CN109047791B - 金纳米颗粒及其合成方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及材料领域，具体而言，涉及一种金纳米颗粒及其合成方法。癌细胞培养基于合成金纳米颗粒中的应用。采用癌细胞培养基能合成金纳米颗粒。癌细胞培养废弃的培养基中生产出金纳米颗粒，而不使用任何其他化学试剂，这种金纳米颗粒具有高度的生物相容性。通过上述金纳米颗粒合成方法制得的金纳米颗粒与健康的体细胞具有相同的生物相容性，并且对乳腺癌细胞具有更高的抗癌活性。同时在癌细胞的生物成像中也具有良好的荧光特性。

Description

金纳米颗粒及其合成方法
技术领域
本发明涉及材料领域，具体而言，涉及一种金纳米颗粒及其合成方法。
背景技术
纳米材料的生物医学应用与日俱增，因其制备过程中有害化学物质的使用，广泛的应用给健康带来了严重的威胁。在这些纳米材料中，金纳米颗粒可用于纳米药物递送、光学诊断和治疗、CT和荧光生物成像等。现今金纳米颗粒的主要合成途径仍为化学合成；在这些方法中，最常用的是柠檬酸盐法，即利用柠檬酸或其衍生物来使1mM的HAuCl4溶液矿物化，从而形成15～45nm的纳米级材料。该反应在标准的化学实验室和所需仪器存在的条件下需要1小时，将盐溶液加热至100℃后加入柠檬酸或其衍生物，根据颜色变化，反应液由微黄色转为红色即形成了金纳米颗粒。制备过程复杂，且其中需要实用多种化学试剂。
发明内容
本发明的目的在于提供一种金纳米颗粒及其合成方法，其旨在提供一种新的绿色的金纳米颗粒的合成方法。
本发明提供一种技术方案：
癌细胞培养基于合成金纳米颗粒中的应用。
在本发明的其他实施例中，上述癌细胞培养基为细胞培养基培养孵育完癌细胞后的废弃癌细胞培养基。
本发明还提供一种技术方案：
一种金纳米颗粒的合成方法，主要包括：
按照体积比为1:0.8-1.4混合HAuCl4水溶液与癌细胞培养基，然后于90-100℃下培养0.5-1.5小时；
所述HAuCl4水溶液浓度为3.0-3.5mmol/L。
在本发明的其他实施例中，上述HAuCl4水溶液浓度为3.25mmol/L。
在本发明的其他实施例中，上述于90-100℃下培养0.5-1.5小时之后，还包括：离心分离，采用去离子水洗涤得到所述金纳米颗粒。
在本发明的其他实施例中，上述癌细胞培养基主要通过以下步骤制得：
将细胞培养基培养孵育完癌细胞后得到的废弃细胞培养基去除死细胞和碎片后得到所述癌细胞培养基。
在本发明的其他实施例中，上述废弃细胞培养基去除死细胞和碎片具体包括：于3-5℃下离心25-30分钟分离去除死细胞和碎片。
在本发明的其他实施例中，上述细胞培养基选自DMEM培养基，DMEM-F12培养基、RPMI 1640培养基中的任一种。
在本发明的其他实施例中，上述癌细胞为胶质母细胞瘤。
本发明还提供一种技术方案：
一种金纳米颗粒，金纳米颗粒通过上述的金纳米颗粒合成方法制得。
本发明实施例提供的金纳米颗粒及其合成方法的有益效果是：
采用癌细胞培养基能合成金纳米颗粒。癌细胞培养废弃的培养基中生产出金纳米颗粒，而不使用任何其他化学试剂，这种金纳米颗粒具有高度的生物相容性。通过上述金纳米颗粒合成方法制得的金纳米颗粒与健康的体细胞具有相同的生物相容性，并且对乳腺癌细胞具有更高的抗癌活性。同时在癌细胞的生物成像中也具有良好的荧光特性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1示出了实施例1制备得到的金纳米颗粒的TEM显微照片。
图2示出了实施例1制备得到的金纳米颗粒的尺寸分布。
图3示出了实施例1制备得到的金纳米颗粒的吸收波长。
图4示出了实施例1制备得到的金纳米颗粒并在488nm处显示荧光。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的金纳米颗粒及其合成方法进行具体说明。
癌细胞培养基于合成金纳米颗粒中的应用。
发明人实验发现，可以采用癌细胞培养基进行金纳米颗粒的合成。通过改方式培养得到的金纳米颗粒有90％小于10nm，并且其大小可以通过培养基的老化时间来调节，即癌细胞在培养基中的孵育时间，细胞的密度(理想状态下为90％)和HAuCL4溶液的浓度也可调节金纳米颗粒的大小，DLS和透射电子显微镜证明了该结果。
