JP5123201B2 - タンパク質及びペプチドに対する結合のための４分枝デンドリマー−ｐｅｇ - Google Patents

Description

本発明は、薬学的対象の結合体を得るための４分枝のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を有するデンドリマー様ポリマー構造に関する。

いくつかの薬理学的性質に関して、治療用タンパク質とポリエチレングリコールとを結合することの利益はよく知られている。例えば、種々の原因、その中でも、ポリマー残基により、プロテアーゼの攻撃及び免疫系による該薬剤の認識が防止され、また、天然タンパク質に関しては、結合体が、相当高い水力学的体積となって、腎臓ろ過が著しく減少するために、血中半減期が増加する。多くの場合、ＰＥＧ化は、インビトロでのタンパク質の生物活性に影響を及ぼすが、血中の存続時間がかなり長くなることにより、その治療上の作用がより有効となる（Ｈａｒｒｉｓ Ｊ．Ｍ．及びＣｈｅｓｓ Ｒ．Ｂ．（２００３）、薬剤に及ぼすペギル化の効果（Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ ｏｎ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．２：２１４〜２１頁）。

また、ＰＥＧ化により、疎水性相互作用によって誘導された分解の経路が立体的に妨げられ、タンパク質の熱的不安定性に関与する分子間相互作用を減少させる立体的非特異的障害が生じる。このすべてのことから、ＰＥＧ化タンパク質は、最終的な製剤の開発にとってきわめて有用な性質である、非修飾分子より高い物理的安定性を有することになる（Ｈａｒｒｉｓ Ｊ．Ｍ．及びＣｈｅｓｓ Ｒ．Ｂ．（２００３）、薬剤に及ぼすペギル化の効果（Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ ｏｎ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．２：２１４〜２１頁）。

タンパク質の結合に一般的に用いられる試薬は、モノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）として知られている、端部の１つがメチル化されたポリエチレングリコールである。メチル基がＰＥＧ鎖の端部の１つを保護することから、他の端部、一官能性試薬によってのみ活性化されることが可能になる。このことは、治療用タンパク質の結合にとってきわめて重要である。二官能性又は多官能性試薬への治療用タンパク質の結合は一般に、該タンパク質の生物活性に影響を及ぼす架橋に至るからである。ｍＰＥＧ分子は常に、非メチル化ポリマー、ジオール画分の小さな画分を有する。きわめて長い鎖では重合過程の制御がより困難であることから、高分子質量のｍＰＥＧにおけるジオール画分はより大きい（Ｒｏｂｅｒｔｓ Ｍ．Ｊ．、Ｂｅｎｔｌｅｙ Ｍ．Ｄ．、Ｈａｒｒｉｓ Ｊ．Ｍ．（２００２）、ペプチド及びタンパク質のＰＥＧ化に関する化学（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｆｏｒ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖｉｅｗｓ ５４：４５９〜７６頁）。

ＰＥＧから誘導された最初の分子の１つは、塩化シアンによる反応によって合成されたものである。しかし、この試薬による結合実験は、広範囲のＰＥＧ化を引き起こす。これは、治療用タンパク質にとって望ましくない。ＰＥＧ化の程度が高いと、活性部位の直接的な妨害、又は接近可能なタンパク質表面からこれらの部位を隠す位相幾何学的変化により、生物活性の突然の低下を引き起こすからである。通常、所望の結合体は、各タンパク質分子当たりＰＥＧ残基が１つだけ存在するものであり、この分子は、モノＰＥＧ化として知られている。

１９８０年代から、「よりソフトな」活性基が使用され始めている。これらは主に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルであるが、他の基もまた使用されている。最も一般的な３つの基は：スクシンイミジルスクシネート、トレシレート及びスクシンイミジルカルボネートである。活性化ＰＥＧ類のこの生成は、第１の生成として知られている（Ｒｏｂｅｒｔｓ Ｍ．Ｊ．、Ｂｅｎｔｌｅｙ Ｍ．Ｄ．、Ｈａｒｒｉｓ Ｊ．Ｍ．（２００２）、ペプチド及びタンパク質のＰＥＧ化に関する化学（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｆｏｒ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖｉｅｗｓ ５４：４５９〜７６頁）。

