ES2229485T3 - Modificacion de peroteinas en sitios protegidos. - Google Patents
Modificacion de peroteinas en sitios protegidos.Info
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Abstract
Esta invención se refiere a procedimientos que permiten conjugar proteínas con polietilenoglicol. Estos procedimientos se aplican en proteínas modificadas que presentan una baja o nula reducción de su actividad y consisten en proteger una o varias regiones de la proteína, en poner en contacto la proteína protegida con polietilenoglico en condiciones que permiten la conjugación del polietilenoglicol con la proteína y en suprimir la protección de la proteína. Esta conservación ventajosa de la actividad deseada de la proteína se atribuye a la disponibilidad de una o varias regiones de enlace de la proteína que no cambian durante el proceso de conjugación y que permanecen estéricamente libres de interactuar con un ligando o un elemento similar de enlace tras el proceso de conjugación.
Description
Modificación de proteínas en sitios
protegidos.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para modificar el receptor p75 del TNF y la proteína
de fusión TNFR:Fc. Más particularmente, la presente invención
implica procedimientos para unir el polietilenglicol al receptor p75
del TNF o la proteína de fusión TNFR:Fc de manera que proporcione
ventajas asociadas a las proteínas conjugadas con polietilenglicol
mientras mantiene la bioactividad del receptor p75 del TNF o la
proteína de fusión
TNFR:Fc.
TNFR:Fc.
Los procedimientos y los reactivos para modificar
químicamente las proteínas se han usado ampliamente durante décadas.
Tradicionalmente, las modificaciones químicas de las proteínas se
llevaron a cabo con el fin de estudiar sus propiedades funcionales y
características estructurales. Con la aparición de las técnicas de
DNA recombinante y compuestos terapéuticos de proteínas, los
investigadores han modificado químicamente las proteínas para
alterar sus propiedades terapéuticas. En particular, los
procedimientos para conjugar proteínas con polietilenglicol han
ganado un extenso uso en las comunidades farmacéuticas y bioquímicas
como resultado de numerosas propiedades farmacológicas y biológicas
asociadas a las proteínas conjugadas con polietilenglicol. Por
ejemplo, las modificaciones con polietilenglicol se sabe que alargan
significativamente la vida media en plasma de las proteínas usadas
en aplicaciones químicas, mejorando sustancialmente la utilidad
clínica de la proteína. La conjugación con polietilenglicol también
se sabe que reduce la antigenicidad e inmunogenicidad de las
proteínas, por lo tanto reduciendo la anafilaxis amenazadora de la
vida.
Otro beneficio asociado con las proteínas
modificadas con polietilenglicol es que la solubilidad en agua que
se incrementa como un resultado de alta solubilidad en agua del
polietilenglicol. El aumento de solubilidad en agua puede mejorar la
formulación de las características de formulación de las proteínas a
pH fisiológicos y pueden disminuir las complicaciones asociadas a la
agregación de proteínas de solubilidad baja.
Adicionalmente, las proteínas conjugadas con
polietilenglicol han encontrado uso en aplicaciones bioindustriales
tales como las reacciones basadas en enzimas en las que el ambiente
de reacción no es óptimo para la actividad de las enzimas. Por
ejemplo, algunas enzimas conjugadas con polietilenglicol muestran
una actividad más amplia a pH óptimo y temperatura de actividad
óptima reducida. Además, las enzimas que tienen actividad reducida
en muchos disolventes orgánicos se han conjugado con éxito con
polietilenglicol hasta un grado que las hace útiles para catalizar
reacciones en disolventes orgánicos. Por ejemplo, el
polietilenglicol se ha conjugado con la peroxidasa de rábano
rusticano el cual después se hace soluble y activo en cloroformo y
tolueno (Urrotigoity y col., Biocatalysis, 2:
145-149, 1989).
Las proteínas conjugadas con polietilenglicol
varían de manera que a medida que la vida media de circulación en
plasma se incrementa, la inmunogenicidad se reduce, la solubilidad
aumenta, y la actividad enzimática se mejora. Los factores
responsables de estas variaciones son numerosos e incluyen el grado
al que la proteína se sustituye con polietilenglicol, las químicas
usadas para unir el polietilenglicol a la proteína, y las
localizaciones de los sitios del polietilenglicol sobre la
proteína.
Los procedimientos más comunes para unir el
polietilenglicol a las proteínas implican la activación de al menos
uno de los grupos hidroxilo sobre el polietilenglicol con una
funcionalidad susceptible al ataque nucleofílico mediante el
nitrógeno de los grupos amino sobre la proteína. Estos
procedimientos generalmente dan como resultado la pérdida de
actividad biológica debida a la unión no específica de
polietilenglicol.
Los planteamientos alternativos para conjugar las
proteínas con polietilenglicol incluyen el control de los reactivos
y condiciones de conjugación de manera que el sitio de conjugación
se confine al extremo N (Kinstler y col., Pharm. Res. 13:
996, 1996) que une el polietilenglicol a las funcionalidades
carbohidrato de la proteína (Urrotigoity y col.,
Biocatalysis, 2: 145-149, 1989) y que une el
polietileno a los residuos cisteína de la proteína (Goodson y col.,
Bio-technology 8: 343, 1990). Aunque éstos ofrecen
algún grado de control del sitio de reacción, existe una continua
necesidad de procedimientos mejorados para proporcionar proteínas
conjugadas con polietilenglicol. En particular, sería deseable
proporcionar procedimientos para conjugar las proteínas con
plietilenglicol que dan como resultado proteínas modificadas que
tienen bioactividad aumentada o pérdida pequeña de bioactividad
mientras mantiene los beneficios de la conjugación con
polietilenglicol, incluyendo la inmunogenicidad sustancialmente
disminuida, solubilidad aumentada, y vidas medias de circulación
prolongadas características de las proteínas modificadas.
El documento WO 94/13322 describe un
procedimiento para la preparación de un conjugado entre un polímero
y una primera sustancia que tiene una actividad biológica mediada
por un dominio de la misma, este procedimiento comprende: (a) poner
en contacto la primera sustancia con una segunda sustancia que se
une específicamente a dicho dominio de la primera sustancia (b)
conjugar un polímero a la primera sustancia que tiene la segunda
sustancia unida al mismo; y (c) liberar la segunda sustancia de la
primera sustancia que tiene el polímero conjugado a la misma. Los
conjugados entre un polímero y anticuerpo contra el
TNF-\alpha.
La presente invención proporciona un
procedimiento de modificación de proteínas que da como resultado el
receptor p75 del TNF modificado o la proteína de fusión TNFR:Fc que
tiene poca o ninguna disminución en una actividad asociada al
receptor p75 del TNF o la proteína de fusión TNFR:Fc con la
proteína.
Más particularmente, la invención descrita en
esta memoria descriptiva incluye procedimientos para modificar un
receptor p75 del TNF o la proteína de fusión TNFR:Fc protegiendo
primero un sitio sobre la proteína y después poniendo en contacto la
proteína protegida con polietilenglicol en condiciones adecuadas
para unir el polietilenglicol a la proteína. Después de desproteger
la proteína, la proteína modificada con polietilenglicol resultante
tiene características mejoradas sobre el receptor p75 del TNF o la
proteína de fusión TNFR:Fc modificada según los procedimientos de la
técnica anterior. Una retención ventajosa de actividad se atribuye a
la disponibilidad de uno o más sitios de unión de la proteína que
está inalterado en los procedimientos de conjugación y por lo tanto
permanece estéricamente libre para interactuar con una partícipe de
unión posterior al procedimiento de conjugación.
La figura 1 es un mapa peptídico de la p75
TNRF:Fc obtenido mediante la separación por HPLC de fase inversa de
los fragmentos de digestión de con tripsina de la TNLF:Fc.
La figura 2 es un mapa peptídico de la p75
TNRF:Fc conjugada obtenido mediante la separación por HPLC de fase
inversa de los fragmentos de digestión con tripsina de TNLF:Fc no
protegida conjugada con polietilenglicol.
La figura 3 es un mapa peptídico de la p75
TNRF:Fc conjugada obtenido mediante la separación por HPLC de fase
inversa de los fragmentos de digestión con tripsina de TNLF:Fc
protegida conjugada con polietilenglicol.
La presente invención proporciona procedimientos
y reactivos para conjugar el receptor p75 del TNF o la proteína de
fusión TNFR:Fc con polietilenglicol de una manera que da como
resultado proteínas conjugadas con plietilenglicol que tienen poca o
ninguna reducción de una actividad deseada. Más específicamente, la
presente invención proporciona procedimientos para conjugar
polietilenglicol con el receptor p75 del TNF o la proteína de fusión
TNFR:Fc en condiciones que imposibilitan la conjugación de
polietilenglicol en sitios sobre la proteína. De manera ventajosa,
debido a que los sitios no se someten a conjugación con
polietilenglcol, el receptor p75 del TNF o la proteína de fusión
TNFR:Fc conjugada según la presente invención mantienen una
actividad deseada mientras muestran beneficios asociados a la
conjugación con polietilenglicol. Los procedimientos se basan en el
descubrimiento que la protección de uno o más sitios similares,
sitios de unión al sustrato u otros sitios de unión sobre un
receptor p75 del TNF o la proteína de fusión TNFR:Fc, conjugando la
proteína protegida con polietilenglicol y posteriormente
desprotegiendo la proteína, el receptor p75 del TNF o la proteína de
fusión TNFR:Fc modificada con polietilenglicol no muestran una
reducción de una actividad deseada.
