CN110746499A - 一种血清淀粉样蛋白a突变体及其应用和制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种血清淀粉样蛋白A突变体，所述突变体具有SEQ ID NO.1所述的氨基酸序列，经过几个氨基酸的替换后仍具有血清淀粉样蛋白的抗原性，得到唯一的突变体。本发明通过对天然SAA蛋白中的4个氨基酸进行替换，得到SAA突变体，提高了其体外稳定性。实验证明，本发明所获得SAA蛋白为可溶的成熟蛋白，最大可能的保持了其活性，保留了天然SAA蛋白的抗原性。本发明还公开了该血清淀粉样蛋白A突变体的应用以及制备方法。

Description

一种血清淀粉样蛋白A突变体及其应用和制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术技术领域，尤其是涉及一种血清淀粉样蛋白A突变体。本发明还涉及该突变体的应用和制备方法。

背景技术

血清淀粉样蛋白A(Serum Amyloid Protein A，SAA)是一种急性时相反应蛋白，属于载脂蛋白家族中的异质类蛋白，相对分子量约12 000。肝内合成的SAA释放入血后，迅速与HDL结合。在体内的代谢主要通过血清、细胞表面及细胞内的蛋白酶降解，肝脏是其主要的降解场所。肝外细胞产生的SAA主要通过细胞间的黏附及内吞作用经细胞表面或细胞内的蛋白酶降解。SAA在各急性时相蛋白中反映最敏锐，疾病好转、康复，SAA首先下降并回归正常。近20年来全世界的临床研究均表明SAA也是一项疾病动态监测的优秀指标，对同一患者的同一疾病，相隔数天，SAA随疾病的变化波动会很大。SAA在疾病的治疗效果评价和预后评估上有较高的临床价值。

目前，用于临床血清SAA检测的方法主要包括放射性免疫测定法(RIA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫速率散射比浊法、微球捕获酶免疫法(MEIA)等。这些方法中都需要用到不同或一定浓度的SAA抗原作为标准品制作标准曲线，从而计算样品中SAA的含量。国内禁止买卖人血清，从国外购买SAA成本昂贵且来源有限，发展重组SAA代替人源SAA非常有必要。目前重组表达的SAA蛋白非常容易形成聚集与降解，在体外的稳定性非常不好，容易降解，并且不容易获得具有天然结构的SAA蛋白，这些缺点大大地限制了SAA的应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种血清淀粉样蛋白A突变体，它具有体外稳定性较佳，具有天然抗原性的特点。本发明还公开了该血清淀粉样蛋白A突变体的应用以及制备方法。

本发明所采用的技术方案是：

一种血清淀粉样蛋白A突变体，所述突变体具有SEQ ID NO.1所述的氨基酸序列，经过几个氨基酸的替换后仍具有血清淀粉样蛋白的抗原性，得到唯一的突变体。

所述突变体具有SEQ ID NO.1所述的氨基酸序列。

所述基因具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或者所述基因具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的核苷酸序列。

所述基因具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

一种重组载体，所述载体含有前述的基因。

血清淀粉样蛋白A突变体，在制备血清淀粉样蛋白A抗原中的应用。

血清淀粉样蛋白A突变体，在血清淀粉样蛋白A检测试剂中标准曲线绘制中的应用。

一种血清淀粉样蛋白A突变体的制备方法，包括以下步骤：

1)血清淀粉样蛋白A突变体氨基酸序列的设计：根据NCBI网站公布的SAA蛋白的氨基酸序列以及该序列的特征，将第52位氨基酸由Ala替换为Val，第57位氨基酸由Val替换为Ala，第60位氨基酸由Asp替换为Asn，第71位氨基酸由His替换为Arg，获得SEQ ID NO.1；

2)血清淀粉样蛋白A突变体基因的优化和获得：采用大肠杆菌优势密码子对SEQID NO.1进行优化，得到SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，通过退火延伸PCR技术，获得由大肠杆菌优势密码子组成的血清淀粉样蛋白突变体基因；

3)血清淀粉样蛋白A突变体表达载体的构建：将步骤2)中获得的大肠杆菌的血清淀粉样蛋白突变体基因序列用NdeI和XhoI进行双酶切，与同样经过NheI和XhoI双酶切的pET-32a(+)载体进行连接，得到表达载体；