１９９０年代後半に、活性化ＰＥＧ類の第２の生成があった。そこでは２つの重要な進歩があった：より選択的なＰＥＧ化を可能にする基（例えば、タンパク質のＮ末端により優先的に結合するアルデヒド基）及び分枝構造である（Ｒｏｂｅｒｔｓ Ｍ．Ｊ．、Ｂｅｎｔｌｅｙ Ｍ．Ｄ．、Ｈａｒｒｉｓ Ｊ．Ｍ．（２００２）、ペプチド及びタンパク質のＰＥＧ化に関する化学（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｆｏｒ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖｉｅｗｓ ５４：４５９〜７６頁）。分枝ＰＥＧ類の例は、２つの分枝を有する一官能性（米国特許第５，９３２，４６２号）、４つの分枝を有するテトラ官能性及び８つの分枝を有するオクタ官能性である。治療用タンパク質の結合にとってより有用な活性化ＰＥＧ類は、一官能性のものである。これらはタンパク質とポリマーとの間の架橋を避けるからである。また、分枝状ＰＥＧ類は、タンパク質表面のより良好な保護を可能にする傘状構造を有する。

２つの分枝の一官能性ＰＥＧにより、天然タンパク質よりも臨床上より良好な成績を有することを示すインターフェロンアルファ２ａとの結合体を得ることが可能になった（Ｒａｊｅｎｄｅｒ Ｒｅｄｄｙ Ｋ．、Ｍｏｄｉ Ｍ．Ｗ．、Ｐｅｄｄｅｒ Ｓ．（２００２）、Ｃ型肝炎治療のためのペグインターフェロンアルファ２ａ（４０ＫＤ）（Ｐｅｇａｓｙｓ）の使用（Ｕｓｅ ｏｆ ｐｅｇｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ａｌｆａ−２ａ（４０ＫＤ）（Ｐｅｇａｓｙｓ） ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ）、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖｉｅｗｓ ５４：５７１〜８６頁）。

ｍＰＥＧ合成に関する現在の技法では、わずか３０ｋＤａの鎖が得られるだけであり、その理由で、２つの分枝を有する試薬は、最大６０ｋＤａの分子質量を得ることが可能になる。一定のタンパク質において最適な値を得るために、より広範囲の結合体を開発することを可能にするより高い分子質量の一官能性ＰＥＧを有する構造を有することが望ましい。しかし、前記の報告では、一官能性となり、２つ超のＰＥＧ鎖を有するＰＥＧ化用の試薬は用いられておらず、特性化も記載もされていない。２つ超のＰＥＧ鎖を有する試薬を得る場合、より高分子質量の結合体が得られると考えられ、これによって、前記の利点に加えて、二分枝構造と同様の分子質量のＰＥＧ化試薬を作製するために、より短いｍＰＥＧ線状分枝を用いることが可能になる。これらの小サイズの分枝は、より小さなジオール画分を有し、合成法がより容易になると考えられる。

本発明は、上記の問題を解決し、４つのｍＰＥＧ分枝を有する一官能性デンドリマー様構造を提供する。この構造により、１２０ｋＤａまでのポリマー残基を有する結合体を得ることが可能になる。このことによって、高分子質量のものなど、広範囲の分子質量を有する結合体を開発することが可能になる。さらに、このアプローチを用いて、他の分枝状一官能性試薬と同様の分子質量を有するが、より低分子質量の線状鎖を有するＰＥＧ分子を得ることができる。

本発明の好ましい一実施形態において、ＰＥＧ鎖の分子質量が５，０００Ｄａから３０，０００Ｄａの間であり、全分子質量が２０，０００Ｄａから１２０，０００Ｄａの間であるポリマー構造が得られる。

小型の線状鎖の使用により、より大型の線状ＰＥＧ分子に典型的なジオール混入をほとんど排除することが可能になった。予想外なことに、本発明の構造を有する結合体は、同様の分子質量を有する結合体よりもはるかに高い物理化学的安定性（高温及びプロテアーゼによる分解に対する抵抗性）を有したが、２つの分枝だけの構造により調製された。やはり予想外なことに、それらは、より長い平均血中存続時間を有した。他の予想外の結果は、本発明のデンドリマー様構造を有する結合体は、同様の分子質量を有するが２つの分枝のみを有する結合体によって得られたものよりもより少ない位置異性体を有することで、より均一だったことである。

