ES2285843T3 - Modificacion de proteinas especifica de sitio por mutagenesis. - Google Patents

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Abstract

Un polipéptido TNFR soluble mutante que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por ID SEC Nº 2 e ID SEC Nº 6.

Description

Modificación de proteínas específica de sitio por mutagénesis.
Antecedentes de la invención Campo de la invención
La presente invención se refiere a procedimientos para modificar proteínas. Más en particular, la presente invención implica procedimientos para unir polietilenglicol a proteínas de una forma que proporciona ventajas asociadas con proteínas conjugadas con polietilenglicol mientras se mantiene una bioactividad de la proteína deseada.
Descripción de la técnica relacionada
Durante décadas se han usado exhaustivamente procedimientos y reactivos para modificar proteínas químicamente. Tradicionalmente, se llevaban a cabo modificaciones químicas de proteínas con el fin de estudiar sus propiedades funcionales y sus características estructurales. Con la aparición de técnicas de ADN recombinante y el interés en terapia de proteínas, los investigadores han modificado químicamente proteínas para mejorar su rendimiento clínico. En particular se ha expandido el uso de procedimientos para conjugar proteínas con polietilenglicol entre las comunidades farmacéutica y bioquímica como resultado de numerosas propiedades farmacológicas y biológicas mejoradas asociadas con proteínas conjugadas con polietilenglicol. Por ejemplo, se sabe que las proteínas conjugadas con polietilenglicol tienen una semivida media en plasma potenciada y por lo tanto han mejorado sustancialmente la utilidad clínica. Adicionalmente, las proteínas conjugadas con polietilenglicol generalmente tienen antigenicidad e inmunogenicidad reducidas, siendo por tanto menos propensas a causar anafilaxis que pone en peligro la vida.
Otro beneficio asociado con proteínas conjugadas con polietilenglicol es el de la solubilidad en agua, que se incrementa como resultado de la alta solubilidad en agua del polietilenglicol. La solubilidad en agua incrementada puede mejorar las características de formulación de la proteína a pH fisiológico y puede disminuir complicaciones asociadas a la agregación de proteínas con baja solubilidad.
Adicionalmente, las proteínas conjugadas con polietilenglicol han encontrado uso en aplicaciones bioindustriales tales como reacciones basadas en enzimas en las que el ambiente de reacción no es óptimo para la actividad de la enzima. Por ejemplo, algunas enzimas conjugadas con polietilenglicol demuestran una actividad a pH óptimo más amplia y menor temperatura de actividad óptima. Además, las enzimas que tienen actividad reducida en muchos disolventes orgánicos se han conjugado con éxito con polietilenglicol en un grado que las hace útiles para catalizar reacciones en disolventes orgánicos. Por ejemplo, se ha conjugado polietilenglicol con peroxidasa de rábano picante que se hace entonces soluble y activa en cloroformo y en tolueno (Urrotigoity y col., Biocatalysis, 2: 145-149,
1989).
Las proteínas conjugadas con polietilenglicol varían en la medida en la que se incrementa la semivida en circulación en el plasma, se reduce la inmunogenicidad, se potencia la solubilidad en agua y se mejora la actividad enzimática. Los factores responsables de estas variaciones son numerosos e incluyen el grado en el que está sustituida la proteína con polietilenglicol, las químicas usadas para unir el polietilenglicol a la proteína y las localizaciones de los sitios de polietilenglicol en la proteína.
Los procedimientos más comunes para unir polietilenglicol a proteínas implican activar al menos uno de los grupos hidroxilo en el polietilenglicol con una funcionalidad susceptible de ataque nucelófilo por parte del nitrógeno de grupos amino en la proteína. Estos procedimientos generalmente dan como resultado la pérdida de actividad biológica debido a la unión no específica de polietilenglicol.
Aproximaciones alternativas para conjugar proteínas con polietilenglicol incluyen controlar los reactivos y condiciones de conjugación de forma que el sitio de conjugación esté confinado al extremo N-terminal (Kinstler y col., Pharm. Res. 13: 996, 1996), unir polietilenglicol a funcionalidades carbohidrato de la proteína (Urrotigoity y col., Biocatalysis, 2: 145, 1989), unir polietilenglicol a restos de cisteína de la proteína (Goodson y col., Biotechnology 8: 343, 1990), unir polietilenglicol durante la síntesis de péptidos en fase sólida y fase en solución (Felix, ACS Symposium Series 680 c. 16, 1997) y sustituyendo selectivamente restos de arginina de la proteína por restos de lisina que proporcionan un sitio de unión a polietilenglicol (Hershfield y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 7185, 1991). Aunque estos ofrecen un cierto grado de control sobre el sitio de reacción, existe una continua necesidad de procedimientos mejorados para proporcionar proteínas conjugadas con polietilenglicol. En particular, sería deseable proporcionar procedimientos para conjugar proteínas con polietilenglicol que dieran como resultado proteínas modificadas que tuviesen bioactividad potenciada o menor pérdida de bioactividad a la vez que mantuviesen los beneficios de la conjugación con polietilenglicol, incluyendo características de inmunogenicidad sustancialmente disminuida, solubilidad incrementada y semividas en circulación prolongadas de las proteínas modificadas.
Pettit, Dean K y col., (Polymer reprints, 1997, volumen 38(1), 574-575) describen un procedimiento para pegilar proteínas uniendo las proteínas por medio de un anticuerpo a una columna de afinidad.
\newpage
El documento WO89/05824 describe un procedimiento para pegilar proteínas en el que se modifican restos de lisina de un polipéptido por eliminación o sustitución y/o un aminoácido diferente en el polipéptido es reemplazado por lisina, que se acopla entonces con un polialquilenglicol.
Resumen de la invención
La presente invención proporciona un polipéptido TNFR mutante soluble que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por ID SEC Nº 2 e ID SEC Nº 6 y secuencias de ADN que codifican el mismo.
