JP2004008027A - cAMPの産生活性を有する新規ペプチド - Google Patents
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Abstract
【解決手段】次の(1)〜(6)の性質、(1)中枢神経系において発現し、(2)カルシトニン受容体に強く作用し、(3)細胞のcAMP産生能を促進させ、(4)ナトリウムイオンを濃度依存的に取り込む作用を有し、(5)カルシウムイオンの取り込みを抑制し、(6)細胞増殖を抑制する作用を有するペプチドに関する。より具体的には、ブタ脳由来の特定なアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加を受けたアミノ酸配列を有する前記のペプチドに関する。また、本発明は、これらのペプチドをコードする遺伝子、及びそれを含有してなる医薬組成物に関する。
【選択図】 なし
Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規かつ有用なペプチド、それをコードする遺伝子、及びそれを含有してなる医薬組成物に関する。より詳細には、本発明は、次の(1)〜(10)の性質、(1)中枢神経系において発現し、(2)カルシトニン受容体に強く作用し、(3)細胞のcAMP産生能を促進させ、(4)ナトリウムイオンを濃度依存的に取り込む作用を有し、(5)カルシウムイオンの取り込みを抑制し、(6)細胞増殖を抑制する作用を有するペプチド、それをコードする遺伝子、及びそれを含有してなる医薬組成物に関する。
【0002】
【従来の技術】
既知ペプチドであるカルシトニンは、32個のアミノ酸からなるポリペプチドホルモンである。哺乳動物では甲状腺のC細胞から分泌され、血液カルシウムを低下させる作用を有する。高カルシウム血症や代謝性骨疾患などの治療薬として利用されている。カルシトニンは、甲状腺など末梢系に存在するとされていて中枢神経系には発現していないとされていた。しかし、カルシトニン受容体は中枢神経系にも存在し、中枢神経系におけるカルシトニン受容体の存在意義や作用についての解明が求められていた。
また、カルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)はアミノ酸37個からなる蛋白質であり、カルシトニンと同じ遺伝子から転写されたmRNAが、カルシトニンとは異なるスプライシングを受けて生成されるものである。カルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)は、カルシトニンと同様な血液カルシウム濃度を低下させる作用も有するが、カリウムイオンチャンネルの活性化作用やアセチルコリン受容体の数を増加させる作用などもあり、神経伝達物質である可能性もあるとされている。
しかし、これらの蛋白質は中枢神経系のカルシトニン受容体に直接作用するものであると確認されておらず、中枢神経系のカルシトニン受容体に直接作用するペプチドの決定が求められていた。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、中枢神経系に発現し、カルシトニン受容体に作用する新規かつ有用なペプチド、その遺伝子、及びそれを含有してなる医薬組成物を提供することを目的としている。
【0004】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、中枢神経系からcAMP産生を指標にして新規な生理活性ペプチドを探索してきた結果、カルシトニン受容体を介して細胞に作用すると考えられる新規なペプチドを単離、精製した。この構造は、データベース(Genbank,swissprot,DDBJ)の検索結果から新規配列であることが確認された。本発明者らはこの新規なペプチドがカルシトニン受容体に作用することからカルシトニン受容体刺激ペプチド(Calcitonin Receptor−Stimulating Peptide(CRSP))と命名した。
【0005】
即ち、本発明は、次の(1)〜(6)の性質、
(1)中枢神経系において発現し、(2)カルシトニン受容体に強く作用し、(3)細胞のcAMP産生能を促進させ、(4)ナトリウムイオンを濃度依存的に取り込む作用を有し、(5)カルシウムイオンの取り込みを抑制し、(6)細胞増殖を抑制する作用を有するペプチドに関する。より詳細には、本発明は少なくとも次ぎのアミノ酸配列、
Ser−Cys−Asn−Thr−Ala−Thr−Cys−Met−Thr−His− 10
Arg−Leu−Val−Gly−Leu−Leu−Ser−Arg−Ser−Gly− 20
Ser−Met−Val−Arg−Ser−Asn−Leu−Leu−Pro−Thr− 30
Lys−Met−Gly−Phe−Lys−Val−Phe−Gly−NH2 38
又はこれらのアミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加を受けたアミノ酸配列を有する前記のペプチドに関する。より具体的には、配列表の配列番号1、配列番号2、配列番号6、配列番号9、配列番号12、配列番号16、若しくは配列番号19で示されるアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加を受けたアミノ酸配列を有する前記のペプチドに関する。
【0006】
また、本発明のペプチドはカルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)と相同性を有するペプチドを含むものであるから、CRSPの有する効果に加えてCGRPに類似した生理活性も期待できる場合がある。即ち、本発明のペプチドは、前記の(1)〜(6)の性質に加えて、(7)カルシトニン関連ペプチド受容体に強く作用し、(8)血管の弛緩作用を有し、(9)利尿を促進させ、(10)血管内皮細胞や血管平滑筋、線維芽細胞の増殖能を変化させる作用などのCGRPが有する作用と類似した作用を有することも期待される場合もある。
【0007】
また、本発明は前記した本発明のペプチドをコードする塩基配列を有する遺伝子に関する。より詳細には、本発明は、遺伝子が、配列表の配列番号3、配列番号7,配列番号10,配列番号13,配列番号17,若しくは配列番号20で示される塩基配列を有する前記した遺伝子に関する。
