CN117603335A - 人血清淀粉样蛋白a突变体 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人血清淀粉样蛋白A突变体。其中，本发明的人血清淀粉样蛋白A突变体与人血清淀粉样蛋白A野生型相比，所述人血清淀粉样蛋白A突变体具有如下位点的突变：N28C、Y29C、I30C、G31C、G48C、P49C、H70C、G71C、A72C或E73C；所述人血清淀粉样蛋白A野生型具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。该人血清淀粉样蛋白A突变体，相比于野生型人血清淀粉样蛋白A，具有游离的巯基，可与多臂‑PEG衍生物（例如八臂PEG马来酰亚胺;8‑arm‑PEG Maleimide）进行偶联反应，形成免疫原性提高的蛋白缀合物。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地，本发明涉及一种人血清淀粉样蛋白A突变体，更具体地，本发明涉及一种蛋白缀合物、制备蛋白缀合物的方法和提高人血清淀粉样蛋白A免疫原性的方法。
背景技术
血清淀粉样蛋白A（serum amyloid A protein；SAA）是一种由肝脏合成的蛋白质，它在炎症和组织损伤等情况下大量产生。SAA是一类多形态的蛋白家族，由多个基因编码，位于11号染色体短臂。SAA属于急性时相反应蛋白家族，是急性炎症反应的一个重要成分。在急性炎症或组织损伤的情况下，SAA的合成和分泌会显著增加。它的表达水平可以通过炎症介质（如白细胞介素-1、白细胞介素-6等）的刺激而被诱导。SAA的主要功能是参与炎症和免疫应答过程。它可以通过多种途径被诱导合成，包括细菌感染、组织损伤、肿瘤、慢性炎症性疾病等。一旦合成，SAA会被释放到血液循环中，并在肝脏和其他组织中被转运和代谢。在炎症过程中，SAA在体内发挥多种作用。它可以作为炎症标志物，其浓度的升高可以指示炎症的存在和严重程度。此外，SAA还具有炎症介导的免疫调节活性，包括激活巨噬细胞、调节炎症细胞的迁移和增殖、促进炎症相关蛋白的合成等。然而，SAA的免疫原性偏低，无法通过常规免疫途径制备获得效价较高的SAA抗体。
因此，亟需制备免疫原性提高的血清淀粉样蛋白A（serum amyloid A protein；SAA），以制备效价较高的SAA抗体。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。
本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
发明人发现，SAA分子量只有12KD，是典型的小分子抗原，本身免疫原性不高，导致常规免疫途径制备获得的SAA抗体效价偏低，容易出现漏检和检测灵敏度不够的问题。为了克服这一问题，发明人选择将人血清淀粉样蛋白A结构域连接处的位点分别突变为半胱氨酸，半胱氨酸自带游离的巯基可用于与多臂PEG衍生物（例如八臂PEG马来酰亚胺；8-arm-PEG Maleimide）进行偶联反应，形成蛋白缀合物。ELISA实验结果证明，该蛋白缀合物作为抗原进行免疫后可以有效提高抗体效价。
基于此，本发明的第一个方面，本发明提出了一种人血清淀粉样蛋白A突变体。根据本发明的实施例，所述人血清淀粉样蛋白A突变体与人血清淀粉样蛋白A野生型相比，所述人血清淀粉样蛋白A突变体具有如下位点的突变：N28C、Y29C、I30C、G31C、G48C、P49C、H70C、G71C、A72C或E73C；所述人血清淀粉样蛋白A野生型具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。根据本发明实施例的人血清淀粉样蛋白A突变体，相比于野生型人血清淀粉样蛋白A，具有游离的巯基，可与多臂-PEG衍生物（八臂PEG马来酰亚胺; 8-arm-PEG Maleimide）进行偶联反应，形成免疫原性提高的蛋白缀合物。
