ES2397852T3 - Antagonistas y conjugados de péptidos CGRP - Google Patents

Abstract

Una composición de materia que comprende: un péptido CGRP que comprende una secuencia de aminoácidos de fórmula: Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4Xaa5Xaa6Xaa7V8Xaa9Xaa10Xaa11Xaa12Xaa13Xaa14Xaa15Xaa16Xaa17Xaa18Xaa19Xaa20G21 V22Xaa23Xaa24Xaa25Xaa26F27V28p29Xaa30Xaa31V32G33Xaa34Xaa35Xaa36Xaa37 (SEO ID NO: 1130) en la que: Xaa1, Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa5, Xaa6 y Xaa7 están cada uno independientemente ausentes o son un residuo de aminoácido hidrófobo; Xaa9 es un residuo de Thr, Ser, Ala, Gly, Val, Leu o lIe; Xaa 10 es un residuo de His, NU-metil-His, Lys, homolisina, omitina o 4-amino-Phe.

Description

Antagonistas y conjugados de péptidos CGRP.

Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional estadounidense n° 60/729.083, presentada el 21 de octubre de 2005

Antecedentes de la invención

1. Campo de la invención

La presente invención se refiere a las técnicas bioquímicas, en particular a conjugados de péptidos terapéuticos.

2. Discusión de la técnica relacionada

La superfamilia de péptidos de calcitonina (CT) incluye al menos cinco miembros conocidos: CT, amilina (AMY), adrenomedulina (ADM) y dos péptidos relacionados con el gen de calcitonina, CGRP1 (también conocido como aCGRP) y CGRP2 (también conocido como ~CGRP). La calcitonina está implicada en el control del metabolismo óseo y también es activa en el sistema nervioso central (SNC). La amilina también tiene sitios de unión específicos en el SNC y se cree que regula el vaciado gástrico y tiene un papel en el metabolismo de los hidratos de carbono. La ADM es un potente vasodilatador. La ADM tiene receptores específicos en astrocitos y su ARN mensajero se regula por incremento en tejidos del SNC que se ven sometidos a isquemia. (Zimmermann, et al., Identification of adrenomedullin receptors in cultured rat astrocytes and in neuroblastoma glioma hybrid cells (NG108-15), Brain Res., 724:238-245 (1996); Wang et al., Discovery of adrenomedullin in rat ischaemic cortex and evidence for its role in exacerbating focal brain ischaemic damage, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 92: 1 1480-1 1484 (1995». Las actividades biológicas de CGRP incluyen la regulación de las uniones neuromusculares, de la presentación de antígenos dentro del sistema inmunitario, del tono vascular y de la neurotransmisión sensorial. (Poyner, D. R., Calcitonin gene-related peptide: multiple actions, multiple receptors, Pharmacol. Ther., 56:23-51 (1992); Muff et al., Calcitonin, calcitonin gene related peptide, adrenomedullin and amylin: homologous peptides, separate receptors and overlapping biological actions, Eur. J. Endocrinol., 133: 17-20 (1995». Se han identificado recientemente tres péptidos estimulantes del receptor de calcitonina (CRSP) en varias especies de mamífero; los CRSP pueden formar una nueva subfamilia en la familia de CGRP, sin embargo, las formas moleculares endógenas, los receptores y la actividad biológica de los CRSP sigue sin identificarse. (Katafuchi, T y Minamino, N, Structure and biological properties of three calcitonin receptor-stimulating peptides, novel members of the calcitonin gene-related peptide family, Peptides, 25(11 ):2039-2045 (2004».

Los péptidos de la superfamilia de CT actúan a través de receptores acoplados a proteínas G con siete dominios transmembrana (GPCR). El receptor de CT y los receptores de CGRP son GPCR de tipo 11 ("familia B"), familia que incluye otros GPCR que reconocen péptidos reguladores tales como secretina, glucagón y polipéptido intestinal vasoactivo (VIP). Las variantes de corte y empalme mejor caracterizadas del receptor de CT humana difieren dependiendo de la presencia (anteriormente CTRII+ o CTR1, actualmente conocida como CT(b) o ausencia (la variante de corte y empalme principal, anteriormente CTRII_ o CTR2, actualmente conocida como CT(a) de 16 aminoácidos en el primer bucle intracelular. (Gorn et al., Expression of two human skeletal calcitonin receptor isoforms cloned from a giant cell tumor of bone: the first intracellular doma in modulates ligand binding and signal transduction, J. Clin. Invest., 95:2680-2691 (1995); Hay et al., Amylin receptors: molecular composition and pharmacology, Biochem. Soco Trans., 32:865-867 (2004); Poyner et al., 2002). Se había propuesto la existencia de al menos dos subtipos de receptores de CGRP a partir de las afinidades de antagonistas y potencias de agonistas diferenciales en una variedad de bioensayos in vivo e in vitro. (Dennis et al., CGRP8-37, A calcitonin gene-related peptide antagonist revealing calcitonin gene-related peptide receptor heterogeneity in brain and periphery, J. Pharmacol. Exp. Ther., 254: 123-128 (1990); Dennis et al., Structure-activity profile of calcitonin gene-related peptide in peripheral and brain tissues. Evidence for receptor multiplicity, J. Pharmacol. Exp. Ther., 251: 718-725 (1989); Dumont et al., A potent and selective CGRP2 agonist, [Cys(Et)2,7]hCGRP: comparison in prototypical CGRP1 and CGRP2 in vitro assays, Can. J. Physiol. Pharmacol., 75:671-676 (1997».

Se encontró que el subtipo de receptor de CGRP1 era sensible al fragmento de antagonista CGRP(8-37). (Chiba et al., Calcitonin gene-related peptide receptor antagonist human CGRP-(8-37), Am. J. Physiol., 256:E331-E335 (1989); Dennis et al. (1990); Mimeault et al., Comparative affinities and antagonistic potencies of various human calcitonin gene-related peptide fragments on calcitonin gene-related peptide receptors in brain and periphery, J Pharmacol. Exp. Ther., 258: 1084-1090 (1991». En cambio, el receptor de CGRP2 era sensible a análogos de CGRP humano lineales (hCGRP), en los que los residuos de cisteína en las posiciones 2 y 7 se derivatizaron (por ejemplo, con acetoaminometilo [Cys(ACM)2,7] o etilamida [CYS(Et)2,7]), pero el receptor de CGRP2 era insensible al fragmento CGRP(8-37). (Dennis et al. (1989); Dennis et al. (1990); Dumont et al. (1997». En 1998, se identificó el receptor de CGRP1 como un heterodímero compuesto por una proteína accesoria de dominio transmembrana único novedosa, una proteína 1 modificadora de la actividad de receptores (RAMP1) Y un receptor de tipo receptor de calcitonina (CRLR o "CL"). (McLatchie et al., RAMPs regulate the transport and ligand specificity of the calcitonin-receptor-like receptor, Nature, 393:333-339 (1998».

CRLR tiene una identidad de secuencia de aminoácidos global del 55% con el receptor de CT, aunque los dominios transmembrana son casi el 80% idénticos. (McLatchie et al. (1998); Poyner et al., International union of pharmacology. XXXII. The mammalian calcitonin gene-related peptides, adrenomedullin, amylin and calcitonin receptors, Pharmacol. Rev., 54:233-246 (2002)).

La especificidad de ligando del receptor de CT y CRLR depende de la coexpresión de miembros de una familia de proteínas accesorias denominadas proteínas modificadoras de la actividad de receptores (RAMP). La familia de RAMP incluye tres que actúan como moduladores de receptores que determinan la especificidad de ligando de receptores para los miembros de la familia de CT. Las RAMP son proteínas transmembrana de tipo I que comparten una identidad de secuencia de aminoácidos de aproximadamente el 30% y una topología pronosticada común, con extremos C-terminales citoplasmáticos cortos, un dominio transmembrana y extremos N-terminales extracelulares grandes que son responsables de la especificidad. (McLatchie et al. (1998); Fraser et al., The amino terminus of receptor activity modifying proteins is a critical determinant of glycosylation state and ligand binding of calcitonin receptor-like receptor, Molecular Pharmacology, 55: 1054-1059 (1999)).

Se ha mostrado que CRLR forma un receptor de alta afinidad para CGRP, cuando se asocia con RAMP1, o que se une preferentemente a ADM cuando se asocia con RAMP2 o RAMP3. (McLatchie et al. (1998); Sexton et al., Receptor activity modifying proteins, Cellular Signaling, 13:73-83 (2001); Conner et al., Interaction of calcitonin-generelated peptide with its receptors, Biochemical Society Transactions 30 (parte 4): 451-454 (2002)). El estado de glicosilación de CRLR está asociado con su farmacología. RAMP 1, 2 Y 3 transportan CRLR a la membrana plasmática con eficacias similares, sin embargo RAMP1 presenta CRLR como una glicoproteína madura, glicosilada de manera terminal y un receptor de CGRP, mientras que RAMP 2 Y 3 presentan CRLR como un receptor de ADM glicosilado en el centro, inmaduro. (Fraser et al. (1999)). La caracterización de los receptores CRLR/RAMP2 y CRLR/RAMP3 en células HEK293T mediante unión a radioligando C251-ADM como radioligando), ensayo funcional (medición de AMPc) o análisis bioquímico (electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida) reveló que eran indistinguibles, aún cuando RAMP 2 Y 3 comparten una identidad de secuencia de aminoácidos de sólo el 30%. (Fraser et al. 1999)).

Se han observado diferencias, sin embargo, en la farmacología para CRLR expresado con RAMP 2 frente a RAMP 3. Tanto aCGRP como CGRP8-37 así como ADM y ADM 22-52 son activos en el heterodímero de RAMP 3, lo que indica que este complejo puede actuar como tanto un CGRP como un receptor de ADM. (Howitt et al., British Journal of Pharmacology, 140:477-486 (2003); Muff et al., Hypertens. Res., 26:S3-S8 (2003)). La coexpresión de CRLR humano con RAMP1 de rata, y viceversa, mostró que la especie RAMP1 determinaba las características farmacológicas del complejo CRLR/RAMP1 con respecto a varios antagonistas de receptores de CGRP de molécula pequeña sometidos aprueba. (Mallee et al., Receptor Activity-Modifying Protein 1 determines the species selectivity of non-peptide CGRP receptor antagonists, J. Biol. Chem., 277(16):14294-14298 (2002)). A menos que esté asociado con una RAMP, se desconoce que CRLR se una a ningún ligando endógeno; actualmente es el único GPCR que se cree que se comporta de este modo. (Conner et al., A key role for transmembrane prolines in calcitonin receptor-like agonist binding and signaling: implications for family B G-protein-coupled receptors, Molec. Pharmacol., 67(1):20-31 (2005)).

También se ha demostrado que el receptor de CT forma complejos heterodiméricos con RAMP, que se conocen como receptores de amilina. Generalmente, los receptores de CT/RAMP1 (AMY1)) tienen alta afinidad por CT, AMY Y CGRP de salmón y afinidad inferior por CT de mamífero. Para receptores de CT/RAMP2 (AMY2) y receptores de CT/RAMP3 (AMY3), se observa principalmente un patrón similar, aunque la afinidad por CGRP es inferior y puede no ser significativa a concentraciones de ligando fisiológicamente relevantes. El fenotipo preciso de receptor depende del tipo de célula y de la variante de corte y empalme del receptor de CT (CT(a) o CT(b)), particularmente para receptores de AMY generados por RAMP2. Por ejemplo, una población pura de células similares a osteoclastos expresaba de manera notificada RAMP2, receptor de CT y CRLR, pero no RAMP1 o RAMP3. (Hay et al. (2004); Christopoulos et al., Multiple amylin receptors arise from receptor activity-modifying protein interaction with the calcitonin receptor gene product, Molecular Pharmacology, 56:235-242 (1999); Muff et al., An amylin receptor is revealed following co-transfection of a calcitonin receptor with receptor activity modifying proteins-1 or -3, Endocrinology, 140:2924-2927 (1999); Sexton et al. (2001); Leuthiiuser et al., Receptor-activity-modifying protein 1 forms heterodimers with two G-protein-coupled receptors to define ligand recognition, Biochem. J., 351: 347-351 (2000); Tilakaratne et al., Amylin receptor phenotypes derived from human calcitonin receptor/RAMP coexpression exhibit pharmacological differences dependent on receptor isoform and host cell environment, J, Pharmacol. Exp. Ther., 294:61-72 (2000); Nakamura et al., Osteoclast-like cells express receptor activity modifying protein 2: application of laser capture microdissection, J. Molec. Endocrinol., 34:257-261 (2005)).

Las respuestas sensibles a CGRP mediadas por CT/RAMP se bloquean mediante el antagonista de receptor selectivo calcitonina(8-32) pero no mediante CGRP(8-37), que antagoniza el complejo CRLR/RAMP1 (receptor de CGRP1). (Kuwasako et al., Novel calcitonin-(8-32)-sensitive adrenomedullin receptors derived from co-expression of calcitonin receptor with receptor activity-modifying proteins, Biochem. Biophys. Res. Commun., 301: 460-464 (2003); Leuthauser et al., 2000).

El péptido aCGRP (también conocido como CGRP1) y el péptido ~CGRP (también conocido como CGRP2) tienen 37 residuos de aminoácido de longitud y difieren entre sí en tres aminoácidos. Estas dos isoformas han demostrado hasta la fecha ser indistinguibles en sus actividades biológicas. (Poyner, D. R. (1992); Muff et al. (1995)). aCGRP y ~CGRP humanos nativos contienen cada uno un puente disulfuro entre residuos de cisteína en las posiciones de aminoácido 2 y 7 Y una fenilalaninamida carboxilo-terminal, ambos de los cuales se requieren para la actividad biológica de los péptidos nativos. (Wimalawansa, SJ, Amylin, calcitonin gene-related peptide, calcitonin and adrenomedullin: a peptide superfamily, Crit. Rev. Neurobiol., 11: 167-239 (1997)). Sus sitios de unión están ampliamente distribuidos entre tejidos periféricos y en el sistema nervioso central, lo que permite que CGRP ejerza una amplia variedad de efectos biológicos, incluyendo una potente vasodilatación. (Van Rossum et al., Neuroanatomical localization, pharmacological characterization and functions of CGRP, related peptides and their receptors, Neurosci. Biobehav. Rev., 21: 649-678 (1997)).

Estudios estructurales que investigan la interacción de CGRP con su receptor han definido tanto subdominios funcionales como residuos específicos implicados en la unión y activación del receptor. (Conner, A.C., Biochem. Soco Trans., 30:451-455 (2002». Tal como se ilustra en la figura 1, se cree que los primeros siete residuos de aminoácido de CGRP, que forman un bucle unido por puentes disulfuro, interaccionan con el dominio transmembrana de CRLR para provocar la activación del receptor. El fragmento CGRP(8-37) se une con alta afinidad al receptor de CGRP1, pero actúa como antagonista. El resto de la molécula de CGRP se encuentra en tres dominios o regiones: los residuos de aminoácido 28-37 y 8-18 se requieren normalmente para la unión de alta afinidad con el receptor de CGRP1, mientras que los residuos 19-27 forman una región de bisagra, que parece permitir una estructura de tipo horquilla en la que los dos subdominios interaccionan entre sí en la superficie de contacto con el receptor. Se cree que la región 28-37 está en contacto directo con el receptor durante la unión, mientras que la región de a-hélice que comprende los residuos 8-18 puede producir contactos adicionales con el receptor o puede estabilizar una conformación apropiada de la región 28-37. Es probable que estas regiones de unión de CGRP interaccionen con el receptor de CGRP1 tanto en el CRLR como en el dominio extracelular de RAMP1. Se ha mostrado que el residuo carboxilo-terminal amidado es esencial para una unión de alta afinidad a receptores de CGRP1 por CGRP y análogos de péptidos CGRP. Análisis de mutación han implicado además a los residuos seleccionados R11, R18, T30, V32, S34 y F37 en la unión al receptor. (Rist et al., From micromolar to nanomolar affinity: a systematic approach to identify the binding site of CGRP at the human calcitonin gene-related peptide 1 receptor, J. Med. Chem., 41: 117-123 (1998); Conner et al., Interaction of calcitonin-gene-related peptide with its receptors, Biochem. Soco Trans., 30(4):451-455 (2002); Smith et al., Modifications to the N-terminus but not the C-terminus of calcitonin gene-related peptide(8-37) produce antagonists with increased affinity, J. Med. Chem., 46:2427-2435 (2003».

Además, se han identificado truncamientos amino-terminales de CGRP (por ejemplo, CGRP(8-37)) que son antagonísticos para el receptor. Mientras que truncamientos adicionales (por ejemplo, CGRP(28-37)) muestran muy poca unión al receptor, gran parte de la actividad antagonista perdida puede restaurarse con tres mutaciones puntuales (T300, V32P y G33F) en la región de CGRP(28-37). (Rist, B. et al., J. Med. Chem., 41: 117-123 (1998)). Se ha sugerido que estas sustituciones de aminoácidos compensan el dominio (CGRP(8-27) que falta (Carpenter,

K.A. et al., Turn structures in CGRP C-terminal analogues promote stable arrangements of key residue side chains, Biochemistry, 40:8317-8325 (2001)).

Se cree que CGRP tiene un papel causante en la migraña. La fisiopatología de la migraña implica la activación de los ganglios trigeminales, en los que se localiza CGRP, y los niveles de CGRP aumentan significativamente durante un ataque de migraña. Esto, a su vez, promueve la dilatación de los vasos sanguíneos craneales y la sensibilización e inflamación neurogénicas. (Ooods, H., Curr. Opino Investig. Orugs, 2: 1261-1268 (2001)). Se ha mostrado que CGRP induce cefaleas por migraña en pacientes susceptibles a migrañas. Además, en un reciente ensayo clínico de fase 11, se ha mostrado que un potente antagonista de CGRP de molécula pequeña alivia el dolor por migraña. CGRP también puede estar implicado en síndromes de dolor crónico distintos de migraña. En roedores, CGRP administrado por vía intratecal induce dolor grave, y los niveles de CGRP están potenciados en varios modelos de dolor. Además, antagonistas de CGRP bloquean el dolor inducido por capsaicina y neuropático en roedores. Conjuntamente, estas observaciones implican que un antagonista de receptores de CGRP potente y selectivo puede ser un compuesto terapéutico eficaz para el tratamiento del dolor crónico, incluyendo migraña.

También se ha implicado a CGRP en diabetes mellitus (tipo 11), inflamación, trastornos cardiovasculares y en las alteraciones hemodinámicas asociadas con endotoxemia y septicemia que resultan de infección posoperatoria y una variedad de otras enfermedades infecciosas. (Por ejemplo, Khachatryan, A et al., Targeted expression of the neuropeptide calcitonin gene-related peptide to beta cells prevents diabetes in NOO mice, J Immunol., 158(3): 14091416 (1997); Ohtori S et al., Phenotypic inflammation switch in rats shown by calcitonin gene-related peptide immunoreactive dorsal root ganglion neurons innervating the lumbar facet joints, Spine, 26(9): 1009-1013 (2001); Oin, X et al. Temporal and spatial distribution of Sustance P and its receptor regulated by calcitonin gene-related peptide in the development of airway hyperresponsiveness, FEBS Journal, sitio web del 30° congreso de la FEBS y

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conferencia de la IUMB, resumen n.o M3-020P (2005); Brain, SO et al., Evidence that calcitonin gene-related peptide contributes to inflammation in the ski n and joint, Ann. NY Acad. ScL, 657(1):412-419 (1992); Caviedes-Bucheli, J. et al., Expression of calcitonin gene-related peptide(CGRP) in irreversible acute pulpitis, J. Endodontics, 30(4):201-204 (2004); Ling, 00 et al., The pattern and distribution of calcitonin gene-related peptide (CGRP) terminals in the rat dorsal following neonatal peripheral inflammation, Neuroreport, 14(15): 1919-1921 (2003); Li, Y J et al., CGRP-mediated cardiovascular effect of nitroglycerin, Med Hypotheses, 60(5):693-698 (2003); Beer, S et al., Systemic neuropeptide levels as predictive indicators for lethal outcome in patients with postoperative sepsis, Critical Care Medicine, 30(8): 1794-1798 (2002».

Evans et al. enseñaron la administración terapéutica de análogos de CGRP para la disminución de la tensión arterial y la secreción de ácido gástrico, y para otros efectos sobre, por ejemplo, el comportamiento de ingestión, el gusto y la percepción sensorial, por ejemplo, la nocicepción. (Documentos US 4.530.838; US 4.736.023).

Se ha propuesto el uso terapéutico de antagonistas de CGRP y aptámeros que seleccionan como diana CGRP para el tratamiento de migraña y otros trastornos. (Por ejemplo, Olesen et al., Calcitonin gene-related peptide receptor antagonist BIBN 4096 BS for the acute treatment of migraine, New Engl. J. Med., 350:1104-1110 (2004); Perspective: CGRP-receptor antagonists-a fresh approach to migraine, New Engl. J. Med., 350:1075 (2004); Vater et al., Short bioactive Spiegelmers to migraine-associated calitonin gene-related peptide rapidly identified by a novel approach: tailored-SELEX, Nuc. Acids Res., 31 (21 e130): 1-7 (2003); documento WO 96/03993).

Por ejemplo, Noda et al. describieron el uso de CGRP o derivados de CGRP para inhibir la agregación plaquetaria y para el tratamiento o la prevención de arteriosclerosis o trombosis. (Documento EP 0385712 B1).

Liu et al. dieron a conocer agentes terapéuticos que modulan la actividad del receptor de cr, incluyendo péptidos conjugados con vehículo tales como calcitonina y aCGRP humana. (Documentos WO 01/83526 A2; US 2002/0090646 A 1).

Smith et al. dieron a conocer antagonistas de péptidos CGRP vasoactivos y su uso en un método para inhibir la unión de CGRP a receptores de CGRP; se mostró que tales antagonistas de péptidos CGRP inhibían la unión de CGRP a membranas de arterias coronarias y relajaban arterias coronarias de cerdo tratadas con capsaicina. (Documentos US 6.268.474 B1; Y US 6.756.205 B2).

Rist et al. dieron a conocer análogos de péptido con actividad antagonista del receptor de CGRP y su uso en un fármaco para el tratamiento y la profilaxis de una variedad de trastornos. (Documento DE 19732944 A 1).

No obstante, los péptidos CGRP han mostrado varios problemas como productos terapéuticos. Los péptidos CGRP nativos son normalmente no selectivos, inactivos en forma oral, tienen generalmente una corta duración de acción y pueden provocar varios efectos secundarios posibles que pueden incluir efectos no deseados sobre la tensión arterial. En general, las proteínas y los péptidos terapéuticos presentan un aclaramiento plasmático muy rápido, requiriendo por tanto frecuentes inyecciones para garantizar niveles sanguíneos farmacéuticamente relevantes constantes de una proteína o un péptido particular con actividad farmacológica. Muchas proteínas y péptidos farmacéuticamente relevantes, incluso los que tienen estructura primaria humana, pueden ser inmunogénicos, dando lugar a anticuerpos neutralizantes que circulan en el torrente sanguíneo. Esto es especialmente cierto para la administración intravenosa y subcutánea, que es de particular interés para la administración de la mayoría de los fármacos de péptido o proteína.

Al aumentar el volumen molecular y enmascarar posibles epítopos, se ha mostrado que la modificación de un polipéptido terapéutico con un vehículo, tal como un polímero de polietilenglicol (PEG), es eficaz en la reducción de tanto la tasa de aclaramiento así como la antigenicidad de la proteína. La reducción de la proteólisis, el aumento de la solubilidad en agua, la reducción del aclaramiento renal y el impedimento esté rico al aclaramiento mediado por receptor son varios de los mecanismos mediante los cuales la unión de un polímero al esqueleto de un polipéptido puede demostrar ser beneficiosa en la potenciación de las propiedades farmacocinéticas del fármaco. Por ejemplo, Davis et al enseñaron la conjugación de PEG o polipropilenglicol con proteínas tales como enzimas e insulina para producir un producto menos inmunogénico mientras que se retenía una proporción sustancial de la actividad biológica. (Documento US 4.179.337).

En la práctica real de desarrollo de un fármaco de péptido conjugado, no es un asunto trivial superar la potencia significativamente inferior que una forma conjugada presenta normalmente en relación con la forma no conjugada del péptido. (J.M. Harrist et al., PEGylation: A Novel Process for Modifying Pharmacokinetics, CHn. Pharmacokinet, 40:539-551 (2001); Y R. Mehvar, Modulation of the Pharmacokinetics and Pharmacodynamics of Proteins by Polyethylene Glycol Conjugation, J. Pharm. Pharmaceut. Sci., 3:125-136 (2000».

Por tanto, se desea combinar los beneficios terapéuticos de péptidos CGRP conjugados con vehículo y análogos (particularmente, pero sin limitarse a, aquéllos con actividad antagonista del receptor de CGRP), tales como semivida farmacológica sustancialmente aumentada e inmunogenicidad disminuida, con poca, si acaso alguna, pérdida de potencia en relación con formas no conjugadas. Estos y otros beneficios se proporcionan mediante la presente invención.

Sumario de la invención

La presente invención se define en las reivindicaciones. La presente invención se refiere a: composiciones de materia que implican antagonistas de péptidos CGRP (es decir, péptidos CGRP específicos que son antagonistas de receptores de CGRP1). En algunas realizaciones, estos antagonistas de péptidos CGRP están conjugados con vehículo, o alternativamente, en otras realizaciones, no están conjugados con un vehículo (es decir, péptidos "no conjugados" o "libres" o "desnudos"). Algunos de los antagonistas de péptidos CGRP conjugados con vehículo de la invención incluyen los que tienen una secuencia de péptido CGRP nativa. Alternativamente, ya sea en realizaciones conjugadas con vehículo o no conjugadas, los antagonistas de péptidos CGRP de la presente invención incluyen análogos de péptidos CGRP que contienen modificaciones en relación con una secuencia de CGRP nativa de interés, y pueden contener residuos de aminoácido que son canónicos o no canónicos, poco comunes de manera natural y/o no naturales. El péptido CGRP puede poseer o bien una secuencia de CGRP de longitud completa, o bien un fragmento truncado de la misma, siempre que tenga una primera región de unión al receptor de CGRP1 proximal al extremo carboxilo terminal del péptido.

También se describen en el presente documento métodos de producción de las composiciones de materia; composiciones farmacéuticas que contienen la composición de materia, es decir, el antagonista de péptido CGRP y un portador farmacéuticamente aceptable; y usos clínicos que implican la administración del antagonista de péptido CGRP a un paciente.

Las composiciones de materia y composiciones farmacéuticas de la presente invención, que comprenden los antagonistas de péptidos CGRP, pueden proporcionar una semivida farmacológica in vivo sustancialmente aumentada y/o inmunogenicidad disminuida, en comparación con formas no conjugadas correspondientes o secuencias de aminoácidos no modificadas, mientras que se mantiene una potencia relativamente alta.

El antagonista de péptido CGRP conjugado con vehículo, o no conjugado, implicado en la composición de materia de la invención, incluye un péptido CGRP que carece de una región de activación del receptor de CGRP1 funcional, pero incluye desde su extremo C-terminal hasta su extremo N-terminal:

el resto carboxilo C-terminal se reemplaza por un resto seleccionado de:

(A)

-C(=O)NRR, en el que R es independientemente hidrógeno, alquilo (C1-Ca), haloalquilo, arilo o heteroarilo; y

(B)

-CH20R en el que R es H (por ejemplo, representando un alcohol de péptido), o alquilo (C1-Ca), arilo o heteroarilo (por ejemplo, representando un éster de péptido). Por ejemplo, en (A) el NRR puede representar un resto amida (denominado de manera intercambiable u-amida" o u-NH2" o U-NH2" en el extremo C-terminal de las secuencias enumeradas en el presente documento), alquil o arilamida N-mono-sustituida o N-di-sustituida; y

el péptido CGRP incluye una primera región de unión al receptor de CGRP1.

En realizaciones conjugadas con vehículo, se conjuga un vehículo farmacéuticamente aceptable con el péptido CGRP en un sitio en el péptido CGRP distinto de su residuo de aminoácido carboxilo terminal.

Por consiguiente, también se describe en el presente documento un método de producción de una composición de materia que implica obtener un péptido CGRP que carece de una región de activación del receptor de CGRP1 funcional, péptido CGRP que incluye desde su extremo C-terminal hasta su extremo N-terminal: un resto amida en el extremo C-terminal; y una primera región de unión al receptor de CGRP1. El péptido CGRP obtenido se conjuga con un vehículo farmacéuticamente aceptable en un sitio en el péptido obtenido distinto de en el residuo de aminoácido C-terminal.

La presente invención también se refiere al uso de la composición de materia de la invención en un método de tratamiento de la migraña, en el que se administra a un paciente que necesita tal tratamiento una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición de materia de la invención, de modo que se alivian uno o más síntomas de la migraña en el paciente.

También se describe en el presente documento el uso de la composición de materia de la invención en un método de prevención o mitigación de la migraña, que implica administrar a un paciente que ha experimentado previamente una migraña una cantidad profilácticamente eficaz de la composición de materia de la invención, de modo que se previene o mitiga al menos un síntoma de una migraña posterior.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 muestra la secuencia de aminoácidos nativa de aCGRP humano de longitud completa (SEO ID NO: 43) con dominios funcionales y elementos estructurales secundarios definidos. Los residuos sombreados (R11, R18, T30, V32, S34 y F35-amida) se han implicado por el estado de la técnica en la unión al receptor, con modificaciones en las posiciones que tienen normalmente un efecto positivo o negativo sobre la unión a CGRP1. Fuente: Conner et al., Interaction of calcitonin-gene-related peptide with its receptors, Biochemical Society Transactions, 30 (parte 4): 451-454 (2002).

La figura 2 ilustra los fragmentos de escisión proteolítica M1-M8 de SEO ID NO: 7 tras la incubación en plasma de rata al 10% durante 1 hora a temperatura ambiente, detectados mediante CUEM produciéndose las escisiones principales después de L 16, S17 Y R18 en relación con la secuencia de aCGRP humana nativa.

La figura 3 representa algunas realizaciones de las posiciones dentro de un péptido CGRP que están separadas por 1 o más aminoácidos que pueden unirse para formar una lactama cíclica.

La figura 4 ilustra los efectos de algunos codisolventes de alcohol diferentes sobre los rendimientos de reacción para la pegilación de un péptido CGRP relativamente soluble (tabla 4, SEO. ID NO: 7).

La figura 5 muestra una comparación de los efectos de IPA y TFE sobre la eficacia de pegilación de un péptido CGRP relativamente soluble (tabla 4, SEO ID NO: 7) y un péptido CGRP relativamente insoluble (tabla 7, SEO ID NO: 31).

La figura 6 muestra el efecto de codisolvente sobre la eficacia de pegilación de un péptido CGRP relativamente soluble, SEO. ID NO: 7 en presencia de IPA (-G-) o TFE e-~)o HFIPA ( O ).

La figura 7 muestra el efecto de la concentración de codisolvente sobre la eficacia de pegilación de un péptido CGRP relativamente insoluble, SEO ID NO: 739, en presencia de IPA (-G-) o TFE e-V -) o HFIPA ( O ).

La figura 8 muestra el efecto de la concentración de codisolvente sobre la eficacia de pegilación de un péptido CGRP relativamente insoluble, SEO ID NO: 658, en presencia de IPA (-G-) o TFE C-~)o HFIPA ( O ).

La figura 9 muestra la identificación metabólica in vitro de la SEO ID: NO: 658 en plasma humano al 100% tras 4 horas de incubación a temperatura ambiente.

La figura 10 muestra la identificación metabólica in vitro de la SEO ID: NO: 144 en plasma humano al 100% tras 4 horas de incubación a temperatura ambiente.

La figura 11 muestra la identificación metabólica in vitro de la SEO ID: NO: 658 en plasma de mono al 100% tras 4 horas de incubación a temperatura ambiente.

La figura 12 muestra la identificación metabólica in vivo de la SEO ID NO: 658 en plasma de mono durante 30 minutos de infusión intravenosa con una dosis de 6 mg/kg.

La figura 13 ilustra algunas técnicas de síntesis de péptidos que pueden emplearse en la preparación de péptidos CGRP según la presente invención.

Descripción detallada las realizaciones preferidas

La presente invención se refiere a una composición de materia que implica un antagonista de péptido CGRP conjugado con vehículo que se une preferentemente a un receptor de CGRP, de mamífero y antagoniza su actividad biológica. Los receptores de CGRP, de mamífero pueden incluir los de seres humanos u otros primates, roedores, caninos, felinos o cualquier otro mamífero de interés, o de células de mamífero cultivadas o recogidas.

La siguiente descripción de la invención se limita sólo por las reivindicaciones adjuntas.

"Polipéptido" y "proteína" se usan de manera intercambiable en el presente documento e incluyen una cadena molecular de aminoácidos unidos a través de enlaces peptídicos. Los términos no hacen referencia a una longitud específica del producto. Por tanto, "péptidos" y "oligopéptidos" se incluyen dentro de la definición de polipéptido. Los términos incluyen modificaciones postraduccionales del polipéptido, por ejemplo, glicosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones y similares. Además, se incluyen fragmentos de proteínas, análogos, proteínas mutadas o variantes, proteínas de fusión y similares dentro del significado de polipéptido. Los términos también incluyen moléculas en las que se incluyen uno o más análogos de aminoácido o aminoácidos no canónicos o no naturales.

"Receptor de CGRP," significa un complejo CRLR/RAMP1 (o "CRLR-RAMP1") integrado en la membrana celular.

Un "péptido CGRP" es un péptido que se une preferentemente al receptor de CGRP, en condiciones fisiológicas de temperatura, pH y fuerza iónica. Para fines de la presente invención, los péptidos CGRP incluyen los que tienen una secuencia de péptido CGRP nativa completa y análogos de péptidos CGRP no nativos que contienen modificaciones de una secuencia de CGRP nativa (por ejemplo, sustituciones, inserciones, deleciones de aminoácidos y/o truncamientos del extremo amino terminal tal como se describe adicionalmente en el presente documento a continuación) en relación con una secuencia de CGRP nativa de interés, que puede ser, por ejemplo, cualquier secuencia de CGRP de mamífero conocida, tal como pero sin limitarse a, la secuencia de aCGRP humana nativa o la secuencia de ~CGRP humana. Según la presente invención, en el péptido CGRP el resto carboxilo C-terminal se reemplaza por un resto seleccionado de: (A) -C(=O)NRR, en el que R es independientemente hidrógeno, alquilo (C,-Cs), haloalquilo, arilo o heteroarilo; y (B) -CH20R en el que R es H, alquilo (C,-Cs), arilo o heteroarilo. En algunas realizaciones, esto constituye una secuencia de aminoácidos amidada de manera carboxilo terminal, tal como, pero sin limitarse a, una secuencia que tiene un residuo de fenilalaninamida o residuo de tirosinamida C-terminal. (Véase, por ejemplo, Smith et al., Modifications to the N-terminus but not the C-terminus of calcitonin gene-related peptide(837) produce antagonists with increased affinity, J. Med. Chem., 46:2427-2435 (2003)).

"Arilo" es fenilo o fenilo fusionado de manera vecinal con un puente de carbono de 3, 4 ó 5 miembros saturado, parcialmente saturado o insaturado, estando sustituido el fenilo o el puente con O, 1, 2 ó 3 sustituyentes seleccionados de alquilo C,·s, haloalquilo CH o halógeno.

"Heteroarilo" es un anillo monocíclico de 5, 6 ó 7 miembros insaturado o bicíclico de 6, 7, 8, 9, 10 u 11 miembros parcialmente saturado o insaturado, en el que al menos un anillo está insaturado, conteniendo los anillos monocíclico y bicíclico 1, 2, 3 ó 4 átomos seleccionados de N, O Y S, en el que anillo está sustituido con O, 1, 2 ó 3 sustituyentes seleccionados de alquilo C'·8, haloalquilo CH y halógeno.

Aunque no son esenciales para la práctica de la presente invención, se conocen métodos de ensayo para la detección de la unión preferente al receptor de CGRP, (por ejemplo, McLatchie et al., Nature, 393:333-339 (1998); Rist et al., J. Med. Chem., 41:117-123 (1998)), y se muestran a modo de ejemplo adicionalmente en el presente documento a continuación.

Un "antagonista de péptido CGRP" es un péptido CGRP, tal como, pero sin limitarse a, un análogo de péptido CGRP, que antagoniza, bloquea, disminuye, reduce, impide o inhibe la activación del receptor de CGRP, por aCGRP o ~CGRP humanos nativos de longitud completa en condiciones fisiológicas de temperatura, pH y fuerza iónica. Los antagonistas de péptidos CGRP incluyen antagonistas completos y parciales. La presente invención no depende de ningún mecanismo particular de antagonismo. Por ejemplo, el antagonista de péptido CGRP puede actuar como antagonista competitivo o antagonista no competitivo. Tal actividad antagonista puede detectarse mediante métodos in vitro o métodos de ensayo funcional in vivo conocidos. (Véase, por ejemplo, Smith et al., Modifications to the N-terminus but not the C-terminus of calcitonin gene-related peptide(8-37) produce antagonists with increased affinity, J. Med. Chem., 46:2427-2435 (2003)).

El péptido CGRP está compuesto por de al menos 2 a aproximadamente 90 residuos de aminoácido conectados en una cadena principal por enlaces peptídicos. Los residuos de aminoácido se clasifican comúnmente según diferentes características químicas y/o físicas. El término "residuo de aminoácido ácido" se refiere a residuos de aminoácido en forma D o L que tienen cadenas laterales que comprenden grupos ácidos. Los residuos ácidos a modo de ejemplo incluyen residuos de aspartato y glutamato. El término "residuo de aminoácido aromático" se refiere a residuos de aminoácido en forma D o L que tienen cadenas laterales que comprenden grupos aromáticos. Los residuos aromáticos a modo de ejemplo incluyen residuos de triptófano, tirosina, 3-(1-naftil)alanina o fenilalanina. El término "residuo de aminoácido básico" se refiere a residuos de aminoácido en forma D o L que tienen cadenas laterales que comprenden grupos básicos. Los residuos de aminoácido básicos a modo de ejemplo incluyen residuos de histidina, lisina, homolisina, ornitina, arginina, N-metilarginina, ro-aminoarginina, ro-metilarginina, 1-metilhistidina, 3-metilhistidina y homoarginina (hR). El término "residuo de amioácido hidrófilo" se refiere a residuos de aminoácido en forma D o L que tienen cadenas laterales que comprenden grupos polares. Los residuos hidrófilos a modo de ejemplo incluyen residuos de cisteína, serina, treonina, histidina, lisina, asparagina, aspartato, glutamato, glutamina y citrulina (Cit). El término "residuo de aminoácido lipófilo" se refiere a residuos de aminoácido en forma D

o L que tienen cadenas laterales que comprenden grupos no cargados, alifáticos o aromáticos. Las cadenas laterales lipófilas a modo de ejemplo incluyen fenilalanina, isoleucina, leucina, metionina, valina, triptófano y tirosina. La alanina (A) es anfifílica, puede actuar como residuo hidrófilo o lipófilo. La alanina, por tanto, se incluye dentro de la definición de tanto "residuo lipófilo" como "residuo hidrófilo". El término "residuo de aminoácido no funcional" se refiere a residuos de aminoácido en forma D o L que tienen cadenas laterales que carecen de grupos ácidos, básicos o aromáticos. Los residuos de aminoácido neutros a modo de ejemplo incluyen residuos de metionina, glicina, alanina, valina, isoleucina, leucina y norleucina (Nle).

El péptido CGRP incluye una primera región, o dominio, de unión al receptor de CGRP" proximal a su extremo carboxilo terminal, región de unión que se une preferentemente a un primer sitio de unión en un complejo CRLRRAMP1. La frase "proximal al extremo carboxilo terminal" significa cercano al residuo de aminoácido C-terminal del péptido (independientemente de cualquier falta de un grupo carboxilo libre sobre el mismo) según la estructura primaria del péptido, es decir, su secuencia de aminoácidos (también conocida como "secuencia primaria"), sin referirse a la distancia espacial real u otras consideraciones de estructura secundaria o de orden superior o, a si el vehículo está conjugado con el mismo. Normalmente, la primera región de unión al receptor de CGRP, implica los diez residuos de aminoácido más proximales a, y que incluyen, el residuo carboxilo terminal del péptido, en las posiciones de aminoácido 28-37 en relación con el orden de posición de la secuencia de aCGRP humana nativa. Sin embargo, siempre que el péptido conserve unión específica o preferente detectable al complejo CRLR-RAMP1, la primera región de unión al receptor de CGRP, puede ser 1, 2, 3, 4 o aproximadamente 5 residuos de aminoácido más larga, o 1, 2 o aproximadamente 3 residuos de aminoácido más corta, que la región de unión al receptor de CGRP, en las posiciones de aminoácido 28-37 de la secuencia de aCGRP humana nativa.

En algunas realizaciones, el péptido CGRP también incluye, desde la primera región de unión al receptor de CGRP, hasta el extremo N-terminal del péptido: una región de bisagra; y una segunda región de unión al receptor de CGRP, entre la región de bisagra y el extremo N-terminal del péptido. Por tanto, el dominio o la región de bisagra es más distal con respecto al extremo carboxilo terminal del péptido que la primera región de unión al receptor de CGRP,. La frase "más distal" significa más distante que un determinado referente (tal como la primera región de unión al receptor de CGRP,) del residuo de aminoácido C-terminal del péptido (independientemente de cualquier falta de un grupo carboxilo libre sobre el mismo) según la estructura primaria del péptido, es decir, su secuencia de aminoácidos (o "secuencia primaria"), sin referirse a la distancia espacial real u otra consideración de estructura secundaria o de orden superior, o a si el vehículo está conjugado con el mismo. La región de bisagra proporciona una articulación o eje móvil en el péptido que facilita, participa en o responde a la unión específica al receptor de

CGRP1 permitiendo que el péptido se doble para estabilizar mejor un complejo péptido-CRLR-RAMP1. Normalmente, la región de bisagra implica los nueve residuos de aminoácido en las posiciones de aminoácido 19-27 en relación con el orden de posición de la secuencia de aCGRP humana nativa. Sin embargo, un péptido que conserva una unión específica o preferente detectable al complejo CRLR-RAMP1 puede tener una región de bisagra 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o aproximadamente 10 residuos de aminoácido más larga, o 1, 2, 3, 4, 5 o aproximadamente 6 residuos de aminoácido más corta, que la región de bisagra en las posiciones de aminoácido 19-27 de la secuencia de aCGRP humana nativa.

Al estar entre la región de bisagra y el extremo N-terminal del péptido, la segunda región o dominio de unión al receptor de CGRP1, cuando está presente, se sitúa incluso más distalmente del extremo carboxilo terminal que la región de bisagra. La frase "incluso más distal" significa a una mayor distancia que un determinado referente (tal como la región de bisagra) del residuo de aminoácido C-terminal del péptido CGRP (independientemente de cualquier falta de un grupo carboxilo libre sobre el mismo) según la estructura primaria del péptido, es decir, su secuencia de aminoácidos (también conocida como "secuencia primaria"), sin referirse a la distancia espacial real u otra consideración de estructura secundaria o de orden superior, o a si el vehículo está conjugado con el mismo. La segunda región de unión al receptor de CGRP1 está implicada en el aumento de la afinidad de unión del péptido CGRP o bien a través de unión directa al complejo CRLR-RAMP1 y/o bien mediante interacción con, o afectando de otra forma a la conformación de, la primera región de unión al receptor de CGRP1. Normalmente, la segunda región de unión al receptor de CGRP1, si está presente, implica once residuos de aminoácido en las posiciones de aminoácido 8-18 en relación con la secuencia de aCGRP humana nativa. Sin embargo, un péptido que conserva una unión específica detectable al complejo CRLR-RAMP1 puede tener, si está presente en su totalidad, una segunda región de unión al receptor de CGRP1 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o aproximadamente 10 residuos de aminoácido más corta que la región de unión al receptor de CGRP1 en las posiciones de aminoácido 8-18 de la secuencia de aCGRP humana nativa (SEO ID NO: 43), o puede tener una segunda región de unión al receptor de CGRP1 más larga en 1 o más residuos de aminoácido hasta la longitud máxima del péptido CGRP, tal como se describe en el presente documento.

El péptido CGRP carece de una región de "activación del receptor de CGRP1 funcional" que pueda activar de manera detectable un receptor de CGRP1 (o activar un receptor de amilina, receptor de adrenomedulina o receptor de CT) a una concentración fisiológica o farmacológicamente relevante del péptido. Aunque no se requiere para la puesta en práctica de la invención, el experto es consciente de ensayos funcionales adecuados para detectar la activación del receptor de CGRP1, o la falta de la misma, tal como un sistema de ensayo basado en AMPc. En algunas realizaciones, el péptido tiene una secuencia de aminoácidos que incluye las posiciones de aminoácido 1-7,

o cualquier parte de las mismas, en relación con la secuencia de CGRP nativa, sin embargo modificada, de manera que el péptido no puede activar funcionalmente el receptor de CGRP1.

