CN103330948B - 一种稀土金属纳米簇的肿瘤靶向活体快速荧光成像方法 - Google Patents

一种稀土金属纳米簇的肿瘤靶向活体快速荧光成像方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种稀土金属纳米簇的肿瘤靶向活体快速荧光成像方法。本发明将一定浓度的稀土金属盐溶液与不同种类肿瘤细胞在生理条件下孵育原位合成稀土金属纳米簇，实现了对肿瘤细胞的实时、高分辨的荧光成像。本发明的稀土金属纳米簇在移植肿瘤裸鼠模型上实现了快速、实时原位活体肿瘤靶向荧光成像。本发明的稀土金属纳米簇通过肿瘤细胞直接生物合成，具有很好的生物相容性；实现原位活体荧光成像方法的快速精准定位与肿瘤靶向成像分析，具有广阔的医学应用前景。

Description

一种稀土金属纳米簇的肿瘤靶向活体快速荧光成像方法
技术领域
本发明涉及一种靶向肿瘤纳米探针的制备方法，在生命体病灶原位生长出具有肿瘤靶向性分子成像的稀土金属纳米簇的纳米生物探针，该功能纳米探针能够在肿瘤部位靶向和快速的荧光成像。
背景技术
癌症，又称恶性肿瘤，已经成为二十一世纪影响人类身体健康及生命的最大杀手。临床医疗工作中，恶性肿瘤的发现主要依赖于影像学、病理学及常规肿瘤标志等检查技术，这些传统的诊断方法虽在临床上应用多年，但缺乏足够的敏感度和特异度，更重要的是难以早期发现肿瘤。若能早期发现癌变位点并及时对其进行靶向治疗是癌症最有效的治疗方法之一。随着肿瘤生物学和肿瘤医学取得很大的发展，肿瘤生物标志物的发现，放疗和化疗的发展等，但是癌症存活率多年来一直没有显著的提高。为了提高肿瘤患者的存活率和生活质量，研究更先进的诊断方法及制剂，来实现准确、及时的癌症早期诊断及治疗一直是人们努力的方向之一。
随着生物医学研究的不断深入，可视化的生物成像技术在生命科学和医学领域扮演着越来越重要的角色，相比于其它生物成像技术而言，荧光成像具有价格低廉、成像快速的特点，并具有分子水平的敏感性单分子成像，并能对肿瘤的生长进行标记和示踪。此外，荧光成像技术可以对各种癌症模型的肿瘤生长情况进行测量，实时监测癌症治疗中癌细胞的变化；定量的对小鼠整体原位瘤、转移瘤及自发瘤进行无创伤地的检测。如RobertMH通过体内荧光蛋白标记肿瘤细胞和高分辨率的小动物荧光显像系统则有可能观察到肿瘤的转移过程。但是目前使用荧光染料和量子点作为荧光探针具有一些明显的缺点，如较低的光穿透深度可能的生物组织破坏，以及生物样品的自发荧光等性限制了它在生物成像领域的进一步应用。
近年来，伴随着纳米科学和技术的发展，用于癌症早期诊断成像和治疗的纳米材料的开发也得到了人们的广泛关注。纳米材料由于其颗粒比癌细胞小，更容易通过细胞屏障，并且由于肿瘤组织微血管通透性亢进和不健全的淋巴引流系统产生的高通透高滞留效应，使得其优先在肿瘤部位聚集。因此，纳米材料能提供癌症病人的高灵敏和特异性成像信息，还能运输抗癌药物到达肿瘤的位置。当前，我们在以下几个方面的认识仍然是有限的：一是适合用来成像的生物标志物；二是成像靶标和反差增强材料的选择；三是用来是成像探针生物化的化学方法。我们在发展癌症特异性成像试剂上同样遇到很多困难，包括：靶向组织或肿瘤的探针的运输不佳；生物毒性大；探针的稳定性不佳；体内信号增强强度低等。本发明更好的解决了这些问题。
发明内容
本发明的技术方案提供了一种原位生长并且集在体或离体肿瘤靶向、荧光成像的生物相容性好的稀土金属纳米簇的纳米生物探针以及提出了一种能够用于活体的肿瘤靶向的荧光成像的新方法，以便实现肿瘤早期诊断和治疗过程的适时监控。
