 있다. 이러한 반응은 인터루킨(interleukin, IL)-2, IL-6, IL-8, IL-17, IL-12, IL-18, 종양괴사인자-알파(tumor necrosis factor-alpha, TNF-α 그리고 인터페론-감마(interferon- gamma, IFN-gamma)를 포함하는 사이토카인(cytokine) 생산의 증가와 연관된다.
CD11b는 호중구, 단백구, 자연살해(natural killer, NK)세포와 림프구의 서브세트(subset)에서 발현된다. CD11b는 말초혈액에서 염증부위로 백혈구를 이동시키는데 중심적인 역할을 하는데 관련이 있음이 밝혀졌고, 숙주방어 프로세서에서 부착, 주화성 및 출혈과 관련된다. 이전의 연구는 건강한 대조군과 비교하여, 베체트병 환자의 단핵구에서 CD11a, CD11b 및 CD18 부착분자(adhesion molecule)의 발현이 현저하게 높았다는 시험결과가 보고되었다.
CD14는 단백질에 결합하는 지질다당류(lipopolysaccharide)의 수용체로 조직 대식세포보다 단핵구에서 더 높게 발현되며, 선천성 면역(innate immunity)의 보조수용체(co-receptor)이다. 베체트병 환자는 단핵구와 호중구에서 CD14 발현의 증가를 보였고, 혈청 내 용해 상태의 CD14 수치의 증가를 보인다. 베체트병 환자의 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC) 상의 열충격 단백질60(heat shock protein 60, HSP60)에 대한 CD69와 CD14 반응에 의하여 확인된 활성화는 항원제시세포(antigen presenting cell, APC)를 통해서 유도된 선천성면역 활성화와 관련될 것이다.
CD16은 Fc 수용체(Fc receptor, Fc RIII)로 호중구의 활성화와 직접적으로 관련이 있다. 일반적으로 CD14와 CD16은 호중구의 분비소포(secretory vesicle)에서 함께 발견되고, 호중구가 자극되었을 때, CD14와 CD16은 원형질막으로 함께 이동한다. 베체트병 환자에 있어서 CD16 발현의 정도는 아직 명확하지 않다. CD16+(FcγIIIA)은 NK 세포, 대식세포 및 호중구에서 발현된다. FcγII, 즉 CD32는 T 세포, 비만세포(mast cell), 단핵구, 대식세포 그리고 일부 상피와 내피 세포 계통에서 발견된다. CD32는 적응 면역(adaptive immunity)을 조절에 중요하고, CD32의 1차적 기능은 항원의 항체-매개(antibody-mediated) 흡수(uptake)와 세포의 활성화 및 성숙 조절이다.
대식세포 만노오즈 수용체(Macrophage mannose receptor, MMR) CD206은 스케빈저 수용체(scavenger receptor)로서, 조직 대식세포 및 림프와 간의 혈관내피세포에서 발현된다. MMR의 탄수화물 패턴 인식과 식세포작용은 숙주 방어와 항상성(homeostasis)을 유지하는 역할을 한다. 또한, CD206은 다양한 자가면역 및 염증 질환인 전신성 홍반성 낭창(systemic lupus erythematosus), 궤양성 대장염(ulcerative colitis) 및 크론병(Crohn＇s disease) 등과 연관이 있다. 그러나 활동성 및 비활동성 베체트병 환자의 PBMC에서 만노오즈 수용체의 역할은 거의 밝혀지지 않았다.
종래 CD8+CD11+이 베체트병 환자에서 높게 발현된다는 보고가 있었으나, 이는 베체트병에 의하여 나타나는 증상 또는 치료를 위해 처방하는 약물의 종류에 따라서 발현의 결과가 상이하게 되었는바, 베체트병을 진단할 수 있는 마커로 이용하는 것이 불가능하였고, 활동성 베체트병과 비활동성 베체트병을 구분하여 진단할 수 없어, 이를 구분하여 진단할 수 있는 생체마커에 대한 연구와 개발이 지속적으로 요구되고 있었다.
KR 10-0448488
본 발명의 목적은 베체트병, 특히 활동성 베체트병과 비활동성 베체트병을 구분하여 진단할 수 있는 마크로파지 만노오즈 수용체 1을 바이오 마커로 이용하는 베체트병 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 위하여, 본 발명자들은 활동성 베체트병의 진단을 위하여 환자의 PBMC에서 CD11b, CD14, CD16, CD32 및 CD206의 세포 표면 발현 패턴을 규명하였고, 이를 통해서 CD206을 활동성 베체트병의 진단 마커로 이용할 수 있는 조성물을 발명하였다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 마크로파지 만노오즈 수용체 1(Macrophage mannose receptor 1, CD206)의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 베체트병 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 마크로파지 만노오즈 수용체 1(Macrophage mannose receptor 1, CD206)의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 베체트병 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 분석할 시료를 제공하는 단계, 상기 시료에 마크로파지 만노오즈 수용체 1(Macrophage mannose receptor 1, CD206)에 특이적인 항체를 접촉시키는 단계, 및 상기 CD206의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 베체트병 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
본 발명의 명세서에서 특별한 언급이 없는 한, '특이적' 또는 '특이적인' 이란 세포 내에서 다른 단백질에 영향을 미치지 않고 목적 단백질하고만 결합하는 능력을 의미하고, 본 발명에서는 마크로파지 만노오즈 수용체1에 특이적인 것을 의미한다.
본 발명의 명세서에서 특별한 언급이 없는 한, '진단'이란 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미하고, 본 발명의 목적상 진단은 베체트병의 발병 여부를 진단하는 것을 의미하며, 가장 바람직하게는 활동성 베체트병의 발병여부를 확인하는 것이다.