デンドリマー様４分枝一官能性ＰＥＧは、２つの主要ステップで得られる。第１のステップは、２つの線状ＰＥＧ分子と、例えば、リシンであり得るコアとの結合による２分枝誘導体の合成である。同様の方法が他の著者によっても用いられており、良好な結果が得られている（米国特許第５，９３２，４６２号）。第２のステップは、４分枝誘導体を得るための、２分子の２分枝誘導体と、前記のものと同様のコアとの結合である。第１のステップにおいて、２つの線状ＰＥＧ分枝をコアと結合させるために、それらは活性基を有することが必要である。この基は、当技術分野で知られているもののいくつかから選択できる。例えば、数ある中でも、スクシンイミジルスクシネート、スクシンイミジルカルボネート、ｐ−ニトロフェニルカルボネート、スクシンイミジルプロピオネート、スクシンイミジルブタノエートである。本発明における好ましい線状活性化ＰＥＧは、スクシンイミジルカルボネートである。これは種々の主要な理由、即ちこの試薬と遊離アミノ基を有するコアとの間の良好な反応収率、並びにこの官能化ＰＥＧの作製方法の容易さによる。この合成方法（Ｍｉｒｏｎ Ｔ．、Ｗｉｌｃｈｅｋ Ｍ．（１９９３）、タンパク質に結合させるスクシンイミジルカルボネートポリエチレングリコールを調製するための簡易化法（Ａ Ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ Ｃａｒｂｏｎａｔｅ Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ ｆｏｒ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．４：５６８〜６９頁）は、当業者に知られている。

線状活性化ＰＥＧが用意できたら、第１のステップは、コアとして選択された分子との反応によって容易に達成される。本発明の好ましい一実施形態において、コアは、生体適合性により、後の活性化に使用できる２つの遊離アミノ基及びカルボキシル基を有するＬ−リシンである。

２分枝誘導体は、反応混合物から、クロマトグラフィー法により容易に精製される。この２分枝誘導体は、コア分子との引き続く反応及び４分枝誘導体の合成のために活性化される。この生成物は、種々の方法で活性化できるが、好ましい方法は、有効性及び使いやすさにより、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの形成である。

この方法は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルとして、ＰＥＧ鎖を含有する構造を有するカルボキシル基の活性化のために首尾よく用いられている（米国特許第４，７３２，８６３号及び米国特許第５，９３２，４６２号）。

４分枝誘導体調製の第２の段階は、２分枝誘導体とコア分子との反応からなり、そこでは、本発明の第１の段階と同様に、本発明の好ましい実施形態は、コアとしてのＬ−リシンである。

対象である誘導体は、反応混合物から、クロマトグラフィー法により容易に精製される。

このデンドリマー様ＰＥＧ分子は、タンパク質へのその結合のために、種々の反応性基を用いて活性化できる。他のＰＥＧ構造の活性化に用いられる任意の官能基を、本特許に記載されたデンドリマー様ＰＥＧに用いることができる。これらの基のいくつかの例は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル類、スクシンイミジルカルボネート、種々のタイプのアルデヒド、マレイミドなどである。タンパク質へのこの構造の結合を可能にする他のタイプの基は、遷移金属を介して、ペプチド主鎖に存在するヒスチジン残基を結合することのできるキレート化基、ニトリロアセテート（ＮＴＡ）である。反応性基の選択は、ＰＥＧ分子を結合させようとしているタンパク質残基に依存する。

例えば、遊離アミノ基との結合に対する優先性があれば、該デンドリマー様ポリマーは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルとして活性化できる。したがって、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルは、段階１の２分枝構造の活性化に関して記載されたものと同じ手順に従って、本発明の具現化として得られる。

タンパク質と活性化ＰＥＧとの結合は適切な緩衝液中で生じる。緩衝液の特性は、他の因子の中でも、該ポリマーの官能基及び結合の対象に依存する。例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルとしての官能化ＰＥＧと遊離アミノ基による結合が望ましい場合、結合部位は、予め決定されたｐＨを用いて、ある程度まで予測できる。約９のｐＨ値が、リシンのεアミノ基を介する結合に有利である。

