CN113087803B - 抗人血管性血友病因子前导肽单克隆抗体sz176及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了抗人血管性血友病因子前导肽单克隆抗体SZ176及其应用，所述单克隆抗体SZ176属于IgG1亚类抗体，由杂交瘤细胞株SZ176(3C1)产生；其中，杂交瘤细胞株SZ176(3C1)的保藏编号为CCTCC NO:C2019273；所述单克隆抗体SZ176能够与重组人VWF D1D2区蛋白特异性结合。与现有技术相比，本发明具有以下优点：(1)本申请所述单克隆抗体能特异性识别血浆中的VWFpp，并结合酶标记方法构建血友病分型诊断或内皮细胞损伤相关疾病的诊断的方法，较以往现有技术而言不仅节约了时间，且对检测及其的要求不高，便于在各实验室和临床上应用；(2)本申请构建的试剂盒利于推广和运用，产业化后可从正规渠道获得，对国内本领域的研究和临床运用提供了便利。

Description

抗人血管性血友病因子前导肽单克隆抗体SZ176及其应用

技术领域

本发明属于免疫学领域，涉及一种单克隆抗体，尤其涉及抗人血管性血友病因子前导肽单克隆抗体SZ176及其应用。

背景技术

血管性血友病因子(Von Willebrand factor，VWF)是血浆里参与止血和凝血过程的重要血浆膜糖蛋白，其既能介导血小板粘附于损伤血管壁上，又是凝血因子(FactorVIII，FVIII)的载体，能稳定和保护FVIII不被降解，延长FVIII的半衰期。VWF在内皮细胞和巨核细胞中表达，合成的VWF离开内皮细胞之前，会经过许多翻译后修饰，包括二聚化、糖基化、异二聚体的聚合、前导肽的切割以及硫基化修饰。大部分合成的VWF是通过组成型途径分泌，其余的则储存于内皮细胞的魏伯尔-帕拉德小体(Weibel-Palade body，WPB)和血小板的α-颗粒中。组成型释放的部分VWF蛋白水解不完全，原因在于其多聚化有限，功能较差。相反，通过调节途径释放的VWF是蛋白水解完全加工的，并且由具有生物活性的高分子量多聚体组成。人血管性血友病因子前导肽(VWF propeptide，VWFpp)包含D1和D2两个结构域，含有741个氨基酸，每个D区各有32个半胱氨酸，而半胱氨酸可形成链内或者链间二硫键，在VWF多聚化过程中发挥重要作用。VWFpp在VWF转运及分泌中的作用被广泛研究，但仍有一些功能有待于进一步阐述。研制VWFpp单克隆抗体对研究VWFpp作用机理及功能是一种良好的工具。

因此研制抗人VWFpp单克隆抗体，建立有效的检测VWFpp的方法至关重要。目前国际上VWFpp的检测主要采用来自荷兰阿姆斯特丹的试剂盒，由于价格昂贵，且属于临床检测试剂盒，在国内没有正规渠道可以获得，不利于推广和运用，严重影响了国内在这一领域的研究和临床上的运用。

发明内容

解决的技术问题：为了克服现有技术的不足，本发明通过真核表达系统获得人血管性血友病因子前导肽VWF D1D2区蛋白和针对该区域的单克隆抗体，该抗体能够特异性识别血浆中的VWFpp，而不识别成熟的不含前导肽的VWF，从而通过对该抗体的检测构建血友病分型诊断或内皮细胞损伤相关疾病的诊断的方法；鉴于此，本发明提供了抗人血管性血友病因子前导肽单克隆抗体SZ176及其应用。

技术方案：抗人血管性血友病因子前导肽单克隆抗体SZ176，所述单克隆抗体SZ176属于IgG1亚类抗体，由杂交瘤细胞株SZ176(3C1)产生；其中，杂交瘤细胞株SZ176(3C1)的保藏编号为CCTCC NO:C2019273；所述单克隆抗体SZ176能够与重组人VWF D1D2区蛋白特异性结合。