De acuerdo con la presente invención la
protección de un sitio sobre el receptor p75 del TNF o la proteína
de fusión TNFR:Fc se puede llevar a cabo con una diversidad de
agentes y procedimientos de protección adecuados para formar
complejos del agente de protección y proteína. En el contexto de la
presente invención, los agentes de protección incluyen cualquier
molécula que tiene la capacidad de unirse o asociarse
reversiblemente con un sitio sobre una proteína que puede ser uno o
más aminoácidos. Cuando el sitio incluye más de un aminoácido, los
aminoácidos pueden ser contiguos, o la conformación de la proteína
puede colocar los aminoácidos en proximidad espacial cercana. Los
sitios incluyen, pero sin limitación a sitios similares o sitios de
unión al sustrato que están asociados a la actividad del receptor
p75 del TNF o la proteína de fusión TNFR:Fc. Por ejemplo, un agente
de protección en la forma de un anticuerpo inmunorreactivo frente a
una proteína seleccionada para la conjugación a polietilenglicol se
puede unir a un sitio activo seleccionado sobre la proteína usando
metodologías de unión conocidas en la técnica. Preferiblemente, un
agente de unión al anticuerpo seleccionado se induce contra un sitio
de la proteína seleccionada que confiere la actividad de interés o
el sitio que tiene la actividad dirigida para la preservación. De
manera inversa, un antígeno puede ser un agente de protección para
un anticuerpo seleccionado para modificación de acuerdo con la
presente invención actuando para proteger sitios seleccionados sobre
el anticuerpo y después conjugando el anticuerpo con el
polietilenglicol. Los procedimientos para producir anticuerpos y
procedimientos para proporcionar complejos
proteína-anticuerpo se conocen en la técnica y
dentro del conocimiento de los expertos en la técnica.
Los planteamientos alternativos para proteger el
sitio similar, sitio del sustrato, o sitio de unión incluyen la
utilización de un receptor o ligando como un agente de protección
sobre la proteína similar seleccionada para modificación. Tales
agentes de protección del receptor o del ligando necesitan no ser el
sustrato o el compuesto similar natural para esa proteína pero
necesitan solamente ser capaces de afinidad de unión suficiente para
el sitio o sitios activos seleccionados sobre la proteína de interés
para proteger el sitio o sitios activos de participar en una
reacción de conjugación con polietilenglicol. Además, las enzimas
que tienen sitios de unión para un sustrato seleccionado para la
modificación con polietilenglicol de acuerdo con la presente
invención son agentes de protección adecuados para el sustrato.
Cuando se elige el agente de protección para el
receptor p75 del TNF o la proteína de fusión TNFR:Fc es deseable
considerar ciertos criterios. Una consideración es el tamaño
molecular relativo del agente de protección y de la proteína
seleccionada para la conjugación. Los rendimientos de la etapa de
protección pueden estar limitados por la relación del tamaño del
agente de protección o el de la proteína seleccionada para la
conjugación. Típicamente, la reacción de protección dará como
resultado rendimientos más altos cuando la reacción es casi uno. En
general, la masa molecular del agente de protección y de la proteína
es una medida de su tamaño molecular. Así pues, por ejemplo, los
anticuerpos bivalentes tienen una masa de entre aproximadamente 125
y 150 kDa y en condiciones óptimas de reacción 10 mg de anticuerpo
protegerán aproximadamente 20 mg de la proteína seleccionada que
tiene un peso molecular de 150 kDa. Por otra parte, el anticuerpo
puede proteger tan poco como 2 mg de una proteína que tiene un peso
molecular de 15 kDa. Así pues, cuando el agente de protección y la
proteína seleccionada son similares en masa los rendimientos de la
etapa de protección pueden ser los más altos.
Otro factor que se puede considerar al
seleccionar un agente de protección para el receptor p75 del TNF o
la proteína de fusión TNFR:Fc es la estabilidad del agente de
protección y la estabilidad del agente de protección de la proteína
conjugada con polietilenglicol en soluciones del agente de
desprotección usado durante la etapa de desprotección de la
invención. Como se describe en detalle más adelante, la etapa de
desprotección de la proteína conjugada a partir del agente de
protección puede implicar la exposición del agente de protección y
la proteína desprotegida conjugada a extremos de pH, soluciones de
resistencia iónica elevada, o agentes caotrópicos. En los casos en
los que el agente de protección se va a reutilizar en reacciones de
protección adicionales, es preferible que el agente de protección se
seleccione de manera que la desprotección de la proteína conjugada
no requiera condiciones extremas de reacción que pueden conducir a
la pérdida irreversible de la actividad del agente de
desprotección.
Otra consideración en la selección de los agentes
de protección puede incluir cualquier toxicidad asociada al agente o
su uso. El receptor p75 del TNF o la proteína de fusión TNFR:Fc
conjugada de acuerdo con la presente invención y propuesta para
aplicaciones clínicas debe estar sustancialmente libre de cualquier
sustancia de naturaleza tóxica. Incluso aunque los procedimientos de
purificación de proteínas conocidos proporcionan material altamente
puro, es preferible evitar los agentes de protección que tengan
cualquier toxicidad conocida.
Otra consideración en la selección de un agente
de protección es la localización de sitios potenciales de
conjugación de polietilenglicol sobre el receptor p75 del TNF o la
proteína de fusión TNFR:Fc y su proximidad respectiva a los sitios
de unión seleccionados para la protección. Para el receptor p75 del
TNF o la proteína de fusión TNFR:Fc que tienen sitios potenciales de
conjugación en proximidad estrecha a un sitio seleccionado para
protección, puede ser deseable utilizar un agente de protección que
es suficientemente grande para proteger un área sobre la proteína
que está en proximidad estrecha al sitio al que se une. Cuando el
agente de protección es capaz de "proteger" un área espacial
suficientemente grande que se extiende fuera del sitio de unión
seleccionado, la conjugación con polietilenglicol se evita
probablemente o se reduce sustancialmente, por lo tanto conservando
una actividad deseada de la proteína conjugada con glicol. El área
protegida espacialmente preferida sobre la proteína dependerá de la
orientación espacial de los sitios de conjugación dentro de la
proteína y tamaño del polietilenglicol que se describe más
adelante.
La actividad deseada del receptor p75 del TNF o
de la proteína de fusión TNFR:Fc conjugada de acuerdo con la
presente invención puede estar influenciada por la selección de los
agentes de protección. Por ejemplo, las proteínas que se unen a
múltiples subunidades de los receptores se pueden conjugar con
polietilenglicol de manera que un primer sitio de unión de la
subunidad del receptor se protege antes de la reacción de
conjugación y un segundo sitio de unión de la subunidad del receptor
no está protegido. En esta realización, la conjugación con
polietilenglicol se previene o se inhibe en el sitio protegido, por
lo, tanto, preservando el sitio para la unión al ligando o receptor;
y la conjugación con polietilenglicol se permite en sitios no
protegidos, por lo tanto haciendo el sitio menos accesible para la
unión al ligando o al receptor. Esta realización tiene valor en
aplicaciones terapéuticas u otras clínicas, debido a que los sitios
de unión para una subunidad del receptor puede estar conservada
mientras que la unión a otra subunidad del receptor está impedida.
Este efecto puede conducir a la producción de antagonistas
específicos o del receptor p75 del TNF o de la proteína de fusión
TNFR:Fc conjugada con polietilenglicol con otras funciones únicas
modificadas.
De manera similar, la presente invención
proporciona metodologías para prevenir la asociación multimérica del
receptor p75 del TNF o de la proteína de fusión TNFR:Fc. Por
ejemplo, el polietilenglicol se puede conjugar selectivamente en los
sitios en o alrededor de la interfase de asociación multimérica,
mientras se conserva la unión de la proteína para su compuesto
similar natural a través de la conjugación con polietilenglicol
"protegida en el sitio" como se ha descrito en esta memoria
descriptiva, previniendo así la multimerización del receptor.
En las realizaciones preferidas de la presente
invención, la etapa de protección del receptor p75 del TNF o de la
proteína de fusión TNFR:Fc se lleva a cabo inmovilizando primero no
o más agentes de protección a un soporte sólido y después poniendo
la proteína en contacto con el agente de protección inmovilizado de
manera que dé cómo resultado unión de la proteína al agente de
protección inmovilizado. De forma ventajosa, los procedimientos de
la presente invención que incluyen la inmovilización del agente de
protección a un soporte sólido se puede repetir usando el mismo
soporte sólido para las reacciones de protección posteriores y así
tener el beneficio de volver a utilizar el agente de protección sin
la necesidad de separar el agente de protección de una mezcla de
reacción. Todavía otra ventaja asociada a esta realización es que el
polietilenglicol que no ha reaccionado y los subproductos de la
reacción de conjugación y cualquier producto secundario se eliminan
fácilmente de la proteína modificada con polietilenglicol lavando
bien la columna antes de la desprotección de la proteína modificada
protegida y recuperando la proteína conjugada de la columna.