本发明的第二个方面，本发明提出了一种蛋白缀合物。根据本发明的实施例，所述蛋白缀合物包括：本发明的第一个方面所述的人血清淀粉样蛋白A突变体；缀合物，所述人血清淀粉样蛋白A突变体与所述缀合物相连。根据本发明实施例的蛋白缀合物，相比于野生型人血清淀粉样蛋白A，免疫原性显著提高。
本发明的第三个方面，本发明提出了一种制备蛋白缀合物的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将本发明第一方面所述的人血清淀粉样蛋白A突变体和缀合物进行接触处理，得到所述蛋白缀合物。根据本发明实施例的方法，可制备与野生型人血清淀粉样蛋白A相比，免疫原性显著提高的蛋白缀合物。
本发明的第四个方面，本发明提出了一种提高人血清淀粉样蛋白A免疫原性的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将所述人血清淀粉样蛋白A与多臂聚乙二醇衍生物进行接触处理；其中，所述人血清淀粉样蛋白A选自本发明第一方面所述的人血清淀粉样蛋白A突变体，所述多臂聚乙二醇衍生物与本发明第二方面所述的蛋白缀合物中所限定的缀合物一致。根据本发明实施例的方法，可提高人血清淀粉样蛋白A的免疫原性。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1为本发明技术实施流程。
图2为SAA分子结构及突变区域示意图。
图3为八臂PEG马来酰亚胺分子结构示意图。
图4为八臂PEG马来酰亚胺修饰突变后SAA及多聚SAA分子示意图。
图5为实施例1中不同类型SAA分子免疫效果对比图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
在本发明中，术语“包含”或“包括”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。
在本发明中，术语“任选地”、“任选的”或“任选”通常是指随后所述的事件或状况可以但未必发生，并且该描述包括其中发生该事件或状况的情况，以及其中未发生该事件或状况的情况。
在本发明中，术语“抗体”在最广义上使用，其可以包括全长单克隆抗体、多特异性抗体、以及嵌合抗体，具体结构不受限制，只要它们展示所需的生物学活性。其通常包括分子量较轻的轻链和分子量较重的重链，重链（H链）和轻链（L链）由二硫键连接形成的抗体分子。其中，肽链的氨基端（N端）氨基酸序列变化很大，称为可变区（V区）；羧基端（C端）相对稳定，变化很小，称为恒定区（C区）。L链和H链的V区分别称为VL和VH。
在本发明中，术语“抗原”是指能够激发免疫系统产生抗体或诱导免疫细胞应答的物质。在本发明的一些可选实施例中，“抗原”是指SAA，SAA突变体，蛋白缀合物等能够激发免疫系统产生抗体或诱导免疫细胞应答的物质。
需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
本发明提出了一种人血清淀粉样蛋白A突变体、蛋白缀合物、制备蛋白缀合物的方法和提高人血清淀粉样蛋白A免疫原性的方法，下面将分别对其进行详细描述。
人血清淀粉样蛋白A突变体
