CN103076453A - P16免疫细胞化学试剂盒及其制备用多肽序列 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种P16免疫细胞化学试剂盒及其制备用多肽序列。该试剂盒成分包括（1）第一抗体；（2）第二抗体；（3）酶底物；（4）阳性对照品；（5）阴性对照品；（6）缓冲液。该试剂盒可用于标记人类癌细胞和癌前期细胞中异常表达的P16蛋白，使之得到不同程度的显色，因此区别于正常细胞或其它未发生进一步P16蛋白编码基因相关变异的同类型癌细胞。
Description
技术领域
本发明属于生物医学领域，涉及一种用于标记人类细胞中P16蛋白的免疫细胞化学试剂盒制备方法和用于制备试剂盒中相关单克隆抗体的几种多肽成分。
背景技术
人类P16蛋白是细胞中的一种保护性蛋白，能够防止人体细胞癌变，起到阻止细胞过度增殖的作用。人类P16蛋白的编码基因为CDKN2A，位于9号染色体短臂上。P16蛋白能够与周期素依赖性激酶4结合并抑制其活性，使细胞停留于G1期，无法持续增殖。故而，P16是一种抑癌蛋白。细胞中，P16蛋白的表达通常受到另两种抑癌蛋白：P53和RB的调控，处于低水平状态。
宫颈癌及其癌前期细胞中，P16蛋白表达量常会异常增加，其原因在于当宫颈细胞处于癌变早期时，抑癌蛋白P53和RB的功能常常处于缺失状态，因此P16蛋白的合成表达被从抑制状态中释放了出来。不过，此时细胞中虽有P16蛋白过量表达，因无法抵抗P53和RB功能缺失带来的不利作用，仍将进入持续增殖状态，进而转变为癌细胞。故而，我们如在宫颈癌前期细胞中考察P16蛋白表达量，就可以预测这些细胞的转归命运。目前，已经知道，宫颈癌Hela细胞株P16蛋白表达量明显高于正常水平，是典型的P16阳性细胞株。
在胃癌、肺癌等恶性肿瘤中，部分癌细胞可因其P16蛋白编码基因的外显子突变或启动子甲基化的关系，P16蛋白表达量显著降低。研究表明，较之周围P16蛋白表达水平较高的同类型癌细胞而言，这些P16蛋白表达量较低的癌细胞的恶性程度通常更高。因此，如在恶性胸水或腹水检测到这类P16表达为阴性的胃癌或肺癌细胞，说明患者预后较差。
免疫细胞化学是指利用针对某种蛋白的特异性抗体对细胞中该蛋白表达情况进行检测的一种实验方法。通常分为三步：（1）以第一抗体（主要使用单克隆抗体，比如小鼠抗人P16单克隆抗体）识别细胞中的目标蛋白，（2）以带有酶分子标记的第二抗体（主要使用多克隆抗体，比如：兔抗小鼠IgG多克隆抗体），识别第一抗体，（3）以酶分子底物（如：辣根过氧化物酶底物为二氨基联苯胺）使被标记目标蛋白显色。免疫细胞化学技术被广泛应用于生命科学和医疗实践工作中，用以判断未知细胞的组织学来源、病理学性质和分子生物学特征。
免疫细胞化学中所用的单克隆抗体（即：第一抗体）来自于单抗制备技术。这种技术诞生于1975年，当时Kohler和Milstein两人发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。目前，单克隆抗体的杂交瘤制备技术广泛用于抗体的工业化生产中。其生产流程主要是先采用某种特定的抗原，比如：蛋白类抗原，注射入小鼠皮下，待免疫过程完成后，收集对该抗原具有反应性的脾细胞（实际是分泌单克隆抗体的B细胞），然后将其与骨髓瘤细胞融合，筛选出对免疫原（或抗原表位）最具反应性的杂交瘤克隆，进行大规模扩增，再从扩增瘤细胞所用的培养基中分离纯化出目标抗体即可。单抗制备技术获得的抗体多为IgG抗体，它们可在体外条件下对抗原成分中的特定表位进行免疫识别和结合。需要注意的是，免疫动物所用的抗原物质应有足够大的分子量，如果所用抗原物质分子量过小，则有可能因为无法刺激B细胞增殖而不能获得所需的单克隆抗体。为此，通常建议采用完整的蛋白分子对小鼠进行免疫。但也有时候，为了制备针对蛋白分子中某个抗原表位的单克隆抗体，有考虑采用蛋白分子的部分肽段来进行抗体制备的做法。此时，如免疫动物所用肽段分子量过小，例如：只含10-20个氨基酸时，必须将此肽段先偶联到一个分子量较大的载体蛋白上，然后以偶联物免疫动物，再通过酶联免疫吸附检测法筛选出对该肽段有较高反应性的杂交瘤克隆，最后对这些瘤细胞加以大量扩增，即可得到针对某特定抗原表位的单克隆抗体产物。
免疫反应机制上，抗原和抗体的识别和结合是特异性的，需要双方分子之间具备相互契合的空间结构，就如同是锁和钥匙之间的一一对应关系那样。但是，抗原抗体的结合过程中，两者的空间构象并不是一成不变的，相反，这是一个相互诱导的过程。通常来说，抗原分子的出现可以诱导抗体分子产生折角和弯曲，以利于抗原分子进入结合位点，实现两者更为密切的结合。而抗体分子在识别抗原表位过程中也可以打开抗原分子表面的屏障，深入到后者内部的识别区位中，更好地与抗原结合。利用抗原抗体分子在识别过程中的这些构象改变机制，现已能够人为设计出一些特殊的抗体分子，通过诱导抗原分子发生各种预定的构象乃至于一些化学键的改变，用以实现某些特定的生物学或化学目标。比如：抗体酶。
慢病毒（Lentivirus）载体是以人类免疫缺陷I型病毒为基础发展起来的基因载体,它对哺乳动物分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，感染后，该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。目前商品化的慢病毒载体系统多由两部分组成，即包装成分和载体成分。包装成分由人类免疫缺陷I型病毒基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白。载体成分与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的HIV顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。目的基因的类型根据实验需要，由研究者自行选择、合成，然后通过酶切-连接方法插入载体质粒。一般来说，长度较短的目的基因易于表达，超过3千碱基对的基因序列很难被成功包装、感染、整合或表达。此外，病毒扩增方面，为产生高滴度的病毒颗粒，需用表达载体和包装质粒同时共转染HEK 293T细胞，于细胞内部进行病毒繁殖和包装。包装好的病毒颗粒会分泌到细胞外的培养基，离心取得培养基上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染。目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平地表达效应分子。
