JPS62236494A - シグナルペプチダ−ゼに対するモノクロ−ナル抗体、およびそれを産生するハイブリド−マ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規な抗大腸菌出来すポプロテインシグナルペ
ブチダーゼ抗体、および該抗体を産生ずるハイブリドー
マに関する。

以下、大腸菌出来リボプロティンシグナルペプチダーゼ
をＬＳＰと、抗大腸菌由来すポプロテインシグナルペブ
チダーゼモノクローナル抗体を抗ＬＳＰモノクローナル
抗体と記す。

分泌蛋白およびペリプラズマ・外ｊ漠に局在する蛋白の
多くは、Ｎ末端に１シグナル配列（シグナルペプチド）
”を有する前駆体の形で細胞質内で生合成される。その
後、細胞質膜（内股）を透過する際、そのシグナルペプ
チドが除去され成熟蛋白がペリプラズマ・外股へ移行・
分泌される。シグナルペプチドの除去番こ働くのが、シ
グナルペプチダーゼという酵素である。シグナルペプチ
ドおよびシグナルペプチダーゼは、蛋白の細胞ＶＭ１模
透過に重要な役割を担っていることが、遺伝学的・生化
学的研究により明らかになっている。

大腸菌の細胞表層に存在する、主侠外膜リポプロティン
やペプチドグリカン結合リポプロティンに代表される各
種のリポプロティン類は、Ｎ末端にシグナルペプチドを
有したグリセライド含有前駆体蛋白として生合成され、
細胞質膜上で、リポプロティンシグナルペプチダーゼ（
ＬＳＰ）によってシグナルペプチドが切断され、成熟蛋
白となる。ＬＳＰは、大腸菌内に微量にしか存在しない
為、精製および性状決定が困難であったが、近年、組換
えＤＮＡ手法を利用し、ＬＳＰ遺伝子がクローニング・
発現されて大垣に生産する道が開かれた。その結果、全
１ＪＮＡ塩基配列およびアミノ酸配列が同定された　（
Ｙｕ　　ｅｔａ）、、　　ＦＥＢＳ　　Ｌｅｔｔｅｒｓ
　　１７８　　、　　２６４−２６８．１９８４）。

ＬＳＰを抗原として選択的に認識するモノクローナル抗
体を提供できれば、核抗体をアフィニティクロマトグラ
フィーに用いることによってＬＳＰを容易に精製するこ
とができる。ＬＳＰ精製品は、遺伝子工学的に生理活性
蛋白を成熟蛋白（ｍａｔｕｒｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　）と
して製造する場合等に用いられる。

現在、動物やヒト由来の生理活性蛋白遺伝子を、遺伝子
工学技術を用いて大腸菌等の原核細胞へ移入し発現させ
ることにより生理活性蛋白を製造することが行なわれて
いる。通常、それらの蛋白は、封入体（ｉｎｃｌｕｓｉ
ｏｎ　ｂｏｄｙ）として原核細胞の細胞質内に蓄積され
るが、　ｏｍｐＡ。

、ｏｍｐＦ％ｐｈｏＡおよび１ｐｐなどに由来するシグ
ナル配列遺伝子を目的とする蛋白の遺伝子上流へ連結さ
Ｃた発現ベクターを構築することによって、ペリプラズ
ムへ分泌させる工夫がなされている。後者の分泌型発現
系は、蛋白分解酵素による分解を受けにくいことや、蛋
白の回収が容易などの利点を持ち、工業的生産に適して
いる。しかしながら、この系においても必ずしもすべて
の蛋白が成熟蛋白とならずに前駆体蛋白として存在する
などの欠点がある。その解決策の一つとして、シグナル
ペプチダーゼによってシグナル配列部位を人工的に除去
する方法がある。すなわち、リポプロティン由来のシグ
ナル配列を利用した分泌型発現系においては、菌体破砕
懸濁液をＬＳＰ処理することによって、混在する前駆体
蛋白を成熟蛋白へ人工的に変換でき、均一な成熟蛋白標
品として得ることが可能となる。