他の例は、わずかに酸性のｐＨにより、ＰＥＧ化が、好ましくはタンパク質のＮ末端部に生じることが可能になるアルデヒド官能基との結合におけるものである。対象となっている結合体の引き続く精製は、種々のクロマトグラフィー法によって実施できる。

本発明の具現化において、タンパク質、ペプチド及びポリペプチドからなる群から選択される生体分子に求核性基が含まれる結合が記載される。

精製した結合体の特性化をできるだけ完全に達成するために、該結合体のいくつかの化学的、物理的及び生物学的性質を分析することが必要である。例えば、ＰＥＧ残基は該タンパク質の吸光係数にほとんど影響を及ぼさないため、該結合体の濃度は通常、紫外線分光法（２８０ｎｍにおける吸光度）によって判定できる。ゲルろ過などのクロマトグラフィー法では、対象となっている結合体及び混入物に対応するシグナルの分解が不良である可能性があるため、精製産物の純度は、好ましくは、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって判定する必要がある。他の物理化学的性質は通常の方法により調べることができる。

この作業の結果、本発明の好ましい具現化では、該タンパク質が、インターフェロンアルファ２ｂ、ストレプトキナーゼ、顆粒球コロニー刺激因子、エリスロポエチン又は上皮成長因子からなる群から選択される結合体の調製が記載される。

調製様式の詳細な解説
（実施例１）
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルとしての活性化ＰＥＧの合成
該構造の獲得及び活性化
モノメトキシポリエチレングリコールのスクシンイミジルカルボネート（ＳＣ−ＰＥＧ）の獲得
１２，０００Ｄａの分子質量を有するモノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ_１２Ｋ）１５グラムを５００ｍＬのトルエンに溶解し、３時間共沸乾燥した。この後、体積を２５０ｍＬに減らし、混合物を室温まで冷却した。この溶液に以下の試薬：６０ｍＬの乾燥ジクロロメタン、１５ｍＬの乾燥アセトンに溶解した２ｇのジスクシンイミジルカルボネート（ＤＳＣ）、及びトルエン：ＤＣＭの３：１混合物１０ｍＬに溶解した１ｇのジメチルアミノピリジンを加えた。攪拌しながら一晩（１６時間）反応させた。該反応混合物を１Ｌの冷ジエチルエーテルによって沈殿させ、沈殿物をろ過により回収した。この生成物をアセトンに溶解させ、ジエチルエーテルにより沈殿させて、３回再結晶させた。最終産物を高減圧下で乾燥し、窒素下、−２０℃で保存した。この過程の最終的収率は、９０％よりも高かった。活性化ＰＥＧの画分は、グリシル−グリシンとの反応及びＴＮＢＳとの反応による遊離アミノ基の定量化によって判定した。

二ＰＥＧ化リシン（Ｌｙｓ−２ＰＥＧ）の獲得
１２グラムのＳＣ−ＰＥＧ_１２Ｋを、１００ｍＭのホウ酸緩衝液ｐＨ８．５中０．２ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解させた４６ｍｇのＬ−（＋）−リシンと反応させた。室温で１６時間攪拌させながら反応させた。この後、反応混合物を２回蒸留水中で５回希釈し、ｐＨを塩酸で調整した。ＰＥＧを１体積のＤＣＭで３回抽出した。３つの抽出画分のプールを無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過した。ＤＣＭ中ＰＥＧ溶液をロータリーエバポレーターで２０ｍＬまで濃縮した。この濃縮物を１２０ｍＬの冷ジエチルエーテルで沈殿させ、ろ過により回収し、高減圧で乾燥した。Ｌｙｓ−２ＰＥＧをＤＥＡＥセファロースによるイオン交換クロマトグラフィーにより該反応混合物の残りの成分から分離した。

