CN115838751A - 一种磷脂酶a2受体重组蛋白的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种磷脂酶A2受体重组蛋白的制备方法。为了解决现有PLA2R重组蛋白活性低且产量不高的问题，本发明提供的制备方法包括如下步骤：(1)将表达所述磷脂酶A2受体重组蛋白的核酸在原核细胞中表达蛋白；(2)采用重复冻融法和盐酸胍溶液重悬法提取原核细胞中表达的蛋白，(3)对步骤(2)所得的蛋白进行复性，得到所述磷脂酶A2受体重组蛋白，其中，步骤(1)中，所述核酸编码的蛋白具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。本发明的制备方法制备的PLA2R重组蛋白活性与天然PLA2R蛋白相当，与抗PLA2R自身抗体的免疫反应性优于全长天然磷脂酶A2受体蛋白，该制备方法产量高，表达流程短，重复性佳。

Description

一种磷脂酶A2受体重组蛋白的制备方法

技术领域

本发明涉及抗原制备技术领域，具体涉及一种磷脂酶A2受体重组蛋白的制备方法。

背景技术

磷脂酶A2受体(PLA2R)是I型跨膜受体蛋白，其是哺乳动物的4个甘露糖受体中的一个。PLA2R是一个表达在人足细胞上分子量为185kDa的蛋白，PLA2R蛋白仅在细胞膜上存在，不跟随身体系统循环流动。大部分PLA2R蛋白结构暴露在细胞外且其胞外区域包含一个保守域，此外PLA2R包含一个跨膜区域和C端的细胞内域。PLA2R的细胞外域中含有N端多半胱氨酸域，纤维粘连蛋白二型重复域，以及8个连续的碳水化合物识别域。PLA2R持续通过细胞内吞作用使其蛋白构型保持一种回收模式，以便使PLA2R能与其他配体形成化合物并展露在免疫系统下。PLA2R的免疫原性取决于蛋白内的二硫键的正确配对与形成。

PLA2R的生理作用虽还未完全得到解析，但其临床意义与膜性肾病相关，至少有70％的膜性肾病患者的样本内检测得到针对PLA2R的自身抗体。由此引发膜性肾炎会诱发针对人体足细胞的自身抗体的推测，PLA2R抗体可成为膜性肾病诊断标志物之一。

PLA2R抗体的检测结果的可靠性以及检测成本的高低与诊断试剂核心原料PLA2R抗原息息相关。PLA2R是跨膜蛋白，表达难度高，表达量低，膜蛋白从细胞膜面分离难度高，纯化步骤复杂。通过真核细胞表达是常用的表达手段，但是真核细胞表达量较低无法难足大批量生产的需求。原核细菌表达体系虽然表达量高，但是由于PLA2R蛋白的活性严重依托正确的蛋白内二硫键形成，而原核生物表达得到的PLA2R重组蛋白几乎为错误折叠不具蛋白天然活性的包含体或杂蛋白。因此，如何在保证PLA2R重组蛋白具有PLA2R蛋白天然活性的同时提高生产效率是研究的重点。

发明内容

本发明的目的是提供一种磷脂酶A2受体重组蛋白的制备方法，该制备方法具有更高的生产效率且制备的磷脂酶A2受体重组蛋白具有PLA2R蛋白天然活性。

本发明的另一目的是提供通过上述制备方法制备得到的磷脂酶A2受体重组蛋白。

本发明的另一目的是提供一种用于检测抗磷脂酶A2受体抗体或用于检测与抗磷脂酶A2受体抗体阳性相关的疾病的试剂盒。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种磷脂酶A2受体重组蛋白的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

(1)将表达所述磷脂酶A2受体重组蛋白的核酸在原核细胞中表达蛋白；

(2)采用重复冻融法和盐酸胍溶液重悬法提取原核细胞中表达的蛋白，

(3)对步骤(2)所得的蛋白进行复性，得到所述磷脂酶A2受体重组蛋白，

其中，步骤(1)中，所述核酸编码的蛋白具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或与其至少具有95％的同源性，