さらに、本発明は、前記した本発明のペプチド少なくとも1種、及び製薬上許容される担体からなる医薬組成物に関する。より詳細には、本発明は、医薬組成物が、骨粗鬆症の予防・治療剤、癌の予防・治療剤、利尿剤、食欲抑制剤、鎮痛剤、降圧剤、又はPTCA(経皮的冠動脈形成術)後の再狭窄を防ぐための薬剤である前記した医薬組成物に関する。
【0008】
本発明者らは、ブタ脳抽出液から腎臓上皮細胞のcAMP産生を指標にして2種の新規な生理活性ペプチドを精製した。得られたペプチドのアミノ酸配列を解析したところ、
Ser−Cys−Asn−Thr−Ala−Thr−Cys−Met−Thr−His− 10
Arg−Leu−Val−Gly−Leu−Leu−Ser−Arg−Ser−Gly− 20
Ser−Met−Val−Arg−Ser−Asn−Leu−Leu−Pro−Thr− 30
Lys−Met−Gly−Phe−Lys−Val−Phe−Gly−NH2 38
という38個のアミノ酸からなるペプチド(以下、このペプチドをCRSPという。)と、そのC末端にさらにグリシンが結合した、
【0009】
Ser−Cys−Asn−Thr−Ala−Thr−Cys−Met−Thr−His− 10
Arg−Leu−Val−Gly−Leu−Leu−Ser−Arg−Ser−Gly− 20
Ser−Met−Val−Arg−Ser−Asn−Leu−Leu−Pro−Thr− 30
Lys−Met−Gly−Phe−Lys−Val−Phe−Gly−Gly−OH 39
という39個のアミノ酸からなるペプチド(以下、このペプチドをCRSP−Glyという。)であることがわかった。
そして、これらのペプチドのアミノ酸配列をデータベース(Genbank,swissprot,DDBJ)で検索したところ、いずれも新規なアミノ酸配列を有するものであることが確認された。
これらのアミノ酸配列を配列表の配列番号1及び2にそれぞれ示す。
【0010】
得られたペプチドのアミノ酸配列に基づいて合成プライマーを作成し、ブタ遺伝子を鋳型にPCR法で増幅することにより、目的の遺伝子をクローニングした。
用いたプライマーは、アミノ酸配列を基にN末端側として、
TG(C/T)AA(C/T)AC(A/C/G/T)GC(A/C/G/T)AC(A/C/G/T)TG(C/T)ATGAC、及び、
C末端側として、
CC(A/G)AA(A/C/G/T)AC(C/T)TT(A/G)AA(A/C/G/T)CCCATA
であった。
得られた遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号3に示し、それがコードしているアミノ酸配列を以下に示す。
【0011】
Met−Gly−Phe−Trp−Lys−Phe−Pro−Pro−Phe−Leu− 10
Val−Leu−Ser−Ile−Leu−Val−Leu−Tyr−Gln−Ala− 20
Gly−Met−Phe−His−Thr−Ala−Pro−Met−Arg−Ser− 30
Ala−Phe−Gly−Ser−Pro−Phe−Asp−Pro−Ala−Thr− 40
Leu−Ser−Glu−Glu−Glu−Ser−Arg−Leu−Leu−Leu− 50
Ala−Ala−Met−Val−Asn−Asp−Tyr−Glu−Gln−Met− 60
Lys−Ala−Arg−Glu−Met−Gln−Lys−Gln−Arg−Ala− 70
Gln−Gly−Ser−Gly−Ile−Ser−Val−Gln−Lys−Arg− 80
Ser−Cys−Asn−Thr−Ala−Thr−Cys−Met−Thr−His− 90
Arg−Leu−Val−Gly−Leu−Leu−Ser−Arg−Ser−Gly− 100
Ser−Met−Val−Arg−Ser−Asn−Leu−Leu−Pro−Thr− 110
Lys−Met−Gly−Phe−Lys−Val−Phe−Gly−Gly−Arg− 120
Arg−Arg−Asn−Phe−Trp−Ile 126
(式中、下線を引いた81番目〜118番目までがCRSPである。)
このアミノ酸配列を配列表の配列番号4に示す。
【0012】
ブタCRSPをプローブにしてウシ及びイヌ甲状腺cDNAライブラリーから本発明のペプチドを得た。
ウシのアミノ酸配列は、アミノ酸の1文字コードで示すと、
ACNTATCMTHRLAGWLSRSG
SMVRSNLLPTKMGFKIFNGP−OH
である。これをアミノ酸の3文字コードで示すと次のようになる。
【0013】
Ala−Cys−Asn−Thr−Ala−Thr−Cys−Met−Thr−His− 10
Arg−Leu−Ala−Gly−Trp−Leu−Ser−Arg−Ser−Gly− 20
Ser−Met−Val−Arg−Ser−Asn−Leu−Leu−Pro−Thr− 30
Lys−Met−Gly−Phe−Lys−Ile−Phe−Asn−Gly−Pro−OH 40
【0014】
また、イヌのアミノ酸配列は、アミノ酸の1文字コードで示すと、
SCNSATCVAHWLGGLLSRAG
SVANTNLLPTSMGFKVYN−OH
である。これをアミノ酸の3文字コードで示すと次のようになる。
【0015】
Ser−Cys−Asn−Ser−Ala−Thr−Cys−Val−Ala−His− 10
Trp−Leu−Gly−Gly−Leu−Leu−Ser−Arg−Ala−Gly− 20
Ser−Val−Ala−Asn−Thr−Asn−Leu−Leu−Pro−Thr− 30
Ser−Met−Gly−Phe−Lys−Val−Tyr−Asn−OH 38
【0016】
これらのアミノ酸配列、塩基配列、及び遺伝子がコードしている全アミノ酸配列をそれぞれ配列表に示す。
ウシの本発明のペプチドのアミノ酸配列を配列表の配列番号6に示し、その遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号7に示し、その遺伝子に基づくペプチドのアミノ酸配列を配列番号8にそれぞれ示す。
また、イヌの本発明のペプチドのアミノ酸配列を配列表の配列番号9に示し、その遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号10に示し、その遺伝子に基づくペプチドのアミノ酸配列を配列番号11にそれぞれ示す。
【0017】