癌细胞培养基可以为DMEM培养基，DMEM-F12培养基、RPMI 1640培养基等。
在本发明的其他实施例中，上述癌细胞培养基为细胞培养基培养孵育完癌细胞后的废弃癌细胞培养基。
详细地，废弃癌细胞培养基是指培养完癌细胞后的细胞培养基。可以达到废物利用的目的，同时也不再需要过多复杂的纯化手段。
需要说明的是，在本发明的其他实施例中，癌细胞培养基也可以直接采用没有培养过癌细胞的培养基。
本发明还提供一种技术方案：
一种金纳米颗粒的合成方法，主要包括：
按照体积比为1:0.8-1.4混合HAuCl4水溶液与癌细胞培养基，然后于90-100℃下培养0.5-1.5小时；
HAuCl4水溶液浓度为3.0-3.5mmol/L。
在本实施例中，将HAuCl4水溶液与癌细胞培养基混合然后培养，在进行分离即可制得金纳米颗粒。制备方法简单，避免纯化的步骤，不使用除金盐和细胞培养废物之外的其他化学试剂，是一种绿色的合成方法。
在实施例中，上述HAuCl4水溶液浓度为3.25mmol/L。
在本发明的其他实施例中，上述于90-100℃下培养0.5-1.5小时之后，还包括：离心分离，采用去离子水洗涤得到所述金纳米颗粒。
在本实施例中，培养之后将溶液冷却至室温25℃。然后将溶液以20000g离心以分离，采用去离子水洗涤得到所述金纳米颗粒。
在本发明的其他实施例中，也可以采用其他分离手段进行分离。
在本发明的其他实施例中，上述癌细胞培养基主要通过以下步骤制得：
将细胞培养基培养孵育完癌细胞后得到的废弃细胞培养基去除死细胞和碎片后得到所述癌细胞培养基。
发明人实验发现，废弃细胞培养及作为一种生物废弃物，可以用于合成金纳米颗粒，且合成多种形状并且大小在2-14nm的金纳米颗粒(约占所有金纳米颗粒的90％)。
废弃的培养基始终是一个公共卫生问题，如果不妥善处理可能导致严重疾病流行。金的离子溶液被分子和某些生物因子矿化，如DNA，RNA，蛋白质，糖，谷胱甘肽，NAD(P)H。与健康组织相比，这些活性氧物质在癌细胞中差异存在。在细胞与细胞培养基温育期间，磨损、细胞正常的自稳态以及代谢过程将上述因子释放到培养基中。另外，癌细胞处理前新鲜培养基的pH是中性的，然而在癌细胞孵育24-72小时后培养基变成碱性。实际上，碱性环境最适合还原过程，有助于金纳米颗粒的形成。
在本发明的其他实施例中，上述废弃细胞培养基去除死细胞和碎片具体包括：于3-5℃下离心25-30分钟分离去除死细胞和碎片。
在本实施例中，在4℃下以15000g离心30分钟，确保不存在细胞或碎片。
在本发明的其他实施例中，上述细胞培养基选自DMEM培养基，DMEM-F12培养基、RPMI1640培养基中的任一种。
DMEM培养基，DMEM-F12培养基、RPMI1640培养基三者均含有浓度为10％的胎牛血清和1％的链霉素-青霉素，另外，谷氨酰胺的浓度分别为4.0mM，2.5mM和2.05mmol/L。
需要说明的是，在本发明的其他实施例中，细胞培养基也可以为其他培养基。
在本发明的其他实施例中，上述癌细胞为胶质母细胞瘤。
培养胶质母细胞瘤(U87)之后的细胞拍阳极得到的金纳米颗粒的粒径更小。
需要说明的是，在本发明的其他实施例中，上述癌细胞培养基也可以直接采用没有培养过癌细胞的培养基。例如，直接采用DMEM培养基，DMEM-F12培养基、RPMI1640培养基等，也能够合成金纳米颗粒。
本发明还提供一种技术方案：
一种金纳米颗粒，金纳米颗粒通过上述的金纳米颗粒合成方法制得。
通过上述金纳米颗粒合成方法制得的金纳米颗粒与健康的体细胞(如单核细胞和成纤维细胞)具有相同的生物相容性，并且对MCF-7(乳腺癌细胞)具有更高的抗癌活性。同时在癌细胞的生物成像中也具有良好的荧光特性。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供了一种金纳米颗粒，主要通过以下步骤制得：
胶质母细胞瘤(U87)在75cm2培养瓶中培养(培养瓶购买于无锡NEST生物技术有限公司)。