4)血清淀粉样蛋白A突变体的表达纯化：将步骤3)中获得的表达载体转化大肠杆菌BL-21感受态细胞，得到血清淀粉样蛋白A突变体表达菌株，进行培养、诱导表达、纯化以及透析除盐，最终获得所述可溶性血清淀粉样蛋白A突变体。

本发明所具有的优点是：体外稳定性较佳，具有天然抗原性。即，本发明通过对天然SAA蛋白中的4个氨基酸进行替换，得到SAA突变体，提高了其体外稳定性。实验证明，本发明所获得SAA蛋白为可溶的成熟蛋白，最大可能的保持了其活性，保留了天然SAA蛋白的抗原性。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明：

图1是本发明的实施例3中对重组质粒pET-32a(+)-SAA突变型)、pET-32a(+)和SAA突变体基因分别进行Xho I和Nde I双酶切鉴定的示意图；

图2是本发明的实施例5中对上清进行SDS-PAGE电泳检测的示意图；

图3是本发明的实施例5中对透析样品进行SDS-PAGE电泳检测的示意图，且和图2采用了相同的Mark。

具体实施方式

实施例1

SAA突变体氨基酸序列的设计：

根据NCBI网站公布的SAA蛋白的氨基酸序列以及该序列的特征，将第52位氨基酸由Ala替换为Val，第57位氨基酸由Val替换为Ala，第60位氨基酸由Asp替换为Asn，第71位氨基酸由His替换为Arg。在保留天然SAA抗原性的前提下，获得的SAA突变体的氨基酸序列，如SEQ ID NO.1所示。该突变体稳定性显著优于天然血清淀粉样蛋白A。

实施例2

SAA突变体基因序列的优化和获得：

采用大肠杆菌优势密码子对SAA突变体核苷酸序列进行人工优化，最终得到SEQID NO.2所示核苷酸序列。通过退火延伸PCR技术，获得由大肠杆菌优势密码子组成的SAA突变体基因，具体操作步骤可以参考授权公告号为CN 104610443B的中国发明专利中所述。

实施例3

SAA突变体表达载体的构建：

将实施例2中获得到SAA突变体基因序列用NdeI和XhoI进行双酶切后替换原核表达载体pET-32a(+)(根据Merck Millipore公司，目录号是69015)的Xho I/Nde I之间的片段，得到pET-32a(+)-SAA(突变型)。

对重组质粒pET-32a(+)-SAA突变型)、pET-32a(+)和SAA突变体基因分别进行XhoI和Nde I双酶切鉴定，结果如图1所示，其中M：DL5000Marker；1:pET-32a(+)-SAA(突变型)重组质粒双酶切；2：pET-32a(+)质粒双酶切；3；SAA突变体基因双酶切。由图1可以看出，重组质粒经Xho I和Nhe I双酶切后，电泳均可见到两条与预期分子量大小一致条带，与pET-32a(+)和SAA突变体基因的大小相符。

实施例4

SAA突变体表达菌株的构建：

(1)从-80℃低温冰箱中取出一支大肠杆菌感受态细胞BL-21(100μL/支)，迅速冰浴化开；

(2)分别取10ng上述重组载体pET-32a(+)-SAA(突变型)加入100μL感受态细胞内，轻轻混匀，冰浴30分钟；于42℃下热激90秒；

(3)迅速冰浴5分钟；

(4)加入1mL LB培养基(无抗生素)，混匀，37℃摇床下复苏培养30分钟；

(5)取50μL全部培养物涂布于含氨苄的LB平板上，于37℃培养16小时，挑选单菌落至5mLLB培养基(含氨苄)，37℃培养16小时；

(6)按1:100比例接种于50mLLB培养基(含氨苄)，37℃培养2.5h左右至对数期，IPTG诱导3小时后SDS-PAGE电泳，此即为成功转化的宿主细胞，命名为pET-32a(+)-SAA/BL21(突变型)。

实施例5

SAA突变体的表达纯化：

(1)将所得阳性克隆pET-32a(+)-SAA/BL21(突变型)接种于含有氨苄的LB培养基中，于37℃，250rpm下培养8～12小时，得到第一菌液；

(2)将第一菌液按1:100比例接种于LB培养基中，于37℃，250rpm下培养至OD600达到0.6，得到第二菌液；

(3)于第二菌液中添加终浓度为0.2mmol/L的IPTG，于37℃，250rpm下培养3小时，得到第三菌液；

(4)将所得第三菌液离心，收集菌体，对菌体进行超声破碎，然后离心弃沉淀留上清；

(5)将上清进行SDS-PAGE电泳检测，结果如图2所示，M：Marker；1:pET-32a(+)-SAA(突变型)上清，可以看出pET-32a(+)-SAA/BL21(突变型)上清中含有约13KD的目标蛋白SAA抗原；