Preferiblemente, las propiedades químicas y físicas del soporte
sólido son tales que existe una gran superficie para la reacción del
agente de protección y receptor p75 del TNF o la proteína de fusión
TNFR:Fc y que es estable en un intervalo de condiciones de reacción,
incluyendo una diversidad de pH, temperara, y disolventes acuosos y
no acuosos. Adicionalmente, el soporte sólido se debe seleccionar de
manera que inmovilice el agente de protección de una manera que
proporcione cantidades suficientes de agente de protección que
tienen un sitio que está disponible para proteger la proteína.
Un factor que afecta a la elección del soporte
sólido o material de la columna es la orientación espacial final del
agente de protección inmovilizado. Preferiblemente, el agente de
protección inmovilizado está orientado espacialmente sobre el
soporte sólido de manera que es capaz de proteger el receptor p75
del TNF o de la proteína de fusión TNFR:Fc de una manera optimizada.
Para llevar esto a cabo, puede ser útil el uso compuestos activos
adicionales que orientan el agente de protección en una
configuración deseada. Por ejemplo, una columna de soporte sólido
que contiene la proteína A o la proteína G inmovilizada preparará la
columna para inmovilizar anticuerpos mediante la unión a través del
dominio Fc del anticuerpo. Los anticuerpos inmovilizados de esta
manera tienen una orientación espacial que proporciona su unión
máxima con la proteína seleccionada para la conjugación. Otro
planteamiento que utiliza compuestos adicionales implica el uso de
espaciadores o engarces entre el material de la columna y el agente
de protección para orientar el agente de protección y proporcionar
el área de contacto máximo entre el agente bloqueante y la proteína
seleccionada para la conjugación. Los engarces o espaciadores para
las proteínas y las biomoléculas en general están ampliamente
disponibles a partir de fuentes comerciales que incluyen Pierce
Chemical y Sigma Chemical. Las condiciones óptimas de reacción y
aplicaciones preferidas para los espaciadores o engarces se conocen
bien en la técnica. Por ejemplo, Wong, Chemistry of Protein
Conjugation and Cross-linking, CRC Press, 1993
describe el uso de reactivos para unir proteínas y otras moléculas a
una diversidad de grupos funcionales a través de reactivos
heterobifuncionales y reactivos homobifuncionales.
Los soportes sólidos que tienen una buena
estabilidad estructural y química en una diversidad de condiciones
de reacción están comercialmente disponibles. Estos soportes están
típicamente en forma de perlas o partículas, están fabricadas de un
polímero reticulado y están disponibles con una diversidad de
mecanismos inmovilizantes. Por ejemplo, los soportes sólidos que
tienen la capacidad de interactuar catiónicamente o aniónicamente
con los compuestos que tienen grupos funcionales iónicos cargados
opuestamente se pueden usar para unir grupos de protección mediante
un resto iónico. Los soportes sólidos de intercambio iónico están
ampliamente disponibles e incluyen funcionalidades tales como grupos
amino cargados, carbonatos, grupos ácidos y básicos de resistencia
iónica y pH variables. De manera similar, los soportes sólidos
adecuados incluyen los que tienen una funcionalidad de unión
específica capaz de unirse a una porción de una proteína de interés.
Por ejemplo, los soportes sólidos que incorporan un ligando para la
porción Fc de la IgG y se usan para inmovilizar anticuerpos o las
proteínas de fusión TNFR:Fc. Las columnas comercialmente disponibles
adecuadas incluyen las que tienen soportes sólidos con la proteína A
y la proteína G unidas, ambas unirán porciones seleccionadas de la
IgG. Todavía otros soportes sólidos adecuados son los que tienen
sitios reactivos activos para unir covalentemente el agente de
protección deseado. Los soportes sólidos que tienen esta
característica incluyen los que incorporan funcionalidades que
reaccionan con nucleófilos tales como grupos amino, grupos hidroxilo
y grupos sulfidrilo. El ejemplo 1 más abajo describe el uso de uno
de tales soportes sólidos comercialmente disponible, EMPHAZE™, que
tiene una funcionalidad de azlactona reactiva con nucleófilos.
Todavía otros soportes sólidos adecuados son los que están
fabricados de materiales poliméricos y que tienen sitios
incorporados, estrechamente asociados, covalentemente, que se unen a
secuencias de aminoácidos específicas. Los principios generales de
cromatografía de afinidad y soportes sólidos para practicar la
cromatografía de afinidad en la que uno o más partícipes de unión
específica se realiza sobre un lecho cromatográfico de manera que
los ligandos de unión se pueden inmovilizar para los propósitos de
purificación del ligando se describen en Affinity
Chromatography, Principles and Methos, Pharmacia Publication
18-1022-29.
En las realizaciones preferidas en las que los
agentes de inmovilización están inmovilizados sobre soportes
sólidos, la etapa de protección de los sitios sobre el receptor p75
del TNF o la proteína de fusión TNFR:Fc se pueden llevar a cabo
poniendo en contacto una solución la proteína para la conjugación
con polietilenglicol con el soporte sólido que tiene el agente de
protección inmovilizado para proporcionar una proteína protegida en
la forma de un agente de protección y un complejo proteico. Los
expertos en la técnica apreciarán que las condiciones óptimas de
reacción dependen del receptor p75 del TNF o de la proteína de
fusión TNFR:Fc y del agente de protección. De acuerdo con lo
anterior, el pH de reacción, temperatura de reacción, tiempo de
reacción, y medio de reacción se pueden variar de acuerdo con los
principios conocidos para preparar los agentes de protección
seleccionados y complejo proteico. El soporte sólido que tiene un
agente de protección inmovilizado puede estar contenido dentro de
una columna, en cuyo caso el contacto de la proteína puede implicar
el paso de la solución que contiene la proteína a través de la
columna a una velocidad y en condiciones de temperatura y pH que
promueven la reacción de protección.
Dentro del alcance de la presente invención se
incluyen procedimientos en los que la etapa de protección se lleva a
cabo en solución y el agente de protección no está inmovilizado.
Tales procedimientos basados en soluciones implican proporcionar una
solución de agente de protección y un receptor p75 del TNF o la
proteína de fusión TNFR:Fc en cantidades relativas adecuadas y en
condiciones de reacción suficientes para hacer que el agente de
protección y la proteína formen un complejo. Como se ha mencionado
anteriormente, el pH de reacción, la temperatura de reacción, tiempo
de reacción y medio de reacción se pueden variar de acuerdo con
principios conocidos para unir el agente de protección y la
proteína. Preferiblemente después de la reacción de protección, el
complejo del agente de protección y del receptor p75 del TNF o la
proteína de fusión TNFR:Fc se separa de la mezcla de reacción
mediante técnicas de separación convencionales. Las técnicas de
separación adecuadas incluyen procedimientos cromatrográficos tales
como cromatografía en fase inversa, cromatografía en fase normal,
cromatografía de intercambio iónico; procedimientos electroforéticos
preparativos; y técnicas de precipitación selectiva. Como
alternativa, el complejo del agente de protección y la proteína no
se recupera de la solución del agente de protección antes de formar
la proteína conjugada con polietilenglicol. En esta realización, las
reacciones para formar la proteína conjugada con polietilenglicol se
llevan a cabo en las soluciones usadas para proteger la proteína.
Siguiendo las reacciones de conjugación como se describe más
adelante, el receptor p75 del TNF o la proteína de fusión TNFR:Fc
conjugada con polietilenglicoles se puede desproteger como se
describe más delante de manera que el sitio o los sitios activos
estén libres y después se recuperen de la solución. Como
alternativa, el receptor p75 del TNF o la proteína de fusión TNFR:Fc
conjugada con polietilenglicol complejados con el agente de
protección se pueden recuperar después de la desprotección de la
proteína conjugada con polietilenglicol en la solución de reacción
de conjugación y recuperar la proteína conjugada usando cualquier
esquema de purificación de proteínas que incluyen pero sin
limitación los descritos anteriormente.