본 발명의 명세서에서 특별한 언급이 없는 한, '분석할 시료'란 베체트병 발명에 의해서 마커 단백질의 발현량의 차이가 검출될 수 있는 개체의 혈액 또는 혈액으로부터 분리된 말초혈액 단핵세포(PBMC)와 같은 생물학적 시료를 의미하고, 본 발명의 기술분야에서 통상적으로 사용되는 방법으로 처리하여 준비될 수 있다.
본 발명의 명세서에서 특별한 언급이 없는 한, '진단용 마커, 진단하기 위한 마커 또는 진단 마커'는 마크로파지 만노오즈 수용체1의 발현 수준을 확인할 수 있는 물질을 의미하고, 바람직하게는 정상 개체와 활동성 베체트병이 발병된 개체의 말초혈액 단핵세포의 표면에서 차이를 나타낼 수 있는 유기 생체 분자를 의미한다.
본 발명의 명세서에서 특별한 언급이 없는 한, '항원-항체 복합체'란 생물학적 시료 중의 마크로파지 만노오즈 수용체 1(CD206)과 이를 특이적으로 인지하는 제제의 결합물을 의미한다. 항원-항체 복합체 형성을 살펴보는 실험방법에는 조직면역 염색, 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법(ELISA), 웨스턴 블랏팅(Western Blotting), 면역침전 분석법(Immunoprecipitaion Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유동계수법 및 단백질 칩 등이 있다.
본 발명의 명세서에서 특별한 언급이 없는 한, '항체'란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 마크로파지 만노오즈 수용체 1 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 의미하고, 다클론 항체, 단클론 항체, 재조합 항체 및 이들의 조합을 모두 포함한다.
이하, 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.
본 발명의 베체트병 진단용 조성물은 마크로파지 만노오즈 수용체 1(Macrophage mannose receptor 1, CD206)의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함한다.
상기 베체트병(Behcet's disease)은 희귀난치성 염증성 질환으로, 증상이 있는 경우 활동성 베체트병으로, 증상이 없는 경우 비활동성으로 나뉜다. 베체트병의 진단을 위한 결정적인 진단 방법은 아직 없으며, 피부이상과민반응 검사(pathergy test), 유전자 검사(HLA-B51 검출), 적혈구 침강 속도(erythrocyte sedimentation rate, ESR) 그리고 C-반응성 단백질 시험(C-reactive protein, CRP) 등으로 병의 발병여부를 진단하고 있으나, 상기 검사는 일반적인 염증 검사로써 베체트병 진단을 위한 결정적인 방법은 아니다. 피부이상과민반응 검사와 유전자검사를 통해서는 베체트병의 활동성 환자와 비활동성 환자를 구분하여 진단하기 어려운 문제가 있다. 본 발명에서 진단의 대상이 되는 베체트병은 바람직하게는 활동성 베체트병 일 수 있다.
상기 마크로파지 만노오즈 수용체 1(Macrophage mannose receptor 1, CD206)는 MRC1 유전자에 의하여 코딩되는 단백질로, C-타입 만노오즈 수용체 1(C-type mannose receptor 1), MMR1 또는 CD206이라고도 한다. 대식세포와 수지상세포의 표면에 주로 존재하는 C형 렉틴 탄수화물 결합 단백질로, 인간의 피부섬유 아세포와 피부세포 각질세포에서 발견된다.
본 발명자는 활동성 베체트병 환자에서 CD206 표면 마커를 나타내는 말초혈액 단핵세포의 빈도가 특이적으로 증가함을 확인하였고, 이를 통해서 CD206의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 조성물을 이용하여 베체트병을 진단하고, 특히 활동성 베체트병을 비활동성 베체트병과 구분하여 진단할 수 있음을 확인하였으므로, CD206 단백질은 베체트병 진단 마커로 이용될 수 있다.
상기 발현 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 마크로파지 만노오즈 수용체 1에 특이적인 항체일 수 있고, 더욱 바람직하게는 말초혈액 단핵세포의 표면에서 발현되는 CD206에 대한 항체일 수 있다. 상기 CD206의 발현 수준을 측정하는 제제는 CD206의 단독 발현을 측정하는 것뿐만 아니라, CD206CD11b 또는 CD206CD14의 동시 발현을 측정할 수 있는 제제도 모두 포함한다.
상기 항체란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미하고, 본 발명의 목적상 CD206을 특이적으로 인지하는 항체를 의미한다.
상기 항체는 다클론 항체, 단클론 항체, 재조합 항체 및 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 및 항체 분자의 기능적인 단편, 예를 들어, Fab, F(ab'), F(ab')2및 Fv를 모두 포함한다.
상기 CD206이 이미 규명되었으므로, 이를 이용하여 항체를 생산하는 것은 본 발명이 속하는 분야에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있고, 제조되어 상업적으로 판매되는 항체를 이용할 수 있다.
다클론 항체는 상기 CD206 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 방법에 의하여 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 또는 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다.
단클론 항체는 본 발명이 속하는 기술분야에서 공지된 융합방법(fusion method)(Kohler 및 Milstein (1976) European Journal of Immunology 6:511-519 참조), 재조합 DNA 방법 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352, 624-628, 1991: Marks et al, J. Mol. Biol., 222,581-597, 1991) 기술을 이용하여 제조할 수 있다.
상기 항체는 상업적으로 시판되는 것을 이용할 수 있고, 본 발명의 일 실시예에서, PE-CyTM 쥐 항-인간 CD206를 사용하였다.
