ES2875957T3 - Agonistas del receptor APJ y usos de los mismos - Google Patents

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Abstract

Un agonista peptídico de APJ que tiene una estabilidad incrementada in vitro con relación a Apelina-13 de tipo salvaje (SEQ ID NO: 2), en donde el agonista se modifica con un grupo que prolonga la semivida en el extremo N o en una cadena lateral del agonista peptídico, en donde el agonista peptídico comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de: SEQ ID NOs 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 43 y48, en donde el agonista peptídico se une y activa el receptor APJ, en donde el grupo que prolonga la semivida es PEG.

Description

DESCRIPCIÓN
Agonistas del receptor APJ y usos de los mismos
REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS
Esta solicitud es una Solicitud internacional PCT que reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional de los Estados Unidos Número 61/740.409, presentada el 20 de diciembre de 2012 y la Solicitud Provisional de los Estados Unidos Número 61/779.985, presentada el 13 de marzo de 2013.
LISTADO DE SECUENCIAS
La presente solicitud contiene un listado de secuencias que se envía adjunto en formato ASCII a través de EFS-Web. El Listado de Secuencias, creado el 17 de diciembre de 2013, se proporciona como un archivo titulado A-1716-WO-PCT_Seq_List.txt y tiene un tamaño de 1.045.666 bitios.
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La solicitud se refiere a agonistas del receptor APJ que tienen estabilidad, semivida circulante y/o potencia incrementada en relación con la apelina nativa.
ANTECEDENTES
Apelina es el ligando endógeno de APJ (APLNR, receptor de angiotensina tipo-1). El receptor APJ es un miembro de la familia del receptor acoplado a proteína G (GPCR) similar a rodopsina. El sistema apelina/APJ se ha observado en muchos tejidos tales como corazón, riñón, páncreas, pulmón y el sistema nervioso central. Esto sugiere diversos papeles del sistema en la fisiología y patología de los mamíferos.
Los péptidos apelina se procesan a partir de una forma pre-pro de 77 residuos en fragmentos bioactivos más pequeños, principalmente una forma de 36 residuos (apelina 42-77, también conocida como apelina-36) y un polipéptido de 13 residuos más pequeño (apelina 65-77 - a la que también se alude como apelina-13) Hosoya et al., J. Biol. Chem.
275:21061-21067, 2000. Se determinó previamente que los péptidos apelina eran ligandos endógenos para el receptor APJ huérfano, un miembro de la superfamilia de siete receptores transmembrana acoplados a proteína G. Tatemoto et al., Biochem. Biophysi. Res. Commun. 251:471-476, 1998. Se ha informado que una de las isoformas más cortas más activas identificadas, apelina-13 piroglutamada ([PE65] Apelina-13 (65-77), es la forma más potente y abundante de apelina en el tejido cardíaco. Maguire et al., Hypertension 54:598-604, 2009. Los modelos In vitro y preclínicos han sugerido que el sistema apelina/APJ tiene un papel en la homeostasis cardiovascular así como en el metabolismo. Barnes et al., Heart 96:1011-1016, 2010. Los niveles circulantes de apelina son transitorios y apelina-13 tiene una breve semivida plasmática de < 5 minutos, lo que conduce a efectos cardiovasculares de corta duración.
In vitro, la apelina exógena aumenta la contractilidad a concentraciones subnanomolares en tiras auriculares y corazones de rata enteros, y aumenta el acortamiento del sarcómero hasta en un 140% en cardiomiocitos aislados. Barnes et al., Heart 96:1011-1016, 2010. Apelina también tiene un potente efecto inotrópico en un ensayo de corazón aislado ex-vivo. In vivo, la infusión aguda de apelina restaura la fracción de eyección, aumenta el gasto cardíaco y reduce la presión telediastólica del ventrículo izquierdo en ratas con insuficiencia cardíaca crónica. Berry et al., Circulation 110:187-193, 2004. La apelina exógena potencia de manera potente la contractilidad del miocardio sin inducir hipertrofia ventricular izquierda concomitante con la reducción de la precarga y poscarga ventricular. Barnes et al., Heart 96:1011-1016, 2010.
Se ha informado de estudios de relación estructura-actividad (SAR) muy limitados para péptidos de apelina. Los limitados estudios de SAR se han centrado en el potenciamiento de la afinidad y/o potencia in vitro. No hay informes de SAR centrados en aumentar la estabilidad proteolítica y prolongar la semivida circulante, al tiempo que se mejora o mantiene la potencia de los agonistas de APJ.
Estudios de Kawamata et al y Hosoya et al han demostrado que el péptido apelina-13 más corto tenía aproximadamente una afinidad in vitro 3,5 veces mayor por el receptor APJ que apelina-36. Kawamata et al., BBA 1538: 162-171,2001, Hosoya et al., JBC 275: 21061-21067. Se informó que análogos de apelina-13 tienen una única sustitución con aminoácidos canónicos o no canónicos. Los autores también informaron de sustituciones dobles y triples en apelina 66-77 y apelina 63-77, pero no en apelina-13. Se hizo hincapié en los péptidos de los que se informó que tienen mayor afinidad y potencia in vitro que apelína-13. Nishizawa et al., en: T. Shioiri (ed.), Peptide Science 2000: Proceedings of the 37th Japanese Peptide Symposium, págs. 151-154. Varios, si no todos, de estos péptidos modificados se reseñan en estudios posteriores. Documento US 7.635.751.
En un estudio de 2003 (Medhurst et al., J. Neurochemistry 84:1162-1172, 2003) se comparó la actividad in vitro de apelina-36, apelina-17 y apelina-13. Se concluyó que los tres péptidos eran aproximadamente equipotentes. La amidación C-terminal dio como resultado una disminución en la afinidad de aproximadamente 14 veces. Un estudio más reciente (Hamada et al., J. Mol. Med. 22:547-552, 2008) reseñó análogos cíclicos de apelina-13. Cuando se evaluó la actividad in vitro, los tres análogos mantuvieron la actividad funcional, aunque con una potencia reducida con relación a la apelina-13.
En una patente de 2009 (US 7.635.751) se informó sobre un péptido apelina de 12 aminoácidos que tiene actividad de ligando en APJ. El péptido podría tener una sustitución de un aminoácido no canónico.
Otro estudio informó la síntesis de análogos de apelina-13 con sustituciones de aminoácidos con aminoácidos no canónicos en el extremo C-terminal de la molécula enfatizada, pero sin pegilación en el extremo N o C u otra ubicación específica del sitio. Sin embargo, también se informó del uso de espaciadores internos de PEG (PEG corto (n = 4 o 6)) en análogos de péptidos de menor actividad con deleciones en el medio de la secuencia que contenían menos residuos de aminoácidos que apelina-13. Murza et al. ChemMedChem 7:318-325, 2012.
Estudios también han informado de intentos de modificar el receptor de apelina con el fin de afectar la función fisiológica. Documento WO 2010/053545. La invención se refiere, en general, a compuestos que son moduladores alostéricos del receptor APJ. Los moduladores alostéricos se derivan de los dominios y bucles intracelulares del receptor APJ. El documento WO 2012/125408 proporciona composiciones y métodos para tratar una enfermedad o trastorno asociado con la apelina. El documento WO 2007/048026 proporciona una composición de materia que implica un antagonista peptídico CGRP.
Esta solicitud proporciona nuevos agentes terapéuticos de apelina y usos de dichos agentes terapéuticos.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La invención proporciona un agonista peptídico de APJ que tiene una estabilidad incrementada in vitro en relación con Apelina-13 de tipo salvaje (SEQ ID NO: 2), en donde el agonista se modifica con un grupo que prolonga la semivida en el extremo N o en una cadena lateral del agonista peptídico, en donde el agonista peptídico comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de:
SEQ ID NOs 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 43 y 48,
en donde el agonista peptídico se une y activa el receptor APJ,
en donde el grupo que prolonga la semivida es PEG.
La estabilidad incrementada del agonista peptídico de APJ puede incrementar la semivida in vitro.
El grupo PEG del agonista peptídico de APJ puede ser tiopropionilo (mPEG de 20K) o Atz (mPEG de 20 K).
El agonista del APJ puede utilizarse en un método para mejorar la contractilidad cardíaca, en un método para mejorar la función sistólica o diastólica y/o en un método para tratar la insuficiencia cardíaca en un paciente que lo necesite.
Se proporcionan agentes terapéuticos que tienen actividad agonista de APJ. Los agonistas pueden tener características farmacéuticas ventajosas (p. ej., semivida o potencia). Compuestos de este tipo pueden comprender un dominio de unión al receptor APJ o secuencias derivadas del mismo mediante diseño racional, rastreo de péptidos, rastreo basado en levadura, presentación de fagos, rastreo de ARN-péptido u otras técnicas de rastreo. El dominio puede tener muy poca o ninguna actividad antagonista. El compuesto también puede comprender un vehículo, tal como un polímero (p. ej., polietilenglicol), una proteína (p. ej., un dominio Ab o Fc) u otra secuencia peptídica (p. ej., un dominio de fijación de objetivo), en que el vehículo está unido covalentemente al dominio agonista de APJ. El vehículo y el dominio agonista de APJ pueden enlazarse a través del extremo N o C, o cualquier otro sitio del polipéptido. El vehículo puede ser un polímero, p. ej., polietilenglicol (PEG).
Los dominios agonistas de APJ se pueden generar mediante diseño racional, rastreo de secreciones de levadura, diseño racional, análisis estructural de proteínas, presentación de fagos, rastreo de ARN-péptido y otras técnicas conocidas en la técnica.
Diversas realizaciones están dirigidas a un agonista de APJ que tiene una estabilidad incrementada con respecto a Apelina-13 de tipo salvaje (SEQ ID NO: 2), en donde el agonista está modificado con al menos un aminoácido no canónico. El agonista de APJ también puede incluir un grupo que prolonga la semivida en el extremo N, el extremo C u otro residuo del agonista. El agonista de APJ puede tener un grupo que prolonga la semivida en el extremo N, el extremo C u otro residuo del agonista que consiste en PEG, un dominio Fc, IgG, HSA, PE, un Ab, un péptido, un lípido. colesterol, una nanoestructura u otro resto que prolonga la semivida conocido en la técnica. El agonista puede piroglutamizarse en el extremo N y/o puede PEGilarse o conjugarse en el extremo N o en cualquier otro lugar del agonista. En diversas realizaciones, el agonista puede unirse al receptor APJ. En otras realizaciones, el agonista de APJ tiene más de 7, 8, 9, 10, 11, 12 aminoácidos de longitud, p. ej., 13 o más aminoácidos de longitud y el grupo que prolonga la semivida puede estar en cualquier parte de la molécula. En aún otras realizaciones, el agonista de APJ puede tener una potencia incrementada en relación con apelina-13 de tipo salvaje.
En diversas realizaciones, el agonista de APJ puede tener al menos 2 residuos de aminoácidos reemplazados por un aminoácido no canónico. Alternativamente, los al menos 2 residuos de aminoácidos no canónicos pueden ser 3, 4 o 5 residuos de aminoácidos.
En diversas realizaciones, el agonista de APJ con estabilidad incrementada tiene una semivida in vitro incrementada. El resto que proporciona una estabilidad incrementada puede ser cualquier grupo que logre este objetivo, p. ej., sustituciones de aminoácidos o modificaciones químicas. En otras realizaciones, el agonista de APJ con estabilidad incrementada tiene una semivida in vivo incrementada. La semivida in vivo incrementada puede ser el resultado de una estabilidad proteolítica o metabólica incrementada y/o la inclusión de un resto que prolonga la semivida. El resto que proporciona una semivida in vivo incrementada puede ser cualquier grupo que logre este objetivo, p. ej., el agonista de APJ puede PEGilarse con tiopropionilo (mPEG de 20K), Atz (PEG10), NPeg11 o Atz (mPEG de 20K) o conjugarse alternativamente. a una proteína.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Figura 1. Ejemplos de aminoácidos no canónicos.
Figuras 2A-B. Ejemplos de PEG y enlazadores.
Figuras 3A-C. Ejemplos de agonistas de APJ.
Figuras 4A-B. Estabilidad in vitro de agonistas de APJ en plasma.
Figura 5. Actividad agonista de péptidos PEGilados de 20 kDa. Los péptidos {Tiopropionilo(mPEG de 20K)}LRP[hArg][Cha]SHKG[Oic][Nle]P[4-Cl-F]{ÁcidoLibre} (SEQ ID NO: 122), {Tiopropionilo(mPEG de 20K)}KFRRQRP[hArg][Cha]SHKG[Oic][Nle]P[4-Cl-F]{ÁcidoLibre} (SEQ ID NO: 123), {Tiopropionilo(mPEG de 20K)}LLRP[hArg][Cha] SHKG[Oic][Nle]P[4-Cl-F]{ÁcidoLibre} (SEQ ID NO: 124), {Hidrógeno}[Atz(mPEG de 20K)]KFRRQRP[hArg][Cha]SHKG[Oic][Nle]P[4-Cl-F]{ÁcidoLibre} (SEQ ID NO: 126) e {Hidrógeno}[Atz(mPEG de 20K)]LRP[hArg][Cha]SHKG[Oic][Nle]P[4-Cl-F]{ÁcidoLibre} (SEQ ID NO: 127) son potentes y actúan como un agonista completo con relación a [PE] RPRLSHKGPMPF (pir apelina-13) (SEQ ID NO: 128).
Figura 6. Comparación de un péptido PEGilado de 525 dalton (SEQ ID NO: 23) y pir apelina 13 (SEQ ID NO: 128).
Figura 7. Demuestra el efecto inotrópico independiente de la carga intrínseca de un agonista (SEQ ID NO: 24) en un corazón de rata Langendorff aislado.
Figura 8. Demuestra que un agonista (SEQ ID NO: 24) aumenta la función sistólica y diastólica en un corazón de Langendorff aislado.
Figura 9. Efectos de un péptido (SEQ ID NO: 23) sobre la contractilidad cardíaca en ratas normales y con insuficiencia cardíaca. MI = ratas con insuficiencia cardíaca.
Figura 10. Efectos del tamaño de PEG sobre la actividad in vitro
Figura 11. Efectos de la valencia del péptido sobre la actividad in vitro
Figura 12. Estructuras de péptidos bis- y tetraquis-PEG de 20 kDa.
Figura 13. Efectos de la valencia del péptido sobre la actividad in vitro
Figura 14. Estructuras de péptidos Bis-PEG de 1,7 y 2,2 kDa..
Figura 15. Efectos de los conjugados Fc para apelina-13 y apelina-17 en ensayos de GTPy humanos y de rata.
Figura 16. Efectos de los conjugados de Fc en el ensayo de GTPy humano.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
El sumario anterior no pretende definir cada uno de los aspectos o realizaciones de la invención, y se pueden describir aspectos adicionales en otras secciones. El documento completo está destinado a referirse como una divulgación unificada, y debe entenderse que se pueden contemplar todas las combinaciones de características descritas en esta memoria, incluso si la combinación de características no se encuentra junta en la misma oración, párrafo o sección de este documento.
Además de lo anterior, como un aspecto adicional, todas las realizaciones de alcance más estrecho en cualquier forma que las variaciones definidas por los párrafos específicos de esta memoria pueden incluirse en esta divulgación. Por ejemplo, determinados aspectos se describen como un género, y debe entenderse que cada uno de los miembros de un género puede ser, individualmente, una realización. Además, debe entenderse que aspectos descritos como un género o la selección de un miembro de un género abarcan combinaciones de dos o más miembros del género. También debe entenderse que si bien se presentan diversas realizaciones en la memoria descriptiva utilizando el lenguaje "que comprende", bajo diversas circunstancias, una realización relacionada también puede describirse utilizando un lenguaje "que consiste en" o "que consiste esencialmente en".
Se entenderá que las descripciones en esta memoria son ejemplares y explicativas solamente y no son restrictivas de la invención como se reivindica. En esta solicitud, el uso del singular incluye el plural a menos que se indique específicamente lo contrario. En esta solicitud, el uso de "o" significa "y/o" a menos que se indique lo contrario. Además, el uso de la expresión "que incluye", así como otras formas, tales como "incluye" e "incluido", no es limitante. Además, términos tales como "elemento" o "componente" abarcan tanto elementos como componentes que comprenden una unidad y elementos y componentes que comprenden más de una subunidad, a menos que se indique específicamente lo contrario. Además, el uso del término "porción" puede incluir parte de un resto o el resto completo.
A menos que se defina lo contrario en esta memoria, las expresiones y los términos científicos y técnicos utilizados en relación con la solicitud tendrán los significados que entienden comúnmente los expertos en la técnica. Además, a menos que el contexto requiera lo contrario, los términos en singular incluirán pluralidades y los términos en plural incluirán el singular. Por lo tanto, tal como se usa en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas en singulares "un", "una" y "el", “la” incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por ejemplo, la referencia a "una proteína" incluye una pluralidad de proteínas; la referencia a "una célula" incluye poblaciones de una pluralidad de células.
También debe entenderse que al describir un intervalo de valores, la característica que se describe podría ser un valor individual que se encuentre dentro del intervalo. Por ejemplo, "un pH de aproximadamente pH 4 a aproximadamente pH 6" podría ser, pero no se limita a, pH 4, 4,2, 4,6, 5,1,5,5, etc. y cualquier valor entre dichos valores. Adicionalmente, "un pH de aproximadamente pH 4 a aproximadamente pH 6" no debe interpretarse en el sentido de que el pH en cuestión varía 2 unidades de pH de pH 4 a pH 6, sino que se puede elegir un valor dentro de un intervalo de dos pH para el pH de la solución.
En algunas realizaciones, cuando se usa el término "aproximadamente", significa el número enumerado más o menos 5%, 10%, 15% o más de ese número enumerado. La variación real prevista se puede determinar a partir del contexto.
Los títulos de las secciones que se utilizan en esta memoria son solo para fines organizativos y no deben interpretarse como limitantes de la materia objeto descrita. Se incluyen todos los documentos, o partes de documentos, citados en esta solicitud, incluyendo, pero no limitados a patentes, solicitudes de patente, artículos, libros y tratados. Según se utilizan de acuerdo con la divulgación, las siguientes expresiones y términos, a menos que se indique lo contrario, se entenderá que tienen los siguientes significados:
La expresión "residuo de carácter ácido" o "aminoácido de carácter ácido" debe entenderse que significa residuos de aminoácidos en forma D o L que tienen cadenas laterales que comprenden grupos ácidos. Residuos de carácter ácido ejemplares pueden incluir D y E.
El término "aminoácido" o "residuo" debe entenderse que significa un compuesto que contiene un grupo amino (NH2), un grupo ácido carboxílico (COOH) y cualquiera de diversos grupos laterales, que tienen la fórmula básica NH2CHRCOOH, y que se enlazan mediante enlaces peptídicos para formar proteínas. Los aminoácidos pueden ser, por ejemplo, de carácter ácido, básico, aromáticos, polares o derivatizados. Aminoácidos no estándares pueden denominarse aminoácidos "no canónicos".