本発明は、大腸菌由来リポプロテインシグナルペブチダ
ーゼ（ＬＳＰ）と反応するモノクローナル抗体、および
該抗体を産生ずるハイブリドーマを提供するものである
。

本発明を以下、詳細に説明する。

抗原としての大腸菌由来リポプロティンシグナルペプチ
ダーゼ（ＬＳＰ）とは、大腸菌からＹａｍａｄａら（Ｆ
ＥＢＳ　　Ｌｅｔｔｅｒｓ　１６６．１７９−１８２゜
１９８４　’）の方法によって単離・精製されるアミノ
酸残基１６４ケからなるプロリポプロティンをリポプロ
ティンに変換する活性、すなわちリポプロティンシグナ
ルペプチダーゼ活性をもつ酵素蛋白（Ｙｕ　ｅｔｏｌ、
、　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　１７８゜２６４−２６
８．１９８４）を意味する。

本発明のハイブリドーマは、Ｋδｈｌｅｒ　（Ｎａｔｕ
ｒｅ２５６．４９５−４９７．１９７５）の方法として
知られる手法によって樹立される。すなわち１　ＬＳＰ
でマウスを免疫した後、このマウスの肺臓細胞をマウス
骨臓腫細胞と融合させる。

その後、生合成阻害剤を含む選択培地を用いた培養にお
いて増殖してくる融合細胞を得る。その培養上清中に含
まれる抗体活性を、通常の免疫学的測定法、主としてＥ
ＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ　１　ｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏ
ｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ）法によってスクリーニン
グし、ＬＳＰと特異的に反応する抗体を産生ずる細胞株
を得る。次いで、軟寒天（ｓｏｆｔ　ａｇａｒ）法、限
界希釈（ｌｉｍｉｔｉｎｇ　ｄｉｌｕｔｉｏｎ）法、又
は、シングルセルマニュピレーシ、ン（ｓｉｎｇｌｅ　
ｃｅｌｌｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ　　）法の手法によ
りクローニングを行ない、ＬＳＰとのみ反応する抗体を
分泌し、かつモノクローン（単一性クローン）由来の細
胞株、いわゆるハイブリドーマを得る。

本発明の抗体は、該ハイブリドーマを組織培養用プレー
トに接種して、無血清培地や血清を含む通常の動物細胞
用培地で培養することによって、又はブリスタンを前投
与したマウス等の動物に接種し生体内培養することによ
って得る。

得られた抗体は、通常の蛋白精製に用いられる生化学的
手法、たとえば硫酸アンモニウムによる沈殿法、イオン
交換クロマトグラフィー法、ゲルろ過性およびアフィニ
ティクロマトグラフィー法によって精製される。

該抗体はアフィニティクロマトグラフィーへ応用され、
ＬＳＰの精製に利用される。

以上、本発明の基本となるものである。

次に実施例をあげて、本発明をさらに具体的に説明する
が、本発明はこれのみに限定されないことは口うまでも
ない。

実施例１ 抗ＬＳＰモノクローナル抗体の作製 （１）　　抗原の調製 ｔｒｐプロモーターおよびｊｓｐＡ遺伝子をランナウヱ
ー・ベクターｐＳＹ８４８にクローニングしたｐＹＫＲ
１６０Ｔ　　プラスミドをもつ大腸菌Ｅ、　ｃｏｌｉＪ
Ｅ５５０６（Ｙｕ　ｅｔ　ａ７　、　ＦＥＢＳＬｅｔｔ
ｅｒｓ、　１７８　、２６４−２６８　、１９８４　）
をアルギニン５０　”／／ｌ　、ヒスチジン５０〜／ｌ
　、　　プロリン５０η７ｔ、０．２％　　カザアミノ
酸、カナマイシン５０”？／７１０．２％グルコースを
含むＭ９培地（以下、Ｍ　９−　ｇｌｕｃｏｓｅ培地と
略）にて培養、Ｙａｍａｄａら（ＦＥＢＳ　　Ｌｅｔｔ
ｅｒｓ。