상기 조성물은 CD206CD11b의 동시 발현을 측정할 수 있는 제제, CD206 CD14의 동시 발현을 측정할 수 있는 제제 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 더 포함할 수 있다. 상기 CD206CD11b의 동시 발현 및 CD206 CD14의 동시 발현은 바람직하게는 말초혈액 단핵세포의 표면에 CD206과 함께 CD11b 또는 CD14가 발현되는 것을 의미한다. 상기 동시 발현의 측정은 CD206의 발현 수준을 측정하는 제제와 함께 CD11b의 발현을 측정하는 제제 및/또는 CD14의 발현 수준을 측정하는 제제일 수 있다.
상기 조성물은 CD206의 발현 수준을 측정하는 제제뿐만 아니라, 항원-항체 복합체의 형성을 정량 또는 정성적으로 측정 가능하게 하는 라벨, 면역학적 분석에 사용되는 통상적인 도구, 시약 등을 더 포함할 수 있다.
항원-항체 복합체의 형성을 정성 또는 정량적으로 측정 가능하게 하는 라벨에는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 산화환원 분자 및 방사선 동위원소 등이 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제, 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-라타마제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 형광물에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 발광물에는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 산화환원 분자에는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K4 W(CN)8, [Os(bpy)3]2+, [RU(bpy)3]2+, [MO(CN)8]4- 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 방사선동위원소에는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I, 186Re 등이 있으며 이로 제한되지 않는다.
상기 도구 또는 시약의 일 예로, 적합한 담체, 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 표지물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 담체는 가용성 담체, 불용성 담체가 있고, 가용성 담체의 일 예로 당 분야에서 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS가 있고, 불용성 담체의 일 예로 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로오스 및 이들의 조합일 수 있다.
상기 조성물을 이용하는 경우 베체트병을 진단할 수 있고, 특히 활동성 베체트 병을 구분하여 진단할 수 있는 효과가 있다. 또한 상기 CD206을 진단에 이용하는 경우 베체트병이 안구 병변을 수반하는지 등의 병의 증상에 따라 진단 결과가 상이해지지 않으므로 신뢰적이고 안정적으로 병을 진단할 수 있고, 처방 약품의 종류에 상관없이 활동성 베체트병의 발병 여부를 진단할 수 있는 효과가 있다.
또한 본 발명의 다른 양태인 베체트병 진단용 키트는 마크로파지 만노오즈 수용체 1(Macrophage mannose receptor 1, CD206)의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함한다.
상기 CD206의 발현 수준을 측정하는 제제는 CD206의 단독 발현을 측정하는 것뿐만 아니라, CD206CD11b 또는 CD206CD14의 동시 발현을 측정할 수 있는 제제도 모두 포함한다.
상기 CD206CD11b의 동시 발현 및 CD206CD14의 동시 발현은 바람직하게는 말초혈액 단핵세포의 표면에 CD206과 함께 CD11b 또는 CD14가 발현되는 것을 의미한다. 상기 동시 발현의 측정은 CD206의 발현 수준을 측정하는 제제와 함께 CD11b의 발현을 측정하는 제제 및/또는 CD14의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하여 할 수 있다.
상기 키트에는 CD206의 발현 수준을 측정하는 제제뿐만 아니라, 면역학적 분석에 사용되는 당 분야에서 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등이 포함될 수 있다.
상기 도구 또는 시약의 일 예로, 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 발색단(chromophores), 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 표지물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 담체는 가용성 담체, 불용성 담체가 있고, 가용성 담체의 일 예로 당 분야에서 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS가 있고, 불용성 담체의 일 예로 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로오스 및 이들의 조합일 수 있다.
상기 키트를 이용하는 경우 베체트병을 진단할 수 있고, 특히 활동성 베체트 병을 구분하여 진단할 수 있는 효과가 있다. 또한 상기 CD206을 진단에 이용하는 경우 베체트병이 안구 병변을 수반하는지 등의 병의 증상에 따라 진단 결과가 상이해지지 않으므로 신뢰적이고 안정적으로 병을 진단할 수 있고, 처방 약품의 종류에 상관없이 활동성 베체트병의 발병 여부를 진단할 수 있는 효과가 있다.
또한, 본 발명은 또 다른 양태로, 분석할 시료를 제공하는 단계, 상기 시료에 마크로파지 만노오즈 수용체 1(Macrophage mannose receptor 1, CD206)에 특이적인 항체를 접촉시키는 단계, 및 상기 CD206의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 베체트병 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다
상기 정보 제공 방법은 CD206의 발현 수준 측정 전에 시료의 마크로파지 만노오즈 수용체 1을 염색하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 정보제공 방법은 CD206이 발현 수준을 측정한 것을 정상 개체의 발현 수준 측정값과 비교하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 분석할 시료는 베체트병 발병여부를 확인 하고자 하는 객체로부터 채취된 혈액 또는 상기 혈액으로부터 분리된 말초혈액 단핵세포(PBMC)일 수 있다.
상기 세포는 효과적인 분석을 위해서 당 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 고정(fix) 등을 수행하여 분석에 이용할 수 있다.
상기 마크로파지 만노오즈 수용체 1에 특이적인 항체를 사용하여 단백질 수준을 측정하는 방법은, 생물학적 시료와 접촉시켜 항원-항체 복합체를 형성하는 방법을 이용할 수 있다.
상기 단백질 수준을 측정하기 위한 구체적인 분석 방법으로 웨스턴 블롯, ELISA, 면역분석법, 면역확산법, 면역전기영동법, 면역염색법, 면역침전법, 보체고정 분석법, 세포자동분리장치(fluorescense activated cell sorter; FACS)를 이용한 유동계수법(Flow cytometry), 단백질 칩(protein chip) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 이용할 수 있다.