本发明的第一个方面，本发明提出了一种人血清淀粉样蛋白A突变体。根据本发明的实施例，所述人血清淀粉样蛋白A突变体与人血清淀粉样蛋白A野生型相比，所述人血清淀粉样蛋白A突变体具有如下位点的突变：N28C、Y29C、I30C、G31C、G48C、P49C、H70C、G71C、A72C或E73C；所述人血清淀粉样蛋白A野生型具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。根据本发明实施例的人血清淀粉样蛋白A突变体，相比于野生型人血清淀粉样蛋白A，具有游离的巯基，可与多臂PEG衍生物（例如八臂PEG马来酰亚胺;8-arm-PEG Maleimide）进行偶联反应，形成免疫原性提高的蛋白缀合物。
MKLLTGLVFCSLVLGVSSRSFFSFLGEAFDGARDMWRAYSDMREANYIGSDKYFHARGNYDAAKRGPGGVWAAEAISDARENIQRFFGHGAEDSLADQAANEWGRSGKDPNHFRPAGLPEKY(SEQ ID NO:1)
根据本发明的实施例，所述人血清淀粉样蛋白A突变体与所述人血清淀粉样蛋白A野生型相比，所述人血清淀粉样蛋白A突变体具有G48C或G71C的突变。根据本发明实施例的人血清淀粉样蛋白A突变体，相比于野生型人血清淀粉样蛋白A，具有游离的巯基，可与多臂PEG衍生物（例如八臂PEG马来酰亚胺; 8-arm-PEG Maleimide）进行偶联反应，进一步形成免疫原性提高的蛋白缀合物。
根据本发明的实施例，所述人血清淀粉样蛋白A突变体与所述人血清淀粉样蛋白A野生型相比，所述人血清淀粉样蛋白A突变体具有G71C的突变。根据本发明实施例的人血清淀粉样蛋白A突变体，相比于野生型人血清淀粉样蛋白A，具有游离的巯基，可与多臂PEG衍生物（例如八臂PEG马来酰亚胺; 8-arm-PEG Maleimide）进行偶联反应，更进一步形成免疫原性提高的蛋白缀合物。
蛋白缀合物
本发明的第二个方面，本发明提出了一种蛋白缀合物。根据本发明的实施例，所述蛋白缀合物包括：本发明的第一个方面所述的人血清淀粉样蛋白A突变体；缀合物，所述人血清淀粉样蛋白A突变体与所述缀合物相连。根据本发明实施例的蛋白缀合物，相比于野生型人血清淀粉样蛋白A，免疫原性显著提高。
根据本发明的实施例，所述缀合物选自多臂聚乙二醇衍生物。其中，需要解释说明的是，“多臂聚乙二醇衍生物”是指具有多条支链的聚乙二醇衍生物，每一个支链聚乙二醇的末端分别连接了一个活性基团，每一条支链称为“臂”。本发明实施例中的“多臂聚乙二醇衍生物”包括但不限于七臂聚乙二醇马来酰亚胺及其类似物、八臂聚乙二醇马来酰亚胺及其类似物、九臂聚乙二醇马来酰亚胺及其类似物、十臂聚乙二醇马来酰亚胺及其类似物、十一臂聚乙二醇马来酰亚胺及其类似物、十二臂聚乙二醇马来酰亚胺及其类似物、十三臂聚乙二醇马来酰亚胺及其类似物、十四臂聚乙二醇马来酰亚胺及其类似物和十五臂聚乙二醇马来酰亚胺及其类似物。其中，八臂聚乙二醇马来酰亚胺及其类似物的分子结构示意图如图3所示，每一个支链聚乙二醇的末端分别连接了一个马来酰亚胺及其类似物。需要进一步解释说明的是，本发明中的“马来酰亚胺及其类似物”是一类具有对巯基的高度反应性，因此常被用作巯基化合物的标记试剂或交联剂。通过与巯基反应，马来酰亚胺及其类似物可以与蛋白质、多肽或其他含有巯基的生物分子发生化学结合，形成稳定的共价连接。本发明中的“马来酰亚胺类似物”是一类具有与马来酰亚胺功能或结构相似的化合物，尤其是可通过取代基团取代马来酰亚胺的H得到马来酰亚胺类似物。在本发明的一个可选实施例中，取代基团具有如下结构：，其中X的范围为1~10。
在本发明的一个可选实施例中，取代基团具有如下结构：，X=2。