El péptido CGRP (o una parte del péptido del vehículo farmacéuticamente aceptable, cuando puede aplicarse tal como se describe en el presente documento) puede obtenerse mediante síntesis empleando métodos sintéticos químicos convencionales. Por ejemplo, pueden usarse técnicas de síntesis de péptidos en fase sólida. Ta!es técnicas se conocen bien en la técnica e incluyen pero no se limitan a las descritas en Merrifield (1973), Chem. Polypeptides, 335-361 (Katsoyannis y Panayotis eds.); Merrifield (1963), J. Am. Chem. Soc, 85:2149; Davis et al. (1985), Biochem. Intl., 10:394-414; Stewart y Young (1969), Solid Phase Peptide Synthesis; patente estadounidense

n.o

3.941.763; Finn et al. (1976), The Proteins (3a ed.) 2:105-253; y Erickson et al., The Proteins (3a ed.) 2:257-527 (1976). Se conoce bien el uso de grupos protectores, ligadores y soportes de fase sólida, así como condiciones de reacción de protección y desprotección específicas, condiciones de escisión del ligador, uso de eliminadores y otros aspectos de la síntesis de péptidos en fase sólida y se describen también en "Protecting Groups in Organic Synthesis", 3a edición, T. W. Greene y P. G. M. Wuts, Eds., John Wiley & Sons, Inc., 1999; NovaBiochem Catalog, 2000; "Synthetic Peptides, A User's Guide", G. A. Grant, Ed., W.H. Freeman & Company, Nueva York, N.Y., 1992; "Advanced Chemtech Handbook of Combinatorial & Sol id Phase Organic Chemistry", W. D. Bennet, J. W. Christensen, L. K. Hamaker, M. L. Peterson, M. R. Rhodes, y H. H. Saneii, Eds., Advanced Chemtech, 1998; "Principies of Peptide Synthesis, 2a ed.", M. Bodanszky, Ed., Springer-Verlag, 1993; "The Practice of Peptide Synthesis, 2a ed.", M. Bodanszky y A. Bodanszky, Eds., Springer-Verlag, 1994; "Protecting Groups", P. J. Kocienski, Ed., Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Alemania, 1994; "Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, A Practical Approach",

W.

C. Chan y P. D. White, Eds., Oxford Press, 2000, G. B. Campos et al., Synthetic Peptides: A User's Guide, 1990, 77-183, yen otros sitios. Se encuentra en la figura 13 una ilustración adicional de técnicas de síntesis de péptidos que pueden emplearse según la presente invención.

Normalmente, se sintetizan péptidos CGRP lineales y cíclicos usando metodologías de síntesis de péptidos en fase sólida de Fmoc (SPPS) en un sintetizador disponible comercialmente, tal como un sintetizador automatizado Symphony (Protein Technologies, Inc., Washington, DC) o un sintetizador automatizado asistido por microondas Liberty (CEM Corporation, Matthews, NC). Pueden adquirirse derivados protegidos de aminoácidos canónicos, Fmoc-Dpr(Mtt)-OH, Fmoc-Dab(Mtt)-OH y Fmoc-Cit-OH de EMD Biosciences, Inc. (La Jolla, CA). Puede adquirirse Fmoc-homoArg(Pmc)-OH de Bachem California, Inc. (Torrance, CA). Todos los otros Fmoc-aminoácidos no canónicos pueden adquirirse de o bien Advanced Chemtech (Louisville, KY) o bien Chem-Impex International, Inc. (Wood Dale, IL). Los reactivos de acoplamiento hexafluorofosfato de 2-(1-H-benzotriazol-HI)-1, 1 ,3,3-tetrametiluronio (HBTU) y hexafluorofosfato de 1-benzotriazoiloxitris(pirrolidino)fosfonio (PyBOP) pueden adquirirse de Matrix

Innovation, Inc. (Montreal, Quebec, Canadá). Pueden adquirirse N-metilpirrolidona (NMP), diclorometano (DCM), metanol (MeOH), acetonitrilo (ACN), isopropanol, dimetilsulfóxido (DMSO) y etil éter anhidro de VWR International (West Chester, PA). Se adquiere N,N-dimetilformamida (DMF) de EMD Biosciences. Se adquieren ácido trifluoroacético (TFA), N-etilmorfolina (NEM), piridina, piperidina, N-N-diisopropiletilamina (DIEA), triisopropilsilano (Tis), fenol, anhídrido acético y TFA al 0,1% en H20 de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Todos los disolventes y reactivos son preferiblemente de calidad ACS o mejor y pueden usarse sin purificación adicional. Los péptidos se ensamblan en una resina CLEAR-amida-MBHA (0,44 meq./g de sustitución), adquirida de Peptides International (Louisville, KV). Normalmente, las síntesis se realizan usando recipientes de reacción de polipropileno de 16 mi equipados con fritas gruesas (Protein Technologies). Se añaden aproximadamente 455 mg de resina (0,2 mmol) a cada recipiente de reacción y se solvata durante 10 min en DMF. Se ensamblan las cadenas de péptidos que crecen en la resina de amida partiendo del extremo C-terminal usando el ciclo de aminoácidos general que sigue: se eliminan los grupos N"'-Fmoc mediante la adición de 5 mi de piperidina al 20% en DMF durante 5 min, seguido por una incubación de 20 min en 5 mI. Se añaden aminoácidos (exceso molar de 3 veces) a la resina (3000 J.11 de disolución de aminoácidos 0,2 M en NMP), seguido por la adición de HBTU en exceso de 3 veces y NEM en exceso de 6 veces (1,2 mi de HBTU 0,5 M Y NEM 1,0 M en DMF). Se agita la mezcla rociando periódicamente nitrógeno durante 45 min, seguido por el vaciado del recipiente de reacción mediante presión de nitrógeno positiva. Se lava la resina con 5 mi de DMF (4 x 30 s). Se repite una segunda reacción de acoplamiento durante 30 min, se vacía el recipiente de reacción y se lava la resina de péptido protegido con NU-Fmoc con 5 mi de DMF (3 x 30 s) y 5 mi de DCM (2 x 30 s). Se repite el ciclo de acoplamiento de aminoácidos con los aminoácidos requeridos hasta que se ensambla el péptido deseado. Tras la desprotección de N"-Fmoc del aminoácido final, se realiza la acetilación de la NU-amina mediante la adición de 2,5 mi de anhídrido acético/disolución de DIEA (1,0 M en DMF) a los recipientes de reacción y se mezcla durante 30 mino Si los péptidos no requieren ciclación, se lava la resina de péptido acetilado con 5 mi de DCM (5 x 30 s) y se seca meticulosamente antes de la escisión de la resina y la eliminación de los grupos protectores de cadenas laterales. Se realizan la desprotección de las cadenas laterales de aminoácidos y la escisión del péptido acetilado de la resina incubando la resina de péptido con 15 mi de cóctel de escisión (92,5% de TFA, 2,5% de agua, 2,5% de Tis, 2,5% de fenol) durante 3 h. Se filtra el producto de escisión bajo presión de gas nitrógeno positiva a tubos cónicos de polipropileno de 50 mi tarados. Se lava la resina con 10 mi de cóctel de escisión durante 5 min, se filtra y se combinan los filtrados. Se concentran las disoluciones de escisión hasta aproximadamente 5 mi de volumen total bajo una corriente suave de nitrógeno. Se añade etil éter anhidro frío (-20°C) (hasta 50 mi) a los filtrados. Se sedimentan los péptidos floculentos mediante centrifugación (por ejemplo, centrífuga Eppendorf 5702 usando un rotor de cubeta oscilante) a 3800 rpm durante 5 min y se decanta el éter. Se lavan los sedimentos de péptidos con etil éter anhidro frío adicional (hasta 50 mi), se sedimentan mediante centrifugación, se decantan y se secan a vacío. Los rendimientos de péptido bruto oscilan normalmente entre el 60% y el 99% de los rendimientos teóricos. Se disuelven los péptidos brutos en DMSO y se purifican mediante RP-HPLC usando, por ejemplo, un sistema de cromatografía preparativa Agilent 1100 con un detector de matriz de fotodiodos (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA) y una columna de sílice unida a RP-HPLC preparativa (Phenomenex JupitE'!r C18(2), 300 A, 10 J.1M, 50 x 250 mm) y se liofilizan para formar sólidos amorfos. Los péptidos purificados son preferiblemente al menos >95% puros tal como se determina mediante la RP-HPLC analítica usando un gradiente lineal del 2-60% de B a lo largo de 60 mino (A = TFA al 0,1% en H20, B = TFA al 0,1% en CAN, columna = Phenomenex Jupiter Proteo, 90 A, 4 J.1M, 2,1 x 50 mm). Puede confirmarse la masa molecular correcta mediante metodologías de CL-EM usando, por ejemplo, un dispositivo Waters Acquity UPLC equipado con un espectrómetro de masas de mesa de tiempo de vuelo de aceleración ortogonal (oa-TOF) LCT Premier XE (Waters Corporation, Milford, MA). Se preparan antagonistas de péptidos CGRP ciclados con un puente de lactama incorporando selectivamente residuos con cadenas laterales nucleófilas que formarán la lactama protegida con 4metiltritilo (Mtt) y cadenas laterales electrófilas con 2-fenil-isopropilo (2-PhiPr). Los aminoácidos implicados en las ciclaciones se adquieren de EMD Biosciences, Inc. Todos los otros aminoácidos usados en las síntesis son preferiblemente Fmoc-aminoácidos protegidos en la cadena lateral con t-butilo, pentametildihidrobenzofuran-5sulfonilo o pentametilcroman-6-sulfonilo convencionales. Los grupos Mtt y 2-PhiPr se eliminan selectivamente de antagonistas de péptidos CGRP cíclicos mediante la adición de 10 mi de TFAlTis/DCM (0,3:0,5:9,2) a la resina de péptido (5 x 10 min), seguido por el lavado de la resina de péptido con 10 mi de una disolución de DIEA al 2% (2 x 2 min) y 10 mi de DCM (4 x 1 min). El puente de lactama en péptidos cíclicos se forma activando grupos carboxilo electrófilos con PyBOP en exceso de 5 veces y DIEA en exceso de 7 veces en DMF. Se agitan las mezclas rociando continuamente nitrógeno. Se monitorizan las reacciones mediante la escisión de una alícuota de 1-2 mg de resina de péptido en 400 J.11 de cóctel de escisión, seguido por filtración, concentración del filtrado bajo nitrógeno y analizando mediante metodologías de CL-EM previamente descritas para péptidos lineales. La formación de lactama oscila entre el 70-99% tras aproximadamente 1-4 días a temperatura ambiente. Se lava la resina de péptido con DMF, se acetila y se lava de nuevo con DCM tras las reacciones de ciclación y se seca meticulosamente a vacío antes de la escisión. Se escinden resinas de péptidos cíclicos, se purifican y se analizan de la misma manera que se describió para péptidos lineales. Los métodos anteriores son meramente ilustrativos, y el experto es consciente de otros diversos métodos y variaciones técnicas para sintetizar los péptidos CGRP de la invención.

El péptido CGRP también puede obtenerse usando técnicas de expresión de proteínas mediada por ADN y/o ARN recombinante, o cualquier otro método de preparación de péptidos o, cuando puedan aplicarse, proteínas de fusión. Por ejemplo, los péptidos pueden prepararse en células huésped transformadas. En resumen, se prepara una molécula de ADN recombinante que codifica el péptido. Se conocen bien en la técnica métodos de preparación de tales moléculas de ADN. Por ejemplo, pueden cortarse del ADN secuencias que codifican los péptidos usando enzimas de restricción adecuadas. Alternativamente, la molécula de ADN puede sintetizarse usando técnicas de síntesis química, tal como el método de fosforamidato. Además, puede usarse una combinación de estas técnicas. Puede usarse cualquiera de un gran número de células huésped bien conocidas y disponibles en la práctica de esta invención. La selección de un huésped particular depende de varios factores reconocidos en la técnica. Estos incluyen, por ejemplo, la compatibilidad con el vector de expresión elegido, la toxicidad de los péptidos codificados por la molécula de ADN, la tasa de transformación, la facilidad de recuperación de los péptidos, las características de expresión, la bioseguridad y los costes. Debe encontrarse un equilibrio de estos factores con la comprensión de que no todos los huéspedes pueden ser igualmente eficaces para la expresión de una secuencia de ADN particular. Dentro de estas directrices generales, los huéspedes microbianos útiles incluyen bacterias (tales como E. coli sp.), levaduras (tales como Saccharomyces sp.) y otros hongos, insectos, plantas, células de mamífero (incluyendo ser humano) en cultivo, u otros huéspedes conocidos en la técnica. También pueden hacerse modificaciones al nivel del ADN. La secuencia de ADN que codifica el péptido puede cambiarse a codones más compatibles con la célula huésped elegida. Para E. coli, se conocen en la técnica codones optimizados. Pueden sustituirse codones para eliminar sitios de restricción o para incluir sitios de restricción silenciosos, que pueden ayudar en el procesamiento del ADN en la célula huésped seleccionada. A continuación, el huésped transformado se cultiva y se purifica. Pueden cultivarse células huésped en condiciones de fermentación convencionales de modo que se expresen los compuestos deseados. Tales condiciones de fermentación se conocen bien en la técnica.

La obtención del péptido CGRP, ya se prepare el péptido mediante técnicas sintéticas o recombinantes, también puede implicar técnicas de purificación de proteínas adecuadas, cuando puedan aplicarse. En algunas realizaciones de los antagonistas de péptidos CGRP conjugados con vehículo de la invención, la parte de ¡Jéptido CGRP puede prepararse para que incluya un marcador isotópico adecuado (por ejemplo, 1251, 14C, 13C, 35S, 3H, 2H, 13N, 15N, 180, 170 , etc.), para facilitar la cuantificación o detección.

Según la presente invención, "obtenido" u "obtener" un péptido CGRP significa que el péptido se prepara, se sintetiza, se produce, se saca a la luz, se purifica, se aísla, se obtiene y/o se adquiere.

En realizaciones útiles de la invención, el péptido CGRP se modifica de uno o más modos en relación con una secuencia de CGRP nativa de interés, tal como una secuencia de aCGRP o pCGRP humana nativa. La una o más modificaciones útiles pueden incluir adiciones o inserciones de aminoácidos, deleciones de aminoácidos, truncamientos de péptidos, sustituciones de aminoácidos y/o derivatización química de residuos de aminoácido, logrados mediante técnicas químicas conocidas. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos así modificada incluye al menos un residuo de aminoácido insertado o sustituido en la misma, en relación con la secuencia de aminoácidos de la secuencia de CGRP nativa de interés, en la que el residuo de aminoácido insertado o sustituido tiene una cadena lateral que comprende un grupo funcional reactivo nucleófilo o electrófilo mediante el que el péptido se conjuga con el vehículo. Según la invención, los ejemplos útiles de un grupo funcional reactivo nucleófilo o electrófilo de este tipo incluyen, pero no se limitan a, un tiol, una amina primaria, un seleno, una hidrazida, un aldehído, un ácido carboxílico, una cetona, un aminooxilo, un aldehído enmascarado (protegido) o un grupo funcional ceto enmascarado (protegido). Los ejemplos de residuos de aminoácido que tienen una cadena lateral que comprende un grupo funcional reactivo nucleófilo incluyen, pero no se limitan a, un residuo de lisina, una homolisina, un residuo de ácido a,p-diaminopropiónico, un residuo de ácido a,y-diaminobutírico, un residuo de ornitina, una cisteína, una homocisteína, un residuo de ácido glutámico, un residuo de ácido aspártico o un residuo de selenocisteína.

El péptido CGRP útil según la presente invención puede tener una o más adiciones o inserciones de aminoácidos, deleciones de aminoácidos, truncamientos de péptidos, sustituciones de aminoácidos y/o derivatizaciones químicas de residuos de aminoácido, en relación con la secuencia de un péptido cuya secuencia se describe en el presente documento, siempre que se mantenga el requisito de actividad antagonista del receptor de CGRP1. Los ejemplos de los antagonistas de péptidos CGRP de la invención incluyen péptidos CGRP que tienen una secuencia primaria de aminoácidos de cualquiera de las expuestas en la tabla 2A, tabla 28, tabla 2C, tabla 2D, tabla 3A, tabla 38, tabla 3 (excepto SEO ID NO:1), tabla 4 o tabla 7, ya se muestren en forma conjugada con vehículo o no conjugada.

Por ejemplo, pueden incluirse residuos de aminoácido adicionales en el extremo N-terminal del péptido CGRP, siempre que no reduzcan significativamente la potencia de la unión al receptor de CGRP1o interfieran de otra forma con el antagonismo del receptor de CGRP1. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un residuo de aminoácido aromático, tal como un residuo de triptófano o tirosina, puede ser una adición útil en el extremo N-terminal del péptido como cromóforo para fines de cuantificación o detección, o, en algunas realizaciones, puede mejorar realmente la potencia. Tales adiciones también pueden hacerse a análogos de péptidos CGRP truncados de manera N-terminal tal como se describe en el presente documento.

En algunas realizaciones de la presente invención, es útil que la secuencia del péptido CGRP incluya un truncamiento N-terminal a partir de una longitud de secuencia de aminoácidos de péptido CGRP nativa (por ejemplo, deleción de toda, o parte, de la región de activación o de la segunda región de unión), por ejemplo, pero sin limitarse a, un péptido que tiene una longitud de secuencia de aminoácidos de un fragmento de CGRP, tal como CGRP(8-37), CGRP(9-37), CGRP(10-37), CGRP(11-37), CGRP(12-37), CGRP(13-37), CGRP(14-37), CGRP(15-37), CGRP(1637), CGRP(17-37), CGRP(18-37), CGRP(19-37), CGRP(20-37), CGRP(21-37), CGRP(22-37), CGRP(23-37), CGRP(24-37), CGRP(25-37), CGRP(26-37), CGRP(27-37) o CGRP(28-37), independientemente de si el fragmento

tiene una secuencia de aminoácidos nativa o es una secuencia análoga a CGRP en otros sentidos. No obstante, según la invención, tales secuencias truncadas de manera N-terminal pueden tener, en determinadas realizaciones, otros residuos de aminoácido añadidos o unidos al extremo N-terminal para formar una región N-terminal de, preferiblemente, 1 a aproximadamente 50 residuos de aminoácido, más preferiblemente, de 1 a aproximadamente 30 residuos de aminoácido y, lo más preferiblemente, de 1 a aproximadamente 10 residuos de aminoácido (por ejemplo, un ligador peptídico, residuo(s) de aminoácido aromático(s), o una o más copias de regiones de unión al receptor de CGRP1, tal como se describe en el presente documento).

Al describir adicionalmente el péptido CGRP en el presente documento, se aplica frecuentemente un sistema de abreviaturas de una letra para designar las identidades de los veinte residuos de aminoácido "canónicos" incorporados generalmente en péptidos y proteínas que se producen de manera natural (tabla 1). Tales abreviaturas de una letra son totalmente intercambiables en significado con las abreviaturas de tres letras, o los nombres de aminoácidos no abreviados. Dentro del sistema de abreviaturas de una letra usado en el presente documento, una letra mayúscula incida un L-aminoácido, y una letra minúscula indica un D-aminoácido. Por ejemplo, la abreviatura "R" designa L-arginina y la abreviatura "r" designa D-arginina.

Tabla 1. Abreviaturas de una letra para los aminoácidos canónicos. Las abreviaturas de tres letras están entre paréntesis.

Alanina (Ala) A Glutamina (Gln) O Leucina (Leu) L Serina (Ser) S Arginina (Arg) R Ácido glutámico (Glu) E Lisina (Lys) K Treonina (Thr) T Asparagina (Asn) N Glicina (Gly) G Metionina (Met) M Triptófano (Trp) W Ácido aspártico (Asp) D Histidina (His) H Fenilalanina (Phe) F Tirosina (Tyr) Y Cisteína (Cys) C Isoleucina (lIe) I Prolina (Pro) P Valina (Val) V

Una sustitución de aminoácido en una secuencia de aminoácidos se designa normalmente en el presente documento con una abreviatura de una letra para el residuo de aminoácido en una posición particular, seguido por la posición de aminoácido numérica en relación con la secuencia de CGRP nativa de interés (secuencia de aCGRP humana, a menos que se especifique otra cosa), a la que entonces le sigue el símbolo de una letra para el residuo de aminoácido sustituido. Por ejemplo, "T30D" simboliza una sustitución de un residuo de treonina por un residuo de aspartato en la posición de aminoácido 30, en relación con la secuencia de aCGRP humana nativa (es decir, SEO ID N0:43), que sirve en el presente documento como secuencia de referencia. A modo de ejemplo adicional, "R18hR" o "R18Cit" indica una sustitución de un residuo de arginina por un residuo de homoarginina (en el presente documento abreviado "hR" o "hArg") o un residuo de citrulina (en el presente documento abreviado "Cit"), respectivamente, en la posición de aminoácido 18, en relación con la secuencia de aCGRP humana nativa (es decir, SEO ID NO:43). Una posición de aminoácido dentro de la secuencia de aminoácidos de cualquier péptido CGRP particular (o análogo de péptido CGRP) descrita en el presente documento puede diferir de su posición en relación con la secuencia de aCGRP humana nativa, es decir, tal como se determina en una alineación del extremo C-terminal de la secuencia de aminoácidos del péptido con el extremo C-terminal de la secuencia de aCGRP humana nativa. Por ejemplo, la posición de aminoácido 1 de la secuencia VTHRLAGLLSRSGGVVKNNFVPTNVGSKAF (SEO ID NO: 1; aCGRP(8-37) humano), así alineada, corresponde a la posición de aminoácido 8 en relación con la secuencia de referencia de aCGRP humana nativa(SEO ID N0:43), y la posición de aminoácido 30 de la SEO ID NO: 1 corresponde a la posición de aminoácido 37 en relación con la secuencia de referencia de aCGRP humana nativa (SEO ID N0:43). Como ejemplo adicional, la adición de un triptófano al extremo N-terminal de un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos SEO ID NO:1 constituye una "adición WO", pero en relación con la secuencia WVTHRLAGLLSRSGGVVKNNFVPTNVGSKAF (SEO ID NO:4), el triptófano está en la posición de aminoácido 1, mientras que corresponde a la posición de aminoácido 7 en relación con la secuencia de aCGRP humana nativa (SEO ID N0:43).

En algunas realizaciones útiles de la composición de materia de la invención, la secuencia de aminoácidos del péptido CGRP incluye las siguientes tres sustituciones de aminoácidos: N31 D, S34P Y K35F, en relación con la secuencia de aCGRP humana nativa (SEO ID NO:43). Se encontró que estas tres sustituciones mejoraban la potencia de algunos antagonistas de péptidos CGRP en el receptor de CGRP1, tal como se demuestra a continuación en el presente documento.

En determinadas realizaciones de la presente invención, las sustituciones de aminoácidos abarcan residuos de aminoácido no canónicos que incluyen residuos de aminoácido poco comunes de manera natural (en péptidos o proteínas) o residuos de aminoácido no naturales. Pueden incorporarse residuos de aminoácido no canónicos en el péptido mediante síntesis química de péptidos en lugar de mediante síntesis en sistemas biológicos, tales como células de expresión recombinante, o alternativamente el experto en la técnica puede emplear técnicas conocidas de ingeniería de proteínas que usan células de expresión recombinante. (Véase, por ejemplo, Link et al., Non-canonical amino acids in protein engineering, Current Opinion in Biotechnology, 14(6):603-609 (2003)). El término "residuo de aminoácido no canónico" se refiere a residuos de aminoácido en forma D o L que no están entre los 20 aminoácidos canónicos incorporados generalmente en proteínas que se producen de manera natural, por ejemplo, ~aminoácidos, homoaminoácidos, aminoácidos cíclicos y aminoácidos con cadenas laterales derivatizadas. Los ejemplos incluyen (en forma Lo D; abreviados entre paréntesis): citrulina (Cit), homocitrulina (hCit), NU-metilcitrulina (NMeCit), NU-metilhomocitrulina.(NU-MeHoCit), ornitina (Om), NU-metilornitina (NU-MeOrn o NMeOrn), sarcosina (Sar), homolisina (hLys o hK), homoarginina (hArg o hR), homoglutamina (hO), NU-metilarginina (NMeR), NU-metilleucina (NU-MeL o NMeL), N-metilhomolisina (NMeHoK), NU-metilglutamina (NMeO), norleucina (Nle), norvalina (Nva), 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina (Tic), ácido octahidroindol-2-carboxílico (Oic), 3-(1-naftil)alanina (1-Nal), 3-(2naftil)alanina (2-Nal), 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina (Tic), 2-indanilglicina (Igl), para-yodofenilalanina (pl-Phe), paraaminofenilalanina (4AmP o 4-amino-Phe), 4-guanidinofenilalanina (Guf), nitrofenilalanina (nitrophe), aminofenilalanina (aminophe o amino-Phe), bencilfenilalanina (benzylphe), ácido y-carboxiglutámico (y-carboxyglu), hidroxiprolina (hydroxypro), p-carboxil-fenilalanina (Cpa), ácido a-aminoadípico (Aad), Na-metilvalina (NMeVal), N-ametil-Ieucina (NMeLeu), Na-metilnorleucina (NMeNle), ciclopentilglicina (Cpg), ciclohexilglicina (Chg), acetilarginina (acetylarg), ácido a,~-diaminopropiónico (Dpr), ácido a,y-diaminobutírico (Dab), ácido diaminopropiónico (Dap), ciclohexilalanina (Cha), 4-metil-fenilalanina (MePhe), ~,~-difenil-alanina (BiPhA), ácido aminobutírico (Abu), 4-fenilfenilalanina (o bifenilalanina; 4Bip), ácido a-aminoisobutírico (Aib), beta-alanina, ácido beta-aminopropiónico, ácido piperidínico, ácido aminocaproico, ácido aminoheptanoico, ácido aminopimélico, desmosina, ácido diaminopimélico, N-etilglicina, N-etilasparagina, hidroxilisina, alo-hidroxilisina, isodesmosina, aloisoleucina, N-metilglicina, Nmetilisoleucina, N-metilvalina, 4-hidroxiprolina (Hyp), y-carboxiglutamato, €-N,N,N-trimetil-lisina, €-N-acetil-lisina, 0fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, O)-metilarginina y otros aminoácidos similares, y formas derivatizadas de cualquiera de éstos tal como se describe en el presente documento. La tabla 1 A contiene algunos residuos de aminoácido no canónicos que son útiles según la presente invención y abreviaturas asociadas tal como se usan normalmente en el presente documento, aunque el experto entenderá que pueden aplicarse diferentes abreviaturas y nomenclaturas a la misma sustancia y pueden aparecer de manera intercambiable en el presente documento.

Tabla 1A. Aminoácidos no canónicos útiles para la adición, inserción o sustitución de aminoácidos en secuencias de péptidos CGRP según la presente invención. En el caso de que una abreviatura enumerada en la tabla 1A difiera de otra abreviatura para la misma sustancia dada a conocer en otra parte en el presente documento, se entiende que pueden aplicarse ambas abreviaturas.

Abreviatura

Aminoácido

Sar

sarcosina

Nle

norleucina

lIe

isoleucina

1-Nal

3-(1-naftil)alanina

2-Nal

3-(2-naftil)alanina

Bip

4,4' -bifenilalanina

Dip

3,3-difenilalanina

Nvl

norvalina

NMe-Val

Na-metilvalina

NMe-Leu

Na-metil-Ieucina

NMe-Nle

Na-metilnorleucina

Cpg

ciclopentilglicina

Chg

ciclohexilglicina

Hyp

hidroxiprolina

Oic

ácido octahidroindol-2-carboxílico

Igl

indanilglicina

Aib

ácido aminoisobutírico

Aic

ácido 2-aminoindano-2-carboxílico

Pip

ácido pipecólico

BhTic

p-homoTic

BhPro

p-homoprolina

Sar

sarcosina

Cpg

ciclopentilglicina

Tiq

ácido 1,2,3,4-L-tetrahidroisoquinolin-1-carboxílico

Nip

ácido nipecótico

Thz

ácido tiazolidin-4-carboxílico

Thi

3-tienilalanina

4GuaPr

4-guanidinoprolina

4Pip

ácido 4-amino-1-piperidin-4-carboxílico

Idc

ácido indolin-2-carboxílico

Hydroxyl-Tic

ácido 1 ,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-7 -hidroxi-3-carboxílico

Bip

4,4' -bifenilalanina

Ome-Tyr

O-metiltirosina

I-Tyr

yodotirosina

Tic

ácido 1,2,3,4-L-tetrahidroisoquinolin-3-carboxílico

Igl

indanilglicina

BhTic

p-homoTic

BhPhe

p-homofenilalanina

AMeF

a-metilfenilalanina

BPhe

p-fenilalanina

Phg

fenilglicina

Anc

ácido 3-amino-2-naftoico

Ate

ácido 2-aminotetralin-2-carboxílico

NMe-Phe

Na-metilfenilalanina

NMe-Lys

Na-metil-lisina

Tpi

ácido 1,2,3,4-tetrahidronorharman-3-carboxílico

Cpg

ciclopentilglicina

14

Dip 4Pal 3Pal 2Pal 4Pip 4AmP Idc Chg hPhe BhTrp pl-Phe Aic NMe-Lys Orn Dpr Dbu homoLys N-eMe-K N-eEt-K N-eIPr-K bhomoK rLys rOrn Acm Ahx EAhx K(NPeg11) K(NPeg27) Cit hArg hCit NMe-Arg Guf bhArg 3G-Dpr 4AmP 3,3-difenilalanina 4-piridinilalanina 3-piridinilalanina 2-piridinilalanina ácido 4-amino-1-piperidin-4-carboxílico 4-amino-fenilalanina ácido indolin-2-carboxílico ciclohexilglicina homofenilalanina

~-homotriptófano

4-yodofenilalanina ácido 2-aminoindano-2-carboxílico Na-metil-lisina ornitina ácido 2,3-diaminopropiónico ácido 2,4-diaminobutírico homolisina NE-metil-lisina NE-etil-lisina NE-isopropil-lisina

~-homolisina

Lys \ji (CH2NH)-enlace amida reducido Orn \ji (CH2NH)-enlace amida reducido acetamidometilo ácido 6-aminohexanoico ácido 6-aminohexanoico NE-(0-(am inoeti 1)-0' -(2 -propanoi I)-undecaetilenglicol)-lisina NE-(0-(am inoeti 1)-0' -(2 -propanoi 1)-(etilenglicol)27 -lisina citrulina homoarginina homocitrulina Na-metilarginina (NMeR) 4-guanidinilfenilalanina

~-homoarginina

ácido 2-amino-3-guanidinopropanoico 4-amino-fenilalanina

4AmPhe 4-amidino-fenilalanina

4AmPig ácido 2-amino-2-(1-carbamimidoilpiperidin-4-il)acético

4GuaPr 4-guanidinoprolina

N-Arg glicina sustituida con Na-[(CH2)JNHCH(NH)NH21

rArg Arg \If(CH2NH)-enlace amida reducido

4PipA 4-piperidinilalanina

NMe-Arg Na-metilarginina (o NMeR)

NMe-Thr Na-metiltreonina (o NMeThr)

Se han publicado la nomenclatura y el simbolismo para aminoácidos y péptidos por la Comisión Mixta de Nomenclatura Bioquímica (uJoint Commission on Biochemical Nomenclature') (JCBN) de la UPAC-IUB en los siguientes documentos: Biochem. J., 1984, 219, 345-373; Eur. J. Biochem., 1984, 138, 9-37; 1985, 152, 1; 1993, 213, 2; Internat. J. Pept. Prot. Res, 1984, 24, siguientes p. 84; J. Biol. Chem., 1985, 260,14-42; Pure Appl. Chem., 1984, 56, 595-624; Amino Acids and Peptides, 1985, 16, 387-410; Biochemical Nomenclature and Related Documents, 2a edición, Portland Press, 1992, páginas 39-69.

En algunas realizaciones útiles de la composición de materia de la invención, una modificación del péptido CGRP es en las posiciones de aminoácido 3, 4, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 24, 25, 26, 27, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, y/o 37, y más preferiblemente, en las posiciones 3, 4,11,18,24,25,34,35 y/o 37, o en cualquier combinación de estas posiciones, en relación con la secuencia de referencia de aCGRP humana (SEO ID NO:43).

En algunas realizaciones de la composición de materia de la invención, la secuencia de aminoácidos del péptido CGRP se modifica, en relación con una secuencia de referencia de CGRP nativa (SEO ID N0:43), de manera que la modificación reduce la susceptibilidad del péptido CGRP a la proteólisis enzimática. Esta susceptibilidad reducida puede deberse a un efecto sobre un sitio de unión de proteasas o sitio de escisión para una exopeptidasa o endopeptidasa. El péptido CGRP nativo se degrada en fluido biológico por enzimas proteolíticas tales como serina proteasas (tripsina, quimotripsina y elastasa). Se notifica que la semivida de CGRP en plasma de mamífero es de aproximadamente 10 mino [A.S. Thakor; DA Giussani, Circulation. 2005; 112:2510-2516; Kraenzlin ME, Ch'ng JL, Mulderry PK, Ghatei MA, Bloom SR., Regul Pept. Marzo de 1985; 10(2-3): 189-97.]. Las enzimas proteolíticas tienen especificidades de sustrato variables, por ejemplo, la tripsina escinde preferentemente en Arg y Lys en posición P1 con tasas superiores para Arg. [Keil, B. Specificity of proteolysis. Springer-Verlag Berlín-Heidelberg-Nueva York, págs.335. (1992)]. Basándose en esto, pueden reconocerse y procesarse múltiples sitios dentro de un péptido o proteína dada por diferentes proteasas.

Con el objetivo de aumentar la estabilidad de CGRP en fluido biológico, se ha investigado la tasa y el sitio de ruptura de CGRP mediante técnicas de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELlSA) y análisis de espectrometría de masas. Tras la identificación del sitio de degradación clave en CGRP y análogos de CGRP usando este enfoque, se han reemplazado aminoácidos naturales seleccionados por aminoácidos no canónicos o no naturales para reducir el procesamiento por proteasas y a su vez aumentar la estabilidad del péptido CGRP en plasma. Ejemplos de este enfoque son el reemplazo de arginina (R) por citrulina, y fenilalanina (F) por 3-(1-naftil)alanina. También se han ciclado cadenas laterales con cadenas laterales (por ejemplo, residuos i, i + 4) para formar estructuras de anillo que también aumentan la estabilidad plasmática global (véanse, por ejemplo, la figura 3 y la figura 13). La introducción de aminoácidos no canónicos o no naturales y estructuras cíclicas se ha llevado a cabo de una manera iterativa para identificar análogos de CGRP novedosos con estabilidad significativamente mejorada en fluido biológico (por ejemplo, el 100% de plasma) con o sin pegilación (MeO-PEG 20 kDa), tal como se ilustra en la tabla 1 B a continuación, y tal como se describe adicionalmente en los ejemplos 4-6, más adelante en el presente documento.

Tabla 1 B. Semivida de algunos péptidos CGRP modificados en el1 00% de plasma. 'SEO ID 172 YSEO ID 173 están ambas pegiladas (MeO-PEG 20 kDa) en Lys25.

Estabilidad en plasma no diluido a 37°C tal como se determina mediante ELlSA

SEO ID NO:172* SEO ID NO:173*

tY2 en plasma de rata

8-9 h 8-9 h

tY2 en plasma de cynomolgus

>24 h >24 h

tY2 en plasma humano

>24 h >24 h

Por consiguiente, en algunas realizaciones de la composición de materia de la invención, una modificación, tal como, pero sin limitarse a, una sustitución de aminoácido de un residuo de aminoácido básico (tal como un residuo de aminoácido básico descrito en el presente documento anteriormente, o una sustitución funcionalmente equivalente) es en las posiciones de aminoácido 3, 4, 9,10,11,12,14,15,16,17,18,19,24,25,26,27,29,30,31, 33, 34, 35, 36 y/o 37, y más preferiblemente, en las posiciones 3, 4, 11, 18,24,25,34,35 y/o 37, o en cualquier combinación de estas posiciones, en relación con la secuencia de referencia de aCGRP humana (SEQ ID N0:43). A modo de ejemplo adicional, en algunas realizaciones, se realiza una sustitución en un residuo que es adyacente a un sitio de escisión proteolítica para prevenir o reducir la proteólisis enzimática, por ejemplo una sustitución S 17P y/o S 19P, en relación con la secuencia de aCGRP humana (SEQ ID N0:43). En otras realizaciones, la sustitución de un residuo cargado, tal como hArg o Guf, en la posición 24 en relación con la secuencia de referencia de aCGRP humana nativa (SEQ ID N0:43) potencia la estabilidad proteolítica del péptido CGRP.

En determinadas realizaciones, la modificación es una sustitución de un único aminoácido, por ejemplo:

R11Q; R11 hR; R11Cit; R11 hK; R110rn; R11Cit; R11hCit; R11NMeR; R11NMeQ; R11NMeHoK; R11 NmeOrn; R11NMeCit; R11 NMeHoCit; R18Q; R18hR; R18Cit; R18NMeR; R18NmeQ; y R18NMeCit, o una sustitución de aminoácido funcionalmente equivalente, o en algunas otras realizaciones,

cualquier combinación de éstas que conlleve una sustitución de aminoácido en tanto la posición 11 como la posición

18, en relación con la secuencia de aCGRP humana nativa. En determinadas realizaciones, la modificación puede implicar sustituciones de aminoácidos dobles o múltiples, incluyendo modificaciones en las posiciones de aminoácido 3, 4, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 24, 25, 26, 27, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36 y/o 37, y más preferiblemente, en las posiciones 3, 4, 11, 18, 24, 25, 34, 35 y/o 37, o en cualquier combinación de estas posiciones, en relación con la secuencia de referencia de aCGRP humana (SEQ ID N0:43), por ejemplo:

R11 hCit, R 18hCit; R11 hK, R18hK; R11NMeR, R18NMeR; R11 NMeR, R18NMeR, K24NMeR; R11Cit, L12NMeL, R18Cit; R11Cit, L12Nle, L15Nle, L16Nle, R18Cit; R11 Cit, L 12Nva, L 15Nva, L 16Nva, R18Cit; R11Cit, S17T, R18Cit;

H10Tic, R11Cit, R18Cit;

R11 Cit, G14Sar, R18Cit;

R11 Cit, L 12Nle, L 15Nle, L 16Nle, S17T, R18Cit, K24hR, G33Sar;

R11hCit, L12Nle, L15Nle, L16Nle, S17T, R18hCit, K24hR, G33Sar;

R11NMeR, L12Nle, L15Nle, L16Nle, S17T, R18NMeR, K24NMeR, G33Sar; y

R11 NMeR, L 12Nva, L 15Nva, L 16Nva, S17T, R18NMeR, K24NMeR, G33Sar, o sustituciones de aminoácidos funcionalmente equivalentes en las posiciones 10, 11 , 12, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 24 y/o 33.

El término "proteasa" es sinónimo de "peptidasa". Las proteasas comprenden dos grupos de enzimas: las endopeptidasas que escinden enlaces peptídicos en puntos dentro de la proteína, y las exopeptidasas, que eliminan uno o más aminoácidos del extremo o bien N o bien C-terminal respectivamente. El término "proteinasa" también se usa como sinónimo para endopeptidasa. Las cuatro clases mecanísticas de proteinasas son: serina proteinasas, cisteína proteinasas, proteinasas aspárticas y metaloproteinasas. Además de estas cuatro clases mecanísticas, hay una sección de la nomenclatura de enzimas que se asigna a proteasas de mecanismo catalítico no identificado. Esto indica que el mecanismo catalítico no se ha identificado.

La nomenclatura de subsitios de escisión se adopta comúnmente de un esquema creado por Schechter y Berger (Schechter 1. & Berger A, On the size of the active site in proteases. 1. Papain, Biochemical and Biophysical Research Communication, 27: 157 (1967); Schechter 1. & Berger A, On the active site of proteases. 3. Mapping the active site of papain; specific peptide inhibitors of papain, Biochemical and Biophysical Research Communication,

32:898 (1968)). Según este modelo, los residuos de aminoácido en un sustrato que se somete a escisión se designan P1, P2, P3, P4, etc. en la dirección N-terminal dirección a partir del enlace escindido. Asimismo, los residuos en la dirección C-terminal se designan P1', P2', P3', P4', etc.

El experto en la técnica es consciente de una variedad de herramientas para identificar sitios de escisión de proteasas o de unión a proteasas de interés. Por ejemplo, la herramienta de software PeptideCutter está disponible a través del servidor de proteómica ExPASy (Expert Protein Analysis System) del Instituto Suizo de Bioinformática (SIB; www.expasy.org/tools/peptidecutter). PeptideCutter realiza búsquedas en una secuencia de proteína de las bases de datos SWISS-PROT y/o TrEMBL o una secuencia introducida por el usuario para detectar sitios de escisión de proteasas. Pueden usarse productos químicos y proteasas individuales, una selección o la lista completa de proteasas y productos químicos. Están disponibles diferentes formas de salida de los resultados: tablas de sitios de escisión o bien agrupados alfabéticamente según los nombres de las enzimas o secuencialmente según el número de aminoácido. Una tercera opción para la salida es un mapa de sitios de escisión. La secuencia y los sitios de escisión mapeados sobre la misma se agrupan en bloques, cuyo tamaño puede elegirse por el usuario. También se conocen otras herramientas para determinar sitios de escisión de proteasas. (Por ejemplo, Turk, B. et al., Determination of protease cleavage site motifs using mixture-based oriented peptide libraries, Nature Biotechnology, 19:661-667 (2001); Barrett A et al., Handbook of proteolytic enzymes, Academic Press (1998)).

Las serina proteinasas incluyen la familia de quimiotripsina, que incluye enzimas proteasas de mamífero tales como quimiotripsina, tripsina o elastasa o calicreína. Las serina proteinasas presentan diferentes especificidades de sustrato, que están relacionadas con sustituciones de aminoácidos en los diversos subsitios de la enzima que interaccionan con los residuos del sustrato. Algunas enzimas tienen un sitio de interacción prolongada con el sustrato mientras que otras tienen una especificidad restringida al residuo del sustrato P1.

La tripsina escinde preferentemente en R o K en la posición P1. Un estudio estadístico llevado a cabo por Keil (1992) describió las influencias negativas de residuos que rodean los enlaces Arg-y Lys-(es decir, las posiciones P2 y P1', respectivamente) durante la escisión por tripsina. (Keil, B., Specificity of proteolysis, Springer-Verlag BerlínHeidelberg-Nueva York, 335 (1992)). Un residuo de prolina en la posición P1' ejerce normalmente una fuerte influencia negativa sobre la escisión por tripsina. De manera similar, el posicionamiento de R y K en P1' da como resultado una inhibición, así como residuos cargados negativamente en las posiciones P2 y P1 '.

La quimiotripsina escinde preferentemente en una W, Y o F en posición P1 (alta especificidad) y en un menor grado en un residuo de L, M o H en posición P1. (Keil, 1992). Las excepciones a estas normas son las siguientes: cuando se encuentra W en posición P1, la escisión se bloquea cuando M o P se encuentran en la posición P1' al mismo tiempo. Además, un residuo de prolina en posición P1' bloquea casi completamente la escisión independientemente de los aminoácidos encontrados en la posición P1. Cuando se encuentra un residuo M en posición P1, la escisión se bloquea por la presencia de un residuo Y en posición P1'. Finalmente, cuando se ubica H en posición P1, la presencia de un residuo de D, M o W también bloquea la escisión.

La metaloendopeptidasa de membrana (NEP; endopeptidasa neutra, proteinasa neutra de borde en cepillo del riñón, encefalinasa, EC 3.4.24.11) escinde péptidos en el lado de amino de residuos de aminoácido hidrófobos. (Connelly, JC et al., Neutral Endopeptidase 24.11 in Human Neutrophils: Cleavage of Chemotactic Peptide, PNAS, 82(24): 8737-8741 (1985)).

La trombina escinde preferentemente en un residuo R en posición P1. (Keil, 1992). El sustrato natural de la trombina es el fibrinógeno. Sitios de escisión óptimos son cuando un residuo R está en posición P1 y Gly está en posición P2 y posición P1'. Asimismo, cuando se encuentran residuos de aminoácidos hidrófobos en posición P4 y posición P3, un residuo de prolina en posición P2, un residuo R en posición P1 y residuos de aminoácidos no ácidos en posición P1' Y posición P2'. Un residuo muy importante para su sustrato natural, fibrinógeno, es un residuo D en P10.

Las caspasas son una familia de cisteína proteasas que llevan un sitio activo con una secuencia de aminoácidos conservada y que escinden péptidos específicamente tras residuos D. (Earnshaw WC et al., Mammalian caspases: Structure, activation, substrates, and functions during apoptosis, Annual Review of Biochemistry, 68:383-424 (1999».

La Arg-C proteinasa escinde preferentemente en un residuo R en posición P1. El comportamiento de escisión parece verse afectado sólo moderadamente por residuos en posición P1'. (Keil, 1992). La Asp-N endopeptidasa escinde específicamente enlaces con un residuo D en posición P1'. (Keil, 1992).