１６６．１７９−１８２．１９８４）記載の方法によっ
てＬＳＰを単離・精製した。

マウスの免役に抗原として用いたＬＳＰには、リポ多糖
体ＬＰＳが８．５　％　（Ｗ／’Ｗ）含まれた。

一方、アッセイ用抗原としてのＬＳＰ標品は、ＳＤＳ／
ポリアクリルアミド電気泳動による分析（シルバー染色
による検出）で単一バンドを示し、ＬＰＳを全く含まな
かった。

ＬＳＰの精製法を以下に略記する。大腸菌Ｊ　Ｅ　５５
０６　／　Ｉ）ＹＫＲ１６０ＴをＭ　ｇ　−ｇ　１ｕｃ
ｏｓｅ培地にて８０°Ｃで前培養、１０倍容量の新しい
同培地を添加、８７°Ｃにて１２時間振盪培養した。集
菌後、Ｃｅ１ｌ　Ｍｉ　１１　（Ｅｄｍｕｎｄ　Ｂ　Ｏ
ｈｌｅｒ　）にて波曲した。未破砕菌体を低速遠心分離
によって除去後、６６、０００　）ｌ、８０分間遠心分
離し細胞膜（ｃｅｌｌ　ｅｎｖｅｌｏｐｅ　）画分を得
た。

次イテ、１．６　％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００を含む
ｔｏｍＭナトリウムリン酸緩衝液（Ｎａ−ＰＢ　：　ｐ
Ｈ７，１）にてａｏ’ｃａｏ分間インキュベートし、６
５，０００×９８０分間の遠心分離操作にて上清を得た
。

８０饅飽和硫酸アンモニウム画分をＤＥＡＥイオン交換
カラムクロマトグラフィー（ＤＥ−５２：ファルマシア
）にかけ、０〜０．２５　ＭＮａｃｌを含むＬ　％Ｔｒ
ｉｔｏｎ　Ｘ−１００，２ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭ　Ｔ
ｒｉｓ　−ＨＣｔ　ｐＨ７，８ｉｃて溶出した。ＬＳＰ
を含むピーク画分をこ２．５倍電のイソプロパツールを
加え、室温にて１０分間放置、遠心後。

沈殿を１　％　Ｓ　Ｄ　Ｓ　、　０．２　Ｍ　Ｎａ−Ｐ
Ｂ　ｐＨ７，１に溶かし、高速液体クロマトグラフィー
ＨＰＬＣ（東洋ソーダＧ８０００　ＳＷ　ｃｏｌｕｍｎ
）にて分離・精製した。史にＳＤＳ・１５チポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動で分離後、ＬＳＰ画分を集めａＷ
ｉした。

（２）免疫肺臓細胞の調製 フロイントの完全アジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓｃｏ
ｍｐｌｅｔｅ　ａｄｊｕｖａｎｔ　；　ＦＣＡ　）と混
和した抗原ＬＳＰ　　５０μｆを、ＢＡＬＢ／Ｃマウス
（雌、４週令）へ腹腔内投与した。その後％　２週間隔
にて８度、フロイントの不完全アジュバント（Ｆｒｅｕ
ｎｄ’ｓ　　ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ　　ａｄｊｕｖａｎ
ｔ；ＦＩＡ）と混和したＬＳＰ５０μｆを腹腔内投与し
た。約ｌカ月後、５０ｍＭ　　リン酸［１液ｐＨ７，０
に溶解されたＬＳＰ５０μりを静脈内投与することによ
って追加免疫した。その８日後にｍ臓を摘出、イーグル
のＭＥＭ培地（平井化学）に懸濁された１ｌＩｌＩＩＰ
ＪＩ＆細胞を得た。

（８）細胞融合 マウス骨髄腫細胞Ｐ８／Ｎ５−１／ｌ−Ａｒ１−１（Ｍ
Ｓ−１）を１０チウシ胎児血清ＦＣ５（Ｇｉｂｃｏ）加
ＲＰＭＩ−１６４０培地（平井化学）中で培養し、対数
増殖期で細胞を集め細胞融合に用いた。融合方法は、Ｋ
ｂｈｌｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ　。