상기 단백질 수준을 측정하는 방법으로, 바람직하게는 분석을 위해 채취된 객체의 말초혈액 단핵세포를 항체를 이용하여 염색하고, 이를 유세포분석기(FACS)를 이용하여 유동계수법으로 측정하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 상기 유동계수법을 이용하여 활동성 베체트병 환자의 말초혈액 단핵세포의 표면에서 CD206의 발현 빈도가 정상개체 또는 비활동성 베체트병 환자와 비교해서 현저하게 높은 것을 측정하여 정보를 제공함으로써 베체트병의 발병 여부 및 병의 진행 상태까지 진단할 수 있음을 확인하였다. 또한 이에 의하는 경우 베체트병 환자가 나타내는 증상에 따라 진단 결과가 상이해지지 않고, 처방하는 약품에 의하여 진단결과가 상이해지지 않아 활동성 베체트병의 진단에 우수한 효과를 가진다.
본 발명에 따른 베체트병 진단용 조성물, 키트 및 이를 이용한 정보제공방법에 의하는 경우 베체트병의 증상 또는 처방 약물의 영향을 받지 않고 베체트병의 발병여부를 알 수 있고, 더불어 비활동성 베체트병과 활동성 베체트병을 구분하여 진단할 수 있다.
도 1은 PBMC의 표면에서 유전자의 발현 빈도를 나타내는 그래프로, A는 CD11+, B는 CD 14+, C는 CD 16+, D는 CD32+ 그리고 E는 CD 206+의 표면발현 빈도를 나타내고, 도 1의 가로축은 각 실험군으로 HC는 건강한 대조군(6명), Inactive는 비활동성 베체트병 환자군(8명) 그리고 Active는 활동성 베체트병 환자군(5명)을 의미하며, 그래프의 세로축은 발현 정도(%)를 나타낸다.
도 2는 PBMC의 표면에서 유전자의 발현 빈도를 나타내는 그래프로, A는 CD11b+CD14+, B는 CD11b+CD16+, C는 CD11b+CD32+의 표면발현 빈도를 나타내고, 도 2의 가로축은 각 실험군으로 HC는 건강한 대조군(6명), Inactive는 비활동성 베체트병 환자군(8명) 그리고 Active는 활동성 베체트병 환자군(5명)을 의미하며, 그래프의 세로축은 발현 정도(%)를 나타낸다.
도 3은 PBMC의 표면에서 유전자의 발현 빈도를 나타내는 그래프로, A는 CD14+CD16+, B는 CD14+CD32+의 표면발현 빈도를 나타내고, 도 3의 가로축은 각 실험군으로 HC는 건강한 대조군(6명), Inactive는 비활동성 베체트병 환자군(8명) 그리고 Active는 활동성 베체트병 환자군(5명)을 의미하며, 그래프의 세로축은 발현 정도(%)를 나타낸다.
도 4는 PBMC의 표면에서 유전자의 발현 빈도를 나타내는 그래프로, A는 CD11+CD206+, B는 CD14+CD206+의 표면발현 빈도를 나타내고, 도 4의 가로축은 각 실험군으로 HC는 건강한 대조군(6명), Inactive는 비활동성 베체트병 환자군(8명) 그리고 Active는 활동성 베체트병 환자군(5명)을 의미하며, 그래프의 세로축은 발현 정도(%)를 나타낸다.
도 5는 활동성에서 비활동성으로 개선된 환자의 PBMC의 표면에서 유전자의 발현 빈도를 나타내는 그래프이다.
도 6은 베체트병 환자군의 혈청 내 IL-10 함량을 나타낸 그래프로, 그래프의 가로축은 실험군으로 Active BD는 활동성 베체트병 환자군, Inactive BD는 비활동성 베체트병 환자군을 나타내고, 그래프의 세로축은 IL-10의 함량(pg/ml)을 나타낸다.
도 7은 PBMC의 전자투과현미경 사진을 나타내는 도이다. Active는 활동성 베체트병 환자, Inactive는 비활동성 베체트병 환자, Healthy는 건강한 대조군의 PBMC를 나타낸다.
이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다.
[준비예] 실험의 준비 및 분석방법
1. 실험군의 준비 및 특성 확인
서울 연세대학교 병원의 피부과에서 치료 중인 베체트병 환자 13명을 환자군으로 하였다. 대조군은 6명의 건강한 사람(여자 3명, 남자 3명, 평균연령 29.6±3.5살)으로 이루어지고, 비활동성 베체트병 환자군(이하 비활동군)은 8명(여자 6명, 남자 2명, 평균연령 48.4±15.0살)으로 구성하였고, 활동성 베체트병 환자군(활동군)은 5명(여자 4명, 남자 1명, 평균연령 30.0±8.6살)으로 구성하였다. 베체트병 진단을 위한 국제 연구 그룹에 따르면 생식기 궤양, 피부 병변(skin lesion), 관절 침범(joint involvement) 그리고 안구 병변(ocular lesions) 중에서 두 개의 증상이 재발성 구강궤양과 함께 있는 경우 베체트병으로 진단하는데, 실험에 참여한 활동성 베체트병 환자는 적어도 두 개 이상의 베체트병 증상을 나타내었고, 항염증 치료를 받은 비활동성 베체트병 환자는 상기 증상이 나타나지 않는 상태에서 잘 관리되었다. 8명의 비활동성 베체트병 환자 중에서 두 명은 활동성 베체트병 환자군으로부터 이동된 것이었다.
본 실험은 헬싱키 선언의 가이드라인에 따라서 본 연구가 행해지기 전에 참가자들로부터 서면동의를 받고 수행되었다.
상기 환자의 더욱 자세한 증상 및 약학적 병력은 하기 표 1 및 표 2에 나타내었다.