小干扰RNA分子（small interfering RNA，简称siRNA）是一种长20到25个核苷酸的双股RNA，能够以专一性的方式下调目的基因的表达量。siRNA两股RNA单链的3’末端各自都超出对方5’末端达2个核苷酸。在细胞内，siRNA主要与Dicer酶结合。由于Dicer酶具有核酸酶活性，siRNA双链与之结合后，其中的一股单链RNA分子会被降解掉。而后，剩下的一股单链分子能够与序列互补的mRNA序列发生特异性结合，并使后者被Dicer酶所降解。根据siRNA的作用原理，可以人为设计siRNA分子，并转染细胞，使之特异性干扰目的基因mRNA的数量，从而降低目标蛋白的表达量。
目前临床上缺乏能够直接应用于宫颈脱落细胞或胸腹水中癌细胞的P16试剂盒。市场上购得的小鼠抗人P16单抗主要适用于组织切片的免疫化学标记而非细胞涂片，其对于单个细胞检测灵敏度不足。本发明提供了一个灵敏、高效的，可供检测单个细胞中P16表达状态的免疫细胞化学试剂盒。
发明内容
本发明提出P16免疫细胞化学试剂盒及其制备用多肽序列。该试剂盒由第（1）-（6）号组分组成。其中：
第（1）号组分含的是第一抗体，所含的实际上是三种小鼠抗人P16蛋白单克隆IgG抗体的混合物，三者浓度相同，按1：1：1（体积比）的比例混合。这三种单克隆抗体由多肽A、B、C（三者都是P16蛋白的全长氨基酸序列中的一部分，但经过重新拼接，以突出P16蛋白的核心表位区域）免疫动物而得到，可以敏感地识别人类P16蛋白中的相应抗原表位。它们的制备过程如下（小鼠单克隆抗体的制备方法在本领域中是已知和常规的，本发明仅仅指出其大致过程，具体细节可以参考其他专业书籍，例如：徐志凯.实用单克隆抗体技术.西安：陕西科学技术出版社，1991.）：
（一）免疫动物 将含有载体-多肽A、B或C偶联物（载体-多肽偶联物的制备在本领域中是已知和常规的，本发明仅仅指出其大致过程，具体细节可以参考其他专业书籍和文献，例如：沈关心，周汝麟.现代免疫学实验技术.湖北科学技术出版社，2002.、赵丽，王健伟，计融，韩春卉，于修平，洪涛.不同牛PrP合成肽段的抗原性研究.中国人兽共患病杂志.2005；21（08）：681-684.和王萧，周培岚，李玉蕾，宫泽辉.A20结合核因子抑制蛋白的抗体制备及鉴定.军事医学2011；35(02)：111-114.）的生理盐水溶液分别注射入6-8周龄雌性小鼠皮下（偶联物剂量、载体类型、佐剂类型根据实验者经验调整，多以钥孔戚血蓝蛋白为载体，以戊二醛法使之与多肽偶联，再将偶联物按300-500微克/次剂量免疫动物3-4次，每次间隔3-4周，使用福氏佐剂），动物体内（包括脾脏）的B淋巴细胞克隆得到刺激后，活化、增殖，分化成为致敏B淋巴细胞。
（二）细胞融合处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制成脾细胞悬液。将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。
（三）进行选择性培养以筛选融合的杂交瘤细胞采用HAT选择性培养基（一种含有次黄嘌呤(H)、氨基蝶呤(A)、胸苷(T)和甘氨酸的细胞培养基）。该培养基中，融合后的杂交瘤细胞从脾细胞处获得次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，加之本身作为瘤细胞具有无限增殖的特性，因此得到选择。
（四）杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养。利用所合成的多肽（A、B或C），对每个克隆进行酶联免疫吸附检测（该方法在本领域中是已知和常规的，本发明仅仅指出其大致过程，具体细节可以参考其他专业书籍，例如：(美)J.萨姆布鲁克，(美)D.W.拉塞尔著，黄培堂等译.分子克隆实验指南.科学出版社，2002.），筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增。针对每种多肽免疫原，应选出至少五株杂交瘤克隆，进行大量制备。
（五）单克隆抗体的大量制备采用体外培养法，将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行培养。在培养过程中，杂交瘤细胞产生并分泌单克隆抗体，收集培养上清液，离心去除细胞及其碎片，即可获得所需要的单克隆抗体。
上述（一）到（五）步制备过程中提及的多肽A、B、C的具体序列信息如下：
多肽A（即：序列表中的SEQ ID NO.1）：MEPAAGSSMEPSADWAAAAAALPN
多肽B（即：序列表中的SEQ ID NO.2）：ARGRVEEVRALLEAGAAAAP
多肽C（即：序列表中的SEQ ID NO.3）：ALPNAPNSYGRRPIQVAAAAGSSME
上述多肽序列中，各单字母缩写的意义如下：G甘氨酸，A丙氨酸，V缬氨酸，L亮氨酸，I异亮氨酸，F苯丙氨酸，W色氨酸，Y酪氨酸，D天冬氨酸，H组氨酸，N天冬酰胺，E谷氨酸，K赖氨酸，Q谷氨酰胺，M甲硫氨酸，R精氨酸，S丝氨酸，T苏氨酸，C半胱氨酸，P脯氨酸。