Lo anterior es meramente a modo de ejemplo y de ningún modo un tratamiento exhaustivo del conocimiento disponible para el experto en la técnica referente a sitios de escisión y/o unión a proteasas que el experto en la técnica pueda estar interesado en eliminar al poner en práctica la invención.

Realizaciones útiles adicionales de antagonistas de péptidos CGRP conjugados con vehículo pueden resultar de modificaciones conservativas de las secuencias de aminoácidos de los péptidos conjugados con vehículo dados a conocer en el presente documento. Modificaciones conservativas producirán péptidos conjugados con vehículo que tienen características funcionales, físicas y químicas similares a las del péptido conjugado con vehículo (por ejemplo, conjugado con PEG) a partir del cual se realizan tales modificaciones. Tales formas modificadas de manera conservativa de los péptidos conjugados con vehículo o PEG dadas a conocer en el presente documento también se contemplan como una realización de la presente invención.

En cambio, pueden lograrse modificaciones sustanciales en las características funcionales y/o químicas de los péptidos CGRP seleccionando sustituciones en la secuencia de aminoácidos que difieren significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura del esqueleto molecular en la región de sustitución, por ejemplo, como una conformación en a-hélice, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o (c) el tamaño de la molécula.

Por ejemplo, una "sustitución de aminoácido conservativa" puede implicar una sustitución de un residuo de aminoácido nativo por un residuo no nativo de manera que hay poco o ningún efecto sobre la polaridad o carga del residuo de aminoácido en esa posición. Además, cualquier residuo nativo en el polipéptido también puede sustituirse por alanina, tal como se ha descrito anteriormente para la "mutagénesis de barrido de alanina" (véase, por ejemplo, MacLennan et al., Acta Physiol. Scand. Suppl., 643:55-67 (1998); Sasaki et al., 1998, Adv. Biophys. 35: 1-24 (1998), que comenta la mutagénesis de barrido de alanina).

Los expertos en la técnica pueden determinar sustituciones de aminoácidos deseadas (ya sean conservativas o no conservativas) en el momento en el que se deseen tales sustituciones. Por ejemplo, pueden usarse sustituciones de aminoácidos para identificar residuos importantes de la secuencia de péptido, o para aumentar o disminuir la afinidad del péptido o moléculas de péptido conjugado con vehículo descritas en el presente documento.

Los residuos que se producen de manera natural pueden dividirse en clases basándose en propiedades de cadenas laterales comunes:

1) hidrófobos: norleucina (Nor), Met, Ala, Val, Leu, lIe;

2) hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

3) ácidos: Asp, Glu;

4) básicos: His, Lys, Arg;

5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro; y

6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.

Las sustituciones de aminoácidos conservativas pueden implicar el intercambio de un miembro de una de estas clases por otro miembro de la misma clase. Las sustituciones de aminoácidos conservativas pueden abarcar residuos de aminoácidos que no se producen de manera natural, que se incorporan normalmente mediante síntesis química de péptidos en vez de mediante síntesis en sistemas biológicos. Estos incluyen peptidomiméticos y otras formas revertidas o invertidas de restos de aminoácido.

Las sustituciones no conservativas pueden implicar el intercambio de un miembro de una de estas clases por un miembro de otra clase. Tales residuos sustituidos pueden introducirse en regiones del anticuerpo humano que son homólogas a anticuerpos no humanos, o en las regiones no homólogas de la molécula.

Al realizar tales cambios, según determinadas realizaciones, puede considerarse el índice hidropático de aminoácidos. A cada aminoácido se le ha asignado un índice hidropático basándose en su hidrofobicidad y características de carga. Son: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptófano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); Y arginina (-4,5).

La importancia del índice hidropático de los aminoácidos para conferir una función biológica interactiva a una proteína se entiende en la técnica (véase, por ejemplo, Kyte et al., 1982, J. Mol. Biol 157: 105-131). Se sabe que determinados aminoácidos pueden sustituirse por otros aminoácidos que tienen una puntuación o índice hidropático similar y conservan todavía una actividad biológica similar. Al realizar cambios basándose en el índice hidropático, en determinadas realizaciones, se incluye la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos están dentro de ±2. En determinadas realizaciones, se incluyen los que están dentro de ±1, Y en determinadas realizaciones, se incluyen los que están dentro de ±0,5.

También se entiende en la técnica que la sustitución de aminoácidos similares puede realizarse eficazmente basándose en la hidrofilicidad, particularmente cuando la proteína o péptido biológicamente funcional creado de ese modo está destinado para su uso en realizaciones inmunológicas, tal como se da a conocer en el presente documento. En determinadas realizaciones, la mayor hidrofilicidad promedio local de una proteína, dictada por la hidrofilicidad de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con su inmunogenicidad y antigenicidad, es decir, con una propiedad biológica de la proteína.

Los siguientes valores de hidrofilicidad se han asignado a estos residuos de aminoácido: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0 ± 1); glutamato (+3,0 ± 1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (O); treonina (-0,4); prolina (-0,5 ± 1); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5) Y triptófano (-3,4). Al realizar cambios basándose en valores de hidrofilicidad similares, en determinadas realizaciones, se incluye la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilicidad están dentro de ±2, en determinadas realizaciones, se incluyen los que están dentro de ±1, y en determinadas realizaciones, se incluyen los que están dentro de ±0,5. También pueden identificarse epítopos a partir de secuencias de aminoácidos primarias basándose en la hidrofilicidad. Estas regiones también se denominan "regiones centrales epitópicas".

Los ejemplos de sustituciones conservativas incluyen la sustitución de un residuo de aminoácido no polar (hidrófobo) tal como isoleucina, valina, leucina norleucina, alanina o metionina por otro, la sustitución de un residuo de aminoácido polar (hidrófilo) por otro tal como entre arginina y lisina, entre glutamina y asparagina, entre glicina y serina, la sustitución de un residuo de aminoácido básico tal como lisina, arginina o histidina por otro, o la sustitución de un residuo ácido, tal como ácido aspártico o ácido glutámico por otro. La frase "sustitución de aminoácido conservativa" también incluye el uso de un residuo químicamente derivatizado en lugar de un residuo no derivatizado, siempre que tal polipéptido presente el requisito de actividad antagonista del receptor de CGRP1• Otras sustituciones de aminoácidos a modo de ejemplo que pueden ser útiles según la presente invención se exponen en la tabla 2.

Tabla 2. Algunas sustituciones de aminoácidos útiles.

Residuos originales

Sustituciones a modo de ejemplo

Ala

Val, Leu, lIe

Arg

Lys, Gln, Asn

Asn

Gln

Asp

Glu

Cys

Ser, Ala

Gln

Asn

Glu

Asp

Gly

Pro, Ala

His

Asn, Gln, Lys, Aro

lIe

Leu, Val, Met, Ala, Phe, norleucina

Leu

Norleucina, lIe, Val, Met, Ala, Phe

Lys

Arg, ácido 1 ,4-diaminobutírico, Gln, Asn

Met

Leu, Phe, lIe

Phe

Leu, Val, lIe, Ala, Tyr

Pro

Ala

Ser

Thr, Ala, Cys

Thr

Ser

Trp

Tvr, Phe

Tyr

Trp, Phe, Thr, Ser

Val

lIe, Met, Leu, Phe, Ala,

norleucina

Tal como se establece en el presente documento anteriormente, según la presente invención, el péptido también puede derivatizarse químicamente en uno o más residuos de aminoácido. Pueden sintetizarse péptidos que contienen residuos de aminoácido derivatizados mediante técnicas de química orgánica conocidas. "Derivado químico" o "químicamente derivatizado" se refiere a un péptido objeto que tiene uno o más residuos químicamente derivatizados mediante reacción de un grupo lateral funcional. Tales moléculas derivatizadas incluyen, por ejemplo, aquéllas moléculas en las que se han derivatizado grupos amino libres para formar clorhidratos de amina, grupos ptoluenosulfonilo, grupos carbobenzoxilo, grupos t-butiloxicarbonilo, grupos cloroacetilo o grupos formilo. Pueden derivatizarse grupos carboxilo libres para formar sales, ésteres metílicos o etílicos u otros tipos de ésteres o hidrazidas. Pueden derivatizarse grupos hidroxilo libres para formar derivados de O-acilo u O-alquilo. El nitrógeno de imidazol de la histidina puede derivatizarse para formar N-im-bencilhistidina. También se incluyen como derivados químicos los péptidos que contienen uno o más derivados de aminoácidos que se producen de manera natural de los veinte aminoácidos canónicos, ya estén en forma L o D. Por ejemplo, puede sustituirse prolina por 4hidroxiprolina; puede sustituirse lisina por 5-hidroxilisina; puede sustituirse histidina por 3-metilhistidina; puede sustituirse serina por homoserina; y puede sustituirse lisina por ornitina.

Las derivatizaciones útiles incluyen, en algunas realizaciones, aquellas en las que el extremo amino terminal del péptido está químicamente bloqueado de modo que se impedirá que tenga lugar la conjugación con el vehículo en un grupo amino libre N-terminal. También puede haber otros efectos beneficiosos de una modificación de este tipo, por ejemplo una reducción en la susceptibilidad del péptido CGRP a la proteólisis enzimática. El extremo N-terminal puede acilarse o modificarse en una amina sustituida, o derivatizarse con otro grupo funcional, tal como un resto aromático (por ejemplo, un ácido de indol, bencilo (Bzl o Bn), dibencilo (DiBzl o Bn2), o benciloxicarbonilo (Cbz o Z)), N,N-dimetilglicina o creatina. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un resto acilo, tal como, pero sin limitarse a, un formilo, acetilo (Ac), propanoílo, butanilo, heptanilo, hexanoílo, octanoílo o nonanoílo, puede unirse covalentemente al extremo N-terminal del péptido, lo que puede impedir reacciones secundarias no deseadas durante la conjugación del vehículo al péptido. Otros ~rupos de derivados N-terminales a modo de ejemplo incluyen -NRR1 (distinto de -NH2), -NRC(O)R1, -NRC(O)OR , -NRS(O)2R1, -NHC(O)NHR1, succinimida o benciloxicarbonil-NH-(Cbz-NH-), en los que R y R1 son cada uno independientemente hidrógeno o alquilo inferior y en los que el anillo de fenilo puede sustituirse con de 1 a 3 sustituyentes seleccionados de alquilo C1-C4, alcoxilo Cr C4, cloro y bromo.

En algunas realizaciones, una o más uniones (enlaces) peptidilo [-C(O)NR-] entre residuos de aminoácido pueden reemplazarse por una unión distinta de peptidilo. Uniones distintas de peptidilo a modo de ejemplo son -CH2carbamato [-CH2-0C(O)NR-], fosfonato, -CH2-sulfonamida [-CH2-S(O)2NR-], urea [-NHC(O)NH-], -CH2-amina secundaria y péptido alquilado [-C(O)NR6-en el que R6 es alquilo inferior].

En algunas realizaciones, pueden derivatizarse uno o más residuos de aminoácido individuales. Se sabe que diversos agentes de derivatización reaccionan específicamente con residuos terminales o cadenas laterales seleccionadas, tal como se describe en detalle a continuación a modo de ejemplo.

Pueden hacerse reaccionar residuos de lisinilo y residuos amino terminales con ácido succínico u otros anhídridos de ácidos carboxílicos, que invierten la carga de los residuos de lisinilo. Otros reactivos adecuados para derivatizar residuos que contienen alfa-ami no incluyen imidoésteres tales como picolinimidato de metilo; piridoxal-fosfato; piridoxal, cloroborohidruro; ácido trinitrobencenosulfónico; O-metilisourea; 2,4-pentanodiona; y reacción con glioxilato catalizada por transaminasas.

Pueden modificarse residuos de arginilo mediante reacción con uno cualquiera o una combinación de varios reactivos convencionales, incluyendo fenilglioxal, 2,3-butanodiona, 1,2-ciclohexanodiona y ninhidrina. La derivatización de residuos de arginilo requiere que la reacción se realice en condiciones alcalinas debido al alto pKa del grupo funcional guanidina. Además, estos reactivos pueden reaccionar con los grupos de la lisina así como el grupo épsilon-amino de la arginina.

Se ha estudiado extensamente la modificación específica de residuos de tirosilo, con particular interés en la introducción de marcadores espectrales en residuos de tirosilo mediante reacción con compuestos de diazonio aromáticos o tetranitrometano. Lo más comúnmente, se usan N-acetilimidizol y tetranitrometano para formar especies de O-acetiltirosilo y derivados de 3-nitro, respectivamente.

Pueden modificarse selectivamente grupos de cadena lateral de carboxilo (aspartilo o glutamilo) mediante reacción con carbodiimidas (R' -N=C=N-R') tales como 1-ciclohexil-3-(2-morfolinil-(4-etil)carbodiimida o 1-etil-3-(4-azonia-4,4dimetilpentil)carbodiimida. Además, pueden convertirse residuos de aspartilo y glutamilo en residuos de asparaginilo y glutaminilo mediante reacción con iones amonio.

Pueden desamidarse residuos de glutaminilo y asparaginilo para dar los correspondientes residuos de glutamilo y aspartilo. Alternativamente, estos residuos pueden desamidarse en condiciones ligeramente ácidas. Cualquier forma

de estos residuos se encuentra dentro del alcance de esta invención.

Pueden reemplazarse residuos de cisteinilo por residuos de aminoácido u otros restos o bien para eliminar los enlaces de disulfuro o bien, a la inversa, para estabilizar el entrecruzamiento. (Véase, por ejemplo, Bhatnagar et al.,

J. Med. Chem., 39:3814-3819 (1996». La derivatización con agentes bifuncionales es útil para reticular los péptidos o sus derivados funcionales con una matriz de soporte insoluble en agua, si se desea, o con otros vehículos macromoleculares. Los agentes de reticulación comúnmente usados incluyen, por ejemplo, 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida, por ejemplo, ésteres con ácido 4-azidosalicílico, imidoésteres homobifuncionales, incluyendo ésteres de disuccinimidilo tales como 3,3'-ditiobis(succinimidilpropionato), y maleimidas bifuncionales tales como bisN-maleimido-1,8-octano. Agentes de derivatización tales como 3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato de metilo producen productos intermedios fotoactivables que pueden formar reticulaciones en presencia de luz. Alternativamente, se emplean para la inmovilización de proteínas matrices insolubles en agua reactivas tales como hidratos de carbono

activados con bromuro de cianógeno y los sustratos reactivos, por ejemplo, tal como se describe en las patentes estadounidenses n.os 3.969.287; 3.691.016; 4.195.128; 4.247.642; 4.229.537; Y 4.330.440. Otras posibles modificaciones incluyen hidroxilación de prolina y lisina, fosforilación de grupos hidroxilo de residuos

de serilo o treonilo, oxidación del átomo de azufre en Cys, metilación de los grupos alfa-amino de cadenas laterales de lisina, arginina e histidina. Creighton, Proteins: Structure and Molecule Properties (W. H. Freeman & Co., San Francisco), 79-86 (1983).

Los ejemplos anteriores de derivatizaciones no pretenden ser un tratamiento exhaustivo, sino meramente ilustrativo. Algunas realizaciones a modo de ejemplo de la composición de materia de la invención incluyen antagonistas de

péptidos CGRP conjugados con vehículo, o no conjugados, en los que la secuencia de aminoácidos del péptido CGRP contiene (a) cualquiera de las SEO ID NOS: 47 a 55 y 82 a 127, en el presente documento a continuación: VTHRLAGLLSRSGGVVKNNFVPTDVGPFAF-NH2 (SEO ID NO:47), VTHRLAGLLSRSGGVKRNNFVPTDVGPFAF-NH2 (SEO ID N0:48), VTHRLAGLLSRSGGVVKNNFVPTDVGPFAF-NH2 (SEO ID NO:49), VTHRLAGLLSRSGGVVRKNFVPTDVGPFAF-NH2 (SEO ID NO:50), VTHRLAGLLSRSGGVVRNKFVPTDVGPFAF-NH2 (SEO ID NO:51), VTHRLAGLLSRSGGVCRNNFVPTDVGPFAF-NH2 (SEO ID NO:52), VTHRLAGLLSRSGGVVCNNFVPTDVGPFAF-NH2 (SEO ID NO:53), VTHRLAGLLSRSGGVVRCNFVPTDVGPFAF-NH2 (SEO ID NO:54), VTHRLAGLLSRSGGVVRNCFVPTDVGPFAF-NH2 (SEO ID NO:55); VTH[hCit]LAGLLS[hCit]SGGWRKNFVPTDVGPFAF-NH2 (SEO ID NO:82); VTH[hK]LAGLLS[hK]SGGVVRKNFVPTDVGPFAF-NH2 (SEO ID NO:83); VTH[NMeR]LAGLLS[NMeR]SGGVVRKNFVPTDVGPFAF-NH2 (SEO ID NO:84); VTH[NMeR]LAGLLS[NMeR]SGGVV[NMeR]KNFVPTDVGPFAF-NH2 (SEO ID NO:85); VTH[Cit][NMeL]AGLLS[Cit]SGGVVRKNFVPTDVGPFAF-NH2 (SEO ID NO:86); VTH[Cit][Nle]AG[Nle][Nle]S[Cit]SGGVVRKNFVPTDVGPFAF-NH2 (SEO ID NO:87); VTH[Cit][Nva]AG[Nva][Nva]S[Cit]SGGVVRKNFVPTDVGPFAF-NH2 (SEO ID NO:88); VT[Tic][Cit]LAGLLS[Cit]SGGVVRKNFVPTDVGPFAF-NH2 (SEO ID NO:89); VTH[Cit]LAGLL T[Cit]SGGVVRKNFVPTDVGPFAF-NH2 (SEO ID NO:90); VTH[Cit]LA[Sar]LLS[Cit]SGGVVRKNFVPTDVGPFAF-NH2 (SEO ID NO:91); VTH[Cit][Nle]AG[Nle][Nle]T[Cit]SGGVV[hR]KNFVPTDV[Sar]pFAF-NH2 (SEO ID NO:92); VTH[hCit][Nle]AG[Nle][Nle]T[hCit]SGGVV[hR]KNFVPTDV[Sar]PFAF-NH2 (SEO ID NO:93); VTH[NMeR][Nle]AG[Nle][Nle]T[NMeR]SGGVV[NMeR]KNFVPTDV[Sar]PFAF-NH2 (SEO ID NO:94); VTH[NMeR][Nva]AG[Nva][Nva]T[NMeR]SGGVV[NMeR]KNFVPTOV[Sar]PFAF-NH2 (SEO ID NO:95); WVTHRLAGLASRPGGVVRKNFVPTOVGPFAF-NH2(SEO ID NO:1128); VTH[Cit]LAGLASRPGGVVRKNFVPTOVGPFAF-NH2 (SEO ID NO:1129); VTH[Cit]LAGLLSRPGGVVRKNFVPTOVGPFAF-NH2 (SEO ID NO:98); VTH[Cit]LAGLLPRSGGVVRKNFVPTOVGPFAF-NH2 (SEO ID NO:99); VTHRLAGLLPRSGGVVRKNFVPTOVGPFAF-NH2(SEO ID NO:100); VTHOLAGLLSOSGGVV[hArg]KNFVPTOVGPFAF-NH2 (SEO ID NO:1 01); VTH[Cit]LAGLLS[Cit]SGGVV[hArg]KNFVPTOVGPFAF-NH2(SEO ID NO:102); VTHRLAGLLSRSGGVVR[4AmP]NFVPTOVGPFAF-NH2 (SEO ID NO:103); VEH[hArg]LKGLLS[Cit]SGGVVRKNFVPTOVGPFAF-NH2(SEO ID NO:104); [1-Nal]VEH[hArg]LKGLLS[Cit]SGGVVRKNFVPTOVGPFAF-NH2 (SEO ID NO:105); Ac-[Aib]WVEH[hArg]LKGLLS[Cit]SGGVVRKNFVPTOVGPFAF-NH2 (SEO ID NO:106); VTH[Cit]LAGLLS[Cit]SGGVVRKNFVPTOVGPFAF-NH2(SEO ID NO:1 07); VTH[hCit]LAGLLS[hCit]SGGVV[hArg]KNFVPTOVGPFAF-NH2 (SEO ID NO:108); VTH[hArg]LAGLLS[hCit]SGGVV[hArg]KNFVPTOVGPFAF-NH2 (SEO ID NO:1 09); VTH[hArg]LAGLLS[Cit]SGGVV[hArg]KNFVPTOVGPFAF-NH2 (SEO ID NO:110); VTH[hArg]LAGLLS[hArg]SGGVV[hArg]KNFVPTOVGPFAF-NH2 (SEO ID NO:111); VTHOLAGLLS[Cit]SGGVVR[hArg]KNFVPTOVGPFAF-NH2 (SEO ID NO:112); VTH[Cit]LAGLLSOSGGVVR[hArg]KNFVPTOVGPFAF-NH2 (SEO ID NO:113); VTH[Cit]LAGLLS[hArg]SGGVVR[hArg]KNFVPTOVGPFAF-NH2 (SEO ID NO:114); VTH[hCit]LAGLLS[hArg]SGGVVR[hArg]KNFVPTOVGPFAF-NH2 (SEO ID NO:115); VEHRLKGLLS[Cit]SGGVVR[hArg]KNFVPTOVGPFAF-NH2 (SEO ID NO:116); VEH[Cit]LKGLLS[Cit]SGGVVR[hArg]KNFVPTOVGPFAF-NH2 (SEO ID NO:117); VEHRLKGLLS[hArg]SGGVVR[hArg]KNFVPTOVGPFAF-NH2 (SEO ID NO:118); VEHRLKGLLSOSGGVVR[hArg]KNFVPTOVGPFAF-NH2 (SEO ID NO:119); VTH[Cit]LAGLLS[Cit]SGGVV[hArg]KNFVPTOVGPFAF-NH2 (SEO ID NO:120); VTH[Cit]LAGLLS[Cit]SGGVV[hArg]KNFVPTOVG[Oic]FAF-NH2 (SEO ID NO:121); VTH[Cit]LAGLLS[Cit]SGGVV[hArg]KNFVPTOVGP[1-Nal]AF-NH2 (SEO ID NO: 122); VTI-I[Cit]LAGLLS[Cit]SGGVV[Guf]KNFVPTOVGPFAF-NH2 (SEO ID NO:123); VTH[Cit]LAGLLS[Cit]SGGVV[hArg]KNFVPTOVGP[Bip]AF-NH2 (SEO ID NO:124); VTH[hArg]LAGLLS[Cit]SGGVV[hArg]KNFVPTOVGP[2-Nal]AF-NH2 (SEO ID NO:125); VTH[Cit]LAGLLS[Cit]SGGVV[hArg]KNFVPTOVGP[lgl]AF-NH2 (SEO ID NO:126); o VTH[Cit]LAGLLS[Cit]SGGVV[hArg]KN[pl-Phe]VPTOVGP[pl-Phe]AF-NH2 (SEO ID NO:127); o

(b)

un truncamiento N-terminal de cualquiera de (a) que conserve la región de bisagra y la primera región de unión al receptor de CGRP1, por ejemplo, pero sin limitarse a, una secuencia que tiene un truncamiento N-terminal de 1,2,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o aproximadamente 20 residuos de aminoácido contiguos; o

(c)

cualquiera de (a) o (b), en el que la secuencia de aminoácidos contiene además un residuo de aminoácido aromático en el extremo N-terminal; o

(d)

cualquiera de (a), (b) o (c), en el que la secuencia de aminoácidos contiene una modificación en relación con la secuencia de referencia de aCGRP humana nativa que elimina un sitio de unión de proteasas o sitio de escisión. Tal como se describe en el presente documento, algunas realizaciones de los péptidos descritos en (a), (b), (c), o (d) están acilados de manera N-terminal útilmente o derivatizados de otra forma con otro grupo funcional tal como se describe en el presente documento.

Algunas realizaciones de la composición de materia de la invención implican un antagonista de péptido CGRP que comprende un péptido CGRP que tiene una secuencia de aminoácidos de fórmula:

Xaa 1Xaa2Xaa3Xaa4Xaa5Xaa6Xaa7V8Xaa9Xaa 10Xaa11 L12A13G14L15L16S17Xaa18S19G20G21V22Xaa23Xaa24Xaa25Xaa26F27 V28p29Xaa30Xaa31V32G33Xaa34Xaa35A36Xaa37 (SEO ID NO:1127)

en la que:

Xaa1, Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa5, Xaa6 y Xaa7 están cada uno independientemente ausentes o son un residuo de aminoácido hidrófobo; Xaa7 es un residuo de aminoácido hidrófobo (por ejemplo, Trp, 1-Nal, 2-Nal, Phe, Tyr o Bip); Xaa9es un residuo polar neutro o hidrófobo neutro (por ejemplo, Thr, Ser, Ala, Gly, Val, Leu o lIe);

Xaa 10 es un residuo de aminoácido básico (por ejemplo, His, N"-metil-His);

Xaa11 es un residuo de aminoácido básico (por ejemplo, un residuo de aminoácido N"-sustituido básico, Arg, N"metil-Arg; homoarginina, Cit, N"-metil-Cit, homocitrulina, His, Guf y 4-amino-Phe);

Xaa18 es un residuo de aminoácido básico (por ejemplo, un residuo de aminoácido N"-sustituido básico, Arg, N"metil-Arg; homoarginina, Cit, N"-metil-Cit, homocitrulina, His, Guf y 4-amino-Phe);

Xaa23 es un residuo de aminoácido básico o residuo de aminoácido neutro (por ejemplo, Val, Arg, O-Arg, homoarginina, Lys, O-Lys, homolisina, Om, Oab, Opr, homocisteína y 4-amino-Phe);

Xaa24 es un residuo de aminoácido básico o residuo de aminoácido neutro (por ejemplo, Arg, O-Arg, homoarginina, Lys, O-Lys, homolisina, Om, Oab, Opr, homocisteína y 4-amino-Phe);

Xaa25 es un residuo de aminoácido básico o residuo de aminoácido neutro (por ejemplo, Arg, O-Arg, Lys, O-Lys, homolisina, Om, Oab, Opr, Cys, homocisteína y 4-amino-Phe);

Xaa26 es un residuo de aminoácido básico o residuo de aminoácido neutro (por ejemplo, Arg, O-Arg, Asn, Lys, 0Lys, homolisina, Om, Oab, Opr, Cys, homocisteína y 4-amino-Phe);

Xaa30 es un residuo de aminoácido polar neutro (por ejemplo, Thr, N"-metil-Thr, Ser, N-metil-Ser);

Xaa34 es un residuo de aminoácido cíclico, un residuo de aminoácido hidrófobo neutro o un residuo de aminoácido polar neutro (por ejemplo, Oic, Pro, Hyp, Tic, O-Tic, O-Pro, Thz, Aib, Sar y Pip); Xaa35 es un residuo de aminoácido aromático o hidrófobo neutro (por ejemplo, Phe, O-Phe, Tyr, 1-Nal, 2-Nal, Trp,

Bip); y Xaa37 es un residuo de aminoácido aromático o hidrófobo neutro (por ejemplo, Phe, Tyr, 1-Nal, 2-Nal, Trp y Bip).

En algunas realizaciones preferidas, la composición de materia incluye en su extremo N-terminal un resto acilo, acetilo (Ac), benzoílo, benciloxicarbonilo (Cbz o Z), bencilo (Bzl) o dibencilo (OiBzl o Bn2). En algunas realizaciones, el péptido CGRP se conjuga con un polietilenglicol (PEG) en:

(a)

1, 2, 3 ó 4 sitios funcional izados con amino del PEG;

(b)

1, 2, 3 ó 4 sitios funcionalizados con tiol del PEG;

(c)

1,2,3 ó 4 sitios funcionalizados con maleimido del PEG;

(d)

1,2, 3 ó 4 sitios funcionalizados con N-succinimidilo del PEG;

(e)

1,2,3 ó 4 sitios funcionalizados con carboxilo del PEG; o

(f)

1,2,3 ó 4 sitios funcionalizados con p-nitrofeniloxicarbonilo del PEG.

Algunas otras realizaciones de la composición de materia de la invención incorporan cielaciones para mejorar la estabilidad en residuos implicados en degradación proteolítica y/o para mejorar la actividad funcional del antagonista de péptido CGRP. Algunos de estos contienen un péptido CGRP que comprende una secuencia de aminoácidos de fórmula:

Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4Xaa5Xaa6Xaa7vBXaa9Xaa10Xaa11Xaa12Xaa13Xaa14Xaa15Xaa16Xaa17Xaa18Xaa19Xaa20G21V22Xaa23 Xaa24Xaa25Xaa26F27V28p29Xaa30Xaa31V32G33Xaa34Xaa35Xaa36Xaa37 (SEQ ID NQ:1130)

en la que

Xaa1, Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa5, Xaa6 y Xaa7 están cada uno independientemente ausentes o son un residuo de aminoácido hidrófobo; Xaa7 es un residuo de aminoácido hidrófobo (por ejemplo, Trp, 1-Nal, 2-Nal, Phe, Tyr, Sip, 4-carboxi-fenilalanina, 4

amino-Phe); Xaa9 es un residuo polar neutro o hidrófobo neutro (por ejemplo, Thr, Ser, Ala, Gly, Val, Leu, lIe); Xaa10 es un residuo de aminoácido básico (por ejemplo, His, NU-metil-His, Lys, homolisina, ornitina, 4-amino-Phe); Xaa11 es un residuo de aminoácido básico (por ejemplo, Arg, NU-metil-Arg, homoarginina, Cit, NU-metil-Cit,

homocitrulina, His, Guf, Lys, homolisina, ornitina, 4-Amino-Phe);

Xaa12 es Leu, Lys, homolisina, ornitina, 4-carboxi-fenilalanina, 4-amino-Phe, ácido beta-glutámico, ácido betahomoglutámico, ácido homoglutámico o Asp; Xaa13 es Ala, Lys, homolisina, ornitina, 4-carboxi-fenilalanina, 4-amino-Phe, ácido beta-glutámico, ácido beta

homoglutámico, ácido homoglutámico o Asp;

Xaa14 es Gly, Lys, homolisina, ornitina, 4-carboxi-fenilalanina, 4-amino-Phe, ácido beta-glutámico, ácido betahomoglutámico, ácido homoglutámico o Asp; Xaa15 es Leu, Lys, homolisina, ornitina, 4-carboxi-fenilalanina, 4-amino-Phe, ácido beta-glutámico, ácido beta

homoglutámico, ácido homoglutámico o Asp;

Xaa16 es Leu, Lys, homolisina, ornitina, 4-carboxi-fenilalanina, 4-amino-Phe, ácido beta-glutámico, ácido betahomoglutámico, ácido homoglutámico o Asp; Xaa17 es Ser, Lys, homolisina, ornitina, 4-carboxi-fenilalanina, 4-amino-Phe, ácido beta-glutámico, ácido beta

homoglutámico, ácido homoglutámico o Asp;

Xaa18 es un residuo de aminoácido básico (por ejemplo, Arg, NU-metil-Arg, homoarginina, Cit, NU-metil-Cit, homocitrulina, His, Guf, Lys, homolisina, ornitina, 4-amino-Phe);

Xaa19 es Ser, Lys, homolisina, ornitina, 4-carboxi-fenilalanina, 4-amino-Phe, ácido beta-glutámico, ácido betahomoglutámico, ácido homoglutámico o Asp;

Xaa20 es Gly, Lys, homolisina, ornitina, 4-carboxi-fenilalanina, 4-amino-Phe, ácido beta-glutámico, ácido betahomoglutámico, ácido homoglutámico o Asp;

Xaa23 es un residuo de aminoácido básico o residuo de aminoácido neutro (por ejemplo, Val, Arg, D-Arg, homoarginina, Lys, D-Lys, homolisina, Qrn, Dab, Dpr, homocisteína o A-amino-Phe);

Xaa24 es un residuo de aminoácido básico o residuo de aminoácido neutro (por ejemplo, Arg, D-Arg, homoarginina, Lys, D-Lys, homolisina, Qrn, Dab, Dpr, homocisteína o 4-amino-Phe);

Xaa¿5 es un residuo de aminoácido básico o residuo de aminoácido neutro (por ejemplo, Lys, D-Lys, homolisina, Qrn, Dab, Dpr, Cys, homocisteína, 4-amino-Phe, Arg o D-Arg);

Xaa26 es un residuo de aminoácido básico o residuo de aminoácido neutro (por ejemplo, Asn, Lys, D-Lys, homolisina, Qrn, Dab, Dpr, Cys, homocisteína, 4-amino-Phe, Arg o D-Arg);

Xaa30 es un residuo de aminoácido polar neutro (por ejemplo, Thr, N-metil-Thr, Ser, N-metil-Ser);

Xaa31 es Asn, Lys, homolisina, ornitina, 4-carboxi-fenilalanina, 4-amino-Phe, ácido beta-glutámico, ácido betahomoglutámico, ácido homoglutámico o Asp;

Xaa32 es Val, Lys, homolisina, ornitina, 4-carboxi-fenilalanina, 4-amino-Phe, ácido beta-glutámico, ácido betahomoglutámico, ácido homoglutámico o Asp;

Xaa33 es Gly, Lys, homolisina, ornitina, 4-carboxi-fenilalanina, 4-amino-Phe, ácido beta-glutámico, ácido betahomoglutámico, ácido homoglutámico o Asp; Xaa34 es un residuo de aminoácido cíclico, un residuo de aminoácido hidrófobo neutro o un residuo de aminoácido polar neutro (por ejemplo, Oic, Pro, Hyp, Tic, O-Tic, O-Pro, Thz, Aib, Sar, Pip);

Xaa35 es un residuo de aminoácido aromático o hidrófobo neutro (por ejemplo, Phe, O-Phe, Tyr, 1-Nal, 2-Nal, Trp, Bip, 4-carboxi-fenilalanina, 4-amino-Phe);

Xaa36 es Ala, Lys, homolisina, ornitina, 4-carboxi-fenilalanina, 4-amino-Phe, ácido beta-glutámico, ácido betahomoglutámico, ácido homoglutámico o Asp;

Xaa37 es un residuo de aminoácido aromático o hidrófobo neutro (por ejemplo, Phe, Tyr, 1-Nal, 2-Nal, Trp, Bip, 4carboxi-fenilalanina, 4-amino-Phe); y en la ~ue un primer par (dos) de residuos de aminoácido seleccionados de Xaa7, Xaa8, Xaa9, XaalO, Xaa", Xaa'2, Xaa' ,Xaa'4, Xaa'5, Xaa'6, Xaa'7, Xaa18, Xaa'9, Xaa20, Xaa30, Xaa3', Xaa32, Xaa33, Xaa34, Xaa35, Xaa36 y Xaa37 se unen covalentemente para formar un primer anillo y el primer par de residuos de aminoácido que forman el primer anillo están separados por de 3 a 7 residuos de aminoácido, más preferiblemente por de 3 a 4 residuos de aminoácido, en la secuencia primaria del péptido CGRP (es decir, la cadena). Por ejemplo, en algunas realizaciones, se forma un puente de lactama entre residuos en las posiciones (en relación con la posición en la SEO ID N0:43 de referencia): 7 y 11, u 8 y 12, o 9 y 13, o 10 y 14, u 11 y 15, o 12 y 16, o 13 y 17, o 14 y 18, o 15 y 19, o 16 y 20, o 17 y 21, o 18 y 22, o 19 y 23, o 21 y 25, o 22 y 26, o 26 y 31, o 27 y 32, o 28 y 33, o 30 y 35, o 31 y 36, o 32 y 37. También son útiles ciclaciones dobles según la presente invención. Por tanto, en algunas realizaciones de la composición de materia, un segundo par de residuos de aminoácido, ambos de los cuales son diferentes de ambos miembros del primer par de residuos de aminoácido, se selecciona de Xaa7, Xaa8, Xaa9, Xaa'o, Xaa", Xaa'2, Xaa'3, Xaa'4, Xaa'S, XaaHI, Xaa'7, Xaa'8, Xaa'9, Xaa20, Xaa30, Xaa3\ Xaa32, Xaa33, Xaa34 , Xaa35, Xaa36 y Xaa37 , uniéndose covalentemente el segundo par de residuos de aminoácido para formar un segundo anillo. El segundo par de residuos de aminoácido que forman el segundo anillo también están separados por de 3 a 7 residuos de aminoácido, más preferiblemente por de 3 a 4 residuos de aminoácido, en la secuencia primaria del péptido CGRP, y ambos miembros del segundo par de residuos de aminoácido están más proximales en la secuencia primaria a o bien el extremo C-terminal o bien el extremo N-terminal del péptido CGRP en comparación con ambos miembros del primer par de residuos de aminoácido. Los antagonistas de péptidos CGRP ciclados de la invención incluyen, por ejemplo, los que implican dos puentes de lactama entre residuos en las posiciones 9 y 13 (un primer anillo, por ejemplo) y entre residuos en las posiciones 15 y 19 (un segundo anillo, por ejemplo) en relación con las posiciones en SEO ID NO:43. Los antagonistas de péptidos CGRP ciclados de la invención también incluyen péptidos CGRP que comprenden la secuencia primaria de aminoácidos de cualquiera de las SEO ID NOS: 155 a 157, 167 a 170,180 a 228,242 a 280,348 a 406,416 a 430, 439 a 498,512 a 566,580 a 634, 889 a 911, 942 a 944, 987, 988, 994 a 996 y 1063 a 1083, ya se muestren o no en forma conjugada con vehículo o no conjugada.

En algunas realizaciones preferidas de estas composiciones de la invención que contienen péptidos CGRP ciclados, la composición de materia incluye en su extremo N-terminal un resto acilo, acetilo (Ac), benzoílo, benciloxicarbonilo (Cbz o Z), bencilo (Bzl o Bn) o dibencilo (OiBzl o Bn2). En algunas realizaciones, el péptido CGRP se conjuga con un polietilenglicol (PEG) en:

(a)

1, 2, 3 ó 4 sitios funcionalizados con amino del PEG;

(b)

1,2,3 ó 4 sitios funcionalizados con tiol del PEG;

(c)

1,2,3 ó 4 sitios funcionalizados con maleimido del PEG;

(d)

1,2, 3 ó 4 sitios funcionalizados con N-succinimidilo del PEG;

(e)

1,2,3 ó 4 sitios funcionalizados con carboxilo del PEG; o

(f)

1,2,3 ó 4 sitios funcionalizados con p-nitrofeniloxicarbonilo del PEG.

Los antagonistas de péptidos CGRP adicionales que están abarcados dentro de la presente invención incluyen cualquiera de los que comprenden una secuencia primaria de aminoácidos expuesta en las siguientes tabla 2A, tabla 2B, tabla 2C y tabla 20, ya se muestren en forma conjugada con vehículo (por ejemplo, forma pegilada) o no conjugada.

Tabla 2A. Secuencias de péptidos CGRP a modo de ejemplo. Los residuos de aminoácido en negrita subrayados, si hay alguno, indican ciclación entre el primer residuo en negrita subrayado y el segundo residuo en negrita subrayado en una secuencia. Se determinaron los valores de CI 50 tal como se describe en el ejemplo 1 en el presente documento.

SEQ

145

146 653

KNFVPTDVGPFA-NH2 >1000

KNFVPTOVGPF-NH2 >1000

656 . >1000

659 660

:>100 O 3

661 662 663

8739 1648 1,217

KNFVPTDVGPFAF-NH2 2057

664

Ac-WVTH{Cit]LAGllS[Cit1SGGW[Guf]KNFVPTDVG{Oic]FAF-NH2 2,292,95

665

Ac-WVTH[Cít]LAGLlS[Cít1SGGW[Cit)KNFVPTOVG[Oic]KAF-NH2 3,77

666

AC-WVTH[Cit]LAGLLS(Cit]SGGW[hArg)KNFVPTDVG[Pip]FAF-NH2 11,21

667

Ac-WVTH[Cit]LAGLLS[Cit1SGGW(hArg1KNFVPTDVG[Hyp]FAF-NH2 Ac-WVTH[Cit]LAGlLS[CjtISGGW[hArglKNFVPTDVG[Hyp)FAF~ amida 6,62

668

AC-WVTH[Cit]LAGllS(Cit}SGGW[hArg}KNFVPTDVG[Hyp]FAFNH2 6,01

669

Ac-WVTH[Cit]LAGLLS[Cil]SGGW[hArg}KNFVPTDVG[Aic]FAF.NH2 33,19261,95

670

Ac-WVTH[Cit}LAGllS[Cít]SGGW[hArg}KNFVPTOVG[AibIFAF-NH2 4,37

671

Ac-WVTH[Cit]LAGLLS[Cit}SGGW[hArg]KNFVPTDVG[Thz]FAF-NH2 2,15

672

Ac-WVTH[Cit}LAGLlS[Cit]SGGW[hArg}KN FVPTDVG[Sar]FAF-NH2 3,19442

673

Ac-V\NTH[Cit}LAGLLS[Cit1SGGW[hArg]KN FVPTDVG[Tpí]FAF -N H2 28,87

674

Ac-WVTH[Cit]LAGLLS(Cit]SGGW[hArg}KNFVPTDVGP[1-Nal)AFNH2 1,311 51

675

Ac-WVTH[Cit)LAGLLS¡Cit1SGGW[hArg]KNFVPTDVGIPip][1-Nal]AFNH2 10,78

676

Ac-WVTH(Cit]LAGLlS[Cit]SGGW[hArg]KNFVPTDVGP[TpijAF-NH2 79,34

Tabla 28. Secuencias de péptidos CGRP a modo de ejemplo adicionales. Los residuos de aminoácido en negrita subrayados, si hay alguno, indican ciclación covalente entre el primer residuo en negrita subrayado y el segundo residuo en negrita subrayado en una secuencia.

SEQ ID NO

Secuencia de péptido CGRP

733

Ac-WVTHRLAGLASRPGGWRKNFVPTDVGPFAF-NH2

734

Ac-WVTH[CitILAGLASRPGGWRKNFVPTDVGPFAF~amida

735

Ac-WVTHrCIt1LAGLLSRPGGWRKNFVPTDVGPFAF~NH2

736

Ac-WVTHfCitlLAGLLPRSGGWRKNFVPTDVGPFAF-NH2

737

Ac-WVTHRLAGLLPRSGGWRKNFVPTDVGPFAF-NH2

738

Ac-WVTHOLAGLLSOSGGWfhArj:¡lKNFVPTDVGPFAF-NH2

739

Ac-WVTH[Clt]LAGLLSICitlSGGW{hArg1KNFVPTDVGPFAF-NH2

740

Ac-WVTHRLAGLLSRSGGWR[4AmPl NFVPTDVGPFAF-NH2

741

Ac-WVEHjMrg]LKGLLSfCit]SGGWRKNFVPTOVGPFAF-NH2

742

Ac-{1-NaI]VEHfhArglLKGLLSrCitlSGGWRKNFVPTDVGPFAF -NH2

743

Ac-rAibl~WVEHrhArqlLKGLLS(CitlSGGWRKNFVPTDVGPFAF-amida

144

Ac-WVTHICIt)LAGlLS[Cit}SGG WRKNFVPTDVGPFAF-NH2

145 746 147 148 749 7S0 751 152 153 754

7SS

756 751 658 144 758 759

FVPTOVGP -Nal

IS8

165 AJ;.\JINT NFVPTOVGPFAF.

166 AJ:.VWTH(hCít)lAGLlS[MrgJSGGWR[hArg]K·~ N, <1<> • NFVPTDVGPFAF.

amfd.

161 168

112 :;;WTH[Cit]LAGLLS{Clt}SGGW[hArgJ ....'He" 40 ;,¡, >D. N FVPTO VG[Oic]FAF

173 Ac.\NVTH[Cit]LAGll S[Crt)SGGWthArgJK Q,PEB·:IO¿'H N FVPTOVGP(1

Na!AF·a~

Ac.wvgHRL,KGLtS[CIJSGGWihArgJKNFVPTOVGlSarlfAF~

Ac-WV¡HRlJSGllS[CftJSGGWihArgJKNFVPTDVG(OicjFAF-"mJrJ.

LKGlLSICltjSGGWlhArg)KNFVPTOVG[Plp}fAF-MnFd4 AG'-WVgHRL,lSGlLS(Cit)SGGW(hAr9)KNFVPTOVG(Hyp)FAF-MnFd4 Ac-wvrH(at}LAGLL$[CJt)SGGW{Mrg]KNFVPTDVG[AiC]FAF-MnFd4 Ae-VWTH(Cít]LAGLLS[Cit)SGGW{Mrg)KNFVPTOVG{AlclFAF • .tmFd4 Ac-wvrH[Cit]LAGlLS[Cit)SGGW{Mrg)KNFVPTOVG{AiblFAF..tn!Jd.I Ac-VWTH(Cit]LAGLLS[Clt)SGGW(hArg]KNFVPTOVG(l'hzlFAF. Mnld. Ac-W\lTH[Cit}LAGLLS(CitjSGGW{Mrg]KNFVPTDVG(Sal'jFAF. Mnld. Ac-WVTH(C4t}LAGLLSlCitJSGGW{hArg]KNFVPTOVG[Sar)FA.F..MnId. k-WVTH{Cit}LAGLlS[CU)SGGW{MrgjKN fVPTDVG(TP11FAf. 4mida AC-WVTH[Cit]LA.GLLS[Cit)SGGW{hArgIKNfVPTDVGIPip]FAF.amkkf Ac-WVTHiCltlLAGllS¡CllJSGGWlhArgIKNFVPTDVG{HypjFAF-amidá

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s.HRl,lSGlLSiCItJSGGWrMr9IKNfVPfNMeThrJOVGIPip]FAF.tm~

§HRL,lSGLlSfCitJSGGWfMrgIKNFVp[NMeThrlDVGIHvpJFAF-,midá

HRL,KGLtS(Cil)SGGW{Mrg)KNfVp{NMeThr}DVG(Byp]FAF-Mnid.