(6)对所得上清液进行过博格隆5mL Ni柱进行纯化，平衡液为20mM PH 7.4PB，500mM咪唑洗脱液(配方20mMPBl+500mM咪唑，PH 7.4)洗脱；

(7)透析后分装保存于缓冲液中；

(8)取透析样品进行SDS-PAGE电泳检测，结果如图3所示，M：Marker；1:pET-32a(+)-SAA(突变型)，从图2中可知蛋白分子量大小与理论大小一致。

实施例6

SAA突变体抗原性检测

(1)将纯化后的突变体蛋白与天然SAA分别使用碳酸盐缓冲液稀释成100ng/mL,100μL/孔，4℃放置过夜；

(2)弃反应液，洗涤拍干，将DAKO抗人血清淀粉样蛋白A多抗稀释为1:10000、1:20000、1:40000、1:80000、1:160000、1:320000与1:640000，纵向加入100μL/孔，37℃反应60min；

(3)弃反应液，洗涤拍干，将羊抗兔酶标二抗稀释为1:4000，100μL/孔，37℃反应60min；

(4)弃反应液，洗涤拍干，加TMB显色液，100μL/孔，37℃反应10min；

(5)加入终止液2mol/l硫酸，50μL/孔，OD450读数。结果见表1。

表1：SAA突变体抗原性检测

抗体稀释梯度	SAA突变体酶标读数	天然SAA酶标读数
			1:10000	1.516	1.528
1:20000	1.463	1.492
			1:40000	1.112	1.156
1:80000	0.584	0.593
			1:160000	0.326	0.386
1:320000	0.218	0.221
			1:640000	0.135	0.175
阴性	0.054	0.062
			空白	0.055	0.051

从表1可知：突变体蛋白与抗人血清淀粉样蛋白A多抗具有反应，且反应强度与天然SAA蛋白接近一致，说明突变体蛋白具有天然SAA的抗原性。

实施例7

使用SAA体外诊断试剂盒对上述突变型SAA抗原进行梯度检测，稀释后作为样本在日立7180生化仪上进行检测。结果见表2。

表2：SAA突变体线性检测

从上表可知：SAA突变体具有良好的线性，可应用在血清淀粉样蛋白A检测试剂中标准曲线的绘制。

实施例8

SAA突变体稳定性测定：

使用SAA体外诊断试剂盒对上述突变型SAA抗原和天然SAA抗原的稳定性进行检测。将本发明所述的SAA突变体和作为对照的天然SAA抗原放入37℃培养箱中，共7天，采用终点法检测，将两者分别作为样本在日立7180生化仪上进行检测。为方便检测，共采用两个浓度进行检测。检测结果见表3和表4。

表3：SAA突变体稳定性检测

100μg/mL浓度直接检测，3mg/mL浓度稀释至1/2检测。

表4：天然SAA稳定性检测

100μg/mL浓度直接检测，3mg/mL浓度稀释至1/2检测。

从表3和表4可知：本发明的SAA突变体，与0天相比37℃破坏后检测值波动不大，稳定性好；对照SAA与0天相比37℃破坏后，检测值下降明显，稳定性差。

以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

序列表

<110> 宁波赛珀生物技术有限公司

<120> 人血清淀粉样蛋白A突变体的制备方法及用途

<141> 2019-11-28

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 104

<212> PRT

<213> 人类(human)

<400> 1

Arg Ser Phe Phe Ser Phe Leu Gly Glu Ala Phe Asp Gly Ala Arg Asp

1 5 10 15

Met Trp Arg Ala Tyr Ser Asp Met Arg Glu Ala Asn Tyr Ile Gly Ser

20 25 30

Asp Lys Tyr Phe His Ala Arg Gly Asn Tyr Asp Ala Ala Lys Arg Gly

35 40 45

Pro Gly Gly Val Trp Ala Ala Glu Ala Ile Ser Asn Ala Arg Glu Asn

50 55 60

Ile Gln Arg Phe Phe Gly Arg Gly Ala Glu Asp Ser Leu Ala Asp Gln

65 70 75 80

Ala Ala Asn Glu Trp Gly Arg Ser Gly Lys Asp Pro Asn His Phe Arg

85 90 95

Pro Ala Gly Leu Pro Glu Lys Tyr

100

<210> 2

<211> 312

<212> DNA

<213> 人类(human)