Con frecuencia se emplea un sistema de abreviaturas de una letra para designar las identidades de los veinte residuos de aminoácidos "canónicos" generalmente incorporados en péptidos y proteínas que se producen de forma natural (Tabla 1). Abreviaturas de una letra de este tipo son completamente intercambiables en significado con abreviaturas de tres letras o nombres de aminoácidos no abreviados. Dentro del sistema de abreviaturas de una letra utilizado en esta memoria, una letra mayúscula indica un L-aminoácido y una letra minúscula indica un D-aminoácido. Por ejemplo, la abreviatura "R" designa L-arginina y la abreviatura "r" designa D-arginina.
TABLA 1. ABREVIATURAS DE UNA LETRA PARA LOS AMINOÁCIDOS CANÓNICOS.
(Las abreviaturas de tres letras están entre paréntesis).
Alanina (Ala) A
Glutamina (Gln) C
Leucina (Leu) L
Serina (Ser) S
Arginina (Arg) R
Ácido Glutámico (Glu) E
Lisina (Lys) K
Treonina (Thr) T
Asparagina (Asn) N
Glicina (Gly) G
Metionina (Met) M
Triptófano (Trp) W
Ácido Aspártico (Asp) D
Histidina (His) H Fenilalanina (Phe) F
Tirosina (Tyr) Y
Cisteína (Cys) C
Isoleucina (Ile) I
Prolina (Pro) P
Valina (Val) V
Una sustitución de aminoácidos en una secuencia de aminoácidos se puede designar en esta memoria con una abreviatura de una letra para el residuo de aminoácido en una posición particular, seguida de la posición numérica del aminoácido con respecto a una secuencia nativa de interés, que luego es seguida por el símbolo de una letra para el residuo de aminoácido sustituido en. Por ejemplo, "T30D" simboliza una sustitución de un residuo de treonina con un residuo de aspartato en la posición de aminoácido 30, con respecto a la secuencia nativa de interés.
Los residuos de aminoácidos se clasifican comúnmente de acuerdo con diferentes características químicas y/o físicas. La expresión "residuo de aminoácido de carácter ácido" se refiere a residuos de aminoácido en forma D o L que tienen cadenas laterales que comprenden grupos ácidos. Residuos de carácter ácido ejemplares incluyen residuos de ácido aspártico y ácido glutámico. La expresión «residuo de alquil aminoácido» se refiere a residuos de aminoácidos en forma D o L que tienen cadenas laterales de alquilo C1-6 que pueden ser lineales, ramificadas o cicladas, incluyendo el aminoácido amina tal como en prolina, en donde el alquilo C1-6 está sustituido con 0, 1, 2 o 3 sustituyentes seleccionados de haloalquilo C1-4, halo, ciano, nitro, -C(=O)Rb , -C(=O)ORa , -C(=O)NRa Ra , -C(=NRa)NRa Ra , -NRaC(=NRa)NRa Ra , -ORa , -OC (=O)Rb , -OC(=O)NRa Ra , -Oalquil C2-6NRa Ra , -Oalquil C2-6ORa , -SRa , -S(=O)Rb , -S(=O)2Rb , -S(= O)2NRa Ra , -NRa Ra , -N(Ra)C(=O)Rb , -N(Ra)C(=O)ORb , -N(Ra)C(=O)NRa Ra , -N(Ra)C(=NRa)N Ra Ra , -N(Ra)S(=O)2 Rb , -N(Ra)S(=O)2NRa Ra , -NRaalquil C2-6NRa Ra y -NRaalquil C2-6ORa ; en donde Ra es independientemente, en cada caso, H o Rb ; y Rb es independientemente, en cada caso, alquilo C1-6 sustituido con 0, 1,2 o 3 sustituyentes seleccionados de halo, alq C1-4, haloalq C1-3, -Oalq C1-4, -NH2 , -NHalq C1-4 y -N(alq C1-4)alq C1-4; o cualquier forma protonada de los mismos, incluyendo alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, serina, treonina, lisina, arginina, histidina, aspartato, glutamato, asparagina, glutamina, cisteína, metionina, hidroxiprolina, ciclohexilalanina, norleucina, ácido 2-aminobutírico, pero cuyos residuos no contienen un grupo arilo o aromático. La expresión "residuo de aminoácido aromático" se refiere a residuos de aminoácido en forma D o L que tienen cadenas laterales que comprenden grupos aromáticos. Residuos aromáticos ejemplares incluyen residuos de triptófano, tirosina, 3-(1-naftil)alanina, histidina o fenilalanina. La expresión "residuo de aminoácido de carácter básico" se refiere a residuos de aminoácido en forma D o L que tienen cadenas laterales que comprenden grupos de carácter básico. Residuos de aminoácidos de carácter básico ejemplares incluyen residuos de histidina, lisina, homolisina, ornitina, arginina, N-metilarginina, w-aminoarginina, w-metil-arginina, 1 -metil-histidina, 3-metil-histidina y homoarginina (hR). La expresión "residuo de aminoácido hidrófilo" se refiere a residuos de aminoácidos en forma D o L que tienen cadenas laterales que comprenden grupos polares. Ejemplos de residuos hidrófilos incluyen residuos de cisteína, serina, treonina, histidina, lisina, asparagina, aspartato, glutamato, glutamina y citrulina (Cit). La expresión "residuo de aminoácido lipófilo" se refiere a residuos de aminoácido en forma D o L que tienen cadenas laterales que comprenden grupos no cargados, alifáticos o aromáticos. Cadenas laterales lipófilas ejemplares incluyen fenilalanina, isoleucina, leucina, metionina, valina, triptófano y tirosina. Alanina (A) es anfifílica - es capaz de actuar como un residuo hidrófilo o lipófilo (es decir, hidrófobo). La alanina, por lo tanto, está incluida dentro de la definición tanto de residuo "lipófilo" (es decir, "hidrófobo") como de residuo "hidrófilo". La expresión residuo de aminoácido "no funcional" o "neutro" se refiere a residuos de aminoácidos en forma D o L que tienen cadenas laterales que carecen de grupos de carácter ácido, básico o aromáticos. Residuos de aminoácidos neutros ejemplares incluyen metionina, glicina, alanina, valina, isoleucina, leucina y norleucina.
Los polipéptidos pueden tener sustituciones de aminoácidos. Los expertos en la técnica pueden determinar las sustituciones de aminoácidos deseadas (ya sean conservadoras o no conservadoras). Pueden utilizarse sustituciones de aminoácidos para identificar residuos importantes de la secuencia polipeptídica, o para aumentar o disminuir la afinidad de las moléculas de péptido o vehículo-péptido (véanse las fórmulas anteriores) descritas en esta memoria.
En determinadas realizaciones, las sustituciones de aminoácidos conservadoras pueden abarcar residuos de aminoácidos que se producen de forma no natural que se incorporan típicamente mediante síntesis química de péptidos en lugar de mediante síntesis en sistemas biológicos.
Las modificaciones conservadoras pueden producir péptidos conjugados con restos que prolongan la semivida que tienen características funcionales, físicas y químicas similares a las del péptido conjugado (p. ej., conjugado con PEG) a partir del cual se realizan modificaciones de este tipo. Por el contrario, se pueden lograr modificaciones sustanciales en las características funcionales y/o químicas de los péptidos seleccionando sustituciones en la secuencia de aminoácidos que difieran significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura de la cadena principal molecular en la región de la sustitución, por ejemplo, como una conformación a-helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana o (c) el tamaño de la molécula.
Por ejemplo, una "sustitución de aminoácidos conservadora" puede implicar una sustitución de un residuo de aminoácido nativo con un residuo no nativo de modo que haya poco o ningún efecto sobre la polaridad o carga del residuo de aminoácido en esa posición. Además, cualquier residuo nativo en el polipéptido también puede sustituirse con alanina, como se ha descrito previamente para la "mutagénesis de barrido de alanina" (véase, por ejemplo, MacLennan et al., Acta Physiol. Scand. Suppl., 643: 55-67 (1998); Sasaki y col., 1998, Adv. Biophys. 35: 1-24 (1998), que comentan la mutagénesis de exploración de alanina).
Los expertos en la técnica pueden determinar las sustituciones de aminoácidos deseadas (ya sean conservadoras o no conservadoras) en el momento en que se deseen dichas sustituciones. Por ejemplo, se pueden utilizar sustituciones de aminoácidos para identificar residuos importantes de la secuencia de péptidos, o para aumentar o disminuir la afinidad del péptido o de las moléculas de péptido conjugado con vehículo descritas en esta memoria..
Residuos que se producen de forma natural se pueden dividir en clases según las propiedades comunes de la cadena lateral:
1) hidrófoba: norleucina(Nor o Nle), Met, Ala, Val, Leu, Ile;
2) hidrófila neutra: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
3) de carácter ácido: Asp, Glu;
4) de carácter básico: His, Lys, Arg;
5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro; y
6) aromática: Trp, Tyr, Phe.
Sustituciones conservadoras de aminoácidos pueden implicar el intercambio de un miembro de una de estas clases por otro miembro de la misma clase. Las sustituciones conservadoras de aminoácidos pueden abarcar residuos de aminoácidos que se producen de forma no natural, que típicamente se incorporan mediante síntesis de péptidos química en lugar de mediante síntesis en sistemas biológicos. Estos incluyen peptidomiméticos y otras formas revertidas o invertidas de restos de aminoácidos. Las sustituciones no conservadoras pueden implicar el intercambio de un miembro de una de estas clases por un miembro de otra clase.
Al realizar cambios de este tipo, de acuerdo con determinadas realizaciones, se puede considerar el índice hidropático de los aminoácidos. A cada uno de los aminoácidos se le ha asignado un índice hidropático en función de sus características de hidrofobicidad y carga. Son: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptófano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); y arginina (-4,5).
La importancia del índice hidropático de aminoácidos para conferir una función biológica interactiva a una proteína se comprende en la técnica (véase, por ejemplo, Kyte et al., 1982, J. Mol. Biol. 157:105-131). Se sabe que determinados aminoácidos pueden sustituirse con otros aminoácidos que tienen un índice o puntuación hidropático similar y aún conservan una actividad biológica similar. Al realizar cambios basados en el índice hidropático, en determinadas realizaciones, se incluye la sustitución de aminoácidos, cuyos índices hidropáticos están dentro de ± 2. En determinadas realizaciones, se incluyen los que están dentro de ± 1, y en determinadas realizaciones se incluyen los que están dentro de ± 0,5.
La sustitución de aminoácidos similares se puede realizar de manera eficaz sobre la base de la hidrofilicidad. En determinadas realizaciones, la mayor hidrofilicidad media local de una proteína, gobernada por la hidrofilicidad de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con su inmunogenicidad y antigenicidad, es decir, con una propiedad biológica de la proteína.
Se han asignado los siguientes valores de hidrofilicidad a estos residuos de aminoácidos: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0 ± 1); glutamato (+3,0 ± 1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5 ± 1); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5) y triptófano (-3,4). Al realizar cambios basados en valores de hidrofilicidad similares, en determinadas realizaciones, se incluye la sustitución de aminoácidos, cuyos valores de hidrofilicidad están dentro de ± 2, en determinadas realizaciones, se incluyen aquellos que están dentro de ± 1, y en determinadas realizaciones, se incluyen aquellos que están dentro de ± 0,5.
Ejemplos de sustituciones conservadoras incluyen la sustitución de un residuo de aminoácido no polar (hidrófobo), tal como isoleucina, valina, leucina, norleucina, alanina o metionina con otro, la sustitución de un residuo de aminoácido polar (hidrófilo) con otro, tal como entre arginina y lisina, entre glutamina y asparagina, entre glicina y serina, la sustitución de un residuo de aminoácido de carácter básico tal como lisina, arginina o histidina con otro, o la sustitución de un residuo de carácter ácido, tal como ácido aspártico o ácido glutámico con otro. La expresión "sustitución conservadora de aminoácidos" también incluye el uso de un residuo derivatizado químicamente en lugar de un residuo no derivatizado, siempre que dicho polipéptido muestre la bioactividad requerida. Otras sustituciones de aminoácidos ejemplares que pueden ser útiles se recogen en la Tabla 2 que figura a continuación.
TABLA 2. Algunas Sustituciones de Aminoácidos Útiles
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El término "agonista" debe entenderse que se refiere a algo que puede afectar positivamente a un proceso, p. ej., activar o estimular el proceso, el proceso puede incluir, pero no se limita a, procesos químicos, bioquímicos, celulares o fisiológicos. Debe entenderse que un "agonista de APJ" se refiere a una molécula que es capaz de activar el receptor APJ. El agonista de APJ puede unirse al receptor APJ. Se proporcionan ejemplos de agonistas en varias Tablas que figura más adelante y en varias figuras, p. ej., Figuras 3 y 4. Puede referirse a un polipéptido que tiene una actividad biológica al menos equiparable a una apelina que se produce de forma natural. El término incluye, además, péptidos que potencian los efectos de la molécula que se produce de forma natural.
La secuencia agonista de APJ puede tener la siguiente fórmula:
Nx1 x W x W x V x 10x11x12x13x14x15x16x17 (SEQ ID NO: 61),
en donde:
N es un enlazador de extensión o conjugación
x1 está ausente, es un residuo de aminoácido (p. ej., básico o polar) o es un enlazador de conjugación; x2 está ausente, es un residuo de aminoácido (p. ej., no funcional o hidrófobo) o es un enlazador de conjugación;
x3 está ausente, es un residuo de aminoácido (p. ej., básico o polar) o es un enlazador de conjugación; x4 está ausente, es un residuo de aminoácido (p. ej., básico o polar) o es un enlazador de conjugación; x5 está ausente o es un residuo no funcional, hidrófobo o polar (p. ej., pE, Q, Cit, L, V, G, H o P) ; o un enlazador de conjugación;
x6 está ausente o es un residuo polar o de carácter básico (p. ej., K o Cit, R, NMeArg o hArg);
x7 es un residuo hidrófobo o no funcional (p. ej., P, Oic o G);
x8 es un residuo de carácter básico o polar (p. ej., Q o Cit, R, NMeArg o hArg);
x9 es un residuo no funcional o hidrófobo (p. ej., V, I, o L preferido, NMeLeu o Cha);
x10 es un residuo no funcional, polar o hidrófobo, o un enlazador de conjugación (p. ej., S, F y 4F-Phe); x11 es un residuo no funcional, polar, de carácter básico o hidrófobo, o un enlazador de conjugación; x12 es un residuo no funcional, hidrófobo, polar o de carácter básico;
x13 es un residuo no funcional o aromático (p. ej. G);
x14 es un residuo no funcional o hidrófobo (p. ej., P y Oic);
x15 es un residuo no funcional, polar o hidrófobo (p. ej., residuos alifáticos, aromáticos, hidrófobos); x16 es un residuo no funcional o un residuo hidrófobo (p. ej., F, 4I-Phe, 4C1-Phe, Bip, P, Oic);
x17 está ausente o es un residuo hidrófobo (p. ej., residuos aromáticos).
Como se mencionó anteriormente, un agonista puede afectar a un proceso fisiológico. Por lo tanto, un péptido modificado puede tener actividad agonista en el corazón aumentando, por ejemplo, diversos aspectos de la contractilidad, tales como dp/dt o frecuencia cardíaca.
La expresión "péptido antagonista", "antagonista peptídico" y "péptido inhibidor" debe entenderse que significa un péptido o polipéptido que bloquea o de alguna manera interfiere con la actividad biológica de un receptor de interés, o tiene una actividad biológica comparable a un antagonista o inhibidor conocido de un receptor de interés. Para un péptido antagonista de apelina, el receptor de interés es el receptor APJ.
La expresión "residuo aromático" o "aminoácido aromático" debe entenderse que significa residuos de aminoácidos en forma D o L que tienen cadenas laterales que comprenden grupos aromáticos. Residuos aromáticos ejemplares pueden incluir F, Y y W.
La expresión "residuo de carácter básico" se refiere a residuos de aminoácidos en forma D o L que tienen cadenas laterales que comprenden grupos de carácter básico. Residuos de carácter básico ejemplares pueden incluir H, K y R.
Los términos "derivatizar" y "derivado" o "derivatizado" deben entenderse que significan procesos y compuestos resultantes, respectivamente, en los que una parte de la molécula o vehículo precursor se ha modificado químicamente. Ejemplos pueden incluir: (1) un compuesto que tiene una porción cíclica; por ejemplo, reticulación entre residuos dentro del compuesto; (2) un compuesto reticulado o que tiene un sitio de reticulación; por ejemplo, el compuesto tiene un residuo cisteinilo y, por lo tanto, forma dímeros reticulados; (3) uno o más enlaces peptidilo se reemplazan por un enlace no peptidilo; (4) un extremo N se modifica con agentes capaces de reaccionar con el grupo amino; (5) el extremo C se puede reemplazar por una amida o un éster; y (6) compuestos en los que los restos de aminoácidos individuales se modifican mediante el tratamiento con agentes capaces de reaccionar con cadenas laterales o restos terminales seleccionados.
En diversas realizaciones, la porción de polipéptido y/o de vehículo de los compuestos puede derivatizarse. Derivados de este tipo pueden mejorar la solubilidad, absorción, estabilidad, semivida biológica y similares de los compuestos. Alternativamente, los restos pueden eliminar o atenuar cualquier efecto indeseable de los compuestos.
La expresión "proteína de fusión" debe entenderse que significa que la proteína incluye componentes polipeptídicos derivados de más de una proteína o polipéptido precursor. Típicamente, una proteína de fusión se expresa a partir de un gen de fusión en el que una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de polipéptidos de una proteína se adjunta en marco y, opcionalmente, se separa mediante un enlazador de una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de polipéptidos de una proteína diferente. A continuación, el gen de fusión puede expresarse mediante una célula huésped recombinante como una única proteína.
La expresión "péptidos apelina endógenos" debe entenderse que significa preproproteína apelina de longitud completa que tiene la secuencia MNLRLCVQAL LLLWLSLTAV CGGSLMPLPD GNGLEDGNVR HLVQPRGSRN GPGPWQGGRR KFRRQRPRLS HKGPMPF (SEQ ID NO: 138). Apelina (42-77) a la que también se alude como Apelina-36 que tiene la secuencia LVQPRGSRNGPGPWQG GRRKFRRQRPRLSHKGPMPF (SEQ ID NO: 1), Apelina (65-77) también conocida como Apelina-13 que tiene la secuencia QRPRLSHKGPMPF (SEQ ID NO: 2) o fragmentos de Apelina de longitud completa. A los péptidos apelina recortados también se les puede aludir como isoformas de la molécula.
La expresión "polipéptido aislado" debe entenderse que significa una molécula de polipéptido que se purifica o se separa de al menos una molécula de polipéptido contaminante con la que normalmente se asocia en la fuente natural del polipéptido. Una molécula de polipéptido aislada es diferente de la forma o el entorno en el que se encuentra en la naturaleza.
La expresión "ligando de APJ" debe entenderse que significa una molécula que se une a APJ o forma un complejo con APJ. El ligando puede ser, pero no necesariamente es una molécula desencadenante de señales. En algunos casos, el término "ligando" puede utilizarse indistintamente con agonista.