１リットルのクロマトグラフィーマトリックスを含有するカラムを、３体積の１００ｍＭホウ酸緩衝液ｐＨ７．５で平衡化してから、５体積の２回蒸留水で洗浄した。１０グラムの反応混合物を取り、５ｍｇ／ｍＬで２回蒸留水に溶解した。２体積の２回蒸留水でカラムを洗浄して、反応しなかったＰＥＧを除去し、塩化ナトリウムの１ｍＭ溶液によりＬｙｓ−２ＰＥＧを溶出させた。この画分のｐＨを塩酸により３に調整し、１体積のＤＣＭで３回抽出した。３つの抽出画分のプールを無水硫酸ナトリウムで乾燥してからろ過した。ＤＣＭ中ＰＥＧ溶液をロータリーエバポレーターで１０ｍＬまで濃縮した。この濃縮物を６０ｍＬの冷ジエチルエーテルで沈殿させ、ろ過により回収し、高減圧で乾燥した。５％での塩化バリウム溶液及び１００ｍＭのヨードによりゲル染色するＳＤＳ−ＰＡＧＥにより精製度を判定した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより判定された分子質量は、２３．０〜２４．５ｋＤａであった。この過程の合計収率は４０％よりも高かった。

Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルとしての二ＰＥＧ化リシンの活性化（ＰＥＧ_{２，１２Ｋ}−ＮＨＳ）
６グラムのＬｙｓ−２ＰＥＧを２０ｍＬの乾燥ＤＣＭ中に溶解し、６０ｍｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミド及び２５０ｍｇのＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を加えた。室温で攪拌しながら２４時間反応を続けた。この混合物をろ過し、ロータリーエバポレーターで５ｍＬまで濃縮した。生成物を２０ｍＬの冷ジエチルエーテルで沈殿させ、アセトンに溶解しジエチルエーテルで沈殿させ３回結晶化させた。最終産物を高減圧下で乾燥し、窒素下−２０℃で保存した。この過程の合計収率は９５％よりも高かった。活性化ＰＥＧの画分は、グリシル−グリシンとの反応により判定し、遊離アミノ基の数は、ＴＮＢＳとの反応により定量化した。

デンドリマー様４分枝ＰＥＧの獲得
５グラムのＰＥＧ_{２，１２Ｋ}−ＮＨＳを、１００ｍＭのホウ酸緩衝液ｐＨ８．５の０．１ｍｇ／ｍＬ中に溶解させた７ｍｇのＬ−（＋）−リシンと反応させた。室温で１６時間攪拌させながら反応させた。この後、反応混合物を２回蒸留水中で５回希釈し、ｐＨを塩酸で３に調整した。ＰＥＧを１体積のＤＣＭで３回抽出した。３つの抽出画分のプールを無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過した。ＤＣＭ中ＰＥＧ溶液をロータリーエバポレーターで５ｍＬまで濃縮した。この濃縮物を３０ｍＬの冷ジエチルエーテルで沈殿させ、ろ過により分離し、高減圧で乾燥した。デンドリマー様４分枝ＰＥＧを、Ｇ３０００−ＰＷカラムのゲルろ過クロマトグラフィーにより精製した。所望の構造を含有する画分のｐＨを塩酸により３に調整し、１体積のＤＣＭで３回抽出した。３つの抽出画分のプールを無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過した。ＤＣＭ中ＰＥＧ溶液をロータリーエバポレーターで５ｍＬまで濃縮した。この濃縮物を３０ｍＬの冷ジエチルエーテルで沈殿させ、ろ過により分離し、高減圧下で乾燥した。５％での塩化バリウム溶液及び１００ｍＭのヨードによりゲル染色するＳＤＳ−ＰＡＧＥにより精製度を判定し、９８％よりも高かった。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより判定された分子質量は、４５．５〜５０ｋＤａであった。この過程の合計収率は３０％よりも高かった。

Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルとしてのデンドリマー様４分枝ＰＥＧの官能化（ＰＥＧ_{４，１２Ｋ}−ＮＨＳ）
１．５グラムのデンドリマー様４分枝ＰＥＧを５ｍＬの乾燥ＤＣＭに溶解し、９ｍｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミド及び３７ｍｇのＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミドを加えた。室温で２４時間攪拌下、反応を続けた。生成物をろ過してから、２０ｍＬの冷ジエチルエーテルで沈殿させた。沈殿物は、アセトンに溶解しジエチルエーテルで沈殿させ３回再結晶させた。最終産物を高減圧下で乾燥し、窒素下−２０℃で保存した。この過程の合計収率は９５％よりも高かった。活性化ＰＥＧの画分は、グリシル−グリシンとの反応により判定し、遊離アミノ基の量は、ＴＮＢＳとの反応により判定した。