２５６．４９５−４９７．１９７５）の方法に準じた。

すなわち、１ｌｉｌｌｌ緘細胞と骨髄腫細胞とを１０：
ｌの比率で血清不含のＲＰＭＩ−１６４０培地に懸濁し
、７分間１　、ＯＯＯｒｐｍ　（トミー精工ＣＤ−１０
０Ｒ）にて遠心分離した。沈査に、３７°Ｃに保温され
た４　５　Ｓ　（Ｗ／’Ｗ）ポリエチレングリ：７−＃
（ＰＥＧ　）　６０００の溶ｆ＆　１　ｍｌを１分間か
けて添加し、さらに室温（２８±８°Ｃ）にて８分間イ
ンキュベートした。次いで血清不合ＲＰＭＩ−１６４０
培地８耐をｌ　ｇｔ／ｍｉｎノ割合で加え懸濁した。さ
らに血清不含ＲＰＭＩ−１６４０培地ＬＯｍｌを徐々に
加えＰＥＧを希釈した。７分間１．０００ｒｐｍで遠心
分離し、その後マウス骨髄諸細胞として６ＸｌＯ／ｍの
細胞濃度が得られるように、１０チＦＣ５−ＲＰＭＩ１
６４０培地に再懸濁し、９６六マイクロプレート（住友
ベークライトＭＳ−８０９６Ｆ）に０．２　ｍｌ　／穴
あて分注した。この融合細胞を５％の２において８７°
Ｃで培養した。細胞融合の１日後に、半分量の培地を新
たなＨＡ　Ｔ培地（１０’Ｍヒポキサンチン％　４×１
０’Ｍアミノプテリン、１．６　Ｘ　１０　’Ｍ９−ミ
ジンを含むＲＰＭＩ−１６４０培地）と交換した。

以後、２日毎に）ＩＡＴ培地による半鰍交換を８回行な
った。１０日後には、約１ｏｏｋのマイクロプレート穴
で、細胞の増殖が観察された。

（４）抗ＬＳＰ抗体のアッセイ 細胞融合１１日後、ハイブリドーマ細胞の培養上清中の
ＬＳＰに対する抗体の存在を、酵素免疫定献法、いわゆ
るＥＬＩＳＡ法にてスクリーニングした。すなわち、ｏ
、Ｉ　Ｍ　ｂｉｃａｒ−ｂｏｎａｔｅ　１）ｕｆｆｅｒ
　ｐＨ９，６に溶解された溶液（ｌμＦ／ｇｌ）１００
μｌをポリ塩化ビニール９６穴マイクロプレート（Ｆａ
ｌｃｏｎ　Ｍｉｃｒｏｔｅｓｔ　ｍｆｌｅｘｉｂｌｅ　
ａｓｓａｙ　ｐｌａｔｅ　＋　Ｂｅｃｋｔｏｎ−Ｄｉｃ
ｋｉｎｓｏｎ；以下ＰＶＣアッセイブレートと略す）に
分注、８７°Ｃ２時間インキュベージ、ン後溶液を除去
し、次いでＰＶＣアッセイブレートを乾燥させた。非特
異的結合を防ぐ為に同様の操作により牛血清アルブミン
（ＢＳＡ）を吸着させ、抗原プレートとして用いた。１
チＢＳＡ、　０．０５　％　（ｖ／ｖ　）　Ｔｗｅｅｎ
　２０　（平井化学）を含むリン酸緩衝生理食塩水１）
）１７．２（以下ＰＢＳＴと略す）にて適宜希釈した培
養上清をｌウェルあたり１００μｌ加え、２時間８７°
Ｃにて培養した。その後、ＰＢＳＴにて８回洗浄し、次
いでカルシウム・マグネシウム不含のリン酸緩衛生理食
塩水ｐＨ７，２（以下、ＰＢＳ←）と略す）にて１０”
倍希釈されたａｌｋａ−１ｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔａ
ｓｅ標識ａｎｔｉ　−ｍｏｕｓｅ　ｉｍｍｕｎｏ−ｇｌ
ｏｂｕｌｉｎ　ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａ
ｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）を１ウエルあたり１００μｌ加
え、２時間８７°Ｃにて培養した。ＰＢＳＴにて６回洗
浄後、ｐａｒａｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ　ｐｙｒｏｐｈ
ｏｓｐｈａｔｅ　（ＰＮＰＰ　）を基質として、１５分
間８７℃にてインキュベートすることにより発色させ、
マルチスキａ、　ン（Ｔｉｔｅｒｔｅｃｋ　Ｍｕｌｔｉ
ｓｋａｎ　ＭＣＣ、ＦｌｏｗＬａｂ、）にて４０５ｎｍ
　　での吸光度を測定した。