步骤(3)中，所述复性采用的复性溶液的配方为：40～80mM Tris，80～150mM精氨酸，200～300mM氯化钠，0.005％～0.02％(g/v)P300防腐剂，余量水。

优选地，步骤(1)中，所述核酸编码的蛋白的氨基酸序列为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

优选地，所述核酸具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列或与其至少具有95％的同源性。

根据一具有实施方式，所述核酸具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

优选地，步骤(1)中，所述原核细胞为大肠杆菌。

优选地，步骤(2)中，所述盐酸胍溶液的配方为：4～8M盐酸胍，200～300mM氯化钠，余量水；采用碱性物质调节所述盐酸胍溶液pH值为5.5～6.5。

优选地，步骤(3)中，所述复性的方法为：将步骤(2)所得的蛋白和所述复性溶液按照体积比为1：40～60混合，同时滴加还原性麸胱甘肽至其终浓度为0.05～0.2M，混匀后滴加氧化性麸胱甘肽至其终浓度为0.02～0.03M，室温静置15～20小时。

优选地，所述制备方法还包括对步骤(3)得到的所述磷脂酶A2受体重组蛋白进行纯化的步骤，所述纯化的步骤为将所述磷脂酶A2受体重组蛋白依次经镍离子亲和纯化柱、阳离子交换层析柱和分子筛层析柱。

根据一些实施方式，所述纯化步骤具体包括：

S1：将步骤(3)得到的所述磷脂酶A2受体重组蛋白透析到磷酸缓冲液中，然后过镍离子亲和纯化柱，接着使用磷酸缓冲液冲洗柱子，再使用第一解离液洗脱蛋白得到蛋白初步洗脱液，所述第一解离液的配方为：100～150mM氯化钠，2～3.5mM氯化钾，5～15mM磷酸氢二钠，1～2.5mM磷酸二氢钾和200～300mM咪唑；

S2：将步骤S1得到的蛋白初步洗脱液透析到pH值为5～6的MOPS缓冲液中，然后过阳离子交换层析柱，接着使用MOPS缓冲液冲洗柱子，再使用第二解离液洗脱蛋白得到蛋白二次洗脱液，所述第二解离液的配方为：40～60mM MOPS，0.5～1.5M氯化钠，余量水；采用碱性物质调整所述第二解离液的pH值为5.5～6.5。

S3：将步骤S2得到的蛋白二次洗脱液透析到磷酸缓冲液中，然后过分子筛层析柱，接着使用磷酸缓冲液冲洗柱子，收集分子量为75kDa的蛋白，即为纯化后的所述磷脂酶A2受体重组蛋白。

根据一些实施方式，经所述纯化步骤后的所述磷脂酶A2受体重组蛋白封存于蛋白保存液中，所述蛋白保护液的配方为：40～60mM Tris，150～250mM氯化钠，15～25mM精氨酸，0.5～1.5％(v/v)甘油，0.01％(g/v)P300防腐剂，余量水。

根据一些实施方式，步骤(1)具体为：将所述核酸克隆到pET-26b质粒中，然后电转染大肠杆菌，电转染后的大肠杆菌采用LB琼脂糖培养至大肠杆菌的OD600值达到0.5～0.6后，加入IPTG后继续培养2～5小时；

步骤(2)具体为：将步骤(1)得到的大肠杆菌菌液在5000～10000rpm离心去除上清液，将菌体沉淀用液氮速冻后放入30～40℃水浴解冻，重复以上速冻解冻流程2～4次后，采用所述盐酸胍溶液重悬，重悬后以8000～12000rpm离心，收集上清液。