（実施例２）
ＰＥＧ_{４，１２Ｋ}−ＮＨＳと結合したＩＦＮ−α２ｂの獲得
結合反応
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルとしての活性化デンドリマー様４分枝ＰＥＧ（ＰＥＧ_{４，１２Ｋ}−ＮＨＳ）４グラムを、１２０ｍＭのホウ酸緩衝液ｐＨ８．５中６ｍｇ／ｍＬのＩＦＮ−α２ｂの１グラムを含有する溶液に加えた。緩やかに攪拌しながら４℃で１時間反応を続けてから、１０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４を用いた５０倍希釈で停止させた。該反応の収率は、クーマシーブリリアントブルーＲ−２５０によるＳＤＳ−ＰＡＧＥ染色のデンシトメトリー分析によって判定した。デンドリマー様４分枝ＰＥＧを有するモノＰＥＧ化ＩＦＮ−α２ｂの画分は、４０％よりも高かった。

デンドリマー様４分枝ＰＥＧを有するモノＰＥＧ化ＩＦＮ−α２ｂの精製
５００ｍＬのＦｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ６５０（Ｍ）ＣＯＯ−を含有するＸＫ５０／６０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を、４０ｍＬ／分の流量で、１０ｍＭの酢酸緩衝液ｐＨ４の３体積により平衡化した。該反応混合物を含有する溶液を同じ流量で該カラムに入れた。反応しなかったＰＥＧ及び１つ超のＰＥＧ残基と結合したＰＥＧを、２５ｍＭの塩化ナトリウムと共に４０ｍＭの酢酸緩衝液ｐＨ４により２時間洗浄して除去した。モノＰＥＧ化結合体を、１５０ｍＭの塩化ナトリウムと共に５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４により溶出させた。純度は９６％より高く、主な混入物は非修飾インターフェロン及び二ＰＥＧ化結合体であった。対象となっている画分を２００ｍＬまで濃縮し、１００ｍＭの塩化ナトリウムと共に、５０ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ７によって平衡化した１ＬのＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５を含むＸＫ５０／６０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に入れた。デンドリマー様４分枝ＰＥＧを有するモノＰＥＧ化インターフェロンは、０．２μｍの孔径を有する酢酸セルロース膜を通してろ過し、４℃で保存した。

（実施例３）
ＰＥＧ_{４，１２Ｋ}−ＩＦＮ−α２ｂの物理化学的特性化
結合体濃度の判定
タンパク質残基の関数としての該結合体の濃度は、２８０ｎｍにおけるＵＶ吸光度によって判定した。１吸光度単位は１ｍｇ／ｍＬの濃度に等価であると考えられた。

結合体の分子質量の判定
該結合体の分子質量は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって判定した。デンドリマー様４分枝ＰＥＧに関して予測される平均分子質量は、４８，０００Ｄａであり、ＩＦＮ−α２ｂのそれは、１９，２００Ｄａであり、したがって、該結合体の理論的質量は、６７，２００Ｄａであった。ＰＥＧ_{４，１２Ｋ}−ＩＦＮ−α２ｂに関して算出された質量は、６４，０００Ｄａ〜７０，０００Ｄａであった。

（実施例４）
ＰＥＧ_{４，１２Ｋ}−ＩＦＮ−α２ｂ結合体の生物学的特性化
ＥＬＩＳＡ型アッセイにおける該結合体の免疫学的同定
種々の濃度の結合体サンプル並びに陰性対照を、ＩＦＮ−α２ｂに対するモノクローナル抗体で覆われたＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートに塗布した。次に、ＩＦＮ−α２ｂの他のエピトープを認識する、セイヨウワサビペルオキシダーゼに結合した他のモノクローナル抗体を加えた。結合体サンプルの吸光度が、陰性サンプルの吸光度プラスこれらの値の標準偏差の３倍の平均よりも高い場合に、サンプルは免疫学的に認識されたと考えられた。すべての場合で、該サンプルは認識された。