A.c-WV!;HRL!SGLLS(CilJSGGWItlArglKNFVp[NMeThrjOVGtAlcjFAF. amitD

Ac-WVSHRL.tS,GlLSlCltlSGGW(llArg)KNFVp{NMeThr]OVG{AicaFAr. amida

AC·~HRL!$GLLSICillSGGWthAr9)KNFVP[NMeThr10VG(Aib]FAF._1Il1Iidá

illSGGWlllArgjKNFVP[NMeThrlDVGfThzlfAF-MnId.

HRLKGLLSICit]SGGVV(hArg)KNFVP[NMeThrjOVG(SarjFAf-.tmJd.l

Ac-\lWiHRLKGLLSICitlSGGWlM.rg!KNFVP[NMeThrJOVG(SarjFAf.amitD ;: S2

AC"\lWgHRl~GLLS[CitlSGGW{M.rgIKN FVp(NMeTht}OVG(TP41FAF"amJda

2l?:3 I1c-\lWfHRl,!SGI.LS(CitlSGGW{Mrg]KNFVP[NMoThr]DVG[OicJFAF-llmidá ;¡ 54'

Ac-\lWgHRl.!S.GllS[Cit]SGGW{Mrg)KNFVP[NMeThr}OVG{Pip)FAF. amld.

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Ac-\M.IiHRL!SGLLSICítlSGGW{MrgJKN FVP[NMe 2 S..,

Ac.WVSHRl.tS,GlLS(CrtjSGGW{hArg]KNFVP[NrvteThr¡OVG(Pip)FAY. amida 2:'e.

Ac-VWSHRlISGlLS[Cit]SGGW{hArg)KNFVP[NMeThr)OVGlHvplFAH-llmida ;¡ :> 9

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it SGG hA!' ]KNfVPTOVG Oíc FA F·.smHJ. it]KAGLLS(Cit]SGGW[hArg KNFVPTDVG{OIc]FA F·"m~ ¡tjlKGLlS Ctt]SGGW hA., KNFVPTOV Oic]FA F-amidá

¡t)SGG nArg]KNFVPTDVG{OicIFA F-amida Ac-wvrH~J.AG!S.LS(Cil]SGGW{hAl'g]KNFVPTDVG[Olc]FA F.amida Ac-WVTHfCitlSAGLKS{Cit]SGGW(hArg]KNFVPTDVG(OiC)FA F-Mnida Ac-WVTH(Cít]ljiGlLKICít]SGGW(hArg)KNFVPTOVG{OiclFA F-amJdf Ac.VWTHICit)LAgLlSKSGGW[hAlgjKNFVPTDVG[Oic]FA F· Ilmm Ac.VWTHICitlLAGgtS[Cit KGGW(hArgIKNFVPTDVG(Oic FA F-amkkf Ac-VWTHfCit]LAGl!S(Cit)SKGW(hArg]KNFVPTOV OiclFA F., Mnid.

212 Ac-VWTH{CitJLAGlLji[Cit]SG,tSW(hAt9lKNFVPTDVG(Oic]FA F-,,~

l18

GlLS CitlSGG hAlg KN FVFiTD VG N' FAF-fm~ Ac)LAGLLS[Cit}SGGW[hAlglKNFVPTDVG .amH:J. Ac-\lVVTH{CltlLAGLLS(C¡tlSGGW[hArg)KNFVPTDVGP{TicJ,AF~amH:J.

Ac.WVfH(CltlLAGllstCitlSGGVV[hArgjKNFV(O¡c]TDVG[OíC1F A{24\laIJ-.amiü Ac·wvrH[CitlLAGllS[CitJSGGW{hArglKNFV(OicJTDVGP{1·NarJA{2~NalJ.iflTlida

A<;.wvrH[Cit)LAGltS{Cit]SGGW{hAlgIKNFV{Oic)TOVGP[SfpjAF-amlda

Ac·WVTH[CrtjLAGllSrCit]SGGW(hArgjKNFV{Oic]TOVGPFA{2-Naij. ifITI~

AcN\lVTH[CIt]LAGUS(Cit]SGGW{hArgjKN(pt-Phe1VIOlc)TDVG?(pl-Phe}AF

392

Ac-VVVgH[Clt]L!S.GLLS{CiOSGGWRKNFV?TDVG[Oic]FAF-amida

393

Ac-VVV,É,HRL!S.GLLS(CitlSGGWRKNFVPTDVG[OicjFAF-amida

394

Ac-VVV,É,H[Cit]L,!SGLLS(Cit]SGGWRKNFVP[NMeThrlDVG(Oic)FAF'amida

395

Ac-VVVgHRL!S.GllS[Cil)SGGWRKNFVP[NMeThr]DVG(Oic1FAF-amid.

396

Ac-VVV,É,H[Cil)L!S.GLLS[Cit}SGGWRKNFV?[NMe ThrlDVG(Oic)FA[2-Nal)-amida

397

Ac.wvgHRL,!SGlLS[Cil]SGGWRKNFV?TDVG[Oic)FAF·amida

398

Ac.VVVgH~l!S.GLLSrCitjSGGWRKNFV?TDVG[Oic]FAF.amida

399

Ac-WV,É,H[hCítlljiGLLS[CiI]SGGWRKNFV?{NMe Thr]DVG[Oíc]FAF ...amida

400

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Ac-WVlW[Cit]LAGLlS(Cit]SGGWKNNFVPTDVG[OiC1FAF-all!ida

652

Ac-WVTW[Clt]LAGLLS[Cit]SGGWKNNFVP[NMeThrlDVG(OíclFAF-:¡",ída.

Tabla 2e. Secuencias de péptidos eGRP a modo de ejemplo adicionales, incluyendo pegiladas de manera N-terminal. Los residuos de aminoácido en negrita subrayados, si hay alguno, indican ciclación covalente entre el primer residuo en negrita subrayado y el segundo residuo en negrita subrayado en una secuencia. Si están

5 presentes, los residuos de aminoácido en negrita tercero y cuarto (en la dirección de N a e-terminal) indican cielación entre el tercer residuo en negrita subrayado y el cuarto residuo en negrita subrayado. Se determinaron los valores de el 50, si están presentes, tal como se describe en el ejemplo 1 en el presente documento. En la mayoría de los casos en la tabla 2e, el sitio de conjugación con PEG está en el residuo de Lys25 en relación con la SEQ ID NO:43 de referencia.

SEC ID N°

Secuencia de p'ptld~ CGRP CI50 de péptido (nM) .. 'C/5O de PEGc péptido (nM)

856 857 858 859 660

Ac~WVTHRLAGLLSQSGGVVRKNFVPTDVGPFAF-NH2 Ac-WVTHQLAGLLSQSGGVVRKNFVPTDVGPFAF-NH2Ac-WVTHRLAGLLPRSGGVVRKNFVPTDVGPFAF-NH2 Ac-WVTHRLAGLASRPGGVVRKNFVPTDVGPFAF-NH2 Ac-WVTHRLAGLLSRPGGVVRKNFVPTDVGPFAF-NH2 0,470.53 1,3 ldll 1.42 0,466,21 5 60, S 16.7

861

Ac-WVTH (Cit] LAGLLSRSGGVVRKNFVPTDVGPFAF-NH2 O 57 2,08

862

AC-WVTHRLAGLLS{CitlSGGVVRKNFVPTDVGPFAF-NH2 0,58 () ,96

863

Ac-WVTH (Cit] LAGLLS rC1tl SGGVVRKNFVPTDVGPFAF-NH2 1,8 3,74

864

Ac-WVTHRLAGLLS[hArg]SGGVVRKNFVPTDVGPFAF-NH2 0.57 0,33

865

Ac-WVTH [hArgj LAGLLSRSGGVVRKNFVPTDVGPFAF-NH2 0,44 0,36

866

Ac-WVTH [hAralLAGLLS [hAra) SGGVVRKNFVPTDVG PFAF-NH 2 2 1 (}~U

867

Ac-WVTH[Cit]LAGLLPRSGGVVRKNFVPTDVGPFAF-NH2 2,31 146

868

Ac-WVTH[Cit)LAGLLSRPGGVVRKNFVPTDVGPFAF-NH2 3 108

869

Ac-WVTH[Cit]LAGLASRPGGVVRKNFVPTDVGPFAF-NH2 6,19 565

870

Ac-WVTH(Cit)LAGLAS{CitJSGGVVRKNFVPTDVGPFAF-NH2 16 1 >1000

871

Ac-WVTH[Cit)LAGLLSrCit]SGGVV[hAr9]KNFVPTDVGPFAFNH2 0,41 ),22

8'72

Ac-[1-Nal]VTH[Cit1LAGLLS(CitlSGGVVRKNFVPTDVGPFAF-NH2 " 1,6 11,04

873

Ac-

WVTH[Citl [Nva]AG[Nva] (Nva)T[Cit}SGGVVRKNFVPTDVGP

63

FAF-NH2

874

Ac-WVTHR [NMeLeu] AGLLSR [NMeSerl GGVVRKNFVPTDVGP FAF-NH2 2,92 208,2

875

Ac-WVTH [NMeArg]LAGLLS[NMeArgl SGGVVRKNFVPTD

876

VGPFAF-NH2 Ac~WVTHRLAGLLSRSGGVVRKNFV[Tic]TDVGPFAF-NH2 1,63 2,33

877

Ac-WVTH (Citl LAGLLS [Cit) SGGVVRKNFV(HYP] TDVGPFAF

NH2

1,81

878

Ac-WVTH (hCit]LAGLLS (hCit] SGGVVRRNFV[Tic]

TDVGPFAF-NH2 ,

1,99

879

Ac-~HRLAGLLSRSGGVVRKNFV(AibJTDVGPFAF-NH2 4,2

880

AC-WVTH(Cit]LAGLL S[hArg]SGGVV[hArg]KNFVPTDVGP 2,06

FAF-NH2

881

Ac-WVTH[hArg]LAGLLS [Cit) SGGVV(hArg}KNFVPTDVGP 2,58

FAF-NH2

882

AC-WVTH['hArglLAGLLS[hArg)SGGVv[hArg)KNFVPTDVG

PFAF-NH2

1,46

883

Ac-WVTH[Cit]LAGLLSQSGGVV[hArg]KNFVPTDVGPFAF-NH2 1,42

884

AC-WVTHQLAGLLS(Cit)SGGVV[hArg]KNFVPTDVGPFAF-NH2 8,87

885

Ac-WVTH[Q)LAGLLS [QJ SGGVV [hArg) KNFVPTDVGPFAF-NH2 1,42 12 , 4

886

Ac-WVTH[hCit]LAGLL S[hCitlSGGVV[hArgJKNFVPTDVG 4,96 22,7

PFAF-NH2

887

Ac-WVTH[hArglLAGLL S(hCitl SGGVV[hArg] KNFVPTDVGP

FAF-NH2

3,14 6,3

888

Ac-WVTH[hCit]LAGLL S [hArg)SGGVV[hArg]KNFVPTDV

GPFAF-NH2

2.11

8.89

AC-WVTHRLRGELSRKGQVVRKNFVPTDVGPFAF-NH2 0,94

890

Ac-WVEHRLªGLL~SGG VVRKN FVPTD VGPFAF-NH2 1.7 2.86

891

Ac-WVEH~GLL SRSGG VVRKN FVPTD VGPFA F-NH2 1,47 j ,71

892

Ac-WV¡HR45G~LS~GGVVRKNFvPTDVGPFAF-NH2 1,11

893

Ac-WVEHR LKGLL S[Cit)SGGVVRKNFVPTDVGPFA F-Mi2 1,64

894

Ac-~H[hArgl~GLL S(CitlSGG VVRKN FVPTD VGPFA

F-NH2

1.26 3,54

895

AC-~HR~GLLSrCit)SGGVVRKNFV~DVGPFAF-NH2 2,8

896

Ac-WVEHRL~LLS[CitJSGGVVRKNFVPTDVGPFAF~NH2 1,61

897

AC-{l-NalJVEH[bArg)LKGLLSrCitJSGGVVRKNFVPTDVGPFA

F-NH2

2,25 4,1 .

898

AC-{Aib)WVEH[hArg]~GLLS{Cit]SGGVVRKNFVPTDVGPFA

F-NH2

3,18 40, 7

899

Ac-WYgH[hArg] LKGLL S[CitlSG{Aze]

VVRKNFVPTDVGPFA F-NH2

1,62

900

AC-{l-Nal]VEH [hAr9]LKGLLS[Citl SGGVVRKNFVPTDVG

PFAF-NH2

2,43

901

Ac-~HRLEGgLSRKGGVV(hArg]KNFVPTDVGPFAF-NH2 1,02

902

AC-W\1EHRI..EGELS (Cit]!SGGVV[bArg] KNFVPTDVGPFAF-NH2 0,49

903 904

Ac-WVT'HRLEGLLKQSGGVV(hArg)KNFVPTDVGPFAF-NH2Ac-WVEHRLKGLLSQSGGVV [hArai KNFVPTDVGPFAF-NH2 3,50 2,03 6,-2L

905 906 907 908 909 910 911

912 913" 914 915 916 917 918

~19

920 921 922 923 924 925 926 927 928 929 930 931 932 933

937 936 939 940 941

Ac-WVlH~GLLS[hArg)SGGVV[hArg)KNFVPTDVGPFAF-NH2 Ac~WVEHR~LLS[CitlSGGVV(hArg]KNFVPTDVGPFAF-NH2 AC-WVEH[Cít]~LS(Cft)sGGVV(hArg]KNFVPTDVGPFAF

NH2 Ac-WVEH (hArg] LKGLLS [CitlSGGVV{hArgJKNFVPTDVGPFAF-NH2

Ac-~H(hArgJLKGLLS[CitlSG[Aze]VV[hArg]KNFVPT

DVGPFAF-NH2 Ac-[l-NallVEH [hArgl LKGLLS[Cit)SG[Aze1VV[hArg]KNFVPTDVGPFAF-NH2

AC-~H[CitJL~GLLS[CitlSGGVV[hArglKNFVPTDVGPFAF

NH2

Ac-WVTHRLAGLLSRSGGVVRKN[2-Nal]VPTDVGPFAF-NH2Ac-WVTHRLAGLLSRSGGVVRKNFVPTDVGPFA[2-Na11-NH2Ac-WVTHRLAGLLSRSGGVVRKNFVPTDVGPFA[1-Nal}-NH2Ac-WVTHRLAGLLSRSGGVVRKNFVPTDVGSKAF-NH2 C{Ahx]WVTHRLAGLLSRSGGVVRKNFVPTDVGPFAF-NH2Ac-WVTHRLAGLLSRSGGVVRKNFVPTDVGPKAF-NH2 Ac-WVTH[Cit1LAGLLS[CitJSGGVVRKNFVPTDVGPRAF-NH2Ac-WVTH{CitJLAGLLSICitjSGGVVRKNFV(Oic)TDVGPFAFNH2 Ac-WVTH(Cit]LAGLLS[Cit]SGGVVRKNFVPTDVG(Oic]FAFNH2 Ac-WVTH(Cit1LAGLLS[CitlSGGVVRKNFV[Oic]TDVG

[Oic]FAF-NH2Ac-WVTHICitlLAGLLSrCitlSGGVVRKN[pIPhe]VPTDVGPFA[pI-phe]-NH2AC-WVTH [Cit) LAGLLS [Citl SGGVVRKNFVPTDVGPFA[pIPhel-NH2 Ac-WVTH[hArg]LAGLLS (Citl SGGVV{hArg) KNFVPTDVGP [1

"Nal]AF-NH2Ac-WVTH[hArg)LAGLLS[CitlSGGvv,{hArglKNFVPTDVGPFA(phg]-NH2.Ac-WVTHlhArg)LAGLL S[Cit]SGGVV(hArg]KN FVPTD VGp[2-NalJA F-NH2 Ac-WVTH[CitlLAGLL.S[Cit]SGGVV(hArg)KN FVPTD VGP[l-Nal]A F7NH2 Ac-WVTH[Cit}LAGLLS[Cit]SGGVV[hArgJKN[pIPhe]VPTDVGP[pI-Phe]AF-NH2Ac-WVTH[Cit]LAGLL S[CitjSGGVV(hArgJKN ¡"VPTD VGP(Bip]A F-NH2. Ac-WVTH[Cit]LAGLL SrCitJSGGVV[hArg]KN FVPTD VGP(Igl]A F-NH2 Ac-WVTH [Cit]LAGLLS(Cit) SGGVV[hArg]KN FVPTD VG[OiC]FA F-NH2 Ac-WVTH (Cit] LAGLLS [Cit] SGGVV[hArglKN FV[Oic]TDVG[OiC]FA F-NH2 Ac-WVTH(CitlLAGLL S{CitlSGGVV[hArg]KN FVPTD VG(Oic} (l-Nal) A F-NH2 Ac-WVTH[Cit]LAGLL S[CitlSGGVV{hArgJKN ~D VG[Oic] [2-Nal}A F-NH2 Ac-WVTH [Cit]LAGLLS (hArg] SGGVV[Guf] KNFVPTDVGPFAFNH2 Ac-WVTH {Citl LAGLLS [hArg] SGGVV(BhArg)KNFVPTDVGPFAF-NH2 Ac-WVTH(Cit]LAGLLS(Cit]SGGVV[CitJKNFVPTDVGPFAFNH2 Ac-WVTH[CitlLAGLLS[Cit] SGGVV[3G-Dpr] KNFVPTDVG PFAF-NH2 Ac-WVTH [Cit] LAGLLS [Cit] SGGW[GufJKNFVPTDVGPFAFNH2 Ac-WVTHfCitlLAGLLS[CitlSGGV(NlelRKNFVPTDVGPFAFNH2 AC-WVTH[Cit)LAGLLS{Citl SGGVV[hArg] K C30KPEGald)

45

1,70

3,70

"2,29 0,83

1, 15

4,87 1,28 3,45 2,31 3,85

1,16 1,7233,13 1,15 1,8 1 1,48

1,24

0,85

0.93

2,21 2,24 2,18 6,78 0,88

2,39 1,28

2,54 1,16

"11, 4

5,58 4,58 1.76

126,3

2¡16 1,31

1,14

0.88 1,65 2,37 2,41 2,87 1,39 0,97

1,86 1, 85

7.76 942

NFVPTD VGPFAF-NH2

Ac-WVTH[hArg]L~GLL~rCitJSGGVVrhArg}KN FVPTD VG[OicJFAF-NH2

0.83 943

Ac-WVTH [Ci t JLAG-ªLS [C i t]~GGW[hArgJKNF'VPTDVG

(OiclFA F-NH2 .

1,45 944

Ac-WVTH[Cit)LAG~LSrhArglKGGVV[hArg)

0.85

KNFVPTDVG [oie] [1-Nal )'AF-NH2

12.98

Ac-KWVTH [Cit) LAGLLS [Citl SGGWRKNFVPTDVGPKAF-NH2

Áe-WVTH (Cit) LAGLLS [Ci t 1"SGGW (hArgJKNFVP

TDVG[Tic}FAF-NH2

2.47 947

Ac-WVTH(CitlLAGLLSrCitlSGGVV[hArg]KNFVPT

DVGP(Tic)AF-NH2

89.91 948

Ac-WVTH [Cit)LAGLLS{Cit) SGGVV[hArg)KNFV[Oic)

TDVG[Oic]FA[2-Nal)-NH2

2. 57 949

AC-WVTH[Cit]LAGLLS[Cit)SGGVV[hArg}KNFV[Oicl

TDVGP[1-NallAf2-Nal]-NH2

2.73 950

Ac-WVTH [Cit]LAGLLS[Cit)SGGW[hArg] KNFV[Oic}

TDVGP[Bip1AF-NH2

3.85 951

Ac-WVTH (Cit)LAGLLSrCitl SGGVV[hArg)KNFV[Oic}

3.22 952

TDVGP~A(2-Nall-NH2

Ac-WVTH[CitJLAGLLS(Cit]SGGW[hArg}KN[pI

Phe)V(OicJTDVGP[pI-Phe)AF-NH2

2.34 953

Ac-WVTH(CitlLAGLLS[Cit}$GGVV[hArg)KN[2

Nal]VPTDVGfOic]FAF-NH2

2.66 954

Ac-WVTHlcitJLAGLLS{CitlSGGVV(hArg)KN[2

Nal)VPTDVG(Oic)FA(2-Nal)-NH2

3,45 955

Ac-WVTH[cit]LAGLLS(CitlSGGVV[hArg)KN[2

Nal]V[Oic]TDVG[Oic)FA[2-Nal]-NH2

3,57 956

Ac-WVTH(Cit]LAGLLS[CitJSGGVVRKNFVPTDVG[TiclFAF

NH2

3.02 957

Ae-WVTR (CitJLAGLLSrCitl SGGVVRKNFVPTDVG(Tic) FAF•

NH2

4.32

958 Ac-WVTH [Citl LAGLLSlCit) SGGW(hArg) KNFVPTDVG [Tic]FAF-NH2

19,7 959

Ac-WVTH [Citl LAGLLS [Cit)SGGVV{hArg]KNFVPTDVG

[TiclFAF-NH2 .

8 85 960

Ac-WVTH [Cit] LAGr.I.S (Cit] SGGVV [hArg] KNFVPTDVGP{l

NalJAF-NH2

2,24 961

Ac-WVTH[CitlLAGLLS[CitlSGGVV(hArg]KNFVPTDVG

[Oic)FAF-NH2

4,04. 962

Ac-WVTH [Cit] LAGLLS [Cit)SGGVVRKNFVPTDVGP[Tic]AF

NH2 .

10,13 963

Ac-WVTH[Cit)LAGLLS rCit]SGGVV(hArg] KNFVPTOVG (TiqlFAF-NH2964

AC-WVTH [Citl LAGLLS [Citl SGGVV[hArg] KNFVPTOVGP [Tiq]AF-NH2965

Ac-WVTH[CitJ LAGLL S[CitlSGG VV(Guf]KN FVPTD VG{Oic)FA F -NH2

Ac-WVTH(Cit] LAGLL ~[CitlSGG VVRKN FVPTO VGPKA FK -NH2

Ac-WVTH[Cit] LAGLL S[CitlSGG W[Guf]KN FVPTD VG[Oic]FA F -NH2

Ac-WVTH[CitlLAGLLS{Cit]SGGVV(hArg]KNFVPTDVGP[lNalJAF-NH2 969

Ac-WVTH[Cit] LAGLL S¡CitJSGG VV{hArg)KN FVPTD VG[Tiq)FA FF -NH2 970

Ac-WVTH(Citl LAGLL S[Cit}SGG VV[hArg]KN FVPTD VGP[Tiq]A FF -NH2 971

Ac-WVTH[Cit]LAGLLS(CitlSGGVV[hArg]KNFVPTDVG[Thz]FAF-NH2972

AC-WVTH(Cit)LAGLLS [Cit] SGGW[hArglKNFVPTDVG[phg]FAF-NH2973

AC-WVTH(Cit]LAGLLS[CitlSGGVV(hArg]KNFVPTDVG [Pip]FAF-NH2

Ac-WVTH[CitJLAGLLS[CitjSGGVV(hArg1KNFVPTDVG[Hyp]FAF-NH2

Ac-WVTH[CitlLAGLLS(Cit]SGGvv(hArg]KNFVPTDVG (Nip]FAF-NH2 976

Ac-WVTH (Cit]LAGLLS [Cit) SGGVV(hArg]KNFVPTDVG [Aic)FAF-NH2 977

Ac-WVTH[Cit]LAGLLS{Cit]SGGVV(hArg]KNFVPTDVG [AibJ FAF-NHi 978

Ac-WVTH[CitlLAGLLS[CitlSGGvv[hArglKNFvPTDVG [Hyp] {1-Na11AF-NH2 . 979

Ac-WVTH (Cit)LAGLLS[Cit) SGGVV{hArg}KNFVPTDVG [pipJ (1-Nal]AF-NH2 980

Ac-WVTH[CitJLAGLLS(CitjSGGVV{hArg]KNFVPTDVG (Sar)FAF-NH2 981

Ac-WVTH [Cit] LAGLLS (Cit] SGGVVRKNFVPTDVGP[Tic)AFNH2 982

Ac-WVTH[Cit] LAGLL S[CitlSGG VV[bArg)KN FVPTD VG[Tpi]FA F -NH2 . 983

Ac-WVTH[CitJ LAGLL S[Cit1SGG vvfhArg]KN FVPTD VGP(Tpi)A F -NH2 984

Ac-WVTH [CitlLAGLLS [Citl SGGVV[CltJKNFVPTDVG

[OiC]KAF-NH2 ,

Ac-WVTH(Guf]LAGLLSrCit]SGGVV(Guf)KNFVPTDVG [Oic]FAF-NH2 986

Ac-WVTH[Guf]LAG~LS[GuflSGGVV[Cit]KNFVPTDVG

[Oic]FAF-NH2 987

Ac-WVTH[Cit)LAG~S(hArgJ~GGVV[Guf]KNFVPTDVG

[9i c)FAF-NH2 . . 988

Ac-WVTH [Ci tl LA~LS(hArgl~GGVV(Guf) KNFV[Oicl " TDVG (Oic) FAF-NH2 989

Ac-WVTH[Cit)LAGLLS[CitJSGGVV[hArg]KNFVPTDVG [ThzJ FAF-NH2' 990

AC-WVTHfCit]LAGLLS lCitl SGGVV [hArg] KNFVPTDVGP (Tpi]AF-NH2 991

Ac-WVTH [Cit] LAGLLS {Cit]SGGVV[hArg]KNFVP1'DVG [Oic]FAF-NH2 992

Ac-WVTH(CitlLAGLLS [Citl SGGVV[hArg]KNFVPTDVGP (1Nal]AF-NH2993

Ac-WVTH [Cit] LAGLLS [Cit] SGGVV[hArg]KNFVPTDVGP (1NalJAF-NH2 994

Ac-WVTH[Cit]LAGgLS(Cit}~VV[hArg]KN FVPTD VGP[1-NalJA F-NH2

AC-WVTH[CitJLAG~LS[hArgJ~GGVV[GufJKNFVPTDVG

[Oic]FAF-NH2 996

Ac-WVTH[Cit]LAG§LS[hArg]~GGVV[Guf)KNFV{OicJ

TDVG [Oic] FAF-NH2

.991

AC-WVEH[CitlLKGELS[Cit~KGGC-NH2

Ac-WVEH[Cit] LKGLL S[Cit]SGGC-NH2

Ac-WVTH [Cit) LEGLLK [Cit] SGGC-NH2

Ac-WVTH(Citl LAGELS [CitlKGGC-NH2

CGGPTDVGrOicl[l-Nal)~ F-NH2

COGPTD VQ(Olcl [2-Nal}A F-NH2

CGGPTDVG[Oicl [2-NalIA(2-NalJ-NH2

CGGPTD VGPI1~Nal]A F-NH2

CGGPTD VGP{2-NalJA F-NH2

CGGPTO VGrOicjFA F-NH2

..

CGG[Oic)TDVG[O!clFAF-NH2

IDO?

Ac-WVTH[Cicl LAGLL S(CitlSGG VV[hArgJKINPegll)KFVPTDVG[oiclKINPegll)AF-NH2

1008 [NPegll]WVTH(C1t} LAGLL S!Cit)SGG VV[hArg}KNFVPTDVGIOic]KAFNH2

1009 Ac-WV'l'H [eir: 1 LAGLL S(Cit)SGG VV{hArg)KN(GuflVPTDVG{oic)KAFNH2

1010 [Gaun) INPeq111W\fflt(Citl LAGLL SICitlSGG .W{Mrg]KNFVPTDVG

IOicJKAF-NH2

Ac-WVTHICitl LAGLL SICitlSGG W{CitJK{NPegll)X¡VPTNVG ¡Oic!K(NPegll)AF-NH2

Ac-WV'l'H[Cit1 LAGLL S¡CitlSGG VV(Cit)K(NPeg11IKFV~ !Oic)K{NPegl1)AF-NH2

Ac-WVTHICit) LAGLL s rCit)SGGVV{CitJK(NPegl1)KFVPTNVG lOicIKAF-NH2

1015 Ac-WVTHICitl LAGLL S(CitlSGG WlhArgJKKFVPTDVG[O!C]KAF-NH2

Ac-WVTH {eir:} LAGLL s [CitISGG VV[hArglKKFVPTDVGIOiclKAF-NH2 1016

lÓ17

[NPeg11jWVTH(Citj LAGLL S['eH1SGG W (h1\rgJKNFVP'l'OVG

(OicJKAF-NH2

1018 Ac-t1VTH Iei t: J LAGLL S [Cit)SGG W{hArg}KN!GuflVPTDVG [Oic)KAFNH2

[GaunJ [NPegllIWVTH[Cit) LAGLL SICit:ISGG W(h1\rg]KNFVP'I'DV G[OicIMF-NH2

1020 Ac-wvrH(Cit) LAGLL s [CitISGG VV[Cit}KKFVPTNVG[OiclKAF-NH2

1021 Ac-WVTIHCit) LAGLL s [CitlSGG VV(Cit}KKFVPTDVGlOic}KAF-NH2

Ac-WVTH(Citl LAGLL S[Cit]SGG VV[CitlKKFVPTNVG{Oic]KAF-NH2 1022

1023 Ac-WVTH[Cit] LAGJ.L SICit]SGG VV[hArg}K(NPegll}NFVPTDVG [OicjFAF-NH2

1024 Ac-WVTHICit} LAGl,L S[Cit)SGGVV[CitlK(NPeg111NFVPTDVG[Oic]FAF-NH2

1025 Ac-WVTIi [eit] LAGLL S[Cit)SGG VV{Cit)K(NPegllINFVPTDVG [Oic]l\AF-NH2

1026 }\,c-WVTHICit) LAGLL SICitlSGG VVICitJKINPegll)NFVPTNVQrOiclKAF-NH2

1027 Ac-WVTH[CitI LAGLL SICil:lSGG VV(hAr9)KNFVPTOVG[Oic}KA(GuflNH2

1028 Ac-WVTH (eit) LAGLL srCitlSGG VVfhAr9JKNFVPTDVG(OiclKAF-NH2

1029 Ac-WVTHICitI LAGLL S¡Cit]SGG VVfhArg)KKFVPTNVGIOiclKAF-NH2

1030 AC-WVTH(Cit} LAGLL S(CitlSGG VV[hArg]KKFVPTDVGIOic}KAF-NH2

1031 Ac-WVTH(Cit)LAGLLS [CitjSGGVV[Cít IKNFVPTDVGIOicl KAF-NH2

1032 Ac-WV'l'H (eí tI LAGLLS rCi t.l SGGVV[Ci tIKNFVPTDVG(Oic}FAF-NH2

Ac-WVTH(Cit]LAGLLS[Cit)SGGW[CitIKNFVPTDVGPII-Nal]AF-NH21034

Ac-R(BocBoc)KNFVPTO(tBu)VG!Oic]K(Boc)AF-NH2

1035 R(8ocBoc)KNFVPTDltBu)VG[OicJKlBoc)AF-NH2

1036 Ac-R(BocBoc)KK(BoclFVPTDltBu)VG{Oic]KAF-NH2

1037 Ac-RlBOCBoc)KKIBoclFVPTNVG[Oic)KAF-NH2

1038 Ac-R(BocBocIRIBocBoc'KNFVPTD(tBu)VG{Oic)KAF-NH2

1039 Ac-RK {Cys)KFVPTDVG (Oic] KAF-NH2

1040 RKICys)KFVPTDVG[Oic)KAF-NH2

.

1050 RK{CyslNFVPTDVGIOiclKAF-NH2

1051 RK(Cvs) KFVP'l'NVG IOicJKAF-NH2

1052 !Cit)tAGúúS[Cit)SGGVVRKNFVPTD VG[OiclFAFMNH2

1053 LAGLLS{Cit)SGGVVRKNFVPTD VGIOiclFAF-NH2

1054 AGLLS¡CitlSGGVVRKNFVPTD VG[Oic]FAF-NH2

1055 G~LSrCitJSGGVVRKNFVPTO VG[Oic]FAF-NH2

1056 LLS[CitlsGGVVRKNFVPTD VG{OicJFAF-NH2

1051 LS[Citl SGGVVRKNFVPTD VG [Oi.cjFAF-N1I2

10S8 S(Cit}SGGVVRKNFVPTD VG(OicIFAF-Nlf2

1059 [CitjSGGVVRKNFVPTD VGIOicIFAF-NH2

1060 SGQVVRKNFVPTD VGIOiclFAF-NH2

1061 GG'VVRMFVPTD VG(Oic)FAF-NH2

1062 VVRKNFVPTO VG(OiclFAF-NH2

1063 Ac-EVTHKtAGLLS{Cit]SGGVV[hArg]KNFVPTDVG(Oic]FA F-NH2

1064 Ac-~HlcitlKAGLL9[Cit}SGGVV[hAroJKNFVPTOVG(OiclFA F-NH2

1065 AC-~JICitJLKGLLS[Cit)SGGVV[hArgJKNFVPTDVG(OicJFA F-NH2

1066 Ac-WVTmICitJ~LS[Cit)SGGVV(hArgJKNFVPTDVGlOicIFA F-NH2

1067 Ac-WVTH~~A~SICitJSGGVV[hArgIKNFVPTDVG[OicJFA F-NH2

1068 Ac-WVTHfCitl~GLKSrCit)SGGVVlhArg]KNFVPTDVG[OícIFA P-NH2

1069 Ac-WVTH{CitlL&GLLKfCit)SGGVV!hArgJKNPVPTDVGIOiclFA F-NHZ

1010 Ac-WVTH!CitlLA§LLSKSGGVVlhArgIKNFVPTDVGfOicIFA,F-NHa

1071 Ac-WVTH¡CitlLAGILS(CítIKGGVVfhArgjKNFVPT9VGIOíclFA F-NH2

1072 Ac-WVTH(Cit)LAGLtsICit)SEGVV[hArg)~~FVPTDVGIOicJFA F-NH2

1073 Ac-WVTH[CitJLAG~~¡CitJSGIVV{hArg)KNFVPTDVGIOicJFA F-NH2

1074 AC-WVTHlCitlLAGLLSRSGGKVlbArgIKNFVPTDVQ[Oic)FA F-NH2

.

1075 Ac-WVTH{CitJLAGLLS[CitJ~GGVK¡hArgJ~~FVPTDVG[OicJFA F-NH2 1076 Ac-WVTH[CitlLAGLLS(CitISG¡VVlhArgIKNFVPTDVGIOic!FA P-NH2 1077 Ac-WVTH[Cit]LAGLLS[Cit]SGQgVlhArg]KKFVPTDVG(Oic!FA F-NH2 1078 Ac-WVTH[CitlLAGLLSICitlSGGVVlhArgjKKFVPTRVG{Olc)FA P-NH2 1079 AC-WVTH[CitJLAGLLS¡CitISGGVVlhArgJKNKVPTDQG(Oic]PA F-NH2 1080 AC-WVTH{Cit)LAGLLS[CitlSGGVV[hArgJKNF~~rOiclFA F-NH2 1081 Ac-WVTHfCitJLAGLLSICitISGGVV!hArglKNFVPKDVG(Oic]DA F-NH2 1082 AC-WVTHICitJLAGLLS¡CitlSGGVVlhArgJKNfVPTKVGfOic]FD F-NH2 1083 AC-WVTH{CitlLAGLLSLCitlSGGVVlhArg]KNFVPTDllG[OiclFA~-NH2

1084 AC-WVTHIC~t]LAGL4S(CitlSGGVV[Cit]KNFVPTDVG[OicJFAF-NH2

1085 . Ac-WVTHrCitjLAGLLS(Cit)SGGVV(Cit]K (NPegll)NFVPTOVG(Oic}FAFNH2

.

1086 Ac-WVTH(Cit) LAGLL S(Cit)SGG VV{hArg)KINPegll)NFVPTNVG[OiC)FAF-NH2

1087 Ac-WVTH [Cit)LAGLLS rCic] SGGVVrCit] KNFVPTDVGP [l-Nal JAF-NH2

1088 Ac-WVTH[CitlLAGLLS[CitJSGGVVlhAr~)KN FVPTD VGrOicJFAP-NH2 1089 Ac-WVTHrCitlLAGLLSrCitISGGVVlhAr~KN FVPTD VG(BhProlFAF-NH2

1090 1091 1092 1093 1094 1095 1096 1097 1098 1099 1100 1101 1102 1103

AC~WVTHrCitlLAGLLSrCitISGGVV(BhAr9JKNFVPTOVGIOlcIFAP~NH2 Ac·WVTH[CitlLAGLLS¡CitlSGqVV(hAr9IKN FVPTD VG[OicJ IBhPhe]APMH:! Ae-WVTH(Clt}LAGúúS{CltISGOVV(hArg]KNIBhPhe}VPTD VG(Olc)FAFNH2 Ac-WVTH(Clt]LAGLLS[CitJSGGVV[hArg]KN!AMeP)VPTO va¡OlclFAFNH2 AC-WVTH(Cie)LAGLLS(CitlSCGVVlhArg)KN FVPTD VGIOiclFA (AMeFl1m2 Ae-WVTH(CitlLAGLLSICit)SGGVV(hArglKN FVPTD VOIOic} (AMeF)AFNH2 Ae-WVTH(CitlLAGLLS[CitjSGGVV(hArgIKNINMePhelVPTD VGI01e}?APNH2 AC-WVTH(CitlLAGLLSICitISGGVV(hArglKN FVPTD VG{01c]FA(NMePbel-NH2 Ac-WVTH{Cü)LAGLLS!Cit}SOOVV{hArg}KN FVPTD IIG!Olc)-INMePheI AF-NH2 Ac-WVTM[CitlLAGLLS¡CltlSOOVV(hArg)KN pVPTD VO[NlplPAF-Nli2 RK(Cys)Nl'VPTDVGfOicIFAF-N}f2 RRK(Cys)NFVPTOVGIOicIFAF-NH2Ac-WVTH[citl LAGLL S('Cit)SOO W¡hArglKINPegll)NFVPTNVG !OiclFAP-NH2 AC~~H{Ciel LAGLL S(Cit)SGG VV[hArQ1K(NPegl1)NFVPTNVGp (l~NalJru:'-NH2

Tabla 2D. Secuencias de péptidos eGRP a modo de ejemplo adicionales, incluyendo pegiladas de manera N-terminal. Los residuos de aminoácido en negrita subrayados, si hay alguno, indican ciclación entre el primer residuo en negrita subrayado y el segundo residuo en negrita subrayado en una secuencia. Los grupos mostrados entre paréntesis y en superíndice se refieren al residuo en su izquierda (normalmente Lys o eys), e indican unión a través del grupo de cadena lateral. Se determinaron los valores de el 50 tal como se describe en el ejemplo 1 en el presente documento.

sea Secuencia CI50 IONO (nM)

764 Ac.wvrHRLAGllSRSGGWRCNFVPTOVGPFAf-amida

-0,91

Ac-WVTHRLAGLLSRSGGWRCIMeO.PEG de 5kDaNFVPTOVGPFAF_am ida

2,52

766 Ae:-WVTHRLAGLLSRSGGWRCtAeO.PEG de 20kDaINFV?TOVGpFAF.amida

4,09

Ac-WVTHRLAGLLSRSGGWRCMeO.PEG de 30kDaNFVPTOVGPFAF_amida

7,86

Ac-WVTHRLAGLLSRSGGWRC(MeO-PEG tamifi~ado de 20kDfNFVPTDVGPFAF~768

amida

23,80

Ac-WVTHRLAGLlSRSGGWRdMeO-PEG tamificado de 4OkD~FVPTDVGPFAF.

amida 33,4~

.Ac-WVTHRLAGLLSRSOOWRé""'Ofl(G ,......,.., M ~'O'i NFVPTOVGPFAF~

amida

0,17

111 Ac.WVTHRLAGu..SRSGGWRdIlCMJ>tGUfO*Q·NFVPTDVGP"AF. ~ 0,30

712 Ac-WVTHRLAGLLS(A1SGGWRCNf'VPTOVGPFAF-Bmid. 2,75

173 Ac-WVTHRtAGLLSASGGWRd.....IJ.I'H,""·O')NfVPTOVGPFAF.smid.

6,20

714 Ac.WVTHRLAGLLSIQ)SGGWR~'l'rG"2!)~o.\4FVPlOVGPFAF~smid. 0,37

At.WVTHRtAGu..SOSGGWR¿"'¡H'HI ... ;¡tIlu,,~FVPTDVGPFAF.~

4,69

176 Ac:.WVTHRLAGLLS{f]SGGWRCNFVPTOVGPFAF. smid. 0,59

PfG

1n Ac.liVVTHRtAGLLS(r}SGGWRd.....O'... ·c..~FVPTOVGPFAF·amida

19,42

778 Ac.{:3lPA}-VTHRLAGllSRSGGWRCNFVPTOVGPFAF.límid.

0,35

179 Ac-{3tPA)NTHRtAGLLSRSGGWRdM.PflEG do 2úlu"NfVPTDVGPFAF.límid. 2,22

180 Ac-\JINlHRLAGllSRSGGVVRCNFVPTOVGPFAF·mnid.

( PEG-CiJn d. 20tO. trivllente unido rAe.781 \lWTHRtAGlLSRSGGWRCz5NFVPTOVGPFAf·smidsl1

0.19

(PEG-Cien d. 2UtD. te•• nido 1Ac182 ~RLAGlLSRSGGVV FVPTOVGPFAf· tm1id'l. 0,08

(PeG-C¡~ d. 20tD. octaval.nte unido [Ae783

~HRLAGLLSRSGGVVR~NfVPTOVGPFAf.smidlh

1,40

784 Av-VWTHlMtglLAGLLSfhAr9JSGGWRKNFVPTOVGPFAF~ 2,10

Af:¡..WVTHlhArgJLAGLLSrhAr9JSGGVVR~"",o.J>tG... 1t)tll3~FVPTDVGPFAF.Iímid.

785 0,37

786 Ac-WVTHRLAGUS(hAtg}SGGWRK'NfVPTDVGPFAf.smíd. 0,57

787 Av-WVTHRLAGllS(hAf91SGGVVR~uf1'fG de moIl31NFVPTDVGPFAF.""¡dI 0,33

188 A¡;:.WV'TH{hArg)LAGllSRSGGWRKNFVPTOVGPFAf·Bmid. 0,44

189 Av-WVTHfMr91l.AGlLSRSGGWR~I'EG.:l\l14'llo~FVPTOVGPFAf·límid.

0.36

700 Ac.WVTHlC¡tjtAGU.SICitlSGG VVRKNFVPTOVGPfAf-amirJ. 1,70

791 Av-~HtCjtJLAGLLSlCit)SGG VVRi""UI'((; do2!)kf}oINFVPTOVGPFAF~mnid. 3,74

792 ' Ac.WVfH(CitjLAGU.S(Cit]SGG WRKM.PI'EGa :l\lkllloINfVPTOVGPFAF_amid.

793 AA:1.\1WTHICf1lLAGllS¡CitISGG WFU<I,_PtGM_.NFVPTDVGPFAF.tmiá 2Ac.WVTHfCítlLAGlLSICitISGG WRK(JII>I;}PtG40l<l>lto'NfVPTOVGPfAF.

tmIi<i.

195 Ac.IJWTH(Clf}tAGllS{CitISGG WRK(JII>OPHI40lt»1!o) NfVPTOVGPFAF.tmiá 796 Ac-VWTHRLAGLlS¡Cíl]SGG WRKNFVPIDVGPFAF·Mnida

0,58

797 ,Ac.vWTHRtAGlLS(Cit}SGG WRKl-PH'''' :>OW.¡NFVPTOVGPfAF.tmIi<i.

0,96

798 Ac·WVTH{CtIILAGt.LSRSGGV VRKNFVPTDVGPFAF·Mnida

0,57,

199 Ac·WVTHICitlLAGllSRSOOV VRK ¡"'~PfG"1t!I(l.)NfV?TOVGPFAF.tmiá

2,08

800 Ac.WVTHRlAGUSRSGGWRN(CjfVPTDVGPFAF.tm1id. 801 AcNNTHRLAGllSRSGGWRNCr-f'i'O.. mv.'FV?TOVGPFAF'tmiá

1,64

802 '')C.,.?Ac.\WTHRlAGlLSRSGG VVRKNFVPTDVGPFA(15N·F}. tmiá 13C1,zAc-WVTHRLAGllSRSGG VVRK¡""~*'tG1ioX<l1J>1 NFVPTOVGPFAf15N.