根据本发明的实施例，所述多臂聚乙二醇衍生物选自具有活化基团的多臂聚乙二醇衍生物，所述人血清淀粉样蛋白A突变体和所述多臂聚乙二醇衍生物通过所述活化基团相连。其中，需要解释说明的是，本发明中的“活化基团”是指可以和蛋白的氨基酸残基进行反应的化学基团。在蛋白质结构中，氨基酸残基通常具有反应活性的氨基（-NH2）基团，可以与其他化合物进行共价结合。在本发明中，多臂聚乙二醇衍生物中通过马来酰亚胺，可以与人血清淀粉样蛋白A突变体形成共价连接，将多臂聚乙二醇与蛋白质结合在一起。这种连接可以改变人血清淀粉样蛋白A的性质，增强了人血清淀粉样蛋白A的免疫原性。
根据本发明的实施例，所述活化基团选自羟基、氨基、巯基、羧基、酯基、醛基、丙烯酸基和马来酰亚胺基中的至少之一。
根据本发明的实施例，所述活化基团选自马来酰亚胺基。
根据本发明的实施例，所述酯基选自琥珀酰亚胺乙酸酯基、琥珀酰亚胺丙酸酯基或琥珀酰亚胺碳酸酯基。
根据本发明的实施例，所述醛基选自丙醛基、丁醛基、乙醛基或戊醛基。
根据本发明的实施例，所述多臂聚乙二醇衍生物中每个臂的活化基团相同或不同。
根据本发明的实施例，所述多臂聚乙二醇衍生物中每个臂的活化基团相同。
根据本发明的实施例，所述多臂聚乙二醇衍生物选自多臂聚乙二醇马来酰亚胺及其类似物，所述人血清淀粉样蛋白A突变体和所述多臂聚乙二醇马来酰亚胺及其类似物通过马来酰亚胺相连，所述人血清淀粉样蛋白A突变体的巯基和所述多臂聚乙二醇马来酰亚胺及其类似物的马来酰亚胺相连。
根据本发明的实施例，所述多臂聚乙二醇马来酰亚胺及其类似物包括七臂聚乙二醇马来酰亚胺及其类似物、八臂聚乙二醇马来酰亚胺及其类似物、九臂聚乙二醇马来酰亚胺及其类似物、十臂聚乙二醇马来酰亚胺及其类似物、十一臂聚乙二醇马来酰亚胺及其类似物、十二臂聚乙二醇马来酰亚胺及其类似物、十三臂聚乙二醇马来酰亚胺及其类似物、十四臂聚乙二醇马来酰亚胺及其类似物、十五臂聚乙二醇马来酰亚胺及其类似物中的至少之一。
根据本发明的实施例，所述多臂聚乙二醇衍生物为八臂聚乙二醇衍生物。
根据本发明的实施例，所述八臂聚乙二醇衍生物为八臂聚乙二醇马来酰亚胺类似物，为市售产品（Merck，JKA8027），所述八臂聚乙二醇马来酰亚胺类似物具有如下结构：
其中，每个n各自独立地选自10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20中的任意整数；根据本发明的一个可选实施例，n为15。
制备蛋白缀合物的方法
本发明的第三个方面，本发明提出了一种制备蛋白缀合物的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将本发明第一方面所述的人血清淀粉样蛋白A突变体和缀合物进行接触处理，得到所述蛋白缀合物。根据本发明实施例的方法，可制备与野生型人血清淀粉样蛋白A相比，免疫原性显著提高的蛋白缀合物。
根据本发明的实施例，所述缀合物选自多臂聚乙二醇衍生物，所述多臂聚乙二醇衍生物与本发明的第二个方面所述的蛋白缀合物中所限定的多臂聚乙二醇衍生物一致。
根据本发明的实施例，所述缀合物在含有所述缀合物和人血清淀粉样蛋白A突变体的溶液中的终浓度为0.5mM~2mM；所述人血清淀粉样蛋白A突变体在含有所述缀合物和人血清淀粉样蛋白A突变体的溶液中的终浓度为0.5mM~2mM。根据本发明实施例的方法，可制备与野生型人血清淀粉样蛋白A相比，免疫原性显著进一步提高的蛋白缀合物。
根据本发明的实施例，所述缀合物在含有所述缀合物和人血清淀粉样蛋白A突变体的溶液中的终浓度为1mM；所述人血清淀粉样蛋白A突变体在含有所述缀合物和人血清淀粉样蛋白A突变体的溶液中的终浓度为1mM。根据本发明实施例的方法，可制备与野生型人血清淀粉样蛋白A相比，免疫原性显著更进一步提高的蛋白缀合物。
提高人血清淀粉样蛋白A免疫原性的方法