La expresión aminoácidos "no canónicos" o "no naturales" debe entenderse que significa residuos de aminoácidos en forma D o L que no se encuentran entre los 20 aminoácidos canónicos generalmente incorporados en proteínas que se producen de forma natural. Se pueden encontrar ejemplos de aminoácidos no canónicos en la Figura 1 y la Tabla 3. Pueden incorporarse residuos de aminoácidos no canónicos en un péptido empleando técnicas conocidas de manipulación de proteínas que utilizan células de expresión recombinante. (Véase, p. ej., Link et al., Non-canonical amino acids in protein engineering, Current Opinion in Biotechnology, 14(6):603-609 (2003). Ejemplos adicionales de aminoácidos no canónicos incluyen, por ejemplo, p-aminoácidos, homoaminoácidos, aminoácidos cíclicos y aminoácidos con cadenas laterales derivatizadas. Ejemplos adicionales pueden incluir (en la forma L o la forma D) palanina, ácido p-aminopropiónico, ácido piperidínico, ácido aminocaprioico, ácido aminoheptanoico , ácido aminopimélico, desmosina, ácido diaminopimélico, Na-etilglicina, Na-etilaspargina, hidroxilisina, alo-hidroxilisina, isodesmosina, alo-isoleucina, w-metilarginina, Na-metilglicina, Na-metilisoleucina, Na-metilvalina, Y-carboxiglutamato, s-N,N,N-trimetilisina, £-N-acetilisina, O-fosfoserina, Na-acetilserina, Na-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina y otros aminoácidos similares, y aquellos enumerados en la Tabla 3 que figura más adelante, y formas derivadas de cualquiera de estos como se describe en esta memoria. La Tabla 3 y la Figura 1 contienen algunos residuos de aminoácidos no canónicos ejemplares que pueden ser útiles y las abreviaturas asociadas como se utilizan típicamente en esta memoria, aunque el médico experto entenderá que diferentes abreviaturas y nomenclaturas pueden ser aplicables a la misma sustancia y aparecen indistintamente en esta memoria. Algunas secuencias de aminoácidos, como se enumeran en esta memoria, pueden incluir "{H}-" en el extremo N, que representa un grupo amino extremo N, y/o pueden incluir "-{ÁcidoLibre}" en el extremo C, que representa un grupo carboxi en el extremo C.
En el caso de que una abreviatura enumerada en la Tabla 3 difiera de otra abreviatura para la misma sustancia descrita en otra parte de esta memoria, se entiende que ambas abreviaturas son aplicables. Los aminoácidos enumerados en la Tabla 3 pueden estar en forma L o en forma D, a menos que se indique lo contrario.
TABLA 3. Ejemplos de aminoácidos no canónicos para sustitución en secuencias peptídicas.
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La expresión "residuo no funcional" o "aminoácido no funcional" debe entenderse que significa residuos de aminoácidos en forma D o L que tienen cadenas laterales que carecen de grupos de carácter ácido, de carácter básico o aromáticos. Residuos de aminoácidos no funcionales ejemplares pueden incluir M, G, A, V, I, L y norleucina (Nle).
La expresión "nanoestructura polimérica" puede entenderse que significa nanopartícula, p. ej., formulación de microesferas que contiene el polímero 50:50 de poli(D,L-lactida-co-glicolida) de Amylin (Diabetes Technol. Ther.
13:1145-1154, 2011; Endocrine J. 56:951-962, 2009 o Medincel (documento WO2012090070A2)
La expresión "sales fisiológicamente aceptables" debe entenderse que significa cualquier sal que se conozca o se descubra más tarde que sea farmacéuticamente aceptable para una formulación de los agonistas de APJ. Algunos ejemplos específicos son: acetato; trifluoroacetato; hidrohaluros, tales como hidrocloruro e hidrobromuro; sulfato; citrato; tartrato; glicolato; y oxalato. En diversas realizaciones, se contemplan sales fisiológicamente aceptables de los polipéptidos y composiciones de materia.
Debe entenderse que la expresión "resto de unión a proteínas séricas" se refiere a la unión a proteínas endógenas (nativas) que se encuentran comúnmente en la sangre en gran abundancia. La albúmina de suero humano es un ejemplo de una proteína de este tipo. La unión a moléculas de este tipo puede permitir que un fármaco adopte la farmacocinética de la proteína de unión al suero, lo cual puede ser una propiedad ventajosa.
La expresión "resto de unión a proteína de membrana" debe entenderse que se refiere a la unión a una proteína incrustada o que abarca la bicapa de lípidos celulares.
La expresión "residuo polar" o "aminoácido polar" debe entenderse que significa residuos de aminoácidos en forma D o L que tienen cadenas laterales que comprenden grupos polares. Residuos polares ejemplares pueden incluir C, S, T, N y Q.
Debe entenderse que el término "polinucleótido" o la expresión "ácido nucleico" incluye polímeros de nucleótidos tanto de cadena sencilla como de doble cadena que contienen dos o más residuos nucleotídicos. Los residuos de nucleótidos que comprenden el polinucleótido pueden ser ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. Dichas modificaciones incluyen modificaciones de base tales como derivados de bromouridina e inosina, modificaciones de ribosa, tales como 2’,3’-didesoxirribosa, y modificaciones de enlaces internucleotídicos, tales como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato y fosforamidato.
Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se utilizan indistintamente en esta memoria e incluyen dos o más aminoácidos enlazados covalentemente a través de enlaces peptídicos. Los términos no se refieren a una longitud específica del producto. Por lo tanto, "péptidos" y "oligopéptidos" se incluyen dentro de la definición de polipéptido. Los términos incluyen modificaciones pos-traduccionales del polipéptido, por ejemplo, glicosilaciones, acetilaciones, biotinilaciones, 4-pentinoilaciones, PEGilaciones, fosforilaciones y similares. Además, los fragmentos de proteínas, análogos, proteínas mutadas o variantes, proteínas de fusión y similares se incluyen dentro del significado de polipéptido. Los términos también incluyen moléculas en las que se incluyen uno o más análogos de aminoácidos o aminoácidos no canónicos o no naturales que se pueden expresar de forma recombinante utilizando técnicas de manipulación de proteínas conocidas. Además, las proteínas de fusión pueden derivatizarse tal como se describe en esta memoria mediante técnicas de química orgánica bien conocidas.
Una composición que incluye un péptido o polipéptido enlazado, fijado o unido covalentemente, ya sea directa o indirectamente a través de un resto enlazador, a otro péptido o polipéptido o a un resto que prolonga la semivida es un "conjugado" o molécula "conjugada", ya sea conjugada por medios químicos (p. ej., pos-traduccional o pos­ sintéticamente) o por fusión recombinante.
La expresión "análogo de polipéptido" o "análogo de péptido" debe entenderse que significa un polipéptido que tiene una secuencia que difiere de una secuencia de polipéptido existente en la naturaleza en al menos una sustitución de residuo de aminoácido, adición interna o deleción interna de al menos un aminoácido, y/o truncamientos o adiciones del extremo amino o carboxi, y/o amidación del carboxi-terminal. Una "deleción interna" se refiere a la ausencia de un aminoácido de una secuencia existente en la naturaleza en una posición distinta al extremo N o C. Asimismo, una "adición interna" se refiere a la presencia de un aminoácido en una secuencia que existe en la naturaleza en una posición distinta al extremo N o C.
El término "residuo" puede utilizarse indistintamente con "aminoácido".
El término "recombinante" debe entenderse que significa que el material (p. ej., un ácido nucleico o un polipéptido) ha sido alterado artificial o sintéticamente (es decir, de forma no natural) por intervención humana. La alteración se puede realizar en el material dentro o fuera de su entorno o estado natural. Por ejemplo, un "ácido nucleico recombinante" es uno que se produce recombinando ácidos nucleicos, p. ej., durante la clonación, transposición de ADN u otros procedimientos de biología molecular bien conocidos. Se encuentran ejemplos de procedimientos de biología molecular de este tipo en Maniatis et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1982). Una "molécula de ADN recombinante" se compone de segmentos de ADN unidos entre sí mediante técnicas de biología molecular .de este tipo La expresión "proteína recombinante" o "polipéptido recombinante", tal como se utiliza en esta memoria se refiere a una molécula de proteína que se expresa utilizando una molécula de ADN recombinante. Una "célula huésped recombinante" es una célula que contiene y/o expresa un ácido nucleico recombinante.
El término "vehículo" debe entenderse que significa, interalia, una molécula que previene la degradación y/o aumenta la semivida, reduce la toxicidad, reduce la inmunogenicidad o aumenta la actividad biológica de una molécula terapéutica. Vehículos ejemplares pueden incluir polímeros (p. ej., polietilenglicol (PEG); lípidos; grupo colesterol (tal como un esteroide); un hidrato de carbono u oligosacárido (p. ej., dextrano); cualquier proteína natural o sintética (p. ej., un dominio Ab o Fc); o cualquier polipéptido o péptido que se una a un receptor de rescate.
En diversas realizaciones, se proporciona una composición de materia en la que un polipéptido agonista de APJ puede fijarse a un vehículo a través del extremo N, extremo C, la cadena principal o la cadena lateral del polipéptido mediante modificación química. Por lo tanto, las moléculas de vehículo-péptido pueden describirse mediante la siguiente fórmula I:
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en donde:
V1 es un vehículo (p. ej. un PEG);
A1, A2 , A3 y A4 se seleccionan, cada uno independientemente, de -(L1)e-P1, -(L1)e-P1-(L2)f -P2 , - (L1)e-P1-(L2)f-P2-(L3)g-P3 , -(L1)e-P1-(L2)f-P2-(L3)g-P3-(L4)h-P4 , y multímeros superiores de los mismos.
P1, P2 , P3 y P4 son, cada uno independientemente, secuencias de dominios agonistas de APJ;
L1, L2 , L3 y L4 son, cada uno de ellos independientemente, enlazadores; y
a, b, c, d, e, f, g y h son, cada uno independientemente, 0 o 1, con la condición de que al menos uno de a, b y c sea 1.
Por lo tanto, el compuesto II puede comprender las fórmulas:
V1-A1
y multímeros de los mismos, en donde V1 es un PEG y está fijado, con o sin enlazador, en el extremo N de A1 ; El compuesto III puede comprender las fórmulas:
Figure imgf000015_0002
y multímeros de los mismos, en donde V1 es un PEG y está fijado, con o sin enlazador, en la cadena principal o la cadena lateral de A2;
El compuesto IV puede comprender las fórmulas:
A3-V1
y multímeros de los mismos, en donde V1 es un PEG y está fijado, con o sin enlazador, en el extremo C de A3; El compuesto V puede comprender las fórmulas:
A2-V1-A1
y multímeros de los mismos, en donde V1 es un PEG y está fijado, con o sin enlazador, en cualquier ubicación de A1 y A2;
El compuesto VI puede comprender las fórmulas
Figure imgf000015_0003
y multímeros de los mismos, en donde V1 es un PEG y está fijado, con o sin enlazador, en cualquier ubicación de A1, A2, A3 o A4;
El compuesto Vil puede comprender las fórmulas:
A A v 2
I
V 1
y multímeros de los mismos, en donde V1 y V2 son un PEG y están fijados, con o sin enlazador, en cualquier ubicación de A1.
Técnicas de expresión de proteínas y manipulación de proteínas mediadas por ADN y/o ARN recombinantes, o cualquier otro método de preparación de péptidos, son aplicables a la preparación de los polipéptidos descritos en esta memoria. Por ejemplo, los péptidos se pueden producir en células huésped transformadas. Brevemente, se prepara una molécula de ADN recombinante, o construcción, que codifica el péptido. Los métodos para preparar moléculas de ADN de este tipo son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, secuencias que codifican los péptidos se pueden escindir del ADN utilizando enzimas de restricción adecuadas. Cualquiera de un gran número de células huésped disponibles y bien conocidas puede utilizarse en la práctica de diversas realizaciones. La selección de un huésped particular depende de un cierto número de factores reconocidos por la técnica. Estos incluyen, por ejemplo, compatibilidad con el vector de expresión elegido, toxicidad de los péptidos codificados por la molécula de ADN, velocidad de transformación, facilidad de recuperación de los péptidos, características de expresión, bioseguridad y costes. Debe lograrse un equilibrio de estos factores, entendiendo que no todos los huéspedes pueden ser igualmente efectivos para la expresión de una secuencia de ADN particular. Dentro de estas pautas generales, células huésped microbianas útiles en cultivo incluyen bacterias (tales como Escherichia co lisp.), levadura (tales como Saccharomyces sp.) y otras células fúngicas, células de insectos, células vegetales, células de mamíferos (incluidas las humanas), p. ej., células CHO y células HEK293. También se pueden realizar modificaciones a nivel del ADN. La secuencia de ADN que codifica el péptido puede cambiarse por codones más compatibles con la célula huésped elegida. Para E. coli, se conocen en la técnica codones optimizados. Los codones pueden sustituirse para eliminar los sitios de restricción o para incluir sitios de restricción silenciosos, que pueden ayudar en el procesamiento del ADN en la célula huésped seleccionada. A continuación, el huésped transformado se cultiva y se purifica. Las células huésped pueden cultivarse en condiciones de fermentación convencionales para que se expresen los compuestos deseados. Condiciones de fermentación de este tipo son bien conocidas en la técnica. Además, el ADN codifica opcionalmente, además, en 5’ la región codificante de una proteína de fusión, una secuencia de péptido señal (p. ej., un péptido señal secretor) enlazada operativamente al análogo peptídico expresado. Para obtener ejemplos adicionales de métodos recombinantes apropiados y construcciones de ADN ejemplares útiles para la expresión recombinante de las composiciones por células de mamíferos, incluyendo proteínas de fusión Fc diméricas ("pepticuerpos") o inmunoglobulina quimérica (cadena ligera cadena pesada)-heterotrímeros Fc ("hemicuerpos"), véase, p. ej.,Sullivan et al., Toxin Peptide Therapeutic Agents, documento US2007/0071764 y Sullivan et al., Toxin Peptide Therapeutic Agents, documento PCT/US2007/022831, publicado como WO 2008/088422.
Las composiciones de péptidos también se pueden preparar mediante métodos sintéticos. La síntesis en fase sólida se puede utilizar como una técnica para producir péptidos individuales, ya que es el método más rentable para producir péptidos pequeños. Por ejemplo, las técnicas de síntesis en fase sólida bien conocidas incluyen el uso de grupos protectores, enlazadores y soportes de fase sólida, así como condiciones de reacción de protección y desprotección específicas, condiciones de escisión del enlazador, uso de depuradores y otros aspectos de la síntesis de péptidos en fase sólida. Técnicas adecuadas son bien conocidas en la técnica. (P. ej., Merrifield (1973), Chem. Polypeptides, pp.
335-61 (Katsoyannis y Panayotis eds.); Merrifield (1963), J. Am. Chem. Soc. 85: 2149; Davis et al. (1985), Biochem. Intl. 10: 394-414; Stewart y Young (1969), Solid Phase Peptide Synthesis; Pat. de EE.UU. N° 3.941.763; Finn et al. (1976), The Proteins (3a ed.) 2: 105-253; y Erickson et al. (1976), The Proteins (3a ed.) 2: 257-527; "Protecting Groups in Organic Synthesis," 3a Edición, T. W. Greene y P. G. M. Wuts, Eds., John Wiley & Sons, Inc., 1999; NovaBiochem Catálogo, 2000; "Synthetic Peptides, A User's Guide," G. A. Grant, Ed., W.H. Freeman & Company, Nueva York, N.Y., 1992; "Advanced Chemtech Handbook of Combinatorial & Solid Phase Organic Chemistry," W. D. Bennet, J. W. Christensen, L. K. Hamaker, M. L. Peterson, M. R. Rhodes y H. H. Saneii, Eds., Advanced Chemtech, 1998; "Principles of Peptide Synthesis, 2a ed.," M. Bodanszky, Ed., Springer-Verlag, 1993; "The Practice of Peptide Synthesis, 2a ed.," M. Bodanszky y A. Bodanszky, Eds., Springer-Verlag, 1994; "Protecting Groups," P. J. Kocienski, Ed., Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Alemania, 1994; "Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, A Practical Approach," W. C. Chan y P. D. White, Eds., Oxford Press, 2000, G. B. Fields et al., Synthetic Peptides: A User's Guide, 1990, 77-183). Para ejemplos adicionales de métodos sintéticos y de purificación conocidos en la técnica, que son aplicables a la preparación de composiciones de materia, véase, p. ej,, Sullivan et al, documento US2007/0071764 y Sullivan et al., documento PCT/US2007/022831, publicado como WO 2008/088422 A2.
Una o más modificaciones útiles de los dominios peptídicos pueden incluir adiciones o inserciones de aminoácidos, deleciones de aminoácidos, truncamientos de péptidos, sustituciones de aminoácidos y/o derivatización química de residuos de aminoácidos, realizada mediante técnicas químicas conocidas. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos así modificada incluye al menos un residuo de aminoácido insertado o sustituido en la misma, con relación a la secuencia de aminoácidos de la secuencia nativa de interés, en la que el residuo de aminoácido insertado o sustituido tiene una cadena lateral que comprende un nucleófilo. o grupo funcional reactivo electrofílico mediante el cual el péptido se conjuga covalentemente con un enlazador y/o un resto que prolonga la semivida. Ejemplos útiles de un grupo funcional reactivo nucleófilo o electrófilo de este tipo incluyen, pero no se limitan a un tiol, una amina primaria, un seleno, una hidrazida, un aldehído, un ácido carboxílico, una cetona, un aminooxi, un aldehído enmascarado (protegido), o un grupo funcional ceto enmascarado (protegido). Ejemplos de residuos de aminoácidos que tienen una cadena lateral que comprende un grupo funcional reactivo nucleófilo incluyen, pero no se limitan a un residuo de lisina, una homolisina, un residuo de ácido a, p-diaminopropiónico, un residuo de ácido a,Y-diaminobutírico, un residuo de ornitina, una cisteína, una homocisteína, un residuo de ácido glutámico, un residuo de ácido aspártico o un residuo de selenocisteína ("SeCys").
Las porciones de péptidos de las composiciones de materia también pueden derivatizarse químicamente en uno o más residuos de aminoácidos mediante técnicas de química orgánica conocidas. "Derivado químico" o "derivatizado químicamente" se refiere a un péptido objeto que tiene uno o más residuos derivatizados químicamente por reacción de un grupo lateral funcional. Moléculas derivatizadas de este tipo incluyen, por ejemplo, las moléculas en las que se han derivatizado grupos amino libres para formar hidrocloruros de amina, grupos p-toluenosulfonilo, grupos carbobenzoxi, grupos t-butiloxicarbonilo, grupos cloroacetilo o grupos formilo. Grupos carboxilo libres pueden derivatizarse para formar sales, ésteres metílicos y etílicos u otros tipos de ésteres o hidrazidas. Grupos hidroxilo libres pueden derivatizarse para formar derivados de O-acilo u O-alquilo. El nitrógeno de imidazol de la histidina puede derivatizarse para formar N-im-bencilhistidina. También se incluyen como derivados químicos los péptidos que contienen uno o más derivados de aminoácidos que se producen de forma natural de los veinte aminoácidos canónicos, ya sea en forma L o D. Por ejemplo, la prolina se puede sustituir por 4-hidroxiprolina; la lisina se puede sustituir por 5-hidroxilisina; la histidina se puede sustituir por 3-metilhistidina; la serina se puede sustituir por homoserina; y la lisina se puede sustituir por ornitina.