La presente invención proporciona además procedimientos para conjugar una proteína con polietilenglicol, comprendiendo los procedimientos las etapas de
preparar un polipéptido TNFR mutante soluble que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por ID SEC Nº 2 e ID SEC Nº 6 y
poner en contacto esta proteína con polietilenglicol en condiciones suficientes para conjugar el polietilenglicol a la proteína.
Breve descripción de los dibujos
La fig. 1 ilustra restos de lisina en el dominio extracelular del receptor p75 de TNF que son sitios de conjugación de polietilenglicol y restos de lisina que hacen contacto con TNF\alpha.
Descripción detallada de la invención
Los procedimientos de la presente invención se basan en el descubrimiento de que eliminando uno o más restos aminoácidos seleccionados que son capaces de reaccionar con sitios de polietilenglicol y conjugando después la proteína con polietilenglicol, la proteína modificada con polietilenglicol resultante no demuestra una reducción significativa de una actividad deseada. En una forma de realización, el resto aminoácido seleccionado es un resto de lisina que, si se hace reaccionar con un polietilenglicol, interfiere con la capacidad de la proteína conjugada resultante para unirse con su pareja de unión, sustrato o receptor. Se cree que los restos aminoácidos seleccionados están asociados con sitios de unión y si se modifican interfieren con los elementos estructurales de la proteína conjugada que determinan la conformación y la función de la proteína. Eliminando el resto aminoácido seleccionado, el polietilenglicol no modifica la proteína en el sitio del resto aminoácido seleccionado durante una reacción de modificación con polietilenglicol posterior. Preferiblemente, con el fin de conservar el número de restos aminoácidos, el resto aminoácido eliminado se sustituye por un resto aminoácido que no sea reactivo con polietilenglicol en las condiciones de reacción. Por ejemplo, se puede eliminar lisina y reemplazarse por un resto de arginina. La arginina tiene la misma estructura que la lisina, con la excepción de la funcionalidad \varepsilon-NH_{2} reactiva con polietilenglicol en la lisina, que está ausente en la arginina.
Los restos aminoácidos que son reactivos con polietilenglicol en condiciones conocidas en la técnica incluyen aquellos que tienen restos que tienen funciones nucleófilas que están disponibles para reaccionar con polietilenglicol o un polietilenglicol activado. Por ejemplo, la lisina es reactiva con polietilenglicol a través de su \varepsilon-NH_{2}, el ácido aspártico y el ácido glutámico son reactivos con polietilenglicol a través de sus funcionalidades COOH (carboxilo), la serina y la treonina son potencialmente reactivas a través de sus sitios OH (hidroxilo) y la cisteína con grupos SH (sulfhidrilo) disponibles también puede reaccionar con polietilenglicol. Las condiciones adecuadas para reacciones entre polietilenglicol o polietilenglicoles activados y restos aminoácidos específicos en proteínas son conocidas y aquellos expertos en la materia conocen tales reacciones. Es conocido en la técnica que los residuos de lisina reaccionan con polietilenglicol activado en condiciones de reacción favorables y con reacciones secundarias mínimas. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, los restos de lisina son típicamente el resto buscado y las condiciones de reacción se controlan para maximizar la reacción entre polietilenglicol y lisina.
Después de expresar, recoger y purificar las proteínas diseñadas, las proteínas expresadas se pueden hacer reaccionar con polietilenglicol para formar una proteína conjugada. Después, la proteína conjugada se puede ensayar en cuanto a su actividad funcional y otras características tales como inmunogenicidad, eliminación fisiológica y solubilidad. Las proteínas conjugadas con polietilenglicol que tienen la actividad deseada y las propiedades más favorables de eliminación, solubilidad e inmunogenicidad también contienen los restos de lisina seleccionados, es decir, los restos que han sido eliminados y sustituidos antes de hacer reaccionar la proteína con polietilenglicol.
Las proteínas se pueden preparar mediante cualquiera de una serie de técnicas convencionales. Se puede sintetizar químicamente una secuencia de ADN deseada usando técnicas en sí conocidas. También se pueden producir fragmentos de ADN mediante digestión con endonucleasas de restricción de una secuencia de ADN clonado de longitud completa y aislarse mediante electroforesis en geles de agarosa. Se pueden emplear enlazadores que contienen sitio(s) de escisión para endonucleasas de restricción para insertar el fragmento de ADN deseado en un vector de expresión, o se puede digerir el fragmento en sitios de escisión presentes de forma natural en el mismo.
De forma similar, la presente invención proporciona metodologías para prevenir la asociación multimérica de proteínas. Por ejemplo, se puede conjugar selectivamente polietilenglicol en sitios sobre o alrededor de la interfaz de asociación multimérica mientras se conserva la unión de la proteína con su cognado natural mediante conjugación con polietilenglicol "de sitio protegido" como se ha dado a conocer en el presente documento, previniendo de esta forma la multimerización de receptor.
Después de preparar una proteína de la invención, la proteína se conjuga con polietilenglicol. En la técnica se conocen en sí reactivos y procedimientos para formar conjugados de proteínas y polietilenglicol y son generalmente aplicables a la práctica de la presente invención. Típicamente, estos procedimientos implican en primer lugar proporcionar un polietilenglicol activado en el que uno o ambos grupos hidroxilo en un polietilenglicol están activados y hacer reaccionar el polietilenglicol activado con sitios activos de una proteína seleccionada para la conjugación con polietilenglicol. Como se ha mencionado anteriormente, los procedimientos más ampliamente utilizados para conjugar una proteína con polietilenglicol se basan en una reacción nucleófila entre sitios amino de la proteína (el nitrógeno \varepsilon-amino de lisina o la amina \alpha-amino terminal) y un hidroxilo activado de polietilenglicol. Dado que los sulfhidrilo también son nucleófilos, los sulfhidrilos de cisteínas que no forman parte de un puente disulfuro también son sitios de reacción potenciales en la proteína. Los principios generales de la conjugación de polietilenglicol con proteínas y reactivos comunes de activación han sido descritos por Delgado y col en The Uses and Properties of PEG-linked Proteins, de Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 9(3,4): 249-304 (1992) y la ACS Symposium Series 680 ed. y Harris y col., Poly(ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications 1997, incorporándose ambos en el presente documento mediante referencia.