（六）三抗体组合的挑选培养Hela细胞，并铺入培养皿中，待细胞帖壁后，以70%乙醇固定。另外，设计、合成针对CDKN2A mRNA的siRNA分子（所含的双股RNA链分别为：5’-ugcccaacgcaccgaauagtt-3’，5’-cuauucggugcguugggcatt-3’，其中a指腺嘌呤，t指胸腺嘧啶，g指鸟嘌呤，c指胞嘧啶，u指尿嘧啶），并转染入Hela细胞（设计、构建和转染siRNA分子的方法在本领域是已知和常规的，本发明仅仅指出其大致过程，具体细节可以参考其他专业书籍和文献，例如：(美)K.阿帕萨尼著，殷勤伟译.RNA干扰技术：从基础科学到药物开发.科学出版社.2007.、游兴松，王蕾，李卓先，方文敏，袁玉林.Bcl-xl和IGF-1受体特异性siRNA真核表达载体的设计、构建及鉴定.数理医药学杂志.2012；25(02)：148-153.和郑红，赵国强，杨洪艳，刘康栋，冯龙，董子明.CEAsiRNA载体的构建和转染人食管癌EC9706细胞的沉默作用.第四军医大学学报.2007；28(23)：2116-2118.）。所得的Hela细胞的P16表达量显著低于原有水平，与正常组织中P16表达状态接近或一致（已通过免疫印迹和质谱方法得到了验证，具体检测方法参见(美)J.萨姆布鲁克，(美)D.W.拉塞尔著，黄培堂等译.分子克隆实验指南.科学出版社，2002.），称为Hela-P16neg细胞。同样以70%乙醇将Hela-P16neg细胞固定在培养皿中。然后，以能够识别上述三种多肽抗原（即：多肽A、B、C）的单克隆抗体（针对同一多肽序列的所有抗体称为一个“制备系列”）分别对Hela细胞和Hela-P16neg细胞内的P16蛋白进行免疫细胞化学检测。从每个抗体制备系列中找出对细胞内P16蛋白检测效率最高（即：对Hela细胞的染色程度最深）且对Hela-P16neg细胞检测结果为阴性（即：对Hela-P16neg细胞的染色水平呈无色或浅黄色）的三株或三株以上抗体。接着，按照抗体制备系列A、B、C的顺序依次从每个系列中挑选出一株抗体，将三者调节至相同浓度，并按1：1：1（体积比）混合。在等浓度情况下（指混合物中的抗体总浓度和待比较单个抗体成员的个体浓度相等），对抗体混合物及其组内各成员有关Hela细胞的检测效率（以免疫细胞化学染色程度来衡量）进行比较，选出一个可以使混合物检测效率显著高于其组内任何一个抗体的组合方式，即为（1）号组分。
经实验验证，以上述三个多肽作为抗原制备得到的系列单克隆抗体中，有70%-85%的成员都可用于实现符合试剂盒制备需求的组合方式。这些抗体独立的免疫细胞化学检测效率均不低于市场上购得的常见小鼠抗人P16单克隆抗体。并且，它们所构成的三元混合物的免疫检测效率都强于市场上目前能购买到的几种小鼠抗人P16单克隆抗体单体或类似的预混合物（这些抗人P16单克隆抗体的识别区域通常位于人P16蛋白全长氨基酸序列中除序列A、B、C以外的其他部位）。
第（2）号组分含的是第二抗体。该抗体为偶联有辣根过氧化物酶的兔抗小鼠IgG多克隆抗体。
第（3）号组分所含的是酶底物，即：二氨基联苯胺溶液（英文名：3,3-diaminobenzidine，缩写：DAB）。
第（4）号组分所含的阳性对照品是兔肾细胞RK13，经过慢病毒感染后，其基因组中整合有一段受到巨细胞病毒即早基因（英文名：cytomegalovirus immediate early gene，缩写CMV IE）启动子调控的目的基因。该目的基因的编码序列中含有一段可表达的序列D成分。由序列D转录翻译得到的表达产物为可以被上述三种单抗同时识别的多肽片段。
DNA序列D（即：序列表中的SEQ ID NO.4）的序列信息如下：
atggcgggga gcagcatgga gccttcggag gaggaggagg aggtgcgggc gctgctggag
gaggaggagg aggagaggcc gatccaggtc atgatgatgg gcgaggagga ggaggagccg
aatagttacg gtcggaagga ggaggaggag gaggtgcggg cgctgctgga ggaggaggag
gaggagccga atagttacgg tcggaagtga
在上述序列D中：a指腺嘌呤，t指胸腺嘧啶，g指鸟嘌呤，c指胞嘧啶。
慢病毒的制备及其对RK13细胞的感染方法如下：
选择含有CMV IE启动子的慢病毒载体质粒，将序列D加上合适的接头序列（此序列含有与慢病毒载体多克隆位点相对应的限制性内切酶识别位点，5’上游和3’下游的接头序列应该适用于不同的限制性内切酶），然后通过双酶切，以DNA粘性末端连接的方式将序列D插入CMV IE启动子3’下游，使之受到该启动子的调控。将慢病毒载体质粒和包装质粒共转染HEK293T细胞，收集上清液，通过超滤和超速离心加以浓缩和纯化。之后，将得到的病毒液感染293T细胞，测定该病毒滴度。根据滴度，进一步浓缩和纯化病毒液，使之滴度达到107/毫升。最后，将106病毒颗粒（即100微升滴度为107/毫升的病毒浓缩液）加入1毫升浓度为104/毫升的RK13细胞悬液中，铺入直径为3厘米的培养皿中，37摄氏度恒温培养72小时后，所得细胞即为整合有受CMV IE启动子调控的序列D的RK13细胞，可以连续传代。
经过实验验证，此段序列在哺乳动物细胞（即：RK13细胞）中有较高的表达效率，其编码产物的表达量和被标记效率显著高于由慢病毒所携带人P16蛋白原编码基因转录产物（即信使mRNA）的互补DNA序列（约450碱基对）在RK13细胞中的表达产物。
需要说明的是，因表位识别部位的细微差别（包括：P16蛋白和序列D编码产物之间在空间结构和表位可识别性上的差异），用于构成三抗体混合物，也即：第（1）号组分的部分或全部抗体成员可能不识别序列D编码产物。因此，当（1）号组分对阳性对照品检测能力较差（即，采用该抗体混合物对（4）号组分进行免疫细胞化学实验，细胞染色结果为无色透明，或浅黄色状态）时，应将新的成员更换入该抗体混合物组合，即再次重复（1）号组分的抗体挑选过程，直至找到了既能高效标记Hela细胞，又能高效标记阳性对照品的三抗体组合为止。经实验证实，以多肽A、B、C免疫小鼠得到的单克隆抗体中，80%-90%的成员均能高效识别和检测出第（4）号组分中携带序列D的RK13细胞。
