KR910002957B1 - 췌장의 α-아밀라제를 정량하는 방법 및 시약 - Google Patents

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Abstract

내용 없음.

Description

췌장의 α-아밀라제를 정량하는 방법 및 시약
본 발명은 타액의 α-아밀라제 존재하에 췌장의 α-아밀라제를 정량하는 방법 및 시약에 관한 것이다.
α-아밀라제(E.C.3.2.1.1)는 1,4-배당체 결합의 불규칙적인 가수븐해에 의해서 1,4-α-배당체 결합된 올리고-및 다당류를 절단하여 맥아당 및 맥아-올리고당류로 분해한다. 본 효소는 발효 산업뿐만 아니라 임상 분석 및 진단영역에 상당히 중요하다. 그러므로, 여러 질병의 경우에 혈청, 소변 및 십이지장의 분비물같은 체액내의 α-아밀라제 함량은 상당히 변화한다. 그러나 체내에는 근본적으로 두가지의 α-아밀라제, 즉 췌장의 효소 및 타액의 효소가 존재한다. 췌장의 효소만이 진단에 중요하기 때문에 드물게 그리고 단지 소량의 추가 효소 존재하에서 두 α-아밀라제를 분석적으로 구별하는 문제가 생긴다.
이때 어려운점은 다층형 물질의 구조가 유사하고 면역학적으로 동일하다는 것이다(K.Lorentz, Laboratoriumsblatter, 32,118/1982 참조). 타액 효소의 활성을 제거하기 위해 음이온 교환수지에 흡착, 소맥 단백질 또는 전기영동법 또는 등전접속법에 의한 저지를 사용하는 것이 공지되어있다. 그러나 이 방법물은 분리효과가 불충분 하거나 정상적인 진단이 곤란하다.
상기된 방법중에서 Clin.Chem., 28/7,1525-1527/1982에 기재된 소맥에서 얻은 저지제에 의해 타액의 효소를 저지하는 방법만이 정상적인 진단에 허용가능한 시간이 소요되지만 선택성은 만족스럽지 못하다. 최적 저지농도의 경우일지라도 타액의 효소활성도가 약 13%로 유지되며 반면에 췌창의 효소 활성도는 약81%까지 감소한다.
미공개공 유럽 특허출원 제 84 114 172.4호에는 타액의 α-아밀라제와 반응하여 그 결과 췌장의 α-아밀라재와의 혼합 반용성(cross-reactivity)이 5% 혹은 그 이하인, 단일크론 항체(monoclonal antibody) 존재하에 작업하여 타액의 α-아밀라제 존재하에 췌장의 α-아밀라제를 정량하는 겻이 이미 제안되었다. 단일크론 항체와 함께 침전 시약을 부과하는 경우에 타액의 α-아밀라제와 불용성 착물을 형성케하고 이들용액으로 부터 용액내에 분리시켜 췌장효소만이 용액에 남도록한 후 이를 정량하는 겻이 가능하다. 또한, 이와는 달리 고정된 형태의 단일크론 항체를 사용하여 타액의 아밀라제를 분리하는 겻이 가능하다. 그러나 두 경우에 불용성 상을 형성하여 용해성 상으로 부터 분리하는 것이 필요하다.
그러므로 이러한 난점을 극복하고 상 분리 작업없이 체액내에서 타액의 α-아밀라제 존재하에 췌장의α-아밀라제의 빠르고 단순하며 믿을수 있는 정량을 가능하게 하는 방법 및 시약을 제공하는 겻이 본 발명의 목적이다.
따라서 본 발명에 따라 타액의 α-아밀라제와 반응하는 단일크론 항체의 존재하에 α-아밀라제를 정량하기 위한 시스템과 반응시킴에 의해, 특히 혈청, 혈장, 십이지장 액 또는 소변등의 체액내의 타액 α-아밀라제 존재하에 췌장의 α-아밀라제를 정량하는 특이 방법이 제공되는데, 여기서 단일크론 항체는 타액의효소를 저지하지만 50% 이상 췌창의 효소를 저지하지는 못한다.
본 발명에 따로는 방법은 타액의 효소는 저지하고 췌장의 효소는 저지하지 않는 단일크론 항체의 놀라운 발견에 기초한다. 타액 및 췌장의 효소는 면역학적으로 동일하다고 알려졌기 때문에 이것은 기대되지 않았었다(Gerhard Pflelderer, Lab Med.,7, 189-193 , K.Lorentz ,loc.cit. 참조).