所述杂交瘤细胞株SZ176的制备方法如下：

(1)使用重组的人血管性血友病因子VWF前导肽(D1D2区)蛋白作为免疫原，以常规方法免疫Balb/C小鼠；

(2)获取融合细胞生长克隆：从免疫合格小鼠无菌取其脾细胞作为抗原致敏的B细胞，按常规方法，将B细胞与骨髓瘤细胞SP2/0株融合，然后利用常规的融合细胞HAT筛选方法进行筛选，进而获取融合细胞生长克隆；

(3)应用ELISA法和Western免疫印迹法等生化和免疫学技术筛选和鉴定后，挑选出具有高抗体分泌水平的杂交瘤细胞株SZ176(3C1)。

上述杂交瘤细胞株SZ176的制备方法中，使用重组的人血管性血友病因子VWF前导肽(D1D2区)蛋白作为免疫原，常规三次免疫接种8周龄雌性Balb/c小鼠，每次间隔4周；用ELISA法检测被免疫动物血清中单克隆抗体的存在和浓度；免疫完成后，选择产生足够高浓度抗血清的小鼠，分离动物脾脏并制备脾细胞悬液；按照已知的杂交瘤技术(参见：Kǒhlerand Milstein，Nature，215：495-497，1975；Kǒhler et al，Immunology Today，4：72-76，1983)将所得到的小鼠脾细胞与骨髓瘤相融合，制备可持续传代并分泌抗血管性血友病因子前导肽(VWFpp)单克隆抗体的杂交瘤细胞系。

所述杂交瘤细胞系的保藏信息为：保藏单位：中国典型培养物保藏中心(ChinaCenter for Type Culture Collection，简称CCTCC)；地址：湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心(武汉大学第一附属小学对面)；保藏日期2019年12月21日；一株保藏编号CCTCCNO:C2019273；分类命名：杂交瘤细胞株SZ176(3C1)。

采用上述杂交瘤细胞株SZ176(3C1)生产单克隆抗体的方法如下：

方法一：在杂交瘤培养液中接种上述杂交瘤细胞，培养后培养液中分离纯化得所需的特异性抗血管性血友病因子前导肽的单克隆抗体。

方法二：在动物腹腔内接种上述杂交瘤细胞，动物腹水液中分离和纯化得所需的特异性抗血管性血友病因子前导肽的单克隆抗体。

采用紫外分光光度计测定并计算免疫球蛋白(IgG)浓度，并可进一步用免疫印迹法(Western-Blot)检测所得单克隆抗体的特异性。经免疫双扩散方法检测，本发明的单克隆抗体属于IgG1亚类抗体。ELISA检测结果显示，本发明的单克隆抗体可与重组人VWF D1D2区(VDD)蛋白特异性结合。

优选的，所述重组人VWF D1D2区蛋白为还原性的VWF前导肽。

优选的，单克隆抗体SZ176是与还原性的VWF前导肽在分子量为90KDa处的蛋白结合。

以上任一所述抗人血管性血友病因子前导肽单克隆抗体SZ176在制备血管性血友病分型检测试剂盒中的应用。

以上任一所述抗人血管性血友病因子前导肽单克隆抗体SZ176在制备内皮细胞受损疾病预后检测试剂盒中的应用。

优选的，所述内皮细胞受损疾病为心肌梗塞或骨髓移植。

以上试剂盒应用的原理在于：将特异性抗体SZ176结合到固相载体上形成固相抗体，然后和待检血浆中相应的VWF前导肽抗原结合形成免疫复合物，洗涤后再加酶标记抗体HRP-SZ175，与免疫复合物中抗原结合形成酶标抗体-抗原-固相抗体复合物，加底物显色，判断抗原含量。具体方法为：

首先，对单克隆抗体SZ175标记辣根过氧化物酶(HRP)。

其次，单克隆抗体SZ176在碳酸缓冲液的条件下，包被于96孔酶标板，4℃过夜。洗板后，用2％的牛血清蛋白BSA37℃封闭1h。

再次，正常人混合血浆作为标准品梯度稀释，患者或正常人血浆1:50的比例用TBS稀释后，加入上述封闭后的酶标板，每孔100μL。37℃孵育2h。洗板后，加入稀释后的HRP-SZ175，37℃孵育1h。