第（5）号组分所含的阴性对照品是不表达人P16蛋白的兔肾细胞RK13。
第（6）号组分所含的缓冲液为pH=7.4的磷酸缓冲液（磷酸二氢钾0.024%，磷酸氢二钠0.144%，氯化钠0.8%，氯化钾0.02%）。
将上述（1）-（6）号组分装入包装盒中，即得可标记人类细胞内P16蛋白的免疫细胞化学试剂盒。该试剂盒可用于标记人类癌细胞和癌前期细胞中异常表达的P16蛋白，使之得到不同程度的显色，因此区别于正常细胞或周围组织中形态类似但尚未发生P16蛋白编码基因相关变异的同类型癌细胞。
与现有技术相比，本发明试剂盒的优点在于：
第一：本试剂盒所用的第一抗体是三种小鼠抗人P16蛋白单克隆抗体的混合物。由于三种抗体在标记同一种蛋白时，相互之间可以产生一定的表位诱导和抗原凝集的协同作用，因此三者的联合检测（免疫标记）效率显著高于过去使用单一抗体所能获得的基本免疫标记效率。
用于制备这三种具有免疫标记协同作用的单克隆抗体的是经过特别设计的多肽A、B、C。这三条多肽序列均来源于人P16蛋白全长氨基酸序列，但采取了不同的拼接方式，使得一些原本不相邻的抗原表位变得相邻。由其免疫动物得到的单克隆抗体因此能够对P16蛋白空间构象产生一定诱导作用，使特定识别表位得到暴露和突出。
第二：过去的P16单克隆抗体试剂盒中，都没有提供稳定可靠的阳性或阴性对照品。本试剂盒通过提供阳性和阴性对照品，可以帮助实验者有效判断其在操作过程中是否存在系统误差而造成待测细胞假阳性或假阴性的染色结果。具体来说，阳性对照品如未被染色，则可判断本批所有实验结果均为假阴性。阴性对照品如被染色，则可判断本批所有实验结果均为假阳性。
第三：本试剂盒所使用的阳性对照品具有独特性。这种对照品对于其他商业化小鼠抗人P16蛋白单克隆抗体来说是有一定排它性的，即：非本试剂盒专有的单克隆抗体由于识别表位的差异，通常无法将该对照品标记出来。因此，这种阳性对照品有助于试剂盒防伪（防止他人用成本低、检测效力弱的抗人P16抗体替换本试剂盒中成本高、检测效力强的单克隆抗体混合物）。仿冒者即使更换了阳性对照品，使得劣质抗体能够在对照品实验中得到阳性结果，专利使用者也可以通过对其所用的阳性对照品进行基因检测（可采用DNA测序或多聚酶链式反应的分析方法）加以甄别和区分。
具体实施方式
以下实施例中所述的分子生物学、免疫学、细胞学的专业术语和技术操作方法都在过去文献和专业书籍中有过详细论述，例如：免疫印迹技术、分子克隆技术、DNA测序、聚合酶链式反应、酶联免疫吸附检测方法和免疫细胞化学技术可以参考：(美)J.萨姆布鲁克，(美)D.W.拉塞尔著，黄培堂等译.分子克隆实验指南.科学出版社，2002.蛋白-多肽偶联物构建、单克隆抗体制备技术和酶联免疫吸附检测方法可参考：沈关心，周汝麟.现代免疫学实验技术.湖北科学技术出版社，2002.蛋白质的质谱鉴定方法可以参考：魏开华，应天翼.蛋白质组学实验技术精编.化学工业出版社，2010.凡在本领域文献书籍中有过描述，并且成为专业人员熟知的常规操作技术，下文不再赘述其详。各种技术操作中用到的各类化学品（包括siRNA、引物）、细胞、动物、培养皿等实验试剂和耗材都可以在一般化学试剂或生物技术公司购到，显微镜、移液器、核酸合成仪和塑料封口机等都是实验室常规设备，可以在大多数专业的分子生物学、免疫学、细胞生物学或病理学实验室中找到。
实施例一、试剂盒组装
取钥孔戚血蓝蛋白与多肽A、B和C的三种偶联物（以戊二醛作为偶联剂）分别免疫小鼠，按常用单克隆抗体制备方法制成针对上述三种多肽抗原的小鼠抗人P16蛋白IgG单克隆抗体制备系列（每个制备系列都含有经过优化挑选的3株抗体）。将纯化后的单克隆抗体原液稀释于磷酸缓冲液中，按1毫克/毫升配置成抗体母液，然后根据不同组合方式按1：1：1（体积比）将任意三种抗体母液加以混合，确保每个混合物组合中含且仅含有三个抗体成员，且三者分别来自三个不同的抗体制备系列。然后，以所得的三抗体混合物（抗体总浓度：1毫克/毫升）和构成该混合物的三个单独成员（即：1毫克/毫升）依次作为第一抗体，按通用方法对Hela细胞和Hela-P16neg细胞（即：预先转染有针对P16编码基因mRNA的siRNA分子：5’-ugcccaacgcaccgaauagtt-3’和5’-cuauucggugcguugggcatt-3’的Hela细胞，a指腺嘌呤，t指胸腺嘧啶，g指鸟嘌呤，c指胞嘧啶，u指尿嘧啶）进行免疫细胞化学实验（即按第一抗体，第二抗体和底物的顺序，依次向待测细胞样品进行滴加、孵育和清洗抗小鼠抗人P16单克隆抗体、辣根过氧化物酶偶联的兔抗小鼠IgG多克隆抗体和DAB底物溶液）。比较细胞染色情况，结果所有九个可能的三抗体组合中（即：从针对多肽A、B、C三个抗体制备系列中各选一株单克隆抗体，加以混合，总共可以有九种组合方式），有七组能够高效地、特异性地标记Hela细胞中的P16蛋白（即：对Hela细胞染色程度强，对Hela-P16neg细胞染色程度弱或为无染色），且它们对Hela细胞染色程度均优于其组内的各个单独成员。于是，从七组混合物中选出免疫标记效率最高者（即：对Hela细胞染色程度最深的三抗体组合），取20微升该抗体混合物分装于1.5毫升试剂管中，即成为（1）号组分。
购得辣根过氧化物酶标记的高浓度兔抗小鼠IgG多克隆抗体原液，取出含1毫克抗体的原液，稀释于1毫升磷酸缓冲液中，成为1毫克/毫升第二抗体母液。取20微升该母液分装于1.5毫升试剂管中，即为（2）号组分。
取1.3毫升浓度为0.01摩尔/升的柠檬酸溶液和8.7毫升浓度为0.02摩尔/升的磷酸氢二钠溶液，两者混合成为10毫升柠檬酸缓冲液。取5毫克DAB溶解于此柠檬酸缓冲液中，成为DAB溶液。取1毫升该DAB溶液分装入1.5毫升试剂管中，即为（3）号组分。