"효소의 면역분석-개판"pp 4-9, 1983에서 M.K.Schwarz는 타액의 α-아밀라제에 대한 항체는 타액형효소를 78%, 췌장의 효소를 75% 저지한다고 기재하였다. 그러므로 선택적이며 매우 특이적인 저지에 의해, 두 효소를 실질적으로 정량 식별하는 단일 크론 항체의 개발은 가능하다고 예상되지 않았다. 본 발명의 바람직한 항체의 경우 타액 효소의 95% 이상의 저지가 성취된다.
본 발명에 따른 방법에 사용된 신규한 단일크론 항체들은 NCACC(National Collection of Animal CellCultures, Porton Down, 영국)에 (99 D 12) 84122003 및 (89E2) 84122004의 번호로 기탁되어 있다.
본 발명에 따른 항체는 친연의 혹은 변성된 타액 α-아밀라제에 의해 면역된 실형 동물로 부터 얻을수 있는데, 면역된 동물의 B-임파구를 변형제(transfonning agent)와 융합시키고 단일크론 항체를 생성하는 혼성세포를 클로닝(cloning) 및 배양하고 이로부터 분리하여 얻는다. 특히 타액 α-아밀라제 항체의 재조에 적당한 동물은 쥐 및 새앙쥐이다.
면역하는데 사람의 천연 타액 α-아밀라제, 혹은 변성된 타액 아밀라제를 이용하였다. 이 목적을 위해 천연 효소가 사용된 경우, 전기 영동으로 균질하게 한 시판 조제를 이용할 수 있다. 화화적으로 변색된 타액 α-아밀라제는 독일연방공화국 특허 명세서 제 25 43 994호에 기술된 공지의 효소 변성 방법에 의해 연을 수 있다.
변성법으로 적당한 것은 N-브로모숙신이이드(NBS)에 의한 단백질중의 트립토판(typtophan)군의 산화(BBA,143,462-472/1967), 주로 히스리딘에 작용하는 요오드아세테이트(IAA)에 의한 카복시메탈화, 또는 테트라니토로 메탄(TNM)에 의한 질화(J.Biol.Chem.,283 3307/1963), 디아조화된 설프아닐린산에 의한 디아조화(Meth.Enzymol.,25,515-531/1972)등이다.
TNM에 의해 변성된 효소가 Balb/c 새앙쥐를 이용하는데 가장 적합하였으며, 혹은 AJ 새앙쥐를 이용하는 경우에는 천연 효소가 적합하였다.
천연 혹은 변성된 효소를 바람직하게는 보조제와 결합된 일반적인 투여에 의해 면역하였다. 보조재로써 보더텔라 퍼투시스(Bordetella pertussis)와 함께 수산화 알루미늄을 사용하는 겻이 바람직하있다.
AJ 새앙쥐를 면역하는데 천연의 타액 α-아밀라제를 사용하거나 또는 Balb/c 새앙쥐를 면역하는데 TNM-변성된 타액 α-아밀라제를 사용한다면, 면역화는 적어도 9개월 이상 기간동안에 최저 7회(주사 I. P )이상 면역으로 수행되었다.
면역 후에, 통상적인 방법에 따라 면역된 동물의 B-임파구를 변형제와 융합하였다. 본 발명의 범위내에서 이용한 변형체의 예로는 골수종세포, 변형 비루스(virus), 예를들어 엡스테인-바(Epstein-Barr) 비루스, 혹은 독일연방공화국 특허 명세서 제 32 45 665호에 기재된 시약들이다. 융합은 Koehler 및 Milstein의 방법에 따라 수행되었다.(Nature,256,495-497/1975). 이 결과 형성된 혼성 세포는 시판용 세포 분별제를 이용하는 동의 통상적인 방법에 의해 클론(clone)화하고, 소기의 단일크론 항체를 형성하는 클론 배양하있다. 혼성 세포의 암성 증식에 기초하여 이들은 불특정 시간동안 배양할 수 있으며 원하는 양의 소기 단일크론 항체를 제조할 수 있다. 이렇게 어어진 단일크론 항체를 사용하여 체액으로 부터의 타액 α-아밀라제를 정량적으로 저지할 수 있으므로 잔존 아밀라제 활성은 췌장의 α-아밀라제에 기인한 것이 될 수 있다.
본 발명에 따른 정량 방법은 단일크론 항체 자체 혹은 그것과 동일한 면역성을 지닌 단편(Fc단편)을 이용한다. 따라서 "단일크론 항체"라는 표현은 또한 단편을 의미함을 이해하여야 할 것이다. 완전한 항체뿐아니라 그로부터의 단편물로 부동화 형태로 이용되어질 수 있다.