Derivatizaciones útiles incluyen, en algunas realizaciones, aquellas en las que el extremo amino del péptido está bloqueado químicamente de modo que se evitará que tenga lugar la conjugación con el vehículo en un grupo amino libre N-terminal. También puede haber otros efectos beneficiosos de una modificación de este tipo, por ejemplo, una reducción en la susceptibilidad del análogo de péptido a la proteólisis enzimática. El extremo N puede acilarse o modificarse para dar una amina sustituida, o derivatizarse con otro grupo funcional, tal como un resto aromático (p. ej., un ácido indol, bencilo (Bzl o Bn), dibencilo (DiBzl o Bn2) o benciloxicarbonilo (Cbz o Z)), W,W-dimetilglicina o creatina. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un resto acilo, tal como, pero no limitado a formilo, acetilo (Ac), propanoílo, butanilo, heptanilo, hexanoílo, octanoílo o nonanoílo, puede enlazarse covalentemente al extremo N-terminal. del péptido, que puede prevenir reacciones secundarias no deseadas durante la conjugación del vehículo con el péptido. Otros grupos derivados del N-terminal ejemplares incluyen -NRR1 (distinto de -NH2), -NRC(O)R1, - NRC(O)Or 1, -NRS(O)2 R1, -NHC(O)NHR1, succinimida o benciloxicarbonil-NH-(Cbz-NH-), en donde R y R1 son, cada uno independientemente, hidrógeno o alquilo inferior y en donde el anillo fenilo puede estar sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados de alquilo C1-C4 , alcoxi C1-C4 , cloro y bromo.
En algunas realizaciones, uno o más enlaces peptidil [-C(O)NR-] (enlaces) entre residuos de aminoácidos se pueden reemplazar por un enlace no peptidilo. Enlaces no peptidilo ejemplares son -CH2-carbamato [-CH2-OC(O)NR-], fosfonato, -CH2-sulfonamida [-CH2-S(O)2 NR-], urea [-NHC(O)NH-], -Ch2-amina secundaria y péptido alquilado [-C(O)NR6-, en donde R6 es alquilo inferior].
En algunas realizaciones, pueden derivatizarse uno o más residuos de aminoácidos individuales. Se sabe que diversos agentes derivatizantes reaccionan específicamente con cadenas laterales o residuos terminales seleccionados, tal como se describe en detalle más adelante a modo de ejemplo.
Los residuos de lisinilo y los residuos amino terminales se pueden hacer reaccionar con anhídridos de ácido succínico u otros anhídridos de ácido carboxílico, que invierten la carga de los residuos de lisinilo. Otros reactivos adecuados para derivatizar residuos que contienen alfa-amino incluyen imidoésteres, tales como picolinimidato de metilo; fosfato de piridoxal; piridoxal; cloroborohidruro; ácido trinitrobencenosulfónico; O-metilisourea; 2,4 pentanodiona; y reacción catalizada por transaminasas con glioxilato.
Los residuos de arginilo se pueden modificar por reacción con uno cualquiera o una combinación de varios reactivos convencionales, incluyendo fenilglioxal, 2,3-butanodiona, 1,2-ciclohexanodiona y ninhidrina. La derivatización de residuos de arginilo requiere que la reacción se realice en condiciones alcalinas debido al alto pKa del grupo funcional guanidina. Además, estos reactivos pueden reaccionar con los grupos de lisina, así como con el grupo épsilon-amino de la arginina.
Se ha estudiado extensamente la modificación específica de residuos de tirosilo, con particular interés en la introducción de marcadores espectrales en residuos de tirosilo mediante reacción con compuestos aromáticos de diazonio o tetranitrometano. Más comúnmente, se utilizan N-acetilimidizol y tetranitrometano para formar especies de O-acetil tirosilo y derivados 3-nitro, respectivamente.
Los grupos carboxilo de la cadena lateral (aspartilo o glutamilo) se pueden modificar selectivamente por reacción con carbodiimidas (R’-N=C=N-R’) tales como 1-ciclohexil-3-(2-morfolinil-(4-etil)carbodiimida o 1-etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilpentil)carbodiimida. Además, los residuos de aspartilo y glutamilo pueden convertirse en residuos de asparaginilo y glutaminilo por reacción con iones amonio.
Los residuos de glutaminilo y asparaginilo se pueden desamidar a los correspondientes residuos de glutamilo y aspartilo. Alternativamente, estos residuos se desamidan en condiciones ligeramente ácidas. Cualquiera de las formas de estos residuos cae dentro del alcance de las diversas realizaciones.
Los residuos de cisteinilo se pueden reemplazar por residuos de aminoácidos u otros restos para eliminar los enlaces disulfuro o, a la inversa, para estabilizar la reticulación. (Véase, p. ej., Bhatnagar et al., J. Med. Chem., 39:3814-3819 (1996)).
La derivatización con agentes bifuncionales es útil para reticular los péptidos o sus derivados funcionales con una matriz de soporte insoluble en agua, si se desea, o con otros vehículos macromoleculares. Agentes de reticulación comúnmente utilizados incluyen, p. ej., 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldehído, ésteres de Nhidroxisuccinimida, por ejemplo, ásteres con ácido 4-azidosalicílico, imidoésteres homobifuncionales, incluyendo ásteres de disuccinimidilo, tales como 3,3’-ditiobis(succinimidilpropionato) y maleimidas bifuncionales, tales como bis-N-maleimido-1,8-octano. Agentes derivatizantes tales como 3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato de metilo producen compuestos intermedios fotoactivables que son capaces de formar reticulaciones en presencia de luz. Alternativamente, las matrices reactivas insolubles en agua tales como hidratos de carbono activados con bromuro de cianógeno y los sustratos reactivos, p. ej., tal como se describe en las Pat. de EE.UU. N°s 3.969.287; 3.691.016; 4.195.128; 4,247,642; 4,229,537; y 4.330.440, se emplean para la inmovilización de proteínas.
Otras posibles modificaciones incluyen hidroxilación de prolina y lisina, fosforilación de grupos hidroxilo de residuos serilo o treonilo, oxidación del átomo de azufre en Cys, metilación de los grupos alfa-amino de lisina, arginina e histidina en las cadenas laterales. Creighton, Proteins: Structure and Molecule Properties (W. H. Freeman & Co., San Francisco), 79-86 (1983).
Los ejemplos anteriores de derivatizaciones no pretenden ser un tratamiento exhaustivo, sino meramente ilustrativos.
En diversas realizaciones se puede desear modular el perfil farmacocinético de un polipéptido agonista de APJ. Para que la modulación del perfil farmacocinético se ajuste a una necesidad terapéutica, diversas realizaciones pueden incluir uno o más restos que prolongan la semivida de diversas masas y configuraciones, cuyos restos o restos que prolongan la semivida se pueden fusionar, fijar, unir o conjugar covalentemente. al polipéptido. Un "resto que prolonga la semivida" se refiere a una molécula que previene o mitiga la degradación in vivo por proteólisis u otra modificación química que disminuya la actividad, aumenta la semivida in vivo o in vitro u otras propiedades farmacocinéticas, tales como, pero no limitadas a disminuir la tasa de aclaramiento renal o hepático, aumentar la tasa de absorción, reducir la toxicidad, reducir la inmunogenicidad, mejorar la solubilidad, aumentar la actividad biológica y/o la selectividad de la diana del análogo peptídico con respecto a una diana de interés y/o aumenta la capacidad de producción, en comparación con una forma no conjugada del análogo polipeptídico. El resto que prolonga la semivida puede ser uno que sea farmacéuticamente aceptable.
El resto que prolonga la semivida media puede seleccionarse de modo que un polipéptido o una composición descritos en esta memoria puedan alcanzar un tamaño hidrodinámico suficiente para evitar el aclaramiento por filtración renal in vivo. Por ejemplo, se puede seleccionar un resto que prolongue la semivida que sea una macromolécula polimérica, que sea sustancialmente de cadena lineal, de cadena ramificada (br) o dendrítica. Alternativamente, se puede seleccionar un resto que prolongue la semivida de modo que, in vivo, el polipéptido o la composición de materia se una a una proteína del suero para formar un complejo, de modo que el complejo así formado evite un aclaramiento renal sustancial. El resto que prolonga la semivida puede ser, por ejemplo, un lípido; un grupo de colesterol (tal como un esteroide); un hidrato de carbono u oligosacárido; un polímero; o cualquier proteína, polipéptido o péptido natural o sintético que se una a un receptor de rescate.
Restos que prolongan la semivida ejemplares que se pueden utilizar pueden incluir un dominio Fc de inmunoglobulina, o una porción del mismo, o un polímero o copolímero biológicamente adecuado, por ejemplo, un compuesto de polialquilenglicol, tal como un polietilenglicol (PEG) o un polipropilenglicol. Otros compuestos de polialquilenglicol apropiados incluyen, pero no se limitan a polímeros cargados o neutros de los siguientes tipos: dextrano, polilisina, ácidos colomínicos u otros polímeros basados en hidratos de carbono, polímeros de aminoácidos y derivados de biotina. En algunas proteínas de fusión o conjugadas monoméricas, se puede utilizar una inmunoglobulina (incluyendo cadenas ligeras y pesadas) o una porción de las mismas, tales como un resto que prolonga la semivida, preferiblemente una inmunoglobulina de origen humano, e incluyendo cualquiera de las inmunoglobulinas, tales como, pero no limitadas a IgG 1, IgG2, IgG3 o IgG4.
Otros ejemplos del resto que prolonga la semivida incluyen un copolímero de etilenglicol, un copolímero de propilenglicol, una carboximetilcelulosa, una polivinilpirrolidona, un poli-1,3-dioxolano, un poli-1,3,6-trioxano, un copolímero de etileno y anhídrido maleico, un poliaminoácido (p. ej., polilisina o poliornitina), una dextrano n-vinil pirrolidona, una poli n-vinil pirrolidona, un homopolímero de propilenglicol, un polímero de óxido de propileno, un polímero de óxido de etileno, un poliol polioxietilado, un poli(alcohol vinílico), una cadena glicosilada lineal o ramificada, un poliacetal, un ácido graso de cadena larga, un grupo alifático hidrófobo de cadena larga o un ácido polisiálico (p. ej., tecnología PolyXen™; Gregoriadis et al., Improving the therapeutic efficacy of peptides and proteins: a role for polysialic acids, Intl. J. Pharmaceutics, 300:125-30 (2005)).
El resto que prolonga la semivida puede ser una entidad química cargada aniónicamente, enlazada covalentemente al extremo N-terminal del análogo peptídico, cuyas entidades químicas cargadas aniónicamente incluyen, pero no se limitan a fosfotirosina, fosfoserina, p-fosfono(difluorometil)-fenilalanina (Pfp), p-fosfono-metil-fenilalanina (Pmp), pfosfatidil-fenilalanina (Ppa) o p-fosfono-metilceto-fenilalanina (Pkp), que pueden enlazarse covalentemente al extremo N del análogo peptídico, opcionalmente de forma indirecta, a través de un enlazador AEEA u otro enlazador tal como se describe en esta memoria. (Véase, Chandy et al.)
El resto que prolonga la semivida puede incluir ligandos peptídicos o ligandos de moléculas pequeñas (orgánicas) que tienen afinidad de unión por una proteína sérica de semivida larga en condiciones fisiológicas de temperatura, pH y fuerza iónica. Ejemplos incluyen un péptido de unión a albúmina o ligando de molécula pequeña, un péptido de unión a transtiretina o ligando de molécula pequeña, un péptido de unión a globulina de unión a tiroxina o ligando de molécula pequeña, un péptido de unión a anticuerpo o ligando de molécula pequeña, u otro péptido o ligando de molécula pequeña que tiene afinidad por una proteína sérica de semivida prolongada. (Véase, p. ej., Blaney et al., Method and compositions for increasing the serum half-life of pharmacologically active agents by binding to transthyretin-selective ligands, Patente de EE.UU. N° 5.714.142; Sato et al., Serum albumin binding moieties, documento US 2003/0069395 A1; Jones et al., Pharmaceutical active conjugates Patente de EE.UU. N° 6.342.225).
Una "proteína sérica de semivida prolongada" es una de los cientos de proteínas diferentes disueltas en el plasma sanguíneo de los mamíferos, incluyendo las denominadas "proteínas de soporte" (tales como albúmina, transferrina y haptoglobina), fibrinógeno y otros factores de coagulación sanguínea, componentes del complemento, inmunoglobulinas, inhibidores de enzimas, precursores de sustancias, tales como angiotensina y bradiquinina y muchos otros tipos de proteínas. Diversas realizaciones pueden abarcar el uso de cualquier especie única de resto que prolonga la semivida farmacéuticamente aceptable, tales como, pero no limitados a los descritos en esta memoria, o el uso de una combinación de dos o más restos que prolongan la semivida diferentes, tales como PEG y dominio Fc de inmunoglobulina o una porción del mismo (véase, p. ej., Feige et al., Modified peptides as therapeutic agents, Patente de EE.UU. N° 6.660.843), tal como un dominio CH2 de Fc, albúmina (p. ej., albúmina de suero humano (HSA); véase, p. ej., Rosen et al., Albumin fusion proteins, Patente de EE.UU. N° 6,926,898 y documento US 2005/0054051; Bridon et al., Protection of endogenous therapeutic peptides from peptidase activity through conjugation to blood components, documento US 6,887,470), una transtiretina (TTR; véase, p. ej., Walker et al.,Use of transthyretin peptide/protein fusions to increase the serum half-life of pharmacologically active peptides/proteins, documentos US 2003/0195154 A1; 2003/0191056 A1), o una globulina de unión a tiroxina (TBG), o una combinación tal como inmunoglobulina (cadena ligera cadena pesada) y dominio Fc (la combinación heterotrimérica un denominado "hemicuerpo"), por ejemplo, como se describe en Sullivan et al., Toxin Peptide Therapeutic Agents, documento PCT/US2007/022831, publicado como WO 2008/088422.
La conjugación del o de los análogos de péptido con el resto o restos que prolongan la semivida, puede ser a través del extremo N y/o el extremo C del péptido, o puede ser intercalar en cuanto a su secuencia de aminoácidos primaria, estando F1 enlazado más cerca del extremo N del análogo peptídico.
Restos que prolongan la semivida particularmente útiles incluyen inmunoglobulinas (p. ej., inmunoglobulina humana, incluyendo IgG 1, IgG2, IgG3 o IgG4). El término "inmunoglobulina" abarca anticuerpos completos que comprenden dos cadenas pesadas (HC) dimerizadas, cada una enlazada covalentemente a una cadena ligera (LC); una única cadena pesada de inmunoglobulina no dimerizada y cadena ligera enlazada covalentemente (HC LC); o un heterotrímero de inmunoglobulina quimérico (cadena ligera cadena pesada)-Fc (un denominado "hemicuerpo").
A la prolongación de la semivida del agonista de APJ no degradado también se le puede aludir como "estabilidad".incrementada. En diversas circunstancias, se puede imaginar que la modificación del péptido, p. ej., la adición de una molécula de PEG, podría prolongar la semivida de un fragmento degradado de la molécula de apelina endógena, lo que no necesariamente puede conducir a una estabilidad incrementada de la apelina bioactiva. También puede entenderse que estabilidad incrementada significa un aclaramiento reducido del agonista o una exposición global incrementada del agonista o un agonista con una modificación o combinación de modificaciones que reduce la velocidad de degradación metabólica con relación al agonista no modificado. La estabilidad incrementada puede prolongar la semivida del agonista en matrices biológicas tales como plasma y homogeneizados de tejidos in vitro y prolongar los tiempos de permanencia en plasma in vivo. Tiempos de permanencia en plasma in vivo deben entenderse en el sentido de circulación de tiempo de vida de la entidad intacta fármaco peptídico administrado a un animal. Tiempos de permanencia en plasma in vivo deben entenderse en el sentido de circulación de tiempo de vida de la entidad intacta fármaco peptídico después de la adición en medio biológico.
Modificaciones del agonista de APJ también pueden conducir a una "potencia" incrementada de la molécula, p. ej., mejorando las propiedades farmacodinámicas o farmacodinámicas de la molécula. También puede entenderse que una potencia incrementada significa un agonista con una modificación o combinación de modificaciones que reduce la velocidad de degradación metabólica en relación con el agonista no modificado. La estabilidad incrementada puede prolongar la semivida del agonista en matrices biológicas tales como plasma y homogeneizados de tejidos in vitro y prolongar los tiempos de permanencia en plasma in vivo. Puede entenderse, además, que una potencia incrementada significa una afinidad y/o eficacia incrementadas del receptor.
Una "región Fc", o utilizado indistintamente en esta memoria, "dominio Fc" o "dominio Fc de inmunoglobulina", contiene dos fragmentos de cadena pesada, que en un anticuerpo completo comprenden los dominios ch1 y ch2 del anticuerpo. Los dos fragmentos de la cadena pesada se mantienen unidos por dos o más enlaces disulfuro y por interacciones hidrófobas de los dominios ch3.
Como se señaló arriba, también se pueden utilizar restos que prolongan la semivida del polímero. Actualmente están disponibles diversos medios para fijar restos químicos útiles como restos que prolongan la semivida, véase, p. ej., la Publicación Internacional del Tratado de Cooperación de Patentes ("PCT") N° WO 96/11953, titulada "N-Terminally Chemically Modified Protein Compositions and Methods," Esta publicación PCT describe, entre otras cosas, la fijación selectiva de polímeros hidrosolubles al ligando de APJ.
En algunas realizaciones, el resto que prolonga la semivida del polímero es polietilenglicol (PEG), enlazado covalentemente en el extremo N, el extremo C o en una o más cadenas laterales intercalares del agonista de APJ. En algunas realizaciones, la composición de materia puede incluir, además, uno o más restos de PEG conjugados con un resto no PEG que prolonga la semivida o con el agonista de APJ, o con cualquier combinación de cualquiera de estos. Por ejemplo, un dominio Fc o una parte del mismo se puede hacer mono-PEGilado, di-PEGilado o de otro modo multi-PEGilado, mediante el proceso de conjugación covalente.
La conjugación covalente de proteínas y péptidos con poli(etilenglicol) (PEG) puede prolongar significativamente las semividas circulantes in vivo. Se cree que la PEGilación logra este efecto predominantemente retardando el aclaramiento renal, ya que el resto de PEG añade un radio hidrodinámico considerable a la molécula. (Zalipsky, S., et al., Use of functionalized poly(ethylene glycol)s for modification of polypeptides., in poly(ethylene glycol) chemistry: Biotechnical and biomedical applications., J.M. Harris, Ed., Plenum Press: Nueva York., 347-370 (1992)). Beneficios adicionales conferidos a menudo por la PEGilación de proteínas y péptidos incluyen una solubilidad, resistencia a la degradación proteolítica incrementadas y una inmunogenicidad reducida del polipéptido terapéutico. Los méritos de la PEGilación de proteínas se evidencian por la comercialización de varias proteínas PEGiladas que incluyen PEG-Adenosina desaminasa (Adagen™/Enzon Corp.), PEG-L-asparaginasa (Oncaspar™/Enzon Corp.), PEG-Interferón a-2b (PEG-Intron™/Schering/Enzon), PEG-Interferón a-2a (PEGASYS™/Roche) y PEG-G-CSF (Neulasta™/Amgen), así como muchos otros en ensayos clínicos.