ブタCRSPのコード領域全長をプローブとして、ブタ遺伝子ライブラリーよりCRSPと相同性を有するペプチドをコードする遺伝子を得た。この遺伝子の産物であるペプチドをそれぞれ、CRSP−2、CRSP−3と名付けた。
また、同様にして、ブタカルシトニン(CT)と相同性を持つペプチドをコードする遺伝子を得た。この遺伝子の産物であるペプチドをCT−2と名付けた。CRSP−2のアミノ酸配列は、アミノ酸の3文字コードで示すと次のようになる。
【0018】
Ser−Cys−Asn−Thr−Ala−Ser−Cys−Val−Thr−His− 10
Lys−Met−Thr−Gly−Trp−Leu−Ser−Arg−Ser−Gly− 20
Ser−Val−Ala−Lys−Asn−Asn−Phe−Met−Pro−Thr− 30
Asn−Val−Asp−Ser−Lys−Ile−Leu−NH2 37
【0019】
CRSP−3のアミノ酸配列は、アミノ酸の3文字コードで示すと次のようになる。
Ser−Cys−Asn−Thr−Ala−Ile−Cys−Val−Thr−His− 10
Lys−Met−Ala−Gly−Trp−Leu−Ser−Arg−Ser−Gly− 20
Ser−Val−Val−Lys−Asn−Asn−Phe−Met−Pro−Ile− 30
Asn−Met−Gly−Ser−Lys−Val−Leu−NH2 37
【0020】
CT−2のアミノ酸配列は、アミノ酸の3文字コードで示すと次のようになる。
Glu−Cys−Asn−Asn−Leu−Ser−Thr−Cys−Val−Leu− 10
Gly−Thr−Tyr−Thr−Trp−Asp−Val−Asn−Lys−Phe− 20
Tyr−Ala−Phe−Pro−Leu−Thr−Thr−Thr−Gly−Ile− 30
Arg−Val−Ser−NH2 33
【0021】
CRSP−2のアミノ酸配列を後記配列表の配列番号12に示し、そのcDNAの塩基配列を配列番号13に、そのcDNAに基づくペプチド(前駆体ペプチド)のアミノ酸配列を配列番号14にそれぞれ示す。また、CRSP−2遺伝子の塩基配列を配列番号15に示す。
CRSP−3のアミノ酸配列を配列表の配列番号16に示し、そのcDNAの塩基配列を配列番号17に、そのcDNAに基づくペプチド(前駆体ペプチド)のアミノ酸配列を配列番号18にそれぞれ示す。
CT−2のアミノ酸配列を配列表の配列番号19に示し、そのcDNAの塩基配列を配列番号20に、そのcDNAに基づくペプチド(前駆体ペプチド)のアミノ酸配列を配列番号21にそれぞれ示す。また、CRSP−3遺伝子及びCT−2遺伝子の塩基配列を配列番号22に示す。
【0022】
図1に本発明のペプチドの例としてブタCRSPの構造を模式的に示す。この例のペプチドの場合は、2番目のCysと7番目のCysが−S−S−結合している。
また、図2に、本発明のブタCRSP(pCRSP)、ブタカルシトニン遺伝子関連ペプチド(pCGRP−I)、ヒトカルシトニン遺伝子関連ペプチドI(hCGRP−I)、ヒトカルシトニン遺伝子関連ペプチドII(hCGRP−II)、ヒトアミリン(hAmylin)、ブタカルシトニン(pCT)、及びヒトアドレノメデュリン(hAM)のアミノ酸配列を比較したものを示す。
本発明の、CRSPはブタカルシトニン遺伝子関連ペプチド(pCGRP)と71.1%、ヒトCGRP−Iと63.2%、ヒトCGRP−IIと71.1%とそれぞれアミノ酸配列上の相同性を有している。
また、ブタ由来のペプチドについて、各CRSPとCRGPやAM、CT−2とCTのアミノ酸の比較を行ったものを図23に示す。
【0023】
次にCRSPの発現部位を調べるためにノーザンブロッティングを行った結果を図3に図面に代わる写真で示す。図3中の矢印は、CRSPmRNAの位置を示している。また、各組織のペプチドの含有量をCRSPの抗体を用いてラジオイムノアッセイにより測定した。この測定結果を次の表1に示す。
【0024】
【表1】
【0025】
この結果、本発明のCRSPは、中枢神経系においては中脳、視床下部に、末梢においては甲状腺に多くの遺伝子発現がみられた。また橋・延髄にも中程度の発現が見られ、大脳、下垂体においても僅かではあるが発現が観察される。一方組織含量は下垂体後葉、甲状腺が最も多く、中脳、視床下部、下垂体前葉にも高い組織含量が観察された。
【0026】
次に、CRSPの生理活性について検討した。
まず、LLC−PK1細胞を用いてCRSPのcAMP産生活性を検討した。LLC−PK1細胞の培地にDMEMに溶解したCRSPを添加して、分泌されてきたcAMPの量をcAMP特異的な抗体を用いたラジオイムノアッセイにより定量した。結果を図4に示す。図4の縦軸はcAMPの産生量(pmol/105細胞/30分)を示し、横軸は各ペプチドの濃度の逆対数(−log(ペプチド濃度(M)))を示す。図4の黒丸(●)は本発明のCRSPを示し、白丸(○)はブタカルシトニン遺伝子関連ペプチド(pigCGRP)を示し、白菱形(◇)はブタカルシトニン(pigCT)をそれぞれ示す。この結果、本発明のCRSPは、ブタ腎上皮細胞由来のLLC−PK1細胞の細胞内アデニル酸シクラーゼ活性を濃度依存的に非常に強く(ED50は約1.5nM)上昇させる。この活性はブタカルシトニン(ED50は約8.7nM)より約6倍、ブタCGRP(ED50は約62nM)より約40倍強かった。
【0027】
次に本発明のCRSPのナトリウムイオン、カルシウムイオンの取り込みの促進作用を検討した。
LLC−PK1細胞の培養液をハンクス−塩化コリン液に置換し、一定量の放射活性をもつ塩化ナトリウム(22Na)及びCRSPをそれぞれ終濃度0M、10−8M、10−7M、10−6Mになるように添加し、10分後、細胞を洗浄して細胞外液に含まれる22Naを完全に除去し、細胞内に取り込まれた放射活性をガンマカウンターにより測定した。また同様にLLC−PK1細胞の培養液をハンクス−塩化コリン液に置換し、一定量の放射活性を持つ塩化ナトリウム(22Na)及びそれぞれCRSPとNa/H共輸送体阻害剤であるアミロライド誘導体5−(N−エチル−N−イソプロピル)−アミロライド(5−(N−ethyl−N−isopropyl)−amiloride(EIPA))を終濃度CRSP 0M+EIPA 0M、CRSP 10−6M+EIPA 0M、CRSP10−6M+EIPA10−8M、CRSP10−6M+EIPA10−7M、CRSP10−6M+EIPA10−6M、CRSP 0M+EIPA10−6Mとなるよう添加し、10分後、細胞を洗浄して細胞外液に含まれる22Naを完全に除去し、細胞内に取り込まれた放射活性をガンマカウンターにより測定した。