놀랍게도 본 발명에 따른 단일크론 항체는 췌장의 α-아밀라제에 대해 5% 이하의 저지율만을 보이며, 대부분의 경우 오직 1%의 저지율만을 보이며, 어떤 경우는 측정 한계 범위보다도 낮은 저지율을 나타낸다. 따라서 이미 알려진 맥아로부터 얻어지는 저지물질, 혹은 앞서 언급한 특허출원의 결합성 단일크론 항체보다 본 발명의 단일 크론 항체가 체액내 췌장 α-아밀라제의 특이적 정량에 보다 적합하다.
α-아밀라제의 정량은 이러한 목적을 위해 공지된 방법에 따라 수행되어진다. 본 발명에 따른 단일 크론항체는 타액형의 α-아밀라제를 선택적으로 저지하기 때문에 단일 크론 항체의 존재하에 측정되는 α-아밀라제 정량치는 췌장 효소에 의한 활성이다.
본 발명에 따른 방법은 분자내에 4 부터 7의 포도당 잔사를 가지는 말토폴리오스(maltopolyose), 맥아당가인산분해효소, β-포스포클루코뮤타제, 6-인산염-포도당 탈수소 효소 및 NAD로 구성된 α-아밀라제검출 시스템(system)을 사용해서 수행하는 것이 바람직하다.
본 발명의 범위대에서 더욱 바람직한 시스템은 분자내에 4 부터 7까지 포도당을 포함하는 니트로페닐말토폴리오스 및 α-클루코시다제를 포함하는 α-아밀라제 검출 시스템이다.
더욱 바람직한 α-아밀라제 검출시스템은 정량 가능한 기로 변성된 전분을 포함하는 것이다. "변성 전분"에는, 예를들어 시판용 Sweden, Pharmacia 제품, "Phadebas" 또는 독일연방공화국 특허 명세서 제28 12 l54호에 기재된 생성물과 같은 정량가능한 기로 변성된 전분 및, 카복시메틸전분 및 한계 댁스트린(boundary dextrin)과 같은 분해 특성이 변성된 전분이 포함된다. 이들 모든 시스템은 공지되어 있으므로 여기서 자세히 기술하지 않는다.
본 발명 방법의 실시를 의해서, 시험액은 본 발명에 따른 항체와 함께 바람직하게 배양하고, 이후로는 직정 재래식 아밀라제 시험에 이용한다. 배양 시간은 행체의 활성도에 좌우되는데 15분 내지 30분이 바람직하다.
타액 α-아밀라제의 분리를 원한다면 단일크론 항체는 완전한 형태로 존재하던가 단편의 형태로 존재하며 면역 수착지 혹은 인조 수지튜브 혹은 관의 표면과 같은 고체 운반체에 고정된 형태로 존재할 수 있다. 이러한 방법으로 타액형 α-아밀라제는 운반체, 즉 고체상에 결합되케게 된다.
여러 다른 클론(clone)으로 부터 생성된 본 발명에 따르는 저지 단일 크론항체를 혼합해서 얻어진 단일크론 항채제제의 이용 또한 가능하다.
본 발명은 또한 체액내에, 특히 혈청, 십이지장액, 혈장 혹은 소변내의 타액 α-아밀라제의 존재하에 췌장의 α-아밀라제를 특이적으로 정량하는 시약을 제공하는데, 이 시약은 α-아밀라제를 검출하는 시스템 및 타액효소를 특이적으로 저지하고 췌장 효소는 저지하지 않는 (혼합 반응율＜50%)단일 크론 항체를 포함한다.
본 발명의 시약에 포함된 α-아밀라제의 검출을 위한 시스템 및 기타의 조건은 정량방법에서 설명할 것이 적용된다.
본 발명은 체액에서 타액형 α-아밀라제 존재하에, 췌장 α-아밀라제의 간단하고 신속하게 또한 고도의 특이적인 정량을 가능하게 하였고, 따라서 임상적 진단의 가능성을 개선시켰다.
다음의 실시예는 본 발명의 설명을 위한 것이다.
[실시예 1]
A) AJ 새앙쥐를 수산화알루미늄내의 100㎍ 사람타액 아밀라제로 보더텔라 퍼투시스(Bordetella Pertussis)와 함께 면역시킨다. 약 8주간의 주기로 3-4회 더 면역시키는데 각 경우 같은 보조제 대에서 50㎍의 사람 타액 아밀라제를 사용한다. 융합하기 4일전 생리 식염수대의 50㎍의 타액 아밀라제로 정맥으로 마지막 면역시킨다.