选择含有CMV IE启动子的商品化慢病毒载体质粒pLenti6/V5-D-TOPO（美利坚合众国，加利福尼亚州，Invitrogen公司产品，货号：K4950-00），按常规方法构建带有目的基因的慢病毒（根据K4950-00说明书操作）。首先，将序列D（由DNA合成仪制备，纯度99%以上）两侧连上不同接头序列（以聚合酶链式反应扩增序列D的方法来实现，使用的上游引物为：5’-ccggatccatggcggggagcagcatgga-3’，下游引物为：5’-ccctcgagtcacttccgaccgtaactattcg-3’，其中a指腺嘌呤，t指胸腺嘧啶，g指鸟嘌呤，c指胞嘧啶）。然后，以限制性内切酶（即：BamH I和Xho I）双酶切该片段，同法（BamH I、Xho I双酶切）处理载体质粒后，以连接酶将序列D插入慢病毒载体质粒pLenti6/V5-D-TOPO多克隆位点处，使之受到上游CMV IE启动子调控，并通过包装、扩增、纯化、浓缩等步骤，制得携带序列D的慢病毒。将含有序列D的慢病毒感染RK13细胞，待病毒整合后，将105个细胞铺于直径3厘米培养皿中，待细胞帖壁后，以70%乙醇固定，将此培养皿和能够淹没培养皿全部体积的足量70%乙醇一同封入7厘米×7厘米塑料袋中长期保存，即得（4）号组分。
按通用的免疫细胞化学方法，以（1）号组分对（4）号组分进行检测（所用的第二抗体为辣根过氧化物酶偶联的兔抗小鼠IgG多克隆抗体，底物为DAB），结果发现，由本次实验制备得到的（1）号组分能够有效识别和标记出（4）号组分中携带序列D的RK13细胞。（4）号组分中所有细胞都被染成了褐色，其染色程度深于（1）号组分对Hela细胞的免疫细胞化学染色结果。因此，无需对（1）号组分中的抗体成员进行替换。
将105个RK13细胞直接铺于直径3厘米培养皿中，待细胞帖壁后，以70%乙醇固定，将此培养皿和能够淹没培养皿全部体积的足量70%乙醇一同封入7厘米×7厘米塑料袋中长期保存，即得（5）号组分。
取0.24克磷酸二氢钾，1.44克磷酸氢二钠，8克氯化钠，0.2克氯化钾，加水至1000毫升，即成为pH=7.4的磷酸缓冲液。取此缓冲液5毫升分装入5毫升试剂管中，即得（6）号组分。
将上述（1）-（6）号组分装入纸质盒中，即得可用于标记细胞内P16蛋白的免疫细胞化学试剂盒。
实施例二、待测样品的检测过程
取含有妇女宫颈脱落细胞的70%乙醇悬液，涂布于载玻片上（涂布面积必须小于5平方厘米），室温干燥，成为待测宫颈细胞涂片。
取2微升（1）号组分，加98微升（6）号组分，稀释成为第一抗体工作液，滴加于待测宫颈细胞涂片，覆盖全部细胞涂布区域。室温孵育1小时。
用10毫升磷酸缓冲液（实验者自行准备，本试剂盒不提供）洗去上述第一抗体工作液，重复三次。
取2微升（2）号组分，加98微升（6）号组分，稀释成为第二抗体工作液，滴加于待测宫颈细胞涂片，覆盖全部细胞涂布区域。室温孵育1小时。
用5毫升磷酸缓冲液（实验者自行准备，本试剂盒不提供）洗去上述第二抗体工作液，重复三次。
取（3）号组分100微升，加入0.1微升浓度为30%的过氧化氢溶液（实验者自行准备，本试剂盒不提供），混合后成为底物工作液，滴加于待测宫颈细胞涂片，覆盖全部细胞涂布区域。室温孵育15分钟。
用5毫升磷酸缓冲液（实验者自行准备，本试剂盒不提供）洗去上述底物工作液。将待测宫颈细胞涂片置于显微镜下观察。
实施例三、阳性和阴性对照品的检测过程
剪开阳性和阴性对照品保存塑料袋，倒去所有70%乙醇固定液，对于每个培养皿，以10毫升磷酸缓冲液（实验者自行准备，本试剂盒不提供）轻轻冲洗三次。
取2微升（1）号组分，加98微升（6）号组分，稀释成为第一抗体工作液，滴加于（4）号组分（即：阳性对照品）的培养皿中；同样取2微升（1）号组分，加98微升（6）号组分，稀释成为第一抗体工作液，滴加于（5）号组分（即：阴性对照品）的培养皿中。室温孵育1小时。
对于每个培养皿，用5毫升磷酸缓冲液（实验者自行准备，本试剂盒不提供）洗去上述第一抗体工作液，重复三次。
取2微升（2）号组分，加98微升（6）号组分，稀释成为第二抗体工作液，滴加于（4）号组分（即：阳性对照品）的培养皿中；同样取2微升（2）号组分，加98微升（6）号组分，稀释成为第二抗体工作液，滴加于（5）号组分（即：阴性对照品）的培养皿中。室温孵育1小时。
对于每个培养皿，用5毫升磷酸缓冲液（实验者自行准备，本试剂盒不提供）洗去上述第二抗体工作液，重复三次。
取（3）号组分100微升，加入0.1微升30%过氧化氢溶液（实验者自行准备，本试剂盒不提供），混合后成为底物工作液，滴加于（4）号组分（即：阳性对照品）的培养皿中；同样取（3）号组分100微升，加入0.1微升30%过氧化氢溶液（实验者自行准备，本试剂盒不提供），混合后成为底物工作液，滴加于（5）号组分（即：阴性对照品）的培养皿中。室温孵育15分钟。
对于每个培养皿，用5毫升磷酸缓冲液（实验者自行准备，本试剂盒不提供）洗去上述底物工作液，将处理后的（4）号阳性对照品和（5）号阴性对照品分别置于显微镜下观察。
实施例四、P16免疫细胞化学检测结果的判断
显微镜下，经过免疫标记处理的阳性对照品，其细胞（主要指胞浆）呈褐色；阴性对照品经过处理后，细胞呈无色透明或浅黄色。待测涂片中，细胞染色情况按由浅到深依次为：无色、浅黄色、浅褐色、褐色、深褐色。
实验者目测比较待测细胞涂片、阳性对照品和阴性对照品的染色状态，如果待测涂片中细胞的染色程度深于阴性对照品，即可判断为阳性。
阳性细胞中，按染色程度，可以再区分出弱阳性（+），中阳性（++）和强阳性（+++），这三种阳性指标的判别标准分别为：细胞染色程度强于阴性对照品，但弱于阳性对照品者为弱阳性；细胞染色程度等同于阳性对照品者，为中阳性；细胞染色程度强于阳性对照品者，为强阳性。
实施例五、针对多肽A、B、C的三种第一抗体的混合物与其中任意一种抗体标记效率的比较结果
取2微升（1）号组分，加98微升（6）号组分，稀释成为第一抗体工作液I；取2微升浓度为1毫克/毫升的小鼠抗人多肽A单克隆抗体溶液（此抗体应为构成（1）号组分的单克隆抗体之一），加98微升（6）号组分，稀释成为第一抗体工作液II；取2微升浓度为1毫克/毫升的小鼠抗人多肽B单克隆抗体溶液（此抗体应为构成（1）号组分的单克隆抗体之一），加98微升（6）号组分，稀释成为第一抗体工作液III；取2微升浓度为1毫克/毫升的小鼠抗人多肽C单克隆抗体溶液（此抗体应为构成（1）号组分的单克隆抗体之一），加98微升（6）号组分，稀释成为第一抗体工作液IV。