結果を図5(EIPA非存在下でのナトリウムイオンの取り込み)、図6(EIPA存在下でのナトリウムイオンの取り込み)、及び図7(カルシウムイオンの取り込み)にそれぞれ示す。図5、図6及び図7の縦軸は各イオンの取り込み量(cpm)を示し、横軸に左端はコントロール(ペプチド無添加)を示し、その右は各濃度のCRSPを示す。図6の横軸のコントロールの右はCRSP単独投与の場合を示し、その右はCRSPとEIPAの共投与の各濃度を示し、右端はEIPA単独投与の場合を示す。図7中のsCTは、サケカルシトニンを示す。図5,図6,及び図7中、*印はp<0.05で、**印はp<0.01で、***印はp<0.001で有意差があったことを示す。
この結果、CRSPはLLC−PK1細胞上のアミロライド感受性Na/H共輸送体を活性化して細胞内へのナトリウムの取り込みを促進する。また細胞内へのカルシウムの取り込みを抑制することがわかった。
【0028】
次にCRSPによる細胞増殖の抑制作用について検討した。
LLC−PK1細胞に各濃度の各ペプチドのDMEM溶液を添加し、125Iで標識したブロモデオキシウリジンを含むDMEM(0.1%BSAを含む)を各ウエルに添加して、5時間後核内に取り込まれた放射活性をガンマカウンターにより測定し、細胞増殖に伴って合成されたDNA量を測定した。結果を図8に示す。図8の縦軸は125I−DUの取り込み量(×100cpm/ウエル)を示し、横軸は各ペプチドの濃度の逆対数(−log(ペプチド濃度(M)))を示す。図8の黒丸(●)は本発明のCRSPを示し、白丸(○)はブタカルシトニン(ブタCT)を示し、白菱形(◇)はサケカルシトニン(サケCT)をそれぞれ示す。
また、細胞の増殖数は、10,000細胞/ウェルのLLC−PK1細胞に各濃度のCRSPのDMEM溶液を添加し、培養後、培養皿上の細胞をトリプシン−EDTA溶液で剥がし、細胞数を計数板にて計測した。結果を図9に示す。図9の縦軸は細胞数(×1,000細胞/ウエル)を示し、横軸は左端はコントロール(CRSP無添加)を示し、その右は各濃度のCRSPを示す。*印はp<0.05で有意差があったことを示す。
これらの結果、CRSPはLLC−PK1細胞の増殖を抑制する作用を有することがわかった。
【0029】
次に、本発明のCRSPによるカルシトニン受容体への作用を検討した。
ブタカルシトニン受容体(CTR)を哺乳類発現ベクターpcDNA3.1に導入し、アカゲザル腎細胞(COS−7)に発現させてCRSP刺激によるcAMP産生量をラジオイムノアッセイにより測定した。同様にオポッサム腎細胞(OK細胞)にCTRを発現させてCRSP刺激によるcAMP産生量をラジオイムノアッセイ法により、ナトリウムイオンの取り込みを放射活性を持つ塩化ナトリウム(22Na)の取り込みをガンマカウンターで計測することにより測定した。結果を図10(遺伝子工学的にカルシトニン受容体を発現している細胞(COS−7)のCRSP刺激によるcAMP産生能の変化)、図11(ブタカルシトニン受容体(CTR)を発現させたオポッサム腎上皮細胞のcAMP産生能の変化)、及び図12(ブタカルシトニン受容体(CTR)を発現させたオポッサム腎上皮細胞のナトリウムイオンの取り込みの変化)に示す。
図10の縦軸はcAMPの産生量(pmol/ウエル/30分)を示し、横軸は各ペプチド(リガンド)の濃度の逆対数(−log(リガンド濃度(M)))を示す。図10の黒丸(●)は本発明のCRSPを示し、白菱形(◇)はブタカルシトニン(pCT)をそれぞれ示す。図11の縦軸はcAMPの産生量(fmol/ウエル/1時間)を示し、横軸はCRSPの濃度の逆対数(−log(CRSP濃度(M))を示す。図11の黒丸(●)はブタカルシトニン受容体(CTR)を導入したオポッサム腎上皮細胞の場合を示し、黒四角(■)はオポッサム腎上皮細胞(OK細胞)の場合を示す。図12の縦軸はナトリウムイオンの取り込み量の比(コントロールを100とする)を示し、横軸はCRSPの濃度の逆対数(−log(CRSP濃度(M)))を示す。図12の黒丸(●)はブタカルシトニン受容体(CTR)を導入したオポッサム腎上皮細胞の場合を示し、黒四角(■)はオポッサム腎上皮細胞(OK細胞)の場合を示す。図12において、***印はp<0.001で有意差があったことを示す。
この結果、CTRをCOS−7に発現させてCRSPで刺激すると、細胞内アデニル酸シクラーゼ活性が上昇(ED50は約0.2nM)する。この活性はブタカルシトニン(ED50は約71nM)より約350倍強かった。CRSPのこの作用はブタのカルシトニンより約350倍も強力で、既知の生理活性ペプチドの中で最も強いものである。同様にオポッサム腎上皮細胞(OK細胞)にCTRを発現させてCRSPで刺激すると、細胞内アデニル酸シクラーゼ活性が上昇するのと同時にアミロライド感受性Na/H共輸送体を活性化して細胞内へのナトリウムの取り込みを促進する効果が観察された。
【0030】
さらに、CRSPのラットの血圧及び血漿中イオン濃度の変化について検討した。
生理食塩水に溶解した16nmol/kgに相当する量のCRSPを麻酔条件下でラット頸静脈より短期間に一度に投与して、血漿中カルシウム濃度及び血圧を測定した。結果を図13(CRSP投与による血中カルシウム濃度の変化)及び図14(CRSP投与による血圧の変化)に示す。図13の縦軸は血中カルシウム濃度(mM)を示し、横軸は時間(分)を示す。図14の縦軸は血圧(mmHg)を示し、横軸は時間(分)を示す。図13中の**印はp<0.01で有意差があったこと示す。
この結果、CRSPの投与により、一過性に血漿中カルシウム濃度が低下するが、一方血圧に対しては明確な変動を及ぼさないことがわかった。
【0031】
続いて、CRSPとCRSP−GlyのcAMP産生促進活性の違いについて検討した。
ブタカルシトニン受容体(CTR)を哺乳類発現ベクターpcDNA3.1に導入し、アカゲザル腎細胞(COS−7)に発現させてCRSP刺激によるcAMP産生量をラジオイムノアッセイにより測定した。結果を図15に示す。
この結果、CRSPとCRSP−Glyはほぼ同等のcAMP産生活性を有することがわかった。
【0032】