本发明还提供一种磷脂酶A2受体重组蛋白，所述磷脂酶A2受体重组蛋白由所述的制备方法制备得到。

本发明还提供一种用于检测抗磷脂酶A2受体抗体或用于检测与抗磷脂酶A2受体抗体阳性相关的疾病的试剂盒，所述的试剂盒包括所述的磷脂酶A2受体重组蛋白。

优选地，所述的试剂盒为化学发光检测试剂盒。

优选地，所述的试剂盒的检测样本类型为血清、血浆或全血中的一种或多种。

优选地，所述的与抗磷脂酶A2受体抗体阳性相关的疾病为膜性肾病。

本发明的制备方法下磷脂酶A2受体重组蛋白表达产量高，且能达到与天然蛋白相当的活性，其能够被膜性肾炎患者样本中的抗PLA2R自身抗体识别，且亲和度高，免疫反应性优于全长PLA2R蛋白。

本发明的制备方法使用原核细胞表达，表达流程短，重复性佳。

本发明的制备方法下的磷脂酶A2受体重组蛋白长期保存稳定性好，能保存在4℃或-20℃，在至少12个月的保存期期间蛋白不降解、不变性、不失活。

本发明与现有技术相比具有如下优势：

本发明的制备方法制备的磷脂酶A2受体重组蛋白活性与天然磷脂酶A2受体蛋白相当，与抗PLA2R自身抗体的免疫反应性优于全长天然磷脂酶A2受体蛋白。本发明的制备方法蛋白产量高，表达流程短，重复性佳。

附图说明

图1为实施例中纯化后的PLA2R重组蛋白的SDS-PAGE电泳图；

图2为实施例中纯化后的PLA2R重组蛋白与全长PLA2R Western blot对比图；

图3为酶联免疫法验证实施例的PLA2R重组蛋白与天然全长PLA2R蛋白的反应性比较曲线图；

图4为酶联免疫法测定实施例的PLA2R重组蛋白在4℃和-20℃下12个月内稳定性的反应曲线图；

图5为免疫印迹法验证实施例的PLA2R胞外区域重组蛋白在4℃和-20℃下12个月内稳定性测试结果图。

图6为酶联免疫法测定比较对比例1中复性得到的PLA2R重组蛋白，实施例中得到的PLA2R重组蛋白以及全长天然PLA2R蛋白的反应性。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步描述。但本发明并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为本行业中的常规条件。本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

以下实施例中，若如特殊说明，所使用的原料、试剂等均为常规市售产品。

实施例1

本实施例提供一种磷脂酶A2受体重组蛋白的优选制备方法，具体如下：

(1)合成多核苷酸。

搜索Genebank获取天然全长PLA2R蛋白的氨基酸序列，然后对该序列进行截取和突变：

根据Uniprot得到的PLA2R蛋白序列进行分析，得到其胞外区域为21位-1397位氨基酸，截取胞外域作为表达PLA2R蛋白片段，经研究后，本实施例中最终选定截取天然全长PLA2R蛋白的第406位-1123位氨基酸，总长718个氨基酸，截取片段包含16个半胱氨酸，共组成8对二硫键配对。将截取片段的糖基化位点454从天门冬酰胺突变为丙氨酸，具体如下：