为了实现上述目的，针对目前现有技术的缺陷，本发明提供了一种稀土金属纳米簇的肿瘤靶向活体快速成像方法为：将稀土金属盐溶液与不同种类肿瘤细胞在生理条件下孵育，利用肿瘤细胞的特异性原位合成稀土金属纳米簇，实现了对肿瘤细胞的实时、高分辨的荧光成像。
具体措施如下：
首先在细胞水平进行研究，其具体步骤是：
1)将浓度为0.0001mmol/L～1mmol/L的稀土金属盐溶液与肿瘤细胞在细胞培养箱中孵育8～24小时后，得到原位生物合成的稀土金属纳米簇。
2)用荧光光谱仪、共聚焦荧光显微镜等对稀土金属纳米簇在细胞中的分布情况进行表征。通过荧光成像的荧光分布情况和其荧光强度对稀土金属纳米簇组分进行定性或定量分析。
该成像用于在体肿瘤成像时，将稀土金属盐溶液注射到肿瘤组织周围或肿瘤组织中，利用肿瘤细胞中特异性生成的大量的稀土金属纳米簇，使用活体荧光成像仪对肿瘤部位进行快速荧光成像。
然后在动物活体模型层面进行研究，其具体步骤是：
1)构建裸鼠肿瘤模型；
2)将0.1～0.5mL无菌的浓度为0.1～100mmol/L的稀土金属盐溶液，注射到裸鼠肿瘤模型上，经过4～24小时的孵育在裸鼠肿瘤模型上实现快速原位、实时肿瘤靶向高分辨荧光成像；所述步骤2)中的注射方法为尾静脉注射或局部注射；
3)用活体荧光成像仪对肿瘤部位进行肿瘤荧光成像并对其进行定性及定量分析。
本发明与现有技术方法相比，具有以下优点和效果：
本研究采用生命体内原位生长稀土金属纳米簇等纳米生物探针的方法，这种方法能有效避免传统纳米材料合成过程中引入的化学试剂以及纳米材料稳定剂对有机体造成的生物毒性，同时避免了传统纳米材料易被网状内皮系统捕获后被清除从而不能到达病灶组织的缺点，以便实现活体肿瘤靶向性荧光成像。
该功能性纳米探针实现了肿瘤靶向和荧光成像，并且在试剂注入活体中后4小时，即可通过荧光成像仪对肿瘤部位进行荧光成像，实现了对肿瘤的快速荧光检测。这种原位活体快速成像方法可望应用于肿瘤临床诊断的多功能适时成像以便实现肿瘤早期诊断以及肿瘤治疗过程中的适时跟踪。
该发明可实现无损伤、原位、实时动态肿瘤靶向治疗，进一步结合荧光、拉曼、超声、CT和核磁等，可进行多形态与多模态的同步诊断及准确靶向定位与治疗，具有广阔的医学应用前景。
具体实施方式
所述的离体肿瘤细胞成像的方法为：将稀土金属盐溶液与肿瘤细胞共育，利用肿瘤细胞中特异性生成的大量的稀土金属纳米簇，通过荧光成像的荧光分布情况和其荧光强度对稀土金属纳米簇组分进行定性或定量分析。
所述的在体活体肿瘤成像的方法为：将稀土金属盐溶液注射到肿瘤组织周围或肿瘤组织中，利用肿瘤细胞中特异性生成的大量的稀土金属纳米簇，采用活体荧光成像仪对肿瘤部位进行肿瘤荧光成像并对其进行定性及定量分析。
本发明采用以下技术措施：
首先在细胞水平进行离体肿瘤细胞成像研究，其具体步骤是：
1)将浓度为0.0001mmol/L～1mmol/L的稀土金属盐溶液与肿瘤细胞在细胞培养箱中孵育8～24小时后，得到原位生物合成的稀土金属纳米簇。
2)用荧光光谱仪、共聚焦荧光显微镜等对稀土金属纳米簇在细胞中的分布情况进行表征。用荧光显微镜来探究肿瘤细胞内原位生长的稀土金属纳米簇用于肿瘤的活细胞的肿瘤靶向的荧光成像；通过荧光成像的荧光分布情况和其荧光强度来对细胞结构或化学组分进行定性或定量分析。
所述稀土金属盐溶液是硝酸铕、硫酸铕、氯化铕、氟化铕、碳酸铕、醋酸铕等铕的配合物或者盐中的一种。