最后，洗板、用发色底物TMB显色、用2M硫酸终止反应，读数并拟标准曲线，分析数据。

有益效果：(1)本申请所述单克隆抗体能特异性识别血浆中的VWFpp，并结合酶标记方法构建血友病分型诊断或内皮细胞损伤相关疾病的诊断的方法，较以往现有技术而言不仅节约了时间，且对检测及其的要求不高，便于在各实验室和临床上应用；(2)本申请构建的试剂盒利于推广和运用，产业化后可从正规渠道获得，对国内本领域的研究和临床运用提供了便利。

附图说明

图1为构建的重组VDD的真核表达质粒双酶切后电泳图；

图2为Western blot鉴定重组表达的VDD蛋白；

图3为对纯化的重组VDD蛋白作10％SDS-PAGE鉴定分析的电泳图和Western blot鉴定图；

图4为ELISA检测小鼠腹水与VDD结合情况；

图5为Western blot鉴定VWFpp抗体与抗原结合的特异性；

图6为ELISA双抗夹心法标准曲线的建立；

图7为骨髓移植患者移植前后VWFpp的检测。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1：免疫原——重组人血管性血友病因子D1D2区(VDD)蛋白的制备

(1)PCR引物设计和合成：设计并合成一对分别位于编码VWF-D1D2区(氨基酸23-763)cDNA序列(2223bp)的上下游两侧的引物，

上游引物，SEQ ID NO.1：5’-AGATATCGCAGAAGAAACTCGC-3’，5’端含EcoRV酶切位点；

下游引物，SEQ ID NO.2：5’-CGGGCCCTCACCTTTTGCTGCGA-3’，5’端含ApaI酶切位点；利用上述引物，以VWF全长cDNA为模板，进行PCR扩增，得到PCR产物。

(2)目的基因的克隆和序列分析：在T4 DNA连接酶作用下，将纯化的PCR产物直接与表达载体pSecTag2B载体(含有6×His的Tag)连接，得到pSecTag2B-VWF-D1D2重组质粒。用所得重组质粒转化大肠杆菌Escherchia coli DH5α感受态中，涂LB板，经氨苄青霉素筛选。以重组质粒为模板全自动测序仪测定DNA序列，测得克隆片段的DNA序列与已知的VWF-D1D2区cDNA序列完全一致，进一步表明克隆的D1D2区基因片段是正确的。