CQADNSALIDITSLAEVEFLVTLLGDENASETWIGLSSNKIPVSFEWSADSSVIFTNWHTLEPHIFPNRSQLCVSAEQSEGHWKVKNCEERLFYICKKAGHVLSDAESGCQEGWERHGGFCYKIDTVLRSFDQASSGYYCPPALVTITNRFEQAFITSLISSVVKMKDSYFWIALQDQNDTGEYTWKPVGQKPEPVQYTHWNTHQPRYSGGCVAMRGRHPLGRWEVKHCRHFKAMSLCKQPVENQEKAEYEERWPFHPCYLDWESEPGLASCFKVFHSEKVLMKRTWREAEAFCEEFGAHLASFAHIEEENFVNELLHSKFNWTEERQFWIGFNKRNPLNAGSWEWSDRTPVVSSFLDNTYFGEDARNCAVYKANKTLLPLHCGSKREWICKIPRDVKPKIPFWYQYDVPWLFYQDAEYLFHTFASEWLNFEFVCSWLHSDLLTIHSAHEQEFIHSKIKALSKYGASWWIGLQEERANDEFRWRDGTPVIYQNWDTGRERTVNNQSQRCGFISSITGLWGSEECSVSMPSICKRKKVWLIEKKKDTPKQHGTCPKGWLYFNYKCLLLNIPKDPSSWKNWTHAQHFCAEEGGTLVAIESEVEQAFITMNLFGQTTSVWIGLQNDDYETWLNGKPVVYSNWSPFDIINIPSHNTTEVQKHIPLCALLSSNPNFHFTGKWYFEDCGKEGYGFVCEKMQDTSGHGVNTSDMYPMPNTLEYGN(SEQ IDNO.1)。

此突变由全基因合成直接达成，合成时在3’加入6个组氨酸的核酸序列(6×His标签)核苷酸序列如下：

tgtcaggctgataacagtgcattaatagacataacctcattagcagaggtggagtttcttgtaaccctccttggagatgaaaatgcatcagaaacatggattggtttgagcagcaataaaattccagtttcctttgaatggtctgcggactcttcagtcatctttactaattggcacacacttgagccccacatttttccaaatagaagccagctgtgtgtctcagcagagcagtctgagggacactggaaagtcaaaaattgtgaagaaagacttttttacatttgtaaaaaagcaggccatgtcctctctgatgctgaatcaggatgtcaagagggatgggagagacatggtggattctgttacaaaattgacacagtccttcgaagctttgaccaagcttccagcggttattactgtcctcctgcacttgtaaccattacaaacaggtttgaacaggcttttattaccagtttgatcagtagtgtggtaaaaatgaaggacagttatttttggatagctcttcaggaccaaaatgatacgggagaatacacttggaagccagtagggcagaaacccgagccggtgcagtacacacactggaacacacaccagccgcgctacagtggtggctgtgttgccatgcgaggaaggcatccacttggtcgctgggaagtgaagcactgtcggcactttaaggcaatgtccttgtgcaagcagccagttgaaaatcaggaaaaagcagagtatgaagagagatggccctttcacccctgctatttggactgggagtcagagcctggtctggccagttgcttcaaggtatttcatagtgaaaaagttctgatgaaaagaacatggagagaagctgaagcattttgcgaagaatttggagctcatcttgcaagctttgcccatattgaggaagagaattttgtgaatgagctcttacattcaaaatttaattggacagaagaaaggcagttctggattggatttaataaaagaaacccactgaatgccggctcatgggagtggtctgatagaactcctgttgtctcttcgtttttagacaacacttattttggagaagatgcaagaaactgtgctgtttataaggcaaacaaaacattgctgcccttacactgtggttccaaacgtgaatggatatgcaaaatcccaagagatgtgaaacccaagattccgttctggtaccagtacgatgtaccctggctcttttatcaggatgcagaatacctttttcatacctttgcctcagaatggttgaactttgagtttgtctgtagctggctgcacagtgatcttctcacaattcattctgcacatgagcaagaattcatccacagcaaaataaaagcgctatcaaagtatggtgcaagttggtggattggacttcaagaagaaagagccaatgatgaatttcgctggagagatggaacaccagtgatataccagaactgggacacaggaagagaaagaactgtgaataatcagagccagagatgtggctttatttcttctataacaggactctggggtagtgaagagtgttcagtttctatgcctagtatctgtaagcgaaaaaaggtttggctcatagagaaaaagaaagatacaccaaaacaacatggaacgtgtcccaaaggatggctatattttaactataagtgccttctgctgaatatccccaaagacccaagcagttggaagaactggacgcatgctcaacatttctgtgctgaagaaggggggaccctggtcgccattgaaagtgaggtggagcaagctttcattactatgaatctttttggccagaccaccagtgtgtggataggtttacaaaatgatgattatgaaacatggctaaatggaaagcctgtggtatattctaactggtctccatttgatataataaatattccaagtcacaataccactgaagttcagaaacacattcctctctgtgccttactctcaagtaatcctaattttcatttcactggaaaatggtattttgaagactgtggaaaggaaggctatgggtttgtttgtgaaaaaatgcaagatacttctggacacggtgtaaatacatctgatatgtatccaatgcccaataccttagaatatggaaaccaccaccaccaccaccac(SEQ ID NO.2)。