F].~

3,28

804 Ac·\iWTHRLAGll.SRSGGWRCNFVPTOVGPFAF· tmiá S05 Ac.V\l'VTHRLAGllSRSGGWRC(JII>Q P.'J. NUJo) NFVP10VGPFAF. tmiá

1.33

800 Ac·WVTHRLAGI.l.SRSGGV\l'RKNFVPTOVGPFAf·tmiá Ac.WVTHRLAGllSRSGGWRK ¡_i+U"" __1NFVPIDVGPFAf.MDitJ.

808 Ac.wvTHRLAGlLSRSGGWRKNfVPTOVGPfAF·tm1id. 809 Ac.\lV\lTHRLAGllSRSGGWRK ,_f'fU'"~MNfVPTOVGPFAF~tm1id.

0,32

810 Ac.WVTHRLAGllSRSGGWRK 1"''''''f;(¡'" »lllo)NfVPTOVGPFAF.lImida 811 AC'·WVTHRLAGllSRSGGWRK(-i'[G·~NFVPTDVGPFAf.tmiá 812 Ac-WVTHRLAGllSRSGGWR~-PHI "'XI\¡¡"¡ NFVPTOVGPFAF-emida 813 Ac-wvn-tRLAGllSRSGGwtl~IlM:G.l'Ol!loi1NFVPTOVGPFAF.tm1ida

814 Ac.WVTHRLAGll.S(Q}SGGWRKNFVPIDVGPFAF·Bmida

0,47

815 Ac-WVTJ.4RLAGl.lS[QISGGWRK(Uo(lI"li'i'":>O'Do1NfVPTOVGPFAF. tmiá

0,46

52

839 Ac-WVTH(CitjLAGLVS[Cit]SGGVCRNNFVPTOVGPFAF-amida

840 AC_WVTH(Cit]LAGLVS[Cit]SGGVCMeO-PEG de 20kDaRN NFVPTDVGPFAF -amida

841 Ac-WVTH[Cit)LAGL[Nva]S[Cit]SGGVCRNNFVPTDVGPFAF. amida

Ac_WVTH[Cit]LAGL[Nva1S[CitJSGGVc'Meo-PEG de 2okDaRNNFVPTDVGPFAF_

amida .

843 Ac·WVTHOLAGLLSQSGGVCRNNFVPTDVGPFAF-amida

Ac.WVTHOLAGLLSQSGGVCMeO-PEG de 20kDakNNFVPTOVGPFAF_amida844.

845 Ac-WVTH(Cit)LAGLLS(Cit]SGGVCRNNFVPTOVGPFAF-amida

846 Ac_WVTHICitJLAGLLS(CiljSGGVCMeO-PEG de 20kDaRNNFVPTDVGPFAF-amida

847 Aa-WVTHRLAGllS[Cít]SGG VCRK.NFVPTOVGPFAF-amida

848 Ac-WVTHRLAGLASRSGGWRKNFVPTDVGPFAF-amida

.¡MeO-PEG de 20kDal . .

849 Ac-WVTHRLAGLASRSGGWRK NFVPTOVGPFAF-,am¡da

850 Ac-WVTHRLAGLAS[Cil]SGGWRKNFVPTDVGPFAF.amida 1,85

851 Ac_WVTHRLAGLAS[Cit]SGGWRKMeO-PEG de 20kDaNFVPTOVGPFAF_amida

227,78

852 Ac-WVTH[Cit]LAGLAS[Cit}SGGWRKNFVPTOVGPFAF-amida 23,31

853 Ac-WVTH[CitlLAGLAS[Cit]SGGWRKMeO-PEG de 20kDaNF"PT~VGPFAF.amida

>1000

854 Ac.WVTHRLAGLLSR[P]GGWRKNfVPTDVGPfAF. amida

1,27

855 Ac-WVTHRLAGLLSR(PIGGWR~eo-PEG de 2okDa~FVPTOVGPFAF.amida

17,96

Algunas realizaciones de la composición de materia de la invención también incluyen un vehículo farmacéuticamente aceptable conjugado con el péptido CGRP en un sitio en el péptido CGRP distinto de su residuo carboxilo terminal.

"Conjugado con vehículo" significa que el péptido CGRP y el vehículo se unen o acoplan covalentemente entre sí, o bien se unen directamente, o bien se unen indirectamente por medio de un resto ligador.

El término "vehículo" se refiere a una molécula que impide o mitiga la degradación in vivo, aumenta la semivida, reduce la toxicidad, reduce la inmunogenicidad y/o aumenta la actividad biológica de un péptido terapéutico. Según la invención, el vehículo es un vehículo farmacéuticamente aceptable. El vehículo debe seleccionarse de manera que el antagonista de péptido CGRP conjugado con vehículo logre un tamaño hidrodinámico suficiente como para impedir el aclaramiento mediante filtración renal in vivo. Por ejemplo, puede seleccionarse un vehículo que es una macromolécula polimérica, que es una cadena sustancialmente lineal, una ramificada o forma dendrítica. Alternativamente, puede seleccionarse un vehículo de manera que, in vivo, la composición de materia de la invención se unirá a una proteína plasmática para formar un complejo, de manera que el complejo así formado evita el aclaramiento renal sustancial.

Los vehículos a modo de ejemplo que pueden usarse, según la presente invención, incluyen un compuesto de polialquilenglicol, tal como un polietilenglicol o un polipropilenglicol. Otros compuestos de polialquilenglicol apropiados incluyen, pero no se limitan a, polímeros cargados o neutros de los siguientes tipos: dextrano, ácidos colomínicos u otros polímeros a base de hidratos de carbono, polímeros de aminoácidos y derivados de biotina.

Otros ejemplos del vehículo, según la invención, incluyen un copolímero de etilenglicol, un copolímero de propilenglicol, una carboximetilcelulosa, una polivinilpirrolidona, un poli-1,3-dioxolano, un poli-1,3,6-trioxano, un copolímero de etileno/anhídrido maleico, un poliaminoácido (por ejemplo, polilisina), una dextrano-n-vinilpirrolidona, una poli-n-vinilpirrolidona, un homopolímero de propilenglicol, un polímero de óxido de propileno, un polímero de óxido de etileno, un poliol polioxietilado, un poli(alcohol vinílico), una cadena glicosilada lineal o ramificada, un poliacetal, un ácido graso de cadena larga, un grupo alifático hidrófobo de cadena larga, un dominio Fe de inmunoglobulina (véase, por ejemplo, Feige et al., Modified peptides as therapeutic agents, patente estadounidense

n.o 6.660.843), una albúmina (por ejemplo, albúmina sé rica humana; véanse, por ejemplo, Rosen et al., Albumin fusion proteins, patente estadounidense n.o 6.926.898 y documento US 2005/0054051; Bridon et al., Protection of endogenous therapeutic peptides from peptidase activity through conjugation to blood components, documento US 6.887.470), una transtiretina (TTR; véanse, por ejemplo, Walker et al., Use of transthyretin peptide/protein fusions to increase the serum half-life of pharmacologically active peptides/proteins, documento US 2003/0195154 A 1 ; documento 2003/0191056 A 1) o una globulina de unión a tiroxina (TBG).

Otras realizaciones del vehículo, según la invención, incluyen ligandos peptídicos o ligandos de molécula pequeña (orgánicos) que tienen afinidad de unión por una proteína plasmática de semivida larga en condiciones fisiológicas de temperatura, pH y fuerza iónica. Los ejemplos incluyen un péptido de unión a albúmina o ligando de molécula pequeña, un péptido de unión a transtiretina o ligando de molécula pequeña, un péptido de unión a globulina de unión a tiroxina o ligando de molécula pequeña, un péptido de unión a anticuerpo o ligando de molécula pequeña, u otro péptido o molécula pequeña que tenga afinidad por una proteína plasmática de semivida larga. (Véanse, por ejemplo, Blaney et al., Method and compositions for increasing the serum half-life of pharmacologically active agents by binding to transthyretin-selective ligands, patente estadounidense n.o 5.714.142; Sato et al., Serum albumin binding moieties, documento US 2003/0069395 A1; Jones et al., Pharmaceutical active conjugates, patente estadounidense n.o 6.342.225). Una "proteína plasmática de semivida larga" es una de los cientos de diferentes proteínas disueltas en el plasma sanguíneo de mamíferos, incluyendo las denominadas "proteínas portadoras" (tales como albúmina, transferrina y haptoglobina), fibrinógeno y otros factores de coagulación sanguínea, componentes del complemento, inmunoglobulinas, inhibidores enzimáticos, precursores de sustancias tales como angiotensina y bradicinina y muchos otros tipos de proteínas. La invención abarca el uso de cualquier especie individual de vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como, pero sin limitarse a, los descritos en el presente documento, en conjugación con el péptido de unión al receptor de CGRP1, o el uso de una combinación de dos o más vehículos diferentes.

Según la presente descripción, que también se refiere a un método de producción de una composición de materia, se incluyen las siguientes etapas: se obtiene un péptido CGRP tal como se describe en el presente documento anteriormente; y el péptido obtenido se conjuga con un vehículo farmacéuticamente aceptable en un sitio en el péptido distinto de en el residuo de aminoácido carboxilo terminal.

Al conjugarse, el vehículo, tal como se describe en el presente documento, se une directamente de manera covalente a un residuo de aminoácido del propio péptido CGRP, u opcionalmente, a un ligador de peptidilo o distinto de peptidilo (incluyendo pero sin limitarse a ligadores aromáticos) que se une covalentemente a un residuo de aminoácido del péptido CGRP. Cualquier grupo "Iigador" es opcional. Cuando está presente, su estructura química no es crítica, puesto que sirve principalmente como espaciador, que puede ser útil en la optimización de la actividad farmacológica de algunas realizaciones de la composición de la invención. El ligador está constituido preferiblemente por aminoácidos unidos entre sí por enlaces peptídicos. El resto ligador, si está presente, puede ser independientemente igual o diferente de cualquier otro ligador, o ligadores, que puedan estar presentes en la composición de la invención.

Tal como se estableció anteriormente, el ligador, si está presente, puede ser de naturaleza peptidílica (es decir, constituido por aminoácidos unidos entre sí por enlaces peptídicos) y constituido en longitud, preferiblemente, por desde 1 hasta aproximadamente 40 residuos de aminoácido, más preferiblemente, de desde 1 hasta aproximadamente 20 residuos de aminoácido, y lo más preferiblemente de desde 1 hasta aproximadamente 9 residuos de aminoácido. Preferiblemente, pero no necesariamente, los residuos de aminoácido en el ligador son de entre los veinte aminoácidos canónicos, más preferiblemente, cisteína, glicina, alanina, prolina, arginina, asparagina, glutamina, serina y/o lisina. Incluso más preferiblemente, un ligador peptidílico está constituido por una mayoría de aminoácidos que no están estéricamente impedidos, tales como glicina y alanina unidos por un enlace peptídico. También es deseable que, si está presente, se seleccione un ligador peptidílico que evite el rápido recambio proteolítico en la circulación in vivo, y/o que incluya una o más copias de una región de unión a CGRP1. Algunos de estos aminoácidos pueden estar glicosilados, tal como entienden bien los expertos en la técnica. Por ejemplo, una secuencia de ligador útil que constituye un sitio de sialilación es X1X2N~XsG (SEO ID NO:1104), en la que X1, X2, ~ Y Xs son cada uno independientemente cualquier residuo de aminoácido.

En otras realizaciones, los de 1 a 40 aminoácidos se seleccionan de glicina, alanina, prolina, asparagina, glutamina, y lisina. Preferiblemente, un ligador está constituido por una mayoría de aminoácidos que no están estéricamente impedidos, tales como glicina y alanina. Por tanto, los ligadores preferidos incluyen poliglicinas, poli(Gly-Ala) y polialaninas. Algunos ligadores peptidílicos a modo de ejemplo son poli(GIY)1-a, particularmente (Gly)J, (GIY)4 (SEO ID NO:11 05), (Gly)s (SEO ID NO:56) y (Gly)¡ (SEO ID NO:57), así como poli(GIY)4Ser (SEO ID NO:67), poli(GlyAla)2-4 y poli(Ala)1-8. Otros ejemplos específicos de ligadores peptidílicos incluyen (GIY)sLyS (SEO ID NO:58) y (GIY)sLysArg (SEO ID NO:59). Otros ejemplos específicos de ligadores son:

(Gly)JLyS(GIY)4 (SEO ID NO:60); (GIY)3AsnGlySer(GIYh (SEO ID NO:61); (Gly)JCys(GIY)4 (SEO ID NO:62); y GlyProAsnGlyGly (SEO ID NO:63). Para explicar la nomenclatura anterior, por ejemplo, (Gly)JLyS(GIY)4 significa Gly-Gly-Gly-Lys-Gly-Gly-Gly-Gly (SEO

ID NO:60). También son útiles otras combinaciones de Gly y Ala. Otros ligadores preferidos son los identificados en el presente documento como "L5" (GGGGS; SEO ID NO:1106),

"L10" (GGGGSGGGGS; SEO ID NO:1107), "L25" GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS; SEO ID NO:1108) y cualquier ligador usado en los ejemplos de trabajo a continuación en el presente documento. En algunas realizaciones de las composiciones de esta invención, que comprenden un resto de ligador peptídico (L),

se colocan residuos ácidos, por ejemplo, residuos de glutamato o aspartato, en la secuencia de aminoácidos del resto de ligador (L). Los ejemplos incluyen las siguientes secuencias de ligador peptídico: GGEGGG (SEO ID NO:1109); GGEEEGGG (SEO ID NO:111 O); GEEEG (SEO ID NO:1111); GEEE (SEO ID NO:1112); GGOGGG (SEO ID NO:1113); GGOOOGG (SEO ID NO:1114); GOOOG (SEO ID NO:1115); GODO (SEO ID NO:1116); GGGGSOOSOEGSOGEOGGGGS (SEO ID NO:1117); WEWEW (SEO ID NO:1118); FEFEF (SEO ID NO:1119); EEEWWW (SEO ID NO:1120); EEEFFF (SEO ID NO:1121); WWEEEWW (SEO ID NO:1122); o

FFEEEFF (SEO ID NO:1123). En otras realizaciones, elligador constituye un sitio de fosforilación, por ejemplo, X1X2YX3X4G (SEO ID NO:1124), en la que X1, X2, X3 y X4 son cada uno independientemente cualquier residuo de aminoácido; X1X2SX3~G (SEO ID NO:1125), en la que X1, X2, X3 y ~ son cada uno independientemente cualquier residuo de aminoácido; o X1X2TX3X4 G (SEO ID NO:1126), en la que X1, X2, X3 y ~son cada uno independientemente cualquier residuo de aminoácido.

Los ligadores mostrados en el presente documento son a modo de ejemplo; los ligadores peptidílicos dentro del alcance de esta invención pueden ser mucho más largos y pueden incluir otros residuos. Un ligador peptidílico puede contener, por ejemplo, una cisteína N-terminal, otro tiol, o nucleófilo para la conjugación con un vehículo. En otra realización, el ligador contiene un residuo de cisteína u homocisteína N-terminal, u otro resto de 2-aminoetanotiol o 3-amino-propanotiol para la conjugación con vehículos funcionalizados con maleimida, yodoacetamida o tioéster. Otro ligador peptidílico útil es un ligador grande, flexible que comprende una secuencia de Gly/SerfThr al azar, por ejemplo: GSGSATGGSGSTASSGSGSATH (SEO ID NO:64) o HGSGSATGGSGSTASSGSGSAT (SEO ID NO:66), que se estima que tiene aproximadamente el tamaño de una molécula de PEG de 1 kOa. Alternativamente, un ligador peptidílico útil puede estar compuesto por secuencias de aminoácidos que se conocen en la técnica que forman estructuras helicoidales rígidas (por ejemplo, ligador rígido: -AEAAAKEAAAKEAAAKAGG-) (SEO ID NO:65).

Adicionalmente, un ligador peptidílico también puede comprender un segmento no peptidílico tal como una molécula alifática de 6 carbonos de fórmula -CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-. Los ligadores peptidílicos pueden alterarse para formar derivados tal como se describe en el presente documento.

Opcionalmente, ligadores no peptidílicos también son útiles para conjugar el vehículo con la parte de péptido del antagonista de péptido CGRP conjugado con vehículo. Por ejemplo, pueden usarse ligadores de alquilo tales como -NH-(CH2)s-C(O)-, en el que s = 2-20. Estos ligadores de alquilo pueden estar sustituidos además con cualquier grupo no esté ricamente impedido tal como alquilo inferior (por ejemplo, Cl -C6), acilo inferior, halógeno (por ejemplo, CI, Sr), CN, NH2, fenilo, etc. Ligadores no peptidílicos a modo de ejemplo son ligadores de PEG (por ejemplo, mostrados a continuación):

(l)

o

~"'N~O~O~~~

H

en los que n es tal que el ligador tiene un peso molecular de aproximadamente 100 a aproximadamente 5000 kilodaltons (kDa), preferiblemente de aproximadamente 100 a aproximadamente 500 kDa.

En una realización, el ligador no peptidílico es arilo. Los ligadores pueden alterarse para formar derivados de la misma manera que se describe en el presente documento. Además, pueden unirse restos de PEG a la amina N-terminal o ami nas de cadena lateral seleccionada mediante o bien alquilación reductora usando aldehídos de PEG o bien acilación usando ésteres de hidroxisuccinimido o carbonato de PEG, o mediante conjugación con tiol.

Las partes no peptídicas de la composición de materia de la invención, tales como ligadores no peptidílicos o vehículos no peptídicos, pueden sintetizarse mediante reacciones de química orgánica convencionales.

Lo anterior es meramente ilustrativo y no un tratamiento exhaustivo de las clases de ligadores que pueden emplearse opcionalmente según la presente invención.

En una realización útil de la composición de materia de la invención y/o el método de producción de un antagonista de péptido CGRP conjugado con vehículo, el péptido se conjuga con el vehículo mediante unión covalente a un residuo de aminoácido en la región de bisagra, tal como, en uno de los nueve residuos de aminoácido en las posiciones 19-27, en relación con la secuencia de aCGRP humana nativa. En algunas realizaciones útiles, el péptido se conjuga con el vehículo, más particularmente, en la posición de aminoácido 22, posición 23, posición 24, posición 25, posición 26 o posición 27, y preferiblemente, en la posición de aminoácido 23, posición 24 o posición 25, en relación con la secuencia de aCGRP humana nativa.

En otras realizaciones de la composición de materia de la invención y/o el método de producción de una composición de materia, el péptido CGRP se conjuga con el vehículo en un residuo de aminoácido en la primera o la segunda región de unión al receptor de CGRP1.

Todavía en otra realización útil de la composición de materia de la invención y/o el método de producción de una composición de materia, que implica un antagonista de péptido CGRP conjugado con vehículo de la invención, el péptido CGRP se conjuga en el residuo de aminoácido en el extremo amino terminal del péptido con el vehículo. (Véase, por ejemplo, Kinstler et al., N-terminally chemically modified protein compositions and methods, patentes estadounidenses n.05 5.985.265 y 5.824.784).

Se apreciará que, puesto que el vehículo empleado para la conjugación con el péptido CGRP puede ser multivalente (por ejemplo, bivalente, trivalente, tetravalente o una valencia de orden superior), en cuanto al número de residuos en los que puede conjugarse el vehículo, y/o la parte de péptido de la composición de materia de la invención puede ser multivalente (por ejemplo, bivalente, trivalente, tetravalente o una valencia de orden superior), es posible mediante el método de la invención de producción de una composición de materia producir una variedad de estructuras vehículo:péptido conjugadas. A modo de ejemplo, un vehículo univalente y un péptido univalente producirán un conjugado 1:1, un péptido bivalente y un vehículo bivalente pueden formar conjugados en los que los conjugados de péptido llevan dos restos de vehículo, mientras que un vehículo bivalente y un péptido univalente pueden producir especies en las que dos entidades peptídicas se unen a un único resto de vehículo; el uso de vehículos de valencia superior puede conducir a la formación de agrupaciones de entidades peptídicas unidas a un único resto de vehículo, mientras que péptidos de valencia superior pueden recubrirse con una pluralidad de restos de vehículo. A modo de ejemplo adicional, si el sitio de conjugación de un vehículo multivalente al péptido CGRP es una cisteína u otro aminotiol, pueden emplearse los métodos dados a conocer por D'Amico et al. (documento estadounidense con número de serie 60/646.685, Method of conjugating aminothiol containing molecules to watersoluble polimers).

Los restos de péptido pueden tener más de un grupo reactivo que reaccionará con el vehículo activado y debe considerarse siempre la posibilidad de formar estructuras complejas; cuando se desee formar estructuras sencillas tales como aductos 1:1 de vehículo y péptido, o usar vehículos bivalentes para formar aductos de péptido:vehículo:péptido, será beneficioso usar razones predeterminadas de material de péptido y vehículo activado, concentraciones predeterminadas de los mismos y realizar la reacción en condiciones predeterminadas (tales como duración, temperatura, pH, etc.) de modo que se forma una proporción del producto descrito y entonces separar el producto descrito de los otros productos de reacción. Las condiciones de reacción, proporciones y concentraciones de los reactivos pueden obtenerse mediante experimentos de ensayo y error relativamente sencillos que están dentro de la capacidad de un experto habitual en la técnica con aumento a escala apropiado según sea necesario. La purificación y separación de los productos se logra de manera similar mediante técnicas convencionales bien conocidas por los expertos en la técnica.

Adicionalmente, también se abarcan dentro de la presente invención sales fisiológicamente aceptables de los antagonistas de péptidos CGRP conjugados con vehículo o no conjugados de esta invención. Por "sales fisiológicamente aceptables" quiere decirse cualquiera de las sales que se sabe o se descubre posteriormente que son farmacéuticamente aceptables. Algunos ejemplos específicos son: sales de acetato, trifluoroacetato; hidrácidos halogenados, tales como clorhidrato y bromhidrato; sulfato; citrato; maleato; tartrato; glicolato; gluconato; succinato; mesilato; besilato; y oxalato.

Como ilustración, en algunas realizaciones de la composlclon de materia de la invención y/o el método de producción de una composición de materia, el vehículo es poli(etilenglicol) (PEG). La conjugación covalente de proteínas con poli(etilenglicol) (PEG) se ha reconocido ampliamente como un enfoque para extender

significativamente las semividas circulantes in vivo de proteínas terapéuticas. La pegilación logra su efecto

predominantemente retardando el aclaramiento renal, puesto que el resto de PEG añade un radio hidrodinámico considerable a la proteína. (Zalipsky, S., et al., Use of functionalized poly(ethylene glycol)s for modification of polipeptides., in poly(ethylene glycol) chemistry: Biotechnical and biomedical applications., J.M. Harris, Ed., Plenum Press: Nueva York., 347-370 (1992)). Los beneficios adicionales conferidos a menudo por la pegilación de proteínas incluyen aumento de la solubilidad, resistencia a la degradación proteolítica y reducción de la inmunogenicidad del polipéptido terapéutico. Los méritos de la pegilación de proteína se demuestran por comercialización de varias proteínas pegiladas incluyendo PEG-adenosina desaminasa (Adagen™/Enzon Corp.), PEG-L-asparaginasa (Oncaspar™/Enzon Corp.), PEG-interferón a-2b (PEG-lntron™/Schering/Enzon), PEG-interferón a-2a (PEGASYSTM/Roche) y PEG-G-CSF (Neulasta™/Amgen) así como muchas otras en ensayos clínicos.

Por "péptido pegilado" quiere decirse un péptido que tiene un resto de polietilenglicol (PEG) unido covalentemente a un residuo de aminoácido del propio péptido o a un ligador peptidílico o no peptidílico (incluyendo pero sin limitarse a ligadores aromáticos) que está unido covalentemente a un residuo del péptido.

Por "polietilenglicol" o "PEG" quiere decirse un compuesto de polialquilenglicol o un derivado del mismo, con o sin agentes de acoplamiento o derivatización con restos de activación o acoplamiento (por ejemplo, con aldehído, hidroxisuccinimidilo, hidrazida, tiol, triflato, tresilato, azirdina, oxirano, disulfuro de ortopiridilo, vinilsulfona, yodoacetamida o un resto de maleimida). Según la presente invención, el PEG útil incluye PEG de cadena lineal, sustancialmente lineal, PEG ramificado o PEG dendrítico. (Véanse, por ejemplo, Merrill, patente estadounidense n.o 5.171.264; Harris et al., Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces, patente estadounidense n.o 5.932.462; Shen, N-maleimidyl polymer derivatives, patente estadounidense n.o 6.602.498).

PEG es un polímero soluble en agua, bien conocido que está disponible comercialmente o puede prepararse mediante polimerización por apertura de anillo de etilenglicol según métodos bien conocidos en la técnica (Sandler y Karo, Polymer Synthesis, Academic Press, Nueva York, vol. 3, páginas 138-161). En la presente solicitud, el término "PEG" se usa de manera amplia para abarcar cualquier molécula de polietilenglicol, en forma mono, bi o polifuncional, independientemente del tamaño o de la modificación en un extremo del PEG, y puede representarse mediante la fórmula:

X-O(CH2CH20)n-1CH2CH20H, (11)

en la que n es de 20 a 2300 y X es H o una modificación terminal, por ejemplo, un alquilo CH.

En algunas realizaciones útiles, un PEG usado en la invención termina en un extremo con hidroxilo o metoxilo, es decir, X es H o CH3 ("metoxi-PEG"). Se indica que el otro extremo del PEG, que se muestra en la fórmula (11) que termina en OH, se une covalentemente a un resto de activación mediante un enlace éter-oxígeno, un enlace amina o un enlace amida. Cuando se usa en una estructura química, el término "PEG" incluye la fórmula (11) anterior sin el hidrógeno del grupo hidroxilo mostrado, dejando al oxígeno disponible para reaccionar con un átomo de carbono libre de un ligador para formar un enlace éter. Más específicamente, con el fin de conjugar PEG con un péptido, el péptido debe hacerse reaccionar con PEG en una forma "activada". Puede representarse PEG activado mediante la fórmula:

(PEG)-(A) (111)

en la que PEG (definido anteriormente) se une covalentemente a un átomo de carbono del resto de activación (A) para formar un enlace éter, un enlace amina o enlace amida, y (A) contiene un grupo reactivo que puede reaccionar con un grupo amino, imino o tiol en un residuo de aminoácido de un péptido o un resto de ligador unido covalentemente al péptido.

Se conocen bien en la técnica técnicas para la preparación de PEG activado y su conjugación con péptidos

os

biológicamente activos. (Por ejemplo, véanse las patentes estadounidenses n.5.643.575, 5.919.455, 5.932.462 Y 5.990.237; Thompson et al, PEGylation of polipeptides, documento EP 0575545 B1; Petit, Site specific protein

os

modification, patentes estadounidenses n.6.451.986 y 6.548.644; S. Herman et al., Poly(ethylene glycol) with reactive endgroups: 1. Modification of proteins, J. Bioactive Compatible Polimers, 10: 145-187 (1995); Y. Lu et al., Pegylated peptides 111: Solid-phase synthesis with PEGylating reagents of varying molecular weight: synthesis of multiply PEGylated peptides, Reactive Polimers, 22:221-229 (1994); A.M. Felix et al., PEGylated Peptides IV: Enhanced biological activity of site-directed PEGylated GRF analogs, Int. J. Peptide Protein Res., 46:253-264 (1995);

A.M. Felix, Site-specific poly(ethylene glycol)ylation of peptides, ACS Symposium Series 680(poly(ethylene glycol)): 218-238 (1997); Y. Ikeda et al., Polyethylene glicol derivatives, their modified peptides, methods for producing them and use of the modified peptides, documento EP 0473084 B1; G.E. Means et al., Selected techniques for the

modification of protein side chains, en: Chemical modification of proteins, Halden Day, Inc., 219 (1971)).

Puede sintetizarse químicamente PEG activado, tal como PEG-aldehídos o hidratos de PEG-aldehído, mediante medios conocidos u obtenerse de fuentes comerciales, por ejemplo, Shearwater Polymers, (Huntsville, Al) o Enzon, Inc. (Piscataway, N.J.).

Un ejemplo de un PEG activado útil para fines de la presente invención es un compuesto de PEG-aldehído (por ejemplo, un metoxi-PEG-aldehído), tal como PEG-propionaldehído, que está disponible comercialmente de Shearwater Polimers (Huntsville, Al). Se representa PEG-propionaldehído mediante la fórmula PEG-CH2CH2CHO. (Véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.o 5.252.714). También se incluyen dentro del significado de "compuesto de PEG-aldehído" hidratos de PEG-aldehído, por ejemplo, hidrato de PEG-acetaldehído e hidrato de PEG-bis-aldehído, que produce posteriormente una estructura activada bifuncionalmente. (Véase, por ejemplo, Bentley et al., Poly(ethylene glycol) aldehyde hydrates and related polimers and applications in modifying amines, patente estadounidense n.o 5.990.237) (Véase, por ejemplo, Bentley et al., Poly(ethylene glycol) aldehyde hydrates and related polimers and applications in modifying amines, patente estadounidense n.o 5.990.237). Puede usarse un compuesto de PEG-aldehído multirramificado activado (derivados de PEG que comprenden múltiples brazos para dar constructos divalentes, trivalentes, tetravalentes, octavalentes). Usando un derivado de PEG de 4 brazos, se unen cuatro (4) péptidos CGRP a cada molécula de PEG. Por ejemplo, según la presente invención, el péptido CGRP puede conjugarse con un polietilenglicol (PEG) en 1,2, 3 ó 4 sitios funcionalizados con amino del PEG.

Al conjugarse, el polietilenglicol (PEG), tal como se describe en el presente documento, se une covalentemente mediante aminación reductora directamente a al menos un resto de amina libre expuesto al disolvente de un residuo de aminoácido del propio péptido CGRP. En algunas realizaciones del método de la invención, el péptido CGRP se conjuga con un PEG en una o más aminas primarias o secundarias en el péptido CGRP, o con dos grupos PEG en un único sitio de amina primaria en el péptido CGRP (por ejemplo, esto puede producirse cuando la reacción de aminación reductora implica la presencia de compuesto de PEG-aldehído en exceso). Se ha observado que cuando la pegilación mediante aminación reductora es en una amina primaria en el péptido, no es poco común tener cantidades (intervalo del 1 al 100%) de producto de reacción que tiene dos o más PEG presentes por molécula, y si el producto de pegilación deseado es uno con sólo un PEG por molécula, entonces esta "sobrepegilación" puede no desearse. Cuando se desea un producto pegilado con un único PEG por molécula de producto de pegilación, puede emplearse una realización del método de la invención que implica pegilación usando aminas secundarias del péptido farmacológicamente activo, debido a que se transferirá sólo un grupo de PEG por molécula en la reacción de aminación reductora.

Los residuos de aminoácido que pueden proporcionar un resto de amina primaria incluyen residuos de lisina, homolisina, ornitina, ácido a,~-diaminopropiónico (Oap), ácido a,~-diaminopropiónico (Opr) y ácido a;ydiaminobutírico (Oab), ácido aminobutírico (Abu) y ácido a-amino-isobutírico (Aib). Los residuos de aminoácido que pueden proporcionar un resto de amina secundaria incluyen E-N-alquil-lisina, a-N-alquil-lisina, 8-N-alquilornitina, a-Nalquilornitina o una prolina N-terminal, en los que el alquilo es de C, a C6.

Según el método de producción de una composición de materia, la inclusión de un codisolvente de alcohol en una disolución tampón puede mejorar la eficacia de conjugación de péptidos CGRP con compuestos de PEG-aldehído mediante aminación reductora, tal como se ilustra adicionalmente en el ejemplo 8 en el presente documento a continuación. La disolución tampón para la reacción de pegilación comprende un "codisolvente de alcohol", término que abarca un disolvente de alcohol, en realizaciones en las que la concentración (v/v) del alcohol es del 100% tal como se describe a continuación. Sin embargo, en muchas realizaciones, la concentración (v/v) del codisolvente de

alcohol en un medio acuoso es de aproximadamente el 30% a aproximadamente el 99%, o de aproximadamente el 30% a aproximadamente el 90%, o de aproximadamente el 30% a aproximadamente el 80%, o de aproximadamente el 30% a aproximadamente el 70%, siendo un intervalo de concentración preferido de aproximadamente el 50% a aproximadamente el 70%. El experto en la técnica entenderá cómo optimizar la concentración de alcohol para la reacción de aminación reductora de una especie particular de péptido CGRP con una especie particular de compuesto de PEG-aldehído. A modo de ejemplo, para algunos péptidos CGRP pequeños (por ejemplo, de aproximadamente 10 -20 residuos de aminoácido de longitud), es adecuada una concentración de alcohol (por ejemplo, TFE) del 100% (v/v).

Pueden prepararse disoluciones tampón acuosas útiles para la reacción de aminación reductora con cualquiera de los tampones conocidos en la técnica bioquímica que proporcionan tamponamiento desde aproximadamente pH 4 hasta aproximadamente pH 9, prefiriéndose de aproximadamente pH 5 a aproximadamente pH 7. Estos tampones pueden incluir, pero sin limitarse a, tampones acetato, citrato, ácido 2-(N-morfolino)-etanosulfónico (MES), fosfato, N,N-bis(2-hidrosietil)glicina (bicina) o borato. Las concentraciones de tampón útiles pueden oscilar entre 5 mM y 100 mM prefiriéndose 10-50 mM. No son adecuados tampones que contienen un grupo amino libre, tales como TRIS.

Los alcoholes que deben acelerar la aminación reductora de PEG-aldehídos con péptidos que contienen amina incluyen 2,2,2-trifluoroetanol (TFE), 1,1,1 ,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HF-i-PA) y 2-trifluorometil-1, 1,1,3,3,3hexafluoro-2-propanol (HF-t-BuOH), aunque, en principio, cualquier codisolvente de alcohol basado en las fórmulas estructurales IV, V YVI (a continuación) podría aumentar la eficacia de pegilación durante la aminación reductora. El codisolvente de alcohol comprende una estructura seleccionada de las fórmulas estructurales IV, V YVI:

IV VI

en las que Rl es independientemente CFnR42.n, n = de 1 a 3; en las que la fórmula VI comprende al menos siete átomos de carbono;

R4

es un resto alquilo lineal o ramificado (Cl a C4), un resto alquilo cíclico (C3 a C6) o un resto arilo o heteroarilo;

R2y R3 son independientemente H o RlH;

A es (CY2)0, en el que o es igual a de 1 a 4, o (CY2-X-CY2), en el que X es O o NR5 e Y es independientemente H o F;

R5 es independientemente H o un alquilo lineal o ramificado (Cl a C4);

yen las que Bes C(R5) o N.

(B puede formar una estructura bicíclica estable tal como biciclo[2.2.2]octano o similares). En algunas realizaciones, si X es O, Y es independientemente H o F; y si X es NR5, Y es H.

En general, la eficacia de pegilación de secuencias de péptidos CGRP se beneficia de alcoholes más hidrófobos tales como HF-i-PA o HP-t-BuOH. Aunque este aspecto de la presente invención no depende de ningún mecanismo de funcionamiento particular, se cree que esta observación se relaciona con el aumento de la solubilidad de residuos de cadena lateral alifática en disolventes alifáticos. En este contexto, el orden de clasificación del carácter alifático es HP-t-BuOH > HF-i-PA > TFE. La potenciación de la eficacia proporcionada por ~-fluoroalcoholes sería la más ventajosa para reacciones de aminación reductora. Esto se relaciona hipotéticamente con el fuerte carácter de uniones por puentes de hidrógeno asociado con ~-fluoroalcoholes tales como TFE por dos motivos. El primero de ellos es la capacidad para disolver la estructura de las poli amidas solvatando el oxígeno de amida. En segundo lugar, la fuerte capacidad de unión por puentes de H proporcionada por el ~-fluoroalcohol debe facilitar la formación de imina entre PEG-aldehído y una amina presente en el péptido de la misma manera que lo hace el ácido. La formación de imina es una etapa requerida en el proceso de aminación reductora, y a menudo es limitante de la velocidad. La capacidad del ~-fluoroalcohol para acelerar esta etapa es por tanto una ventaja particular.

Otro PEG activado útil para generar los péptidos conjugados con PEG de la presente invención es un compuesto de PEG-maleimida, tal como, pero sin limitarse a, una metoxi-PEG-maleimida, de manera que maleimido-monometoxi-PEG son particularmente útiles para generar los péptidos conjugados con PEG de la invención. (Por ejemplo, Shen, N-maleimidyl polymer derivatives, patente estadounidense n.o 6.602.498; C. Delgado et al., The uses and properties of PEG-linked proteins., Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems, 9:249-304 (1992); S. Zalipsky et al., Use of functionalized poly(ethylene glycol)s for modification of polypeptides, en: Poly(ethylene glycol) chemistry: Biotechnical and biomedical applications (J.M. Harris, Editor, Plenum Press: Nueva York, 347-370 (1992); S. Herman et al., Poly(ethylene glycol) with reactive endgroups: 1. Modification of proteins, J. Bioactive Compatible Polimers, 10: 145-187 (1995); PJ. Shadle et al., Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1, patente estadounidense n.o 4.847.325; G. Shaw et al., Cysteine added variants IL-3 and chemical modifications thereof, patente estadounidense

n.o 5.166.322 y documento EP 0469074 B1; G. Shaw et al., Cysteine added variants of EPO and chemical modifications thereof, documento EP 0668353 A 1; G. Shaw et al., Cysteine added variants G-CSF and chemical modifications thereof, documento EP 0668354 A 1; N.V. Katre et al., Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof, patente estadounidense n.o 5.206.344; R.J. Goodson y NV Katre, Site-directed pegylation of recombinant interleukin-2 at its glycosylate site, Biotechnology, 8:343-346 (1990)).

Una vinilsulfona de poli(etilenglicol) es otro PEG activado útil para generar los péptidos conjugados con PEG de la presente invención mediante conjugación en residuos de aminoácido tiolados, por ejemplo, en residuos de C. (Por ejemplo, M. Morpurgo et al., Preparation and characterization of poly(ethylene glycol) vinyl sulfone, Bioconj. Chem., 7:363-368 (1996); véanse también Harris, Functionalization of polyethylene glicol for formation of active sulfoneterminated PEG derivatives for binding to proteins and biologically compatible materials, patentes estadounidenses n.os 5.446.090; 5.739.208; 5.900.461; 6.610.281 Y6.894.025; YHarris, Water soluble active sulfones of poly(ethylene glycol), documento WO 95/13312 A 1).

Otra forma activada de PEG que es útil según la presente invención es un compuesto de éster de PEG-Nhidroxisuccinimida, por ejemplo, éster metoxi-PEG-N-hidroxisuccinimidílico (NHS).

También son útiles formas activadas de manera heterobifuncional de PEG. (Véase, por ejemplo, Thompson et al., PEGylation reagents and biologically active compounds formed therewith, patente estadounidense n.o 6.552.170).

Todavía en otras realizaciones del método de producción de una composición de materia, el péptido CGRP se hace reaccionar mediante técnicas químicas conocidas con un compuesto de PEG activado, tal como pero sin limitarse a, un compuesto de PEG activado con tiol, un compuesto de PEG activado con diol, un compuesto de PEG-hidrazida, un compuesto de PEG-oxiamina o un compuesto de PEG-bromoacetilo. (Véanse, por ejemplo, S. Herman, Poly(ethylene glycol) with Reactive Endgroups: 1. Modification of Proteins, J. Bioactive and Compatible Polimers, 10: 145-187 (1995); S. Zalipsky, Chemistry of Polyethylene glycol Conjugates with Biologically Active Molecules, Advanced Drug Delivery Reviews, 16: 157-182 (1995); R. Greenwald et al., Poly(ethylene glycol) conjugated drugs and prodrugs: a comprehensive review, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 17:101-161 (2000)).

Puede usarse cualquier masa molecular para un PEG según se desee de manera práctica, por ejemplo, de desde aproximadamente 1.000 dalton (Da) hasta 100.000 Da (n es de 20 a 2300). El número de unidades de repetición Un" en el PEG es aproximado para la masa molecular descrita en dalton. Se prefiere que la masa molecular combinada de PEG en un ligador activado sea adecuada para su uso farmacéutico. Por tanto, la masa molecular combinada de la molécula de PEG no debe superar aproximadamente 100.000 Da.

Todavía en otras realizaciones del método de producción de una composición de materia, el péptido CGRP se hace reaccionar mediante técnicas químicas conocidas con un compuesto de PEG multirramificado activado (derivados de PEG que comprenden múltiples brazos para dar constructos divalentes, trivalentes, tetravalentes, octavalentes), tal como pero sin limitarse a, pentaeritritol tetra-polietilenglicol éter. Funcionalización y derivados activados, tales como, pero sin limitarse a, N-succinimidiloxicarbonil)propilo, p-nitrofeniloxicarbonilo, (-C02-P-C6H4N02), 3-(Nmaleimido)propanamido, 2-sulfaniletilo y 3-aminopropilo. Usando un derivado de PEG de cuatro brazos, se unen cuatro antagonistas de péptidos CGRP a cada molécula de PEG. Por ejemplo, según la presente invención, el péptido CGRP puede conjugarse con un polietilenglicol (PEG) en:

(a)

1, 2, 3 ó 4 sitios funcional izados con amino del PEG;

(b)

1,2,3 ó 4 sitios funcional izados con tiol del PEG;

(c)

1, 2, 3 ó 4 sitios funcionalizados con maleimido del PEG;

(d)

1, 2, 3 ó 4 sitios funcionalizados con N-succinimidilo del PEG;

(e)

1,2,3 ó 4 sitios funcionalizados con carboxilo del PEG; o

(f)

1, 2, 3 ó 4 sitios funcional izados con p-nitrofeniloxicarbonilo del PEG.

Preferiblemente, la masa molecular total o combinada del PEG usado en un péptido conjugado con PEG de la presente invención es de desde aproximadamente 3.000 Da hasta 60.000 Da (n total es de desde 70 hasta 1.400), más preferiblemente desde aproximadamente 10.000 Da hasta 40.000 Da (n total es de aproximadamente 230 a aproximadamente 910). La masa combinada más preferida para PEG es de desde aproximadamente 20.000 Da hasta 30.000 Da (n total es de aproximadamente 450 a aproximadamente 680).

También se proporciona el uso de la composición de materia de la invención y las composiciones farmacéuticas que las contienen, por ejemplo, en los métodos de la invención de tratamiento de la migraña, y de prevención o mitigación de la migraña. Los usos de la invención son beneficiosos en el alivio y/o la mitigación de síntomas de la migraña. "Aliviado" significa que se reduce, aligera, disminuye, suaviza, mitiga (es decir, se hace más leve o suave), amaina, calma, aplaca, relaja, anula o disipa, independientemente de si el dolor o síntoma de la migraña se borra, erradica, elimina o previene totalmente en un paciente particular.

Si se desea, la eficacia terapéutica o profiláctica de los antagonistas de péptidos CGRP puede someterse a prueba de manera preclínica, antes de su uso clínico en seres humanos, usando cualquier modelo animal apropiado conocido por los expertos en la técnica relacionado con un estado de interés particular. (Véase, por ejemplo, Wang y Wang, Animal and cellular models of chronic pain, Advanced Drug Delivery Reviews 55:949-965 (2003)). Puede seleccionarse un modelo animal apropiado para la migraña de numerosos métodos, tal como se describe, por ejemplo, en Bergerot et al., Review Article: Animal models of migraine: looking at the component parts of a complex disorder, European Journal of Neuroscience 24:1517-1534 (2006); y Akerman, S y Goadsby PJ, The role of dopamine in a model of trigeminovascular nociception, Pharmacol. Exp. Ther. 314(1): 162-169 (2005).

La presente invención se refiere al tratamiento de la migraña, y también se describe la prevención o mitigación de la migraña. El uso de la composición de materia de la invención en un método de tratamiento de la migraña incluye administrar a un paciente que necesita tal tratamiento una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición de materia de la invención, de manera que se alivien uno o más síntomas de la migraña en el paciente. El uso de la composición de materia de la invención en un método de prevención o mitigación de la migraña incluye administrar a un paciente que ha experimentado previamente una migraña una cantidad profilácticamente eficaz de la composición de materia de la invención de manera que se previene o mitiga al menos un síntoma de una migraña posterior. El al menos un síntoma es un síntoma de migraña experimentado previamente por el paciente con migraña en un ataque de migraña previo.

Según estos usos de la invención, un paciente que necesita tratamiento para la migraña, o un paciente que ha experimentado previamente una migraña, pueden reconocerse bien y/o diagnosticarse por el profesional sanitario experto, tal como un médico, familiarizado con la migraña y sus síntomas.