细胞在含有4mM L-谷氨酸，4500mg/L葡萄糖的15ml DMEM高葡萄糖培养基中，并在37℃温度，95％相对湿度和5％CO2的标准培养条件下孵育。
细胞孵育48小时。收集细胞培养基于50ml试管中。将收集的培养基以2000g离心20分钟，除去死细胞和碎片。
将上清液转移至另一50ml试管中，在4℃下以15000g离心30分钟，确保不存在细胞或碎片。
用去离子水溶解HAuCl4(电导率为18Ω/cm2)使其终浓度为3.25mMol/L。
将去除细胞、碎片的培养基与的HAuCl4溶液以1：1的比例混合。
溶液颜色变黄并转移到95℃的热空气培养箱中，50rpm下反应1小时。溶液由黄色变为红色，表明金纳米颗粒形成。溶液冷却至室温25℃。然后将溶液以20000g离心以分离金纳米颗粒。去离子的水洗涤金纳米颗粒。
实施例2
本实施例提供了一种金纳米颗粒，主要通过以下步骤制得：
用去离子水溶解HAuCl4使其终浓度为3.0mMol/L。按照体积比为1:0.8混合HAuCl4水溶液与DMEM-F12培养基，于90℃下培养0.5小时；分离固相后用去离子水洗涤。
实施例3
本实施例提供了一种金纳米颗粒，主要通过以下步骤制得：
胶质母细胞瘤(U87)在75cm2培养瓶中培养(培养瓶购买于无锡NEST生物技术有限公司)。
细胞在DMEM-F12培养基中，并在37℃，95％相对湿度和5％CO2的标准培养条件下孵育。
细胞孵育48小时。收集细胞培养基于50ml试管中。将收集的培养基以2000g离心20分钟，除去死细胞和碎片。
将上清液转移至另一50ml试管中，在3℃下以15000g离心30分钟，确保不存在细胞或碎片。
用去离子水溶解HAuCl4使其终浓度为3.5mMol/L。按照体积比为1:1.4混合HAuCl4水溶液与除去死细胞和碎片的细胞培养基，然后于90℃下培养0.5小时；分离固相后用去离子水洗涤。
实施例4
本实施例提供了一种金纳米颗粒，主要通过以下步骤制得：
胶质母细胞瘤(U87)在75cm2培养瓶中培养(培养瓶购买于无锡NEST生物技术有限公司)。细胞在RPMI1640培养基中，并在37℃温度，95％相对湿度和5％CO2的标准培养条件下孵育。
细胞孵育48小时。收集细胞培养基于50ml试管中。将收集的培养基以2000g离心20分钟，除去死细胞和碎片。
将上清液转移至另一50ml试管中，在5℃下以15000g离心30分钟，确保不存在细胞或碎片。
用去离子水溶解HAuCl4使其终浓度为3.5mMol/L。
按照体积比为1:0.8混合HAuCl4水溶液与除去死细胞和碎片的细胞培养基，然后于100℃下培养1.5小时；分离固相后用去离子水洗涤。
对比例
采用化学合成的方法制备金纳米颗粒，利用柠檬酸来使1mM的HAuCl4溶液矿物化，从而形成15-45nm的纳米级材料。
试验例1
对实施例1制备得到的金纳米颗粒进行检测。
采用透射电子显微镜观测实施例1制备得到的金纳米颗粒。图1示出了实施例1制备得到的金纳米颗粒的TEM显微照片。图2示出了实施例1制备得到的金纳米颗粒的尺寸分布。
结合图1与图2。说明实施例1制备得到的金纳米颗粒粒径较小，约有90％小于10nm。
在25cm2细胞培养瓶中培养U87癌细胞，当细胞密度达到90％时，使用0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液(1.5ml)对细胞进行胰蛋白酶消化。温育3分钟后，将细胞收集在试管中，在室温下1000rpm离心3分钟，然后弃去细胞上清液，重悬沉淀，使细胞浓度为0.5×106个/ml，在基底提供镜片的共聚培养皿中培养。培养24小时后，用30μM生物合成的金纳米颗粒(实施例1提供的金纳米颗粒)和化学合成的金纳米颗粒孵育细胞用于摄取和荧光研究。将细胞温育12小时，然后用共聚焦显微镜(美国纽约尼康仪器公司)在488nm激发波长下生物成像。在生物成像之前，使用DAPI染料在黑暗中将细胞核缎纹化10分钟，然后用PBS洗涤。
通过使用(SpectraMax i3X)在400-650nm波长的96孔板中进行施例1制备得到的金纳米颗粒的荧光吸收。