Están comercialmente disponibles formas activadas de polietilenglicol y monometoxipolietilenglicol y se pueden usar en procedimientos de la presente invención. De la forma más notable, Shearwater Polymers, Inc de Huntsville, AL, proporciona una serie de polímeros de polietilenglicol y derivados de polietilenglicol. El catálogo de Shearwater Polymers Inc. (Shearwater Polymers Inc. Catalog Funcionalized Biocompatible Polymers for Research, 1997-1998, incorporado en el presente documento mediante referencia) describe y pone a disposición una gran variedad de polietilenglicoles activados adecuados para el acoplamiento con proteínas en un amplio intervalo de condiciones de reacción. Este catálogo proporciona adicionalmente condiciones de reacción preferidas para sus reactivos de polietilenglicol derivatizados. Aquellos expertos en la materia, habiéndose percatado de los numerosos reactivos adecuados para conjugar proteínas con polietilenglicol, apreciarán la variedad de opciones de reactivos en vista de la naturaleza de la proteína seleccionada, la naturaleza de los grupos amino o los grupos sulfhidrilo reactivos en la proteína y el uso final de la proteína conjugada. Por ejemplo, para proporcionar proteínas conjugadas que tengan solubilidad, características de actividad y propiedades de suministro mejoradas pero no necesariamente un tiempo de eliminación clínico incrementado, se puede usar un polietilenglicol activado con succinato de succinimidilo (SS-PEG) en la reacción de conjugación. El enlace éster con la proteína es menos estable y se hidrolizará in vivo, liberando el polietilenglicol de la proteína. Están disponibles polietilenglicoles activados que reaccionarán de forma más preferible con grupos amino en contraposición a grupos sulfhidrilo y viceversa. Los polietilenglicoles activados normalmente seleccionados incluyen polietilenglicoles activados con carbonato de succinimidilo, polietilenglicol activado con succinato de succinimidilo y polietilenglicoles con succinimidilo ácido propiónico.
Como una alternativa a seleccionar polietilenglicoles activados comercialmente disponibles, se puede activar un polietilenglicol de interés usando reactivos que reaccionan con funcionalidades hidroxilo para formar un sitio reactivo con un sitio en una proteína de interés. Típicamente, el sitio activo de la proteína es un grupo amino, pero puede ser un sulfhidrilo o hidroxilo y el polietilenglicol activado típicamente es un éster o imidazol activo (véanse las páginas 274-285 igual que la referencia anterior). Preferiblemente sólo se activa una funcionalidad hidroxilo en el polietilenglicol, lo cual se puede efectuar utilizando un monometoxipolietilenglicol en una reacción de activación. No obstante, en el alcance de la invención entran procedimientos en los que se activan dos hidroxilos. En función de la naturaleza del grupo activador y del ataque nucleófilo, la función activadora puede o no incorporarse en la proteína tras la reacción nucleófila.
El polietilenglicol puede ser de cualquier peso molecular, pero preferiblemente se encuentra en el intervalo de aproximadamente 500 a aproximadamente 10000 y más preferiblemente en el intervalo de 2000 a 20000. Los criterios para seleccionar un peso molecular específico del polietilenglicol incluyen, pero no se limitan al peso molecular de la proteína seleccionada para su modificación, la carga de la proteína, el tipo de proteína y el número y localización de sitios de conjugación potenciales. En Delgado y col., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9: 349, 1992 y las ACS Symposium Series 680, Harris y col., Poly(ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications, 1997 se discuten características inmunológicas y de la semivida en plasma de proteínas conjugadas con polietilenglicol de diferentes pesos moleculares. Como es conocido en la técnica, en general, cuanto mayor sea la cantidad de polietilenglicol conjugado con la proteína, mayor será la semivida en plasma y mayor la solubilidad de la proteína. Dado que el límite de peso molecular para la filtración glomerular es aproximadamente 70 kDa, las proteínas que tengan pesos moleculares inferiores a aproximadamente 70 kDa experimentarán una semivida en plasma prolongada. Para proteínas mayores de 70 kDa, los efectos de polietilenglicol y su peso molecular variarán con su mecanismo de eliminación.
En general, usando un polietilenglicol que tenga un peso molecular elevado en los procedimientos de la presente invención se obtienen como resultado proteínas conjugadas que tienen más polietilenglicol por molécula de proteína que usando polietilenglicol que tenga un peso molecular inferior. Por lo tanto, cuando es deseable una alta cantidad de polietilenglicol por molécula de proteína, el peso molecular del polietilenglicol es preferiblemente hasta 20000. No obstante, los polietilenglicoles de menor peso molecular, debido a su mayor movilidad en solución, se pueden conjugar a más sitios en la proteína que una proteína de mayor peso molecular. Por lo tanto, cuando una proteína tiene un número de sitios de conjugación deseados, puede ser preferible usar un polietilenglicol que tenga un peso molecular inferior para asegurar que se conjuga un número óptimo de sitios. Esto puede ser una aproximación particularmente deseable cuando los sitios de conjugación potenciales o el sitio de reacción en la proteína están muy próximos entre sí. Otra consideración que se usa al seleccionar el peso molecular de un polietilenglicol es que incluso aunque las proteínas tratadas de acuerdo con la presente invención tienen sitios protegidos, los polietilenglicoles de gran peso molecular pueden ser tan grandes que una vez conjugados, su tamaño molecular provoca que extiendan su influencia estérica o espacial de forma que los sitios de unión o receptores tienen accesibilidad reducida. Forma parte del conocimiento de aquellos expertos en la materia determinar un peso molecular de polietilenglicol óptimo para cualquier proteína seleccionada y los beneficios deseados a partir de la conjugación con polietilenglicol.