상태 구분 나이 성별 OU GU SL GI JI NEUR VAS OL Pathergy HLA-B51 ESR CRP
활
동
군		 A 28 M + + + - - - - - - - 13 <0.01
B 31 F + - - - - - - + - + 65 <0.01
C 29 F + + + - + - - - - - 41 2.4
D 19 F + + + - + - - - - - 20 <0.01
E 43 f + + + - - - - - - + 50 2.33
비
활
동
군		 A 28 M -- -- -- -- -- -- -- -- -- - 2 <1.00
B 31 F -- -- -- -- -- -- -- -- -- + 10 <1.00
F 59 F -- -- -- -- -- -- -- -- -- - 10 <1.00
G 64 F -- -- -- -- -- -- -- -- -- + 17 <1.00
H 53 F -- -- -- -- -- -- -- -- -- - 19 <1.00
I 45 M -- -- -- -- -- -- -- -- -- - 14 <1.00
J 39 F -- -- -- -- -- -- -- -- -- - 18 1.54
K 68 F -- -- -- -- -- -- -- -- -- - 2 <1.00
상기 표 1에 있어서, M은 남자, F은 여자, OU는 구강 궤양(oral ulcers), GU는 생식기 궤양(genital ulcers), SL은 피부 병변(skin lesions), GI는 위장염증(gastrointestinal inflammation), JI는 관절 침범(joint involvement), NEUR은 신경 침범(neurological involvement), VAS는 혈관염(vasculitis) 그리고 OL은 안구 병변(ocular lesions)을 의미한다.
상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 모두 5명의 활동성 베체트병 환자는 병이 진행되는 동안 생식기 궤양(genital ulcers)을 수반한 구강 궤양(ulcer)과 피부 병변으로 이루어진 심각한 징후를 나타내었다. 한 명의 환자(환자 b)는 생식기 궤양과 피부 병변을 보이지 않았으나, 안구 병변을 나타내었다. 또한, 환자 C와 환자 D는 관절 침범(joint involvement) 증상을 나냈었다. 그러나 위장 간염(gastrointestinal infection), 신경 침범(neurological involvement) 및 혈관염(vasculitis)은 연구 기간 동안 관찰되지 않았다.
실험실 조사(laboratory test)로는 피부이상과민반응 검사(pathergy test), 유전자 검사(HLA-B51 검출), 적혈구 침강 속도(erythrocyte sedimentation rate, ESR) 그리고 C-반응성 단백질 시험(C-reactive protein, CRP)을 실시하였다.
활동성 베체트병 환자는 비활동성 베체트병 환자보다 ESR 수치가 현저하게 증가하는 급성기(acute-phase) 반응을 나타내었고(37.8±21.39 mm/h 및 11.5±6.76 mm/h, p=0.007; 각각), 또한 활동성 베체트병 환자군의 혈청의 CRP 수치는 <0.01 mg/dL 에서 2.4 mg/dL까지 다양하였고, 비활동성 베체트병 환자군에서는 <1.0 mg/dL 에서 1.54 mg/dL까지 다양하였다.
유전적 요인인 유전자 HLA-B51는 활동성 및 비활동성 베체트병 환자군 모두에서 양성으로 검출되었다. 마지막으로 피부이상과민반응 검사가 수행되었고, 활동성 및 비활동성 베체트병 환자 중에서 아무도 양성결과를 나타내지 않았다(표 1). 따라서, 상기 페설지반응 또는 유전자검사를 통해서는 활동성 환자와 비활동성 환자를 구분하여 진단할 수 없음을 다시 한번 확인하였다.
혈액 샘플링 후에, 활동성 베체트병 환자(환자 a와 환자b)는 약물 처치를 시작하였다. 하기 표 2에 나타낸 바와 같이, 환자 A는 콜히친(colchicine), 프레드니솔론(prednisolone) 및 아자치오프린(azathioprine)으로; 환자 B는 콜히친, 프레드니솔론, 아자치오프린 및 사이클로스포린으로; 환자 F, G 및 K는 콜히친으로; 환자 H 및 J는 콜히친 및 아스피린(aspirin)으로 그리고 환자 I는 프레디솔론으로 약학적 처치를 하였다.
상태 구분 콜히친 프레드니솔론 아자치오프린 아스피린 사이클로스포린
비
활
동
군		 A* + + + - -
B* + + + - +
F + - - - -
G + - - - -
H + - - + -
I - + - - -
J + - - + -
K + - - - -
상기 표 2의 환자 A*와 환자 B*는 활동성 베체트병 환자군에서 개선된 환자 A 및 환자 B이다.
2. 세포의 준비
상기 대조군, 활동군 및 비활동군 각각으로부터 전혈을 채취하고, 분석을 위해 세포를 분리하여 준비하였다. 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)는 ACK 용해 완충액(lysing buffer)을 이용하여, 헤파린 처리된 정맥 혈액으로부터 분리하였다. 상기 분리된 세포를 인산 완충 식염수(phosphate buffered saline, PBS)로 두 번 세척하였고, PBS에 재현탁(resuspend) 하였다. 세포 현탁액은 최종적으로 농도를 1×106 cells/ml로 조정하였고, 세포 염색 단계를 더 거쳤다.
3. 분석의 실시
3.1. 유동계수법(Flow cytometry)
상기에서 분리된 PBMC는 항-인간 항체를 이용하여 30분 동안 4℃의 암(dark) 조건에서 표면-염색하였다.
상기 항-인간 항체는 각각의 유전자에 대하여 항-인간 CD11b FITC(Clone: ICRF44, eBiosciences, USA), 항-인간 CD14 PE-Cyanine 7(Clone: 61D3, eBiosciences, USA), 항-인간 CD16PE(Clone: eBioCB16, eBiosciences, USA), 항-인간 CD32 APC(Clone: 6C4, eBiosciences, USA) 그리고 PE-CyTM5 쥐 항-인간 CD206(Clone: 19.2, BD Biosciences Pharmingen, USA)을 이용하였고, 표면-염색에는 CD11b는 플루오레세인 이소시오시아네이트(fluorescein isothiocynate), CD14는 피코에리트린(phycoerythrin), CD16은 피코에리트린(Phycoerythrin), CD32는 알로피코시아닌(Allophycocyanin) 그리고 CD206은 페리디닌 플로로필 단백질(Peridinin Chlorophyll Protein)을 사용하였다. 아형 대조 항체(Isotype control antibody)는 목적 1차 항체의 비-특이적 결합을 확인하는데 사용하였다. 유세포분석기인 FACS Canto II(Becton Dickinson, USA)를 이용하여 염색된 세포를 유동계수법에 의하여 분석하였다.