将105个Hela细胞铺于直径3厘米培养皿中，待细胞帖壁后，以70%乙醇固定24小时，倒去乙醇，用10毫升磷酸缓冲液（实验者自行准备，本试剂盒不提供）轻轻冲洗三次，作为待测样品。同法另行制备3个Hela细胞待测样品。
向每个培养皿中分别加入上述第一抗体工作液I、II、III和IV各100微升。室温孵育1小时。
对于每个培养皿，用5毫升磷酸缓冲液（实验者自行准备，本试剂盒不提供）洗去上述第一抗体工作液，重复三次。
对于每个培养皿，取2微升（2）号组分，加98微升（6）号组分，稀释成为第二抗体工作液，滴加于其中。室温孵育1小时。
对于每个培养皿，用5毫升磷酸缓冲液（实验者自行准备，本试剂盒不提供）洗去上述第二抗体工作液，重复三次。
对于每个培养皿，取（3）号组分100微升，加入0.1微升30%过氧化氢溶液（实验者自行准备，本试剂盒不提供），混合后成为底物工作液，滴加于其中。室温孵育15分钟。
对于每个培养皿，用5毫升磷酸缓冲液（实验者自行准备，本试剂盒不提供）洗去上述底物工作液，将经过免疫标记处理的各Hela细胞待测品依次置于显微镜下观察，比较染色程度的差异。
结果可见，经第一抗体工作液I处理后的Hela细胞待测品染色程度最深，其余经II、III、IV号第一抗体工作液处理后的Hela细胞待测品在染色强度上均有不同程度的减弱。这表明，三种单克隆抗体混合物对P16阳性细胞的标记效率确实高于其中任何一种抗体单独使用时的标记效率。
实施例六、针对多肽A、B、C的三种第一抗体的混合物与几种商品化小鼠抗人P16单克隆抗体标记效率的比较结果
从市场上购得不同品牌的小鼠抗人P16单克隆抗体三种，分别称为：品牌1、2、3号抗体。按它们所标称的原始浓度，统一稀释至浓度为1毫克/毫升母液。
将2微升（1）号组分，加98微升（6）号组分，稀释成为第一抗体工作液I；
将2微升浓度为1毫克/毫升的小鼠抗人多肽A单克隆抗体溶液（为构成（1）号组分的单克隆抗体之一），加98微升（6）号组分，稀释成为第一抗体工作液II；
将2微升浓度为1毫克/毫升的小鼠抗人多肽B单克隆抗体溶液（为构成（1）号组分的单克隆抗体之一），加98微升（6）号组分，稀释成为第一抗体工作液III；
将2微升浓度为1毫克/毫升的小鼠抗人多肽C单克隆抗体溶液（为构成（1）号组分的单克隆抗体之一），加98微升（6）号组分，稀释成为第一抗体工作液IV。
同样，将品牌1、2、3号母液以上述方法依次稀释成第一抗体工作液V、VI、VII号。
将105个Hela细胞铺于直径3厘米培养皿中，待细胞帖壁后，以70%乙醇固定24小时，倒去乙醇，用10毫升磷酸缓冲液（实验者自行准备，本试剂盒不提供）轻轻冲洗三次，作为待测样品。同法另行制备6个Hela细胞待测样品。
将第一抗体工作液I、II、III、IV、V、VI、VII号分别加入上述7个含Hela细胞待测品的培养皿中，室温孵育1小时。
对于每个培养皿，用5毫升磷酸缓冲液（实验者自行准备，本试剂盒不提供）洗去上述第一抗体工作液，重复三次。
对于每个培养皿，取2微升（2）号组分，加98微升（6）号组分，稀释成为第二抗体工作液，滴加于其中。室温孵育1小时。
对于每个培养皿，用5毫升磷酸缓冲液（实验者自行准备，本试剂盒不提供）洗去上述第二抗体工作液，重复三次。
对于每个培养皿，取（3）号组分100微升，加入0.1微升30%过氧化氢溶液（实验者自行准备，本试剂盒不提供），混合后成为底物工作液，滴加于其中。室温孵育15分钟。
对于每个培养皿，用5毫升磷酸缓冲液（实验者自行准备，本试剂盒不提供）洗去上述底物工作液，将处理后的Hela细胞待测品置于显微镜下观察、比较染色程度的差异。
结果可见，经第一抗体工作液I处理后的Hela细胞待测品染色程度最深，其余经V、VI、VII号第一抗体工作液处理后的Hela细胞待测品在染色强度上均有不同程度的减弱。这表明，三种单克隆抗体混合物对P16阳性细胞的标记效率确实高于这几种品牌的商品化小鼠抗人P16单克隆抗体单独使用时的标记效率。
另外，与II、III、IV号第一抗体工作液处理得到的Hela细胞待测品的染色程度相比，三种商品化小鼠抗人P16单克隆抗体的标记效率都比较接近。这表明，相对于单个的商品化小鼠抗人P16单克隆抗体，抗体混合物标记效率的提高并非来自于其中任何一个抗体成员标记效率的单独提高，而是三者联合应用后协同效应的结果。
实施例七、几种商品化小鼠抗人P16单克隆抗体对P16蛋白抗原表位的识别区域均不位于序列D表达产物所对应的P16蛋白氨基酸序列区域内。
从市场上购得不同品牌的小鼠抗人P16单克隆抗体三种，分别称为：品牌1、2、3号抗体。按它们所标称的原始浓度，统一稀释至浓度为1毫克/毫升母液。
将2微升（1）号组分，加98微升（6）号组分，稀释成为第一抗体工作液I；
同样，将品牌1、2、3号母液以上述方法依次稀释成第一抗体工作液V、VI、VII号。
取4个含阳性对照品（即（4）号组分）的培养皿，剪开保存塑料袋，倒去所有70%乙醇固定液。对于每个培养皿，以10毫升磷酸缓冲液（实验者自行准备，本试剂盒不提供）轻轻冲洗三次。
向每个培养皿中分别加入上述第一抗体工作液I、V、VI、VII号各100微升。室温孵育1小时。
对于每个培养皿，用5毫升磷酸缓冲液（实验者自行准备，本试剂盒不提供）洗去上述第一抗体工作液，重复三次。
对于每个培养皿，取2微升（2）号组分，加98微升（6）号组分，稀释成为第二抗体工作液，滴加于其中。室温孵育1小时。
对于每个培养皿，用5毫升磷酸缓冲液（实验者自行准备，本试剂盒不提供）洗去上述第二抗体工作液，重复三次。
对于每个培养皿，取（3）号组分100微升，加入0.1微升30%过氧化氢溶液（实验者自行准备，本试剂盒不提供），混合后成为底物工作液，滴加于其中。室温孵育15分钟。