Aunque los procedimientos de conjugación de polietilenglicol descritos anteriormente son aquellos en los que el resultado es polietilenglicol conjugado a una proteína por medio de un enlace covalente, entra dentro del alcance de la presente invención incluir procedimientos en los que la conjugación es por medio de una asociación diferente. En el contexto de la presente invención, pueden modificarse proteínas conjugándolas con polietilenglicol usando una variedad de mecanismos de unión o conjugación diferentes. Por ejemplo, una proteína seleccionada para conjugación puede derivatizarse en un grupo amino u otra funcionalidad reactiva adecuada con un nucleótido poliA y luego conjugarse con un polietilenglicol derivatizado con un nucleótido poliT. Otra aproximación implica derivatizar la proteína con una funcionalidad que tiene una pareja de unión específica conocida y después conjugar la proteína con polietilenglicol que ha sido derivatizado con la pareja de unión de la funcionalidad. Por ejemplo, una proteína puede derivatizarse con biotina y el polietilenglicol derivatizarse con estreptavidina o avidita (o viceversa). Esto da como resultado la unión específica de polietilenglicol con aquellos sitios de la proteína que tienen la biotina. Existe una serie de reactivos para modificar proteínas para el propósito de introducir ciertas funcionalidades disponibles comercialmente. Por ejemplo, el catálogo de Pierce Immunotechnology indentifica y proporciona acceso a una variedad de reactivos asociados con modificación de proteínas. Entre ellos están los reactivos de Traut y SATA (Pierce ImmunoTechnology Catalogue, Vol I, pág. E-14) que pueden introducir grupos activos en aminas N-terminales y funcionalidades amino de lisina. Estos grupos activos proporcionan sitios para introducir adicionalmente funcionalidades para reaccionar de forma más específica con polietilenglicol. Aquellos expertos en la materia reconocerán también que también son posibles interacciones iónicas entre polietilenglicol y una proteína de interés. Por ejemplo, una asociación entre una función iónica en la proteína y su contraión en el polietilenglicol puede utilizarse si la asociación es lo suficientemente fuerte para permanecer asociados en condiciones fisiológicas.
Formas de realización adicionales de la presente invención que pueden utilizar proteínas modificadas anteriores incluyen aquellos procedimientos en los que la proteína seleccionada para su conjugación tiene demasiados pocos sitios de conjugación con polietilenglicol potenciales o ningún sitio de conjugación con polietilenglicol potencial fuera de la región de aminoácidos protegida. Modificando la proteína seleccionada para introducir sitios amino y sulfhidrilo en la proteína, se puede conjugar suficiente polietilenglicol a la proteína seleccionada para proporcionar los beneficios deseados. Modificar la proteína seleccionada se puede conseguir usando metodologías de ingeniería genética o modificación química. Como se ha mencionado anteriormente, en la técnica son bien conocidos procedimientos y reactivos para modificar proteínas para conseguir una gran variedad de resultados deseados. En particular, en Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking, CRC Press, 1993, incorporado mediante referencia en el presente documento, se proporciona información relacionada con reactivos de conjugación y condiciones de
procedimiento.
Aunque el polietilenglicol es un reactivo de conjugación de proteínas preferido, se han usado una variedad de modificadores poliméricos adicionales. Estos incluyen polietilenglicoles modificados, polietilenglicoles ramificados, polietilenglicoles reticulados.
Las proteínas modificadas según los procedimientos descritos en el presente documento tienen beneficios asociados con la conjugación con polietilenglicol sin la pérdida significativa esperada de actividad. Los beneficios de las proteínas conjugadas de acuerdo con al presente invención pueden demostrarse simplemente aplicando procedimientos conocidos de ensayo para establecer la actividad post-conjugación. Los ensayos de actividad son específicos para la proteína y deben seleccionarse según la proteína de interés. Muchas proteínas tienen más de un sitio asociado con una o más actividades. La elección de la actividad para su medición para tales proteínas depende de la actividad de interés y del sitio que se selecciona específicamente para la deleción del resto aminoácido y la posterior reacción de conjugación. Además de evaluar proteínas conjugadas con polietilenglicol respecto a su actividad, se pueden analizar respecto al grado de sustitución con polietilenglicol, peso molecular y sitios de conjugación. Se conocen bien técnicas para llevar a cabo estos procedimientos analíticos y algunas se describen respecto a proteínas conjugadas con polietilenglicol en Critical Review Therapeutic Drug Carrier Systems, 9 (3:4) 285-291, 1992. Los ejemplos 4-6 describen procedimientos ilustrativos para caracterizar proteínas conjugadas con polietilenglicol.
Además de proporcionar compuestos que tienen características de bioactividad mejoradas, los procedimientos de la presente invención proporcionan producto molecular conjugado con polietilenglicol que es más homogéneo y en rendimientos más elevados. Dado que la conjugación no tiene lugar en restos aminoácidos que son críticos para la bioactividad de la molécula, el producto de reacción no tiene que purificarse eliminando numerosas fracciones de productos no deseados. Dado que la reacción de polietilenglicol se puede completar y todos los sitios disponibles para el polietilenglicol se pueden hacer reaccionar completamente, el producto final es más homogéneo que los productos de la técnica anterior que se preparan en condiciones que favorecen la reacción en sitios específicos.
Los siguientes ejemplos se presentan con el fin de proporcionar una descripción más detallada de formas de realización específicas de la presente invención y no deben considerarse como limitantes del alcance de la invención.
Ejemplo 1 Selección de un sitio de modificación de proteínas
A continuación se describe un procedimiento para identificar restos aminoácidos del receptor p75 de TNF para la deleción y sustitución según la presente invención. Dado que las condiciones de reacción de modificación con polietilenglicol esperadas iban a ser aquellas que favoreciesen la modificación del grupo \varepsilon-amino de restos de lisina y la amina N-terminal, los aminoácidos identificados fueron restos de lisina que hacen contacto entre el receptor de TNF y el ligando en el complejo receptor de TNF-ligando.