3.2. 효소 결합 면역 흡착법(Enzyme-linked immunosorbant assay, ELISA)
환자군과 건강한 대조군으로부터 채취한 혈청을 상업적으로 판매되는 IL-10 검출용 ELISA 키트를 이용하여 분석하였다. Bio-Rad 170-6850 마이크로플레이트 리더(Bio-Rad, USA)를 이용하여 450nm의 파장에서 각 샘플의 ELISA 값을 측정하였다. 평균과 표준편차는 각각의 웰(well)에 대하여 결정된 ELISA 값을 이용하여 계산하였다.
3.3 투과 전자 현미경(Transmission electron microscopy, TEM)
건강한 대조군, 비활동성 베체트병 환자군 및 활동성 베체트병 환자군의 전혈로부터 PBMC를 분리하였고, 그 형태적 변화를 EM902A 투과 전자 현미경(Zeiss, Germany)을 이용하여 관찰하였다.
상기 TEM으로 세포를 관찰하기 위하여, 상기 분리된 세포를 카노브스키(Karnovsky＇s) 고정액(2% 파라포름알데하이드, 2% 글루타르알데히드, 카코딜염산 완충액의 0.5% 염화칼슘, pH 7.2)에 30분 동안 고정하였고, 카코딜염산 완충액(cacodylate buffer)으로 세척한 후, 에탄올 농도별 용액(20% 내지 100%) 에서 탈수하였으며, 포매제(Epon mixture)에 담근 후 60℃ 항온기에서 중합한 다음, Reichert Jung Ultracut S(Leica, Austria)를 이용하여 초박 절편(ultrathin section)으로 절단하였고, 아세트산우라닐(uranyl acetate)과 시트르산 납(lead citrate)으로 염색하였으며, 이를 TEM을 이용하여 관찰하였다.
3.4. 통계 분석
통계분석은 SPSS 11.0 소프트웨어(SPSS, USA)를 이용하여 수행되었고, 크루스컬-왈리스 검정(Kruskal-Wallis Test)과 본페로니 보정(Bonferroni correction)에 의하여 수행되었다. 통계적으로 유의한 p value는 0.05 이하 일 경우 유의성을 가짐을 의미한다.
[시험예] 활동성 베체트병 환자 검출용 마커를 위한 발현 특성 확인
1. PBMC에서 표면발현 특성 확인
활동성 베체트병과 비활동성 베체트병 환자 사이에 다르게 발현되는 세포 표면 마커를 확인하기 위해서, 건강한 대조군, 활동성 베체트병 환자군 및 비활동성 베체트병 환자군 각각에서 PBMC를 분리하고, 항체로 표지한 후, 유동계수법에 따라 분석하여, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1A에 나타낸 바와 같이, CD11b+ 단핵구 마커는 대조군(HC) 97.5±1.3%와 비교해서 활동성 베체트병 환자군(Active)은 91.5±10.9%, 비활동성 베체트병 환자군(Inactive)은 88.8±12.2%를 나타냄을 확인하였다. 따라서 CD11b+ 는 환자군과 대조군 사이의 발현 차이가 많지 않고, 활동군과 비활동군의 차이도 크지 않아서 활동성 베체트병을 진단하는 마커로 부적합하다고 판단하였다.
도 1B에 나타낸 바와 같이, 단핵구 마커 CD14+는 대조군(HC) 11.1±3.7%와 비교하여, 활동성 베체트병 환자군은 28.9±18.7%(p=0.05), 비활동성 베체트병 환자군은 30.8±21.4%(p=0.08)의 발현을 나타내었다.
도 1C에 나타낸 바와 같이, CD16+는 비활동 베체트병 환자군에서 93.9±2.4%, 활동성 베체트병 환자군에서 85.3±14.0% 발현되었다.
도 1D에 나타낸 바와 같이, CD32+(FcγII)는 활동성 베체트병 환자군 26.6±18.1%와 비교하여, 비활동성 베체트병 환자군은 46.6±30.3%(p=0.04), 건강한 대조군(HC)은 71.7±17.4%(p=0.002)의 발현을 나타내었다.
도 1E에 나타낸 바와 같이, CD206+(만노오즈 수용체 마커)는 활동성 베체트병 환자군 49.7±35.2%와 비교하여, 건강한 대조군이 7.4±0.8%(p=0.02), 비활동성 베체트병 환자군이 4.7±3.1%(p=0.007) 발현을 나타내었다. 따라서 베체트병이 발병되지 않은 사람과 비활동기의 베체트병 발명 환자와 달리 활동기의 베체트병 환자의 PBMC의 표면에서 CD206+의 발현이 현저하게 높은 것을 확인하였다.