Por "péptido PEGilado", "polipéptido PEGilado" o "proteína PEGilada" se entiende un péptido que tiene un resto de polietilenglicol (PEG) unido covalentemente a un residuo de aminoácido del propio péptido o a un enlazador peptidilo o no peptidilo que está unido covalentemente a un residuo del péptido, ya sea directa o indirectamente a través de otro resto enlazador. Un ejemplo no limitante es la conjugación N-terminal del péptido con 3-(1-(1-bromo-2-oxo-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-undecaoxa-3-azaoctatriacontan-38-il)-1 H-1,2,3-triazol-4-il)propanoílo (designado en esta memoria por la abreviatura "{bromoacetamida-PEG11 -triazol} -").
Por "polietilenglicol" o "PEG" se entiende un compuesto de polialquilenglicol o un derivado del mismo, con o sin agentes de acoplamiento o derivatización con restos de acoplamiento o activación (p. ej., con aldehído, hidroxisuccinimidilo, hidrazida, tiol, triflato, tresilato, azirdina, oxirano, disulfuro de ortopiridilo, vinilsulfona, yodoacetamida o un resto maleimida). De acuerdo con diversas realizaciones, PEG útil incluye PEG de cadena lineal, sustancialmente lineal, PEG ramificado (brPEG) o PEG dendrítico. (Véase, p. ej., Merrill, Patente de EE.UU. N° 5.171.264; Harris et al., Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces, Patente de EE.UU. N° 5.932.462; Shen, N-maleimidyl polymer derivatives, Patente de EE.UU. N° 6.602.498).
Brevemente, los grupos PEG generalmente se pueden fijar a la porción peptídica de la composición mediante acilación o alquilación (o aminación reductora) a través de un grupo reactivo en el resto PEG (p. ej., un grupo aldehído, amino, tiol o éster) a un grupo reactivo en el compuesto (p. ej., un grupo aldehído, amino o éster). Una estrategia útil para la PEGilación de péptidos sintéticos consiste en combinar, a través de la formación de un enlace conjugado en solución, un péptido y un resto de PEG, portando cada uno una funcionalidad especial que es mutuamente reactiva con el otro. Los péptidos se pueden preparar fácilmente con síntesis en fase sólida convencional. Los péptidos se pueden «preactivar» con un grupo funcional apropiado en un sitio específico. Los precursores se purifican y caracterizan completamente antes de reaccionar con el resto de PEG. El ligamiento del péptido con PEG tiene lugar habitualmente en fase acuosa y puede controlarse fácilmente mediante HPLC analítica de fase inversa. Los péptidos PEGilados pueden purificarse fácilmente mediante HPLC preparativa y caracterizarse mediante HPLC analítica, análisis de aminoácidos y espectrometría de masas con desorción láser.
El PEG es un polímero hidrosoluble bien conocido que está disponible comercialmente o se puede preparar mediante polimerización de etilenglicol con apertura de anillo de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica (Sandler y Karo, Polymer Synthesis, Academic Press, Nueva York, Vol. 3, páginas 138-161). En la solicitud, el término "PEG" se utiliza ampliamente para abarcar cualquier molécula de polietilenglicol, en forma mono-, bi- o poli-funcional, sin tener en cuenta el tamaño o la modificación en un extremo del PEG, y se puede representar por la fórmula:
X-O(CH2CH2O)n-R, (I)
en que n es 3 a 2300 y X es H o una modificación terminal, p. ej., un metilo o alquilo C1-4, y R es el resto reactivo utilizado para la fijación covalente.
En algunas realizaciones, se puede utilizar un PEG que termine en un extremo con hidroxi o metoxi, es decir, X es H o CH3 ("metoxi PEG"). Se observa que el otro extremo del PEG, que se muestra en la fórmula (I) terminando en R, se fija covalentemente a un resto activador mediante un enlace éter oxígeno, un enlace amina o un enlace amida. Cuando se utiliza en una estructura química, el término "PEG" incluye la fórmula (I) anterior sin el hidrógeno del grupo hidroxilo mostrado, dejando el oxígeno disponible para reaccionar con un átomo de carbono libre de un enlazador para formar un enlace éter. Más específicamente, con el fin de conjugar PEG con un péptido, el péptido debe reaccionar con PEG en una forma "activada". El PEG activado se puede representar mediante la fórmula:
(PEG)-(A) (II)
en que PEG (definido supra) se fija covalentemente a un átomo de carbono del resto de activación (A) para formar un enlace éter, un enlace amina o un enlace amida, y (A) contiene un grupo reactivo que puede reaccionar con un grupo amino, azido, alquino, imino, maleimido, N-succinimidilo, carboxilo, aminooxi, seleno o tiol en un residuo de aminoácido de un péptido o un resto enlazador fijado covalentemente al péptido, p. ej., el agonista de APJ.
A continuación se muestran ejemplos de diversos PEG.
Aminoalquilo PEG
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Tiol PEG
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Ácido carboxílico PEG
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Hidrazida PEG
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Azido PEG
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Mesilato y tosilato PEGs
Maleimida PEGs
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p-nitrofenil carbonato PEG
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NHS carbonato PEG
Ésteres NHS activos
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Yodoacetamida PEG
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Disulfuro de orto-piridilo PEG
Alquino PEG
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Técnicas para la preparación de PEG activado y su conjugación con péptidos biológicamente activos son bien conocidas en la técnica. (P. ej., véanse las Pat. de EE.UU. N°s 5.643.575, 5.919.455, 5.932.462 y 5.990.237; Kinstler et al., N-terminally chemically modified protein compositions and methods, Patentes de EE.UU. N°s 5.985.265 y 5.824.784; Thompson et al., PEGylation of polypeptides, documento EP 0575545 B1; Petit, Site specific protein modification, Patentes de eE.UU. N°s 6.451.986 y 6.548.644; S. Herman et al., Poly(ethylene glycol) with reactive endgroups: I. Modification of proteins, J. Bioactive Compatible Polymers, 10:145-187 (1995); Y. Lu et al., PEGylated peptides III: Solid-phase synthesis with PEGylating reagents of varying molecular weight: synthesis of multiply PEGylated peptides, Reactive Polymers, 22:221-229 (1994); A.M. Felix et al., PEGylated Peptides IV: Enhanced biological activity of site-directed PEGylated GRF analogs, Int. J. Peptide Protein Res., 46:253-264 (1995); A.M. Felix, Site-specific poly(ethylene glycol)ylation of peptides, ACS Symposium Series 680(poly(ethylene glycol)): 218-238 (1997); Y. Ikeda et al., Polyethylene glycol derivatives, their modified peptides, methods for producing them and use of the modified peptides, documento EP 0473084 B1; G.E. Means et al., Selected techniques for the modification of protein side chains, en: Chemical modification of proteins, Holden Day, Inc., 219 (1971)).
El PEG activado, tales como PEG-aldehídos o hidratos de PEG-aldehído, puede sintetizarse químicamente por medios conocidos u obtenerse de fuentes comerciales, p. ej. Shearwater Polymers, (Huntsville, Al) o Enzon, Inc. (Piscataway, NJ).
Un ejemplo de un PEG activado útil puede ser un compuesto de PEG-aldehído (p. ej., un metoxi-PEG-aldehído), tal como PEG-propionaldehído, que está disponible comercialmente de Shearwater Polymers (Huntsville, Al). El PEG-propionaldehído está representado por la fórmula PEG-CH2CH2CHO. (Véase, p. ej., la Pat. de EE.UU. N° 5.252.714). También se incluyen dentro del significado de «compuesto de PEG-aldehído» los hidratos de PEG-aldehído, p. ej., PEG acetaldehído hidrato y PEG bis aldehído hidrato, este último que produce una estructura activada bifuncionalmente. (Véase., p. ej., Bentley et al., Poly(ethylene glycol) aldehyde hydrates and related polymers and applications in modifying amines, Patente de EE.UU. N° 5.990.237) (Véase., p. ej., Bentley et al., Poly(ethylene glycol) aldehyde hydrates and related polymers and applications in modifying amines, Patente de EE.UU. N° 5.990.237). Puede utilizarse un compuesto de PEG-aldehído multi-ramificado activado (derivados de PEG que comprenden múltiples brazos para dar construcciones divalentes, trivalentes, tetravalentes y octavalentes). Utilizando un derivado de PEG de 4 brazos, se pueden fijar cuatro (4) agonistas de APJ a cada una de las moléculas de PEG. Por ejemplo, el agonista de APJ se puede conjugar con un polietilenglicol (PEG) en 1, 2, 3 o 4 sitios funcionalizados con amino del PEG.
Al estar conjugado, el polietilenglicol (PEG), tal como se describe en esta memoria, se une covalentemente mediante la alquilación de un tiol presente en el péptido o se une covalentemente mediante una reacción de cicloadición entre restos azido y alquino presentes en el PEG y el péptido. Alternativamente, el PEG se puede unir covalentemente mediante aminación reductora directamente a al menos un resto de amina libre expuesto al disolvente de un residuo de aminoácido del propio agonista de APJ. En algunas realizaciones, el agonista de APJ se puede conjugar con un PEG en una o más aminas primarias o secundarias en el análogo peptídico, o con dos grupos PEG en un solo sitio de amina primaria en el análogo peptídico (p. ej., esto puede ocurrir cuando la reacción de aminación reductora implica la presencia de un exceso de compuesto de PEG-aldehído). Se ha observado que cuando la PEGilación por aminación reductora está en una amina primaria en el péptido, no es raro tener cantidades (intervalo de 1 a 100%) de producto de reacción que tienen dos o más PEG presentes por molécula y, si se desea, el producto de PEGilación es uno con solo un PEG por molécula, entonces esta "sobre-PEGilación" puede ser indeseable. Cuando se desea un producto PEGilado con un solo PEG por molécula de producto de PEGilación, se puede emplear una realización que implique la PEGilación utilizando aminas secundarias del péptido farmacológicamente activo, porque solo se transferirá un grupo PEG por molécula en la reacción de aminación reductora.
Residuos de aminoácidos que pueden proporcionar un resto de amina primaria incluyen residuos de lisina, homolisina, ornitina, ácido a,p-diaminopropiónico (Dap), y ácido a,p-diaminopropionoico (Dpr) y ácido a,Y-diaminobutírico (Dab), ácido aminobutírico (Abu) y ácido a-amino-isobutírico (Aib). El extremo N del polipéptido también proporciona un grupo a-amino útil para la PEGilación. Los residuos de aminoácidos que pueden proporcionar un resto de amina secundaria incluyen s-N-alquil lisina, a-N-alquil lisina, 5-N-alquil ornitina, a-N-alquil ornitina o una prolina N-terminal, en que el alquilo es C1 a C6..
Otro PEG activado útil para generar los análogos PEGilados es un compuesto de PEG-maleimida, tal como, pero no limitado a una metoxi PEG-maleimida, tal como maleimido monometoxi PEG, que son particularmente útiles para generar péptidos conjugados con PEG. (P.ej., Shen, W-maleimidyl polymer derivatives, Patente de EE.UU. N° 6.602.498; C. Delgado et al., The uses and properties of PEG-linked proteins., Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems, 9:249-304 (1992); S. Zalipsky et al., Use of functionalized poly(ethylene glycol)s for modification of polypeptides, en: Poly(ethylene glycol) chemistry: Biotechnical and biomedical applications (J.M. Harris, Editor, Plenum Press: Nueva York, 347-370 (1992); S. Herman et al., Poly(ethylene glycol) with reactive endgroups: I. Modification of proteins, J. Bioactive Compatible Polymers, 10:145-187 (1995); P.J. Shadle et al., Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1, Patente de EE.UU. N° 4.847.325; G. Shaw et al., Cysteine added variants IL-3 and chemical modifications thereof, Patente de EE.UU. N° 5.166.322 y documento e P 0469074 B1; G. Shaw et al., Cysteine added variants of EPO and chemical modifications thereof, documento EP 0668353 A1; G. Shaw et al., Cysteine added variants G-CSF and chemical modifications thereof, documento EP 0668354 A1; N.V. Katre et al., Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof, Patente de EE.UU. N° 5.206.344; R.J. Goodson y N.V. Katre, Site-directed pegylation of recombinant interleukin-2 at its glycosylation site, Biotechnology, 8:343-346 (1990)).
Una poli(etilenglicol) vinil sulfona es otro PEG activado útil para generar los agonistas de APJ conjugados con PEG mediante conjugación en residuos de aminoácidos tiolados, p. ej., en residuos C. (P. ej., M. Morpurgo et al., Preparation and characterization of poly(ethylene glycol) vinyl sulfone, Bioconj. Chem., 7: 363-368 (1996); véase también Harris, Functionalization of polyethylene glycol for formation of active sulfone-terminated PEG derivatives for binding to proteins and biologically compatible materials, Patentes de EE.UU. N°s 5.446.090; 5.739.208; 5.900.461; 6.610.281 y 6.894.025; y Harris, Water soluble active sulfones of poly(ethylene glycol), documento WO 95/13312 A1). Otra forma activada de PEG que es útil de acuerdo con diversas realizaciones es un compuesto de éster de PEG-N-hidroxisuccinimida, por ejemplo, éster de metoxi PEG-N-hidroxisuccinimidilo (NHS).
También son útiles las formas de PEG activadas heterobifuncionalmente. (Véase, p. ej., Thompson et al.,PEGylation reagents and biologically active compounds formed therewith, Patente de EE.UU. N° 6.552.170).
En aún otras realizaciones de producir una composición de materia, el agonista de APJ se hace reaccionar mediante técnicas químicas conocidas con un compuesto de PEG activado, tal como, pero no limitado a un compuesto de PEG activado por tiol, un compuesto de PEG activado por diol, un compuesto de PEG-hidrazida, un compuesto de PEG-oxiamina o un compuesto de PEG-bromoacetilo. (Véase, p. ej., S. Herman, Poly(ethylene glycol) with Reactive Endgroups: I. Modification of Proteins, J. Bioactive and Compatible Polymers, 10:145-187 (1995); S. Zalipsky, Chemistry of Polyethylene Glycol Conjugates with Biologically Active Molecules, Advanced Drug Delivery Reviews, 16:157-182 (1995); R. Greenwald et al., Poly(ethylene glycol) conjugated drugs and prodrugs: a comprehensive review, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 17:101-161 (2000)).
En otra realización, el PEG activado para generar un agonista de APJ conjugado con PEG puede ser un PEG multivalente que tiene más de un residuo activado. Restos de PEG multivalentes pueden incluir, pero no se limitan a los que se muestran a continuación en la Tabla 4:
TABLEE Multivalent PEG
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En aún otras realizaciones, el agonista de APJ puede hacerse reaccionar mediante técnicas químicas conocidas con un compuesto de PEG multi-ramificado activado (derivados de PEG que comprenden múltiples brazos para dar construcciones divalentes, trivalentes, tetravalentes, octavalentes), tales como, pero no limitados a pentaeritritol tetraéter de polietilenglicol. Funcionalización y derivados activados, tales como, pero no limitados a N-succinimidiloxicarbonil)propilo, p-nitrofeniloxicarbonilo, (-CO2-p-C6H4NO2), 3-(N-maleimido)propanamido, 2-sulfaniletilo y 3-aminopropilo. Utilizando un derivado de PEG de 4 brazos, se pueden fijar cuatro análogos peptídicos a cada una de las moléculas de PEG. Por ejemplo, el agonista de APJ se puede conjugar con un polietilenglicol (PEG) en
(a) 1, 2, 3 o 4 sitios funcionalizados con amino del PEG;
(b) 1, 2, 3 o 4 sitios funcionalizados con tiol del PEG;
(c) 1, 2, 3 o 4 sitios funcionalizados con maleimido del PEG;
(d) 1, 2, 3 o 4 sitios funcionalizados con N-succinimidilo del PEG;
(e) 1, 2, 3 o 4 sitios funcionalizados con carboxilo del PEG;
(f) 1,2, 3 o 4 sitios funcionalizados con p-nitrofeniloxicarbonilo del PEG;
(g) 1,2, 3 o 4 sitios funcionalizados con azido del PEG;
(h) 1,2, 3 o 4 sitios funcionalizados con alqueno del PEG; o
(i) 1,2, 3 o 4 sitios funcionalizados con haluro o haluro-acetilamida del PEG.
El tamaño práctico más pequeño de PEG es de aproximadamente 500 Dalton (Da), por debajo del cual PEG se vuelve tóxico. Por encima de aproximadamente 500 Da, se puede utilizar cualquier masa molecular para un PEG según se desee en la práctica, p. ej., de aproximadamente 500 Dalton (Da) a 100.000 Da (n es 10 a 2300). El número de monómeros de PEG (n) se aproxima a partir de la masa molecular media utilizando un PM = 44 Da para cada uno de los monómeros. En algunas realizaciones, la masa molecular promedio combinada o total de PEG utilizado en un agonista de APJ conjugado con PEG puede ser de aproximadamente 500 Da a 10.000 Da (n total es de 10 a 230), o de aproximadamente 10.000 a 40,000 Da (n total es de 230 a 910), o de aproximadamente 40.000 a 100.000 Da (n total es de 910 a 2300).
En diversas otras realizaciones, la masa molecular combinada de la molécula de PEG no debería exceder de aproximadamente 100.000 Da. En algunas realizaciones, la masa molecular promedio combinada o total de PEG utilizado en un agonista de APJ conjugado con PEG puede ser de aproximadamente 3.000 Da a 60.000 Da (n total es de 70 a 1.400), de aproximadamente 10.000 Da a 40.000 Da (n total es de aproximadamente 230 a aproximadamente 910). En otras realizaciones, la masa combinada de PEG es de aproximadamente 20.000 Da a 30.000 Da (n total es de aproximadamente 450 a aproximadamente 680).
Se apreciará que se pueden producir "multímeros" de la composición de materia, ya que el resto que prolonga la semivida empleado para la conjugación del agonista de APJ (con o sin un resto de enlazador intermedio) puede ser multivalente (p. ej., bivalente, trivalente, tetravalente o una valencia de orden superior) en cuanto al número de residuos de aminoácidos en los que se puede conjugar el resto que prolonga la semivida. En algunas realizaciones, el péptido puede ser multivalente (p. ej., bivalente, trivalente, tetravalente o una valencia de orden superior) y, por lo tanto, algunos "multímeros" pueden tener más de un resto que prolonga la semivida. En consecuencia, es posible producir una diversidad de estructuras peptídicas de restos que prolongan la semivida conjugados. A modo de ejemplo, un resto univalente que prolonga la semivida y un péptido univalente pueden producir un conjugado 1:1; un péptido bivalente y un resto que prolonga la semivida univalente pueden formar conjugados en los que los conjugados de péptidos portan dos restos del resto que prolonga la semivida, mientras que un resto bivalente que prolonga la semivida y un péptido univalente pueden producir especies en las que dos entidades peptídicas están enlazadas a un resto único que prolonga la semivida; el uso de un resto que prolonga la semivida de valencia superior puede conducir a la formación de agrupaciones de entidades peptídicas unidas a un único resto que prolonga la semivida, mientras que péptidos de valencia superior pueden incrustarse con una pluralidad de restos que prolongan la semivida. A modo de ejemplo adicional, si el sitio de conjugación de un resto que prolonga la semivida multivalente al agonista de APJ es una cisteína u otro aminotiol, pueden emplearse los métodos descritos por D’Amico et al. (D’Amico et al., Method of conjugating aminothiol containing molecules to vehicles, publicado como documento US 2006/0199812).