El receptor p75 de TNF forma parte de una familia de receptores estructuralmente homólogos que incluyen el receptor p55 de TNF. TNF\alpha y TNF\beta (ligandos TNF) compiten por la unión a los receptores de TNF p55 y p75. Se ha determinado la estructura cristalina de rayos x del complejo formado por el dominio extracelular del receptor p55 de TNF y TNF\beta (Banner y col., Cell, 73:431, 1993, incorporado mediante referencia en el presente documento). Este trabajo cristalográfico confirmó que el complejo de receptor p55 de TNF y TNF\beta tiene tres moléculas de receptor p55 de TNF unidas simétricamente a un trímero de TNF\beta. Los estudios demostraron además que el receptor se une en una hendidura entre dos unidades de TNF\beta adyacentes. De forma ventajosa, la estructura cristalina del complejo proporciona un modelo para la estructura y activación del receptor de TNF y se puede usar para identificar dominios de aminoácidos en el interior del ligando y en el receptor que hacen contacto para formar el complejo.
Un alineamiento de secuencia de la secuencia de aminoácidos del receptor p55 de TNF y la secuencia de aminoácidos del receptor p75 de TNF revela que los restos K34, K42, K47, K108, K120 y K40 del receptor p75 de TNF están estrechamente alineados con los restos K32, Y40, G45, S108, L119 y T138 del receptor p55 de TNF (véase banner y col., Cell, 73:431, 1993). Basándose en esta información de alineación y modelización molecular que ilustra las posiciones espaciales de restos de lisina en el receptor p75 de TNF, se puede ver que dos restos de lisina en el receptor p75 de TNF hacen contacto entre el receptor p75 y el ligando. Estos restos de lisina son K108 y K120 (la lisina en la posición 108 y la lisina en la posición 120). La Fig. 1 proporciona una secuencia de aminoácidos del dominio extracelular del receptor p75 de TNF (sin la secuencia señal) e ilustra restos de lisina que son sitios de conjugación con polietilenglicol y restos de lisina que hacen contacto con TNF\alpha. Por lo tanto, los restos de lisina en las posiciones 108 y 120 fueron seleccionados para su deleción y sustitución de acuerdo con la presente
invención.
Ejemplo 2 Preparación de receptor p75 de TNF de tipo natural y receptor p75 de TNF mutante
A continuación se describen procedimientos para la preparación de una molécula soluble de receptor p75 de TNF de tipo natural (dominio extracelular del receptor p75 de TNF) y tres moléculas solubles mutantes receptoras de TNF. El receptor p75 de TNF soluble de tipo natural tiene las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos descritas en ID SEC Nº 7 e ID SEC Nº 8. Las moléculas receptoras de TNF de tipo natural y mutantes utilizadas en los siguientes experimentos fueron los dominios extracelulares sin el péptido señal.
El receptor p75 de TNF en forma de una construcción dimerizada covalentemente de dos porciones extracelulares de unión a ligando del receptor p75 de TNF humano fusionadas por una función IgG1Fc (TNFR:Fc) (Mohler y col., J. Immunol. 151:1548:1561, 1993) se preparó expresando la proteína en células CHO usando el marcador amplificable seleccionable dihidrofolato reductasa. Se centrifugaron células en suspensión y se resuspendieron en medio exento de suero en un biorreactor controlado. El producto se recogió después de 7 días y la molécula TNFR:Fc se purificó usando cromatografía de afinidad de proteína A seguida de una etapa de cromatografía de intercambio iónico.
Para cada uno de las tres moléculas solubles mutantes receptoras de TNF se eliminó una lisina específica, K, y se diseñó una arginina, R, en la misma posición. Más específicamente, la lisina en la posición 108 y/o la lisina en la posición 120 se mutaron individualmente de forma que se prepararon dos mutantes individuales (K108R o K120R) y un mutante doble (K108R, K120R) en los que la K en la posición 108 y/o en la posición 120 se sustituyó por una R en la misma posición. ID SEC Nº 1 proporciona la secuencia de nucleótidos para el mutante K108R e ID SEC Nº 2 describe la secuencia de aminoácidos codificada por ID SEC Nº 1. ID SEC Nº 3 proporciona la secuencia de nucleótidos para el mutante K120R e ID SEC Nº 4 describe la secuencia de aminoácidos codificada por ID SEC Nº 3. ID SEC Nº 5 proporciona la secuencia de nucleótidos para el mutante K108R, K120R e ID SEC Nº 6 describe la secuencia de aminoácidos codificada por ID SEC Nº 5.
Brevemente, los mutantes se prepararon usando mutagénesis dirigida al sitio de K108 y/o K120 en el receptor p75 de TNF humano usando mutagénesis por PCR del fragmento Sfr1-Not1 del receptor de hTNF y la proteína de fusión Fc (hTNFR:Fc). Los fragmentos del receptor de TNF mutante se ligaron en marco con un fragmento Fc humano en el vector de expresión de mamífero sf Have409. Varios de los clones preparados se secuenciaron para confirmar que los cambios en el ácido nucleico deseados estaban incorporados en las secuencias de nucleótidos mutantes.
Más particularmente, se usó mutagénesis por PCR para generar fragmentos Sal/Sfr1 de 430 pares de bases mutados. Los procedimientos de mutagénesis por PCR utilizaron ADNc de TNFR de tipo natural (ID SEC Nº 7) usado como molde para las reacciones de PCR. Las secuencias de oligonucleótidos usadas en las reacciones de PCR para generar los 3 fragmentos mutantes Sal1-Srf1 de ADN son como sigue:
Para al receptor de TNF mutante (K108R), el oligonucleótido 3' contenía una sustitución de A a G en la posición 389 y un sitio Srf1 en el extremo 3'. Para el receptor de TNF mutante (K120R), el oligonucleótido 3' contenía una sustitución de A a G en la posición 425 y un sitio Srf1 en el extremo 3'. Para el receptor de TNF mutante (K108R, K120R), el oligonucleótido contenía una sustitución de A a G en la posición 389 y 425 y un sitio Srf1 en el extremo 3'. Los oligonucleótidos 5' usados para generar los fragmentos mutantes de ADN por PCR no tenían cambios de nucleótido en los nucleótidos que codifican TNFR y contenían el sitio Sal1 5'.