また、ウシ及びイヌから単離してきた本発明のペプチド(ウシCRSP及びイヌCRSP)について、前記したのと同様にしてLLC−PK1細胞を用いたCRSPのcAMP産生活性を検討した。結果を図16に示す。図16の縦軸はcAMPの産生量(pmol/ウエル/10分)を示し、横軸は添加したCRSPの濃度を示す。
この結果、ウシやイヌのCRSPでもブタCRSPの場合とほぼ同様な結果が得られることがわかった。
【0033】
本発明のペプチドの各種、CRSP、CRSP−2、CRSP−3、CT−2、CT,CGRP,GAPDHの遺伝子発現量をRT−PCRによる高感度定量により測定した。その結果を図24に示す。
CRSP−2及びCRSP−3は中枢及び甲状腺、卵巣に発現が観察された。一方CT−2は何れの組織でもバンドが増幅されず、発現が観察されなかった。CT−2は図24に示された組織以外に限局して発現しているものと考えられる。
【0034】
以上のように、本発明のペプチドは、カルシトニンより強くカルシトニン受容体を刺激し、アデニル酸シクラーゼを活性化することが示された。このことは、本発明のペプチドがカルシトニン受容体の真の内因性のリガンドであることを示している。
従って、本発明のペプチドは、末梢の組織のカルシトニン受容体に作用して以下のような薬効を奏するものと考えられる。
カルシトニンはその受容体であるカルシトニン受容体を介して骨へのカルシウムの取り込みを促進させる。本発明のペプチドはカルシトニンと同様にカルシトニン受容体に作用して骨へのカルシウムの取り込みを促進させると考えられる。実際に図13で示したようにラットにおいてこのペプチドの投与により、血漿中のカルシウム濃度の減少が観察された。この結果は骨へのカルシウムの取り込みの促進を裏付けていると考えられる。この作用を利用して骨粗鬆症により低下した骨密度を健常状態に回復させるための薬剤として利用が可能であり、骨粗鬆症の予防・治療剤として使用することができる。
また図13に示されるように、本ペプチドは、血漿中のカルシウム濃度を低下させる活性を持っており、アルカローシス等に伴う高カルシウム血症の血漿中カルシウム濃度を通常レベルにまで下げるための薬剤への応用が可能であり、高カルシウム血症の治療・予防剤として使用することができる。
本ペプチドは、腎上皮細胞のアミロライド感受性Na/H共輸送体の作用を活性化する。これはカリウム保持性の利尿剤であるアミロライドの反対方向の活性であり、抗利尿剤として使用できる。
本発明のペプチドは、図8及び図9で示したようにカルシトニン受容体を介して腎上皮細胞の増殖を強く抑制する。カルシトニンはカルシトニン受容体を介して腺ガン細胞等の増殖を強く抑制する事が報告されている(Cancer Res. 1985, 45, 4890−4894他)ため、同様に本発明のペプチドもカルシトニン受容体を介してこれらのガン細胞の増殖をカルシトニンよりも強力に抑制すると考えられ、ガンの治療、予防薬として使用できる。
【0035】
本発明のペプチドは、中枢に大量に発現していることが示された。従来から知られてきたアゴニストであるカルシトニンは中枢における発現が認められず、一方カルシトニン受容体は中枢に発現しているため、この事は本発明のペプチドが中枢における真の内因性リガンドであることを示している。カルシトニンを脳室内に投与すると、食欲の抑制、鎮痛作用を示すことが報告されている。カルシトニンは脳内に発現していないため、本ペプチドが脳内でこれらの作用を担っているものと考えられる。
したがって、本発明のペプチドは、中枢神経系のカルシトニン受容体に作用して以下のような薬効を奏するもとの考えられる。
カルシトニンは中枢神経系で食欲の抑制に働いていることが報告されている(Science 1979, 206, 850−852、THE BONE 1992, 6, 69−74他)。カルシトニン受容体をカルシトニンよりも強く活性化する事ができる本発明のペプチドは強い食欲抑制作用を示す可能性が強い。本発明のペプチドの投与により肥満及びそれに伴う疾患(高血圧、高脂血症等)の治療・予防薬として使用することができる。
さらに、従来よりカルシトニン製剤がガンの転移や骨粗鬆症等による骨の痛み、偏頭痛、膵炎による痛み等に対し鎮痛作用を示すことが報告されている(Am. J. Med. Sci. 1997, 313, 13−16他)。カルシトニン受容体をカルシトニンよりも強く活性化する本発明のペプチドは、カルシトニンと同様に強い鎮痛作用を示す可能性が高く、これらの痛みに対する鎮痛剤として有効性を有する。
【0036】
本発明のペプチドは、(1)中枢神経系において発現し、(2)カルシトニン受容体に強く作用し、(3)細胞のcAMP産生能を促進させ、(4)ナトリウムイオンを濃度依存的に取り込む作用を有し、(5)カルシウムイオンの取り込みを抑制し、(6)細胞増殖を抑制する作用を有することを特徴とするものである。これらの作用を有するペプチドであれば、前記したアミノ酸配列を有するものに限定されないが、カルシトニンやカルシトニン遺伝子関連ペプチドのアミノ酸配列と50%以上、好ましくは60%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるペプチドが好ましい。前記した例ではブタからの本発明のペプチドであるCRSPを示してきたが、本発明のペプチドはブタ由来のものに限定されるものではなく、ヒト、ラット、イヌ、ウシなどの哺乳動物、サケなどの魚類動物などに由来するペプチドを包含している。
本発明のペプチドは、天然から抽出などの操作により、分離精製することもできる。また、通常のペプチド合成法により合成することもできる。さらに、本発明の遺伝子を適当なベクターに組み込んで、原核細胞や真核細胞を宿主細胞として遺伝子組換え技術により製造することもできる。
【0037】
本発明の医薬組成物は、本発明のペプチドと製薬上許容される担体からなるものである。本発明の医薬組成物は、非経口投与又は経口投与することができ、好ましくは静脈投与、筋肉投与などの非経口投与される。
本発明の医薬組成物は、注射用製剤、凍結乾燥製剤、直腸投与製剤などに製剤化することができる。また、貼付デバイス、軟膏、貼付剤などの外用剤として製剤化することもできる。さらに、舌下錠として製剤化することもできる。製剤化は通常のペプチド製剤の方法により行うことができる。