アッセイの結果、細胞増殖ウェルに対して約６０チのウ
ェルが陽性を示した。その代表例を表１に記す。

表１ （５）抗ＬＳＰ抗体産生ハイブリドーマのクローニング ＬＳＰに対して高い結合能を示す抗体を産生じている５
ケのハイブリドーマを、各々、ＢＡＬＢ／Ｃマウスの胸
腺細胞をフィーダ一層（ＩＸＩＯ／ウェル）として用い
た９６穴マイクロプレートにて、Ｇａｇｎｏｎ　ｅｔ、
ａｚ（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃｅｌ　Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ　７８　、２６７−２６９．１９８５）の方法に準
じた単細胞マニュビレーシ、　ン（ｓｉｎｇｌｅ　ｃｅ
ｌｌ　ｍａｎｉｐｕｌａ−ｔｉｏｎ）法によりクローニ
ングした。

（６）抗ＬＳＰ抗体産生ハイブリドーマの培養および精
製 クローニング後、培養にて増殖させたハイブリドーマ５
Ｘ１０’　細胞を、２週間前にブリスタン投与したＢＡ
Ｌ、Ｂ／Ｃマウスの腹腔内へ接種した。１０〜１４日後
、マウスの腹腔より腹水を採取し、５０ｓ飽和硫酸アン
モニウムによる沈殿法で、抗ＬＳＰモノクローナル抗体
を単離した。１６分間１０，０ＯＯＸｐ遠心分離により
得た沈殿を、　４０　ｍＭ　ＮａＣ１を含む少量の２０
　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｔ　ｐＨ７，８に溶解、透析チ
ューブを用いて２０ｍＭ　ＮａＣ１含有２０　ｍＭ　Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｔ　ｐＨ７，８１２：対して４°Ｃにて１
晩透析した。透析内液を１６分間１０．０００×２遠心
分離した上清を２０　ｍＭ　ＮａＣｔ含有２０ｍＭ　Ｔ
ｒｉｓ−）ｉｃｌｐＨ７，８テ平衝化したＤＥＡＥ−セ
ルロース（ＤＥ−５２、ワットマン・ケミカル・セパレ
ーション）カラムクロマトグラフィーに負荷した後、Ｎ
ａＣｚ　ｆ度を２０ｍＭから４００ｍＭへ連続的に上げ
て溶出させ、ＩｇＧ画分を得た。

（７）腹水の抗体価 クローン化されたハイブリドーマのマウス腹水をＰＢＳ
Ｔで１０４倍希釈し、（４）項記載のＥＬ　Ｉ　ＳＡ法
にて、ＬＳＰ％ＬＰＳおよびＢＳＡに対する抗体価を測
定した。（表２）。

表２ ２Ｂ７　　　　１．９１　０．１８　０．２１４Ａｌｌ
　　　　２．８１　０．２１　０．１１７Ｇ２　　　　
２．０Ｂ　　０．１４　０．１０Ｍ５−１（陰性対照）
　　　０．０７　　０．１４　　０．１５（８）抗体の
免疫グロブリンクラスの同定ハイプリドーマ培養上清７
５μＩを、オフタロニーの二重免疫拡散法に基づくモノ
クローナル抗体タイピングキット（生化学工業）に付し
て、室ｍ（２８±８°Ｃ）にて２４時間インキュベート
し、抗原抗体沈降物を観察し、サブクラスを同定した。