Los restos de péptidos pueden tener más de un grupo reactivo que reaccionará con el resto que prolonga la semivida activado y siempre debe considerarse la posibilidad de formar estructuras complejas; cuando se desee formar estructuras simples tales como aductos 1:1 del resto que prolonga la semivida y péptido, o utilizar el resto bivalente que prolonga la semivida para formar aductos de péptido:resto que prolonga la semivida:péptido, será beneficioso utilizar relaciones predeterminadas de resto activado que prolonga la semivida y material peptídico, concentraciones predeterminadas de los mismos y llevar a cabo la reacción bajo condiciones predeterminadas (tales como duración, temperatura, pH, etc.) para formar una proporción del producto descrito y luego separar el producto descrito de los otros productos de reacción. Las condiciones de reacción, proporciones y concentraciones de los reactivos pueden obtenerse mediante experimentos de prueba y error relativamente sencillos que están dentro de la capacidad de un experto ordinario en la materia con el aumento apropiado según sea necesario. La purificación y separación de los productos se consigue de forma similar mediante técnicas convencionales bien conocidas por los expertos en la técnica.
Adicionalmente, sales fisiológicamente aceptables del resto que prolonga la semivida fusionadas o conjugadas con el agonista de APJ también están abarcadas por diversas realizaciones descritas en esta memoria.
Los restos que prolongan la semivida arriba descritos y otros restos que prolongan la semivida descritos en esta memoria son útiles, ya sea individualmente o en combinación, y como se describe adicionalmente en la técnica, por ejemplo, en Sullivan et al., Toxin Peptide Therapeutic Agents, documento US2007/0071764 y Sullivan et al., Toxin Peptide Therapeutic Agents, documento PCT/US2007/022831, publicado como WO 2008/088422. Diversas realizaciones abarcan el uso de cualquier especie única de resto que prolonga la semivida farmacéuticamente aceptable, tal como, pero no limitado a los descritos en esta memoria, en conjugación con el análogo peptídico, o el uso de una combinación de dos o más restos que prolongan la semivida similares o diferentes.
Un "enlazador" o "resto enlazador" es opcional en los polipéptidos y/o las composiciones de materia descritas en esta memoria. Cuando está presente, su estructura química no es crítica, ya que sirve principalmente como medio de unión covalente del agonista APJ a un vehículo. El enlazador, p. ej., puede consistir en un tioéter, amina, imina, amida, triazol, disulfuro o un enlace carbono-carbono. Por lo tanto, en diversas realizaciones, p. ej., un tioéter puede unir el vehículo al agonista de APJ.
El "enlazador" o "resto enlazador'' puede ser un grupo orgánico peptidilo o no peptidilo biológicamente aceptable, que está unido covalentemente a un residuo de aminoácido de un agonista de APJ u otra cadena polipeptídica (p. ej., un dominio HC o LC de inmunoglobulina o dominio Fc de inmunoglobulina) contenido en una composición, cuyo resto enlazador une o conjuga covalentemente el análogo peptídico u otra cadena polipeptídica con otro péptido o cadena polipeptídica en la composición, o con un resto que prolonga la semivida. En algunas realizaciones, un resto que prolonga la semivida, tal como se describe en esta memoria, se conjuga, es decir, se une covalentemente de forma directa a un residuo de aminoácido del propio agonista de APJ u, opcionalmente, a un resto de enlazador peptidilo o no peptidilo (incluyendo, pero no limitado a enlazadores aromáticos o arilo) que está unido covalentemente a un residuo de aminoácido del análogo peptídico. La presencia de cualquier resto enlazador es opcional. Cuando está presente, su estructura química no es crítica, ya que sirve principalmente como un espaciador para colocar, unir, conectar u optimizar la presentación o posición de un resto funcional con relación a uno o más de otros restos funcionales de una molécula en diversas realizaciones.
La presencia de un resto enlazador puede ser útil para optimizar la actividad farmacológica de algunas realizaciones. El enlazador puede estar formado por aminoácidos enlazados entre sí por enlaces peptídicos. El resto enlazador, si está presente, puede ser independientemente el mismo o diferente de cualquier otro enlazador, o enlazadores, que puedan estar presentes en la composición. Como se indicó anteriormente, el resto enlazador, si está presente (ya sea dentro de la secuencia de aminoácidos primaria del análogo peptídico, o como un enlazador para unir un resto que extiende la semivida al análogo peptídico), puede ser de naturaleza "peptidilo" (es decir, compuesto por aminoácidos enlazados entre sí por enlaces peptídicos) y compuesto en longitud, preferiblemente de 1 hasta aproximadamente 40 residuos de aminoácidos, de 1 hasta aproximadamente 20 residuos de aminoácidos, o de 1 a aproximadamente 10 residuos de aminoácidos. Los residuos de aminoácidos en el enlazador son de entre los veinte aminoácidos canónicos, p. ej., cisteína, glicina, alanina, prolina, asparagina, glutamina y/o serina. En diversas realizaciones, un enlazador peptidilo puede estar formado por una mayoría de aminoácidos que no tienen impedimentos estéricos, tales como glicina, serina y alanina enlazadas por un enlace peptídico. También puede ser deseable que, si está presente, se seleccione un enlazador peptidilo que evite el rápido recambio proteolítico en circulación in vivo. Algunos de estos aminoácidos pueden estar glicosilados, como bien entienden los expertos en la técnica. Por ejemplo, una secuencia de enlazador útil que constituye un sitio de sialilación es X1X2NX4X5G (SEQ ID NO: 76), en donde X1, X2 , X4 y X5 son, cada uno independientemente, cualquier residuo de aminoácido. También puede ser deseable que, si está presente, un enlazador peptidilo pueda consistir en cualquier aminoácido no canónico o una combinación de aminoácidos no canónicos y canónicos seleccionados para evitar o reducir el rápido recambio proteolítico in vitro y/o in vivo.
En otras realizaciones, los 1 a 40 aminoácidos del resto de enlazador peptidilo se pueden seleccionar de glicina, alanina, prolina, asparagina, glutamina y lisina. Un enlazador puede estar formado por la mayoría de aminoácidos que no tienen impedimentos estéricos, tales como glicina y alanina. Por lo tanto, los enlazadores pueden incluir poliglicinas, poliserinas y polialaninas, o combinaciones de cualquiera de éstas. Algunos enlazadores peptidilo ejemplares son poli(Gly)1-8 (SEQ ID n O: 77), particularmente (Gly)3 (SEQ ID NO: 78), (Gly)4 (SEQ ID NO: 79), (Gly)5 (SEQ ID NO: 80) y (Gly)/ (SEQ ID NO: 81), así como GlySer y poli(Gly)4Ser (SEQ ID NO: 82), tal como "L15" (GGGGSGGGGSGGGGS; SEQ ID NO: 83), poli(Gly-Ala)2-4 (SEQ ID NO: 62) y poli(Ala)1-8 (SEQ ID NO: 84). Otros ejemplos específicos de enlazadores de peptidilo útiles incluyen (Gly)5Lys (SEQ ID NO: 85) y (Gly)5LysArg (SEQ ID NO: 86). Otros ejemplos de enlazadores de peptidilo útiles son: Otros ejemplos de enlazadores de peptidilo útiles son:
(Gly)3Lys(Gly)4 (SEQ ID NO: 87);
(Gly)3AsnGlySer(Gly)2 (SEQ ID NO: 88);
(Gly)3Cys(Gly)4 (SEQ ID NO: 89); y
GlyProAsnGlyGly (SEQ ID NO: 90).
Para explicar la nomenclatura anterior, por ejemplo, (Gly)3Lys(Gly)4 (SEQ ID NO: 91) significa Gly-Gly-Gly-Lys-Gly-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 91). También son útiles otras combinaciones de Gly y Ala.
Otros enlazadores son los identificados en esta memoria como "L5" (GGGGS; o "G4S"; SEQ ID NO: 92), "L10" (GGGGSGGGGS; SEQ ID NO: 93); "L20" (GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS; SEQ ID NO: 94); "L25" (GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS; SEQ ID NO: 95) y cualquier enlazador utilizado en los ejemplos de trabajo que figuran más adelante.
En algunas realizaciones que comprenden un resto enlazador peptídico, se colocan restos de carácter ácido, por ejemplo, residuos de glutamato o aspartato en la secuencia de aminoácidos del resto enlazador. Ejemplos incluyen las siguientes secuencias de enlazador peptídico:
GGEGGG (SEQ ID NO: 96);
GGEEEGGG (SEQ ID NO: 97);
GEEEG (SEQ ID NO: 98);
GEEE (SEQ ID NO: 99);
GGDGGG (SEQ ID NO: 100);
GGDDDGG (SEQ ID NO: 101);
GDDDG (SEQ ID NO: 102);
GDDD (SEQ ID NO: 103);
GGGGSDDSDEGSDGEDGGGGS (SEQ ID NO: 1412);
WEWEW (SEQ ID NO: 104);
FEFEF (SEQ ID NO: 105);
EEEWWW (SEQ ID NO: 106);
EEEFFF (SEQ ID NO: 107);
WWEEEWW (SEQ ID NO: 108); o
FFEEEFF (SEQ ID NO: 109).
En otras realizaciones, el enlazador constituye un sitio de fosforilación , p. ej., X1X2YX4X5G (SEQ ID NO: 110), en donde X1, X2 , X4 y X5 son, cada uno independientemente, cualquier residuo de aminoácido.; X1X2SX4X5G (SEQ ID NO: 111), en donde X1, X2 , X4 y X5 son, cada uno independientemente, cualquier residuo de aminoácido; o X1X2TX4X5G (SEQ ID NO: 112), en donde X1, X2 , X4 y X5 son, cada uno independientemente, cualquier residuo de aminoácido.
Los enlazadores mostrados aquí son ejemplares; los enlazadores de peptidilo pueden ser mucho más largos y pueden incluir otros residuos. Un enlazador de peptidilo puede contener, p. ej., una cisteína, otro tiol o nucleófilo para la conjugación con un resto que prolonga la semivida. En otra realización, el enlazador puede contener un residuo de cisteína u homocisteína, u otro resto 2-aminoetanotiol o 3-aminopropanotiol para la conjugación con maleimida, yodoacetaamida o tioéster, resto funcionalizado que prolonga la semivida.
Otro enlazador de peptidilo útil es un enlazador grande y flexible que comprende una secuencia Gly/Ser/Thr aleatoria, por ejemplo: GSGSATGGSGSTASSGSGSATH (SEQ ID NO: 113) o HGSGSATGGSGSTASSGSGSAT (SEQ ID NO: 114), que se estima que tiene aproximadamente el tamaño de una molécula de PEG de 1 kDa. Alternativamente, un enlazador de peptidilo útil puede estar compuesto por secuencias de aminoácidos conocidas en la técnica por formar estructuras helicoidales rígidas (p. ej., Enlazador rígido: - AEAAAKEAAAKEAAAKAGG (SEQ ID NO: 115). Adicionalmente, un enlazador de peptidilo también puede comprender un segmento no peptidilo, tal como una molécula alifática de 6 carbonos de fórmula -CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-. Los enlazadores de peptidilo se pueden alterar para formar derivados tal como se describe en esta memoria.
Opcionalmente, un resto enlazador no peptidilo también es útil para conjugar el resto que prolonga la semivida con la porción peptídica del péptido conjugado con el resto que prolonga la semivida. Por ejemplo, se pueden utilizar enlazadores de alquilo, tales como -NH-(CH2)s-C(O)-, en donde s = 2-20. Estos enlazadores de alquilo pueden estar sustituidos, además, con cualquier grupo de no impedimento estérico tal como alquil inferior (p. ej., C1-C6) acilo inferior, halógeno (p. ej., Cl, Br), CN, NH2 , fenilo, etc. Enlazadores no peptidilo ejemplares son enlazadores de PEG (p. ej., mostrados a continuación):
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en donde n es tal que el enlazador tiene un peso molecular de aproximadamente 100 a aproximadamente 5000 Dalton (Da).
El enlazador también podría ser un aminoácido no natural, tal como ácido aminohexanoico, o un grupo orgánico, tal como un ácido dicarboxílico, tal como el ácido succínico (ácido butanodioico).
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ácido 6-aminohexanoico
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ácido butanodioico
En una realización, el enlazador no peptidilo es arilo. Los enlazadores se pueden alterar para formar derivados de la misma manera que se describe en esta memoria. Además, los restos de PEG pueden fijarse a la amina N-terminal o aminas de cadena lateral seleccionadas por alquilación reductora utilizando aldehídos de PEG o acilación utilizando hidroxisuccinimido o ésteres de carbonato de PEG, o por conjugación con tiol.
"Arilo" es fenilo o fenilo condensado vecinalmente con un puente de carbono de 3, 4 o 5 miembros saturado, parcialmente saturado o insaturado, estando el fenilo o el puente sustituido con 0, 1,2 o 3 sustituyentes seleccionados de alquilo C1-8, haloalquilo C1-4 o halo. "Heteroarilo" es un anillo bicíclico, insaturado, de 5, 6 o 7 miembros, monocíclico o parcialmente saturado o insaturado de 6, 7, 8, 9, 10 u 11 miembros, en donde al menos un anillo está insaturado, el anillo monocíclico y los anillos bicíclicos que contienen 1, 2, 3 o 4 átomos seleccionados de N, O y S, en donde el anillo está sustituido con 0, 1,2 o 3 sustituyentes seleccionados de alquilo C1-8, haloalquilo C1-4 y halo. Las porciones que no son péptidos, tales como enlazadores no peptidilo o restos no peptídicos que prolongan la semivida pueden sintetizarse mediante reacciones de química orgánica convencionales.
Lo anterior es meramente ilustrativo y no es un tratamiento exhaustivo de los tipos de enlazadores que pueden emplearse opcionalmente de acuerdo con diversas realizaciones.
Diversas realizaciones también se refieren a las composiciones de materia descritas para su uso en un método de tratamiento o prevención de una enfermedad, trastorno u otra afección médica, por ejemplo, trastornos cardíacos. Los trastornos cardíacos pueden comprender, por ejemplo, cualquier trastorno que afecte a la contractilidad del corazón u otras funciones del corazón. Además, diversas realizaciones se refieren a cualquier forma de enfermedad cardíaca, p. ej., hipertrofia, hipertensión, insuficiencia cardíaca, insuficiencia cardíaca congestiva o miocardiopatía. La insuficiencia cardíaca puede ser insuficiencia cardíaca congestiva. Otras realizaciones se refieren al uso de agonistas de APJ descritos en esta memoria para tratar trastornos del corazón que resultan de la hipertensión, incluyendo el cáncer de hipertensión arterial pulmonar, diabetes, obesidad, enfermedades metastásicas y VIH. Los agonistas de APJ pueden utilizarse en un método para tratar o prevenir diversos otros trastornos o enfermedades, tales como, pero no limitados a trastornos asociados con el metabolismo de lípidos y glucosa, trastornos asociados con la regulación y función del tracto GI, protección contra la entrada de células del VIH. y protección contra la apoptosis celular.
Las composiciones farmacéuticas se pueden configurar para su administración a un paciente mediante una amplia diversidad de vías de suministro, p. ej., una vía de suministro intravascular, tal como por inyección o infusión, vías de suministro subcutánea ("s.c."), intravenosa ("i.v."), intramuscular, intraperitoneal ("i.p."), epidural o intratecal, o para vías de suministro oral, enteral, pulmonar (p. ej., inhalante), intranasal, transmucosal (p. ej., administración sublingual), transdérmica u otras vías de suministro y/o formas de administración conocidas en la técnica. La administración de un fármaco o una composición farmacéutica que contiene un agonista de APJ puede tener lugar mediante modalidades inyectables estándares, ya sea auto-administradas con jeringas precargadas o en un ámbito hospitalario, o también mediante una bomba de suministro tal como un autoinyector, una bomba de parche o un inyector de gran volumen. para lograr la dosificación más precisa y los niveles de exposición plasmática más estables. Las composiciones farmacéuticas pueden prepararse en forma líquida o pueden estar en forma de polvo seco, tal como en forma liofilizada o en forma cristalina. Para uso oral o enteral, las composiciones farmacéuticas pueden configurarse, por ejemplo, como comprimidos, trociscos, pastillas, suspensiones acuosas u oleosas, polvos o gránulos dispersables, emulsiones, cápsulas duras o blandas, jarabes, elixires o fórmulas enterales.
En general, diversas realizaciones proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden un agonista de APJ y un soporte farmacéuticamente aceptable. Composiciones farmacéuticas de este tipo se pueden configurar para su administración a un paciente mediante una amplia diversidad de vías de suministro, p. ej., una vía de suministro intravascular, tal como por inyección o infusión, vías de suministro subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, epidural o intratecal, o para vías de suministro oral, enteral, pulmonar (p. ej., inhalante), intranasal, transmucosal (p. ej., administración sublingual), transdérmica u otras vías de suministro y/o formas de administración conocidas en la técnica. Las composiciones farmacéuticas pueden prepararse en forma líquida o pueden estar en forma de polvo seco, tal como en forma liofilizada. Para uso oral o enteral, las composiciones farmacéuticas pueden configurarse, por ejemplo, como comprimidos, trociscos, pastillas, suspensiones acuosas u oleosas, polvos o gránulos dispersables, emulsiones, cápsulas duras o blandas, jarabes, elixires o fórmulas enterales.
Propiedades farmacéuticas potenciadas pueden referirse a moléculas con farmacocinética, farmacodinamia y/o frecuencia de dosificación mejoradas para la eficacia del fármaco, p. ej., no cada pocas horas.
En la práctica, el "soporte farmacéuticamente aceptable" puede ser cualquier sustancia fisiológicamente tolerada conocida por los expertos ordinarios en la técnica, útil en la formulación de composiciones farmacéuticas, incluyendo, cualesquiera diluyentes, excipientes, dispersantes, aglutinantes, cargas, deslizantes, agentes anti-rozamiento, coadyuvantes de la compresión, agentes desintegradores de tabletas (desintegrantes), agentes de suspensión, lubricantes, saboreantes, aromatizantes, edulcorantes, potenciadores de la permeación o penetración, conservantes, tensioactivos, solubilizantes, emulsionantes, espesantes, adyuvantes, colorantes, revestimientos, material o materiales encapsulantes y/u otros aditivos, solos o en combinación. Composiciones farmacéuticas pueden incluir diluyentes de diversos contenidos de tampón (p. e j, Tris-HCl, acetato, fosfato), pH y fuerza iónica; aditivos tales como detergentes y agentes solubilizantes (p. e j, Tween® 80, Polisorbato 80), antioxidantes (p. ej., ácido ascórbico, metabisulfito de sodio), conservantes (p. ej.,, Thimersol®, alcohol bencílico) y sustancias conferidoras de consistencia (p. e j, lactosa, manitol); incorporación del material en preparaciones en partículas de compuestos poliméricos, tales como ácido poliláctico, ácido poliglicólico, etc. o en liposomas. También se puede utilizar ácido hialurónico, y esto puede tener el efecto de fomentar una duración sostenida en la circulación. Composiciones de este tipo pueden influir en el estado físico, la estabilidad, la velocidad de liberación in vivo y la velocidad de aclaramiento in vivo de las presentes proteínas y derivados. Véase, p. ej., Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18a Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) páginas 1435-1712. Las composiciones se pueden preparar en forma líquida o en polvo seco, tal como en forma liofilizada. También son útiles las formulaciones implantables de liberación sostenida, al igual que las formulaciones transdérmicas o transmucosales. Adicionalmente (o alternativamente), diversas realizaciones proporcionan composiciones para su uso en cualquiera de las diversas formulaciones de liberación lenta o sostenida o formulaciones de micropartículas conocidas por el experto en la materia, por ejemplo, formulaciones de micropartículas de liberación sostenida, que pueden administrarse por vía de rutas de suministro pulmonar, intranasal o subcutánea. (Véase, p. ej., Murthy et al., Injectable compositions for the controlled delivery of pharmacologically active compound, Patente de EE.UU. N°.6.887.487; Manning et al., Solubilization of pharmaceutical substances in an organic solvent and preparation of pharmaceutical powders using the same, Patentes de EE.UU. N°s 5.770.559 y 5.981.474; Lieberman et al., Lipophilic complexes of pharmacologically active inorganic mineral acid esters of organic compounds, Patente de EE.UU. N° 5.002.936; Gen, Formative agent of protein complex, documento US 2002/0119946 A1; Goldenberg et al., Sustained release formulations, documento WO 2005/105057 A1).