编码表达人VWF-D1D2区cDNA序列全长2223bp，见SEQ ID NO.3所述的碱基序列具体序列如下所示：

GCAGAAGGAACTCGCGGCAGGTCATCCACGGCCCGATGCAGCCTTTTCGGAAGTGACTTCGTCAACACCTTTGATGGGAGCATGTACAGCTTTGCGGGATACTGCAGTTACCTCCTGGCAGGGGGCTGCCAGAAACGCTCCTTCTCGATTATTGGGGACTTCCAGAATGGCAAGAGAGTGAGCCTCTCCGTGTATCTTGGGGAATTTTTTGACATCCATTTGTTTGTCAATGGTACCGTGACACAGGGGGACCAAAGAGTCTCCATGCCCTATGCCTCCAAAGGGCTGTATCTAGAAACTGAGGCTGGGTACTACAAGCTGTCCGGTGAGGCCTATGGCTTTGTGGCCAGGATCGATGGCAGCGGCAACTTTCAAGTCCTGCTGTCAGACAGATACTTCAACAAGACCTGCGGGCTGTGTGGCAACTTTAACATCTTTGCTGAAGATGACTTTATGACCCAAGAAGGGACCTTGACCTCGGACCCTTATGACTTTGCCAACTCATGGGCTCTGAGCAGTGGAGAACAGTGGTGTGAACGGGCATCTCCTCCCAGCAGCTCATGCAACATCTCCTCTGGGGAAATGCAGAAGGGCCTGTGGGAGCAGTGCCAGCTTCTGAAGAGCACCTCGGTGTTTGCCCGCTGCCACCCTCTGGTGGACCCCGAGCCTTTTGTGGCCCTGTGTGAGAAGACTTTGTGTGAGTGTGCTGGGGGGCTGGAGTGCGCCTGCCCTGCCCTCCTGGAGTACGCCCGGACCTGTGCCCAGGAGGGAATGGTGCTGTACGGCTGGACCGACCACAGCGCGTGCAGCCCAGTGTGCCCTGCTGGTATGGAGTATAGGCAGTGTGTGTCCCCTTGCGCCAGGACCTGCCAGAGCCTGCACATCAATGAAATGTGTCAGGAGCGATGCGTGGATGGCTGCAGCTGCCCTGAGGGACAGCTCCTGGATGAAGGCCTCTGCGTGGAGAGCACCGAGTGTCCCTGCGTGCATTCCGGAAAGCGCTACCCTCCCGGCACCTCCCTCTCTCGAGACTGCAACACCTGCATTTGCCGAAACAGCCAGTGGATCTGCAGCAATGAAGAATGTCCAGGGGAGTGCCTTGTCACAGGTCAATCACACTTCAAGAGCTTTGACAACAGATACTTCACCTTCAGTGGGATCTGCCAGTACCTGCTGGCCCGGGATTGCCAGGACCACTCCTTCTCCATTGTCATTGAGACTGTCCAGTGTGCTGATGACCGCGACGCTGTGTGCACCCGCTCCGTCACCGTCCGGCTGCCTGGCCTGCACAACAGCCTTGTGAAACTGAAGCATGGGGCAGGAGTTGCCATGGATGGCCAGGACGTCCAGCTCCCCCTCCTGAAAGGTGACCTCCGCATCCAGCATACAGTGACGGCCTCCGTGCGCCTCAGCTACGGGGAGGACCTGCAGATGGACTGGGATGGCCGCGGGAGGCTGCTGGTGAAGCTGTCCCCCGTCTATGCCGGGAAGACCTGCGGCCTGTGTGGGAATTACAATGGCAACCAGGGCGACGACTTCCTTACCCCCTCTGGGCTGGCGGAGCCCCGGGTGGAGGACTTCGGGAACGCCTGGAAGCTGCACGGGGACTGCCAGGACCTGCAGAAGCAGCACAGCGATCCCTGCGCCCTCAACCCGCGCATGACCAGGTTCTCCGAGGAGGCGTGCGCGGTCCTGACGTCCCCCACATTCGAGGCCTGCCATCGTGCCGTCAGCCCGCTGCCCTACCTGCGGAACTGCCGCTACGACGTGTGCTCCTGCTCGGACGGCCGCGAGTGCCTGTGCGGCGCCCTGGCCAGCTATGCCGCGGCCTGCGCGGGGAGAGGCGTGCGCGTCGCGTGGCGCGAGCCAGGCCGCTGTGAGCTGAACTGCCCGAAAGGCCAGGTGTACCTGCAGTGCGGGACCCCCTGCAACCTGACCTGCCGCTCTCTCTCTTACCCGGATGAGGAATGCAATGAGGCCTGCCTGGAGGGCTGCTTCTGCCCCCCAGGGCTCTACATGGATGAGAGGGGGGACTGCGTGCCCAAGGCCCAGTGCCCCTGTTACTATGACGGTGAGATCTTCCAGCCAGAAGACATCTTCTCAGACCATCACACCATGTGCTACTGTGAGGATGGCTTCATGCACTGTACCATGAGTGGAGTCCCCGGAAGCTTGCTGCCTGACGCTGTCCTCAGCAGTCCCCTGTCTCATCGCAGCAAAAGG

实施例2：特异性抗血管性血友病因子D1D2区的单克隆抗体的制备

1.1真核表达载体的转化扩增和定量

将pSecTag2B-VWF-D1D2质粒转化入DH5α感受态中，涂板后37℃过夜培养。挑取阳性克隆，37℃细菌摇床过夜扩增培养，4℃离心收集细菌后，用质粒抽提试剂盒进行质粒抽提(按试剂盒说明书操作)。质粒经EcoRV和ApaI酶切鉴定，结果如图1所示。