抗血清としては、マウス免疫グロブリンｒｓ　、　ｒ２
ａ、　ｒｚｂ　、　ｒａ　、　ａオよびμに対するヒツ
ジポリクローナル抗体（Ｍｉｌｅｓ　）を用いた。その
結果を表８に示す。

表８ ２Ｂ７　　　　　　　　ＩｐＧ３ ７Ｇ２　　　　　　　　　　　ＩｐＧ２ｂ実施例２ 抗ＬＳＰモノクローナル抗体の抗原特異性精製ＬＳＰ標
品８μ２および大腸菌細胞膜（ｃｅｌｌ　ｅｎｖｅｌｏ
ｐｅ　）画分１５　μＰをＳＤＳ／ボリアクリルア電ド
（１２，５％）ゲル電気泳動後、ケルをトランスファー
バッファー（２５ｍ　Ｍ　）すＸ−１９２ｍＭグリシン
ｐＨ８，８、２０％　（’／／Ｖ）メタノール）に４°
Ｃ−夜浸漬した。

次いでニトロセルロース膜（Ｂｉｏｒａｄ）へ電気的（
８０Ｖ、４．５ｈ）に室温にてトランスファージ、２％
ＢＳＡ含有０．　ｇ　％　ＮａＣｔ加５０ｍＭ）リス−
塩酸緩衝０ｐＨ８，０（ＴＢＳと略）で室温、１時間イ
ンキュベートすることによりブロッキングした。更にＱ
、１９６ＢｓＡ。

ｌＯチＦＣ５含有ＴＢＳで室温、１時間インキュベート
することによりブロッキングされたニトロセルロースル
健を、抗ＬＳＰモノクローナル抗体（２Ｂ７．４Ａｌ　
ｌ又は７Ｇ２；１０’倍希釈の腹水）の水溶液を８７°
Ｃ１時間、続いて４°Ｃ−夜インキユベートした。０．
０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０含有ＴＢＳ　（ｐＨｓ、ｏ　
）テニトＯセルロース膜を５回洗浄した後、第２抗体（
１％ＢＳＡ　、　０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ
にて１．０００倍希釈されたペルオキシダーゼ標識抗マ
ウスイムノグロブリン抗体）と８７°Ｃ１時間インキュ
ベートした。同様に０．０５％Ｔｗｅｅｎ　２０含有Ｔ
ＢＳ（ｐＨ８，０）で５回洗浄後、発色試薬（０，５”
Ｉ／ｓｌクロロナフトール、２０％／タノール、０．０
８　％　ＨｚＯａを含ムＴＢｓ。

ｐＨ７，５）を添加し発色させた。

抗ＬＳＰモノクローナル抗体２　Ｂ　７　、４Ａ１１゜
７Ｇ２のいずれの場合も、ＬＳＰ橡品（クマッシーブリ
リアント色素染色による検出）に対応した、約１８に付
近に一本の単一バンドを得た。この事は、これらのモノ
クローナル抗体が、ＬＳＰを特異的に認識していること
を示している。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、大腸菌由来リポプロテイン・シグナルペプチダーゼ
   と反応するモノクローナル抗体 ２、大腸菌由来リポプロテイン・シグナルペプチダーゼ
   と反応する抗体を産生するハイブリドーマ ３、２Ｂ＿７、４Ａ＿１＿１、７Ｇ＿２として特定され
   るモノクローナル抗体群から選ばれる特許請求の範囲第
   １項記載のモノクローナル抗体 ４、２Ｂ＿７、４Ａ＿１＿１、７Ｇ＿２として特定され
   るハイブリドーマ群から選ばれる特許請求の範囲第２項
   記載のハイブリドーマ