B) Balb/c 새앙쥐를 수산화알루미눔내의 TNM-변성된 사람 타액 아밀라제 100㎍로 보더텔라 퍼투시스와 함께 면역시킨다. 약 8주간의 주기로 3-4회 더 면역시키는데 각 경우 같은 보조제내의 50㎍의 사람TNM 타액 아밀라제를 사용한다. 융합하기 4일전 생리 식염수를 사용해서 50㎍의 타액 아밀라제를 정맥으로 마지막 면역을 행한다.
C) 비장세포와 Ag 8.653(ATCC CRL 1580) 흑은 SP2/0(ATCC CRL 1581)의 골수종 세포와의 융합은J.of Imm Meth ,39, 285-308에 기재된 표준 방법에 따라 수행했다. 비장세포와 골수종 세포의 융합비는5 : 1이다.
융합 생성물은 20 내지 24 배양 접시(costar)에 접종하고 각 배양접시에 5×104개의 복막 상줄액 세포(peritoneal exudate cell)를 공급하있다. 융합을 하고 3 내지 4주후, 양성 일차 배양물(실시예 3 참조)은 형광-활성화된 세포 분류계외 도움으로 클론으로 만들었다. 세포를 96개의 Costar단에 나누고 2×104개의 목막 삼출액 세포를 공급하였다. 배지로서는, 10%의 태아 송아지 혈청과 함께 시판되는 RPMI 1640 배지를 사용한다(J.A.M.A.,l99,519/1957에 기재).
[실시예 2]
테토라니트로메탄(TNM)으로 α-아밀라제의 변성
5.2㎎의 사람 타액 아밀라제(Sigma)를 1.6㎖의 tris 완충용액(90mM tris HCl,1mM 염화칼슘 : pH8.0)에 용해시킨다. 교반하면서 10% v/v의 무수 에탄올내 테트라니트로메탄(Roth)을 10㎕를 첨가한다. 혼합액을 상온에서 12시간 동안 방치한다. 단백질을 위에서 언급한 완충용액에 대해 하룻밤 동안 투석 시킴으로써 과량의 테트라니트로메탄으로 부터 분리한다. 381㎚에서의 흡광도 측정은 α-아밀라제 한 분자당 2.6개 니트로기를 나타낸다.
[실시예 3]
면역된 새앙쥐의 헐청, 혹은 혼성 세포 배양의 상등액, 폭은 복수(腹水)내의 아밀라제-저지 항체의 농도와 특이성을 화실히하기 위한 검색법으로 아밀라제 저지 시험법을 사용하였다.
이를 위하여, 96개의 엘리사(ELisa) 평판(Nunc)에 완충용액(50mM tris, 1% 소혈청 알부민, 0.1M 염화나트륨; pH 7.5)에 포함된 췌장 및 타액 아밀라제 50㎕(약 400mU/㎖)을 부가하고 시험할 용액(예를들어 배양 상등액) 50㎕와 함께 20분동안 전배양한다.
그후 50㎕의 아밀라제 기질(4-니토로폐닐 말토헵타오시드; Boehringer Mannheim GmbH, Order No.56 85 89)을 사용하여 효소 반응을 시작한다. 상온에서 20-60분 후에 흡광도는 405㎚에서 광도계(Elesa-Reader, Kontro, 스위스)로 측정한다.
다음의 바교치토 동시애 측정한다 :
1. 신선한 배양 매체(실시예 1C 참고)
2. 유럽 특허출원 제 84 114 174.2호 클론의 배양 상등액
3. 맥아 저지제(유럽 특허 명세서 제 00 79 793호), 농도 2㎍/㎖ 및 0.2㎍/㎖
다음의 결과는 위에서 언급한 시험에서 얻은 것이다 :
[저지율 %]
Figure kpo00001
모든 일차 배양액의 약 4%로 부터, 특이적 타액 아밀라제-저지 활성이 발전되었으며 혼합 반응물은10% 이하였다.
[실시예 4]
[복수 배지의 제조 및 활성 측정]
1-2×106개의 혼성 세포(실시예 1에 따라 제조)를 0.5㎖ pristan(Sigma, No.T7640)으로 1회 내지 2회전 처리된 새앙쥐의 복강내로 주사한다. 약 15-20일후에 각 새앙쥐 당 3-5㎖의 복수를 취출하면 이에 약10㎎ IgG/㎖이 포함되어 있다.