1.2pSecTag2B-VWF-D1D2质粒转染HeLa细胞

HeLa细胞培养：HeLa细胞用含10％小牛血清的DMEM(Dulbecco’s ModifiedEagles Medium)培养。转染前24小时，将细胞接种于24细胞培养孔板中(1.0×10⁵/mL)，至60～80％融合。

转染液制备：将pSecTag2B-VWF-D1D2质粒1μg稀释至100μL无血清DMEM培养基中，加入4μL Tubofect DNA转染试剂，混匀后室温放置20分钟。

转染前准备：无血清DMEM漂洗细胞1次，每孔加入900μL无血清DMEM培养基。

转染：将待转染混合物缓缓加入待转染细胞中，混匀后37℃、5％CO₂温箱培养6h，弃去无血清上清，换入含血清细胞培养基继续培养。

稳定转染细胞株筛选：转染细胞培养48h后消化分离，重新接种至35mm细胞培养皿中(2×10³/mL)，换入细胞筛选液(含10％小牛血清DMEM细胞培养基，加入400μg/mLHygromycine B)进行阳性细胞克隆的筛选；待细胞大部分死亡脱落后(约7至10日后)，重新换入细胞筛选维持液(含10％小牛血清DMEM细胞培养基，加入200μg/mL Hygromycine B)进行维持筛选；筛选后待阳性细胞克隆长出，挑选单克隆扩大培养，即获得稳定表达重组VDD蛋白的细胞株，并通过western blot方法筛选高表达细胞株保种冻存。

1.3 HeLa稳转细胞株上清的收集、浓缩

稳定表达重组VDD蛋白的细胞株用无血清DMEM细胞培养基驯化后，再行大量扩增培养，收集无血清培养上清。所收集的上清立即经Amicon Ultra-15离心超滤管100倍离心浓缩，分装后冻存于-80℃冰箱备用。

1.4重组VDD蛋白Westernblot鉴定

将浓缩后的培养上清进行5％SDS-PAGE电泳后，转膜，并行Western blot鉴定。以鼠抗His单抗作为一抗，HRP标记的驴抗鼠IgG为二抗，ECL显影剂化学发光法显影，胶片经清洗风干后，于凝胶成像仪下拍照，以ImageJ软件分析，结果如图2所示。

1.5重组VDD蛋白蛋白纯化

蛋白纯化缓冲液配制：按照说明书配制如下蛋白纯化缓冲液，

平衡Ni-NTA Agarose：将保存液中的Ni-NTA Agarose与保存液混匀，吸取4mL Ni-NTA Agarose至15mL离心管中；500×g离心5min，小心弃上清；加入10倍体积NPI-10缓冲液平衡Ni-NTA Agarose；500×g离心5min，小心弃上清。

蛋白与Ni-NTA Agarose结合：将浓缩后培养上清与Ni-NTA Agarose混匀，4℃摇床结合过夜；500×g离心5min，小心收集上清待电泳。

Ni-NTA Agarose洗涤：加入10倍体积NPI-20缓冲液洗涤Ni-NTA Agarose，充分混匀，500×g离心5min，小心收集上清待电泳；重复洗涤一次。

重组VDD蛋白洗脱：加入1倍体积NPI-250缓冲液重悬洗涤后Ni-NTA Agarose，室温下充分混匀2min，使重组蛋白与Ni-NTA Agarose分离，500×g离心5min，将上清收集至已编号的离心管中，置于冰上；重复洗脱6次。