本发明的第四个方面，本发明提出了一种提高人血清淀粉样蛋白A免疫原性的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将所述人血清淀粉样蛋白A与多臂聚乙二醇衍生物进行接触处理；其中，所述人血清淀粉样蛋白A选自本发明第一方面所述的人血清淀粉样蛋白A突变体，所述多臂聚乙二醇衍生物与本发明第二方面所述的蛋白缀合物中所限定的缀合物一致。根据本发明实施例的方法，可提高人血清淀粉样蛋白A的免疫原性。
根据本发明的实施例，所述多臂聚乙二醇衍生物在含有所述多臂聚乙二醇衍生物和人血清淀粉样蛋白A突变体的溶液中的终浓度为0.5mM~2mM；所述人血清淀粉样蛋白A突变体在含有所述多臂聚乙二醇衍生物和人血清淀粉样蛋白A突变体的溶液中的终浓度为0.5mM~2mM。根据本发明实施例的方法，可进一步提高人血清淀粉样蛋白A的免疫原性。
根据本发明的实施例，所述多臂聚乙二醇衍生物在含有所述多臂聚乙二醇衍生物和人血清淀粉样蛋白A突变体的溶液中的终浓度为1mM；所述人血清淀粉样蛋白A突变体在含有所述多臂聚乙二醇衍生物和人血清淀粉样蛋白A突变体的溶液中的终浓度为1mM。根据本发明实施例的方法，可更进一步提高人血清淀粉样蛋白A的免疫原性。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
本实施例的技术实施流程如图1所示，具体流程如下所示。
（1）制备SAA突变体：
首先本实施例使用分子克隆的方法（参照NEB定点突变试剂盒说明书；E0552）分别制备人血清淀粉样蛋白A突变体，将图2所示的SAA分子结构的突变区域的位点分别突变。
具体实验过程如下：
将人血清淀粉样蛋白A的第28位天冬酰胺(N)突变为半胱氨酸(C)，记录为1#；
将人血清淀粉样蛋白A的第29位酪氨酸(Y)突变为半胱氨酸(C)，记录为2#；
将人血清淀粉样蛋白A的第30位异亮氨酸(I)突变为半胱氨酸(C)，记录为3#；
将人血清淀粉样蛋白A的第31位甘氨酸(G)突变为半胱氨酸(C)，记录为4#；
将人血清淀粉样蛋白A的第48位甘氨酸(G)突变为半胱氨酸(C)，记录为5#；
将人血清淀粉样蛋白A的第49位脯氨酸(P)突变为半胱氨酸(C)，记录为6#；
将人血清淀粉样蛋白A的第70位组氨酸(H)突变为半胱氨酸(C)，记录为7#；
将人血清淀粉样蛋白A的第71位甘氨酸(G)突变为半胱氨酸(C)，记录为8#；
将人血清淀粉样蛋白A的第72位丙氨酸(A)突变为半胱氨酸(C)，记录为9#；
将人血清淀粉样蛋白A的第73位谷氨酸(E)突变为半胱氨酸(C)，记录为10#。
（2）突变SAA的多聚化修饰：
其次，将1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#、8#、9#、10#于大肠杆菌中诱导表达得到目的蛋白后按照Sun, Xiaowei et al.“Conjugation Reaction with 8-Arm PEG MarkedlyImproves the Immunogenicity of Mycobacterium tuberculosis CFP10-TB10.4 FusionProtein.”Bioconjugate chemistry vol. 28,6 (2017):1658-1668所述方法与八臂聚乙二醇马来酰亚胺类似物进行偶联后纯化分别得到的1#蛋白缀合物、2#蛋白缀合物、3#蛋白缀合物、4#蛋白缀合物、5#蛋白缀合物、6#蛋白缀合物、7#蛋白缀合物、8#蛋白缀合物、9#蛋白缀合物、10#蛋白缀合物。
随后，使用分子筛去除1#蛋白缀合物、2#蛋白缀合物、3#蛋白缀合物、4#蛋白缀合物、5#蛋白缀合物、6#蛋白缀合物、7#蛋白缀合物、8#蛋白缀合物、9#蛋白缀合物、10#蛋白缀合物中未聚合的单分子后备用。