(2)磷脂酶A2受体重组蛋白表达。

采用本领域常规技术手段将上述全基因合成的表达PLA2R蛋白片段的多核酸序列克隆至表达质粒pET-26b中：

使用引物1和引物2扩增获得带有限制性内切酶NotI和HindIII的PLA2R基因片段，分别使用10个单位的NotI和HindIII限制性内切酶酶切1μg核酸样本各30分钟，然后使用PCR纯化试剂盒(QIAGEN)纯化得到核酸片段后使用T4连接酶接入质粒pET-26b中。引物1和引物2的序列如下：引物1:5’-aagctt tgtcaggctgata-3’(SEQ ID NO.3)，引物2:5’-gcggccgcgtttccatat-3’(SEQ ID NO.4)。

上述克隆成功后的质粒采用电转方式转入BL21电感受态细菌株中：将200ng克隆成功后的质粒与40μL大肠杆菌混合后加入0.1cm间隙的电转杯中，使用伯乐GenepulserXcell^TM进行电转，转入程序为约4.2msec的1.7kV，200Ω电阻，25mF单一电脉冲。将电转后的大肠杆菌与1mL LB培养液混匀，在37℃培养箱里摇晃修复1小时得到单克隆大肠杆菌。将单克隆大肠杆菌按照1：5000(v/v)比例转入LB琼脂糖培养液中，在37℃摇床内培养4-6小时直到菌液OD600达到0.5-0.6，立刻在菌液中加入终浓度为1mM IPTG后继续在37℃以160rpm摇匀培养3小时。

LB培养液配方：1％(g/ml)蛋白胨，1％(g/ml)酵母提取物，0.5％(g/ml)氯化钠，余量水。

LB琼脂糖培养板配方：1％(g/ml)蛋白胨，1％(g/ml)酵母提取物，0.5％(g/ml)氯化钠，1.5％(g/ml)细菌培养琼脂糖，70μg/mL卡那霉素，余量水。

(3)磷脂酶A2受体重组蛋白提取。

使用重复冻融法破碎菌体释放表达得到的PLA2R重组蛋白：

将上述含有PLA2R重组蛋白的菌液在25℃通过8000rpm速度离心15分钟后，去除上清液。将离心后的菌体浸没在液氮中20秒后取出，立刻放入37℃水域解冻直至菌体充分解冻为止。重复以上操作3次后，菌体充分裂解，将大肠杆菌内不溶的包含体使用100mL pH6.4的盐酸胍溶液进行重悬，所有包含体都溶解于此盐酸胍溶液中。充分搅拌重悬后的混合液再次通过10000rpm速度离心分离30分钟后，取上清溶液保存待用，上清液中含有变性PLA2R重组蛋白。

盐酸胍溶液配方：6M盐酸胍，250mM氯化钠，余量水，用1M氢氧化钠调节pH至6.0。

(4)PLA2R重组蛋白复性。

将上述上清液按照1：50体积比与蛋白复性液混合，持续混匀30分钟后，向复性溶液中滴加还原性麸胱甘肽到其终浓度为0.1M，混匀15分钟后在逐渐滴加氧化性麸胱甘肽至其终浓度为0.025M，将溶液充分混匀后在室温静置18小时即完成蛋白复性。