对于每个培养皿，用5毫升磷酸缓冲液（实验者自行准备，本试剂盒不提供）洗去上述底物工作液，将各阳性对照品依次置于显微镜下观察、比较染色程度的差异。
结果可见，经第一抗体工作液I处理后的阳性对照品获得了染色，细胞呈褐色；但是，经V、VI、VII号第一抗体工作液处理后的阳性对照品均未得到有效染色，细胞呈无色或浅黄色。这表明，上述商品化小鼠抗人P16单克隆抗体所能识别的P16蛋白抗原表位并不位于序列D表达产物所对应的P16蛋白氨基酸序列区域内。
实施例八、针对多肽A、B、C的三种第一抗体的混合物与三种商品化小鼠抗人P16单克隆抗体混合物标记效率的比较结果
将2微升（1）号组分，加98微升（6）号组分，稀释成为第一抗体工作液I。
从市场上购得不同品牌的小鼠抗人P16单克隆抗体三种，分别称为：品牌1、2、3号抗体。按它们所标称的原始浓度，统一稀释至浓度为1毫克/毫升母液。将三者按体积比1：1：1混合。取出2微升混合物，加98微升（6）号组分，稀释成为第一抗体工作液VIII。
将105个Hela细胞铺于直径3厘米培养皿中，待细胞帖壁后，以70%乙醇固定24小时，倒去乙醇，用10毫升磷酸缓冲液（实验者自行准备，本试剂盒不提供）轻轻冲洗三次，作为待测样品。同法另行制备1个Hela细胞待测样品。
将第一抗体工作液I、VIII号分别加入上述2个含Hela细胞待测品的培养皿中，室温孵育1小时。
对于每个培养皿，用5毫升磷酸缓冲液（实验者自行准备，本试剂盒不提供）洗去上述第一抗体工作液，重复三次。
对于每个培养皿，取2微升（2）号组分，加98微升（6）号组分，稀释成为第二抗体工作液，滴加于其中。室温孵育1小时。
对于每个培养皿，用5毫升磷酸缓冲液（实验者自行准备，本试剂盒不提供）洗去上述第二抗体工作液，重复三次。
对于每个培养皿，取（3）号组分100微升，加入0.1微升30%过氧化氢溶液（实验者自行准备，本试剂盒不提供），混合后成为底物工作液，滴加于其中。室温孵育15分钟。
对于每个培养皿，用5毫升磷酸缓冲液（实验者自行准备，本试剂盒不提供）洗去上述底物工作液，将处理后的Hela细胞待测品置于显微镜下观察，比较染色程度的差异。
结果可见，经第一抗体工作液I处理后的Hela细胞待测品染色程度深于经第一抗体工作液VIII处理后的Hela细胞待测品。这表明，抗体混合物标记效率的提高与其所识别的具体P16蛋白表位区域有关，并非所有小鼠抗人P16单克隆抗体的等浓度组合都能产生协同效应。
实施例九、携带序列D的慢病毒和携带人P16蛋白编码基因的慢病毒感染RK13细胞后目标蛋白表达情况和标记效率的比较结果
按照通用慢病毒载体制备方法（即：仍然采用“实施例一”中提到的Invitrogen公司的货号为K4950-00的慢病毒构建试剂盒），将序列D和P16蛋白编码基因插入慢病毒载体质粒（双酶切位点同“实施例一”），分别构建成携带序列D的慢病毒和携带人P16蛋白编码基因（为含有P16蛋白完整编码区的互补DNA序列，约450碱基对）的慢病毒。
用于构建完整P16蛋白编码基因的互补DNA序列如下：
atggagccgg cggcggggag cagcatggag ccttcggctg actggctggc cacggccgcg
gcccggggtc gggtagagga ggtgcgggcg ctgctggagg cgggggcgct gcccaacgca
ccgaatagtt acggtcggag gccgatccag gtcatgatga tgggcagcgc ccgagtggcg
gagctgctgc tgctccacgg cgcggagccc aactgcgccg accccgccac tctcacccga
cccgtgcacg acgctgcccg ggagggcttc ctggacacgc tggtggtgct gcaccgggcc
ggggcgcggc tggacgtgcg cgatgcctgg ggccgtctgc ccgtggacct ggctgaggag
ctgggccatc gcgatgtcgc acggtacctg cgcgcggctg cggggggcac cagaggcagt
aaccatgccc gcatagatgc cgcggaaggt ccctcagaca tccccgattg a
其中，a指腺嘌呤，t指胸腺嘧啶，g指鸟嘌呤，c指胞嘧啶。
由携带序列D的慢病毒感染后得到的RK13细胞称为阳性对照品I，由携带人P16蛋白编码基因互补DNA序列的慢病毒感染后得到的RK13细胞称为阳性对照品II。两种阳性对照品都通过相同的病毒感染复数得到，即：用于感染的病毒数量为106，被感染的细胞数量为104，以保证两者具有同样的制备基础。
将6微升（1）号组分，加294微升（6）号组分，稀释成为第一抗体工作液I。将此工作液按每皿100微升加入分别含有阳性对照品I、阳性对照品II和Hela细胞（预先都经过70%乙醇固定）的三个直径3厘米培养皿中。室温孵育1小时。
对于每个培养皿，用5毫升磷酸缓冲液（实验者自行准备，本试剂盒不提供）洗去上述第一抗体工作液，重复三次。
对于每个培养皿，取2微升（2）号组分，加98微升（6）号组分，稀释成为第二抗体工作液，滴加于其中。室温孵育1小时。
对于每个培养皿，用5毫升磷酸缓冲液（实验者自行准备，本试剂盒不提供）洗去上述第二抗体工作液，重复三次。
对于每个培养皿，取（3）号组分100微升，加入0.1微升30%过氧化氢溶液（实验者自行准备，本试剂盒不提供），混合后成为底物工作液，滴加于其中。室温孵育15分钟。
对于每个培养皿，用5毫升磷酸缓冲液（实验者自行准备，本试剂盒不提供）洗去上述底物工作液，将各Hela细胞待测品依次置于显微镜下观察、比较染色程度的差异。
结果可见，染色程度从强到弱依次为：阳性对照品I>Hela细胞>阳性对照品II。这表明，慢病毒介导的P16蛋白编码基因在RK13细胞中的整合、表达量相对较低，其产物得到免疫标记的效率相对较差，不如以携带序列D的慢病毒感染哺乳动物细胞（即：RK13细胞）得到的产物更为有效。