具体实验流程如下：1）用20mM PBS pH7.4的缓冲液将八臂聚乙二醇马来酰亚胺类似物（Merck，JKA8027）以及1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#、8#、9#、10#SAA突变体配制终浓度为2mM；
2）将上述1）中的八臂聚乙二醇马来酰亚胺类似物溶液和1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#、8#、9#、10#SAA突变体溶液分别按照1:1体积比混合，4℃搅拌过夜反应，经过如图4所示的反应，分别获得1#蛋白缀合物、2#蛋白缀合物、3#蛋白缀合物、4#蛋白缀合物、5#蛋白缀合物、6#蛋白缀合物、7#蛋白缀合物、8#蛋白缀合物、9#蛋白缀合物、10#蛋白缀合物；
3）用Superdex 200分子筛分别处理2）中蛋白缀合物，分别收集修饰后的蛋白缀合物，浓缩后于-80℃分装冻存。
（3）动物免疫及效价检测：将步骤（2）中获得的1#~10#蛋白缀合物按照王传武等(2002)所述标准免疫流程选择新西兰大耳白兔进行免疫制备多克隆抗体。共进行五次免疫，每次免疫后取耳血ELISA法检测免疫效果。
具体实验流程如下：1）蛋白缀合物制备：首先利用生理盐水分别调整1#蛋白缀合物、2#蛋白缀合物、3#蛋白缀合物、4#蛋白缀合物、5#蛋白缀合物、6#蛋白缀合物、7#蛋白缀合物、8#蛋白缀合物、9#蛋白缀合物、10#蛋白缀合物浓度至1mg/mL；
第一次免疫分别取1）中蛋白缀合物1.2mL，加入弗氏完全佐剂1.2mL，乳化均匀；
第二至五次免疫，分别取1）中蛋白缀合物1.2mL，加入弗氏不完全佐剂1.2mL，乳化均匀。
2）动物免疫：将健康成年新西兰大耳白兔分为3只/组，第一次免疫按照0.8mL/只，皮下多点免疫平行免疫；
第二至第五次免疫，分别于首次免疫后第15天、30天、45天、60天进行，按照0.8mL/只，皮下多点免疫平行免疫；
3）血清检测：分别于免疫后的第7天取兔耳血，离心分离血清；ELISA法监测抗血清效价，3只兔子结果取平均值；最后进行数据分析。
1#蛋白缀合物、2#蛋白缀合物、3#蛋白缀合物、4#蛋白缀合物、5#蛋白缀合物、6#蛋白缀合物、7#蛋白缀合物、8#蛋白缀合物、9#蛋白缀合物、10#蛋白缀合物免疫过程中ELISA的实验结果显示均比野生型单分子和单分子抗原对照组效果好，抗血清效价均提升，本实施例示例性展示5#蛋白缀合物和8#蛋白缀合物的免疫过程的ELISA的实验结果。实验结果如图5所示，5#蛋白缀合物随着免疫次数的增加，抗血清效价提升明显高于野生型单分子及5#单分子抗原对照组，5#蛋白缀合物相对于野生型单分子对照组（SAA），抗血清效价提升约3倍达到1:6000；8#蛋白缀合物随着免疫次数的增加，抗血清效价提升明显高于野生型单分子及8#单分子抗原对照组。8#蛋白缀合物相对于野生型单分子对照组（SAA），抗血清效价提升约4倍达到1:8000。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (18)
1.一种人血清淀粉样蛋白A突变体，其特征在于，与人血清淀粉样蛋白A野生型相比，所述人血清淀粉样蛋白A突变体具有如下位点的突变：
N28C、Y29C、I30C、G31C、G48C、P49C、H70C、G71C、A72C或E73C；
所述人血清淀粉样蛋白A野生型具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的人血清淀粉样蛋白A突变体，其特征在于，与所述人血清淀粉样蛋白A野生型相比，所述人血清淀粉样蛋白A突变体具有G48C或G71C的突变。
3.根据权利要求1所述的人血清淀粉样蛋白A突变体，其特征在于，
与所述人血清淀粉样蛋白A野生型相比，所述人血清淀粉样蛋白A突变体具有G71C的突变。