复性溶液配方：50mM Tris，100mM精氨酸，250mM氯化钠，0.01％(g/v)P300防腐剂，余量水。

(5)PLA2R重组蛋白纯化。

镍离子亲和纯化柱(Ni-NTA柱)作为PLA2R重组蛋白纯化的第一步。将复性后的PLA2R重组蛋白透析到磷酸缓冲液(PBS)中，磷酸缓冲液配方为：137mM氯化钠，2.7mM氯化钾，10mM磷酸氢二钠和1.8mM磷酸二氢钾。将蛋白溶液以5mL/min速度流过Ni-NTA纯化柱，然后使用5倍柱体积的PBS缓冲液冲洗柱子，最后使用蛋白解离液将PLA2R重组蛋白从填料上解离出来。解离液配方为：137mM氯化钠，2.7mM氯化钾，10mM磷酸氢二钠，1.8mM磷酸二氢钾和250mM咪唑。

阳离子交换层析柱作为PLA2R重组蛋白纯化的第二步。将从Ni-NTA层析柱上解离得到的PLA2R重组蛋白溶液透析到平衡缓冲液中，平衡缓冲液配方为50mM MOPS，用NaOH将pH调节到5.5。将透析后的蛋白溶液以5mL/分钟的速度流过SP sepharose阳离子交换柱(GE)，随后用5体积的上述平衡液冲洗柱子，最后用阳离子交换柱解离液解离PLA2R重组蛋白。阳离子交换柱解离液配方为：50mM MOPS，1M氯化钠，用1M NaOH将pH调节到6.0。

分子筛层析柱Sephacryl S-100作为PLA2R重组蛋白纯化的最后一步。将阳离子交换柱解离的蛋白溶液透析到PBS缓冲液中，PBS缓冲液配方为：137mM氯化钠，2.7mM氯化钾，10mM磷酸氢二钠和1.8mM磷酸二氢钾。将蛋白浓缩到20mg/ml浓度，上样进入分子筛层析柱Sephacryl S-100。用10体积的PBS对层析柱进行冲洗，收集对应PLA2R分子量为72kDa的组份，这些组份混合后即为复性且纯化后的PLA2R重组蛋白。

通过SDS-PAGE电泳分析得到PLA2R重组蛋白的蛋白纯度：将10μg PLA2R纯化蛋白上样到SDS-PAGE，电泳按150V运行60分钟，得到清晰单一的蛋白条带(图1)，蛋白纯度大于95％。

通过western blot对PLA2R重组蛋白活性进行验证：将天然全长PLA2R蛋白与本实施例的PLA2R重组蛋白各5μg跑SDS-PAGE电泳，完成后将蛋白转移到硝酸纤维素膜上，用包含抗PLA2R抗体的阳性样本作为一抗孵育，阳性样本1/100稀释在PBS/Tween(Tween含量为0.05％(v/v))中，孵育1小时后用PBS冲洗3次，然后用偶联了HRP的抗人IgG作为二抗孵育,抗人IgG-HRP1/10000稀释在PBS/Tween中，孵育一小时后用PBS冲洗3次。最后加入ECL底物显色后得到清晰的反应条带。验证PLA2R重组蛋白的活性与天然全长PLA2R蛋白相当甚至更好(图2中70KD处的条带对应PLA2R重组蛋白，150KD处的条带对应天然全长PLA2R蛋白)。

采用酶联免疫法定量比较PLA2R重组蛋白的活性与天然全长PLA2R蛋白的活性和免疫源性：分别采用0.2μgPLA2R重组蛋白与天然全长PLA2R蛋白包被酶标板，37℃包被2小时后用PBS清洗5次，用PBS/1％BSA(g/ml)封闭酶标板1小时，然后用PBS清洗酶标板5次，加入使用PBS/0.05％(v/v)Tween20稀释50倍的抗PLA2R抗体阳性样本(医疗机构提供)，37℃孵育1小时后，使用清洗酶标板5次。在酶标板内加入用PBS/0.05％(v/v)Tween20稀释5000倍的抗人IgG-HRP(Thermo Fisher)，37℃孵育1小时后用PBS/0.05％(v/v)Tween20清洗5次。最后加入TMB预配置溶液等待10分钟后加入100μL/孔1M盐酸终止反应。在450nm下读取信号值，结果见图3，PLA2R重组蛋白的反应信号高于天然全长PLA2R蛋白反应信号。