Los reactivos y procedimientos para formar
conjugados de polietilenglicol con proteínas se conocen en la
técnica per se y son en general aplicables a la práctica de
la presente invención. Típicamente, estos procedimientos implican
primero proporcionar un polietilenglicol activado en el que uno o
más de los grupos hidroxilo sobre un polietilenglicol están
activados, y haciendo reaccionar el polietilenglicol con sitios
activos sobre una proteína seleccionada para la conjugación con
polietilenglicol. Los procedimientos más ampliamente utilizados para
conjugar una proteína con polietilenglicol se basan en una reacción
nucleofílica entre los sitios amino de la proteína (el nitrógeno del
amino \varepsilon de lisina o la amina del terminal amino) y un
hidroxilo activado de polietilenglicol. Ya que los sulfidrilos son
también nucleófilos, los sulfidrilos de la cisteína que no son parte
de un puente disulfuro son también sitios potenciales de reacción
sobre la proteína. Los principios generales de la conjugación de
polietilenglicol con las proteínas, y los reactivos de activación
comunes se describen en el documento de Delgado y col., The Uses and
Properties of PEG-Linked Preoteins, de Critical
Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 9 (3, 4):
249-304 (1992). Las formas activadas de
polietilenglicol y monometoxipolietilenglicol están comercialmente
disponibles y se pueden usar en los procedimientos de la presente
invención. Lo más notablemente, Shearwater Polymers, Inc of
Huntsville, AL proporciona un número de polímeros de
polietilenglicol y derivados de polietilenglicol. The Shearwater
Polymers, Inc Catalog (Shearwater Polymers, Inc. Catalog
Funcionalized Biocompatible Polymers for Research, 1994) incluye una
amplia diversidad de polietilenglicoles activados adecuados para
acoplamiento con proteínas en un intervalo amplio de condiciones de
reacción. Este catálogo proporciona adicionalmente condiciones
preferidas de reacción para sus reactivos de polietilenglicol
derivatizados. Los expertos en la técnica que se han dado cuenta de
los numerosos reactivos adecuados para conjugar proteínas con
polietilenglicol apreciaran la diversidad de elecciones de reactivos
en vista de la naturaleza de la proteína seleccionada, la naturaleza
de los grupos amino o grupos sulfidrilo reactivos sobre la proteína
y el uso de la proteína conjugada. Por ejemplo, para proporcionar
proteínas conjugadas que tienen solubilidad, características de
actividad y propiedades de distribución mejoradas pero no
necesariamente tiempo de eliminación clínica aumentado, un
polietilenglicol activado con succinato de succinimidilo
(SS-PEG) se puede usar en la reacción de
conjugación. El enlace éster a la proteína es menos estable y se
hidrolizará in vivo, liberando el polietilenglicol de la
proteína. Los polietilenglicoles activados están disponibles, los
cuales reaccionarán más preferiblemente con grupos amino opuestos a
los grupos sulfidrilo y viceversa. Los polietilenglicoles activados
comúnmente seleccionados incluyen polietilenglicoles activados con
carbonato de succinimidilo y polietilenglicoles activados con ácido
succinimidilpropiónico.
Como alternativa para seleccionar
polietilenglicoles activados comercialmente disponibles, un
polietilenglicol de interés se puede activar usando reactivos que
reaccionan con funcionalidades hidroxilo para formar un sitio
reactivo con un sitio sobre una proteína de interés. Típicamente, el
sitio reactivo de la proteína es un grupo amino pero puede ser un
sulfidrilo o hidroxilo y el polietilenglicol activado típicamente es
un éster activo o imidizol (véanse las páginas
274-285 citadas anteriormente) Preferiblemente,
solamente la funcionalidad hidroxilo del polietilenglicol se activa
y puede llevarse a cabo utilizando un monometoxipoolietilenglicol en
una reacción de activación. Sin embargo, los procedimientos en los
que están activados dos hidroxilos están dentro del alcance de la
presente invención. Dependiendo de la naturaleza del grupo de
activación y del ataque nucleofílico, el resto de activación puede o
no puede llegar a incorporarse en la proteína después de la reacción
nucleofílica.
El polietilenglicol puede ser de cualquier peso
molecular pero se prefiere en el intervalo entre aproximadamente 500
y aproximadamente 100.0000 y más preferiblemente en el intervalo
entre 2.000 y 20.0000. Los criterios para seleccionar un peso
molecular del polietilenglicol específico incluyen, pero sin
limitación, el peso molecular de la proteína seleccionada para la
modificación, la carga sobre la proteína, el tipo de proteína y el
número y localización de los sitios potenciales para la conjugación.
La vida media inmunológica y en plasma característica de las
proteínas conjugadas con polietilenglicoles de diferente peso
molecular se describen en el documento de Delgado y col.,
Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 9: 249,
1992. Como se sabe en la técnica, en general, cuanto mayor es la
cantidad de polietilenglicol conjugada a la proteína menor es la
vida media en plasma y mayor la solubilidad de la proteína. Ya que
el corte del peso molecular para filtración glomerular es
aproximadamente 70 kDa, las proteínas que tienen pesos moleculares
menores que aproximadamente 70 kDa experimentarán una vida media
prolongada en plasma. Para las proteínas mayores que 70 kDa, los
efectos del polietilenglicol y su peso molecular variará con su
mecanismo de eliminación.
En general, el uso de un polietilenglicol que
tiene un alto peso molecular en los procedimientos de la presente
invención da como resultado proteínas conjugadas que tienen más
polietilenglicol por molécula de proteína que el uso de
polietilenglicol que tiene un peso molecular más bajo. Así pues,
cuando se desea una cantidad alta de polietilenglicol por molécula
de receptor p75 del TNF o de proteína de fusión TNFR:Fc, el peso
molecular del polietilenglicol es preferiblemente hasta de 20.000.
Sin embargo, polietilenglicoles de peso molecular más pequeño,
debido a su mayor movilidad en solución, pueden conjugarse a más
sitios sobre la proteína que una proteína molecular mayor. Así pues,
cuando una proteína tiene un número de sitios de conjugación deseado
puede ser preferible usar un polietilenglicol que tiene un peso
molecular más bajo para asegurar que se conjuga a un número óptimo
de sitios. Esto puede ser un planteamiento deseable cuando los
sitios de conjugación o sitio de reacción potenciales sobre la
proteína están en proximidad estrecha entre sí. Otra consideración
usada en la selección de un peso molecular del polietilenglicol es
que incluso aunque las proteínas tratadas de acuerdo con la presente
invención tengan sitios protegidos, los polietilenglicoles de alto
peso molecular pueden ser tan grandes que, una vez conjugados, sus
tamaños moleculares les hace ampliar su influencia espacial o
estérica de manera que los sitios de unión o de recepción tengan
accesibilidad reducida. Está dentro del conocimiento de los expertos
en la técnica determinar un peso molecular óptimo de
polietilenglicol para el receptor p75 del TNF o la proteína de
fusión TNFR:Fc y los beneficios deseados de la conjugación con
polietilenglicol.
Después de la conjugación el receptor p75 del TNF
o la proteína de fusión TNFR:Fc con polietilenglicol, la presente
invención además incluye la desprotección de la proteína con un
agente de desprotección. Como se usa en esta memoria descriptiva un
agente de desprotección es cualquier molécula, solución o gas que
tenga un pH predeterminado, una solución que tenga una resistencia
iónica predeterminada que libera o escinde la proteína unida
reversiblemente a partir del complejo de proteína y agente de
protección. En realizaciones preferidas en las que el agente de
protección está inmovilizado a un soporte sólido, la desprotección
de la proteína conjugada se puede llevar a cabo poniendo en contacto
el soporte sólido que tiene el agente de protección inmovilizado y
la proteína conjugada con un agente de protección adecuado. De forma
ventajosa, esta técnica puede dar como resultado que el agente de
protección permanezca inmovilizado al soporte sólido y disponible
para volver a usar en las reacciones posteriores de conjugación con
polietilenglicol que usan el mismo soporte sólido y el agente de
protección inmovilizado. El agente de desprotección seleccionado y
su uso puede variar con la naturaleza del complejo del agente de
protección y la proteína conjugada. Más particularmente, cuando se
selecciona un agente de desprotección y el procedimiento en el que
se usa, puede ser una consideración la resistencia del complejo y la
constante de disociación (Kd) para el complejo del agente de
protección y el receptor p75 del TNF o de proteína de fusión TNFR:Fc
conjugada. Por ejemplo, en muchos procedimientos de la presente
invención, un agente de desprotección adecuado puede ser una
solución tampón que tenga un pH que haga que el agente de protección
libere la proteína conjugada del agente de protección. Cuando el
complejo del agente de protección y la proteína conjugada está
fuertemente asociado y se requieren condiciones de pH rigurosas
para disociar el complejo, es típicamente aconsejable eluir la
proteína conjugada desprotegida en un sistema tampón que tenga un pH
ajustado que libere el pH final de la solución de la proteína
conjugada desprotegida cerca del neutro.
Como alternativa, los agentes de desprotección
pueden ser soluciones que tengan una resistencia iónica suficiente
para disgregar el complejo del agente de protección y el receptor
p75 del TNF o la proteína de fusión TNFR:Fc conjugada y liberar la
proteína conjugada del agente de protección. Las proteínas
conjugadas se pueden liberar de los complejos de las proteínas y del
agente de protección usando un agente de protección competitivo de
unión más fuertemente. Los agentes de desprotección adicionales
incluyen desnaturalizantes tales como urea, agentes quelantes tales
como EGTA y EDTA u otros reactivos que incluyen isotiocianato de
potasio y sales caotrópicas. Las características de muchos complejos
de liando:partícipe de unión y los reactivos adecuados para
desproteger el complejo se describen en Pharmacia Affinity
Chomatography Principles and Methods,
18-1022-29 pág.
117-119 (1993). En cualquier caso, el agente de
desprotección se selecciona de manera que provoca que el receptor
p75 del TNF o la proteína de fusión TNFR:Fc tengan una mayor
afinidad para la solución que contiene el agente de desprotección
que la proteína tiene para el agente de protección. Cuando la
proteína seleccionada para la modificación es TNFR y el agente de
protección es un anticuerpo de neutralización de TNFR, un agente de
desprotección adecuado es una solución tampón de pH bajo debido a
que el TNFR se disocia de su anticuerpo de neutralización a pH
bajos.