200㎍/㎖의 농도에서, 단일 크론 항체 89E2는 사람 타액 α-아밀라제(800mU/㎖)을 95% 이상 저지하지만 사랍 췌장 α-아밀라제는 2% 이하로 저지한다(실시예 3에 기술한 것과 유사한 방법).

Claims (15)

  1. 타액의 α-아밀라제와 반응하는, 그중에서도 타액 효소를 특이적으로 저지하지만 췌장 효소는 50%이상 저지하지 않는 단일 크론 항체 존재하에 α-아밀라제 검출을 위한 시스템(system)과의 반응으로, 타액 α-아밀라제 존재하에 체액, 특히 혈정, 혈장, 십이지장액 혹은 소변내의 췌장 α-아밀라제 특이 정량을 위한 방법.
  2. 제1항에 있어서, AJ 새앙쥐를 천연, 혹은 변성된 타액 아밀라제로 면역시키고 면역된 동물의 B-입파구를 변형제와 융합하고, 클로닝하고 형성된 혼성 세포를 배양하고 그로부터 분리하여 얻은, 단일크론항체를 사용하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 테트라니트로메탄, N-브로모숙신이미드, 요오드아세테이트, 혹은 디아조화 설포아닐린 산에 의해 변성된 타액의 α-아밀라제로 Balb/c 새앙쥐를 면역시키고 면역된 동물의 B-입파구를 변형제와 용합하고, 클로닝하고 형성된 혼성 세포를 배양하고 그로부터 분리하여 얻은, 단일 크론 항체를사용하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 단일 크론 항체를 NCACC No.84122003, 및 NCACC No. 84122004에서 선택한방법.
  5. 제2항에 있어서, 수산화 알루미늄 및 보더텔라 퍼투시스로 구성되는 보조제 존재하에 면역시키는 방법.
  6. 제2항, 또는제5항에 있어서, 변형체가 골수종 세포로 구성되는 방법.
  7. 제1항, 제2항 또는 제3항중 어느 한 항에 있어서, 단일 크론 항체가 부동화 형태인 방법.
  8. 제1항, 제2항 또는 제3항중 어느 한 항에 있어서, 췌장의 α-아밀라제의 검출을 위한 시스템이 분자내에 4 부터 7까지 포도당 잔사를 가지는 말토폴리오스, 맥아당 가인산 분해효소, β-포스포글루코 뮤타제, 포도당-6-인산염 탈수소효소 및 NAD로 구성되는 방법.
  9. 제1항, 제2항 또는 제3항중 어느 한 항에 있어서, 췌창의 α-아밀라제 검출을 위한 시스템이 분자대에 4 부터 7까지 포도당 잔사를 가지는 니트로페닐말토폴리오스와 함께 α-클루코시다제로 구성되는 방법.
  10. 제1항, 제2항 또는 제3항중 어느 한 항에 있어서, α-아밀라제의 검출을 위한 시스템이 정량가능한 기로 변성된 전분으로 구성되는 방법.
  11. α-아밀라제의 정량을 위한 시스템 및 타액효소를 특이적으로 저지하지만 췌장효소는 50% 이상 저지하지 않는 타액 α-아밀라제에 대한 단일크론 항체를 포함하는, 타액 α-아밀라제가 존재하는 체액내, 특히 혈청, 혈장, 십이지장액 혹은 소변내에서 췌장의 α-아밀라제를 특이적으로 정량하는 시약.
  12. 제11항에 있어서, 췌장의 α-아밀라제를 검출하기 위한 시스템이 분자내에 4부터 7까지 포도당 잔사를 가지는 말토폴리오스, 맥아당 가연산 분해효소, β-포스포클루코뮤타제, 포도당-6-인산염 탈수소 효소 및 NAD로 구성되는 시약.
  13. 제11항에 있어서, 췌장의 α-아밀라제의 검출을 위한 시스템이 분자내에 4 부터 7까지 포도당 잔사를 가지는 니토로페닐말토폴리오스 및 α-클루코시다제로 구성외는 시약.
  14. 제11항에 있어서, 췌장의 α-아밀라제의 검출을 위한 시스템이 정량가능한 기로 변성된 전분으로 구성되는 시약.
  15. 제3항에 있어서. 수산화 알루미늄 및 브데텔라 퍼투시스로 구성되는 보조제 존재하에 면역시키는 방법.
KR1019860000070A 1985-01-09 1986-01-09 췌장의 α-아밀라제를 정량하는 방법 및 시약 KR910002957B1 (ko)

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