本発明の医薬組成物は、有効成分として本発明のペプチドのほかに他の有効成分を組み合わせて使用することもできる。本発明の医薬組成物の投与量としては、有効成分の本発明のペプチドの量として、通常は1日、体重あたり1μg/kg〜1000mg/kg、好ましくは0.1mg/kg〜500mg/kgの範囲で投与することができるが、患者の性状や疾患の症状に応じて適宜変更することができる。本発明のペプチドは、カルシトニンよりも強くカルシトニン受容体に作用するものであることから、従来のカルシトニン製剤と同様に疾患に適用することもできる。
【0038】
本発明のペプチドはまた、カルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)に相同性を有するペプチドも含まれるため、上記に記載した目的で利用できるのみならず、CGRPに類似した生理活性を利用することが可能である。
CGRPの生理活性としては、CGRP受容体に強く作用し、細胞内のcAMP産生を促進させる作用が知られている。また、CGRPは血管の弛緩作用を揺すること(Regul Pept. 1986, 15, 1−23等)、利尿を促進させること(Proc SocExp Biol Med 1998, 188, 316−322等)、血管内皮細胞や血管平滑筋、線維芽細胞などの細胞の増殖能を変化させること(Proc Natl Acad Sci USA.1990, 87, 3299−3303:Regul Pept 2001, 101, 169−178等)が報告されている。
【0039】
したがって、本発明のペプチドのなかのある種のもの、特にCGRPとの相同性の高いペプチドについては、(1)中枢神経系において発現し、(2)カルシトニン受容体に強く作用し、(3)細胞のcAMP産生能を促進させ、(4)ナトリウムイオンを濃度依存的に取り込む作用を有し、(5)カルシウムイオンの取り込みを抑制し、(6)細胞増殖を抑制する作用を有する、ことに加え、(7)カルシトニン関連ペプチド受容体に強く作用し、(8)血管の弛緩作用を有し、(9)利尿を促進させ、(10)血管内皮細胞や血管平滑筋、線維芽細胞の増殖能を変化させる作用などのCGRPが有する作用と類似する作用も合わせ持つものであることが期待されるが、必ずしも本発明のペプチドのすべてが(7)〜(10)に示される作用を有するものではない。
このようなCGRPの有する作用に基づけば、本発明のペプチドを含む医薬組成物は、前記した本発明の医薬組成物の使用法の他に次の目的に使用する製剤として利用可能である。すなわち、血管の弛緩作用を直接利用した降圧剤、中枢及び末梢神経系を介した血管弛緩作用を利用した降圧剤、利尿剤、血管平滑筋の増殖の抑制を利用したPTCA(経皮的冠動脈形成術)後の再狭窄を防ぐための薬剤などとしても使用できる可能性がある。
【0040】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【0041】
実施例1 (CRSPペプチドの抽出、単離)
ブタ脳20kgを4倍量の水中で10分間煮沸し、冷却後、最終的に1Mになるよう酢酸を添加してホモジェナイズし、遠心分離で不溶物を除去してブタ脳抽出液を作成した。これを限外濾過(ペリコンカセットPLAC #000−05,ミリポア社)で脱塩し、脱塩後の抽出液に氷冷下、終濃度66%になるようにアセトンをゆっくり加えた。沈殿を遠心分離により除去し、上精をエバポレーターによりアセトンを除去した後、逆相のカラム(LC−SORB SPW−C−ODS、ケムコ、1.5 l)に吸着させた。カラムを3倍量の0.5M酢酸で洗浄した後、3倍量の溶出バッファー(水:アセトニトリル:10%トリフルオロ酢酸=40:60:1)でペプチド画分を溶出した。溶出液はエバポレーターによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥した。
凍結乾燥標品は秤量後1M酢酸に溶解し、陽イオン交換樹脂(SP−Sephadex、ファルマシア社、3×28 cm)の充填されたオープンカラムに吸着させ、素通り画分(SP−I)、2Mピリジン(pH8.0)で溶出された溶出画分(SP−II)、2Mピリジン−酢酸(pH5.0)で溶出された画分(SP−III)に分画し、SP−III強イオン性画分を得た。この画分を凍結乾燥した後1M酢酸に溶解し、ゲル濾過(Sephadex G−50、ファルマシア社、7.5×145 cm、1M酢酸、流速100ml/h)で分子量に応じてフラクションに分画し、分子量1kDaから5kDaに相当する部分を集めた。これを再びゲル濾過(Sephadex G−25、ファルマシア社、7.5×145 cm、1M酢酸、流速100ml/h)で、分子量に応じた画分に分離し、分子量2kDaから4kDaに相当する部分を集め、凍結乾燥した。
【0042】
凍結乾燥標品をイオン交換クロマトグラフィー(CM52、Whatman社、2.4×45cm、A液:10mMギ酸アンモニウム(pH6.5):アセトニトリル=9:1、B液:1Mギ酸アンモニウム(pH6.5):アセトニトリル=9:1、流速35ml/h)を用いて、10mMから0.5Mまでギ酸アンモニウムによる濃度勾配溶出を行った。
ここで各画分の1/1000量を凍結乾燥し、凍結乾燥標品をダルベッコ改変イーグル培地(DMEM、0.05%牛血清アルブミンを含む)に溶解した培地でブタ腎臓由来の上皮細胞LLC−PK1を刺激して37℃1時間インキュベーションし、培地に分泌されるcAMP量をラジオイムノアッセイにより定量した。
方法は未知量のcAMPを含む培地及び既知濃度のcAMPを含む培地100μlに、4%になるように無水コハク酸を溶解したジオキサン−トリエチルアミン混合液(ジオキサン:トリエチルアミン=4:1)を等量加え、30分間室温で放置してcAMPをサクシニル化し、遠心エバポレーターで乾固した後、1mlの緩衝液(50mM酢酸ナトリウム(pH6.2)、1mMEDTA、0.025%アジ化ナトリウム、0.5%血清アルブミン、0.01%Triton X−100)に溶解し、その内100μlずつを試験管に取り分け、50μlずつ放射性標識したサクシニル化cAMP及び抗体を加え、4℃で48時間放置した。次に100μlの1%γ−グロブリン及び500μlの25%ポリエチレングリコールを添加してよく混和し、遠心分離を行って沈殿の放射活性をガンマカウンターを用いて測定し、既知濃度のcAMPにより作成した標準曲線の放射活性と比較することでcAMP量を定量した。