<400> 2

cgtagctttt ttagctttct gggcgaagcc tttgatggtg ctcgcgatat gtggcgcgcc 60

tatagtgata tgcgtgaagc taattatatc ggctcagata aatgtgttca tgcgaggggc 120

gattatgatg ctgccaaacg cggtccgggc ggtgcttggg ccgcagaagt tattagcaat 180

gcccgtgaaa atattcagcg gttttttggt cgtggtgccg aagattcact ggctgatcag 240

gcagccaatg aatggggtcg ttctggcaaa gatcctaatc attttcgtcc tgctggttta 300

ccggaaaaat at 312

<210> 3

<211> 104

<212> PRT

<213> 人类(human)

<400> 3

Arg Ser Phe Phe Ser Phe Leu Gly Glu Ala Phe Asp Gly Ala Arg Asp

1 5 10 15

Met Trp Arg Ala Tyr Ser Asp Met Arg Glu Ala Asn Tyr Ile Gly Ser

20 25 30

Asp Lys Tyr Phe His Ala Arg Gly Asn Tyr Asp Ala Ala Lys Arg Gly

35 40 45

Pro Gly Gly Ala Trp Ala Ala Glu Val Ile Ser Asp Ala Arg Glu Asn

50 55 60

Ile Gln Arg Phe Phe Gly His Gly Ala Glu Asp Ser Leu Ala Asp Gln

65 70 75 80

Ala Ala Asn Glu Trp Gly Arg Ser Gly Lys Asp Pro Asn His Phe Arg

85 90 95

Pro Ala Gly Leu Pro Glu Lys Tyr

100

Claims (8)

1.一种血清淀粉样蛋白A突变体，其特征在于：所述突变体具有SEQ ID NO.1所述的氨基酸序列，经过几个氨基酸的替换后仍具有血清淀粉样蛋白的抗原性，得到唯一的突变体。

2.根据权利要求1所述的血清淀粉样蛋白A突变体，其特征在于：所述突变体具有SEQID NO.1所述的氨基酸序列。

3.一种血清淀粉样蛋白A突变体的基因，其特征在于：所述基因具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或者所述基因具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的核苷酸序列。

4.根据权利要求3所述的血清淀粉样蛋白A突变体的基因，其特征在于：所述基因具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

5.一种重组载体，其特征在于：所述载体含有如权利要求3所述的基因。

6.根据权利要求1所述的血清淀粉样蛋白A突变体，在制备血清淀粉样蛋白A抗原中的应用。

7.根据权利要求1所述的血清淀粉样蛋白A突变体，在血清淀粉样蛋白A检测试剂中标准曲线绘制中的应用。

8.一种血清淀粉样蛋白A突变体的制备方法，包括以下步骤：

1)血清淀粉样蛋白A突变体氨基酸序列的设计：根据NCBI网站公布的SAA蛋白的氨基酸序列以及该序列的特征，将第52位氨基酸由Ala替换为Val，第57位氨基酸由Val替换为Ala，第60位氨基酸由Asp替换为Asn，第71位氨基酸由His替换为Arg，获得SEQ ID NO.1；

2)血清淀粉样蛋白A突变体基因的优化和获得：采用大肠杆菌优势密码子对SEQ IDNO.1进行优化，得到SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，通过退火延伸PCR技术，获得由大肠杆菌优势密码子组成的血清淀粉样蛋白突变体基因；

3)血清淀粉样蛋白A突变体表达载体的构建：将步骤2)中获得的大肠杆菌的血清淀粉样蛋白突变体基因序列用NdeI和XhoI进行双酶切，与同样经过NheI和XhoI双酶切的pET-32a(+)载体进行连接，得到表达载体；

4)血清淀粉样蛋白A突变体的表达纯化：将步骤3)中获得的表达载体转化大肠杆菌BL-21感受态细胞，得到血清淀粉样蛋白A突变体表达菌株，进行培养、诱导表达、纯化以及透析除盐，最终获得所述可溶性血清淀粉样蛋白A突变体。

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