En las realizaciones en las que el soporte sólido
está configurado en una columna, la desprotección del receptor p75
del TNF o de la proteína de fusión TNFR:Fc conjugada se lleva a cabo
convenientemente pasando una solución del agente de desprotección a
través de la columna en condiciones que permiten que el agente de
desprotección desproteja la proteína. El receptor p75 del TNF o la
proteína de fusión TNFR:Fc conjugada con plietilenglicol se puede
recoger y recuperar directamente a partir de la solución del agente
de desprotección. Cuando el soporte sólido está contenido dentro de
un recipiente, el soporte sólido que tiene el agente de protección
inmovilizado se puede separar de la solución que contiene la
proteína conjugada con polietilenglicol desprotegida mediante
filtración, centrifugación, u otras técnicas de separación conocidas
en la técnica.
Cuando el complejo del agente de protección y el
receptor p75 del TNF o la proteína de fusión TNFR:Fc conjugada con
polietilenglicol está en solución, o no inmovilizados a un soporte
sólido, la proteína conjugada se puede desproteger mediante la
adición del agente de desprotección a la solución de la proteína
conjugada. Los criterios para seleccionar los agentes de
desprotección son los mismos que los descritos anteriormente y
pueden ser soluciones tamponadas que tienen un pH seleccionado,
soluciones que tienen una resistencia iónica seleccionada, u otras
soluciones o posiblemente gases que tienen propiedades adecuadas
para desproteger proteínas a partir del un partícipe de unión. Las
condiciones para la etapa de desprotección deben ser tales que se
mantengan el tiempo y la temperatura suficientes para permitir que
el agente de desprotección provoque que el receptor p75 del TNF o la
proteína de fusión TNFR:Fc conjugada se disocie del agente de
protección. La proteína conjugada con polietilenglicol desprotegida
se puede recuperar de la solución del agente de protección usando
técnicas de recuperación y purificación habituales que incluyen
cromatografía líquida preparativa, cromatografía de intercambio
iónico y técnicas electroforéticas preparativas.
Aunque los procedimientos de conjugación con
polietilenglicol son aquellos en los que el resultado es el receptor
p75 del TNF o la proteína de fusión TNFR:F conjugada con
polietilenglicol mediante un enlace covalente, está dentro del
alcance de la presente invención incluir los procedimientos en los
que la conjugación es mediante una asociación diferente. En el
contexto de la presente invención el receptor p75 del TNF o la
proteína de fusión TNFR:F se puede modificar conjugándolos al
polietilenglicol usando una diversidad de mecanismos diferentes de
unión o conjugación. Por ejemplo, el receptor p75 del TNF o la
proteína de fusión TNFR:F se puede derivatizar en un grupo amino u
otra funcionalidad reactiva adecuada con un polinucleótido A y
después conjugarse con un polietilenglicol derivatizado con un
polinucleótido T. Otro planteamiento implica la derivatización de la
proteína con una funcionalidad que tiene un partícipe conocido de
unión específica y después conjugar la proteína con polietilenglicol
que se ha derivatizado con el partícipe de unión para la
funcionalidad. Por ejemplo, el receptor p75 del TNF o la proteína de
fusión TNFR:F se puede derivatizar con biotina y el polietilenglicol
derivatizarse con estreptavidina o avidina (o viceversa). Esto da
como resultado la unión específica de polietilenglicol a aquellos
sitios de proteínas que tiene la biotina. Un número de reactivos
para modificar proteínas con el propósito de introducir ciertas
funcionalidades están comercialmente disponibles. Por ejemplo, el
catálogo de Pierce Immuno Technology identifica y proporciona el
acceso a una diversidad de reactivos asociados a la modificación de
la proteína. Entre éstos están los reactivos de Traut y SATA (Pierce
ImmunoTechnology Catalogue, vol I, pág. E-14) que
pueden introducir grupos activos en las aminas
N-terminales y las funcionalidades amino de lisina.
Estos grupos activos proporcionan sitios para introducir
funcionalidades adicionales para reaccionar más específicamente con
polietilenglicol. Los expertos en la técnica también reconocerán que
las interacciones iónicas entre el polietilenglicol y el receptor
p75 del TNF o la proteína de fusión TNFR:F son también posibles. Por
ejemplo, una asociación entre un resto iónico sobre la proteína y su
contraión sobre el polietilenglicol se puede utilizar si la
asociación es suficientemente fuerte para permanecer asociado en
condiciones fisiológicas.
Las realizaciones adicionales de la presente
invención que pueden utilizar el receptor p75 del TNF o la proteína
de fusión TNFR:F modificados anteriores incluyen los procedimientos
en los que la proteína seleccionada para conjugación tiene
demasiados pocos sitios potenciales de conjugación con
polietilenglicol o ningún sitio de conjugación potencial con
polietilenglicol fuera de la región de aminoácido protegida.
Mediante la modificación de la proteína seleccionada para introducir
sitios amino y sulfidrilo sobre la proteína se puede conjugar
suficiente polietilenglicol a la proteína seleccionada para
proporcionar los beneficios deseados. La modificación de la proteína
seleccionada se puede llevar a cabo usando metodologías de
ingeniería genética o modificación química. Como se ha mencionado
anteriormente, los procedimientos y reactivos para modificar
proteínas que logran una gran diversidad de resultados deseados se
conocen bien en la técnica. En particular, en el documento de Wong,
Chemistry of Protein Conjugation and
Cross-linking, CRC Press, 1993 proporciona
información con relación a los reactivos de conjugación y
condiciones de elaboración.
Aunque el polietilenglicol es un reactivo
preferido de conjugación de proteínas, se han usado una diversidad
de modificadores de polímeros adicionales para modificar proteínas.
Éstos incluyen polietilenglicoles modificados, polietilenglicoles
ramificados, polietilenglicoles reticulados, dextranos,
plivinilpirrolidona, alcohol polivinílico, poliaminoácidos, albúmina
y gelatinas. Los expertos en la técnica apreciarán, una vez que
tengan una comprensión de la presente invención, que los principios
y procedimientos descritos en esta memoria descriptiva se pueden
aplicar a procedimientos para modificar proteínas con cualquiera de
estos reactivos adicionales.
El receptor p75 del TNF o la proteína de fusión
TNFR:F modificada según los procedimientos descritos en esta memoria
descriptiva tienen beneficios asociados a la conjugación con
polietilenglicol sin la pérdida significativa esperada en actividad.
Aplicando meramente los procedimientos de ensayo conocidos para
establecer la actividad después de la conjugación, se pueden mostrar
los beneficios para las proteínas conjugadas de acuerdo con la
presente invención. Además para evaluar la actividad de las
proteínas conjugadas con polietilenglicol, se pueden analizar para
evaluar el grado de sustitución de polietilenglicol, peso molecular,
y sitios de conjugación. Las técnicas para realizar estos
procedimientos analíticos se conocen bien y algunas se describen con
relación a las proteínas conjugadas con polietilenglicol en
Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 9 (3:
4): 285-291, 1992. El ejemplo 3 más adelante
describe procedimientos para determinar el peso molecular o
volúmenes hidrodinámicos, grado de sustitución de polietilenglicol,
y bioactividad del la proteína de fusión p75 TNFR:Fc conjugada de
acuerdo a la presente invención. La caracterización de las proteínas
conjugadas para evaluar su peso molecular y el grado de sustitución
no es necesaria para la práctica de la presente invención pero
proporciona conocimiento de las especificaciones del producto de
conjugación.
Los siguientes ejemplos se presentan con el fin
de proporcionar una descripción más detallada de las realizaciones
específicas de la presente invención y no se construyen como
limitación del alcance de la invención.
A continuación se describe un procedimiento para
la conjugación con polietilenglicol de un receptor de TNF dimérico
de acuerdo con la presente invención. La proteína seleccionada era
una construcción de fusión dimerizada covalentemente de dos
porciones de unión al ligando, extracelulares del receptor p75 del
TNF condensadas juntas mediante un resto de IgGFc (TNFR:Fc) (Mohler
y col., J. Immunol. 151: 1548-1561, 1993)
TNFR:Fc es una proteína de 120 kDa que se une a TNF\alpha y
LT\alpha con alta afinidad. La TNFR:Fc recombinante se obtuvo
mediante la expresión de la proteína en células CHO usando el
marcador amplificable seleccionable de la dihidrofolatorreductasa.
Las células en suspensión se centrifugaron y se resuspendieron en
medio exento de suero en un biorreactor controlado. El producto se
recogió después de 7 días y la molécula de TNFR:Fc se purificó
usando la cromatografía de afinidad de la proteína A seguido de una
etapa de cromatografía de intercambio iónico.
Un anticuerpo monoclonal neutralizante de TNFR:Fc
antihumano (hu TNFR M1) se generó como se ha descrito en el
documento de Ware y col., Immunol. 147: 4229. Diecinueve
miligramos (19 mg) del hu TNFR M1 se dializaron en 1 litro de tampón
de acoplamiento de citrato sódico 0,5 M bicarbonato sódico 0,1 M y
se ajustó hasta pH 8,6 con NaOH 1 M. Después de diálisis durante una
noche el tampón de diálisis se reemplazó con un segundo volumen de 1
L y se continuó la diálisis durante un día. Se preparó una columna
de afinidad cargando 0,37 g de medio de biosoporte 3M EMPHAZE™
(comprado a 3M de Mineápolis, MN) en una columna Amicon de 3 ml. El
medio de soporte 3M EMPHAZE se fabrica con perlas copoliméricas
altamente reticuladas de bis-archilamida/azlactona
hidrófilas que tienen funcionalidad azlactona que une
covalenmtemente biomoléculas a través de sus funcionalidades
nucleófilicas.