Para las reacciones de PCR se usaron el kit Expand HIgh Fidelity PCR de Boehringer Mannheim y reactivos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El protocolo de ciclos de PCR implicaba las siguientes condiciones: 94ºC durante 2 minutos, 94ºC durante 30 segundos, 50ºC durante 15 segundos, 72ºC durante 1 minuto. Reacción de 25 ciclos.
Los fragmentos de ADN generados en las reacciones de PCR se separaron en un gel de agarosa al 1% y los fragmentos de 430 pares de bases se aislaron usando reactivo GeneClean de BIO101. Los fragmentos aislados fueron digeridos en condiciones de restricción con Sal1 y Srf de NEB en tampón de restricción universal de Stratagene. El ADN se purificó de nuevo usando los reactivos GeneClean de BIO101.
Cada uno de los fragmentos Sal1/Srf 430 de ADN generados anteriormente (y correspondientes al extremo 5' del receptor de TNF) se ligó individualmente con el fragmento de ADN de 1065 pares de bases Srf1/Not1 correspondiente al receptor de TNF 3' y ADNc humano Fc y el pDC409 de expresión de 7730 pares de bases Sal1/Not1. Se usaron 20 ng del vector pDC409 para cada reacción de ligamiento y los fragmentos del receptor de TNF estaban presentes a una concentración molar 3 veces mayor. La reacción de ligamento se llevó a cabo usando la mezcla de ligación de Boehringer Mannheim con 500 unidades de ligasa a temperatura ambiente durante 3 horas.
Las mezclas de reacción de ligamiento se dializaron y 1/10 de la mezcla de reacción se introdujo por electroporación en células DH10B de E. coli. Se cultivaron 10 colonias de cada construcción en cultivo líquido y las construcciones de vector de expresión se confirmaron usando análisis enzimáticos de restricción. El inserto de ADNc del receptor de TNf en una construcción de cada uno de los 3 mutantes se analizó por secuenciación de nucleótidos para confirmar las mutaciones de nucleótidos deseadas.
Las tres construcciones mutantes de fusión de ADNc fueron transfectadas a células CV1/EBNA. Las células transfectadas se cultivaron a 37ºC durante 7 días y después se recogió medio acondicionado de estas células y se monitorizó respecto a la expresión de TNFR:Fc usando un ensayo ELISA de Fc. El medio acondicionado también se monitorizó respecto a la bioactividad del receptor de TNF usando un bioensayo de crecimiento celular A375 que se basa en medir la inhibición de la actividad del TNF. Los tres mutantes TNFR:Fc y la construcción de TNFR:Fc de tipo natural demostraron niveles de expresión de la molécula de receptor similares.
Con el fin de recoger y purificar las proteínas receptoras de TNF mutantes, se recogieron sobrenadantes de las células CV1/EBNA transfectadas 7 días después de la transfección y se aclararon por centrifugación y filtración a través de un filtro de 0,45 \mum. La purificación de la proteína de tipo natural recogida y filtrada y de las proteínas mutantes se llevó a cabo usando cromatografía de afinidad de proteína A. Se usó una columna de proteína A sefarosa para capturar la porción Fc de las proteínas de fusión. Una vez unida, la proteína se lavó con 3 volúmenes de columna de TRIS 25 mM/NaCl 140 mM a pH 7,4 y se eluyó con 3 volúmenes de columna de acetato de sodio 50 mM/NaCl 100 mM a pH 4,0. Cada proteína de fusión eluida se dializó frente a Na_{2}HPO_{4} a pH 7,4 y se diluyó hasta aproximadamente 1 mg/ml. Los productos recogidos finales eran mutantes purificados solubles p75 TNFR:Fc como se ha descrito anteriormente. ID SEC Nº 1 proporciona la secuencia de nucleótidos para el mutante K108R e ID SEC Nº 2 describe la secuencia de aminoácidos codificada por ID SEC Nº 1. ID SEC Nº 3 proporciona la secuencia de nucleótidos para el mutante K120R e ID SEC Nº 4 describe la secuencia de aminoácidos codificada por ID SEC Nº 3. ID SEC Nº 5 proporciona la secuencia de nucleótidos para el mutante K108R, K120R e ID SEC Nº 6 describe la secuencia de aminoácidos codificada por ID SEC Nº 5.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 3 Conjugación de receptores p75 TNF:Fc de tipo natural y mutantes con polietilenglicol
A continuación se describe un procedimiento para preparar moléculas de tipo natural de TNFR:Fc conjugadas con polietilenglicol y moléculas mutantes de TNFR:Fc conjugadas con polietilenglicol. Para cada reacción de conjugación con polietilenglicol se disolvió una porción de cien microgramos (100 \mug) de TNFR:Fc de tipo natural o TNFR:Fc mutante preparado en el ejemplo 2 en 400 \mul de Na_{2}HPO_{4} 50 mM a pH 8,5 y se dejó reaccionar con SPA-PEG 5000 a diferentes proporciones molares de polietilenglicol a proteína (calculadas como el número de restos de lisina en TNFR:Fc) durante toda la noche a 4ºC. Las proporciones molares de proteína a restos de lisina 1:1 y 10:1. SPA-PEG es un monometoxipolietilenglicol activado con carbonato de succinimidilo de 5000 MW obtenido de Shearwater Polymers, Birmingham, Al. Las soluciones de proteína y de polietilenglicol se dejaron reaccionar durante toda la noche a 2-8ºC.