纯化后蛋白定量：使用分光光度计对纯化后蛋白定量，用NPI-250缓冲液调零，测定蛋白样品在280nm处的吸光度，推算纯化后蛋白浓度。

1.6透析去除咪唑：高浓度咪唑可能造成蛋白沉淀，因此，使用消毒后的PBS缓冲液去除纯化蛋白中高浓度的咪唑，-80℃冻存蛋白备用。

1.7纯化后蛋白鉴定

将结合后培养上清、洗涤后上清及洗脱液进行10％SDS-PAGE电泳，结果如图3所示，电泳后进行考马斯亮蓝染色及Western blot鉴定。以鼠抗His单抗作为一抗，HRP标记的驴抗鼠IgG为二抗，ECL显影剂化学发光法显影，胶片经清洗风干后，于凝胶成像仪下拍照，以ImageJ软件分析。SDS-PAGE电泳结果显示纯化后蛋白纯度超过90％以上，Western blot结果显示蛋白能与His单抗特异性结合，条带大小约为90kDa。

实施例3：特异性的抗血管性血友病因子前导肽的单克隆抗体的制备特异性抗血管性血友病因子D1D2区的单克隆抗体的制备

我们应用常规免疫学方法和杂交瘤技术(Kǒhler and Milstein，Nature，215：495-497，1975)制备本发明的单克隆抗体。

首先，以纯化的重组VDD蛋白免疫8周龄雌性Balb/c小鼠(上海科学院实验动物中心)，共免疫三次，每次间隔四周。前两次为背部皮下多点注射加腹腔注射，第三次为经小鼠尾静脉注射加腹腔注射。

待被免疫小鼠的血清抗体滴度达到足够高后，处死动物并分离脾脏细胞。应用标准的单克隆抗体细胞融合技术，将被免疫Balb/c小鼠的脾脏细胞与小鼠的SP2/0骨髓瘤细胞(法国巴黎输血中心杂交瘤实验室引进)进行细胞融合。在HAT培养基中选择培养融合细胞，培养后取上清以ELISA法筛选出高水平分泌抗体的细胞株。用于进一步的扩大培养或冻存。

应用ELISA法和Western印迹法等生化和免疫学技术筛选和鉴定后，获得两株特异性抗血管性血友病因子前导肽的单克隆抗体，命名为SZ176。

为了大量制备单克隆抗体，我们选用Balb/c小鼠或其亲代小鼠，先用降植烷行小鼠腹腔注射，一周后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中(5×10⁵/小鼠)。大约在接种一周后即有明显的腹水产生，每只小鼠可收集5～10mL腹水。

实施例4：本发明单克隆抗体的化学性质

(1)应用免疫双扩散方法测定证实，本发明的单抗SZ176属于IgG1亚类。

(2)将单克隆抗体SZ176接种于Balb/c小鼠腹腔产生腹水，7-14天后抽取腹水。利用ELISA方法检测腹水效价：纯化的VDD蛋白用碳酸盐缓冲液配置成1μg/mL，100μL/孔包板，4℃过夜；0.05％Tween-TBS洗涤2次后，2％BSA-TBS封闭过夜，同上洗涤后，每孔加100μL按一定比例稀释的腹水(1:100，1:1000，1:10000，1:20000)，TBS为空白对照，以同期未免疫小鼠血清为阴性对照，以免疫小鼠血清为阳性对照，37℃孵育2h。同上洗涤4次，加HRP标记驴抗鼠二抗(1:10000稀释)100μL/孔，37℃孵育1h。同上洗涤6次，TMB显色100μL/孔，室温8-10min，50μL/孔3M硫酸终止反应。酶标检测仪上读取OD₄₅₀值。结果如图4所示，腹水与阳性对照效价都能达到1:20000以上。

(3)腹水纯化：经过Protein A/G纯化，经PBS透析，用紫外分光光度计测定IgG含量，测知每1mL腹水可纯化得到IgG 4-6mg。

(4)Western blot免疫印迹法检测单克隆抗体识别的抗原蛋白：正常人混合血浆和重组的成熟VWF(不含前导肽)蛋白行10％SDS-PAGE电泳，在Bio-Rad系统转移至硝酸纤维酸上，用2％BSA-PBS封闭过夜，次日用含0.05％Tween-PBS洗涤后，加入纯化后的抗体SZ176以及兔抗人阳性对照多抗1-AP(商品化抗体)(1：1000稀释)，室温孵育2h，洗涤半小时后，分别加入HRP标记驴抗鼠二抗(1：40000稀释)和HRP标记羊抗兔二抗(1：10000稀释)，室温孵育1h，再次洗涤后ECL显色，压片观察，结果如图5所示。结果表明，单克隆抗体SZ176能与血浆中的VWFpp结合，在90kDa处显带，同时阳性对照多抗1-AP也在该处显带，而两株抗体和阳性对照多抗都与重组的成熟VWF蛋白无反应，说明抗体与VWFpp是特异性结合的。