2. CD11b + 서브세트의 발현 특성
CD11b+이 CD14+, CD16+ 또는 CD32+와 동시 발현(co-express)되는 마커의 빈도를 결정하기 위해서, 건강한 대조군, 활동성 및 비활동성 베체트형 환자로부터 채취한 PBMC에서 CD11b+CD14+, CD11b+CD16+ 및 CD11b+CD32+가 발현된 세포 빈도를 상기 3.1의 유동계수법에 따라서 분석하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2A에 나타낸 바와 같이, CD11b+CD14+ 세포의 빈도는 건강한 대조군(HC)은 11.0±3.7%의 빈도를 나타낸 것과 비교하여, 비활동군에서 27.7±4.1%( p=0.03), 활동성 베체트병 환자군에서 25.9±16.3%(p=0.06)의 발현 빈도를 나타내었다. 상기 결과에 따라 베체트병 환자군이 대조군과 비교해서 CD11b+CD14+ 세포의 발생이 많은 것을 확인하였다.
도 2B에 나타낸 바와 같이, CD11b+CD16+ 세포의 빈도 건강한 대조군(HC)은 85.5±4.7%의 빈도를 나타낸 것과 비교하여, 비활동군은 85.7±9.4%, 활동성 베체트병 환자군은 82.2±15.9%의 빈도를 나타내었다. 상기 결과에 따라서 CD11b+CD16+ 세포의 빈도는 처리군 사이에 현저한 차이가 없는 것을 확인하였다.
도 2C에 나타낸 바와 같이, CD11b+CD32+ 세포의 빈도는 건강한 대조군에서 70.6±18.2%인 것과 비교하면, 활동성 베체트병 환자군에서 24.8±18.0%(p=0.002)이고, 비활동성 베체트병 환자군에서 47.8±27.8%(p=0.04)의 빈도를 나타내었다. 상기 결과를 통해서 CD11b+CD32+의 발현이 베체트병 환자군에서 현저하게 낮아지는 것을 확인하였고, 활동성 베체트병 환자의 경우가 비활동성 베체트병 환자보다 발현이 더 낮은 것을 확인하였다.
3. CD14 + CD16 + 서브세트의 발현 특성
도 1B에 나타낸 바와 같이, CD14+ 세포는 활동성 및 비활동성 환자군 모두에서 건강한 대조군과 비교하여 빈도가 증가되었다. 이와 관련하여, 이중 양성(double positive) 세포의 발현도 증가되는지를 확인하기 위해서 CD14b+CD16+ 및 CD14b+CD32+가 발현된 세포 빈도를 상기 3.1의 유동계수법에 따라서 분석하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3A에 나타낸 바와 같이, CD14+CD16+ 세포는 또한 건강한 대조군이1.7±0.6%의 빈도를 나타내는 것과 비교하여, 비활동성 환자군 36.1±22.4%(p=0.008)와 활동성 환자군 22.9±17.6%(p=0.02)의 빈도를 나타내는 것을 확인하였다.
또한 도 3B에 나타낸 바와 같이, CD14+CD32+ 세포는 비활동성 베체트병 환자군이 18.0±3.3%, 활동성 베체트병 환자군은 10.4±4.4% 그리고 건강한 대조군이 7.9±1.3%의 빈도를 나타내었다.
4. 만노오즈 수용체 CD206 + 발현의 증가 확인
단핵구/대식세포 서브세트와 관련된 만노오즈 수용체의 발현을 확인하기 위하여, 대조군, 활동성 및 비활동성 베체트병 환자군에서 CD11b+CD206+와 CD14+CD206+ 세포의 빈도를 상기 3.1의 유동계수법에 따라서 분석하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4A에 나타낸 바와 같이, CD11b+CD206+ 세포의 경우 대조군에서 7.4±0.9%의 발현을 나타냈었지만, 활동성 베체트병 환자군에서 49.4±35.6%(p=0.05) 를 나타냈고, 비활동성 베체트병 환자군에서는 4.4±3.1%(p=0.007)의 발현을 나타내었다. 따라서 활동성 베체트병 환자군의 경우 CD11b+CD206+ 의 발현이 다른 실험군보다 현저히 높음을 확인하였다.
도 4B에 나타낸 바와 같이, CD14+CD206+ 세포의 경우 대조군에서 5.6±1.4%의 발현을 나타낸 것과 비교해서, 활동성 베체트병 환자군에서 14.6±9.6%의 발현을 나타내었고, 비활동 베체트병 환자군에서는 4.4±2.9% (p=0.02)의 발현을 나타내었다. 따라서 활동성 베체트병 환자군의 경우 CD11b+CD206+ 의 발현이 다른 실험군보다 현저히 높음을 확인하였다.
따라서 CD206+이 단일 발현 시와 다른 표면 분자와 동시 발현 시, 모두 활동성 베체트병 환자군에서만 현저하게 발현이 높았으므로, 활동성 베체트병의 진단용 마커로 이용될 수 있음을 확인하였다.
5. 활동성에서 비활동성으로 개선된 환자의 발현 변화 확인
5명의 활동성 베체트병 환자 중에서, 환자 A 및 환자 B에 대하여 상기 준비예1과 같은 방법으로 약물처방을 하였다(표 2). 환자 A 및 환자 B의 병적 징후가 활동성에서 비활동성 상태로 전환할 때, PBMC의 표면의 유전자의 발현 빈도를 유동 계수법으로 분석하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5A에 나타낸 바와 같이, CD14+ 세포의 빈도는 환자 A의 경우 29.8%(활동기)에서 53.0%(비활동기)로 증가하였고, 환자 B의 경우도 7.8%(활동기)에서 44.4%(비활동기)로 증가하여, 활동기와 비교해서 비활동기에 CD14+ 세포의 발현이 증가되었고, 이는 도 1B와 같은 경향을 나타냄을 확인하였다. CD11b+ 세포의 빈도는 환자 A의 경우 96.7%(활동기)에서 96.4%(비활동기)로, 환자 B의 경우 90.2%(활동기)에서 81.9%(비활동기)로 약간 감소하는 경향을 나타내었다. CD14+CD11b+ 세포의 빈도는 활동기(환자 A 25.9%, 환자 B 7.4%)와 비교하여, 비활동기에 환자 A가 37.7%, 환자 B가 42.4%로 증가하였다(도 5A). CD16+ 세포의 빈도는 활동기(환자 A 90.9%, 환자 B 93.4%)에서 비활동기에 환자 A가 95.8%, 환자 B가 97.6%로 약간 증가하였다. CD16+CD11b+ 세포의 빈도는 환자 A에서는 활동기에 86.6%에서 비활동기에 78.7%로 낮아졌으나, 환자B의 경우 활동기에 93.0%에서 비활동기에 94.6%로 거의 변화가 없었다(도 5A). 또한 이중 양성 CD16+CD14+ 세포는 활동기에 환자 A 25.5%, 환자 B 3.8%에서 비활동기에 환자 A 53.1%, 환자 B 43.3%로 발현 빈도가 상향되었다(도 5A).