Cada una de las moléculas de TNFR:Fc conjugadas con polietilenglicol se purificó por cromatografía de intercambio iónico usando resina SP de flujo rápido de sefarosa (Pharmacia) equilibrada con fosfato de sodio 20 mM, pH 7,4. El TNFR:FC conjugado con polietilenglicol se unió a la resina en estas condiciones. El polietilenglicol que no había reaccionado y los subproductos de reacción se aclararon de la columna con 5 volúmenes de columna del tampón de equilibrado. El TNFR:Fc conjugado con polietilenglicol se eluyó de la columna con cinco volúmenes de columna de fosfato de sodio 20 mM, NaCl 200 mM, pH 7,4. Las fracciones eluidas se reunieron y se concentraron hasta aproximadamente 1-5 mg/ml.
A continuación se indican las designaciones dadas a cada una de las moléculas de TNFR:Fc conjugadas con polietilenglicol (PEG) mediante el procedimiento anteriormente descrito.
1.
PEG-TNFR:Fc (K108R, K120R);
2.
PEG-TNFR:Fc (K108R);
3.
PEG-TNFR:Fc (K120R);
4.
PEG-TNFR:Fc.
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Ejemplo 4 Caracterización de TNFR:Fc conjugado
A continuación se describe la caracterización de moléculas de TNFR:FC de tipo natural conjugadas con polietilenglicol y mutantes conjugadas con polietilenglicol preparadas en el ejemplo 3 y una caracterización de control de moléculas de TNFR:Fc de tipo natural y mutantes no conjugadas preparadas en el ejemplo 2. Los análisis de caracterización incluyen electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS, cromatografía de exclusión molecular, ELISA y pruebas de bioensayo in vitro.
Se pusieron en marcha geles de SDS-PAGE en gradientes de acrilamida de 4-20% (Novex, San Diego) con 1 \mug de cada una de las moléculas de TNFR:Fc de tipo natural conjugadas con polietilenglicol y moléculas de TNFR:Fc mutantes conjugadas con polietilenglicol. Estos geles se tiñeron con tinte rápido Novex según las instrucciones del fabricante. Los geles en gradiente mostraron que el grao del conjugación con polietilenglicol era similar para cada una de las moléculas de TNFR:Fc de tipo natural conjugadas con polietilenglicol y moléculas de TNFR:Fc mutantes conjugadas con polietilenglicol.
Se llevó a cabo cromatografía de exclusión molecular en cada una de las moléculas conjugadas con polietilenglicol como se ha descrito en el ejemplo 3. La caracterización por exclusión molecular se llevó a cabo usando un sistema de HPLC Waters de Millipore Corp. Milford, MA, que estaba equipado con una columna de 300 x 8 mm SEC-400 Biosil de BioRad. Los tamaños de inyección de muestras eran 50-100 \mug y la fase móvil era solución salina tamponada con fosfato a 1 ml/minuto. Los resultados confirmaron que los mutantes conjugados con polietilenglicol y el TNFR:Fc de tipo natural conjugado con polietilenglicol tenían incrementos sustanciales en el tamaño global. Más particularmente, dependiendo de la proporción de polietilenglicol a lisina usada en la reacción de conjugación, las moléculas conjugadas con polietilenglicol eran 2-3 veces más grandes que las moléculas no conjugadas.
Las moléculas de TNF:Fc mutantes conjugadas con polietilenglicol, la molécula de TNF:Fc de tipo natural conjugada con polietilenglicol y formas no conjugadas de TNFR:Fc se sometieron a ensayo mediante ELISA que implicaba el recubrimiento de placas de microvaloración de 96 pocillos con anticuerpos monoclonales anti-IgG1-Fc, aplicar las moléculas modificadas con polietilenglicol a las placas de microvaloración y dejarlas unirse con los anticuerpos anti-IgG1-Fc. Se usó un anticuerpo policlonal secundario anti-TNFR para detectar la cantidad de moléculas conjugadas con polietilenglicol y la cantidad de TNFR:Fc unida a la placa. Los resultados de estos estudios demostraron que el TNFR:Fc mutante conjugado con polietilenglicol y el TNFR:Fc de tipo natural conjugado con polietilenglicol reducían o eliminaban la unión con anticuerpos anti-IgG1-Fc y/o anti-TNFR. Los resultados sugieren que la conjugación con polietilenglicol esconde epítopes que son activos en la unión con anticuerpos.
Ejemplo 5 Farmacocinética de moléculas TNFR:Fc de tipo natural y mutantes
A continuación se describen experimentos designados para comparar la farmacocinética de TNFR:Fc de tipo natural con la molécula mutante de TNFR:Fc conjugada con polietilenglicol K108R, K120R (las lisinas en 108 y 120 sustituidas por arginina). La molécula mutante había sido conjugada con una proporción de polietilenglicol:lisina de 10:1.
Se inyectaron a grupos de 2 ratones BALB/c hembras de 10-12 semanas de edad por vía intravenosa 10 \mug de TNFR:Fc de tipo natural o TNFR:Fc mutante conjugado en un volumen total de 100 \mul. Después de la inyección, se sacrificó a los ratones y se tomaron muestras de sangre a los 5 minutos, 1 hora, 8 horas, 24 horas, 48 horas y 72 horas por punción cardiaca. Se analizaron muestras de plasma mediante bioensayo A375. Se determinaron las semividas de eliminación, t^{1/2}, TNFR:Fc mutante conjugado con polietileno y del TNFR:Fc de tipo natural. Los valores de semivida se presentan como t^{1/2} +/- ET, donde ET significa error típico en el ajuste del log lineal de la línea a los puntos de datos. Se determinó que el t^{1/2} de TNFR:Fc de tipo natural era 16,6+/-1, horas y el del mutante conjugado con polietilenglicol era 36,5+/-8,5 horas.