实施例5：利用两株抗血管性血友病因子前导肽单克隆抗体构建检测VWFpp抗原的ELISA试剂盒

1.对单克隆抗体SZ176标记辣根过氧化物酶

1.1在冻干的磷酸缓冲液(PBS)中加入500mL的超纯水。

1.2准备1mg的纯化后单抗SZ176(IgG)(存在于0.5mL-1.0mL的PBS里)。

1.3用100μL超纯水重悬1mg的冻干状态的EZ-Link Plus活化的过氧化物酶，并将其直接与IgG溶液混合。

1.4在通风橱内，迅速将氰基硼氢化钠加入上述混合物反应，在室温条件下孵育1h。

1.5加20μL的Quenching Buffer在室温下反应15min。

1.6透析纯化偶联后的抗体以脱盐，存放于含浓度10mg/mL的BSA的储存液里、等体积的甘油混合，分装保存在-20℃。

2.利用SZ176单克隆抗体运用用双抗夹心法的原理构建检测VWFpp的试剂盒。以正常人混合血浆(1:20，1:50，1:100，1:200，1:500，1:1000，1:2000稀释)做标准曲线，如图6所示。

实施例6：利用构建的血管性血友病因子前导肽ELISA检测试剂盒对白血病患者骨髓移植前后血浆进行VWFpp的检测

(1)收集15例白血病患者骨髓移植前后血浆(1:9枸橼酸钠抗凝)，-80℃冻存。

(2)以正常人混合血浆做标准品(1:20，1:50，1:100，1:200，1:500，1:1000，1:2000稀释)，患者血浆1:50稀释，加入包被有SZ176(封闭后)的酶标板，每孔100μL，TBS为空白对照，37℃孵育2h。0.05％Tween-TBS洗涤4次，加HRP标记SZ175(1：2000稀释)100μL/孔，37℃孵育1h。同上洗涤6次，TMB显色100μL/孔，室温8-10min，50μL/孔3M硫酸终止反应。酶标检测仪上读取OD₄₅₀值，结果如图7所示，设定正常人混合血浆中VWFpp浓度为100IU/dL,根据标准曲线，换算患者血浆中VWFpp浓度。

序列表

<110> 苏州大学附属第一医院

<120> 抗人血管性血友病因子前导肽单克隆抗体SZ176及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agatatcgca gaagaaactc gc 22