Se pueden diluir las composiciones o aumentar el volumen de las composiciones farmacéuticas con un material inerte. Diluyentes de este tipo pueden incluir hidratos de carbono, especialmente manitol, a-lactosa, lactosa anhidra, celulosa, sacarosa, dextranos modificados y almidón. También se pueden utilizar como cargas determinadas sales inorgánicas, incluyendo trifosfato de calcio, carbonato de magnesio y cloruro sódico. Algunos diluyentes disponibles comercialmente son Fast-Flo, Emdex, STA-Rx 1500, Emcompress y Avicell.
Una diversidad de espesantes convencionales son útiles en configuraciones de cremas, ungüentos, supositorios y gel de la composición farmacéutica, tales como, pero no limitados a alginato, goma xantana o vaselina, también se pueden emplear en diversas configuraciones de la composición farmacéutica.
En diversas realizaciones, las composiciones farmacéuticas líquidas, que son soluciones o suspensiones estériles, se pueden administrar a un paciente mediante inyección, por ejemplo, por vía intramuscular, intratecal, epidural, intravascular (p. ej., intravenosa o intraarterial), intraperitoneal o subcutánea. (Véase, p. ej., Goldenberg et al., Suspensions for the sustained release of proteins, Patente de EE.UU. N° 6.245.740 y documento WO 00/38652 A1). Soluciones estériles también se pueden administrar mediante infusión intravenosa. La composición se puede incluir en una composición farmacéutica sólida estéril, tal como un polvo liofilizado, que se puede disolver o suspender en un momento conveniente antes de la administración a un paciente utilizando agua estéril, solución salina, solución salina tamponada u otro medio inyectable estéril apropiado.
Formulaciones implantables de liberación sostenida también son realizaciones útiles de las composiciones farmacéuticas. Por ejemplo, el soporte farmacéuticamente aceptable, que es una matriz biodegradable implantada dentro del cuerpo o debajo de la piel de un vertebrado humano o no humano, puede ser un hidrogel similar a los arriba descritos. Alternativamente, puede formarse a partir de un componente de poli-alfa-aminoácido. (Sidman, Biodegradable, implantable drug delivery device, and process for preparing and using same, Patente de EE.UU. N° 4.351.337). También se conocen y son útiles otras técnicas para fabricar implantes para el suministro de fármacos.
En forma de polvo, el soporte farmacéuticamente aceptable es un sólido finamente dividido, que está mezclado con ingrediente(s) activo(s) finamente dividido(s), incluyendo la composición. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una forma de polvo es útil cuando la composición farmacéutica está configurada como inhalante. (Véase, p. ej., Zeng et al., Method of preparing dry powder inhalation compositions, documento WO 2004/017918; Trunk et al., Salts of the CGRP antagonist BIBN4096 and inhalable powdered medicaments containing them, Patente de EE.UU. N° 6.900.317).
Se puede diluir o aumentar el volumen del compuesto con un material inerte. Estos diluyentes podrían incluir hidratos de carbono, especialmente manitol, a-lactosa, lactosa anhidra, celulosa, sacarosa, dextranos modificados y almidón. También se pueden utilizar como cargas determinadas sales inorgánicas, incluyendo trifosfato de calcio, carbonato de magnesio y cloruro sódico. Algunos diluyentes disponibles comercialmente son Fast-Flo™, Emdex™, STA-Rx™ 1500, Emcompress™ y Avicell™.
Se pueden utilizar aglutinantes para mantener unido el agente terapéutico para formar una tableta dura e incluyen materiales de productos naturales como acacia, tragacanto, almidón y gelatina. Otros incluyen metilcelulosa (MC), etilcelulosa (EC) y carboximetilcelulosa (CMC). Tanto polivinilpirrolidona (PVP) como hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC) podrían utilizarse en soluciones alcohólicas para granular el agente terapéutico. Se puede incluir un agente anti-rozamiento en la formulación del agente terapéutico para evitar que se pegue durante el proceso de formulación. Se pueden utilizar lubricantes como una capa entre el agente terapéutico y la pared de la matriz, y estos pueden incluir, pero no se limitan a; ácido esteárico, incluyendo sus sales de magnesio y calcio, politetrafluoroetileno (PTFE), parafina líquida, aceites vegetales y ceras. También se pueden utilizar lubricantes solubles tales como lauril sulfato de sodio, lauril sulfato de magnesio, polietilenglicol de diversos pesos moleculares, Carbowax 4000 y 6000.
También son útiles en diversas realizaciones las formas de dosificación oral. Si es necesario, la composición se puede modificar químicamente para que la administración oral sea eficaz. Generalmente, la modificación química contemplada es la unión de al menos un resto a la propia molécula, en que dicho resto permite (a) la inhibición de la proteólisis; y (b) la captación en el torrente sanguíneo desde el estómago o el intestino. También se desea el aumento de la estabilidad general del compuesto y el aumento del tiempo de circulación en el cuerpo. Restos útiles como restos que prolongan la semivida fijados covalentemente también se pueden utilizar para este propósito. Ejemplos de restos de este tipo incluyen: PEG, copolímeros de etilenglicol y propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, poli(alcohol vinílico), polivinilpirrolidona y poliprolina. Véase, por ejemplo, Abuchowski y Davis (1981), Soluble Polymer-Enzyme Adducts, Enzymes as Drugs (Hocenberg y Roberts, eds.), Wiley-Interscience, Nueva York, NY, págs 367-83; Newmark, et al. (1982), J. Appl. Biochem. 4:185-9. Otros polímeros que podrían utilizarse son poli-1,3-dioxolano y poli-1,3,6-tioxocano. Se prefieren para uso farmacéutico, como se indicó anteriormente, los restos de PEG.
Para las formas de dosificación de suministro oral, también es posible utilizar una sal de un aminoácido alifático modificado, tal como N-(8-[2-hidroxibenzoil]amino)caprilato de sodio (SNAC) como un soporte para potenciar la absorción de los compuestos terapéuticos. La eficacia clínica de una formulación de heparina utilizando SNAC se ha demostrado en un ensayo de Fase II realizado por Emisphere Technologies. Véase la Patente de EE.UU. N° 5.792.451, "Oral drug delivery composition and methods."
En una realización, el soporte farmacéuticamente aceptable puede ser un líquido y la composición farmacéutica se prepara en forma de una solución, suspensión, emulsión, jarabe, elixir o composición presurizada. El ingrediente o los ingredientes activos (p. ej., la composición de materia) se pueden disolver, diluir o suspender en un soporte líquido farmacéuticamente aceptable tal como agua, un disolvente orgánico, una mezcla de ambos, o aceites o grasas farmacéuticamente aceptables. El soporte líquido puede contener otros aditivos farmacéuticos adecuados, tales como detergentes y/o solubilizantes (p. ej., Tween 80, Polisorbato 80), emulsionantes, tampones a pH apropiado (p. ej., Tris-HCl, acetato, fosfato), adyuvantes, antioxidantes (p. ej., ácido ascórbico, metabisulfito de sodio), conservantes (p. ej., Thimersol, alcohol bencílico), edulcorantes, agentes aromatizantes, agentes de suspensión, agentes espesantes, sustancias conferidoras de consistencia (p. ej., lactosa, manitol), colorantes, reguladores de la viscosidad, estabilizadores, electrolitos, osmolutos u osmo-reguladores. También se pueden incluir aditivos en la formulación para potenciar la absorción de la composición. Aditivos que potencialmente tienen esta propiedad son, por ejemplo, los ácidos grasos ácido oleico, ácido linoleico y ácido linolénico.
También son útiles las formas de dosificación sólidas orales, que se describen generalmente en Remington’s Pharmaceutical Sciences (1990), supra, en el Capítulo 89. Las formas de dosificación sólidas incluyen comprimidos, cápsulas, píldoras, trociscos o pastillas, sellos o nódulos. Además, la encapsulación liposomal o proteinoide puede utilizarse para formular las presentes composiciones (tal como, por ejemplo, microesferas proteinoides reseñadas en la Patente de EE.UU. N° 4.925.673). Puede utilizarse la encapsulación liposómica y los liposomas pueden derivatizarse con diversos polímeros (p. ej., Patente de EE.UU. N° 5.013.556). En Marshall, K., Modern Pharmaceutics (1979), editado por G. S. Banker y C. T. Rhodes, en el Capítulo 10 se ofrece una descripción de posibles formas de dosificación sólidas para el agente terapéutico. En general, la formulación incluirá el compuesto y los ingredientes inertes que permiten la protección contra el entorno del estómago y la liberación del material biológicamente activo en el intestino.
En forma de comprimido, los ingredientes activos se mezclan con un soporte farmacéuticamente aceptable que tiene las propiedades de compresión necesarias en proporciones adecuadas y se compactan en la forma y tamaño deseados.
Los polvos y tabletas pueden contener hasta 99% del o de los ingredientes activos. Soportes sólidos adecuados incluyen, por ejemplo, fosfato de calcio, estearato de magnesio, talco, azúcares, lactosa, dextrina, almidón, gelatina, celulosa, polivinilpirrolidina, ceras de bajo punto de fusión y resinas de intercambio iónico.
Puede ser deseable una formulación de liberación controlada. En diversas realizaciones, la composición puede incorporarse en una matriz inerte que permite la liberación por difusión o por mecanismos de lixiviación, p. ej., gomas. También se pueden incorporar lentamente a la formulación matrices de degeneración, p. ej., alginatos, polisacáridos. Otra forma de liberación controlada de las composiciones es mediante un método basado en el sistema terapéutico Oros™ (Alza Corp.), es decir, el fármaco está encerrado en una membrana semipermeable que permite que el agua penetre y expulse el fármaco a través de una única abertura pequeña. debido a los efectos osmóticos. Algunos recubrimientos entéricos también tienen un efecto de liberación retardada.
También puede ser útil la administración pulmonar de las composiciones. La proteína (o derivado) se suministra a los pulmones de un mamífero mientras se inhala y atraviesa el revestimiento epitelial del pulmón hasta el torrente sanguíneo. (Otros informes de esto incluyen Adjei et al., Pharma. Res. (1990) 7: 565-9; Adjei et al. (1990), Internatl. J. Pharmaceutics 63: 135-44 (acetato de leuprolida); Braquet et al. (1989), J. Cardiovasc. Pharmacol. 13 (supl.5): s.
143-146 (endotelina-1); Hubbard et al. (1989), Annals Int. Med. 3: 206-12 (a1-antitripsina); Smith et al. (1989), J. Clin.
Invest. 84: 1145-6 (a1-proteinasa); Oswein et al. (March 1990), "Aerosolization of Proteins," Proc. Symp. Resp. Drug Delivery II, Keystone, Colorado (hormona del crecimiento humana recombinante); Debs et al. (1988), J. Immunol. 140 3482-8 (interferón-y y factor de necrosis tumoral a) y Platz et al., Patente de EE.UU. N° 5.284.656 (factor estimulante de colonias de granulocitos).
El régimen de dosificación implicado en un método para tratar una afección será determinado por el médico tratante, considerando diversos factores que modifican la acción de los fármacos, p. ej., la edad, condición, peso corporal, sexo y dieta del paciente, la gravedad de cualquier infección, el tiempo de administración y otros factores clínicos. Generalmente, el régimen diario debe estar en el intervalo de 0,1-1000 microgramos del compuesto por kilogramo de peso corporal, preferiblemente de 0,1-150 microgramos por kilogramo.
La Tabla 5 contiene las SEQ ID NO: 139-161. En la tabla, un ácido libre puede ser un ácido carboxílico y una amida puede ser un extremo C amidado.
TABLA 5.
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La Tabla 6 se muestra a continuación. En la tabla, un ácido libre puede ser un ácido carboxílico y una amida puede ser un extremo C amidado.
TABLA 6
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La siguiente tabla muestra ejemplos de péptidos. En la tabla, el ácido libre puede ser un ácido carboxílico y la amida puede estar en el extremo C y el agonista puede incluir un derivado de PEG o un grupo que prolonga la semivida en suero.
TABLA 7.
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La siguiente tabla muestra ejemplos de péptidos. En la tabla, el ácido libre puede ser un ácido carboxílico y la amida puede estar en el extremo C.
TABLA 8.
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La Tabla 9 muestra ejemplos de péptidos. Los ejemplos pueden incluir un derivado de PEG o un grupo que prolonga la semivida en suero. En la tabla, el ácido libre puede ser un ácido carboxílico y la amida puede estar en el extremo C.
TABLA 9.
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[Atz(PEG10)]FRRQRP[hArg][Cha]S Atz(Peg10)-[hArg68;Cha69;Oic74;Nle75;4-Cl-HKG[Oic][Nle]P[4-Cl-F] F77]Apelina-17(62-77) 1233 [Atz(PEG10)]LRP[hArg][Cha]SHKG [Oic][Nle]P[4- Atz(Peg10)-[Leu65;hArg68;Cha69;Oic74;Nle75;4-Cl-Cl-F] F77]Apelina-17(65-77) 1234 {Palmitoilo}LRP[hArg][Cha]FHKGP [Nle][4-Cl- Palmitoilo-[Leu65;hArg68;Cha69;Phe70;Nle75 F]{ÁcidoLibre} F76]Apelina-13(65-76) 1235 {Palmitoilo}LRP[hArg][Cha]FHKPP[ Nle][D- Palmitoilo-[Leu65;hArg68;Cha69;Phe70;Pro73 1 Nal]{ÁcidoLibre} 5;D-1 Nal76]Apelina-13(65-76)
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1236
{Palmitoilo}LRP[hArg][Cha]SHKGP [Nle][4-Cl-F] Palmitoilo-Leu65;hArg68;Cha69;Nle75;4-Cl- 1237 F76]Apelina-13(65-76)
{Palmitoilo}LRP[hArg][NMeLeu]FA [1-Nal]G[1- Palmitoilo-[Leu65;hArg68;NMeLeu69;Phe70;Ala71; 1-Nal][Nle][4-Cl-F]{Amida} Nal72,74;Nle75;4-Cl-F76]Apelina-13(65-76) 1238 {Palmitoilo}LRP[hArg][NMeLeu]FA [1- Palmitoilo-[Leu65;hArg68;NMeLeu69;Phe70;Ala71; 1-Nal]G[Oic][Nle][4-Cl-F]{Amida} Nal72,Oic74;Nle75;4-Cl-F76]Apelina-13(65-76) 1239 {Palmitoilo}LRP[hArg][NMeLeu]FA [1-Nal]G[1- Palmitoilo-[Leu65;hArg68;NMeLeu69;Phe70;Ala71; 1-Nal][Nle][4-Cl-F]{Amida} Nal72,74;Nle75;4-Cl-F76]Apelina-13(65-76) 1240
La Tabla 10 muestra ejemplos de péptidos. Los ejemplos pueden incluir un ácido libre que puede ser un ácido carboxílico y una amida que puede estar en el extremo C.
TABLA 10.
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La Tabla 11 muestra ejemplos de péptidos. Los ejemplos pueden incluir un ácido libre que puede ser un ácido carboxílico y una amida que puede estar en el extremo C y puede incluir también un derivado de PEG o un grupo que prolonga la semivida en suero.
TABLA 11
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TABLA 12.
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Diversas realizaciones arriba presentadas proporcionan una fórmula específica para un péptido, en donde «z» puede definirse como PEG o PE. En esta memoria se describen péptidos que comprenden las mismas fórmulas en donde «z» puede ser cualquier grupo que prolonga la semivida.
La descripción anterior y los siguientes ejemplos de trabajo son ilustrativos y no deben interpretarse de ninguna manera como limitantes de la invención.
EJEMPLOS EJEMPLO 1
Se han preparado diversos polipéptidos que actúan como agonistas de APJ. Los polipéptidos se seleccionaron para determinar su potencia y estabilidad metabólica. Las secuencias se aleatorizaron mediante técnicas conocidas en la técnica en las que se pueden cambiar uno o más aminoácidos al tiempo que se mantiene o mejora la afinidad, la actividad funcional o la estabilidad del péptido. Nishizawa et al., Peptide Science 37: 151-157 2001; Murza et al., ChemMeDChem., 7: 318-3252012
Aproximadamente > 800 polipéptidos modificados se utilizaron en ensayos de relación estructura-actividad para optimizar la potencia y la estabilidad metabólica en relación con el ligando endógeno pyr apelina-13. Todos los compuestos se rastrearon hasta 10 uM junto con pyr apelina-13 utilizado como control positivo. Los compuestos que mostraron actividad funcional en todos los ensayos de SAR se consideraron positivos y se volvieron a rastrear. El proceso iterativo continuó y los polipéptidos se modificaron adicionalmente para su optimización.
Se proporcionan varias secuencias agonistas de APJ en las Tablas 12 y 13 que figuran más adelante y en las Figuras 3 y 4. En la Tabla 13, los corchetes indican que el residuo es un aminoácido no canónico. Además, en la Tabla 12, los símbolos "o " y "ft" pueden ser cualquier derivado de PEG fijado covalentemente al agonista de APJ a través de cualquiera de los enlazadores descritos en esta memoria o simplemente pueden estar fijados por un enlace peptídico normal (es decir, de modo que ningún enlazador está presente). PE es piroglutamato.
TABLA 13. AGONISTAS DE APJ
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A continuación se proporcionan ejemplos adicionales de agonistas de APJ.
TABLA 14. EJEMPLOS ADICIONALES DE AGONISTAS DE APJ:
(Se enumeran la Secuencia, los nombres Químicos y las Estructuras).
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Además de los agonistas enumerados en las Tablas 12 y 13, y las Figuras 3 y 4, diversas realizaciones pueden comprender conjugados en los que un polímero, péptido o proteína está enlazado a una secuencia de péptidos diferente; por ejemplo, en donde un Fc está enlazado a una secuencia agonista de APJ. Se pueden preparar composiciones de materia de este tipo en las que el agonista de APJ está fijado a un vehículo a través del extremo N, el extremo C, la cadena principal o la cadena lateral del polipéptido mediante modificación química.
Cualquiera de los polipéptidos puede fijarse en tándem (es decir, secuencialmente), con o sin enlazadores. Cualquier péptido descrito en esta memoria, ya sea como un monómero o como multímeros, puede unirse covalentemente, con o sin enlazadores, a un vehículo. Cualquiera de estos péptidos puede derivatizarse.