Los resultados de los experimentos anteriores demuestran que el receptor de TNF conjugado con polietilenglicol preparado según la presente invención tiene una semivida en circulación significativamente potenciada comparada con un receptor de TNF que no está conjugado con polietilenglicol.
Ejemplo 6 Bioactividad de TNFR:Fc de tipo natural conjugado con polietilenglicol y TNFR:Fc mutante conjugado con polietilenglicol
Se midieron las bioactividades de moléculas de TNFR:Fc conjugadas con polietilenglicol preparadas en el ejemplo 3 mediante bioensayos A375 in vitro. Este ensayo se describe de forma general en Onozaki y col., J. Immunology 135:3962 (1985) y Nakai y col., Biochem. Biophys. Res. Com. 154:1189 (1988). Este bioensayo se basa en la respuesta inhibidora de la línea celular adherente de melanoma maligno humano A375 a TNF\alpha. El TNFR:Fc soluble puede neutralizar específicamente la actividad inhibidora de TNF\alpha de una forma dependiente de la dosis. Para llevar a cabo el ensayo, se recogió la línea celular 375 (ATCC CRL 1872) usando una solución de tripsina-ADTA para retirar la monocapa de células de las botellas. Las células recogidas se lavaron con un medio de ensayo de medio de Eagle modificado de Dulbecco con suero bovino fetal añadido, aminoácidos no esenciales y piruvato de sodio (todo adquirido en GIBCO).
Se prepararon noventa y seis placas con diluciones seriadas de soluciones de trabajo del TNFR:Fc mutante conjugado con polietilenglicol descrito en el ejemplo 3. Después se añadieron cantidades iguales de TNF\alpha (R&D Systems,, Cat. nº #210-CA TF) en el medio de ensayo descrito anteriormente a pocillos en placas de 96 pocillos seguido de la adición de un volumen igual de aproximadamente 4x10^{5} células recogidas en suspensión a cada pocillo.
Las placas se colocaron en una cámara húmeda a 37ºC y 10% de CO_{2} y se dejaron incubar las células durante 72 horas. Después se retiraron las placas de la cámara y se lavaron las células con solución de PBS, se transfirieron y se fijaron con alcohol etílico. Las células viables se hicieron visibles tiñendo las células fijadas con solución acuosa de cristal violeta al 0,1%. Después de lavar las placas con agua y transferir las células, se añadió solución de deoxicolato sódico al 2% a cada pocillo y se leyeron los pocillos de cada placa respecto a densidad óptica a 570 nm sobre un lector de placas usando el software de análisis de microplacas Delta Soft. Se asignaron unidades de bioactividad convencionales para cada muestra y se ajustaron para tener en cuenta la concentración de TNFR:Fc en los pocillos. A los pocillos que contenían blancos se les asignó una bioactividad de cero.
Los resultados del bioensayo A375 demostraron el siguiente orden de actividad para las moléculas conjugadas con polietilenglicol:
PEG-TNFR:Fc (K108R, K120R)> PEG-TNFR:Fc (K108R)>> PEG-TNFR:Fc (K120R)> PEG-TNFR:Fc (PEG=> conjugada con polietilenglicol).
Los resultados indican que las moléculas de TNFR:Fc conjugadas con polietilenglicol mantienen una actividad biológica significativa según se determina mediante procedimientos in vitro. Dado que la muteína de TNFR:Fc, PEG-TNFR:Fc (108R), en la que la lisina en la posición 108 se ha mutado a arginina mantiene una actividad mucho mayor que la muteína en la que la lisina en la posición 120 se ha mutado a arginina, se sugiere que el polietilenglicol conjugado a K108 interfiere con la unión de TNF. Cuando este resto se muta a R108, se previene la conjugación con polietileno en la posición 108 y no se reduce de forma significativa la actividad de unión a TNF.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
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(i)
SOLICITANTE: Pettit, Dean
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(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Modificación de proteínas específica de sitio
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 8
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
PERSONA DE CONTACTO: Janis C Henry
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 51 University
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Seattle
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: WA
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: 98101
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: IBM compatible con PC
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.30
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 18 de junio de 1999
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Janis, C
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
NÚMERO DE REGISTRO: 34.347
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 2367-WO
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: (206) 470-4189
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(2) INFORMACIÓN DE LA ID SEC Nº 1:
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(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 705 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1..705
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 1:
\vskip1.000000\baselineskip
1 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA ID SEC Nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 235 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 2:
\vskip1.000000\baselineskip
2 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA ID SEC Nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 705 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1..705
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
3 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA ID SEC Nº 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 235 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 4:
\vskip1.000000\baselineskip
4 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA ID SEC Nº 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 705 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1..705
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 5:
\vskip1.000000\baselineskip
5
6 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA ID SEC Nº 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 235 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 6:
\vskip1.000000\baselineskip
7
8 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA ID SEC Nº 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 705 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1..705
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 7:
\vskip1.000000\baselineskip
9
10 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA ID SEC Nº 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 235 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 8:
\vskip1.000000\baselineskip
11
12

Claims (6)

1. Un polipéptido TNFR soluble mutante que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por ID SEC Nº 2 e ID SEC Nº 6.
2. Un ADN que codifica un polipéptido TNFR soluble mutante que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por ID SEC Nº 2 e ID SEC Nº 6.
3. Un polipéptido TNFR soluble mutante según la reivindicación 1, en el que el polipéptido está conjugado con polietilenglicol.
4. Un procedimiento para conjugar una proteína con polietilenglicol, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de
preparar un p75TNFR modificado según la reivindicación 1 y
poner en contacto esta proteína con polietilenglicol en condiciones suficientes para conjugar el polietilenglicol a la proteína.
5. Un procedimiento para conjugar una proteína con polietilenglicol según la reivindicación 4 que comprende preparar un polipéptido que comprende la ID SEC Nº 2.
6. Un procedimiento para conjugar una proteína con polietilenglicol según la reivindicación 4 que comprende preparar un polipéptido que comprende la ID SEC Nº 6.
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