El TNFR M1 humano se inmovilizó al soporte sólido
de EMPHAZE™ añadiendo 5 ml de solución de hu TNFR M1 dializado que
tiene un contenido total de hu TNFR M1 de 17 mg a las perlas
siguiendo las instrucciones del fabricante para hacer reaccionar las
proteínas con las funcionalidades azlactona. Después de la reacción,
las perlas y la solución se centrifugaron hasta que se formó un
sedimento de perlas en el tubo de centrífuga. El sobrenadante se
separó por decantación y las perlas se inactivaron con 10 volúmenes
de etanolamina 3,0 M a pH 9 para bloquear los sitios de azlactona
sin reaccionar sobre las perlas. Después de inactivar durante 2,5
horas según las instrucciones del fabricante, las perlas se
centrifugaron hasta que decantó un sedimento y el sobrenadante de
etanolamina a partir del sedimento. Después 25 ml de PBS sin
proteína se añadieron a las perlas y la mezcla se agitó en un
aparato vortex durante 10 minutos. Después de mezclar en el aparato
vortex, se retiró el PBS y se añadieron 25 ml adicionales de PBS a
la mezcla.
Después de inmovilizar el anticuerpo sobre el
soporte sólido, las perlas que tienen anticuerpo inmovilizado se
transfirieron a una columna Amicon. Los sitios activos sobre la
TNFR:Fc se protegieron con el agente de protección del anticuerpo M1
pasando una solución que contenía 0,5 mg de TNFR:Fc sobre las perlas
a un caudal de 0,1 ml/min. Después de completarse la reacción de
protección, la TNFR:Fc se conjugó con un polietilenglicol de 5.000
de peso molecular pasando continuamente una solución de 10 mg de
SC-PEG-5000
(monometoxipolietilenglicol activado con carbonato de succinimidilo
de peso molecular 5.000 comprado a Shearwater Polymers, Birmingham,
AL) en 5 ml de Na_{2}HPO_{4} 50 mM pH 8,5 a través de la columna
EMPHAZE™ a 1 ml/min durante una noche a 25ºC.
Después de la reacción de conjugación la TNFR:Fc
conjugada con polietilenglicol se desprotegió pasando una solución
50 mM de citrato sódico ajustado hasta pH 3,0 a través de la columna
a un caudal de 1 ml/min durante 60 minutos. Después la solución de
TNFR:Fc conjugada con polietilenglicol recuperada se neutralizó
hasta pH 7,4 con NaOH 0,1 N.
A continuación se describe un procedimiento para
preparar una TNFR:Fc control conjugada con polietilenglicol en un
procedimiento que no incluye una etapa para proteger la TNFR:Fc.
Cien microgramos (100 \mug) de TNFR:Fc (rhu) humana utilizada en
el ejemplo 1 en 400 \mul de Na_{2}HPO_{4} 50 mM a pH 8,5, se
dejó que reaccionara con SC-PEG 5000 a diferentes
relaciones molares de polietlenglicol a proteína (calculada como
número de residuos de lisina en TNFR:Fc) durante una noche a 4ºC.
Las relaciones molares de proteína a residuos de lisina fueron
1,25:1, 0,625:2, 0,313:1, 0,156:1, y 0,078:1. La TNFR:Fc conjugada
con plietilenglicol se purificó mediante cromatografía de exclusión
por tamaño usando una columna Bio-Sil 400 disponible
de BioRad, Hercules, CA, según las direcciones del fabricante para
purificación de proteínas.
A continuación se describe la caracterización de
TNFR:Fc protegida conjugada preparada en el ejemplo 1 y la TNFR:Fc
control preparada en el ejemplo 2. La caracterización incluyó el
análisis de las proteínas conjugadas para evaluar las cadenas de
polietilenglicol por molécula de TNFR:Fc (grado de conjugación),
peso molecular de proteína, y bioactividad de la proteína conjugada.
Adicionalmente, las muestras control de TNFR:Fc no conjugada se
analizaron usando los mimos procedimientos analíticos.
La concentración de las proteínas en las
soluciones obtenidas en el ejemplo 1 y el ejemplo 2 se determinó
usando un analizador de aminoácidos Beckman según las instrucciones
del fabricante. Después el número de unidades de polietilenglicol
por molécula de TNFR:Fc en solución se determinó usando el
procedimiento de fluorescamina generalmente descrito por Sartore y
col., Applied Biochemistry and Biotechnology, 31: 213, 1991.
El procedimiento de Fluorescamina mencionado implica el uso del
reactivo de fluoerscamina, un reactivo no fluorescente que reacciona
con aminas primarias para producir un producto detectable
cuantitativamente altamente fluorescente. En particular, el volumen
de cada una de las soluciones de proteína se ajustó de manera que la
concentración de la proteína fuera aproximadamente 200 \mug/ml.
Después, cada solución de proteína se añadió a una serie de 5 tubos
de manera que los tubos tenían los siguientes volúmenes: 0,5 ml, 0,4
ml, 0,3 ml, 0,2 ml y 0,1 ml. Cada tubo se diluyó hasta un volumen
total de 2,0 ml con tampón fosfato sódico 0,1 M a pH 8,0.
Secuencialmente, 1,0 ml de una solución de 0,3
mg/ml de fluorescamina (comprado a Sigma Chemical Company, Sal Luis,
MO) en acetona se añadió a cada una de los tubos de muestra y a un
tubo de control que contenía 2 ml de solución tampón. Después de
mezcla vigorosa durante 5 minutos cada muestra se analizó en un
espectrómetro de fluorescencia a una longitud de onda de excitación
de 390 nm y una longitud de onda de emisión de 475 nm. Para
determinar la cantidad relativa de modificación de lisina un se
preparó un diagrama de unidades de fluorescencia frente a
concentración de proteína. El porcentaje de conjugación de
conjugación de polietilenglicol se determinó como 1-(pendiente de la
proteína modificada/pendiente de la proteína no modificada) x
100.
El tamaño molecular relativo de las muestras de
TNFR:Fc conjugada no protegida, la muestra de TNFR:Fc conjugada
protegida, y la muestra de TNFR:Fc control se determinaron usando
procedimientos de exclusión habituales y una columna
Bio-Sil SEC 400. El tamaño molecular se determinó
usando patrones de proteínas de alto peso molecular y más
exactamente refleja un volumen hidrodinámico o tamaño relativo de
las proteínas conjugadas como opuesta a un peso molecular exacto.
Esto es debido a que los patrones son proteínas que tienen pesos
moleculares conocidos y no proteínas modificadas con
polietilenglicol. Las cadenas de polietilenglicol se amplían en
solución y tienen radios mayores que las proteínas. Así pues, la
conjugación de polietilenglicol a proteínas incrementa su peso
molecular aparente debido a que las proteínas conjugadas tienen
mayores volúmenes hidrodinámicos por incremento de peso molecular
real atribuido al polietilenglicol. El efecto es un tamaño molecular
relativo mayor cuando se compara con patrones de proteínas.
Las bioactividades de la TNFR:Fc conjugada con
polietilenglicol en el ejemplo 1 y el ejemplo 2 y una TNFR:Fc no
conjugada se determinaron usando un bioensayo descrito generalmente
en los documentos de Onozaki y col., J. Immunology 135:3962
(1985) y de Nakai y col., Biochem. Biophys. Res. Comm. 154:
1189 (1988). El bioensayo se basa en la respuesta inhibitoria de la
línea celular adherente del melanoma maligno humano A375 a
TNF\alpha. La TNF:Fc soluble puede neutralizar específicamente la
actividad inhibitoria del TNF\alpha de una manera dependiente de
la dosis. Para realizar el bioensayo, la línea celular 375 (ATCC CRL
1872) se recogió usando una solución en EDTA de tripsina para
retirar la monocapa de células de los matraces. Las células
recogidas se lavaron con un medio de ensayo de medio de Eagles
modificado de Dulbeccos con suero fetal bovino añadido, aminoácidos
no esenciales, y piruvato sódico (todos comprados a GIBCO).
Se prepararon placas de noventa y seis pocillos
con diluciones en serie de soluciones de trabajo de TNFR:Fc no
modificada como se describe en el ejemplo 1, la TNFR:Fc bloqueada
conjugada con polietilenglicol como se describe en el ejemplo 1, y
TNFR:Fc no protegida conjugada con polietilenglicol preparada como
se describe en el ejemplo 2. Después, cantidades iguales de
TNF\alpha (R y D Systems, nº de catálogo 210-CA
TH) en el medio de ensayo descrito anteriormente se añadieron a los
pocillos en placas de 96 pocillos seguido de la adición de un
volumen igual de aproximadamente 4 x 10^{5} células recogidas en
suspensión a cada pocillo.