Hay varios tipos de migraña, cada uno con síntomas o características únicas bien conocidas por los expertos en la técnica, pero la presente invención no se limita a ningún tipo y puede ser útil en el tratamiento, el alivio y la prevención o mitigación de síntomas de cualquier tipo de migraña. La migraña clásica y la migraña común son las dos variedades principales. La migraña común (Sin aura) es el tipo más frecuente, representando aproximadamente el 80-85% de las migrañas. A diferencia de otras cefaleas, las migrañas se producen habitualmente en un lado de la cabeza, aunque el lado que se ve afectado puede cambiar con cada nuevo ataque. Las migrañas también van acompañadas a menudo por síntomas de sensibilidad anómala a la luz y/o el sonido. Los síntomas de dolor de una cefalea por migraña se describen a menudo como una sensación vibrante o de martilleo en la frente/sien, oído/mandíbula o alrededor de los ojos. Aunque el dolor por migraña aparece normalmente en un lado de la cabeza, el 30 -40% de las migrañas se producen en ambos lados. Normalmente, un ataque de migraña dura aproximadamente de 4 a 72 horas. Los síntomas de la migraña también pueden incluir dificultad en el habla, náuseas, vómitos, confusión, debilidad de un brazo o una pierna y hormigueo de la cara o las manos.

La diferencia básica entre los tipos clásico y común de la migraña es la aparición de un "aura". El aura es la incidencia de síntomas neurológicos 10 -30 minutos antes del ataque de migraña clásico. Durante el aura de la migraña, el paciente con migraña puede ver luces centelleantes o brillantes, líneas en zigzag, formas geométricas o puede perder temporalmente la visión (por ejemplo, hemianopsia), o experimentar puntos ciegos denominados escotomas, experimentar alteraciones en el habla, o experimentar otros fenómenos sensoriales, tales como alucinaciones gustativas y/o olfativas. Otros síntomas del aura de la migraña pueden incluir entumecimiento, hormigueo, dificultades en el habla y debilidad muscular en un lado del cuerpo.

Otro tipo de migraña es la migraña basilar, que va acompañada de síntomas transitorios en el tronco encefálico que se cree que se deben a un estrechamiento vasoespástico de la arteria basilar. En la migraña de tipo basilar, el paciente con migraña cumple los criterios generales para una migraña con aura y tiene dos o más de los siguientes síntomas: disartria, vértigo, acúfenos, hipoacusia, visión doble (diplodia), síntomas visuales bilaterales, ataxia, entumecimiento peribucal, reducción del nivel de conciencia y/o parestesias simultáneamente bilaterales.

Los síntomas de la migraña descritos anteriormente son meramente ilustrativos y no pretenden ser una descripción exhaustiva de todos los posibles síntomas de la migraña que experimenta un paciente individual o varios pacientes de migraña en conjunto, y a los que se refiere la presente invención. Los expertos en la técnica son conscientes de otros diversos síntomas de la migraña y conjuntos de síntomas de la migraña padecidos por pacientes individuales, y a esos síntomas de la migraña también se refieren los presentes usos de la invención en el tratamiento de la migraña, o la prevención o mitigación de la migraña.

La cantidad terapéuticamente eficaz, la cantidad profilácticamente eficaz y el régimen de dosificación implicados en los usos de la invención en el tratamiento del dolor crónico o la migraña, o de prevención o mitigación de la migraña, los determinará el médico encargado, considerando diversos factores que modifican la acción de los agentes terapéuticos, tales como la edad, el estado, el peso corporal, el sexo y la dieta del paciente, la gravedad del estado que está tratándose, el tiempo de administración y otros factores clínicos. Generalmente, el régimen o la cantidad diaria debe estar en el intervalo de aproximadamente 1 a aproximadamente 10.000 microgramos (¡..tg) del péptido CGRP por kilogramo (kg) de masa corporal, preferiblemente de aproximadamente 1 a aproximadamente 5000 ¡..tg por kilogramo de masa corporal, y lo más preferiblemente de aproximadamente 1 a aproximadamente 1000 ¡..tg por kilogramo de masa corporal.

Por consiguiente, la presente invención se refiere también al uso de uno o más de las composiciones de materia de la invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la migraña. Se describe también la prevención de la migraña.

Tales composiciones farmacéuticas pueden configurarse para su administración a un paciente mediante una amplia variedad de vías de administración, por ejemplo, una vía de administración intravenosa tal como mediante inyección

o infusión, vías de administración subcutánea, intramuscular, intraperitoneal, epidural o intratecal, o por vías de administración oral, enteral, pulmonar (por ejemplo, inhalante), intranasal, transmucosa (por ejemplo, administración sublingual), transdérmica u otras y/o formas de administración conocidas en la técnica. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden prepararse en forma líquida, o pueden estar en forma de polvo secado, tal como forma liofilizada. Para uso oral o enteral, las composiciones farmacéuticas pueden configurarse, por ejemplo, como comprimidos, trociscos, pastillas para chupar, suspensiones acuosas u oleosas, polvos o gránulos dispersables, emulsiones, cápsulas duras o blandas, jarabes, elixires o fórmulas enterales.

En general, la invención abarca composiciones farmacéuticas que comprenden cantidades terapéuticamente eficaces de antagonista de péptido CGRP de la invención conjugado con vehículo o no conjugado (en cantidades eficaces para prevenir, aliviar, mitigar, mejorar o suprimir el dolor crónico, por ejemplo, la migraña, o cualquiera de las otras causas médicas, trastornos o estados considerados en el presente documento) junto con uno o más portador(es) farmacéuticamente aceptable(s). En la práctica de esta invención, el "portador farmacéuticamente aceptable" es cualquier substancia tolerada fisiológicamente conocida por el experto habitual en la técnica útil en la formulación de composiciones farmacéuticas, incluyendo, cualquier diluyente, excipiente, dispersante, aglutinante, relleno, deslizante, agente anti-fricción, adyuvante de compresión, agente de disgregación de comprimidos (disgregante), agente de suspensión, lubricante, aromatizante, odorizante, edulcorante, potenciador de la permeación o penetración, conservante, surfactante, solubilizante, emulsionante, espesante, adyuvante, colorante, recubrimiento, material de encapsulación farmacéuticamente aceptable y/u otros aditivos individualmente o en combinación.

Por ejemplo, pueden usarse aglutinantes para mantener juntos los componentes de la composición farmacéutica para formar un comprimido duro, e incluyen materiales de productos naturales tales como goma arábiga, tragacanto, almidón y gelatina. Otros incluyen metilcelulosa (MC), etilcelulosa (EC) y carboximetilcelulosa (CMC). Podrían usarse tanto polivinilpirrolidona (PVP) como hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC) en disoluciones alcohólicas para granular el agente terapéutico.

Pueden incluirse disgregantes en la formulación de la composición farmacéutica para dar una forma farmacéutica sólida. Los materiales usados como disgregantes incluyen, pero no se limitan a, almidón, incluyendo el disgregante disponible comercialmente a base de almidón, Explotab. También pueden usarse glicolato sódico de almidón, amberlita, carboximetilcelulosa de sodio, ultraamilopectina, alginato de sodio, gelatina, piel de naranja, carboximetilcelulosa ácida, esponja natural y bentonita. Otra forma útil de los disgregantes son las resinas de intercambio catiónico insolubles. Pueden usarse gomas en polvo como disgregantes y como aglutinantes, y éstas pueden incluir gomas en polvo tales como agar-agar, goma karaya o tragacanto. También son útiles como disgregantes ácido algínico y su sal de sodio.

En la formulación de algunas realizaciones de la composición farmacéutica puede incluirse un agente anti-fricción para prevenir la adherencia durante el procedimiento de formulación.

Pueden usarse lubricantes como una capa entre la composición farmacéutica y la pared del troquel en la preparación de la formulación moldeada (por ejemplo, un comprimido o comprimido oblongo), y éstos pueden incluir, pero sin limitarse a: ácido esteárico, incluyendo sus sales de magnesio y calcio, politetrafluoroetileno (PTFE), parafina líquida, aceites vegetales y ceras. Pueden usarse también lubricantes solubles, tales como laurilsulfato de sodio, laurilsulfato de magnesio, polietilenglicol de diversos pesos moleculares, Carbowax 4000 y 6000.

Pueden incluirse deslizantes para mejorar las propiedades de flujo de los antagonistas de péptidos CGRP conjugados con vehículo o no conjugados y/o composiciones farmacéuticas durante la formulación y para ayudar a la reorganización durante la compresión. Los deslizantes útiles incluyen almidón, talco, sílice pirogénica y silicoaluminato hidratado.

Para ayudar a la disolución de las composiciones de materia y/o composiciones farmacéuticas de la presente invención en un entorno acuoso, puede incluirse un surfactante como agente humectante. Los surfactantes pueden incluir detergentes aniónicos tales como laurilsulfato de sodio, dioctil-sulfosuccinato de sodio y dioctil-sulfonato de sodio. Podrían usarse detergentes catiónicos y pueden incluir cloruro de benzalconio o cloruro de bencetonio. La lista de posibles detergentes no iónicos que pueden incluirse en la formulación como surfactantes son lauromacrogol 400, estearato de polioxilo 40, aceite de ricino hidrogenado de polioxietileno 10, 50 y/o 60, monoestearato de glicerol, polisorbato 40, 60, 65 y/u SO, ésteres de ácidos grasos de sacarosa, metilcelulosa y/o carboximetilcelulosa. Estos surfactantes pueden estar presentes en la formulación de las composiciones farmacéuticas que contienen antagonistas de péptidos CGRP conjugados con vehículo o no conjugados, o bien individualmente o bien como una mezcla de surfactantes en diferente razones.

Pueden incluirse también algunos otros aditivos en la formulación de la composición farmacéutica para potenciar la captación de los antagonistas de péptidos CGRP conjugados con vehículo o no conjugados. Aditivos que tienen potencialmente esta propiedad son, por ejemplo, los ácidos grasos ácido oleico, ácido linoleico y ácido linolénico.

En una realización, el portador farmacéuticamente aceptable puede ser un líquido y la composición farmacéutica se prepara en forma de una disolución, suspensión, emulsión, jarabe, elixir o composición presurizada. El/los principio(s) activo(s) (por ejemplo, la composición de materia de la invención) puede(n) disolverse, diluirse o suspenderse en un portador líquido farmacéuticamente aceptable tal como agua, un disolvente orgánico, una mezcla de ambos, o aceites o grasas farmacéuticamente aceptables. El portador líquido puede contener otros aditivos farmacéuticos adecuados tales como detergentes y/o solubilizantes (por ejemplo, Tween SO, polisorbato SO), emulsionantes, tampones a pH apropiado (por ejemplo, Tris-HCI, acetato, fosfato), adyuvantes, antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico, metabisulfito de sodio), conservantes (por ejemplo, timerosal, alcohol bencílico), edulcorantes, agentes aromatizantes, agentes de suspensión, agentes espesantes, substancias de relleno (por ejemplo, lactosa, manitol), colores, reguladores de la viscosidad, estabilizantes, electrolitos, osmolitos u osmorreguladores.

Los ejemplos adecuados de portadores líquidos farmacéuticamente aceptables para administración oral y enteral de la composición farmacéutica incluyen agua (que contiene parcialmente aditivos tales como los indicados anteriormente, por ejemplo derivados de celulosa, preferiblemente disolución de carboximetilcelulosa de sodio), alcoholes (incluyendo alcoholes monohidroxilados y alcoholes polihidroxilados, por ejemplo glicoles) y sus derivados, y aceites (por ejemplo aceite fraccionado de coco y aceite de maní). Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden administrarse a un paciente por vía oral o por vía enteral en forma de una disolución o suspensión estéril que contiene otros solutos o agentes de suspensión (por ejemplo, suficiente solución salina o glucosa para hacer que la disolución sea isotónica), sales biliares, goma arábiga, gelatina, monoleato de sOrbitano, polisorbato SO (ésteres de oleato de sorbitol y sus anhídridos copolimerizados con óxido de etileno) y similares. Para administración enteral, el portador puede incluir también un éster oleoso tal como oleato de etilo y miristato de isopropilo.

El portador farmacéuticamente aceptable para composiciones presurizadas, tales como una composición configurada como un inhalante, puede ser un hidrocarburo halogenado u otro propelente en aerosol farmacéuticamente aceptable. (Véase, por ejemplo, Báckstrom et al., Aerosol drug formulations containing hydrofluoroalkanes y alkyl saccharides, patente estadounidense n.o 6.932.962).

En otra realización, el portador farmacéuticamente aceptable es un sólido y la composición farmacéutica está en forma de polvo, gránulos, micropartículas, microesferas o comprimido. Los antagonistas de péptidos CGRP conjugados con vehículo o no conjugados pueden incorporarse en preparaciones particuladas o microparticuladas de compuestos poliméricos tales como poli(ácido láctico), poli(ácido glicólico), etc. o en liposomas. Puede usarse también ácido hialurónico, y éste puede tener el efecto de promover una duración sostenida en la circulación. Tales composiciones pueden influir en el estado físico, la estabilidad, la velocidad de liberación in vivo y la velocidad de aclaramiento in vivo de los antagonistas de péptidos CGRP. (Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 1Sa edición, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1435-1712 (1990). Un portador sólido puede incluir también una o más substancias que pueden actuar como agentes aromatizantes, lubricantes, solubilizantes o agentes de suspensión.

También pueden incluirse colorantes, odorizantes y/o agentes aromatizantes (aromas) como portadores en la composición farmacéutica formulada (tal como mediante encapsulación en microesferas o liposomas) que va a contenerse adicionalmente en un producto comestible, tal como una bebida refrigerada que contiene colorantes, odorizantes y/o agentes aromatizantes.

En formas de polvo, el portador farmacéuticamente aceptable es un sólido finamente dividido, que está en mezcla con principio(s) activo(s) finamente dividido(s), incluyendo el antagonista de péptido CGRP conjugado con vehículo o no conjugado de la invención. Por ejemplo, en algunas realizaciones, es útil una forma de polvo cuando la composición farmacéutica está configurada como un inhalante. (Véase, por ejemplo, Zeng et al., Method of preparing dry powder inhalation compositions, documento WO 2004/01791S; Trunk et al., Salts of the CGRP antagonist BIBN4096 and inhalable powdered medicaments containing them, patente estadounidense n.o 6.900.317).

En forma de comprimido, el/los principio(s) activo(s) se mezcla(n) con un portador farmacéuticamente aceptable que tiene las propiedades de compresión necesarias en proporciones adecuadas y se compacta(n) en la forma y el tamaño deseados.

Los polvos y comprimidos contienen preferiblemente hasta un 99% del/de los principio(s) activo(s). Los portadores sólidos adecuados incluyen, por ejemplo, fosfato de calcio, estearato de magnesio, talco, azúcares, lactosa, dextrina, almidón, gelatina, celulosa, polivinilpirrolidina, ceras de bajo punto de fusión y resinas de intercambio iónico.

Pueden diluirse los antagonistas de péptidos CGRP conjugados con vehículo o no conjugados para aumentar el volumen de las composiciones farmacéuticas de la invención con un material inerte. Tales diluyentes pueden incluir hidratos de carbono, especialmente, manitol, a-lactosa, lactosa anhidra, celulosa, sacarosa, dextranos modificados y almidón. Pueden usarse también ciertas sales inorgánicas como rellenos, incluyendo trifosfato de calcio, carbonato de magnesio y cloruro de sodio. Algunos diluyentes disponibles comercialmente son Fast-Flo, Emdex, STA-Rx 1500, Emcompress y Avicell.

Una variedad de espesantes convencionales que son útiles en cremas, pomadas, supositorios y configuraciones de gel de la composición farmacéutica, tales como, pero sin limitarse a, alginato, goma xantana o vaselina, pueden emplearse también en tales configuraciones de la composición farmacéutica de la presente invención. También puede emplearse un potenciador de la permeación o penetración, tal como monolaurato de polietilenglicol, dimetilsulfóxido, N-vinil-2-pirrolidona, N-(2-hidroxietil)-pirrolidona o 3-hidroxi-N-metil-2-pirrolidona. Se conocen técnicas útiles para producir matrices de hidrogel. (Por ejemplo, Feijen, Biodegradable hydrogel matrices for the controlled release of pharmacologically active agents, patente estadounidense n.o 4.925.677; Shah et al., Biodegradable pH/thermosensitive hydrogels for sustained delivery of biologically active agents, documento WO 00/38651 A 1). Pueden formarse tales matrices de gel biodegradables, por ejemplo, mediante entrecruzamiento de un componente proteínico y un componente de polisacárido o mucopolisacárido, cargándose entonces con la composición de materia de la invención que va a administrarse.

Pueden administrase a un paciente composiciones farmacéuticas líquidas de la presente invención que son disoluciones o suspensiones estériles mediante inyección, por ejemplo, por vía intramuscular, por vía intratecal, por vía epidural, por vía intravascular (por ejemplo, por vía intravenosa o por vía intraarterial), por vía intraperitoneal o por vía subcutánea. (Véase, por ejemplo, Goldenberg et al., Suspensions for the sustained release of proteins, patente estadounidense n.o 6.245.740 y documento WO 00/38652 A1). También pueden administrarse disoluciones estériles mediante infusión intravenosa. El antagonista de péptido CGRP conjugado con vehículo o no conjugado puede incluirse en una composición farmacéutica sólida estéril, tal como un polvo liofilizado, que puede disolverse o suspenderse en un momento conveniente antes de su administración a un paciente usando agua estéril, solución salina, solución salina tamponada u otro medio inyectable estéril apropiado.

Formulaciones implantables de liberación sostenida son también realizaciones contempladas de las composiciones farmacéuticas de la invención. Por ejemplo, el portador farmacéuticamente aceptable, que es una matriz biodegradable implantada dentro del cuerpo o bajo la piel de un vertebrado humano o no humano, puede ser un hidrogel similar a los descritos anteriormente. Alternativamente, puede formarse a partir de un componente de polialfa-aminoácido. (Sidman, Biodegradable, implantable drug delivery device, and process for preparing and using same, patente estadounidense n.o 4.351.337). También se conocen otras técnicas para preparar implantes para la administración de fármacos y son útiles según la presente invención.

Adicional (o alternativamente), la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas para su uso en cualquiera de las diversas formulaciones de liberación lenta o sostenida o formulaciones de micropartículas conocidas por el experto en la técnica, por ejemplo, formulaciones de micropartículas de liberación sostenida, que pueden administrarse mediante vías de administración pulmonar, intranasal o subcutánea.

En una realización adicional, la composición farmacéutica de la invención está configurada como una parte de un parche transdérmico o transmucoso farmacéuticamente aceptable o un trocisco. Se conocen sistemas de administración de fármacos en parche transdérmico, por ejemplo, parches transdérmicos de tipo matriz, y son útiles para poner en práctica algunas realizaciones de las presentes composiciones farmacéuticas. (Por ejemplo, Chien et

s

al., Transdermal estrogen/progestin dosage unit, system and process, patentes estadounidenses n.o4.906.169 y 5.023.084; Cleary et al., Diffusion matrix for transdermal drug administration and transdermal drug delivery dispositives including same, patente estadounidense n.o 4.911.916; Teillaud et al., EVA-based transdermal matrix system for the administration of an estrogen and/or a progestogen, patente estadounidense n.o 5.605.702; Venkateshwaran et al., Transdermal drug delivery matrix for coadministering estradiol and another steroid, patente estadounidense n.o 5.783.208; Ebert et al., Methods for providing testosterone and optionally estrogen replacement therapy to women, patente estadounidense n.o 5.460.820).

Se conoce también en la técnica una variedad de sistemas farmacéuticamente aceptables para la administración transmucosa de agentes terapéuticos y son compatibles con la práctica de la presente invención. (Por ejemplo, Heiber et al., Transmucosal delivery of macromolecular drugs, patentes estadounidenses n.os 5.346.701 y 5.516.523; Longenecker et al., Transmembrane formulations for drug administration, patente estadounidense n.o 4.994.439). Los dispositivos de administración transmucosa pueden estar en forma libre, tal como una crema, un gel o una pomada, o pueden comprender una forma determinada tal como un comprimido, parche o trocisco. Por ejemplo, la administración del antagonista de péptido CGRP de la invención puede ser mediante un sistema de administración transmucosa que comprende un compuesto laminado de, por ejemplo, una capa adhesiva, una capa de soporte, una membrana permeable que define un depósito que contiene el antagonista de péptido CGRP conjugado con vehículo

o no conjugado, un disco autoadhesivo por debajo de la membrana, uno o más sellos térmicos y un revestimiento de liberación desprendible (por ejemplo, Ebert et al., Transdermal delivery system with adhesive overlay and peel seal disc, patente estadounidense n.o 5.662.925; Chang et al., Dispositivo for administering an active agent to the skin or mucosa, patentes estadounidenses n.os 4.849.224 y 4.983.395).

Alternativamente, entre los sistemas de comprimido o parche conocidos configurados para la administración terapéutica a través de la mucosa oral (por ejemplo, mucosa sublingual), algunas realizaciones pueden comprender una capa interna que contiene el antagonista de péptido CGRP conjugado con vehículo o no conjugado, un potenciador de la permeación, tal como una sal biliar o fusidato y un polímero hidrófilo, tal como hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, dextrano, pectina, polivinilpirrolidona, almidón, gelatina o cualquier número de otros polímeros que se sabe que son útiles para este fin. Esta capa interna puede tener una superficie adaptada para ponerse en contacto y adherirse al tejido mucoso húmedo de la cavidad bucal y pueden tener una superficie opuesta que se adhiere a una capa inerte no adhesiva superpuesta. Opcionalmente, un sistema de administración transmucosa de este tipo puede estar en forma de un comprimido bicapa en el que la capa interna contiene también agentes de unión adicionales, agentes aromatizantes o rellenos. Algunos sistemas útiles emplean un detergente no iónico junto con un potenciador de la permeación. Estos ejemplos son meramente ilustrativos de la tecnología de administración terapéutica transmucosa disponible y no son limitativos de la presente invención.

En otras realizaciones, la composlclon de materia y/o composlclon farmacéutica de la invención pueden administrarse a un paciente por vía oral. Las composiciones adecuadas para la administración oral incluyen formas sólidas, tales como comprimidos, píldoras, cápsulas, comprimidos oblongos, gránulos, comprimidos, trociscos, pastillas para chupar, sellos, grageas y polvos, y formas líquidas, tales como disoluciones, jarabes, elixires y suspensiones. Las formas útiles para la administración enteral incluyen disoluciones, emulsiones y suspensiones estériles. Se describen adicionalmente ejemplos de formas farmacéuticas orales sólidas generalmente en el capítulo 89 de Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a ed., Mack Publishing CO., Easton PA 18042, (1990).

Además, puede usar encapsulación liposómica o proteinoide para formular las composiciones farmacéuticas de la invención para administración oral (tales como, por ejemplo, microesferas proteinoides notificadas en la patente estadounidense n.o 4.925.673; veáse también Giovagnoli et al., Biodegradable microspheres as carriers for native superoxide dismutase and catalase delivery, AAPS PharmSciTech, 5(4), artículo 51, (www.aapspharmscitech.org) (2004)). La encapsulación liposómica puede incluir derivatización con diversos polímeros, (por ejemplo, patente estadounidense n.O 5.013.556). En el capítulo 10 de Marshall, K., Modern Pharmaceutics, G. S. Banker y C. T. Rhodes, eds. (1979) se proporciona una descripción adicional de posibles formas farmacéuticas sólidas adecuadas para la composición farmacéutica.

Si es necesario, pueden modificarse químicamente las composiciones que contienen los antagonistas de péptidos CGRP de la invención de modo que la administración oral sea eficaz. Generalmente, la modificación química contemplada es la unión de al menos un resto a la propia molécula de compuesto, en la que el resto permite (a) la inhibición de la proteólisis o hidrólisis ácida en el entorno gástrico; y (b) la captación en el torrente sanguíneo a partir del estómago o el intestino. También se desea el aumento en la estabilidad global de los antagonistas de péptidos CGRP conjugados con vehículo o no conjugados y el aumento en el tiempo de circulación en el cuerpo. Por consiguiente, también pueden usarse para este fin restos útiles como vehículos conjugados en esta invención. Los ejemplos de tales restos incluyen: PEG, copolímeros de etilenglicol y propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, poli(alcohol vinílico), polivinilpirrolidona y poliprolina. Véase, por ejemplo, Abuchowski y Davis, Soluble Polymer-Enzyme Adducts, Enzymes as Drugs, Hocenberg y Roberts, eds., Wiley-Interscience, Nueva York, NY, 367-383 (1981); Newmark, et al., J. Appl. Biochem., 4: 185-189 (1982). Otros polímeros que pueden usarse son poli-1,3dioxolano y poli-1,3,6-tioxocano. Se prefieren para uso farmacéutico, tal como se indicó anteriormente, restos de PEG. También es posible usar una sal de un aminoácido alifático modificado, tal como N-(8-[2hidroxibenzoil]amino)caprilato de sodio (SNAC), como portador para potenciar la absorción de los antagonistas de péptidos CGRP de la invención. (Véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.o 5.792.451, titulada "Composición y métodos de administración de fármacos orales".

Las composiciones que contienen los antagonistas de péptidos CGRP de la invención pueden incluirse en la formulación de la composición farmacéutica para administración oral como multiparticulados finos en forma de gránulos o grageas. La formulación del material para administración mediante cápsulas puede ser también como un polvo, como tapones ligeramente comprimidos, o incluso como comprimidos.

Pueden ser deseables formulaciones orales de liberación controlada de la composición farmacéutica. Las composiciones de materia y/o composiciones farmacéuticas de la invención pueden incorporarse en una matriz inerte que permite la liberación mediante o bien difusión o bien mecanismos de lixiviación, por ejemplo, gomas. También pueden incorporarse matrices de degeneración lenta en la formulación, por ejemplo, alginatos, polisacáridos. Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas pueden recubrirse mediante las técnicas descritas en

s

las patentes estadounidenses n.o4.256.108; 4.160.452; Y 4.265.874, para formar comprimidos terapéuticos osmóticos para liberación controlada. Pueden usarse otras técnicas para las composiciones de liberación controlada,

s

tales como las dadas a conocer en las patentes estadounidenses n.o4.193.985; y 4.690.822; 4.572.833 en la formulación de las composiciones farmacéuticas de la invención. Otra forma de liberación controlada de los antagonistas de péptidos CGRP conjugados con vehículo o no conjugados y/o composiciones farmacéuticas de esta invención es mediante un método basado en el sistema terapéutico Oros (Alza Corp.), es decir, los antagonistas de péptidos CGRP y/o composiciones farmacéuticas de la invención se encierran en una membrana semipermeable que permite la entrada de agua y el empuje hacia fuera del fármaco a través de una abertura pequeña única debido a efectos osmóticos. Algunos recubrimientos entéricos tienen también un efecto de liberación retardada.

Pueden usarse otros recubrimientos para la formulación para administración oral. Éstos incluyen una variedad de azúcares que pueden aplicarse en una cubeta de recubrimiento. También puede administrarse el agente terapéutico en un comprimido recubierto con película y los materiales usados en este caso se dividen en 2 grupos. Los primeros son los materiales no entéricos e incluyen metilcelulosa, etilcelulosa, hidroxietilcelulosa, metilhidroxietilcelulosa, hydroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio, povidona y polietilenglicoles. El segundo grupo consiste en los materiales entéricos que son comúnmente ésteres de ácido ftálico. Podría usarse una mezcla de materiales para proporcionar el recubrimiento de película óptimo. Puede llevarse a cabo el recubrimiento con película en un recubridor de cubeta o en un lecho fluidizado o mediante recubrimiento por compresión.

También es útil la administración pulmonar a un paciente de los antagonistas de péptidos CGRP conjugados con vehículo o no conjugados y/o composiciones farmacéuticas, según la presente invención. Los antagonistas de péptidos CGRP se administran a los pulmones de un paciente mediante inhalación y atraviesan el revestimiento epitelial del pulmón hasta el torrente sanguíneo. (Véase también, Adjei et al., Pharma. Res., 7:565-569 (1990); Adjei et al., Int'1. J. Pharmaceutics, 63: 135-44 (1990), acetato de leuprolida; Braquet et al., J. Cardio. Pharmacol. 13(5): 143-146 (1989), endotelina-1; Hubbard et al., Annals Int. Med., 3:206-212 (1989), a1-antitripsina; Smith et al., J. Clin. I nvest. , 84: 1145-1146 (1989), a1-proteinasa; Oswein et al., "Aerosolization of Proteins", Proc. Symp. Resp. Drug Delivery 11, Keystone, Colorado, (marzo de 1990), hormona de crecimiento humana recombinante; Debs et al., J. Immunol., 140:3482-3488 (1988), interferón-y y factor de necrosis tumoral a; y Platz et al., patente estadounidense

n.o 5.284.656 (factor estimulante de colonias de granulocitos)).

En la práctica de la presente invención son útiles una amplia gama de dispositivos de dispensación de inhalante mecánica (es decir, dispositivos inhaladores) diseñados para la administración pulmonar de productos terapéuticos, incluyendo, pero sin limitarse a nebulizadores, inhaladores de dosis medida e inhaladores de polvo, todos los cuales son familiares para los expertos en la técnica. Algunos ejemplos específicos de dispositivos disponibles comercialmente adecuados para la práctica de esta invención son el nebulizador Ultravent, fabricado por Mallinckrodt, Inc., St. Louis, Missouri; el nebulizador Acorn 11, fabricado por Marquest Medical Products, Englewood, Colorado; el inhalador Ventolin de dosis medida, fabricado por Glaxo Inc., Research Triangle Park, Carolina del Norte; y el inhalador de polvo Spinhaler, fabricado por Fisons Corp., Bedford, Massachusetts. (Véase, por ejemplo, Helgesson et al., Inhalation device, patente estadounidense n.o 6.892.728; McDerment et al., Dry powder inhaler, documento WO 02/11801 A 1; Ohki et al., Inhalant medicator, patente estadounidense n.o 6.273.086).

Todos los dispositivos de dispensación de inhalante requieren el uso de formulaciones adecuadas para la dispensación de la composición de materia de la invención. Normalmente, cada formulación es específica para el tipo de dispositivo de dispensación de inhalante empleado y puede implicar el uso de un material propelente de aerosol apropiado, además de disolventes, adyuvantes y/o portadores útiles en terapia.

Para la administración pulmonar de tales formulaciones de inhalante de la composición farmacéutica, la composición farmacéutica de la invención debe prepararse lo más ventajosamente en forma de micropartículas con un diámetro aerodinámico promedio de aproximadamente 0,5 a 5 11m, para lograr la administración más eficaz al pulmón distal.

Los portadores farmacéuticamente aceptables adecuados para tales formulaciones de inhalante incluyen hidratos de carbono tales como trehalosa, manitol, xilitol, sacarosa, lactosa y sorbitol. Otros componentes para su uso en las formulaciones pueden incluir DPPC, DOPE, DSPC Y DOPC. Pueden usarse surfactantes naturales o sintéticos. Puede usarse PEG (incluso aparte de su uso como vehículo para conjugarse con el antagonista de péptido CGRP). Pueden usarse dextranos, tales como ciclodextrano. Pueden usarse sales biliares y otros potenciadores relacionados. Pueden usarse celulosa y derivados de celulosa. Pueden usarse aminoácidos, tal como su uso en una formulación tampón. Además, se contempla el uso de liposomas, microcápsulas o microesferas, complejos de inclusión u otros tipos de portadores para algunas formulaciones de inhalante.

Las formulaciones adecuadas para su uso con un nebulizador, o bien de chorro o bien ultrasónico, comprenderán normalmente la composición de materia de la invención disuelta en agua. La formulación puede incluir también un tampón y un azúcar sencillo (por ejemplo, para la estabilización del péptido y la regulación de la presión osmótica). La formulación de nebulizador puede contener también un surfactante, para reducir o prevenir la agregación de la proteína inducida por la superficie provocada por la atomización de la disolución al formar el aerosol.

Las formulaciones para uso con un dispositivo inhalador de dosis medida comprenderán generalmente un polvo finamente dividido que contiene el compuesto de la invención suspendido en un propelente con la ayuda de un surfactante. El propelente puede ser cualquier material convencional empleado para este fin tal como un clorofluorocarbono, un hidroclorofluorocarbono, un hidrofluorocarbono o un hidrocarburo, incluyendo triclorofluorometano, diclorodifluorometano, diclorotetrafluoroetanol o 1,1,1 ,2-tetrafluoroetano, o combinaciones de los mismos. Los surfactantes adecuados incluyen trioleato de sorbitano y lecitina de soja. También puede ser útil ácido oleico como surfactante. (Véase, por ejemplo, Backstrom et al., Aerosol drug formulations containing hydrofluoroalkanes and alkyl saccharides, patente estadounidense n.o 6.932.962).

Las formulaciones para su dispensación a partir de un dispositivo inhalador de polvo comprenderán un polvo seco finamente dividido que contiene el compuesto de la invención y puede incluir también un agente de relleno, tal como lactosa, sorbitol, sacarosa, manitol, trehalosa o xilitol en cantidades que facilitan la dispersión del polvo desde el dispositivo, por ejemplo, del 50 al 90% en peso de la formulación. (Véase, por ejemplo, McDerment et al., Dry powder inhaler, documento WO 02/11801 A 1).

Según la presente invención, también es útil la administración intranasal de la composición de materia y/o composiciones farmacéuticas de la invención, lo que permite el paso de las mismas al torrente sanguíneo directamente tras la administración al interior de la nariz, sin la necesidad de deposición del producto en el pulmón. Las formulaciones adecuadas para la administración intranasal incluyen aquéllas con dextrano o ciclodextrano, y se conocen dispositivos de administración intranasal. (Véase, por ejemplo, Freezer, Inhaler, patente estadounidense n.o 4.083.368).

Tal como se usa en la memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el/la" incluyen referentes plurales a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Por tanto, por ejemplo, la referencia a "un antagonista de péptido CGRP conjugado con vehículo" o "un antagonista de péptido CGRP conjugado con vehículo" incluye mezclas de tales conjugados.

La invención se describirá en mayor detalle mediante referencia a los siguientes ejemplos.

Ejemplos

Ejemplo 1: Síntesis del péptido CGRP, unión de CGRP1 y actividad antagonista. Se sinterizaron una serie de análogos de péptidos CGRP mediante técnicas sintéticas de péptidos en fase sólida convencionales para el fin de introducir sitios de conjugación selectivos de sitio para vehículo activado.

Se exploraron varias estrategias de conjugación incluyendo alquilación mediada por tiol, así como acilación y alquilación reductora. También se obtuvieron por ingeniería genética sitios de conjugación selectivos de sitio en el extremo N-terminal del péptido CGRP o dentro de la región de bisagra.

Síntesis del péptido CGRP. Se usó el siguiente protocolo para generar análogos de CGRP tal como se describe en el presente documento. Se usaron aminoácidos protegidos en cadena lateral con NIl-Fmoc y resina de amida Rink. Las estrategias de protección de cadena lateral representativas fueron: Asp(OtBu), Arg(Pbf), Cys(Acm), Glu(OtBu), Glu(02-PhiPr), His(Trt), Lys (Nf-Boc ), Lys (Nf-Mtt), Ser(OtBu), Thr(OtBu), Trp(Boc) y Tyr(OtBu). Se sintetizaron los derivados del péptido CGRP de manera escalonada en un sintetizador de péptidos ABI433 mediante SPPS usando química de acoplamiento con hexafluoro-fosfato de O-benzotriazol-N,N,N',N'-tetrametil-uronio (HBTU)/N,Ndiisopropiletilamina (DIEA)/N,N-dimetilformamida (DMF) en 0,2 mmol de equivalente de escala de resina (resina de amida Rink desprotegida de Fmoc). Para cada ciclo de acoplamiento, se usaron 1 mmol de NIl-Fmoc-aminoácido, 4 mmol de DIEA y 1 mmol de equivalentes de HBTU. La concentración de los Fmoc-aminoácidos activados por HBTU fue de 0,5 M en DMF, y el tiempo de acoplamiento fue de 45 mino Las desprotecciones de Fmoc se llevaron a cabo con dos tratamientos usando una piperidina al 30% en disolución de DMF en primer lugar durante 2 min y luego durante 20 min adicionales.

Formación de lactama. En algunas realizaciones de los péptidos CGRP, se llevó a cabo la formación de lactama cadena lateral a cadena lateral en el péptido-resina protegido con Fmoc unido en el extremo N-terminal. El péptidoresina se solvató en DCM durante 30 min, y se drenó. Se eliminaron los grupos Mtt y 2-PhiPr (grupo de protección en los sitios de formación de enlace de lactama especificados) con TFA al 1 % en disolución de DCM que contenía TIS al 5%. Se repitió el tratamiento del péptido-resina con TFA a11% en disolución de DCM 8 veces en incrementos de 30 min, y a cada tratamiento le siguieron extensos lavados con DCM. Entonces se condensaron los grupos carboxilo y amino liberados mediante la adición de 5 equiv. de hexafluorofosfato de benzotriazol-HI-oxi-trispirrolidino-fosfonio (PyBOP) 0,5 M Y se añadieron 10 equiv. de DIEA en DMF al péptido-resina y se dejó durante 24

h. Entonces se lavó meticulosamente la resina con DMF, DCM y DCM/MeOH, y se secó.

Desprotección de cadena lateral y escisión de la resina. Tras la síntesis y la modificación, se drenó entonces la resina y se lavó con DCM, DMF, DCM, y luego se secó a vacío. Se desprotegió el péptido-resina y se liberó de la resina mediante tratamiento con una disolución de ácido trifluoroacético (TFA)/1 ,2-etanoditiol (EDT)/triisopropil-silano (TIS)/H20 (92,5:2,5:2,5:2,5 v/v) a temperatura ambiente durante 90 mino Entonces se eliminaron los componentes volátiles con una corriente de gas nitrógeno, se precipitó el péptido en bruto dos veces con dietil éter y se recogió mediante centrifugación.

Purificación mediante HPLC de fase inversa. Se realizó cromatografía de líquidos de alta resolución de fase inversa en una columna analítica (C18, 5 ~m, 0,46 cm x 25 cm) o en una preparativa (C18, 10 ~m, 2,2 cm x 25 cm). Se lograron las separaciones cromatográficas usando gradientes lineales de tampón B en A (A = TFA acuoso al 0,1%; B =ACN ac. al 90% que contenía TFA al 0,09%) normalmente del 5-95% durante 35 min a una velocidad de flujo de 1 ml/min para el análisis analítico y del 5-65% durante 90 min a 20 ml/min para las separaciones preparativas. Las fracciones de HPLC analítica y preparativa se caracterizaron mediante ESMS y HPLC con matriz de fotodiodos (PDA), y las fracciones seleccionadas se combinaron y se liofilizaron.

Experimentos de unión de CGRP1. Se establecieron ensayos de unión de CGRP1 en placas de 96 pocillos a temperatura ambiente que contenían: 110 ~I de tampón de unión (Tris-HCI20 mM, pH 7,5, MgS04 5,0 mM, BSA al 0,2% [Sigma], 1 comprimido de Complete™/50 mi de tampón [inhibidor de proteasa]); 20 ¡.tI de compuesto de prueba

(1 OX); 20 ¡.tI de 1251-haCGRP (Amersham Biosciences) (10X); y 50 ¡.tI de suspensión de membrana (10 ¡.tg por pocillo,

PerkinElmer) de células de neuroblastoma humano (SK-N-MC). Se incubaron las placas a temperatura ambiente

durante 2 horas con agitación a 60 rpm, luego se filtró el contenido de cada pocillo sobre placas filtrantes de 96

5 pocillos GF/C tratadas con polietilenimina (PEI) al 0,5% (al menos durante una hora). Las placas filtrantes de GF/C

se lavaron 6 veces con Tris 50 mM enfriado en hielo, pH 7,5 Y se secaron en un horno a 55°C durante 1 hora.

Entonces se sellaron los fondos de las placas de GF/C y se añadieron 40 ¡.tI de MicroscinFM 20 a cada pocillo, luego

se sellaron las partes superiores de las placas de GF/C con TopSeaFM-A, una película de sellado adhesiva mediante

presión, y se contaron las placas de GF/C con un dispositivo TopCount NXT (Packard). Se analizaron los datos 10 usando el software ActivityBase (IDBS) o Prizm (GraphPad). Los resultados de los ensayos de unión se muestran en

la tabla 3A y en la tabla 3B a continuación.

Tabla 3A. Resultados del experimento de unión de CGRP1.

SEQ

Secuencia

Ki

ID

(n1\.·i)

¡..,O 31

A.c~\V\lTH{C it)LAGLLS(Cit)SGGVVRKNFV PTDVGPFAF·NI E;¡

20K PEG (ald)-Ac-vVVTH{Cit]lAGLLS(Git)SGG

WRKNFVPTDVGPFAF~NH2

LLS{Git}SGG

RKI2aKPEGald)NFVPTOVGPfA.F~NH2

,> ,>~.",. .. .F""-'··'" '."""",~'",. . = ...·"'«Nxw« """''-__''''1'''' """"""'.,

A

739 Ac-\lIJVTH(Cit]LAGLLS[Cítl SGGW[hArgIKNFVPTOVGPFAf-NH2

[53 lit 658

o

M'

53 118

127

17]

H2 Ar:.-WlTH(CU]lAGLlSrClt]SGGW[hArgjK{20KPEGald)N AlPTDVG 1-Nal AF-NH2 064 084

Tabla 3B. Resultados del experimento de unión de CGRP1.

sea ID NO

Sequencia de péptido CGRP KI (nNl)

6

Ac..VTHRtAGLlSRSGGWRKNFVPTDVGPFAf-amida 0,04

229

Ac.vrHRLAGllSRSGGWR~{~P!ClNFVPTOVGPFAF.. amida 0,06

230

Ac.vTHRLAGlLSRSGGWRJr~PEG'NFVPTDVGPFAF.amida 0,17

231 232

Ac.\NVTHRLAGlLSRSGGWK~t~P!G)NFVPTDVGPFAF.amida ' Ac.WVTHRLAGLlSRSGGWK~pomaP!GlNFVPTOVGPFAf.amida 0,27 0,27

15

5 Acil -WTHRLAGLLSRSG~DVGPFAF-NH2 O~O6

A;;JNVTHRLAGllSRSGGWR.!1'1'I1 ""'l'IIDlo'NFVPTDVGPFAf. 0.57617 lifmida 13,11

Ae-'ltWTHRLAGllSRSGGWRCNfVPTDVGPFAF.amidlt

6ao O~58 A;;.wvrHRLAGlLSRSGGWRgPRI' "2~'NfVpTOVGPfÁF~

681 amldtt 0,60

Ac.wvrHRLAGLlSRSGGWCNNFVPTDVGPFAF.amida

682 0134

Ac.WVTHRlAGlI.SRSGGW~\'1"'2Wl1:}NNFVPTDVGPFAF.

683 I:'fmida 1.58

.<tc-wvrHRLAGllSRSGGWKNNFVPTOVGPFAF.amidtt

684 0,08

Ac-wvrHRLAGlLSRSGGW.!S(JoItt...~iltCWtNNFVPTDVGPFAF. 68S .~~a ' 15Sr 30 Ac~wvrHRLAGUSRSGGWI(l""\'1g,,2!1<D4·NNFVPTDVGPFAF.686 mnirll:'f . -1~33

Ac-WVTHRLAGLLSRSOOWJrW<l,.o.m.tll}NNFVPTDVGPFA,F.

681 0,49

~ida

ass ilVVTHRlAGllSR$GGWKCNFVPTNVGSKAF.NH2 11,69

689 VWTHRLAGLlSRSGGWKCNFVPTDVGPFAF~NH2 OJ95 c!~rI<So

600 $-'GGGGGGGVTHRlAGLLSRSGGWKNNFVPTNVGSKAF. ~lda 3072,00

691 VTHRLAGllSRSGGWd-'-tt..·Jo:DJ.INNFVPTNVGSKAF.NH2 157,42

ClPE11I ...

s-1GGGGGGGVTHRLAGLlSRSGGWKNNFVPTOVGPFAF.

~id8 20,84

693 VTHRLAGllSRSGGWKC'liIol>I'l'''''''·~NFV?TNVGSI<AF.amida 17,50

694 VTHRLAGllSRSGGWKC¡"~Ai\'1··S>DAlNfVPTNVGSI<AF.rmidB 31 tSO VV\lTHRLAGllSRSGGWKC!~"'f'f'qjf.j~HM)NFVpTNVGSKAF.

695 amidll 5,44

vwrHRLAGllSRSGGWKC(""~l'IItt""·atlA.NFVPTOVGPFAF.