도 5B에 나타낸 바와 같이, 환자 A에서 단일 CD32+ 세포의 빈도는 활동기에 34.0%에서 비활동기에 9.6%로 감소되었지만, 환자 B에서는 활동기에 54.8%에서 비활동기에 85.8%로 증가하였다. 이중 양성 CD32+CD11b+ 세포의 빈도는 환자 A에서 활동기에 29.9%에서 비활동기에 9.2%로 감소하였지만, 환자 B에서는 활동기에 53.7%에서 비활동기에 84.7%로 증가하였다. CD32+CD14+ 세포의 빈도는 환자 A에서 활동기에 17.8% 였다가 비활동기에 9.6%로 감소하였지만, 환자 B에서는 활동기에 6.0% 였다가 비활동기에 38.1%로 증가하였다. 따라서 CD32+, CD32+CD11b+ 및 CD32+CD14+ 세포의 빈도는 환자 A와 환자 B 사이에서 반대되는 결과를 보였다.
도 5C에 나타낸 바와 같이, CD206+ 세포의 빈도는 환자 A와 환자 B 모두에서 비활동기와 비교해서 활동기에 높게 나타났다. 비활동기에 환자 A는 6.0%, 환자 B는 2.5%의 발현을 나타내었으나, 활동기에는 환자 A가 67%, 환자 B가 68.1% 였다. 또한, CD206+CD11b+ 및 CD206+CD14+ 세포의 빈도는 활동기에 각각 환자 A가 65.8% 및 28.4%, 환자 B가 67.9% 및 7.3% 였으나, 비활동기에 환자 A는 각각 5.9% 및 5.9%, 환자 B는 각각 2.4% 및 2.5%를 나타내어 비활동기에 발현 빈도가 현저하게 감소되는 것을 확인하였다.
상기 결과를 종합하여 보면, CD32+ 세포의 빈도 또는 CD32+ 를 포함하는 이중 양성세포의 경우 동일 실험군 사이에서 일관되지 않은 결과를 나타내므로 베체트병의 진단용 마커로 이용할 수 없으나, CD206+ 발현 세포의 빈도는 활동성 환자에 처방하는 약물의 영향을 받지 않고 활동기에 높게 나타나는바, 활동성 베체트병의 진단에 유용한 마커로 활용할 수 있음을 확인하였다.
6. 베체트 병의 개선 이후에, 항-염증성 사이토카인 IL-10의 변화
베체트병 환자 A 및 환자 B로부터 베체트병 활동기와 비활동기 각각의 상태에서 채취한 혈청을 이용하여 항-염증성 사이토카인 IL-10 수치를 상기 준비예에 기재한 바와 같이 ELISA에 의하여 측정하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 환자 B에서 IL-10 수치는 활동기에는 5.41 pg/ml 였으나, 비활동기에 33.25 pg/ml 로 현저하게 증가하였고, 환자 A에서 IL-10 수치는 활동기에 3.36 pg/ml 였으나, 비활동기에는 11.39 pg/ml 로 약간 증가하였다.
7. 다형핵 호중구의 형태 확인
베체트병 환자의 단계에 따른 세포 내 변화를 관찰하기 위해서, 건강한 대조군, 활동성 베체트병 환자군, 비활동성 베체트병 환자군 각각의 전혈로부터 PBMC를 분리해내고, 상기 세포를 TEM을 이용하여 관찰하였고, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 건강한 대조군과 비활동기의 환자군의 PBMC는 구조적으로 일반적인 외향을 나타내었으나, 활동기 베체트병 환자군의 PBMC에서는 중성 호중구의 세포질에서 거대한 아쥬르 과립 집합형태가 관찰되었다.

Claims (7)

  1. 마크로파지 만노오즈 수용체 1(Macrophage mannose receptor 1, CD206)의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 베체트병 진단용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제제는 CD206에 특이적 항체인 것인, 베체트병 진단용 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 항체는 다클론 항체, 단클론 항체, 재조합 항체 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 베체트병 진단용 조성물.
  4. 마크로파지 만노오즈 수용체 1(Macrophage mannose receptor 1, CD206)의발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 베체트병 진단용 키트.
  5. 분석할 시료를 제공하는 단계,
    상기 시료에 마크로파지 만노오즈 수용체 1(Macrophage mannose receptor 1, CD206)에 특이적인 항체를 접촉시키는 단계, 및
    상기 CD206의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 베체트병 진단을 위한 정보 제공 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 CD206의 발현 수준은 웨스턴 블롯, ELISA, 면역분석법, 면역확산법, 면역전기영동법, 면역염색법, 면역침전법, 보체고정 분석법, 유동계수법(Flow cytometry), 단백질 칩(protein chip) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 이용하여 측정하는 것인, 베체트병 진단을 위한 정보 제공 방법.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 분석할 시료는 검체의 전혈로부터 분리된 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)를 포함하는 것인, 베체트병 진단을 위한 정보 제공 방법.
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