Las placas se colocaron en una cámara húmeda a
37ºC y CO_{2} al 10% y las células se dejaron en incubación
durante 72 horas. Después las placas se retiraron de la cámara y las
células se lavaron con solución de PBS, se transfirieron, y se
fijaron con alcohol etílico. Las células viables se hicieron visible
tiñendo las células fijadas con solución de violeta cristal acuosa
al 0,1%. Después de lavar las placas con agua y transferir las
células, se añadió solución de desoxicolato de sodio al 2% a cada
pocillo y las células de cada placa se leyeron para evaluar su
densidad óptica a 570 nm en un lector de placas usando el software
de análisis de microplacas Delta Soft. Las unidades de bioactividad
patrón se asignaron a cada muestra y se ajustaron para tener en
cuenta la concentración de TNFR:Fc en los pocillos. Los pocillos que
contenían blancos se asignaron una bioactividad de cero y las que
contenían TNFR:Fc no modificada o no conjugada se asignaron una
bioactividad de 100.
La tabla II presenta los resultados del grado de
análisis de conjugación con polietilenglicol, los análisis de tamaño
molecular, y los ensayos de bioactividad para cada uno de los
estudios de proteínas TNFR:Fc.
| (1) | Las relaciones son moles de PEG activado:moles de residuos de lisina de TNFR:Fc. | |
| (2) | No determinado | |
| (3) | Tamaño molecular relativo; mediciones de volumen hidrodinámico | |
| (4) | Bioactividad relativa; TNFR:Fc o conjugada asignada 100. | |
| (5) | Número de unidades de polietilenglicol por molécula de TNFR:Fc |
Como se demuestra por los resultados de los
análisis de caracterización mostrados en la tabla II, las proteínas
que se protegieron antes de su conjugación no muestran una
disminución en su actividad. De hecho, en el caso de la TNFR:Fc, se
incrementa la bioactividad de la proteína. Cuando una TNFR:Fc no se
protege antes de sus conjugación con polietilenglicol, muestra un
incremento en el número de unidades de polietilenglicol o cadenas
por molécula de TNFR:Fc hasta aproximadamente 4,5 unidades de
polietilenglicol por molécula de TNFR:Fc. De manera similar, y como
se esperaba, el peso molecular relativo de la proteína conjugada se
incrementa con cantidades crecientes de polietilenglicol en la
mezcla de reacción. También, como se esperaba, la actividad la
TNFR:Fc conjugada sin el beneficio de un sitio bloqueado disminuye
con relaciones crecientes de polietilenglicol:residuos de lisina en
la reacción de conjugación. Sorprendentemente, cuando una proteína
se protege antes de la reacción de conjugación, la actividad de la
proteína conjugada se mide a una actividad incluso más alta que la
de la proteína control no conjugada. La actividad de la proteína que
se conjugó en condiciones protegidas incrementa no obstante el
número relativamente alto de las unidades de polietilenglicol
conjugadas a la proteína. Es decir, en las condiciones de reacción,
entre aproximadamente 5 y 6 unidades de polietilenglicol por TNFR;Fc
conjugada a la proteína protegida da como resultado una bioactividad
que se midió a entre 110% y 130% de la proteína control. Por el
contrario, cuando una media de aproximadamente 4,5 de unidades de
polietilenglicol conjugadas a una TNFR:Fc no protegida la actividad
cae a menos de 40% de la de una proteína no conjugada control.
Evidentemente, los procedimientos de la presente proporcionan
proteínas conjugadas con polietilenglicol que tienen beneficios
incrementados sobre los procedimientos de la técnica anterior.
Con el fin de estudiar los sitios de la
conjugación con polietilenglicol y la actividad asociada al sitio de
conjugación, los mapas de péptidos se generaron para productos de
conjugación de TNFR:Fc no conjugada, los productos conjugados de
acuerdo con la presente invención, y TNFR:Fc control no conjugada.
Los mapas de péptidos se generaron digiriendo la TNFR:Fc con
tripsina, una enzima que actúa sobre los enlaces de lisilo y
arginilo de las cadenas peptídicas. La TNFR:Fc nativa no glicosilada
tratada con tripsina se espera que forme 39 fragmentos ya que hay 38
sitios que tienen un residuo lisina o arginina. El polietilenglicol
se sabe que se conjuga mediante funcionalidades amino disponibles
sobre lisina y la reactividad de la tripsina hacia un sitio de
lisina conjugada se altera. De acuerdo con lo anterior, se espera
que el mapa de digestión con tripsina de una proteína conjugada
comparado con el de una proteína no conjugada proporcionará
información relativa a los sitios de conjugación y el grado de
conjugación.
La digestión con tripsina se llevó a cabo
diluyendo 200 \mul de aproximadamente 10 mg/ml de solución de
proteína con 500 \mul de guanidina 7 M:HCl, y
TRIS-HCl 0,1 M, a pH 8,3. Después se añadieron 7
\mul de ditiotreitol 1 M a la solución de proteína y la solución
se incubó a 65ºC durante 15 minutos para reducir la proteína.
Después de enfriar la solución de proteína reducida a 65ºC durante
15 minutos para reducir la proteína. Después de enfriar la solución
de proteína reducida se añadieron 15,4 \mul de yodoacetamida
acuosa 1 M y la solución de proteína reducida se incubó a
temperatura ambiente durante 10 minutos. Después de añadir otros
15,4 \mul de ditiotreitol 1 M a la solución, se incubó durante 10
minutos y se diluyó hasta un volumen final de 7 ml añadiendo 6,276
ml de TRIS 0,1 M, a pH 7,5. Una solución de
N-glicanasa se añadió a la solución de proteína
hasta una relación final de 2 U de N-glicanasa/100
\mug de TNFR:Fc. Esta solución se incubó durante 1 hora a 37ºC.
Después, se añadió suficiente solución de tripsina que contenía 1
\mug/\mul de tripsina a la solución de proteína para conseguir
una relación final de tripsina:proteína en peso de 1:10. Se dejó
que la muestra se digiriera incubándola durante 5 horas a 37ºC.
Después de la incubación, la digestión se inactivó hirviendo la
digestión durante 3 minutos y ajustando la digestión hasta pH 2
usando ácido trifluoroacético al 10%.
El procedimiento anterior se realizó usando
muestras de TNFR:Fc no conjugada, TNFR:Fc conjugada después de
proteger su sitio de unión, y TNFR:Fc conjugada sin bloquear su
sitio de unión. Después todas las muestras se cromatografiaron
usando un sistema de HPLC de Waters equipado con una columna guarda
Kromasil C18, 5 \mu, tamaño de poro 100 A, 3,2 x 250 mm. Se usó
una fase móvil de gradiente con disolvente A que contenía TFA al
0,15% acuoso y disolvente B que contenía TFA al 0,12% en CH_{3}CN
al 80%. El caudal fue de 0,5 ml/min con una temperatura de
desarrollo de 215 minutos. Un detector de UV controló las
absorbancias a 220 nm y a 280 nm.
Los cromatogramas de los mapas de péptidos
trípticos obtenidos para la TNFR:Fc control, TNFRR:Fc conjugada sin
la etapa de protección, y la TNFR:Fc conjugada posterior a una etapa
de protección se presentan en la figura 1, figura 2, y figura 3,
respectivamente. En general los mapas muestran que la conjugación de
TNFR:Fc protegida y la TNFR:Fc no protegida da como resultado la
desaparición de los picos del mapa o una reducción de la altura de
los picos. En particular, hay que destacar los picos identificados
como T7, T1 y T9. El pico T7 se confirma que es un fragmento de
digestión con tripsina que está flanqueado por arginina en ambos
extremos. Ya que ninguno de los sitios activos para este fragmento
de digestión contiene una lisina, este fragmento no se espera que
esté afectado por una reacción de conjugación con
polietilenglicol.
De acuerdo con lo anterior, el pico se espera que
sea el mismo para la, muestra de digestión de TNFR:Fc
independientemente de si o no la TNFR:Fc haya experimentado una
reacción de conjugación con polietilenglicol. Por esta razón, el
pico T7 se usó para normalizar todos los otros picos de los tres
cromatogramas y se presenta que tienen alturas de picos iguales en
los tres mapas.
El fragmento T1 se ha identificado como el
extremo N de TNFR:Fc y es muy aparente en el mapa de digestión con
tripsina de la proteína control no conjugada (Figura 1) pero ausente
en los mapas de la proteína conjugada sin protección anterior
(Figura 2) y el mapa de la proteína conjugada posterior a una etapa
de protección. Esto se espera ya que el extremo N contiene una
funcionalidad amino muy reactiva que se conjugará rápidamente con
una funcionalidad de polietilenglicol activada. El fragmento
digerido conjugado con polietilenglicol no eluirá en mismo volumen
de elución durante la separación por HPLC.
De manera interesante, el pico identificado como
T9 se sabe que corresponde a un fragmento que incluye el residuo de
aminoácido lis108 que se cree que está implicado con la unión
TNF\alpha. De una manera significativa, el pico T9 está
sustancialmente reducido en el mapa asociado con la digestión de
TNFR:Fc conjugada sin protección anterior (Figura 2) demostrando que
este residuo de lisina no era un sitio activo para la digestión de
tripsina, probablemente como consecuencia de la reacción de
conjugación con polietilenglicol sin proteger. En contraste, el pico
T9 asociado al mapa de digestión de la TNFR:Fc conjugada posterior a
la protección (figura 3) no disminuye en tamaño demostrando que el
residuo de lisina no se efectuó mediante la reacción de conjugación
y permanece activo durante la digestión con tripsina. Estos datos
proporcionan una fuerte sugerencia de que una TNFR:Fc estaba
suficientemente protegida antes de la reacción de conjugación y
explica la actividad retenida asociada a la TNFR:Fc conjugada de
acuerdo a la presente invención.