图3示出了实施例1制备得到的金纳米颗粒的吸收波长。
图4示出了实施例1制备得到的金纳米颗粒并在488nm处显示荧光。
从图3与图4可以看出，实施例1制备得到的金纳米颗粒的荧光可以在488nm激发下获得。实施例1制备得到的金纳米颗粒细胞摄取和荧光特性没有差异。
此外，发明人使用动态光散射系统(DLS)(Malvern，Zeta Sizer)进行生物合成纳米颗粒的ζ电位。计算的平均zeta电位为-48mV。
试验例2
对实施例1制备得到的金纳米颗粒的抗癌活性进行检测
将MCF-7细胞在25cm2的细胞培养瓶中培养，当细胞密度达到90％时，使用0.25％的胰蛋白酶-EDTA溶液(1.5ml)对细胞进行胰蛋白酶消化。温育3分钟后，将细胞收集在试管中并在室温下，1000rpm离心3分钟，弃去细胞上清液，将沉淀重新悬浮,并在96孔板中培养,每孔加入200μl培养基并接种1×106个细胞。
孵育24小时后，分别用15μMol/L,30μMol/L,60μMol/L,90μMol/L,120μMol/L,150μMol/L,225μMol/L,300μMol/L和375μMol/L实施例1提供的纳米颗粒处理细胞24小时，同时使用化学合成的Au纳米颗粒和标准对照。然后以每孔加入10μl的5mg/ml MTT溶液，并再次温育4小时。
然后弃去细胞培养基并向每个孔中加入200μl二甲基亚砜(DMSO)。然后将其涡旋10分钟，溶解形成的晶体，再用ELISA读板器(SpectraMax i3X)读取492nm波长的光密度。通过使用MS excel的存活率百分比来比较结果。
在15μMol/L，30μMol/L，60μMol/L，90μMol/L，120μMol/L，150μMol/L，225μMol/L，300μMol/L和375μMol/L的不同浓度下比较化学合成和实施例1提供的金纳米颗粒，通过使用MS excel的存活率百分比来比较结果；结果显示：
上述各个浓度下化学合成的金纳米颗粒中癌细胞杀伤率分别为：
2.00％，1.88％，1.64％，9.48％，10.05％，16.9％，18.7％，21.01％和29.93％；
上述各个浓度下实施例1提供的金纳米颗粒癌细胞杀伤率分别为：
9.05％，18.17％，20.13％，19.12％，23.45％，28.24％，31.74％，37.60％和40.96％。
从上述实验结果可以看出，与化学合成的金纳米颗粒相比，实施例1提供的金纳米颗粒在375μMol/L时，可将细胞活力降低至60％，显示出针对MCF-7细胞的抗癌活性，而化学合成的金纳米颗粒约保持在75％。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种金纳米颗粒的合成方法，其特征在于，主要包括：
按照体积比为1:0.8-1.4混合HAuCl4水溶液与癌细胞培养基，然后于90-100℃下培养0.5-1.5小时；
所述HAuCl4水溶液浓度为3.0-3.5mmol/L；
所述癌细胞培养基主要通过以下步骤制得：
将细胞培养基培养孵育完癌细胞后得到的废弃细胞培养基去除死细胞和碎片后得到所述癌细胞培养基。
2.根据权利要求1所述的金纳米颗粒的合成方法，其特征在于，所述HAuCl4水溶液浓度为3.25mmol/L。
3.根据权利要求1所述的金纳米颗粒的合成方法，其特征在于，于90-100℃下培养0.5-1.5小时之后，还包括：离心分离，采用去离子水洗涤得到所述金纳米颗粒。
4.根据权利要求1所述的金纳米颗粒的合成方法，其特征在于，所述废弃细胞培养基去除死细胞和碎片具体包括：于3-5℃下离心25-30分钟分离去除死细胞和碎片。
5.根据权利要求4所述的金纳米颗粒的合成方法，其特征在于，所述细胞培养基选自DMEM培养基，DMEM-F12培养基、RPMI 1640培养基中的任一种。
6.根据权利要求1所述的金纳米颗粒的合成方法，其特征在于，所述癌细胞为胶质母细胞瘤。
7.一种金纳米颗粒，其特征在于，所述金纳米颗粒通过权利要求1-6任一项所述的金纳米颗粒合成方法制得。
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