cAMP量の上昇が観察された画分(ギ酸アンモニウム(pH6.5)約0.3M)をさらに陽イオン交換HPLC(TSK−gel CM−2SW 、東ソー、7.8×300mm、A液:10mM ギ酸アンモニウム(pH3.8):アセトニトリル=9:1、B液:1Mギ酸アンモニウム(pH3.8):アセトニトリル=9:1、流速2ml/min)でギ酸アンモニウムの濃度勾配溶出を行った。再びそれぞれの画分の1/1000量を取り、活性を測定し、活性の観察された画分(ギ酸アンモニウム(pH3.8)約0.36M)を、さらに逆相HPLC(C18 218TP54、Vydac社、4.6×250mm、A液:水:アセトニトリル:10%トリフルオロ酢酸=90:10:1、B液:水:アセトニトリル:10%トリフルオロ酢酸=40:60:1、流速1ml/min)でアセトニトリルによる濃度勾配溶出を行い、活性を持つ画分(アセトニトリル約32%)を得た。これを再び逆相HPLC(diphenyl 219TP5215、Vydac社、2.1×150mm、A液:水:アセトニトリル:10%トリフルオロ酢酸=90:10:1、B液:水:アセトニトリル:10%トリフルオロ酢酸=40:60:1、流速0.2ml/min)にて分離し、(アセトニトリル約29%)最終的な精製標品を得た。
約50pmolのペプチドが得られた。このペプチドの分子量は4099で理論上の等電点は12.81と算出された。また上述の通りVydac社のC18カラム(4.6×250mm、218TP54)で0.1%TFA存在下、アセトニトリル濃度約32%で溶出される程度の疎水性を持っていた。
【0043】
実施例2 (CRSPのアミノ酸配列の決定)
アミノ酸配列はエドマン法による自動アミノ酸シーケンサーを用いて決定した。まず、5pmolの精製標品をN末端からアミノ酸シーケンサーを用いて解析し、 Ser−Xaa−Asn−Thr−Ala−Thr−Xaa−Met−Thr−His−Arg−Leu−Val−Gly−Leu−Leu−Ser−
Arg−Ser−Gly−Ser−Met−Valを決定した。次に10pmolの精製標品をトリプシン分解し、逆相HPLC(C18 218TP5215、Vydac社、2.1×150mm、A液:水:アセトニトリル:10%トリフルオロ酢酸=90:10:1、B液:水:アセトニトリル:10%トリフルオロ酢酸=40:60:1、流速0.2ml/min)でアセトニトリルによる濃度勾配溶出を行った。得られたピークをアミノ酸シーケンサーで解析し、
Ser−Xaa−Asn−Thr−Ala−Thr−Xaa−Met−Thr−His−Arg、
Leu−Val−Gly−Leu−Leu−Ser−Arg、
Ser−Gly−Ser−Met−Val−Arg、
Ser−Asn−Leu−Leu−Pro−Thr−Lys、
Met−Gly−Phe−Lys、
Val−Phe
の6個のシーケンスを得ることができた。これらの配列とデータベースとの比較から本ペプチドがカルシトニン遺伝子関連ペプチドと相同性を持ち、このペプチドが
Ser−Cys−Asn−Thr−Ala−Thr−Cys−Met−Thr−His−Arg−Leu−Val−Gly−Leu−Leu−Ser−
Arg−Ser−Gly−Ser−Met−Val−Arg−Ser−Asn−Leu−Leu−Pro−Thr−Lys−Met−Gly−Phe−
Lys−Val−Phe−NH2
という配列であると考えられた。
【0044】
一方、質量分析計により分子量を測定したところ、4130.6±0.7Daという結果が得られた。これはアミノ酸配列から予想される4042Daと約89Da異なっていたが、この差異は2個のメチオニンの酸化(16Da×2)とアミノ酸シーケンサーで判読できなかったC末端のグリシン(57Da)の存在によるものではないかと予想された。最終的には次の実施例3よりこれらの予想通りに、
Ser−Cys−Asn−Thr−Ala−Thr−Cys−Met−Thr−His−Arg−Leu−Val−Gly−Leu−Leu−Ser−
Arg−Ser−Gly−Ser−Met−Val−Arg−Ser−Asn−Leu−Leu−Pro−Thr−Lys−Met−Gly−Phe−
Lys−Val−Phe−Gly−NH2
(2番目のCysと7番目のCysの間でジスルフィド結合を形成する。)
であることが明らかになった。
得られたCRSPのアミノ酸配列を配列表の配列番号1に示し、CRSP−Glyのアミノ酸配列を配列番号2に示す。
【0045】
実施例3 (相補的DNA塩基配列及び前駆体アミノ酸配列)
プローブは実施例2のアミノ酸配列を基にN末端側
(TG(C/T)AA(C/T)AC(A/C/G/T)GC(A/C/G/T)AC(A/C/G/T)TG(C/T)ATGAC)
及びC末端側
(CC(A/G)AA(A/C/G/T)AC(C/T)TT(A/G)AA(A/C/G/T)CCCATA)
で合成プライマーを作成し、ブタ遺伝子を鋳型にPCR法で増幅することにより作成した。
相補的DNA λファージライブラリーはブタ視床下部mRNA(3μg)よりファルマシア社Time saver cDNA作成キット及びStratagene社のλZAPIIを用いて作成した。スクリーニングの方法は大腸菌をλファージ(約10万個の独立したクローンを持つ)に感染させてLB培地を含む0.7%アガロースと混合し、LB培地を含む1.5%寒天培地を敷いた培養皿に播き、37℃で8時間ほど培養した。冷蔵庫で2時間ほど冷却した後、形成したプラークをナイロンフィルターに転写し、アルカリ変性(0.5M水酸化ナトリウム+1.5M塩化ナトリウム溶液で2分間、0.5Mトリス−塩酸塩(pH7.5)+1.5M塩化ナトリウム溶液で2分間、45mMクエン酸ナトリウム(pH7.0)+450mM塩化ナトリウムで5分間処理を行う)後、フィルターを80℃で2時間乾燥させた。次に乾燥したフィルターをプレハイブリダイゼーション液(50%ホルムアミド、0.09Mクエン酸ナトリウム(pH7.0)、0.9M塩化ナトリウム、0.5%牛血清アルブミン、0.5%フィコール、0.5%ポリビニルピロリドン、0.5%ラウリル硫酸ナトリウム)に37℃で2時間浸し、そこに32Pで標識したプローブを加え、42℃で16時間ハイブリダイゼーションを行う。フィルターは洗浄液で洗浄(30mMクエン酸ナトリウム(pH7.0)、300mM塩化ナトリウム、0.1%ラウリル硫酸ナトリウム溶液、室温5分間を2回、3mMクエン酸ナトリウム(pH7.0)、30mM 塩化ナトリウム、0.1%ラウリル硫酸ナトリウム溶液、65℃1時間を2回行う)後、X線フィルムに感光させ、放射線により感光する部分を培養皿上のプラークと照合し、プラークから陽性クローンを単離した。