(6)PLA2R重组蛋白保存。

将复性且纯化后的PLA2R重组蛋白转移至蛋白保护液中，蛋白保护液的配方为：50mM Tris，200mM氯化钠，20mM精氨酸，1％甘油，0.01％P300防腐剂，余量水。

每3个月对PLA2R重组蛋白稳定性及活性通过上述描述的SDS-PAGE及Westernblot法进行检验，分别将PLA2R重组蛋白保存在4℃以及-20℃下，PLA2R重组蛋白在一年期间活性和稳定性保持不变(图4和图5)。

对比例1

本对比例提供一种磷脂酶A2受体重组蛋白的制备方法，其基本同实施例1，区别仅在于PLA2R重组蛋白复性操作时采用的复性溶液配方：50mM Tris，50mM尿素，200mM氯化钠，0.01％(g/v)P300防腐剂。经上述描述的酶联免疫法定量比较本对比例制备的PLA2R重组蛋白的活性与天然全长PLA2R蛋白的活性和反应性，结果显示本对比例制备的PLA2R重组蛋白的反应信号明显低于天然全长PLA2R蛋白和上述复性溶液复性得到的PLA2R重组蛋白的反应信号。

对比例2

本对比例提供一种磷脂酶A2受体重组蛋白的制备方法，其基本同实施例1，区别仅在于PLA2R重组蛋白纯化步骤调整为直接将复性后的蛋白通过镍离子亲和纯化柱(Ni-NTA柱)进行纯化和解离。通过SDS-PAGE电泳分析得到PLA2R重组蛋白的蛋白纯度，电泳图除了PLA2R主条带外，还有10条杂带，杂带的蛋白含量略低于主条带，本对比例制备的PLA2R重组蛋白的纯度为60％。

对比例3

本对比例提供一种磷脂酶A2受体重组蛋白的制备方法，其基本同实施例1，区别仅在于蛋白保护液配方调整为20mM Tris，200mM氯化钠，0.01％P300防腐剂，余量水。通过上述描述的SDS-PAGE及Western blot法进行检验，分别将PLA2R重组蛋白保存在4℃以及-20℃下，PLA2R重组蛋白活性和稳定性在6月时出现明显下降。

以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (12)

1.一种磷脂酶A2受体重组蛋白的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括如下步骤：

(1)将表达所述磷脂酶A2受体重组蛋白的核酸在原核细胞中表达蛋白；

(2)采用重复冻融法和盐酸胍溶液重悬法提取原核细胞中表达的蛋白，

(3)对步骤(2)所得的蛋白进行复性，得到所述磷脂酶A2受体重组蛋白，

其中，步骤(1)中，所述核酸编码的蛋白具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或与其至少具有95％的同源性，

步骤(3)中，所述复性采用的复性溶液的配方为：40～80mM Tris，80～150mM精氨酸，200～300mM氯化钠，0.005％～0.02％(g/v)P300防腐剂，余量水。

2.根据权利要求1所述的磷脂酶A2受体重组蛋白的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述核酸编码的蛋白的氨基酸序列为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；

和/或，所述核酸具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列或与其至少具有95％的同源性。

3.根据权利要求1所述的磷脂酶A2受体重组蛋白的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述原核细胞为大肠杆菌。

4.根据权利要求1所述的磷脂酶A2受体重组蛋白的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述盐酸胍溶液的配方为：4～8M盐酸胍，200～300mM氯化钠，余量水；采用碱性物质调节所述盐酸胍溶液pH值为5.5～6.5。