696 amida 0,21

C{.....:>.nao:.

s_lGGGGGG<MNTHRLAGLLSRSGGWKNNfVPTOVGPFAF.

mnirla 5.74

698 azl~~GIiLSRSGGVVlUJNPVPTNVGSKAF-Nlfl >1000

699 Bn~VTHRLAGLLSRSGGVVKNNFVPTNVaSKAF-NUl 3,24

100 an-VTIfRLAG.lJ.,S~.F'\fPTOVG!>FAF-Ha:! .°,22

70l. (l-~JVTHRLAGL~SRS~IVKNNFVPTDVGPFAF-NH~ 0.14

"102 Bn;-VTRRLAGLLSRSGGVVKNNFVPTDVGPFAF-NH2 0,.23

103 (Phg] V"f':ofP.LAGLLSRSGG\lV'KNNJ'VPTDVGPFAP-NH2 0,19

104 rChal~SRSOOVVKNNFV1"T'DWPFAF-NH2 0,2(1

105 Ac-VTHRI.AG~SOOVVl\NNFVPTtíVGPF-l\F-tffl2 0,73

706 Ac-VTHRtAGlLSRSGGWKNNFVPTOVGPFAF-NH2 OJ'24 707 ~SDTATC(Acm)VTHRLAGiLSRS~GSKAF-NH2 20,80 708 Ac(Acm)DTATSVTHRLAGLLSRSGGVVKNNFVPTNVGSKAF-NH2 23,99 709 ASmATSV"PHRLAGLLSRSGGWKNNF'VPl'NVGSKAF-NH2 12,05 710 e (SAhx ~ FVPTDVGPFAF-NH:2 12,67 711 FVl?TDvGPFAF-Na2 >1000 ·712 FVPTDVGPfAF-NH2 >1000 713 FVPTDVGpFAF-NH2 >1000 714 f'VPTDVGPFAF-NH:2 12,79 715 PVPTDVGpF'aF'-NH2 >1000 ,;e; FvPTDVGPFAF-NH2 3012 717 FVPTDVAPf'AF-NH2 >1000 '118 FVp'l'DVGP¡.~AF -NH 2 21 ,58 719 FVP1:'dVGPFAF-mi2 >1000 720 FVP'I'DVGPFA.f-NH2 >1000 721 C'GGGOOGGYVPTDV'GPFAF-NH2 71M 722 aCOTATCVTHRLAGLLSRSGGVVKNNFVPTNVGSKAF-NH:2 0,09 723 AcOTA'l'CVTHALAGLLSRSOOWN.'ffl'FVPrNVCSKAF-NH2 0,26 ,24 ACdTATCVTHRLAGLLSRSGGVVKNNFVPTNVGSKAF-NH2 1,73 725 ACDtA'l'CVTHRLAGLLSRS~GSKAF-NH2 3,25 726 ACD'l'aTCV'I'HRLAGLLSRSOO'I/VKN'NFVP'l'NVGSKAF-NH2 0,12 728 ACDTAtCVTHRLAGLLSRSOOWKNNFVP'!'h"VGSlCAF-NH2 7,84 729 ACDTATcVTHRI...AGLLSRSGGVVKNNFVP1."'NVGSKAF-NH2 0,52 730 ACDTATCv"rHRLAGLLSRSGGVVKNNFVPTNVGSKAF-NH2 11,.75 731 ACDTATCVThRl.AGLLSRSGGVVKNNFVPTNVGSKAF-NH2 Or67 732 ACDTATCVtHRLAGLLSRSGGVVKNNFVPTNVGSKAF-NH2 0,07

Actividad antagonista de CGRP. Se seleccionaron análogos de péptidos CGRP no conjugados en un ensayo in vitro de AMPc mediado por receptor de CGRP1 para determinar la potencia intrínseca antes de la conjugación con el vehículo.

S La tabla 3 (más adelante en el presente documento) muestra los resultados de tales ensayos in vitro basados en AMPc que comparan el antagonista de péptido aCGRP(8-37) humano negativo (tabla 3, SEO ID NO:1) con una variedad de otros análogos diseñados para mejorar la potencia en el receptor de CGRP1, permitir la conjugación selectiva de sitio y/o facilitar el manejo in vitro. El ensayo in vitro de AMPc empleó una línea celular derivada de neuroblastoma humano (SK-N-MC). Las células SK-N-MC expresan CRLR y RAMP1, que forman el receptor de CGRP1. El receptor de CGRP1es un receptor acoplado a proteínas G unido a la proteína G estimuladora, Gs. Tras la unión de CGRP al receptor, los niveles de AMPc aumentan, mediado por la activación de Gs de adenilil ciclasa y la proteína cinasa dependiente de AMPc (PKA). Se desarrolló un ensayo de ELlSA para medir el nivel de AMPc acumulado en las células SK-N-MC tratadas como un sistema de selección para la identificación de antagonistas de CGRP. Brevemente, dos días antes del ensayo, se sembraron en placa las células en placas de 96 pocillos en medio de crecimiento. En el día del ensayo, se aclararon las células con PBS seguido por la adición de 60 J.lI de medio libre de plasma durante 15 minutos a temperatura ambiente. Entonces se añadieron antagonistas de péptidos CGRP a concentraciones variables en 20 ,.11 de tampón seguido por una incubación de 5 minutos a 37°C. Luego se añadió el agonista de CGRP, aCGRP, en 20 J.lI de tampón a cada pocillo seguido por una incubación de 5 minutos a 37°C. Entonces se eliminó el medio y se lisaron las células con 100 J.lI de tampón de lisis durante 30 minutos a 37°C durante 30 minutos. Usando un kit de ELlSA Tropix (Applied Biosystems, Foster City, CA), se diluyó un conjugado de AMPc-AP (1:100) y se añadió (30 J.lI) a cada pocillo de una placa de ELlSA de 96 pocillos. Se añadió entonces una alícuota del tampón de lisis desde la placa de células a la placa de ELlSA seguido por una alícuota del anticuerpo AMPc. Se incubó esta mezcla durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación suave. Entonces se lavó la placa de ELlSA 6X con tampón de lavado seguido por las adiciones de un potenciador de sustrato. Esta mezcla se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente y luego se leyó en un lector de placas MicroBeta Jet o EnVision. Se analizaron los resultados usando Prism (GraphPad).

Las estrategias de conjugación iniciales incluyeron modificación por ingeniería genética de una cisteína N-terminal con un ligador de hepta-glicina para el antagonista nativo de CGRP(8-37) para acoplamiento mediado por tiol en el extremo N-terminal. Esta adición del extremo N-terminal del péptido CGRP demostró ser deletérea para la potencia en el receptor de CGRP1 (tabla 3, SEO ID NO:2 en comparación con SEO ID NO:1). Inesperadamente, descubrimos que la adición de tres sustituciones de aminoácido (T30D, V32P y G33F), usadas para restablecer la actividad en el antagonista de péptido CGRP truncado, no sólo restablecieron la actividad para el análogo de conjugación en el extremo N-terminal (tabla 3, SEO ID NO:3), sino que mejoraron la potencia en más de 6 veces en relación con el antagonista de péptido CGRP(8-37) nativo (tabla 3, SEO ID NO:1). Este resultado fue inesperado puesto que las tres sustituciones de aminoácido se describieron como necesarias para la activación de CGRP(28-37) truncado, proponiéndose en este contexto para compensar la desaparición de la región de unión del receptor de CGRP1 a CGRP(8-18). (Rist et al., From Micromolar to Nanomolar Affinity: A systematic approach to identify the binding site of CGRP at the human calcitonin gene-related peptide 1 receptor, J. Med. Chem., 41: 117-123 (1998)). Por tanto, la introducción de tres sustituciones de aminoácido (T30D, V32P y G33F) mejoró significativamente la potencia de los análogos de antagonista de péptido CGRP(8-37) de longitud completa.

El beneficio de las tres sustituciones de aminoácido (T30D, V32P y G33F) se observó de nuevo cuando se añadió un triptófano (W7, en relación con la secuencia de aCGRP humana nativa) al extremo N-terminal de CGRP(8-37) (tabla 3, SEO ID NO:4 y SEO ID NO:5), que se incorpora de manera útil a un cromóforo en la secuencia de CGRP para permitir una mejor monitorización y cuantificación en proceso usando métodos espectroscópicos. De manera notable, la adición de W7 sola (tabla 3, SEO ID NO:4) mejoró significativamente la potencia del análogo en más de 7 veces en relación con la secuencia del péptido aCGRP(8-37) nativa (tabla 3, SEO ID NO:1). La combinación de las cuatro modificaciones (tabla 3, SEO ID NO:5) logró un antagonista con actividad mejorada en más de 35 veces con respecto a aCGRP(8-37).

Con las cuatro sustituciones de aminoácido (W7, T30D, V32P Y G33F) y el extremo N-terminal acetilado (tabla 3, SEO ID NO:5), sólo quedó una amina primaria en la región bisagra de CGRP en K24 (en relación con la secuencia de aCGRP humana nativa) para que sirviera como un nucleófilo reactivo para conjugación. Se diseñaron análogos adicionales (por ejemplo, tabla 3, SEO ID NO:6 y SEO ID NO:7) en este contexto convirtiendo K24R y N25K para desplazar el sitio de conjugación un residuo en la dirección del extremo C-terminal y para restablecer la carga positiva de un residuo básico a la posición 24 (en relación con la secuencia de aCGRP humana nativa). Estos análogos no modificados mostraron una actividad antagonista similar a la del análogo que contiene una secuencia de región bisagra nativa (tabla 3, SEO ID NO:5). Además, la comparación de las SEO ID NO:6 y SEO ID NO:7 análogas (en la tabla 3) demuestra de nuevo los efectos beneficiosos inesperados del triptófano N-terminal.

También se evaluó el efecto de la conjugación en las posiciones de aminoácido 24 ó 25 (en relación con la secuencia de aCGRP humana nativa) (véase, por ejemplo, la tabla 4) usando sustituciones de cisteína para introducir un tiol reactivo en estas posiciones (tabla 3, SEO ID NO:8 y SEO ID NO:9). Sorprendentemente, estos análogos fueron algo menos activos que los análogos de lisina y arginina equivalentes en las mismas posiciones.

Finalmente, también se evaluó la posición 23 (en relación con la secuencia de aCGRP humana nativa) como sitio de conjugación potencial usando V23C, K24R (tabla 3, SEO ID NO:10) o V23K, K24R (tabla 3, SEO ID NO:11).

Tabla 3. Ensayos in vitro de AMPc mediados por receptor de CGRP1 (n=2-4) que comparan el antagonista de péptido aCGRP(8-37) humano nativo (SEO ID NO:1) con una variedad de análogos de péptidos CGRP. Las modificaciones a la secuencia de aCGRP humana nativa dentro de cada análogo se muestran en negrita.

SEQ :ID

Secuencia CI~ (111\<1)

NQ;

VTHR["AG LLS RSGGVVKNNFV PTNVGSKAf-NH1

4~94

2

CGGGGGGGVTHRLAGLLSRSOOVVKNNFVPTNVOSKA.F~NHl 2.1,11

3

CCCGGCGCVTHRLAGLLSRSGOVVK'NNFVPTDVOP1TAF-NHz 0,72

••

WVTH111AG LLSRSGGVVKNNFVPTNVGSKAF~NHt 0,64

5

Ac-WVTHRLAGI.LSRSGCJVVKNNFVPTDVGPFAf-NH::! 0,14

6

Ac~VTHRLAOLLSRSGGVVRKNFVPTDVGPFAF~NHl 0,10

1

Ac:-WV1tfR.LAt"lLlS RSC.C'JVVRkNFV PTllVOPFAf-Nfh f\JJ

8

Ac:-\VVTHRLAGLLSRSGGVVRCNFVPTDVGJ1FAF-NHz n~'W

9

A(~WVTIiRLAGLLSRSGGVVCNNFVPTDVGPF'AF-h"H2 2,15

10

Ac-\\lVTHRLAGLLSltSGGVCRNNFVPTDVG P FAF-NH] ()~6

II

Aí!-WVTHRLAGLLSRSGOVKRNNFVPTOVGPFA f wNH1 Q.Sl

96 WFV PTOVGPf"'A,r-NH]I-*-t FVPTDVGfFAF-,lH,

11,,68 1',39

CGGGGGGGPTDVGPFAFMNIh

56,57

Ejemplo 2: Actividad antagonista mediante antagonistas de péptidos CGRP conjugados con vehículo. Se obtuvieron por ingeniería genética una variedad de análogos de CGRP para la conjugación con vehículo a través de varias químicas de conjugación diferentes. Se conjugaron tres derivados de metoxi-PEG de 20 kDa monofuncionales con los análogos de péptidos CGRP apropiados dando como resultado enlaces amina, amida o tioéter. El sitio de conjugación específico también se varió para incluir el extremo N-terminal del péptido CGRP o las posiciones de aminoácido 23, 24 ó 25 (en relación con la secuencia de aCGRP humana nativa) en la región bisagra del péptido CGRP.

La tabla 4 (más adelante en el presente documento) muestra los resultados de ensayos in vitro de AMPc mediados por receptor de CGRP1 que comparan una variedad de antagonistas de péptidos CGRP conjugados con PEG. Los PEG-péptidos unidos mediante enlace amina se derivaron de antagonistas de péptidos CGRP con sus extremos N-terminal acilados y una única amina primaria modificada por ingeniería genética en el sitio de conjugación designado (tabla 4, SEO ID NOS: 5, 7 Y 11). El derivado de PEG activado usado fue un metoxi-PEG-aldehído de 20 kDa (mPEG-ald) y se logró la conjugación mediante alquilación reductora en presencia de cianoborohidruro de sodio. Brevemente, se disolvió el péptido CGRP a 2 mg/ml en un tampón libre de amina (fosfato de sodio 20 mM, pH 6), se añadió el mPEG-ald en exceso estequiométrico (aproximadamente de 5 veces) y se añadió cianoborohidruro de sodio hasta una concentración final de 10 mM. Se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante de 24 a 48 horas y se monitorizó mediante cromatografía de líquidos a alta presión de fase inversa (RP-HPLC). Tras la finalización, se extinguió la reacción mediante una dilución de 4 a 5 veces en tampón acetato de sodio 20 mM, pH 4. Se logró la purificación mediante cromatografía de intercambio catiónico preparativa, eluyendo con un gradiente lineal de cloruro de sodio de 0-500 mM. Se identificó el PEG-péptido eluido mediante RP-HPLC y electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE), y se concentró y se dializó en acetato de sodio 10 mM, sorbitol al 5%, a pH 4. Se determinaron las purezas superiores al 99% para todos los conjuntos finales mediante RP-HPLC. Se usó mapeo y secuenciación de péptidos para confirmar la conjugación de PEG en cada uno de los sitios de conjugación deseados.

Los PEG-péptidos unidos a amida se derivaron de la misma amina primaria única que contenía análogos de CGRP (tabla 4, SEO ID NOS: 5, 7 Y 11 de análogos) usada para los conjugados unidos a amina. El derivado de PEG activado fue un metoxi-PEG-N-hidroxisuccinimidil éster (mPEG-NHS) de 20 kDa, y la conjugación se logró mediante acilación a pH 8. Brevemente, se disolvió el péptido CGRP a 2 mg/ml en un tampón libre de amina (Bicina 50 mM, pH 8); se añadió el mPEG-NHS en exceso estequiométrico (2 -10 veces) y se dejó reaccionar durante de 4 a 24 horas a temperatura ambiente. Se monitorizó la reacción, se extinguió y se purificó mediante el mismo método usado para los PEG-péptidos unidos a amina, tal como se describió anteriormente. Aunque hubo una fracción de péptido sustancial que pareció estar di-pegilada, se separó fácilmente en purificación, y, tal como se describió

anteriormente para el PEG-péptido unido a amina, también se purificó el péptido unido a amida mono-pegilado hasta una pureza> 99% tal como se determina mediante RP-HPLC.

Se derivaron PEG-péptidos unidos a tioéter de análogos de antagonistas de CGRP con tioles reactivos obtenidos mediante ingeniería genética en el sitio de conjugación deseado (tabla 4, análogos de péptidos CGRP, SEO ID NOS:3, 8, 9 Y 10). El derivado de PEG activado fue una metoxi-PEG-maleimida (mPEG-mal) de 20 kDa y se logró la conjugación mediante alquilación a pH 6. Brevemente, se disolvió el péptido CGRP a 2 mg/ml en un tampón libre de amina (fosfato de sodio 50 mM, EDTA 5 mM, pH 6), se añadió la mPEG-mal en un exceso estequiométrico moderado (1,2-1,5 veces) y se dejó reaccionar de 0,5 a 2 horas a temperatura ambiente. Se monitorizó la reacción, se extinguió con ~-mercaptoetanol 5 mM, y tras la extinción se dejó incubar a temperatura ambiente otros 30 minutos. Entonces, se purificaron los PEG-péptidos unidos a tioéter mediante el mismo método usado para los PEG-péptidos unidos a amina, tal como se describió anteriormente.

Hubo varios resultados inesperados observados cuando se evaluaron estos diversos análogos de PEG-CGRP usando en ensayo in vitro de AMPc, tal como se describe en el ejemplo 1. En primer lugar, hubo una preferencia muy clara por acoplar en la región bisagra de CGRP en comparación con el extremo N-terminal. La pegilación a través de un enlace tioéter en el extremo N-terminal redujo espectacularmente la potencia del conjugado en > 190 veces cuando se comparó con el análogo N-terminal no conjugado (tabla 4, SEO ID NO:3). En contraposición, la pegilación en una cisteína modificada por ingeniería genética en la región de bisagra (tabla 4, SEO ID NO:14) tuvo poco efecto sobre la actividad antagonista del péptido parental (tabla 4, SEO ID NO:9). Sin embargo, puesto que el acoplamiento de tioéter en la región de bisagra no dio como resultado un conjugado especialmente potente, se exploraron químicas alternativas para el acoplamiento en la región de bisagra.

El uso de enlaces amina (tabla 4, SEO ID NO:12) y amida (tabla 4, SEO ID NO:13) para pegilar la lisina nativa en la posición 24 también produjo resultados de unión algo decepcionantes. Aunque el péptido parental (tabla 4, SEO ID NO:5) era bastante potente, la pegilación a través de cualquiera de estos enlaces produjo una pérdida mayor de 15 veces en la actividad antagonista. Inesperadamente, la doble sustitución K24R, N25K de CGRP (tabla 4, SEO ID NO:7) toleró muy bien la pegilación por cualquiera del enlace amina o amida, sufriendo sólo una pérdida de aproximadamente tres veces en la actividad antagonista (compárese la SEO ID NO:7 en la tabla 4, SEO ID NO:15 y SEO ID NO:16), y estos conjugados todavía eran aproximadamente 12 veces más potentes que el péptido CGRP(837) de secuencia nativa no pegilado (tabla 4, SEO ID NO:1). Ambos conjugados (tabla 4, SEO ID NO:15 y SEO ID NO:16) disfrutan de un beneficio de potencia significativo de la modificación por ingeniería genética de un residuo básico no reactivo (por ejemplo, arginina) para sustituir a la lisina nativa en la posición 24 (en relación con la secuencia de aCGRP humana nativa) y de mover la lisina del sitio de conjugación a la posición 25 (en relación con la secuencia de aCGRP humana nativa). Por razones desconocidas, el conjugado que sustituye a un enlace tioéter (tabla 4, SEO ID NO:17) no se benefició del mismo reordenamiento en las posiciones 24 y 25 (en relación con la secuencia de aCGRP humana nativa), aunque el péptido no pegilado mostrara una mejora de más de 4 veces en la potencia (compárese en la tabla 4, la SEO ID NO:8 con la SEO ID NO:9). El sitio de conjugación también pudo moverse a la posición 23 (en relación con la secuencia de aCGRP humana nativa), por ejemplo, con la doble sustitución V23C, K24R (tabla 4, SEO ID NO:10 y SEO ID NO:11). De manera notable, cuando se pegilaba, este conjugado (tabla 4, SEO ID NO:18) era altamente potente, mostrando una CI50 = 0,16 nM en el ensayo in vitro de AMPc. Esto fue casi 31 veces más potente que el CGRP(8-37) de secuencia nativa no pegilada.

La invención no se limita a las moléculas de PEG o modificaciones de secuencia de péptido facilitadas a modo de ejemplo anteriormente. Por ejemplo, pueden lograrse conjugados vehículo-péptido eficaces en otras posiciones en la región de bisagra o en cualquiera de las regiones de unión del receptor de CGRP,. Además, la introducción de sitios de conjugación reactivos no se basa únicamente en sustituciones de secuencia con residuos de lisina o cisteína, , sino que puede incluir inserciones entre residuos existentes, o la adición de diferente aminoácidos reactivos. Además, puesto que esta invención puede utilizar péptidos sintéticos, pueden emplearse numerosas estrategias químicas para lograr la conjugación con el vehículo en sitios preferidos en el péptido CGRP. Finalmente, el propio vehículo no se limita a PEG, sino que puede incluir cualquiera de una amplia lista de polímeros, polisacáridos, proteínas o péptidos biocompatibles, tal como se describe en el presente documento.

Tabla 4. Ensayos in vitro de AMPc mediados por receptor de CGRP, (n=2-4) que comparan una variedad de antagonistas de péptido conjugado con PEG. Los conjugados varían en el sitio de pegilación (por ejemplo, posiciones de aminoácidos 23, 24 ó 25 en relación con la secuencia de aCGRP humana nativa), y sus químicas de unión respectivas (amina, amida o tioéter). Las modificaciones a la secuencia antagonista del péptido aCGRP(8-37) humano nativo se muestran en negrita. La conjugación con PEG específica de sitio se indica en el residuo subrayado.

sa:Q Unión a Secuencia CIM

Iil PEGde (nH) NO: 20 k

Ninguna VTHRlAOLLSRsGClVVK'N"NFVPTNVGSKAF-NH1 4,94

tling FVPTDVGPFAF-Ntl¡ 0,1.4

11 1S,NNFVP'TIJVGPFAf·Nl11 3,05

13 2.1.5

l} c-WVTHRLA,GLLSRSGGVVCNNFVPTDVGPFAfi'-Ntb 2,1.5

14 TIoéter c-WVTHRLAGttsRSGGW~FVPTDVGPFAF~NHI 2,20

1 Ninguna Ac-WVTI-iRLAGLLSRSOOVVRKNfVfTDVG rrAP-Nl:lz Q,:U

15 Amina Ac-WVTH~LAGLLSRSaOVVRKNFV?11>VGrFAI1-1'\H2 O!,42

U Amida Ac-WVTBRLAGLLSRSCJOYYRKNFVPTDVaPFAf.NH: 0,39

El Ninguna, Ac-WVTHRLAGL LSRSGGVVRCNFVPTDVúPFAP-N HJ o,SO

17 Ac-WVTHRLAGLLSRS(i{JVVR~NfVFrOY{¡PFAF-NH2 1,90

10 Ninguna ' Ac-WVTI-lR.LAGLLSRSGGVCRNNFVPTDVG PFA P-NHl 0,35

18 Tioéter Ae-WVnnU.AGLLSRSGGVCRNNFVPTOVGPI;'AF-NH2 I),:U'

1l. Ninguna Ác-WV'lHRLAOLLSRSGGVKRNN fVPTDVGPF A F-NR1 0,51

19 Amina .-\c-WVníRLAGLLSRSGG VKRNNfVPTDVGPF,", f -NH;¡ 0,98

:3 CGGGGGGGVTHRL4.GLLSRSGGVV[{¡'\fNFVPTDVGPFA 0,72

tlinguna

F-NH:1

~CGGGGGGVtHRLAGLLSRSGGVVK'NNFVPTDVGPFA

F-NH1

Ejemplo 3. Semividas circulantes aumentadas in vivo medidas mediante ELlSA

Normalmente, los péptidos inyectados se metabolizan rápidamente, con semividas circulantes del orden de minutos. (Felix, A., Site-specific Poly(ethylene glycol)ylation of peptides, ACS Symposium Series 680 (Polyethylene glycol), 218-238 (1997)). En el presente ejemplo, se demuestra que los péptidos de la invención superan este obstáculo proporcionando un perfil farmacocinético prolongado in vivo.

En un experimento, se dosificaron a cada ratón C57 Black 6 (n=5 por punto de tiempo) por vía subcutánea 5 mg/kg de PEG-CGRP (tabla 4, SEO ID NO:15) a t = O. Entonces se sacrificó cada grupo a t=4, 24, 48 Y 72 h Y se sometió a ensayo el plasma mediante ELlSA de tipo "sándwich" para determinar la concentración de péptido CGRP.

El sistema de ELlSA empleado utiliza anticuerpos específicos para cada uno de los respectivos extremos del péptido y cuantifica de manera precisa el péptido CGRP funcional. En resumen, se recubrieron los pocillos de una microplaca con reactivo de captura de anticuerpo policlonal anti-C-CGRP (pAb; 0,050 Jlg/pocillo, incubación durante la noche a 4°C) generado contra el dominio C-terminal de un péptido CGRP modificado aCGGGGGGGPTOVGPFAF-NH2 (SEO ID NO:45; designado "cgCGRP27"). Se lavaron los pocillos y se bloquearon con tampón I-Block (Tropix, Bedford, MA). Se pretrataron las muestran en tampón I-Block 1 :10 para lograr una concentración de plasma final del 5% o el 10% (de roedor o ser humano); se llevaron a cabo diluciones de las muestras en I-Block, en plasma coincidente al 5% o al 10%. Se añadieron muestras diluidas (50 JlI/pocillo) a pocillos recubiertos con anti-C-CGRP y se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas con agitación, tras lo cual se lavaron los pocillos con tampón I-Block (4°C) para eliminar el péptido CGRP no unido. Se añadió conjugado de a-NCGRP pAb marcado con peroxidasa del rábano (HRP), específico para el dominio N-terminal de CGRP aCGGGGGGVTHRLAGLLSRSGGVVKNNFVPTOVGPFAF-NH2 (SEO ID N0:46) en tampón I-Block y se añadió a los pocillos y se incubó durante 1 hora (a temperatura ambiente con agitación), para la detección del péptido CGRP capturado. Tras otra etapa de lavado, se añadió sustrato Pico (Bio FX Laboratories) a los pocillos creando una señal luminiscente proporcional a la cantidad de péptido CGRP unido por el reactivo de captura en la etapa inicial. Se midió la intensidad de luminiscencia con un luminómetro. Se prepararon muestras patrón (STO) y de control de calidad (OC) mediante adiciones conocidas de cgCGRP-27 en plasma coincidente al 100%, se cargaron en pocillos tras el pretratamiento y en tampón I-Block 1:10 y diluciones adicionales en tampón I-Block, y se sometieron a ensayo por lo demás según el método de ELlSA descrito anteriormente.

La tabla 5 muestra resultados que demuestran un aumento en la semivida farmacocinética lograda por antagonistas de péptidos CGRP conjugados con vehículo de la presente invención. Se administró por vía subcutánea PEG-CGRP (PEG de 20 kDa; secuencia de péptido CGRP en la tabla 4, SEO ID NO:15) a 5 mg/kg a ratones C57 Black 6 (n = 5), Y se tomaron muestras de plasma a los puntos de tiempo (t = 4, 24, 48 Y 72 horas). Se usó ELlSA tal como se describe en el presente documento anteriormente para detectar el péptido CGRP intacto, que persistió in vivo durante al menos 72 horas.

Tabla 5. Estabilidad in vivo de PEG-péptido CGRP (PEG de 20 kDa; péptido CGRP SEO ID NO:15, 5 mg/kg) en ratones C57 Black 6 (n = 5) tras inyección subcutánea. Los valores de concentración son media ± DE

24 48 72 Conc. de péptido CGRP (ng/ml)

33 ± 12 7±1 1±0

Ejemplo 4. Estabilidad aumentada de un antagonista de péptido CGRP conjugado con vehículo en plasma.

Aunque el notable aumento en la semivida circulante de un antagonista de péptido PEG-CGRP demostrada en el ejemplo 3 se debe lo más probablemente a una disminución del aclaramiento renal, también es posible que el péptido conjugado con PEG disfrute de algo de protección adicional frente a la degradación proteolítica. Para someter a prueba esta hipótesis, se realizaron experimentos in vitro que comparaban la estabilidad de un antagonista de péptido PEG-CGRP (SEO ID NO:15) con su péptido parental no pegilado (es decir, SEO ID NO:7) en plasma de ratón al 5% a temperatura ambiente. Se realizaron adiciones conocidas de muestras de péptido a 2 mg/ml en PBS con plasma de ratón al 5% y se analizaron mediante ELlSA de tipo "sándwich" (tal como se describe en el ejemplo 3 en el presente documento a continuación) a lo largo de 48 horas a temperatura ambiente. Se determinó la integridad del péptido mediante ELlSA de tipo "sándwich" que requería extremos terminales del péptido intactos. Se realizaron controles de calidad a t = O, 4, 24 Y 48 horas antes de la preparación de la curva patrón y la cuantificación; la recuperación debe ser del 100% si no se pierde analito durante el análisis; se observó una recuperación del 80 -90% a t = OY representa la variabilidad del ensayo. La semivida del péptido PEG era más de 9 veces más larga que la del péptido parental no pegilado (véase la tabla 6). Claramente, la conjugación con vehículo confirió estabilidad adicional al péptido CGRP en presencia de plasma.

Tabla 6. Recuperación in vitro de péptido CGRP no conjugado (SEO ID NO:7) en comparación con péptido CGRP conjugado con vehículo (SEO ID NO:15) en plasma de ratón al 5%. Los valores son la media (%) ± DE.

Tiempo (h)

O 4 24 48

SEO ID NO:7 112,1 ± 1,8 46,1 ± 60,1 2,509 ± 0,573 1,812 ± 0,754

SEO ID NO:15 82,84 ±8,68 93,93 ± 15,52 55,83 ± 15,77 26,21 ± 3,32

Ejemplo 5. Sustituciones en la secuencia del péptido CGRP para proteger frente a la proteólisis mientras que se conserva la potencia.

A pesar de la protección significativa proporcionada a CGRP mediante esta invención frente a la degradación proteolítica (ejemplo 4) y el aclaramiento renal in vivo (ejemplo 3), todavía se detectaron fragmentos seleccionados de CGRP en estos experimentos. Para determinar los sitios de escisión proteolítica más lábiles, se realizaron adiciones conocidas de análogo de CGRP, SEO ID NO:7 (tabla 3) en plasma de rata a 2,5 mg/ml y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Entonces se diluyeron las muestras 10 veces con agua y se analizaron mediante CUEM. Se detectaron los fragmentos de CGRP designados M1-M8 (figura 2), produciéndose las principales escisiones tras R11, L16, S17 Y R18 (en relación con la secuencia de aCGRP humana). Combinados con los datos de la bibliografía (por ejemplo, LeGreves et al., Regulatory Peptides, 25:277-286 (1989); Katayama et al., Peptides, 12:563-567 (1991); Tam y Caughey, Degradation of airway neuropeptides by human lung tryptase, Am. J. Resp. Cell Mol. Biol., 3(1):27-32 (1990)), para los sitios proteolíticos de aCGRP humano, R11, L15, L16, S17 Y R18 son posibles sitios de riesgos proteolíticos importantes. Desafortunadamente, los residuos R11, L16 y R18 se han identificado anteriormente como importantes para la unión al receptor y la actividad antagonista. A.C. Conner et al., Interaction of Calcitonin-Gene-Related Peptide with its Receptors, Biochemical Society Transactions 30:451-455 (2002); Howitt et al., British Journal of Pharmacology, 138:325-332 (2003)). No obstante, se diseñaron varios análogos resistentes a proteasas con modificaciones en R11, L16 y/o R 18 con la esperanza de conservar suficiente actividad para un antagonismo eficaz del receptor CGRP1.

Se seleccionaron sustituciones para arginina basándose en la conservación de la carga y el potencial de unión por puentes de hidrógeno. Se sintetizaron los análogos como sustituciones o bien únicas o bien dobles con homoarginina, D-arginina, citrulina, alanina o glutamina en las posiciones 11 y/o 18 (en relación con la secuencia de aCGRP humana nativa). Se sometió a prueba cada análogo antes y después de la pegilación para determinar la actividad in vitro en el ensayo de AMPc tal como se describe en el ejemplo 1.

La tabla 7 muestra los resultados de los ensayos in vitro de AMPc mediados por el receptor de CGRP1 que comparan una variedad de análogos de péptidos CGRP sustituidos en las posiciones R11 y/o R18 (en relación con la secuencia de aCGRP humana nativa). También se muestran los efectos de la pegilación y el tipo de unión sobre la actividad antagonista del receptor de CGRP1 tal como se mide mediante el ensayo de AMPc. Las modificaciones en la secuencia del antagonista de aCGRP(8-37) humana nativa se muestran en negrita. La pegilación específica de sitio se indica en el residuo subrayado. En general, se toleraban bien análogos de homoarginina de sustitución única no pegilados (tabla 7, SEO ID NO:21 y SEO ID NO:23), que conservan su actividad antagonista del receptor de CGRP1 cuando se pegilan con PEG de 20 kDa mediante una unión amina (tabla 7, SEO ID NO:22 y SEO ID NO:24). Sin embargo, un mutante de homoarginina doble no pegilado (tabla 7, SEO ID NO:25) mostró una actividad antagonista reducida de aproximadamente 5 veces en relación con cualquiera de los péptidos no pegilados con sustituciones únicas (es decir, SEO ID NO:21 y SEO ID NO:23). Cuando se pegiló este péptido de sustitución doble (tabla 7, SEO ID NO:26), la actividad antagonista retornó a los niveles de los dos péptidos con sustituciones únicas.

Los análogos sustituidos con citrulina mostraban un patrón similar a análogos sustituidos con homoarginina, en los que las sustituciones únicas en cualquiera de las posiciones 11 ó 18 (tabla 7, SEO ID NO:27 y SEO ID NO:29) se toleraban bien, presentando la sustitución doble (tabla 7, SEO ID NO:31) un antagonismo del receptor de CGRP1 de sólo aproximadamente 3 veces menos potente que cualquier sustitución única. Sin embargo, todos los análogos sustituidos con citrulina padecían alguna pérdida relativamente minoritaria de actividad antagonista in vitro cuando se pegilaban (tabla 7, SEO ID NO:28, SEO ID NO:30 y SEO ID NO:32), presentando el análogo de sustitución única R18Cit la mejor Clso de estos.

Inicialmente, se sometieron a prueba sustituciones con aminoácidos naturales, alanina, glutamina y D-arginina como

sustituciones únicas en la posición R18 (en relación con la secuencia de aCGRP humana nativa) y en el contexto de un sitio de pegilación de cisteína en la posición 25 (en relación con la secuencia de aCGRP humana nativa; tabla 4, SEO ID NO:8). Aunque la alanina en esta posición (tabla 7, SEO ID NO:33) no se toleraba bien en cuando a la actividad antagonista in vitro medida mediante el ensayo de AMPc, fue sorprendente descubrir que la glutamina (tabla 7, SEO ID NO:35) y D-arginina (SEO ID NO:41) se toleraban bien ambas en cuanto a actividad antagonista medida mediante el ensayo de AMPc mediado por el receptor de CGRP1. Desafortunadamente, cuando se pegilaron, los análogos de tanto glutamina (tabla 7, SEO ID NO:36) como D-arginina (tabla 7, SEO ID N0:42) de sustitución única padecían una gran pérdida de actividad antagonista in vitro, mayor de 12 veces y mayor de 32 veces, respectivamente.

Al observar que en el contexto de un enlace amina los análogos sustituidos con homoarginina (tabla 7, SEO ID NO:26) y sustituidos con citrulina (tabla 4, SEO ID NO:32) pegilados parecían conservar mayor potencia, se prepararon un par de análogos de sustitución con glutamina única (tabla 7, SEO ID NO:37) y doble (tabla 7, SEO ID NO:39) con lisina en la posición 25 (en relación con la secuencia de aCGRP humana nativa) en lugar de cisteína. De manera notable, cuando el análogo de glutamina de sustitución única (tabla 7, SEO ID NO:38) se pegiló en este contexto, usando una unión ami na, entonces el conjugado resultante era más de 42 veces más potente que el análogo de péptido CGRP equivalente que se pegiló con un enlace tioéter (tabla 7, SEO ID NO:36). De manera similar, el análogo de glutamina de sustitución doble pegilado a través de un enlace amina (tabla 7, SEO ID N0:40) también mostró una potencia in vitro razonablemente buena. Estos resultados refuerzan las observaciones previas de que la pegilación a través de una unión amina conserva el mayor porcentaje de la potencia del análogo. El acoplamiento con amina de PEG a análogos sustituidos con glutamina (tabla 7, SEO ID NO:38 y SEO ID NO:40) dio como resultado antagonistas de péptidos CGRP conjugados con vehículo potentes.

Tabla 7. Ensayos in vitro de AMPc mediados por el receptor de CGRPl que comparan una variedad de análogos de estabilidad sustituidos en las posiciones R11 y/o R18 (en relación con la secuencia de aCGRP humana nativa). También se muestran los efectos de la pegilación y el tipo de enlace sobre la actividad antagonista. Las modificaciones en la secuencia de antagonista de aCGRP(8-37) humana nativa se muestran en negritas. Se indica la pegilación específica de sitio en los residuos subrayados.

SEQ Unión a CISIJ 'ID PEG ele Secuencia (nM)20 kDa

NO: 21 Ninguna Ac-WVTH(bR)LAGLLSRSGGVVRKNFVPTDVGPFAF-NH2 0,44 21 Amina A(:-WVTH(bR)LAGLLSRSGGVVRKNFVPTDVGPFAF~N}f2 0,36 23 Ninguna Ac-WVTHRLAGLLS(hR)SGGVVRKNFVPTDVGPFAF-NHl 0,57 24 Amina Ae-WVTHRLAGLLS(bR)SGGVVRKNFVPTDVGPFAF-NH2 0.33 2S Ác-WVTH(hR)LAGLLS(hR)SGGVVRKNFVPTDVGPFAF-2.1

Ninguna

NH:!. . 26 Ac-WVTH(hR)LAGLLS(hR)SGGVVRKNFVPTDVQPFAF-0,37

Amina

NH2 27 Ninguna Ac-WVTH(Cit)LAGLLSRSGGVVRKNFVPTDVGPFAF-NHz 0.57 28 Amina Ac-WVTH(Cit)LAGLLSRSGGVVRKNFVPTDVGPFAF-NHa 2,08 29 Ninguna Ac-WVTHRLAGLLS(Cit)SGGVVRKNFVPTDVGPFAF-NH2 0.58 30 Amina ÁC-WVTHRLAGLLS(Cit)SGGVVRKNFVPTOVGPFAF-NH~ 0,96

·31 Ac-WVTH(Cit)LAGLLS(Cit)SGGVVRKNFVPTDVGPFAf-J.8

Ninguna

NH2 32 Ac-WVTH(Cit)LAGLLS(Cit)SGGVVRKNFVPTDVGPFAF-3.74

I Amina NH1

33 Ninguna Ac-WVTHRLAGLLSASGGVVRCNFVPTDVGPFAF-NH2 2.75 34 Ac-WVTHRLAGLLSASGGVVR&NFVPTDVGPFAF -NH2 6,2

Tloéter

-

35 Ninguna Ac~WVTHRLAGLLSQSGGVVRCNFVPTDVGPFAF-NHl 0,3.7 ·36 Ac-WVTHRLAGLLSQSGG VVRCNFVPTDVGPFAF-NH! 4,69

Tioéter

37 Ninguna Ac-WVTHRLAGLLSQSGGVVRKNFVPTDVGPFAF-NH1 0,56 38 Amina Ac-WVTHRLAGLLSQSGGVVR,KNFVPTDVGPFAF-NHz 0.1J 39 Ninguna Ac-WVTHQLAGLLSQSOGVVRKNFVPTDVGPFAF-NHz 0.53 40 Amina Ac~WVTHQLAGLLSQSOGVVRKNFVPTDVGPFAF·NH2 1.33 41 Ninguna Ac-WVTHRLAG LLSrSGGVVRCNFVPTDVGPFAF-NH2 0.59 42 Ac-WVTHRLAGLLSrSGGVVRCNFVPTDVGPF AF-NH2 J9.42

Tioéter

Ejemplo 6. Estabilidad in vitro de antagonistas de péptidos CGRP en plasma de mamífero

5 En el ejemplo 5, se identificaron varios análogos de CGRP potentes con mutaciones diseñadas para resistir la proteólisis en las posiciones R11 y R18 (en relación con la secuencia de aCGRP humana nativa). Aunque algo menos activos en el ensayo de in vitro AMPc (pero con una CI50 todavía inferior a 10 nM), estos análogos de CGRP podían demostrar ser incluso más eficaces in vivo, si les liberaba del riesgo proteolítico asociado con los residuos R11 y R18 nativos.

En consecuencia, se evaluó la estabilidad de análogos no pegilados, seleccionados in vitro en presencia de plasma humano o de rata al 10%. Brevemente, se diluyeron muestras de cada péptido hasta 100 ng/ml en PBS que contenía plasma humano o de rata al 10%. Entonces se incubó cada muestra a temperatura ambiente y se analizó mediante CL-EM/EM para cuantificar el péptido intacto que quedaba a puntos de tiempo seleccionados a lo largo de 6 horas.

Los análogos de péptidos CGRP sometidos a prueba fueron el análogo disustituido (R11 hR/R18hR) (tabla 7, SEO ID NO:25), el análogo disustituido (R11 CitlR18Cit) (tabla 7, SEO ID NO:31), el análogo disustituido (R11 O/R180) (tabla 7, SEO ID NO:39), el análogo monosustituido (R180) (tabla 7, SEO ID NO:37) y como control, el análogo no sustituido (R11/R18) (tabla 4, SEO ID NO:7).

Cuando se expusieron a plasma de rata al 10%, el péptido control (tabla 8, SEO ID NO:7) y el análogo monosustituido (R180) (tabla 8, SEO ID NO:37) persistieron ambos a aproximadamente el 10% de la concentración de partida hasta 2,5 h Y se redujeron al 50% a aproximadamente 45 minutos (tabla 8). Los tres análogos disustituidos (R11 hR/R18hR [SEO ID NO:25J, R11 CitlR18Cit [SEO ID NO:31] y R11 Q/R180 [SEO ID NO:39]) eran muy similares en sus perfiles de degradación, quedando un 10% a aproximadamente 5 horas y un 50% a aproximadamente 1 ,5 horas.

En cambio, cuando se expusieron a plasma humano al 10%, el péptido control (tabla 9, SEO ID NO:7) y el análogo monosustituido (R180) (tabla 9, SEO ID NO:37) persistieron ambos a aproximadamente el 10% de la concentración de partida y hasta aproximadamente 1 hora y se redujeron al 50% a < 30 minutos (tabla 9). A diferencia de en el experimento con plasma de rata (tabla 8), en plasma humano el análogo (R11 hR/R18hR [tabla 9, SEO ID NO:25]) demostró ser menos estable que los otros análogos disustituidos, quedando un 10% a aproximadamente 2 horas y un 50% detectable a aproximadamente 30 minutos. Los otros dos análogos de disustitución (R11CitlR18Cit -SEO ID NO:31 y R110/R180 -SEO ID NO:39) eran muy similares en sus perfiles de estabilidad, quedando un 10% a aproximadamente 4 horas y un 50% a aproximadamente 1 hora.

Estos dos experimentos (tabla 8 y tabla 9) demostraron los efectos beneficiosos de añadir sustituciones resistentes a proteólisis en las posiciones R11 y R18 de antagonistas de péptidos CGRP. Aún cuando los perfiles de degradación del péptido eran más rápidos en plasma humano (tabla 9) que en plasma de rata (tabla 8), la clasificación de estabilidad relativa era la misma en plasma de cualquier especie: SEO ID NO:7 (R11/R18) < SEO ID NO:37 (R11/R180) < SEO ID NO:25 (R11hR/R18hR) < SEO ID NO:31 (R11CitlR18Cit) =SEO ID NO:39 (R11Q/R180).

En algunos experimentos adicionales, se incubaron péptidos CGRP a temperatura ambiente en plasma al 100% (humano o de mono) a una concentración inicial de 10 ¡lg/ml. En resumen, a los puntos de tiempo de O horas y 4 horas, se tomaron muestras de plasma de 100 ¡ll, seguido inmediatamente por extracción en fase sólida. Se recogieron las muestras extraídas para el análisis mediante CL-EM/EM. Se llevó a cabo la CL-EM/EM en un sistema de CL Agilent 1100 LC equipado con una trampa iónica Thermo Finnigan LCO. Se llevó a cabo la separación por cromatografía de líquidos de alta resolución en una columna de fase inversa C18. Se usó detección espectrométrica de masas en tándem dependiente de los datos para la secuenciación de péptidos. Se realizó una comparación de la identificación metabólica in vitro de péptido CGRP SEO ID NO:658, el péptido "parental" no pegilado del péptido CGRP pegilado SEO ID No:172 (figura 9) y péptido CGRP SEO ID NO:144, el péptido "parental" no pegilado del péptido CGRP pegilado SEO ID NO:173 (figura 10) en plasma humano al 100%. Los resultados en la figura 9 y la figura 10 muestran que los dos análogos de CGRP (R11CitlR18CitlR24hR/P340ic, [SEO ID NO:658], R11CitlR18CitlR24hR/F35Nal, [SEO ID NO:173]) eran relativamente estables tras cuatro horas de incubación en plasma humano al1 00%. El producto de degradación principal para el péptido SEO ID NO:658 era el fragmento W7hR24. Había más sitios de escisión para el péptido CGRP SEO ID NO:173; los productos de degradación proteolíticas eran los fragmentos W7-P34, W7-hR24 y W7-N26.

La figura 11 muestra los resultados de la identificación metabólica in vitro del péptido CGRP SEO ID NO:658, el péptido "parental" no pegilado del péptido CGRP pegilado SEO ID NO:172 en plasma de mono Cynomolgus al 100%. Los resultados indican que había diferencias en la estabilidad in vitro en plasma humano y de mono. El producto de degradación principal para el péptido CGRP SEO ID NO: 658 era el fragmento W7-K25 en plasma de mono en lugar del fragmento W7-hR24 en plasma humano. (Además, véase el ejemplo 7 a continuación en el presente documento para la comparación con la identificación metabólica in vivo).