インビトロ抗ウィルス活性
インビトロ抗ウィルス活性は、Ｈｅｐ−２細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ２３）に及ぼすメンゴウィルスにより生じる細胞変性効果の阻害によって判定した。２％ウシ胎仔血清及び４０μｇ／ｍＬのゲンタマイシンを有する最少基本培地中の該結合体連続希釈液（１：２）を、９６ウェルマイクロタイタープレート内の細胞単層に混合した。３％二酸化炭素雰囲気及び９５％相対湿度下、３７℃で２４時間、該プレートをインキュベートした。ウィルス（１０^７ＴＣＩＤ）を加え、細胞変性効果（９０％の細胞溶解）が明らかになるまで、該プレートをインキュベートした。クリスタルバイオレットを用いた細胞の染色によって、細胞破壊のレベルを測定した。各サンプルの活性は、国際単位（ＩＵ）で表し、世界保健機構のＩＦＮ−α２ｂ国際基準６９／１９によって評価し、得られた結果を表１に示してある。

インビトロ抗増殖活性
ダウディ細胞（バーキットリンパ腫）の増殖を抑制する結合ＩＦＮ−α２ｂの能力により、インビトロ抗増殖活性を測定した。ＰＥＧ_{４，１２Ｋ}−ＩＦＮ−α２ｂのインビトロ活性が、非修飾ＩＦＮ−α２ｂのインビトロ活性の５％に等価であるという結果が示された。

（実施例５）
ＰＥＧ_{４，１２Ｋ}−ＩＦＮ−α２ｂの物理化学的安定性
プロテアーゼによる分解に対する抵抗性
同様の分子質量を有する２又は４分枝ＰＥＧに結合した天然ＩＦＮ−α２ｂの４００μｇ／ｍＬを含有する４％重炭酸ナトリウム溶液ｐＨ８の４０マイクロリットルと、１６０μｇ／ｍＬのトリプシン溶液の１０μＬとを混合した。該サンプルを３７℃で一定時間インキュベートした。反応は、１０μＬのトリフルオロ酢酸によって停止させた。クーマシーブリリアントブルーによって染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析におけるバンドの消失によって、タンパク質の残量（結合又は非結合）を予測した。結果（図１）は、ＩＦＮ−α２ｂ結合体の分解に対する４分枝ＰＥＧ構造（▲）をもたらす保護は、同様の分子質量の２分枝構造（●）によって生じるものよりも優れていることを示している。

熱安定性
デンドリマー様４分枝ＰＥＧとのＩＦＮ−α２ｂの結合の安定性に及ぼす効果を判定するために、天然タンパク質及び結合タンパク質のサンプルを、リン酸緩衝生理食塩溶液中、６０℃でインキュベートした。同様の分子質量の２分枝ＰＥＧに結合したＩＦＮ−α２ｂのサンプルを対照として用いた。一定の時点でサンプルを取り出し、クーマシーブリリアントブルーによって染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析におけるバンドの消失によって、タンパク質の残量（結合又は非結合）を予測した。結果（図２）は、４分枝ＰＥＧ構造（▲）による結合の熱安定性が、他の２つの例［天然ＩＦＮ（■）、２分枝構造に結合したＩＦＮ（●）］のそれよりも高いことを示している。

（実施例６）
ＰＥＧ_{４，１２Ｋ}−ＩＦＮ−α２ｂの薬物動態
非修飾インターフェロンとデンドリマー様４分枝ＰＥＧに結合させたタンパク質との間の薬物動態比較試験を、平均体重２ｋｇのニュージーランドラビットにおいて実施した。２分枝ＰＥＧに結合させたＩＦＮ−α２ｂを対照として用いた。生体分子を、体重１ｋｇ当たり１５０μｇのタンパク質で皮下経路により注入した。血液サンプルを、予め決められた時点で、１４４時間の間隔で採取した。サンプルを遠心分離して血清を分離し、分析するまで−２０℃で保存した。このサイトカインに特異的なモノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ型アッセイによってＩＦＮ−α２ｂ濃度（結合又は非結合）を判定した。古典的なコンパートメント乳頭モデルに基づいて解釈を行った。結果は表２に示されている。