\newpage
De
referencia
A continuación se describe la conjugación del
receptor de la IL-4 (abreviadamente
IL-4R) utilizando una metodología de sitio
protegido. El IL-4R recombinante producido en las
células CHO fue la proteína seleccionada y el agente de protección
usado fue el anticuerpo monoclonal del IL-4R, que
neutraliza la actividad del IL-4R. Los
procedimientos de expresión del IL-4R en las células
CHO y de preparación de un anticuerpo de neutralización se describen
en la publicación PCT WO 90/05183. El anticuerpo de neutralización
del IL-4R se inmovilizó en medio de biosoporte 3M
EMPHAZE™ sustancialmente de la misma manera que la descrita en el
ejemplo 1 usando 15 mg de anticuerpo de neutralización y 0,25 g de
3M EMPHAZE™.
Las perlas que tienen anticuerpo inmovilizado se
transfirieron a una columna Amicon de acero inoxidable de 2 ml (VL
11 x 25) y se compactaron haciendo fluir PBS a través de la columna
a 1 ml/ruin durante dos minutos. La columna se equilibró haciendo
fluir Na_{2}HPO_{4} 50 mM (pH 8,5) durante 20 minutos a 0,5
ml/min. Después, se cargaron 400 \mul de solución de
IL-4R (5,0 mg/ml de IL-4R en Tris
20 mM, pH 7,4) en la columna en Na_{2}HPO_{4} 50 nM (pH 8,5). La
solución resultante se pasó continuamente a través de la columna a
0,5 ml/min durante 1 hora.
Después de la reacción de protección, el
IL-4R se conjugó con polietilenglicol añadiendo 50
mg de PEG5000 activado con el ácido succidinilpropiónico (SPA) (un
exceso molar de 10 veces de polietilenglicol a residuos de lisina
sobre el IL-4R) en 6 ml de Na_{2}HPO_{4} 50 mM
(pH 8,5) bombeando la solución en la resina de la columna. La
reacción de conjugación con polietilenglicol se dejó que se
desarrollase durante una noche. El polietileno no unido y los
subproductos de la reacción de conjugación se enjuagaron de la
columna bombeando Na_{2}HPO_{4} 50 mM (pH 8,5) durante 60
minutos a 0,5 ml/min.
El IL-4R conjugado se desprotegió
eluido de la columna bombeando citrato sódico 0,2 M, (pH 2,5) a 0,5
ml por minuto durante 1 hora a través de la columna. Las fracciones
del material eluido se recogieron y se analizaron mediante
absorbancia por UV a 280 nm. Las muestras que contenían proteína se
neutralizaron hasta pH 7,0 mediante la adición de NaOH 0,1 N.
El IL-4R conjugado se caracterizó
mediante SDS-PAGE y análisis de cromatografía por
exclusión de tamaño. Cada una de estas técnicas confirmó que el
IL-4R protegido se conjugó con polietilenglicol.
De
referencia
El huGM-CSF se produjo en
levadura como se describe en el documento de Bilis, D. L. y col.,
Behring Inst. Mitt., 83: 1-7 (1988). Ochenta
y nueve miligramos de anticuerpo monoclonal de
GM-CSF, denominación Immunex M8, específico para el
extremo N del Hugo-CSF se conjugó a 25 ml de
Sefarosa activada con bromuro de cianógeno según las instrucciones
de los fabricantes.
Después el anticuerpo se inmovilizó a la resina,
se vertió en una columna Amicon de 50 ml y se compactó haciendo
fluir PBS a través de la columna. El GM-CSF (1,5 ml
a 6,8 mg/ml de Na_{2}PO_{4}, (pH 7,0) se cargó en la columna en
Na_{2}PO_{4} 50 mM (pH 7,0) y la solución se pasó continuamente
a través de la columna a 0,5 ml/min durante 2 horas. Después la
columna se equilibró pasando Na_{2}PO_{4} 50 mM (pH 8,5) a
través de la columna durante 1 hora.
El GM-CSF se conjugó con
polietilenglicol añadiendo 500 mg de polietilenglicol 5000 activado
con carbonato de succidinimilo (abreviadamente en inglés CS) (un
exceso molar de 50 veces de polietilenglicol a grupos amino de
residuos de lisina sobre el GM-CSF) en 10 ml de
Na_{2}HPO_{4} 50 mM (pH 8,5) y bombeando la solución a través de
la columna a 0,1 ml/min durante una noche.
El GM-CSF conjugado se eluyó de
la columna bombeando Na_{2}HPO_{4} 50 mM (pH 11,0) a 1 ml/min
durante 1 hora. Las fracciones de material eluido se recogieron y se
analizaron mediante absorbancia por UV a 280 nm. Las muestras que
contenían proteína se neutralizaron hasta pH 7,1 mediante la adición
de HCl 1 M. El GM-CSF conjugado se caracterizó
mediante SDS-PAGE y espectrometría de masas
MALDI-TOF. Cada una de estas técnicas confirmó que
el GM-CSF se había conjugado con PEG. El cambió en
masa fue de aproximadamente 14 kDa, el peso molecular del
GM-CSF no modificado, a 29 kDa. El cambio de peso
molecular detectado indica que tres moléculas de polietilenglicol de
peso molecular 5.000 se conjugaron a cada molécula de
GM-CSF.
Claims (13)
1. Un procedimiento para conjugar el receptor p75
del TMF con polietilenglicol, dicho procedimiento comprendiendo las
etapas de
unión del anticuerpo de neutralización del
receptor del p75 del TNF a receptor del TNF para proporcionar un
sitio del p75 del TNF protegido; y
poner en contacto el receptor del p75 del TNF
protegido con polietilenglicol en condiciones suficientes para
conjugar el polietilenglicol al sitio del receptor del TNF
protegido.
2. El procedimiento de la reivindicación 1 en el
que la etapa de unión del anticuerpo de neutralización del receptor
del p75 del TNF al receptor p75 del TNF comprende las etapas de:
inmovilizar el anticuerpo de neutralización del
receptor del TNF a un soporte sólido y,
poner en contacto el receptor p75 del TNF con el
anticuerpo de neutralización del receptor del TNF inmovilizado en
condiciones que hacen que el anticuerpo de neutralización del
receptor del TNF se una reversiblemente al receptor p75 del TNF,
proporcionando un receptor protegido del p75 del TNF.
3. El procedimiento de la reivindicación 2 en el
que el soporte sólido comprende grupos funcionales capaces de unirse
covalentemente al anticuerpo de neutralización del receptor del
TNF.
4. El procedimiento de la reivindicación 1, 2 ó 3
en el que la etapa de poner en contacto el receptor p75 del TNF con
polietileno comprende hacer que un polietilenglicol activado
reaccione con nucleófilos sobre el receptor p75 del TNF.
5. El procedimiento de cualquiera de cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende además la etapa de
desproteger el receptor p75 del TNF protegido.
6. El procedimiento de la reivindicación 5 en el
que la etapa de desprotección del receptor p75 del TNF comprende
tratar el receptor protegido p75 del TNF con un agente de
desprotección, el agente de desprotección siendo capaz de disociar
el receptor p75 del TNF del agente de desprotección.
7. El procedimiento de cualquiera de la
reivindicaciones 1 a 6 que comprende además la etapa de recuperación
del receptor p75 del TNF conjugado con polietilenglicol.
8. Un receptor p75 del TNF conjugado con
polietilenglicol preparado según el procedimiento de cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 7.
9. Un procedimiento para modificar una proteína
de fusión TNFR:Fc, dicho procedimiento comprendiendo las etapas
de:
inmovilizar un anticuerpo de neutralización del
receptor del TNF a un soporte sólido y,
poner en contacto la proteína de fusión TNF:Fc
con el anticuerpo de neutralización del receptor de TNF inmovilizado
en condiciones que hacen que el anticuerpo de neutralización del
receptor del TNF se una a la proteína de fusión TNFR:Fc; y
poner en contacto la proteína de fusión TNFR:Fc
protegida con polietilenglicol en condiciones suficientes para
conjugar el polietilenglicol a la proteína de fusión TNFR:Fc.
10. El procedimiento de la reivindicación 9 que
comprende además las etapas de desproteger la proteína de fusión
TNFR:Fc protegida y conjugada.
11. Una proteína de fusión TNFR:Fc conjugada con
polietilenglicol preparada según el procedimiento de la
reivindicación 9 ó 10.
12. Un procedimiento para conjugar una proteína
de fusión TNFR:Fc con polietilenglicol, dicho procedimiento
comprendiendo las etapas de:
inmovilizar un anticuerpo de neutralización del
receptor del TNF a un soporte sólido,
poner en contacto la proteína de fusión TNF:Fc
con el anticuerpo de neutralización del receptor de TNF inmovilizado
en condiciones que hacen que el anticuerpo de neutralización del
receptor del TNF se una a la proteína de fusión TNFR:Fc; y
poner en contacto la proteína de fusión TNFR:Fc
protegida con polietilenglicol en condiciones suficientes para
conjugar el polietilenglicol a la proteína de fusión TNFR:Fc.
13. El procedimiento de la reivindicación 12 que
incluye además la etapa de desprotección del la proteína de fusión
TNFR:Fc conjugada.
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