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgggccctca ccttttgctg cga 23

<210> 3

<211> 2223

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 3

gcagaaggaa ctcgcggcag gtcatccacg gcccgatgca gccttttcgg aagtgacttc 60

gtcaacacct ttgatgggag catgtacagc tttgcgggat actgcagtta cctcctggca 120

gggggctgcc agaaacgctc cttctcgatt attggggact tccagaatgg caagagagtg 180

agcctctccg tgtatcttgg ggaatttttt gacatccatt tgtttgtcaa tggtaccgtg 240

acacaggggg accaaagagt ctccatgccc tatgcctcca aagggctgta tctagaaact 300

gaggctgggt actacaagct gtccggtgag gcctatggct ttgtggccag gatcgatggc 360

agcggcaact ttcaagtcct gctgtcagac agatacttca acaagacctg cgggctgtgt 420

ggcaacttta acatctttgc tgaagatgac tttatgaccc aagaagggac cttgacctcg 480

gacccttatg actttgccaa ctcatgggct ctgagcagtg gagaacagtg gtgtgaacgg 540

gcatctcctc ccagcagctc atgcaacatc tcctctgggg aaatgcagaa gggcctgtgg 600

gagcagtgcc agcttctgaa gagcacctcg gtgtttgccc gctgccaccc tctggtggac 660

cccgagcctt ttgtggccct gtgtgagaag actttgtgtg agtgtgctgg ggggctggag 720

tgcgcctgcc ctgccctcct ggagtacgcc cggacctgtg cccaggaggg aatggtgctg 780

tacggctgga ccgaccacag cgcgtgcagc ccagtgtgcc ctgctggtat ggagtatagg 840

cagtgtgtgt ccccttgcgc caggacctgc cagagcctgc acatcaatga aatgtgtcag 900

gagcgatgcg tggatggctg cagctgccct gagggacagc tcctggatga aggcctctgc 960

gtggagagca ccgagtgtcc ctgcgtgcat tccggaaagc gctaccctcc cggcacctcc 1020

ctctctcgag actgcaacac ctgcatttgc cgaaacagcc agtggatctg cagcaatgaa 1080

gaatgtccag gggagtgcct tgtcacaggt caatcacact tcaagagctt tgacaacaga 1140

tacttcacct tcagtgggat ctgccagtac ctgctggccc gggattgcca ggaccactcc 1200

ttctccattg tcattgagac tgtccagtgt gctgatgacc gcgacgctgt gtgcacccgc 1260

tccgtcaccg tccggctgcc tggcctgcac aacagccttg tgaaactgaa gcatggggca 1320

ggagttgcca tggatggcca ggacgtccag ctccccctcc tgaaaggtga cctccgcatc 1380

cagcatacag tgacggcctc cgtgcgcctc agctacgggg aggacctgca gatggactgg 1440

gatggccgcg ggaggctgct ggtgaagctg tcccccgtct atgccgggaa gacctgcggc 1500

ctgtgtggga attacaatgg caaccagggc gacgacttcc ttaccccctc tgggctggcg 1560

gagccccggg tggaggactt cgggaacgcc tggaagctgc acggggactg ccaggacctg 1620

cagaagcagc acagcgatcc ctgcgccctc aacccgcgca tgaccaggtt ctccgaggag 1680

gcgtgcgcgg tcctgacgtc ccccacattc gaggcctgcc atcgtgccgt cagcccgctg 1740

ccctacctgc ggaactgccg ctacgacgtg tgctcctgct cggacggccg cgagtgcctg 1800

tgcggcgccc tggccagcta tgccgcggcc tgcgcgggga gaggcgtgcg cgtcgcgtgg 1860

cgcgagccag gccgctgtga gctgaactgc ccgaaaggcc aggtgtacct gcagtgcggg 1920

accccctgca acctgacctg ccgctctctc tcttacccgg atgaggaatg caatgaggcc 1980

tgcctggagg gctgcttctg ccccccaggg ctctacatgg atgagagggg ggactgcgtg 2040

cccaaggccc agtgcccctg ttactatgac ggtgagatct tccagccaga agacatcttc 2100

tcagaccatc acaccatgtg ctactgtgag gatggcttca tgcactgtac catgagtgga 2160

gtccccggaa gcttgctgcc tgacgctgtc ctcagcagtc ccctgtctca tcgcagcaaa 2220

agg 2223

Claims (3)

1.抗人血管性血友病因子前导肽单克隆抗体SZ176，其特征在于，所述单克隆抗体SZ176属于IgG1亚类抗体，由杂交瘤细胞株SZ176产生；其中，杂交瘤细胞株SZ176的保藏编号为CCTCC NO:C2019273；所述单克隆抗体SZ176能够与重组人VWF D1D2区蛋白特异性结合。

2.根据权利要求1所述的抗人血管性血友病因子前导肽单克隆抗体SZ176，其特征在于，所述单克隆抗体SZ176能够与SEQ ID NO.3所述的碱基序列编码的重组人VWF D1D2区结合。

3.权利要求1或2所述的抗人血管性血友病因子前导肽单克隆抗体SZ176在制备检测人血管性血友病因子前导肽抗原试剂盒中的应用。

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