4.一种蛋白缀合物，其特征在于，包括：
权利要求1~3任一项所述的人血清淀粉样蛋白A突变体；
缀合物，所述人血清淀粉样蛋白A突变体与所述缀合物相连。
5.根据权利要求4所述的蛋白缀合物，其特征在于，所述缀合物选自多臂聚乙二醇衍生物。
6.根据权利要求5所述的蛋白缀合物，其特征在于，所述多臂聚乙二醇衍生物选自具有活化基团的多臂聚乙二醇衍生物，所述人血清淀粉样蛋白A突变体和所述多臂聚乙二醇衍生物通过所述活化基团相连。
7.根据权利要求6所述的蛋白缀合物，其特征在于，所述活化基团选自羟基、氨基、巯基、羧基、酯基、醛基、丙烯酸基和马来酰亚胺基中的至少之一。
8.根据权利要求7所述的蛋白缀合物，其特征在于，所述酯基选自琥珀酰亚胺乙酸酯基、琥珀酰亚胺丙酸酯基或琥珀酰亚胺碳酸酯基。
9.根据权利要求7所述的蛋白缀合物，其特征在于，所述醛基选自丙醛基、丁醛基、乙醛基或戊醛基。
10.根据权利要求6~9任一项所述的蛋白缀合物，其特征在于，所述多臂聚乙二醇衍生物中每个臂的活化基团相同或不同。
11.根据权利要求5所述的蛋白缀合物，其特征在于，所述多臂聚乙二醇衍生物选自多臂聚乙二醇马来酰亚胺及其类似物，所述人血清淀粉样蛋白A突变体和所述多臂聚乙二醇马来酰亚胺及其类似物通过马来酰亚胺相连，所述人血清淀粉样蛋白A突变体的巯基和所述多臂聚乙二醇马来酰亚胺及其类似物的马来酰亚胺相连。
12.根据权利要求11所述的蛋白缀合物，其特征在于，所述多臂聚乙二醇马来酰亚胺及其类似物包括七臂聚乙二醇马来酰亚胺及其类似物、八臂聚乙二醇马来酰亚胺及其类似物、九臂聚乙二醇马来酰亚胺及其类似物、十臂聚乙二醇马来酰亚胺及其类似物、十一臂聚乙二醇马来酰亚胺及其类似物、十二臂聚乙二醇马来酰亚胺及其类似物、十三臂聚乙二醇马来酰亚胺及其类似物、十四臂聚乙二醇马来酰亚胺及其类似物、十五臂聚乙二醇马来酰亚胺及其类似物中的至少之一。
13.根据权利要求6~9任一项所述的蛋白缀合物，其特征在于，所述多臂聚乙二醇衍生物为八臂聚乙二醇衍生物。
14.一种制备蛋白缀合物的方法，其特征在于，包括：
将权利要求1~3任一项所述的人血清淀粉样蛋白A突变体和缀合物进行接触处理，得到所述蛋白缀合物。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述缀合物选自多臂聚乙二醇衍生物，所述多臂聚乙二醇衍生物与权利要求4~13任一项所述的蛋白缀合物中所限定的多臂聚乙二醇衍生物一致。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述缀合物在含有所述缀合物和人血清淀粉样蛋白A突变体的溶液中的终浓度为0.5mM~2mM；
所述人血清淀粉样蛋白A突变体在含有所述缀合物和人血清淀粉样蛋白A突变体的溶液中的终浓度为0.5mM~2mM。
17.一种提高人血清淀粉样蛋白A免疫原性的方法，其特征在于，包括：
将所述人血清淀粉样蛋白A与多臂聚乙二醇衍生物进行接触处理；
其中，所述人血清淀粉样蛋白A选自权利要求1~3任一项所述的人血清淀粉样蛋白A突变体，所述多臂聚乙二醇衍生物与权利要求4~13任一项所述的蛋白缀合物中所限定的缀合物一致。
18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述多臂聚乙二醇衍生物在含有所述多臂聚乙二醇衍生物和人血清淀粉样蛋白A突变体的溶液中的终浓度为0.5mM~2mM；
所述人血清淀粉样蛋白A突变体在含有所述多臂聚乙二醇衍生物和人血清淀粉样蛋白A突变体的溶液中的终浓度为0.5mM~2mM。
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