实施例十、针对多肽A、B、C的三种第一抗体的混合物与几种商品化小鼠抗人P16单克隆抗体标记特异性的比较结果
取Hela细胞和Hela-P16neg细胞分别铺入直径3厘米的培养皿，待细胞贴壁后，以70%乙醇固定。制备含Hela细胞和Hela-P16neg细胞的培养皿各4个。
剪开阳性和阴性对照品保存塑料袋，倒去所有70%乙醇固定液，对于每个培养皿，以10毫升磷酸缓冲液（实验者自行准备，本试剂盒不提供）轻轻冲洗三次。按此法准备阳性和阴性对照品各4个。
从市场上购得不同品牌的小鼠抗人P16单克隆抗体三种，分别称为：品牌1、2、3号抗体。按它们所标称的原始浓度，统一稀释至浓度为1毫克/毫升母液。
将8微升（1）号组分，加392微升（6）号组分，稀释成为第一抗体工作液I；同样，将品牌1、2、3号母液以上述方法依次稀释成第一抗体工作液V、VI、VII号。
按每皿100微升的加样量，将第一抗体工作液I、V、VI、VII号分别加入上述4个Hela细胞待测品、4个Hela-P16neg细胞待测品、4个阳性对照品和4个阴性对照品的培养皿中，室温孵育1小时。
对于每个培养皿，用5毫升磷酸缓冲液（实验者自行准备，本试剂盒不提供）洗去上述第一抗体工作液，重复三次。
对于每个培养皿，取2微升（2）号组分，加98微升（6）号组分，稀释成为第二抗体工作液，滴加于其中。室温孵育1小时。
对于每个培养皿，用5毫升磷酸缓冲液（实验者自行准备，本试剂盒不提供）洗去上述第二抗体工作液，重复三次。
对于每个培养皿，取（3）号组分100微升，加入0.1微升30%过氧化氢溶液（实验者自行准备，本试剂盒不提供），混合后成为底物工作液，滴加于其中。室温孵育15分钟。
对于每个培养皿，用5毫升磷酸缓冲液（实验者自行准备，本试剂盒不提供）洗去上述底物工作液，将处理后的Hela细胞待测品置于显微镜下观察、比较染色程度的差异。
结果可见，在所有含Hela-P16neg细胞待测品的培养皿中，经第一抗体工作液I、V、VI、VII处理后，细胞染色结果均呈无色或浅黄色，与同样方法处理后的阴性对照品染色结果完全一致，故按“实施例四”标准，均可判断为阴性。在所有含Hela细胞待测品的培养皿中，经第一抗体工作液I、V、VI、VII处理后，细胞染色结果均呈褐色或深褐色，与经第一抗体工作液I处理后的阳性对照品染色结果较为接近，按“实施例四”的标准，均可判断为阳性；但经第一抗体工作液V、VI、VII处理后的阳性对照品均呈无色或浅黄色，按“实施例四”标准，均可判断为阴性。这表明，无论是抗体混合物还是商品化小鼠抗人P16单克隆抗体都能对Hela细胞表达的P16蛋白进行专一性的免疫标记。而且，当P16蛋白的表达受到抑制后，这些抗体都不会对待测细胞中的其他无关蛋白成分形成非特异性标记，造成假阳性染色结果。
以上具体实施方式各例中所称的用于对比的商品化抗人P16蛋白单克隆抗体购自美国Abcam公司（美利坚合众国，马萨诸塞州，剑桥市），Cell signaling科技公司（美利坚合众国，马萨诸塞州，波士顿市）和丹麦Dako公司（丹麦王国，格洛斯楚普自治市），三者为供应世界各国科研用单克隆抗体的主要生产企业。所述内容仅为本发明的较佳实施例而已，并非用来限定本发明的实施范围。即凡依本发明申请专利范围的内容所作的等效变化与修饰，都应为本发明的技术范畴。
Claims (3)
1.一种P16免疫细胞化学试剂盒，其特征在于：该试剂盒由第（1）-（6）号组分组成；其中：
第（1）号组分所含的第一抗体是三种小鼠抗人单克隆IgG抗体的混合物，三者浓度相同，按体积比1：1：1的比例混合；
第（2）号组分所含的第二抗体是偶联有辣根过氧化物酶的兔抗小鼠IgG多克隆抗体；
第（3）号组分所含的酶底物是二氨基联苯胺溶液；
第（4）号组分所含的阳性对照品是兔肾细胞RK13，经过慢病毒感染后，其基因组中整合有一段可表达的DNA序列D；由该序列转录翻译的产物为可以被上述三种单抗同时识别的多肽片段；
第（5）号组分所含的阴性对照品是不表达人P16蛋白的兔肾细胞RK13；
第（6）号组分所含的缓冲液为pH=7.4的磷酸缓冲液；
2.根据权利要求1所述的P16免疫细胞化学试剂盒，其特征在于：所述的构成第（1）号组分中的三个单克隆抗体分别由多肽A、B、C免疫小鼠，按常规单克隆抗体制备方法制备，并经过单次或多次筛选得到。
多肽A、B、C的具体序列信息如下：
多肽A（即：序列表中的SEQ ID NO.1）：MEPAAGSSMEPSADWAAAAAALPN
多肽B（即：序列表中的SEQ ID NO.2）：ARGRVEEVRALLEAGAAAAP
多肽C（即：序列表中的SEQ ID NO.3）：ALPNAPNSYGRRPIQVAAAAGSSME
上述多肽序列中，各单字母缩写的意义如下：G甘氨酸，A丙氨酸，V缬氨酸，L亮氨酸，I异亮氨酸，F苯丙氨酸，W色氨酸，Y酪氨酸，D天冬氨酸，H组氨酸，N天冬酰胺，E谷氨酸，K赖氨酸，Q谷氨酰胺，M甲硫氨酸，R精氨酸，S丝氨酸，T苏氨酸，C半胱氨酸，P脯氨酸。
3.根据权利要求1所述的P16免疫细胞化学试剂盒，其特征在于：在所述的第（4）号组分中，作为阳性对照品的RK13细胞基因组中含有一段可表达的序列D：
DNA序列D（即：序列表中的SEQ ID NO.4）的序列信息如下：
atggcgggga gcagcatgga gccttcggag gaggaggagg aggtgcgggc gctgctggag
gaggaggagg aggagaggcc gatccaggtc atgatgatgg gcgaggagga ggaggagccg
aatagttacg gtcggaagga ggaggaggag gaggtgcggg cgctgctgga ggaggaggag
gaggagccga atagttacgg tcggaagtga
在上述序列D中：a指腺嘌呤，t指胸腺嘧啶，g指鸟嘌呤，c指胞嘧啶。
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