所述肿瘤细胞为肝癌、肺癌、宫颈癌、白血病、骨肉瘤等肿瘤细胞株。
离体肿瘤细胞成像的方法证实稀土金属盐溶液可与肿瘤细胞原位生物合成稀土金属纳米簇，在此基础之上，将稀土金属盐溶液注入活体肿瘤细胞组织周围或肿瘤组织中实现在体活体肿瘤成像。
在动物活体模型层面进行研究，其具体步骤是：
1)构建裸鼠肿瘤模型；
2)将0.1～0.5mL无菌的浓度为0.1～100mmol/L的稀土金属盐溶液，注射到裸鼠肿瘤模型上，经过4～24小时的孵育在裸鼠肿瘤模型上实现快速原位、实时肿瘤靶向高分辨荧光成像；
3)利用过程2)中所生成的稀土金属纳米簇，使用荧光成像技术对肿瘤部位进行荧光成像，根据荧光的强度及分布情况从而对肿瘤部位的生物化学组分的分布以及数量进行定性和定量分析，以实现肿瘤的早期诊断以及肿瘤治疗过程适时监控。所述步骤2)中的注射方法为尾静脉注射或局部注射。
实例1基于肿瘤细胞内原位生物合成稀土金属纳米簇的成像方法
1.以HepG2细胞为研究对象，将无菌的为0.0001mmol/L～1mmol/L的稀土金属盐溶液与处于对数生长期的HepG2细胞共孵育8～24小时(37℃，5％CO2，RH95％)，即可得到细胞体内原位生物合成的稀土金属纳米簇。
2.用共聚焦荧光显微镜等对稀土金属化合物纳米簇进行定性和定量分析；
选用肝癌细胞(HepG2)作为研究对象，实验组将处于对数生长期的肝癌细胞(HepG2)按照1.6×105个细胞/孔的密度接种于6孔板中，培养24h后加入已灭菌并用新鲜无菌的DMEM培养基进行稀释的含有浓度为0.0001mmol/L～1mmol/L的稀土金属盐溶液。
对照组将培养基中的肝癌细胞(HepG2)按照1.6×105个细胞/孔的密度接种于6孔板中，培养24h。培养时间终止后向实验组和对照组的每孔加入磷酸缓冲溶液(PBS,pH＝7.2)冲洗2-3次。将其置于激光聚焦荧光显微镜下，采用波长为488nm蓝光进行激发即可采集到细胞的绿色荧光图像，通过荧光断层扫描技术可以清晰的观察到这种稀土金属纳米簇主要集中在细胞上。
实例2基于活体病灶原位生长稀土金属纳米簇的肿瘤靶向快速成像方法
首先在已经植入肝癌肿瘤模型裸鼠的肿瘤附近局部皮下注射0.1～0.5mL无菌的浓度为0.1～100mmol/L的稀土金属盐溶液，注入后分别选取4小时、8小时、12小时、24小时、48小时等不同时间点进行孵育，然后将该实验裸鼠用5％异氟烷进行气体麻醉，然后将其置于小动物活体成像仪操作平台上，选择蓝光激发即可采集到肿瘤区域的图像。

Claims (1)

1.  一种稀土金属纳米簇的离体肿瘤靶向活体快速荧光成像方法，其特征在于，该成像方法将稀土金属盐溶液与不同种类肿瘤细胞在生理条件下孵育，利用肿瘤细胞的特异性原位合成稀土金属纳米簇，实现了对肿瘤细胞的实时、高分辨的荧光成像，具体措施如下：在细胞水平进行研究，其具体步骤是：1）将浓度为0.0001mmol/L~1 mmol/L的稀土金属盐溶液与肿瘤细胞在细胞培养箱中孵育8~24小时后，得到原位生物合成的稀土金属纳米簇；2）用荧光光谱仪和共聚焦荧光显微镜对稀土金属纳米簇在细胞中的分布情况进行表征，通过荧光成像的荧光分布情况和其荧光强度对稀土金属纳米簇组分进行定性或定量分析；其中所述稀土金属盐溶液是硝酸铕、硫酸铕、氯化铕、氟化铕、碳酸铕、醋酸铕的配合物或者盐中的一种；所述肿瘤细胞为选自肝癌、肺癌、宫颈癌、白血病、骨肉瘤的肿瘤细胞株。
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