5.根据权利要求1所述的磷脂酶A2受体重组蛋白的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，所述复性的方法为：将步骤(2)所得的蛋白和所述复性溶液按照体积比为1：40～60混合，同时滴加还原性麸胱甘肽至其终浓度为0.05～0.2M，混匀后滴加氧化性麸胱甘肽至其终浓度为0.02～0.03M，室温静置15～20小时。

6.根据权利要求1所述的磷脂酶A2受体重组蛋白的制备方法，其特征在于：所述制备方法还包括对步骤(3)得到的所述磷脂酶A2受体重组蛋白进行纯化的步骤，所述纯化的步骤为将所述磷脂酶A2受体重组蛋白依次经镍离子亲和纯化柱、阳离子交换层析柱和分子筛层析柱。

7.根据权利要求6所述的磷脂酶A2受体重组蛋白的制备方法，其特征在于：所述纯化步骤具体包括：

S1：将步骤(3)得到的所述磷脂酶A2受体重组蛋白透析到磷酸缓冲液中，然后过镍离子亲和纯化柱，接着使用磷酸缓冲液冲洗柱子，再使用第一解离液洗脱蛋白得到蛋白初步洗脱液，所述第一解离液的配方为：100～150mM氯化钠，2～3.5mM氯化钾，5～15mM磷酸氢二钠，1～2.5mM磷酸二氢钾和200～300mM咪唑；

S2：将步骤S1得到的蛋白初步洗脱液透析到pH值为5～6的MOPS缓冲液中，然后过阳离子交换层析柱，接着使用MOPS缓冲液冲洗柱子，再使用第二解离液洗脱蛋白得到蛋白二次洗脱液，所述第二解离液的配方为：40～60mM MOPS，0.5～1.5M氯化钠，余量水；采用碱性物质调整所述第二解离液的pH值为5.5～6.5。

S3：将步骤S2得到的蛋白二次洗脱液透析到磷酸缓冲液中，然后过分子筛层析柱，接着使用磷酸缓冲液冲洗柱子，收集分子量为75kDa的蛋白，即为纯化后的所述磷脂酶A2受体重组蛋白。

8.根据权利要求6所述的磷脂酶A2受体重组蛋白的制备方法，其特征在于：经所述纯化步骤后的所述磷脂酶A2受体重组蛋白封存于蛋白保存液中，所述蛋白保护液的配方为：40～60mM Tris，150～250mM氯化钠，15～25mM精氨酸，0.5～1.5％(v/v)甘油，0.01％(g/v)P300防腐剂，余量水。

9.根据权利要求1所述的磷脂酶A2受体重组蛋白的制备方法，其特征在于：

步骤(1)具体为：将所述核酸克隆到pET-26b质粒中，然后电转染大肠杆菌，电转染后的大肠杆菌采用LB琼脂糖培养至大肠杆菌的OD600值达到0.5～0.6后，加入IPTG后继续培养2～5小时；

步骤(2)具体为：将步骤(1)得到的大肠杆菌菌液在5000～10000rpm离心去除上清液，将菌体沉淀用液氮速冻后放入30～40℃水浴解冻，重复以上速冻解冻流程2～4次后，采用所述盐酸胍溶液重悬，重悬后以8000～12000rpm离心，收集上清液。

10.一种磷脂酶A2受体重组蛋白，其特征在于：所述磷脂酶A2受体重组蛋白由权利要求1至9中任一项所述的制备方法制备得到。

11.一种用于检测抗磷脂酶A2受体抗体或用于检测与抗磷脂酶A2受体抗体阳性相关的疾病的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括权利要求8所述的磷脂酶A2受体重组蛋白。

12.根据权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒为化学发光检测试剂盒；

和/或，所述的试剂盒的检测样本类型为血清、血浆或全血中的一种或多种；

和/或，所述的与抗磷脂酶A2受体抗体阳性相关的疾病为膜性肾病。

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