Tabla 8. Estudio de estabilidad in vitro de péptidos CGRP en plasma de rata al 10%. Se expusieron muestras de cada análogo de péptido CGRP a 100 ng/ml a plasma de rata al 10% a temperatura ambiente y se analizaron mediante CL-EM/EM para determinar el % de péptido restante a cada punto de tiempo.

% restante

SEO ID NO

Oh 0,5 h 1 h 2h 3h 4h 5h 6h

37

100,0 62,7 39,5 10,5 4,7 2,5 1,3 0,7

39

100,0 83,8 66,2 29,9 20,4 11,8 6,4 4,0

7

100,0 55,4 34,5 8,0 5,2 1,4 1,7 0,6

31

100,0 82,3 59,0 26,1 18,5 10,1 5,2 3,3

25

100,0 76,9 58,1 27,5 21,3 16,3 11,0 7,1

79

Tabla 9. Estudio de estabilidad in vitro de péptidos CGRP en plasma humano al 10%. Se expusieron muestras de cada análogo de péptido CGRP a 100 ng/ml a plasma humano al 10% a temperatura ambiente y se analizaron mediante CL-EM/EM para determinar el % de péptido restante a cada punto de tiempo.

% restante

Pé~tido

Oh 0,17 h 0,5 h 1 h 2h 3h 4h 5h 6h

SEO

ID 100,0 59,0 20,6 10,0 2,3 1,3 0,7 0,7 0,0

NO:37

SEO

ID 100,0 74,2 54,0 50,2 36,7 15,8 11,3 6,3 5,2

NO:39

SEO ID NO:7

100,0 60,3 13,8 4,9 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

SEO

ID 100,0 73,0 52,8 44,0 34,9 15,3 11,8 6,1 5,9

NO:31

SEO

ID NO: 100,0 88,3 47,3 28,7 11,0 5,4 3,1 3,6 2,8

25

Ejemplo 7. Estudios farmacocinéticos (PK).

Estudios farmacocinéticos en rata. Los resultados de los estudios farmacocinéticos (PK) de algunos antagonistas de péptidos CGRP conjugados con PEG, realizados en ratas Sprague-Dawley macho, se muestran en la tabla 10. Había tres ratas por grupo (n =3), pesando cada una 250-325 g. Cada grupo recibió una administración diferenciada

o bien intravenosa o bien subcutánea de 2 mg/kg. El volumen de dosis aproximado fue de 0,3 mi por rata. Se tomaron aproximadamente 0,25 mi de sangre completa por punto de tiempo a los siguientes tiempos de recogida tras la dosis para los grupos intravenosos (en horas): 0,083, 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48, 72, 96 Y los siguientes puntos de tiempo para los grupos subcutáneos (en horas): 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48, 72, 96. Se recogieron muestras de sangre completa en viales Microtainer que contenían EDT A como anticoagulante y se mantuvieron en hielo húmedo hasta que se procesaron para obtener plasma. Se obtuvo el plasma centrifugando la sangre completa durante aproximadamente 5 min a 11.500 rpm. Se transfirió el plasma a tubos nuevos y se almacenaron congelados a aproximadamente -70°C hasta el análisis cuantitativo. Se realizó el análisis para la cuantificación de los péptidos CGRP conjugados con vehículo según el método de ELlSA descrito en el ejemplo 3 anteriormente, usando plasma de rata. Se calculó el promedio de las concentraciones de muestras individuales para cada punto de tiempo (n = 3) dentro de un grupo de dosis dado usando el software Excel 2000. Se analizaron los datos de concentración plasmática promedio-tiempo mediante métodos no compartimentales usando el software WinNonlin v.3.3. Se usaron tiempos de muestra nominales en el análisis farmacocinético. Se calculó el área bajo la curva de concentración-tiempo usando el método lineal/trapezoidal logarítmico para determinar la exposición.

Los resultados en la tabla 10 demuestran un perfil farmacocinético global potenciado para el antagonista de péptido CGRP conjugado con vehículo que tiene la SEO ID NO:32 (incluyendo sustituciones R11 Cit, R18Cit en su secuencia de aminoácidos en relación con la secuencia de aCGRP humana nativa), en comparación con un antagonista de péptido CGRP conjugado con vehículo que tiene la SEO ID NO:15, mientras que los resultados para SEO ID NO:26 y SEO ID N0:40 eran más similares a los de SEO ID NO:15. Tras la administración intravenosa, el tiempo de residencia medio (MRT) era 4 veces más largo para el antagonista de péptido CGRP conjugado con vehículo que tenía la SEO ID NO:32, en comparación con el antagonista de péptido CGRP conjugado con vehículo que tenía la SEO ID NO:15. Tras la administración subcutánea, la exposición (AUC) aumentó en aproximadamente 15 veces, dando como resultado una biodisponibilidad aumentada (F%) del 47% frente al 12%. Por tanto, las sustituciones R11 Cit, R18Cit proporcionaron el mejor perfil PK global de los cuatro péptidos sometidos a prueba in vivo.

Tabla 10. Resultados de farmacocinética de antagonistas de péptidos CGRP conjugados con vehículo realizada en ratas Sprague-Dawley macho. La inyección (dosis = 2 mglkg) fue subcutánea (s.c.) o intravenosa (i.v.). Se disolvieron los antagonistas de péptidos CGRP conjugados con vehículo en disolución acuosa (acetato de sodio 1°mM, sorbitol al 5%, pH 4,0). Todos los valores representan la media, n = 3. Las secuencias de péptido CGRP enumeradas se describen en detalle en las tablas 2B, 4 Y 7.

s.c.

Péptido Tmáx. (h} Cmáx. tv., (h} AUCo-t AUCa-in! CKlF F% (ng/ml) (ng·h/ml) (ng·h/ml) (ml/h/kg)

SEOID 2,00 137 22,37 1264 1542 1257 12% NO:15 SEO ID 2,00 143 26,17 1188 1204 1660 5% NO: 26 SEO ID 4,00 1879 29,98 18933 19046 105 47% NO:32 SEOID 4,00 121 27,15 1212 1223 1634 11% NO:40

SEO ID 4,67 662 ND 4349 4375 647 14%

NO:172

SEOID 4,00 643 ND 4385 4396 461 5%

NO: 173

Péptido tv" .lbl AUCa-t AUCa-int Cl Vss MRT

(ng·h/ml) (ng·h/ml) (ml/h/kg) (ml/kg) .lbl

SEO ID 10,60 12940 12959 154 174 1,10

NO:15

SEO ID 7,39 24546 24555 81 83 1,01

NO: 26

SEO ID 42,78 40250 40431 49 204 4,12

NO:32

SEO ID 32,57 10651 10666 187 496 2,63

N0:40

SEOID ND 31494 31543 64 117 1,82

NO:172

SEO ID ND 80440 80996 27 125 4,97

NO:173

Estudios farmacocinéticos en monos. la tabla 11 muestra los resultados de estudios farmacocinéticos de algunos antagonistas de péptidos CGRP conjugados con PEG y no conjugados ("desnudos") de la presente invención, realizados en monos Cynomolgus macho. Se realizó un panel de química sanguínea completo en cada mono antes de cada día de estudio para obtener valores basales y garantizar la recuperación hematológica. Se colocó un catéter en la vena cefálica de tres monos Cynomolgus macho (Macaca fascicularis) para la toma de muestras de sangre durante el estudio. Para la rama intravenosa (i.v.) del estudio, también se colocó un catéter en una vena safena para la infusión de compuesto de prueba. En cada día de estudio, se colocaron los monos en sillas de restricción durante las primeras 4 h del estudio para facilitar la administración del fármaco y la toma de muestras de sangre. Para la administración del antagonista, cada mono recibió péptido solubilizado (dosis y SEO ID enumeradas en la tabla 11 a continuación) o bien como una infusión intravenosa de 30 min (4 ml/kg/h) o bien como un único bolo subcutáneo (aproximadamente 1,0 mi/animal). Se recogieron muestras de sangre de cada animal de estudio a diversos tiempos durante y tras la administración del fármaco, se aislaron muestras de plasma (100 ¡..tI) mediante centrifugación y se almacenaron a -70aC hasta su análisis. Para monos que recibieron infusión intravenosa, también se tomó una muestra de este tipo a los 20 min durante la infusión.

Tal como se muestra en la tabla 11, el péptido de SEO ID NO:172 presentaba bajo aclaramiento plasmático, un volumen pequeño de distribución y un tiempo de residencia medio (MRT) de 2,5 h. la exposición tras la administración subcutánea de ambos péptidos CGRP conjugados con PEG evaluados era varias veces más alta en primates no humanos en comparación con ratas (tabla 10). la mejor exposición parece deberse a una mejor absorción tras la administración subcutánea, a un aclaramiento plasmático inferior y a volúmenes de distribución más pequeños en el primate no humano en comparación con la rata (véase la tabla 10).

Se analizó la identificación metabólica del péptido CGRP SEO ID NO:658 (secuencia dada a conocer en la tabla 2B), el péptido "parental" del péptido CGRP pegilado SEO ID NO:172 en monos que recibieron una infusión intravenosa del mismo (muestra tomada a los 20 min durante la infusión). Se tomaron las muestras tal como se describió anteriormente. Tras descongelar, se extrajo cada muestra de plasma de 100 ¡..tI mediante extracción en fase sólida. Se recogieron las muestras extraídas para el análisis mediante Cl-EM/EM. Se llevó a cabo la Cl-EM/EM en un sistema de Cl Agilent 1100 equipado con una trampa iónica Thermo Finnigan lCO. Se llevó a cabo la separación por cromatografía de líquidos de alta resolución en una columna de fase inversa C18. Se usó detección espectrométrica de masas en tándem dependiente de los datos para la secuenciación de péptidos. El resultado se muestra en la figura 12, e indica que también había diferencias significativas entre la estabilidad in vivo e in vitro para el mismo péptido CGRP SEO ID NO: 658 (identificación metabólica in vitro realizada tal como se describe para plasma humano al 100% en el ejemplo 6 en el presente documento anteriormente; figura 11). Se observaron más sitios de escisión en la muestra de plasma del estudio de infusión i.v. los productos de degradación fueron los fragmentos W7-T9, T30-A36, W7-N26, T30-F37 y W7-hR24.

Tabla 11. Resultados de farmacocinética de antagonistas de péptidos CGRP conjugados con vehículo realizada en monos Cynomolgus macho. la administración fue mediante infusión intravenosa (4 ml/kg/h) o como un único bolo subcutáneo (aproximadamente 1,0 mi/animal). Todos los valores representan la media, n = 3.

MONO s.C.

Péptido Dosis T máx. (h) Cmáx. AUCo-t AUCa-int CUF (mg/kg) (ng/ml) (ng·h/ml) (ng·h/ml) (ml/h/kg) SEO ID NO:172 0,8 5,33 3597 24718 24,773 28 51%

(tabla 2B) SEO ID NO:173 0,8 5,33 1691 11842 12,195 68 Na (tabla 2B)

MONO i.v.

Péptido Dosis T% (h) AUCo-t AUCO-int CL VSS MRT (mg/kg) (ng·h/ml) (ng·h/ml) (ml/h/kg) (ml/kg) (h) SEO ID NO:172 1,56 2,3 98,843 98,887 16 41 2,54 (tabla 2B) SEO ID NO: 658 6,0 0,8 16,942 16,964 399 174 0,42 (péptido desnudo; tabla 2A)

Ejemplo 8. Conjugación mediada por codisolvente de vehículo a antagonistas de péptidos CGRP. Muchos de los péptidos CGRP que se desarrollaron para resistir la proteólisis (véase, por ejemplo, el ejemplo 4 en el presente documento) también demostraron ser considerablemente menos solubles que sus péptidos parentales (por ejemplo, en comparación con el parental relativamente soluble SEO. ID NO:7, dado a conocer en la tabla 4) en los tampones de conjugación acuosos usados para acoplar el vehículo al péptido (véase el ejemplo 2 en el presente documento). En un intento por solubilizar mejor estos péptidos menos solubles durante la reacción de conjugación, y de ese modo mejorar los rendimientos de conjugado, se sometieron a prueba una variedad de codisolventes de alcohol en la reacción de conjugación.

En resumen, se preparó una serie de reacciones de conjugación por alquilación reductora usando mPEG-ald de 20 kDa y el péptido CGRP relativamente soluble (tabla 4, SEO ID NO:7) tal como se describe en el ejemplo 2, con la excepción que se añadieron los alcoholes: metanol (MeOH), etanol (EtOH), isopropanol (lPA) y tri-fluoroetanol (TFE) cada uno a una razón de o bien el 25% o bien el 50% (v/v). Se monitorizó el progreso de cada reacción mediante RP-HPLC tras 20 h. Se cuantificó el producto de péptido monopegilado (tabla 4, SEO ID NO:15) mediante integración de los cromatogramas de RP-HPLC y se notificó como el % de pico de producto (figura 4). Estos resultados demuestran un efecto inhibidor por MeOH y EtOH sobre la pegilación de este péptido CGRP relativamente soluble mientras que IPA mostró poco efecto y sorprendentemente TFE mostró efectos tanto positivos como negativos, dependiendo de la concentración.

A continuación, se realizó una comparación entre el péptido CGRP relativamente soluble (secuencia dada a conocer en la tabla 4, SEO. ID NO:7) y un péptido CGRP relativamente insoluble (secuencia dada a conocer en la tabla 7, SEO ID NO:31). En este experimento, se pegilaron ambos péptidos mediante alquilación reductora, tal como se describe en el ejemplo 2, usando mPEG-ald de 20 kDa en presencia de o bien IPA al 50% o bien TFE al 50%. Se monitorizó el progreso de cada reacción mediante RP-HPLC tras 20 h. Se cuantificó el producto de péptido monopegilado (tabla 4, SEO ID NO:15 o tabla 7, SEO ID NO:32) mediante integración de los cromatogramas de RPHPLC y se notificó como el % de pico de producto (figura 5). Estos resultados duplican la mejora modesta en el rendimiento de producto (tabla 4, SEO ID NO:15) para el péptido CGRP más soluble también observado en la figura

4. Sorprendentemente, ambos codisolventes proporcionaron una mejora mucho más drástica en la eficacia de pegilación para el péptido CGRP relativamente insoluble (tabla 7, SEO ID NO:31), mostrando aumentos en los rendimientos de producto de 2,6 veces con IPA y 4,1 veces con TFE.

Se han pegilado más de 42 péptidos CGRP relativamente insoluble mediante este método en presencia de TFE al 50% con buen rendimiento de producto. Se produjeron al menos 34 de estos conjugados con un rendimiento de producto en exceso del 60% (datos no mostrados).

Con el fin de determinar las concentraciones óptimas de codisolvente para la pegilación de diferente péptidos CGRP, se realizaron experimentos de titulación a partir de codisolvente al 30-70% usando o bien IPA, TFE o bien alcohol hexafluoro-isopropílico (HFIPA o HF-i-PA). Se prepararon las reacciones de pegilación tal como se describe en el ejemplo 2 para la alquilación reductora con los tres alcoholes añadidos a sus concentraciones establecidas. Se monitorizó el progreso de cada reacción mediante RP-HPLC tras 20 h. Se cuantificó el producto de péptido monopegilado mediante integración de los cromatogramas de RP-HPLC y se notificó como el % de pico de producto. Desafortunadamente, HFIPA demostró ser parcialmente inmiscible en el tampón de reacción acuoso, lo que hace que los resultados de pegilación con el codisolvente de HFIPA sean difíciles de usar en el procedimiento existente.

La figura 6 muestra los efectos de IPA, TFE Y HFIPA sobre el péptido CGRP relativamente soluble (secuencia dada a conocer en la tabla 4, SEO ID NO:7) examinado anteriormente. Estos datos muestran poco efecto de IPA hasta que la concentración supera el 50%. A IPA al 70%, se observó un modesto aumento de 1,1 veces en el rendimiento de producto (secuencia dada a conocer en la tabla 4, SEO ID NO:15). Sin embargo, TFE al 70% muestra un aumento más significativo en el rendimiento de producto de 1,4 veces. HFIPA mostró un efecto máximo aparente de entre el 50-60%.

La figura 7 muestra el efecto de IPA, TFE Y HFIPA sobre un péptido CGRP relativamente insoluble AcWVTH[Cit]LAGLLS[Cit]SGGVV[hArg]KNFVPTDVGPFAF-NH2 SEO ID NO:739 (secuencia dada a conocer en la tabla 2B) no examinada anteriormente. Estos datos muestran un efecto mucho más pronunciado para los tres codisolventes, en los que IPA produjo un efecto máximo a IPA aproximadamente al 60% de un aumento de 1,8 veces en el rendimiento de producto para el péptido CGRP pegilado SEO ID NO:153. Con TFE, los resultados fueron incluso más drásticos, mostrando un aumento continuado en el rendimiento de producto que alcanza un máximo a TFE a aproximadamente el 70% y de 3,4 veces. HFIPA también indujo un aumento significativo en el rendimiento de producto (-3,2 veces) a codisolvente al 50%, pero los rendimientos disminuyen rápidamente a concentraciones de HFIPA superiores.

La figura 8 muestra el efecto de IPA, TFE Y HFIPA sobre un péptido CGRP relativamente insoluble SEO ID NO:658 no examinado anteriormente. Estos datos muestran un efecto mucho más pronunciado para los tres codisolventes, en los que IPA produce un efecto máximo a IPA aproximadamente al 70% de un aumento de 3,3 veces en el rendimiento de producto de péptido CGRP pegilado SEO ID NO:172. Con TFE, se logró el rendimiento máximo a TFE a aproximadamente el 70% con un aumento de 4,0 veces. De nuevo, el HFIPA proporciona un efecto máximo de un aumento de -4,0 veces a codisolvente al 50%, pero entonces los rendimientos disminuyen rápidamente a concentraciones de HFIPA superiores.

Conjuntamente, estos datos ilustran un beneficio de eficacia significativo e inesperado que se produce utilizando codisolventes en reacciones de pegilación para péptidos CGRP.

Ejemplo 9. Ensayo de flujometría sanguínea por láser doppler

Métodos. Se usa un dispositivo de flujometría sanguínea por láser doppler automatizado (MoorLOI®; Moor Instrument, Oevon, RU). Se encendió el dispositivo antes del inicio de los experimentos y se dejó calentar durante 20 minutos. Se leyeron los datos de flujo de sangre (en FLUX) a partir de registros de software (véase a continuación).

Para cada rata, se realizó el procedimiento experimental en el plazo de un único día y se sacrificó cada rata el mismo día inmediatamente tras terminar el experimento. En un día de experimento, se pesó cada rata y se le administró 1 ml/kg (inyección intramuscular en la pierna derecha) de un cóctel de anestésicos que consistía en ketamina, xilazina y PBS (5:3:2). Entonces se colocó cada rata en su jaula durante 15 min para permitir el comienzo de la anestesia, tras lo cual se afeitó la superficie ventral (abdomen) del cuerpo. Se colocó un pequeño punto cerca del centro del abdomen usando un marcador. El animal estaba entonces listo para el experimento.

Se recogieron aproximadamente 20 min tras la inyección del cóctel de anestésicos las lecturas de flujo de sangre basal para cada animal. Se colocó cada rata bajo el dispositivo de exploración láser doppler, haciendo coincidir el láser con el punto marcador en el abdomen. Usando el paquete de software del dispositivo, se activó el dispositivo y se exploró la superficie del abdomen durante 1 min con el láser. El área de exploración fue de 4 cm x 4 cm. El paquete de software asociado con el dispositivo calcula un valor de flujo de sangre con unidades arbitrarias.

Tras la finalización de la exploración basal, se retiró la rata del dispositivo. La rata recibió entonces una inyección de antagonista de péptido CGRP (péptido CGRP pegilado o el correspondiente péptido CGRP no conjugado ["parental"]) o su vehículo control mediante inyección intravenosa a través de la vena dorsal del pene o por vía subcutánea en el costado derecho dorsal. Tras un intervalo predeterminado, basándose en las características farmacocinéticas del antagonista de péptido CGRP relevante, se inyectó agonista (aCGRP humano; 0,1 ll9, 50 lll; interdérmico) de manera que el punto de entrada de la aguja (calibre 30) estaba alejado del punto marcador pero el bolo de inyección intradérmica estaba centrado bajo el punto.

A los 10 min tras la inyección de haCGRP (agonista), se colocó la rata bajo el láser de nuevo para explorar el abdomen en el punto de tiempo de 10 mino A los 30 min tras la inyección de haCGRP (agonista), se colocó la rata bajo el láser una última vez para explorar el abdomen en el punto de tiempo de 30 mino Los parámetros de exploración fueron los mismos que se emplearon en el nivel basal.

Inmediatamente tras la exploración a los 30 min tras hCGRP, se recogió una muestra de sangre de cada rata a través de punción cardiaca usando una jeringuilla de calibre 21. Se obtuvieron aproximadamente 200 III de plasma mediante centrifugación inmediata de 400 III de sangre completa a 14000 x g durante 10 min a 4°C. Se sometieron las muestras de plasma a determinación analítica de la concentración plasmática.

Tras la finalización de todas las pruebas y la recogida de muestras de sangre, se sacrificó cada rata mediante asfixia con C02.

Análisis estadístico. Se convirtieron los valores de flujo de sangre recogidos a los puntos de tiempo de 10 min y 30 min tras hCGRP en % de cambio con respecto a los valores basales usando la fórmula:

x =(valor de flujo tras hCGRP) -valor de flujo basal X 100 flujo basal

Normalmente, se analizaron los datos de dos modos: 1) análisis de la varianza (ANOVA) seguido por pruebas post

hoc HSD de Tukey, y 2) regresión por mínimos cuadrados no lineal (respuesta a la dosis sigmoidea) para la determinación de los valores de DI50 del antagonista y los intervalos de confianza cuando se recogieron suficientes datos de suficientes dosis para permitir un análisis de respuesta a la dosis completo. En algunos casos, se calcularon los valores de CI50 plasmáticos realizando regresión lineal por mínimos cuadrados sobre los valores de concentración plasmática logarítmicos (nM) frente al % de cambio en los valores de flujo de sangre calculados para ratas individuales.

Resultados y conclusiones. Los resultados experimentales se resumen en la tabla 12 a continuación. En los experimentos de flujometría sanguínea por láser doppler, la inyección intradérmica de hCGRP dentro de una zona pequeña, definida de la piel abdominal produjo un aumento del 30-40% en el flujo de sangre local. La inyección sistémica de varios de los antagonistas de péptidos CGRP (análogos o bien pegilados o bien no pegilados; o bien mediante la vía i.v. o bien la s.c.) redujo el efecto de hCGRP en una manera dependiente de la dosis. Por tanto, este modelo pudo demostrar la cobertura de la diana por los antagonistas in vivo de una manera que dio como resultado antagonismo funcional de un efecto mediado por agonista. Las diferencias en la potencia in vitro frente al ortólogo de rata del receptor de CGRP1 entre versiones pegiladas y no pegiladas de antagonistas de péptidos dieron como resultado generalmente diferencias similares en la potencia in vivo. Por ejemplo, SEO ID NO:808 y SEO ID NO:809 (la versión pegilada de SEO ID NO:808) mostraron potencias in vitro e in vivo similares (véase la tabla 12). Por otro lado, SEO ID NO:31 y su análogo pegilado SEO ID NO:791 mostraron una marcada diferencia en la potencia funcional in vitro frente al receptor de CGRP1 de rata; la potencia in vitro de SEO ID NO:791 se desplazó hacia la derecha en aproximadamente 9 veces en comparación con SEO ID NO:31. Esto se vio reflejado en un desplazamiento hacia la derecha aparentemente similar en la potencia in vivo.

En resumen, el modelo de flujo de sangre por láser doppler demostró propiedades antagonistas funcionales, específicas de los péptidos in vivo. Las potencias in vivo coincidían generalmente con la potencia in vitro frente al ortólogo de rata del receptor de CGRP1.

Tabla 12. Resultados por láser doppler

Compuesto SEO ID NO:

CI 50 in vitro (ortólogo de rata; nM) Vía adminis de tración Tiempo pretratamiento (antes agonista; minutos) de del DI50 (más intervalo de confianza del 50%) (mg/kg) CI50 plasma (nM) en Eficacia observada (%) (a la dosis más alta sometida a prueba)

809 (tabla 2D)

6,4 i.v. 5 0,52 (0,2-1,4) 916 100 (3 mg/kg)

809 (tabla 2D)

s.c. 240 100 (10 mg/kg)

808 (tabla 2D)

5,4 i.v. 5 0,39 (0,2-0,8) 100 (0,6 mg/kg)

31

(tablas 14,8 i.v. 5 100 (5 mg/kg)

3A y 7)

791 (tabla

130,7 i.v. 5 69 (20 mg/kg)

2D)

739 (tabla

8,9 i.v. 5 0,89 (0,28-2,8) 100 (6 mg/kg)

2D)

173 (tabla

49,5 i.v. 5 75,5 (3 mg/kg)

28)

Siendo lo anterior una descripción ilustrativa pero no exhaustiva de las realizaciones de la presente invención, se presentan las siguientes reivindicaciones.

Claims (27)

1. REIVINDICACIONES

   1. Una composición de materia que comprende: un péptido CGRP que comprende una secuencia de aminoácidos de fórmula:

   Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4Xaa5Xaa6Xaa7V8Xaa9Xaa10Xaa11Xaa12Xaa13Xaa14Xaa15Xaa16Xaa17Xaa18Xaa19Xaa20G21 V22Xaa23Xaa24Xaa25Xaa26F27V28p29Xaa30Xaa31V32G33Xaa34Xaa35Xaa36Xaa37 (SEO ID NO: 1130)

   en la que:

   Xaa1, Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa5, Xaa6 y Xaa7 están cada uno independientemente ausentes o son un residuo de aminoácido hidrófobo; Xaa9 es un residuo de Thr, Ser, Ala, Gly, Val, Leu o lIe;

   Xaa10 es un residuo de His, NU-metil-His, Lys, homolisina, omitina o 4-amino-Phe;

   Xaa11 es un residuo de NU-metil-Arg, homoarginina, Cit, W-metil-Cit, homocitrulina, His, Guf, Lys, homolisina, ornitina o 4-amino-Phe;

   Xaa12 es Leu, Lys, homolisina, ornitina, 4-carboxi-fenilalanina, 4-amino-Phe, ácido beta-glutámico, ácido beta-homoglutámico, ácido homoglutámico o Asp;

   Xaa13 es Ala, Lys, homolisina, ornitina, 4-carboxi-fenilalanina, 4-amino-Phe, ácido beta-glutámico, ácido beta-homoglutámico, ácido homoglutámico o Asp;

   Xaa14 es Gly, Lys, homolisina, ornitina, 4-carboxi-fenilalanina, 4-amino-Phe, ácido beta-glutámico, ácido beta-homoglutámico, ácido homoglutámico o Asp;

   Xaa15 es Leu, Lys, homolisina, ornitina, 4-carboxi-fenilalanina, 4-amino-Phe, ácido beta-glutámico, ácido beta-homoglutámico, ácido homoglutámico o Asp;

   Xaa16 es Leu, Lys, homolisina, ornitina, 4-carboxi-fenilalanina, 4-amino-Phe, ácido beta-glutámico, ácido beta-homoglutámico, ácido homoglutámico o Asp;

   Xaa17 es Ser, Lys, homolisina, ornitina, 4-carboxi-fenilalanina, 4-amino-Phe, ácido beta-glutámico, ácido beta-homoglutámico, ácido homoglutámico o Asp;

   Xaa18 es un residuo de NU-metil-Arg, homoarginina, Cit, NU-metil-Cit, homocitrulina, His, Guf, Lys, homolisina, ornitina o 4-amino-Phe;

   Xaa19 es Ser, Lys, homolisina, ornitina, 4-carboxi-fenilalanina, 4-amino-Phe, ácido beta-glutámico, ácido beta-homoglutámico, ácido homoglutámico o Asp;

   Xaa20 es Gly, Lys, homolisina, ornitina, 4-carboxi-fenilalanina, 4-amino-Phe, ácido beta-glutámico, ácido beta-homoglutámico, ácido homoglutámico o Asp;

   Xaa23 es un residuo de Val, Arg, D-Arg, homoarginina, Lys, D-Lys, homolisina, Om, Dab, Dpr, homocisteína

   o 4-amino-Phe;

   Xaa24 es un residuo de Arg, D-Arg, homoarginina, Lys, D-Lys, homolisina, Orn, Dab, Dpr, homocisteína o 4amino-Phe;

   Xaa25 es un residuo de Arg, D-Arg, homoarginina, Lys, D-Lys, homolisina, Orn, Dab, Dpr, homocisteína o 4amino-Phe;

   Xaa26 es un residuo de Asn, Arg, D-Arg, homoarginina, Lys, D-Lys, homolisina, Orn, Dab, Dpr, homocisteína

   o 4-amino-Phe;

   Xaa30 es un residuo de Thr, NU-metil-Thr, Ser o NU-metil-Ser;

   Xaa31 es un residuo de Asn, Lys, homolisina, ornitina, 4-carboxi-fenilalanina, 4-amino-Phe, ácido betaglutámico, ácido beta-homoglutámico, ácido homoglutámico o Asp;

   Xaa34 es un residuo de Oic, Pro, Hyp, Tic, D-Tic, D-Pro, Thz, Aib, Sar o Pip; Xaa35 es un residuo de Phe, D-Phe, Tyr, 1-Nal, 2-Nal, Trp o Bip;

   Xaa36 es Ala, Lys, homolisina, ornitina, 4-carboxi-fenilalanina, 4-amino-Phe, ácido beta-glutámico, ácido beta-homoglutámico, ácido homoglutámico o Asp; y

   Xaa37 es un residuo de Phe, Tyr, 1-Nal, 2-Nal, Trp, Bip, 4-carboxi-fenilalanina o 4-amino-Phe; y

   en la que un primer par de residuos de aminoácido seleccionados de Xaa7, Xaas, Xaa9, Xaa1O, Xaa11 , Xaa12, Xaa13, Xaa14, Xaa15, Xaa16, Xaa17, Xaa1S, Xaa19, Xaa20, Xaa30, Xaa31 , Xaa32, Xaa33, Xaa34, Xaa35 , Xaa36 y Xaa37 se unen covalentemente para formar un primer anillo y el primer par de residuos de aminoácido que forman el primer anillo están separados por de 3 a 7 residuos de aminoácido en la secuencia primaria del péptido CGRP; y

   en la que el resto carboxilo C-terminal se reemplaza por un resto seleccionado de

   (A)

   -C(=O)NRR, en el que R es independientemente hidrógeno, alquilo (C,-Cs), haloalquilo, arilo o heteroarilo; y

   (B)

   -CH20R en el que R es H, alquilo (C1-CS), arilo o heteroarilo; y

   en la que se conjuga un vehículo farmacéuticamente aceptable con el péptido CGRP en un sitio distinto de en el residuo de aminoácido C-terminal del péptido.
2. 2. Una composición de materia que comprende:

   un péptido CGRP que comprende una secuencia de aminoácidos de fórmula:

   Xaa 1Xaa2Xaa3Xaa4Xaa5Xaa6Xaa7VSXaa9Xaa 10Xaa11 L12A13G14L15L16S17Xaa1SS19G20G21V22Xaa23Xaa24Xaa25 Xaa26F27V2Sp29Xaa30Xaa31V32G33Xaa34Xaa35A36Xaa37 (SEO ID NO: 1127) en la que:

   -

   Xaa1, Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa5, xa"J>";¡Xaa7 están cada uno independientemente ausentes o son un residuo de aminoácido hidrófobo;

   Xaa9 es un residuo de Thr, Ser, Ala, Gly, Val, Leu o lIe;

   Xaa10 es un residuo de His, NCX-metil-His, Lys, homolisina, ornitina o 4-amino-Phe;

   Xaa11 es un residuo de NCX-metil-Arg, homoarginina, Cit, NCX-metil-Cit, homocitrulina, His, Guf, Lys, homolisina, ornitina o 4-amino-Phe;

   Xaa1S es un residuo de NCX-metil-Arg, homoarginina, Cit, NCX-metil-Cit, homocitrulina, His, Guf, Lys, homolisina, ornitina o 4-amino-Phe;

   Xaa23 es un residuo de Val, Arg, D-Arg, homoarginina, Lys, D-Lys, homolisina, Orn, Dab, Dpr, homocisteína

   o 4-amino-Phe;

   Xaa24 es un residuo de Arg, D-Arg, homoarginina, Lys, D-Lys, homolisina, Orn, Dab, Dpr, homocisteína o 4amino-Phe;

   Xaa25 es un residuo de Arg, D-Arg, homoarginina, Lys, D-Lys, homolisina, Orn, Dab, Dpr, homocisteína o 4amino-Phe;

   Xaa26 es un residuo de Asn, Arg, D-Arg, homoarginina, Lys, D-Lys, homolisina, Orn, Dab, Dpr, homocisteína

   o 4-amino-Phe;

   Xaa30 es un residuo de Thr, NCX-metil-Thr, Ser o NCX-metil-Ser;

   Xaa31 es un residuo de Asn, Lys, homolisina, ornitina, 4-carboxi-fenilalanina, 4-amino-Phe, ácido betaglutámico, ácido beta-homoglutámico, ácido homoglutámico o Asp;

   Xaa34 es un residuo de Oic, Pro, Hyp, Tic, D-Tic, D-Pro, Thz, Aib, Sar o Pip;

   Xaa35 es un residuo de Phe, D-Phe, Tyr, 1-Nal, 2-Nal, Trp o Bip;

   Xaa37 es un residuo de Phe, Tyr, 1-Nal, 2-Nal, Trp o Bip; y

   en la que el resto carboxilo C-terminal se reemplaza por un resto seleccionado de

   (A)

   -C(=O)NRR, en el que R es independientemente hidrógeno, alquilo (C1-Cs), haloalquilo, arilo o heteroarilo; y

   (B)

   -CH20R en el que R es H, alquilo (C1-CS), arilo o heteroarilo; y

3. 3.
4. 4.
5. 5.
6. 6.
7. 7."
8. 8.
9. 9.

10. 10.

11. 11.

12. 12.

13. 13.

    en la que se conjuga un vehículo farmacéuticamente aceptable con el péptido CGRP en un sitio distinto del en el residuo de aminoácido C-terminal del péptido.

    La composición de materia de la reivindicación 1 ó 2, en la que Xaa7 se selecciona de Trp, 1-Nal, 2-Nal" Phe, Tyr o Sipo

    La composición de materia de la reivindicación 1 ó 2, en la que el péptido CGRP comprende en su extremo N-terminal un resto acilo, acetilo, benzoílo, benciloxicarbonilo, bencilo o dibencilo.

    La composición de materia de la reivindicación 1 ó 2, en la que el vehículo se conjuga con el péptido CGRP en la posición de aminoácido 23, la posición 24 o la posición 25, en relación con la secuencia de aCGRP humana nativa (SEO ID NO:43).

    La composición de materia de la reivindicación 1 ó 2, en la que el vehículo farmacéuticamente aceptable es un polietilenglicol, un copolímero de etilenglicol, un polipropilenglicol, un copolímero de propilenglicol, una carboximetilcelulosa, una polivinilpirrolidona, un poli-1,3-dioxolano, un poli-1 ,3,6-trioxano, un copolímero de etileno/anhídrido maleico, un poliaminoácido, una dextrano-n-vinilpirrolidona, una poli-n-vinilpirrolidona, un homopolímero de propilenglicol, un polímero de óxido de propileno, un polímero de óxido de etileno, un poliol polioxietilado, un poli (alcohol vinílico), una cadena gilcosilada lineal o ramificada, un poliacetal, un ácido graso de cadena larga, un grupo alifático hidrófobo de cadena larga, un dominio Fe de inmunoglobulina, una albúmina, una transtiretina, una globulina de unión a tiroxina o un ligando que tiene afinidad por una proteína plasmática de semivida larga, seleccionándose dicho ligando de ligandos peptídicos y ligandos de molécula pequeña; o una combinación de cualquiera de estos miembros.

    La composición de materia de la reivindicación 1 ó 2, en la que el péptido CGRP comprende además un marcador isotópico. -,.

    La composición de materia de la reivindicación 1 ó 2, en la que el péptido de CGRP se conjuga con un polietilenglicol (PEG) en:

    (a)

    1,2,3 ó 4 sitios funcionalizac;los con amino del PEG;

    (b)

    1,2,3 ó 4 sitios funcionalizados con tiol del PEG;

    (c)

    1,2, 3 ó 4 sitios funcionalizados con maleimido del PEG;

    (d)

    1,2,3 ó 4 sitios funcionalizados con N-succinimidilo del PEG;

    (e)

    1, 2, 3 ó 4 sitios funcionalizados con carboxilo del PEG; o

    (f)

    1, 2, 3 ó 4 sitios funcional izados con p-nitrofeniloxicarbonilo del PEG.

    La composición de materia de la reivindicación 1, en la que un segundo par de residuos de aminoácido, ambos miembros del cual son diferentes de ambos miembros del primer par de residuos de aminoácido, se selecciona de Xaa7, Xaa8, Xaa9 Xaa1O, Xaa11 , Xaa12 , Xaa13, Xaa14, Xaa15, Xaa16, Xaa17, Xaa18, Xaa19, Xaa20, Xaa30, Xaa31 , Xaa32, Xaa33, Xaa34 , Xaa35, Xaa36 y Xaa37, uniéndose covalentemente el segundo par de residuos de aminoácido para formar un segundo anillo, en la que el segundo par de residuos de aminoácido que forman el segundo anillo están separados por de 3 a 7 residuos de aminoácido en la secuencia primaria del péptido CGRP, y en la que ambos miembros del segundo par de residuos de aminoácido están más próximos en la secuencia primaria a o bien el extremo C-terminal o bien el extremo N-terminal del péptido CGRP en comparación con ambos miembros del primer par de residuos de aminoácido.

    La composición de materia de la reivindicación 2, que comprende un péptido CGRP que comprende una secuencia primaria de aminoácidos de SEO ID NO: 658.

    Una composición farmacéutica que comprende la composición de materia de cualquiera de las reivindicaciones 1-10 Yun portador farmacéuticamente aceptable.

    La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, para su uso en el tratamiento de la migraña.

    La composición de materia de las reivindicaciones 1-10, en la que el vehículo farmacéuticamente aceptable es un polialquilenglicol.

    FIG.1

    Estructura de aCGRP humano

    Los residuos sombreados se han implicado en la unión al receptor.

    1-7 &-18 28-37 activación del receptor unión al receptor región de bisagra unión, al receptor ACDTATC VT~GLL~ SGGVVKNNFV ~CONH21 I (l.-hélice giro giro giro

    disulfuro

    FIG.2

    M8

    M2----------------~

    ¡-=....

    KN

    M7 Ae -ilVT!fAGL _ _E'_V_P_T_D P_F_A_F_-_N_H_2_ M1

    1o.-.__ __

    M6

    M\;3 ____--'

    FIG.3

    Lys-Glu o

    ("'/'N~

    ~ H ...,...

    ~u..()m Om·Glu

    o o

    ~N~~~

    .,.... H • I H I Homo-Glu-Om Om-Homo-G1u

    d~~ ,s~~

    ~ t ~ ~

    epa-Om ' Om·Cpa

    g

    o..

    J:

    el..

    a::

    S

    e

    .!!

    'O

    t.D

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14. -

    .::

    Q.

    o

    CJ

    'ti

    t.D 'O

    ~

    10,0

    60,0 r-
15. 50..0 40,0 30,0 20,,0

16. -

    .

    10,,0
17. 0.0

    Control M.oH al 21'11

    -

    -

    [ 60

    CJ

    e 50

    ¡: ...

    Q.40

    o

    u

    aJO

    ~ 20 'i/. 10 o

    ID n.o 7 control

    r-

    M.OH al 10'11

    r-

    ID n,o 7 +IPA al 50'11

    FIG.4

    r-

    r--r-

    EtOH EIOH IPA 1121.. a' 50" al 25'11

    FIG.5

    r-

    .-

    ID n.O 7 JO n.o 31 +TFE conlrol al 50'11

    ,....

    ,....

    ,....

    IPA TFE TFE a_ 50" al 25'11 al 50 ..

    ...

    ..

    ID n.o 31 ID n.O 31

    + IPA +TFE 1.50'" liSO"

    FIG. 6

    o

    .... 80

    u

    ::s

    'O

    o

    ....

    c.. 70

    G)

    'O

    .!l o 60

    c..

    G)

    . '0

    tl 50

    60 80

    .40 % de codisolvente

    o IPA

    ~TFE,

    -B-HFIPA

    80 o

    ....

    u 70

    ~

    "C

    ....

    o 60

    Q. CD

    "C 50

    o

    U 40

    Q.

    CD "C

    30 '#.

    ,FIG. 7

    O 20

    % de codlsolvente

    o IPA V TFE s HFtPA·

    FIG. 8

    ,Q

    c..

    O 20 40 60 SO

    %de codisolvente

    o IPA 'i1 TFE e HFIPA

    FIG.9

    W7-F37
18. 29..49

    80 ca 70

    >

    :.¡::;

    ca

    <D

    \O .... 60

    +::o

    ca

    u

    1:: 50

    ca

    "'C 1:: 40 '1

    ...Q¡

    ce 3°1

    10 , 639 ~:;::'~-¿ ••o<W~V

    879 12.10·· 12.92

    O1·. 1'( í; ¡' ;i; • ;?; ;-;':-. 7" ~T!":!:I!::;;¡: ;:v~ ;, • I

    o S· 10 15 20 25 30 Tiempo (m in.)

    i~34,79

    .J

    90-3 80

    1.0

    VI 1i

    I ! 7°160

    ü• •e 50 v

    § 40

    ~

    2°1

    FIG. 10

    W7-P34

    24,14

    1W7·F37

    ".25,67

    W7-hArg24

    W1-N2~2;;4!~ 11 11

    32,.59

    I

    O 5 10 15 20 25 30 35

    n.mpo (mln.)

    FIG. 11

    100 "J W1.f31 90 ..::¡ 2&.21 SO .1 70

    \O 1ii

    ! 60

    ü

    W7-K25

    0\ i• 50]
19. 21..60

    ~ 40 30 31..27

    2°1

    ~ Il

    ¿1,11 Il

    O ~08 4..69 9..40_ 12..7~ 14.07 ............ "" .. Jl~ A~ ~J,l2. ~35..98 O 5 10 15 20 25 30 35

    TlempD (mln.)

    FIG. 12

    W7-F37
20. 25.43

    00 80 70

    '-D I

    TaO-Fa7 i 60 ¡;¡•

21. -

    ....) 1i

    •e 50 e

    "

    :1 40

    t 30 20 10
22. 3.97 9,23

    O.. 9,63 O 5 10 15 20 25 30 35 Tiempo (mln.)

    FIG.13

    Ligador lábil a ácido fuerte HzN-1L1GADOR ~Soporte de polímero

    L Acoplar el siguiente aminoácido (de extremo C-term. a N-term.): 5 equiv. de fmoc-aminoácido (cadena lateral protegida según sea necesario) 5 equiv. de HBTU 0,5 M en OMf, 20 equiv. de OlEA, 45 min. Ciclos de síntesis de péptidos
23. 2.lavado en flujo de OMf de perlas de pOlímero en fase sólida

    l.Oesprotección de fmoc: piperidina al 30% en OMf, 2 Y 20 min. .. •lavado en flujo de OMf de perlas de pOlímero
24. 5. Repetir las etapas 1-4 con el siguiente aminoácido (no se elimina el Fmoc N-terminal del último residuo)

    2-PpiPr Mtt tau

    FmOe-YWVeCit] dGLLfLCit] fGGW(~q)FPfbVG(OiClFAF NJI ~LlGADOR ~

    Boc Trt tSI,! lau Pbf Boc tSu

    \O 10 Eliminar el grupo 2-PhiPr y Mtt con TfA al 1% en OCM '1

    00 FormaclOn del enlace lactama . (ortogonal a las condiciones de escisión delligador)

    de cadena lateral Z. Ciclar las cadenas laterales de residuos de Glu y lys desprotegidas con 2 equiv. de PyBop 0,5 M en OMSO y 5 equiv. de OlEA.

    ,CO-NH, .,., ~

    FmOC-fVEfCCitlLKGLL,CCitl ,GGVV[~glfNi'V'P'fVG(Oic:]J!AF NH 1L1GADOR Boc Trt 'Bu '8tJ Pbf Boc láu

    l. Piperidina al 30%IDMF, 2 Y 20 min.; Ac20 I OlEA I OMf 10 min.
25. 2. TFA:EOT:TIS:H20 (92,5:2,5:2,5;2,5 vlv)

    Desprotección de la cadena lateral

    Temperatura ambiente, 90 min. y escisión del soporte de polímero
26. 3. Evaporar
27. 4. Precipitar con dietil éter

    S. Recoger el precipitado de péptido y secar

    rCO~NH-, 6. Purificar mediante HPlC de fase in~ersa

    Ac-WVEH[Cit]LKGLLSlCitlSGGVV[hAr91KNFVPrDVG(Oic]FAF~amlda