EJEMPLO 2
Se realizaron la evaluación de la estabilidad del plasma in vitro y la identificación de los principales metabolitos in vitro de péptidos de apelina en múltiples especies, incluyendo ratón, rata, perro y ser humano.
Se añadieron péptidos de apelina en plasma con EDTA de ratón, rata, perro y ser humano recién preparados hasta una concentración final de 5 |uM. A continuación, las muestras de plasma se incubaron a 37°C a lo largo de un período de 4 h. Se tomaron muestras de hasta 8 momentos para facilitar la estimación de la semivida in vitro en matrices de plasma. En un experimento típico, se tomó una parte alícuota de 100 |uL de muestra de plasma del vial de incubación, seguido de la adición de 300 |uL de patrón interno que contenía MeOH. La muestra extinguida se centrifugó a 5500 g durante 15 min después de 15 min de agitación en vórtice a temperatura ambiente. A continuación, se analizó el sobrenadante mediante LC-MS de alta resolución. Se utilizaron datos de masa de barrido completo de masa precisos para la estimación del nivel de péptido precursor a lo largo de un transcurso de tiempo de 4 h, y los datos se utilizaron posteriormente para la estimación de la semivida in vitro en plasma. Utilizando el mismo conjunto de datos, también se identificaron los principales metabolitos basándose en datos de masa precisos de MS y MS/Ms de barrido completo. (datos de metabolitos no mostrados). Los resultados de la estabilidad del plasma In vitro se muestran a continuación en la Tabla 15.
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Cabe señalar en la Tabla 15 que todos los polipéptidos enumerados tienen una estabilidad in vitro mucho mayor que el nativo (0,1% a los 15 minutos) o la Apelina 13 piroglutamatizada (0,7% a los 15 minutos). Los péptidos testados adicionalmente tenían entre 50 y 96% en 1 hora. Experimentos adicionales proporcionaron una estabilidad plasmática in vitro comparativa en cuatro especies diferentes de plasma, es decir, ratón, rata, perro y ser humano (Figura 4). Estos resultados demostraron que los agonistas de APJ deberían poder utilizarse en modelos preclínicos de diferentes especies.
EJEMPLO 3
Se realizaron ensayos para determinar la potencia y la estabilidad metabólica de los agonistas de APJ.
Se utilizaron líneas celulares CHO estables que expresan APJ para los ensayos de cAMP. Las células se incubaron con tampón de estimulación que contenía tampón de HANK, forskolina e IBMX 0,5 mM en ausencia o presencia de diversas concentraciones de péptidos a 37°C durante 45 min. El nivel de cAMP se determinó utilizando un kit de AMP cíclico (DiscoverX) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Para analizar el GTP, se prepararon membranas a partir de líneas celulares estables y se utilizaron para determinar la eficacia/potencia de los péptidos modificados. Se determinaron inicialmente las condiciones experimentales óptimas para las concentraciones de GDP, MgCl2 y NaCl en el tampón de ensayo. Las membranas se incubaron con péptidos modificados en el tampón de ensayo. La reacción se inició mediante la adición de [35S] GTPyS en ausencia o presencia de péptidos y se incubó a temperatura ambiente durante 90 min. La unión no específica se determinó en presencia de un exceso de GTPyS frío y siempre fue inferior al 0,2% de la unión total. [35S] GTPyS unido se separó de radiomarcador libre por filtración. La radiactividad unida al filtro se determinó mediante recuento de centelleo líquido.
La Figura 5 muestra la actividad agonista de péptidos PEGilados de 20 kDa. La (SEQ ID NO: 122), (SEQ ID NO: 123), (SEQ ID NO: 124), SEQ ID NO: 126) y (SeQ ID NO: 127) son potentes y actúan como un agonista completo con relación a 2540421 (pir apelina-13) (SEQ ID NO: 128). Adicionalmente, la estimulación de cAMP puede verse utilizando líneas celulares estables de APJ de rata o ser humano.
La Figura 6 muestra una comparación de un péptido PEGilado de 525 dalton (SEQ ID NO: 23) y pir apelina 13 (SEQ ID NO: 128). Con relación a la pir apelina-13, el péptido de 525 dalton muestra una potencia y eficacia in vitrosimilares , lo que indica que, aunque el péptido está muy modificado, conserva una actividad de APJ similar a la del ligando de APJ endógeno. La modificación de los péptidos de apelina nativos mediante la introducción de aminoácidos no canónicos o la introducción de PEG no tuvo efecto alguno sobre la actividad funcional en los ensayos de cAMP y GTPyS.
EJEMPLO 4
Para evaluar la función cardíaca hemodinámica de los péptidos se utilizó un sistema de corazón aislado de Langendorff. El corazón aislado de rata proporciona un amplio espectro de mediciones que pueden incluir índices bioquímicos, metabólicos, morfológicos y fisiológicos. Las limitaciones/ventajas del método incluyen la ausencia de influencias neurohormonales, regulación neural y altos flujos coronarios. Sin embargo, limitaciones de este tipo se compensan con la capacidad de estudiar los efectos cardíacos directos sin circulación sistémica y una serie de interacciones periféricas.
La reproducibilidad y precisión de las mediciones y los costos relativamente bajos de los estudios in vivo para la elaboración de perfiles de fármacos superan cualquier limitación de este método. Por lo tanto, este método proporciona una excelente relación dosis-respuesta y arroja información crítica sobre las propiedades farmacológicas y fisiológicas de las moléculas de interés.
Los animales se anestesiaron tras la administración de una dosis de 50-100 mg/kg de pentobarbital sódico para ratas por vía intraperitoneal. El corazón se extirpó y se acunó suavemente entre los dedos para evitar lesiones, seguido de un ligero levantamiento antes de realizar una incisión en la aorta, la vena cava y los vasos pulmonares. Inmediatamente después de la escisión del corazón con aorta, el corazón se montó sobre la cánula en el aparato de Langendorff a través de la aorta. El corazón se perfundió con tampón de Krebs-Henseleit oxigenado modificado pH 7,5 y se equilibró con 95% de O2/5% de CO2 a 37°C. La perfusión se realizó a un caudal constante de 10 ml/min y se estimuló a 300 bpm. La presión se midió a través de un catéter de balón sensor de presión insertado en la cavidad LV. Los efectos intrínsecos de inotropía (fuerza de contracción muscular) y lusitropía (relajación cardíaca) del corazón se evaluaron mediante dp/dtmáx y dp/dtmín.
Utilizando el sistema de Langendorff aislado, las Figuras 7 y 8 demuestran un aumento dependiente de la dosis en dp/dtmáx y una disminución en dp/dtmín, junto con aumentos en la presión sistólica para dos péptidos diferentes (SEQ ID NO: 23) y (SEQ ID NO: 24) en ratas control. Estas figuras ilustran la mejora en la función sistólica y diastólica de corazones normales con péptidos de SEQ ID NOs: 23 y 24.
EJEMPLO 5
Se evaluaron los efectos cardíacos In vivo del péptido modificado SEQ ID NO: 23 en ratas control y con insuficiencia cardíaca. Se midió la función cardíaca de ratas sanas y de las ratas que tenían insuficiencia cardíaca inducida por MI (infarto de miocardio) mediante el sistema de bucle Millar PV y se examinó el catéter de presión arterial femoral.
Para los estudios se utilizaron ratas Lewis macho de 2-3 meses de edad. El infarto de miocardio fue inducido por ligadura de la arteria coronaria descendente anterior izquierda (LAD). Se realizó una ecocardiografía una semana después del MI para el reclutamiento de los animales. Si la fracción de eyección (FE) era superior al 40% y no se identificaba infarto alguno en las imágenes de ecocardiografía, estos animales se excluyeron del estudio. El catéter de bucle Millar PV se insertó en la arteria carótida común derecha y luego se hizo avanzar hasta el ventrículo izquierdo (LV) para la evaluación hemodinámica cardiovascular. El catéter de presión arterial se insertó en una arteria femoral para controlar la presión sanguínea periférica.
Los experimentos se realizaron en ratas de seis a siete semanas después del MI o en ratas sanas. Las ratas de cada uno de los experimentos se dividieron en 3 grupos: tratamiento con péptido SEQ ID NO: 23, vehículo y dobutamina como control positivo. Los artículos de ensayo se administraron por vía intravenosa a través de la vena yugular y se utilizaron 3 conjuntos de dosis de péptidos en el experimento. El péptido con la SEQ ID NO: 23 se dosificó continuamente a 5,5, 27,5 y 55 mg/kg durante 10 min en cada período de infusión. Al final del experimento, el tamaño del infarto se verificó mediante morfología macroscópica si se utilizaron ratas con MI en el estudio.
Los animales en los grupos de MI tenían un tamaño de infarto muy similar (38-39% del LV) entre los grupos (no se muestran los resultados). La Figura 9 demuestra que la media de dp/dt máx aumentó un 32% y un 24,5% en ratas sanas y con MI, respectivamente. La frecuencia cardíaca (FC) aumentó hasta un 10,6% en ratas MI con la infusión intravenosa de 88 pg/kg de dosis acumulativa del péptido 2704121. No se observaron otros cambios hemodinámicos cardíacos en los intervalos de dosis de 5,5 a 88 pg/kg. No se observaron cambios significativos en la medición de la resistencia vascular periférica, como la presión arterial media, en los intervalos de dosis de 5,5 a 88 pg/kg.
EJEMPLO 6
Se llevó a cabo la evaluación del perfil farmacocinético in vivo del péptido apelina en ratas. Se evaluaron los perfiles farmacocinéticos de péptidos apelina en ratas Sprague-Dawley mediante administraciones de bolo intravenoso (IV) y subcutáneo (SC). En un experimento IV típico, se administró una solución tampón PBS de péptido apelina a ratas a través de la vena yugular hasta una dosis final de 0,5 mg/kg. Las muestras de sangre recogidas a lo largo de un período de 24 h se transfirieron a tubos de recogida que contenían EDTA de potasio y se almacenaron en hielo hasta su procesamiento. El plasma se obtuvo de la sangre mediante centrifugación. Después de transferirlas a un recipiente de 96 pocillos, las muestras de plasma se almacenaron en un congelador mantenido a aproximadamente -80°C. El análisis cuantitativo del péptido apelina en muestras de plasma de rata se logró utilizando el modo de monitor de reacción múltiple (MRM) en un sistema LC-MS/MS. Los péptidos con estabilidad incrementada en relación con la pirapelina-a3 tienen perfiles farmacocinéticos potenciados, es decir, una semivida incrementada. Los péptidos conjugados con PEG tienen una semivida circulante prolongada con relación a los péptidos no conjugados.
EJEMPLO 7
Se preparó una serie de péptidos PEGilados y se rastreó in vitro para explorar los efectos del tamaño de PEG y la valencia del péptido sobre la potencia y eficacia en el ensayo de GTPyS. En el ensayo se compararon PEG de 20 kDA y 40 kDA (Figura 10). La potencia de 40 Kda (SEQ iD NO: 474). El péptido PEGilado se redujo 5 veces con relación a 20 kDa (SEQ ID NO: 24) (20 kDa CE50 = 0,252 nM frente a 40 kDA CE50 = 1,37 nM). La eficacia del péptido PEGilado de 40 Kda también se redujo en relación con 20 kDa (Emax 40 kDa = 84% de 20 kDa.
Adicionalmente se prepararon PEGS mono- y multi-valentes conjugados con bis- y tetra-kis-péptido para explorar la valencia del péptido. La Figura 11 muestra los efectos de la valencia del péptido sobre la actividad in vitro utilizando la actividad de péptidos PEGilados de 20 kDa (estructuras mostradas en la Figura 12) en un ensayo biológico. El aumento de la valencia del péptido no tuvo un efecto significativo sobre la potencia in vitro cuando los péptidos se conjugaron con PEG de 20 kDa, aunque no se han evaluado los efectos sobre la respuesta farmacodinámica in vivo. La figura muestra mono-bis (SEQ ID NO: 130) y tetrakis-péptidos. (SEQ ID NO: 131) PEG-mono 20kDa (SEQ ID NO: 129), moléculas bis y tetrakis (Atz-KFRRQRP [hArg][Cha]SHKG[Oic][Nle]P[4-Cl-F]) (SEQ ID NO: 1562) son aproximadamente equipotentes en el ensayo de GTPyS de rata in vitro, aunque significativamente más potentes que la pir apelina 13 endógena (SEQ ID NO: 128).
Se investigaron varios bis-péptidos PEGilados adicionales tal como se muestra en la Figura 13. Tres de los 4 bispéptidos tenían una potencia incrementada en relación con el mono-péptido cuando se conjugaron con derivados de PEG monodispersos de bajo peso molecular. El conjugado de PEG más corto ( PEG de ~ 0,6 kDa (SEQ ID NO: 133) tenía una potencia reducida, mientras que los conjugados de PEG de 1 (SEQ ID NO: 134), 1,7 (SEQ ID NO: 135) y 2,2 kDa (SEQ ID NO: 136) (Figura 14) tenían una potencia incrementada con relación al monopéptido (SEQ ID NO: 494). El conjugado más bis-péptido es 16 pM.
A partir de este ejemplo se puede llegar a las siguientes conclusiones. 1) El incremento del PM de PEG de 20 kDa a 40 kDa dio como resultado un conjugado con potencia y eficacia reducidas en el ensayo de GTPyS en ratas. 2) El incremento de la multivalencia de PEG de 20 kDa no dio como resultado una potencia incrementada, lo que sugiere que la distancia entre péptidos cuando se conjugan con PEG de 20 kDa no es óptima. 3) La mayoría de los bispéptidos conjugados con PEG monodisperso de bajo PM tenían una potencia incrementada con relación al PEG monoconjugado.
Además, se sugirió que a) la distancia entre péptidos cuando se conjugan con PEG de 1,7 o 2,2 kDa parece óptima, b) los conjugados de bis-péptido PEG pueden ofrecer una potencia > 10 veces mayor con relación a los conjugados de mono-péptido y c) los conjugados de PEG debis-péptido pueden tener propiedades PK beneficiosas.
EJEMPLO 8
Se utilizaron dos agonistas de APJ discretos (SEQ ID Nos: 1413 y 1414) para la conjugación selectiva del sitio a una región Fc manipulada de IgG humana haciendo reaccionar la porción de bromoacetamida de los péptidos con el residuo de cisteína libre para lograr un enlace tioéter covalente. Las secuencias de los dos péptidos se muestran en la Tabla 16. La secuencia de la proteína Fc se muestra a continuación.
Secuencia E53C (E384C) (SEQ ID NO: 1415),
1 MDKTHTC1PPC2PAPELLGGPSVFLFPPKPKD 30
31 TLMISRTPEVTC3VWDVSHEDPCVKFNWYV 60
61 DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVL 90
91 HQDWLNGKEYKC3KVSNKALPAPIEKTISKA 120
121 KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTC4LV 150
151 KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD 180
131 SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC4 SVMH 210
211 EALHNHYTQKSLSLSPGK
La C subrayada indica el sitio de la cisteína manipulada y el punto de fijación covalente del agonista de APJ. En el homodímero, C7-C7 y C10-C10 son disulfuros intermoleculares, mientras que C42-C102 y C148-C206 son disulfuros intramoleculares. x Se puede encontrar información adicional relacionada con esto en la Pub. de EE.UU. N° 2012/0009205
TABLA 16. Secuencias de aminoácidos de los agonistas de APJ para la conjugación de proteínas selectiva del sitio.
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La proteína Fc forma un homodímero al plegarse y, por lo tanto, contiene dos sitios reactivos manipulados por cada proteína plegada. Cada uno de los conjugados de Fc-homodímero contendrá idealmente dos copias del agonista de APJ. Los conjugados se denominaron FcE52C-ap13 y FcE52C-ap17 (13 y 17 son el número de residuos en el péptido, 1 vez para 1 péptido, 2 veces para dos péptidos unidos covalentemente a Fc a través de un enlace tioéter).
Los resultados de este experimento se muestran en la Figura 15 con la comparación de la actividad de los conjugados Fc con la SEQ ID NO: 128. Se conjugaron con éxito dos agonistas de APJ peptídicos de diferentes longitudes con una proteína Fc manipulada con cisteína de una manera selectiva del sitio. Los conjugados Fc que contienen un péptido y dos péptidos por cada proteína Fc se separaron por cromatografía. Los conjugados péptido-proteína mantienen la potencia y eficacia en los receptores APJ humanos y de rata. Los conjugados se compararon con pirapelina-13 de tipo salvaje (SEQ ID NO: 128) tanto en APJ de rata como humana y se encontró que tenían una potencia y eficacia superiores o equivalentes.
Los resultados de otro experimento que utiliza varios conjugados de proteína de la Tabla 17 se muestran en la Figura 16. Los resultados de este experimento se muestran en la Figura 16 con la comparación de la actividad de los conjugados Fc con la SEQ ID NO: 128. Agonistas de APJ peptídicos de diferentes longitudes de espaciadores entre el péptido y el enlazador de conjugación se conjugaron con éxito con dos proteínas Fc modificadas con cisteína diferentes de una manera selectiva del sitio. Los conjugados Fc que contienen un péptido y dos péptidos por cada proteína Fc se separaron por cromatografía. Los conjugados péptido-proteína se testaron frente al receptor de APJ humano y mantuvieron la potencia y eficacia. Los conjugados se compararon con pir-apelina-13 de tipo salvaje (SEQ ID NO: 128) y se encontró que tenían una potencia y eficacia superiores o equivalentes.
TABLA 17. CONJUGADOS DE PROTEÍNAS
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La siguiente es la secuencia para huFc (T487C) (SEQ ID NO: 1462):
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAP IEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMCKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK EJEMPLO 9
En la Tabla 18 se pueden encontrar péptidos adicionales que se pueden utilizar como agonistas de apelina.
TABLA 18.
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A lo largo de esta memoria descriptiva se ha hecho referencia a diversas publicaciones, patentes y solicitudes de patentes. Sin embargo, la referencia a documentos de este tipo no debe interpretarse como un reconocimiento de que este tipo de memorias son estado de la técnica anterior a la solicitud. Además, el mero hecho de que se pueda hacer referencia a un documento no indica necesariamente que la solicitante estén completamente de acuerdo con el contenido del documento.

Claims (6)

REIVINDICACIONES
1. Un agonista peptídico de APJ que tiene una estabilidad incrementada in vitro con relación a Apelina-13 de tipo salvaje (SEQ ID NO: 2), en donde el agonista se modifica con un grupo que prolonga la semivida en el extremo N o en una cadena lateral del agonista peptídico, en donde el agonista peptídico comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de:
SEQ ID NOs 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 43 y48,
en donde el agonista peptídico se une y activa el receptor APJ,
en donde el grupo que prolonga la semivida es PEG.
2. El agonista peptídico de APJ de la reivindicación 1, en donde la estabilidad incrementada es una semivida incrementada in vitro.
3. El agonista peptídico de APJ de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el grupo PEG es tiopropionilo (mPEG 20K) o Atz (mPEG 20K).
4. El agonista APJ de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para uso en un método de mejorar la contractilidad cardíaca en un paciente que lo necesite.
5. El agonista APJ de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para uso en un método de mejorar la función sistólica o diastólica en un paciente que lo necesite.
6. El agonista APJ de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para uso en un método de tratar la insuficiencia cardíaca en un paciente que lo necesite.
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