（実施例７）
デンドリマー様４分枝ＰＥＧに対する他の治療用タンパク質の結合
組換えストレプトキナーゼ（ｒ−ＳＫ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）及び上皮成長因子（ＥＧＦ）などの他の治療用タンパク質を、デンドリマー様４分枝ＰＥＧに結合させた。プロテアーゼによる分解率に及ぼす結合の効果を評価した。

Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドのエステルとして活性化されたデンドリマー様４分枝ＰＥＧの結合
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドのエステルとして活性化されたデンドリマー様４分枝ＰＥＧ（ＰＥＧ_{４，１２Ｋ}−ＮＨＳ）の１００ミリグラムを、１２０ｍＭのホウ酸緩衝液ｐＨ８．５中６ｍｇ／ｍＬの治療用タンパク質２５ｍｇを含有する溶液に加えた。緩やかに攪拌しながら、４℃で１時間反応を続けた。１０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４を用いた５０倍希釈によって反応を停止させた。クーマシーブリリアントブルーＲ−２５０によって染色したサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥからのデンシトメトリー分析により反応収率を判定した。すべての場合において、デンドリマー様４分枝ＰＥＧを有するモノＰＥＧ化タンパク質の画分は、３０％よりも高かった。

アルデヒドとして活性化されたデンドリマー様ＰＥＧとの結合
２０ｍＭのシアノホウ化水素と共に１００ｍＭの酢酸緩衝液ｐＨ５中４ｍｇ／ｍＬの治療用タンパク質１５ｍｇを含有する溶液に、アルデヒドとして活性化されたデンドリマー様４分枝ＰＥＧ（ＰＥＧ_{４，１２Ｋ}−ＡＬＤ）の１００ミリグラムを加えた。緩やかに攪拌しながら、４℃で２４時間反応を続け、１ｍＭのＨＣｌを用いた２０倍希釈によって反応を停止させた。クーマシーブリリアントブルーＲ−２５０によって染色したサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥからのデンシトメトリー分析により反応収率を判定した。すべての場合において、デンドリマー様４分枝ＰＥＧを有するモノＰＥＧ化タンパク質の画分は、３０％よりも高かった。

プロテアーゼによるタンパク質の分解に対するデンドリマー様４分枝ＰＥＧの結合効果
４００μｇ／ｍＬの天然タンパク質又は４分枝ＰＥＧに結合したタンパク質を含有する、４０マイクロリットルの４％重炭酸溶液ｐＨ８を、１０μＬの１６０μｇ／ｍＬトリプシン溶液に混合した。このサンプルを、緩やかに攪拌しながら３７℃で４時間インキュベートした。この時間後、反応を１０μＬのトリフルオロ酢酸で停止させた。タンパク質（結合又は非結合）の残量を、クーマシーブリリアントブルーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析におけるバンドの消失により算出した。この結果（表３）は、デンドリマー様４分枝ＰＥＧとの結合は、トリプシンによる分解から結合タンパク質を保護することを示している。すべての場合において、使用された化学結合法とは独立して、３５％超のタンパク質は、トリプシンとの反応４時間後に消化されていなかった。しかしながら、天然タンパク質では、この反応時間後に検出できる徴候はなかった。

プロテアーゼによる分解に対する保護を示す図である。Ｘ軸は、時間を表し、Ｙ軸は、ゼロ時間における量のパーセントで表される非分解タンパク質量を表す。 耐熱性を示す図である。Ｘ軸は、日数期間を表し、Ｙ軸は、ゼロ時間における量のパーセントで表される非分解タンパク質量を表す。

Claims (2)

1. ａ）下記式により表すことができる４分枝のモノメトキシポリエチレングリコールを含むポリマーデンドリマー様構造、
   

   

   及び、
   ｂ）インターフェロンアルファ２−ｂに含まれる求核性基、を含み、
   全分子質量が６４，０００Ｄａから７０，０００Ｄａの間である結合体。
2. 前記ポリマー構造が、カルボン酸基の官能化により得られた前記求核性基との結合のために活性化された、請求項１に記載の結合体。

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