単離された陽性λファージクローンはStratagene社ヘルパーファージR408を用いてDNAシーケンスに適したベクターであるプラスミドpBluescriptに変換し、塩基配列はサンガー法により決定した。
決定された塩基配列を配列表の配列番号3に示し、そのアミノ酸配列を配列番号4に示す。
得られたCRSPは、ブタカルシトニン(CT)遺伝子関連ペプチド (CGRP)と71.1%、ヒトCGRP−Iと63.2%、ヒトCGRP−IIと71.1% のアミノ酸配列上の相同性を有していた(図2参照)。
【0046】
実施例4 (発現部位)
遺伝子の発現量のためのRNAの調製は酸性グアニジンフェノールクロロホルム抽出法により行った。約1gのブタ組織を5mlの変性液(4Mグアニジンチオシアン塩、25mMクエン酸ナトリウム(pH7.0)、0.1M 2−メルカプトエタノール、0.5%サルコシン酸ナトリウム)でホモジェナイズし、1/10量の2M酢酸ナトリウム、等量の水飽和フェノール、1/5量のクロロホルムを加えよく攪拌した後、遠心分離を行った。次に水層を分離してそこに等量の2−プロパノールを加えよく攪拌し−20℃で1時間静置し、再び遠心分離し、沈殿(RNA)を回収した。このRNAのうち30μgをホルムアルデヒド−アガロース変性ゲル(1%アガロース、2.2Mホルムアルデヒド、20mM Mops(pH7)、8mM酢酸ナトリウム、1mM EDTA)を用いて電気泳動を行い、泳動後のゲルを十分水洗してホルムアルデヒドを除去した後、0.05M水酸化ナトリウムに15分間、0.3Mクエン酸ナトリウム(pH7)+3M塩化ナトリウム溶液で45分間処理した。次にゲルに含まれるRNAをキャピラリブロット法でナイロンフィルターに転写し、RNAを転写したフィルターを80℃で乾燥させた。次にフィルターをAmbion社のULTRAhybハイブリダイゼーション液に37℃2時間浸した後、CRSPを暗号化している部分(cDNA上の346番目−488番目の間の塩基対)を32Pで標識したプローブを加え、42℃で16時間ハイブリダイゼーションさせた。ハイブリダイゼーション後、フィルターを洗浄液で洗浄(30mM クエン酸ナトリウム(pH7.0)、300mM塩化ナトリウム、0.1%ラウリル硫酸ナトリウム溶液、室温5分間を2回、1.5mMクエン酸ナトリウム(pH7.0)、15mM塩化ナトリウム、0.1%ラウリル硫酸ナトリウム溶液、65℃1時間を2回行う)後、X線フィルムに感光させ、RNAの定量を行った。
結果を図3に示す。
【0047】
実施例5 (発現量の測定)
各組織のペプチド含量は合成ペプチドに対して作成した抗体を利用してラジオイムノアッセイにより測定した。組織約1gを10倍量の水で煮沸し、氷冷後酢酸を1Mになるよう加え、ホモジェナイズ後、遠心分離により不溶物を除去して抽出液を作成した。この抽出液を凍結乾燥後、緩衝液(50mMリン酸ナトリウム(pH7.4)80mM塩化ナトリウム、25mM EDTA、0.5%Triton X−100,0.5%牛血清アルブミン0.05%アジ化ナトリウム)に溶解し、100μlずつ試験管に取り分けた。これらのCRSPを含む緩衝液及び既知濃度のCRSPを溶解した緩衝液に等量の放射性標識したCRSP及び抗体を加えて攪拌し、48時間4℃で静置した後、100μlのγ−globulin及び500μlの23%ポリエチレングリコールを添加してよく混和し、遠心後、沈殿の放射活性を既知濃度のCRSPにより作成した標準曲線の放射活性と比較することでCRSP量を定量した。
結果を表1に示す。表1は段落番号24に記載したものである。
【0048】
実施例6 (LLC−PK1細胞におけるCRSPのcAMP産生促進作用)
LLC−PK1細胞を栄養培地(10%牛胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM))中で培養し、2日後、0.05%牛血清アルブミンを含むDMEMに溶解したCRSPを細胞の栄養培地と置き換えて30分間インキュベーション後、培地を回収して、分泌されてきたcAMPの量をcAMP特異的な抗体を用いたラジオイムノアッセイにより定量した。
結果を図4に示す。
【0049】
実施例7 (LLC−PK1細胞におけるCRSP存在下でのナトリウムイオン、カルシウムイオンの取り込みの作用)
LLC−PK1細胞を6ウェル培養皿上、DMEM(10%FCSを含む)中で2日間培養した。ナトリウムイオンの取り込みの測定は以下のように行った。LLC−PK1細胞の培養液をハンクス−塩化コリン液に置換し、一定量の放射活性をもつ塩化ナトリウム(22Na)及びCRSPをそれぞれ終濃度0M、10−8M、10−7M、10−6Mになるように添加し、10分後、細胞を洗浄して細胞外液に含まれる22Naを完全に除去し、細胞内に取り込まれた放射活性をガンマカウンターにより測定した。また同様にLLC−PK1細胞の培養液をハンクス−塩化コリン液に置換し、一定量の放射活性を持つ塩化ナトリウム(22Na)及びそれぞれCRSPとNa/H共輸送体阻害剤であるアミロライド誘導体5−(N−エチル−N−イソプロピル)−アミロライド(5−(N−ethyl−N−isopropyl)−amiloride(EIPA))を終濃度CRSP 0M+EIPA 0M、CRSP10−6M+EIPA 0M、CRSP10−6M+EIPA10−8M、CRSP10−6M+EIPA10−7M、CRSP10−6M+EIPA10−6M、CRSP 0M+EIPA10−6Mとなるよう添加し、10分後、細胞を洗浄して細胞外液に含まれる22Naを完全に除去し、細胞内に取り込まれた放射活性をガンマカウンターにより測定した。
EIPAの非存在下における結果を図5に、またEIPA存在下における結果を図6にそれぞれ示す。
【0050】
カルシウムイオンの取り込みは以下のように行った。LLC−PK1細胞は塩化カルシウム濃度を0mMに下げたハンクス液(カルシウムフリーハンクス液)で洗浄した。CRSPと共に塩化カルシウム(45Ca)を細胞上のカルシウムフリーハンクス液に添加し、10分後、細胞を洗浄して細胞外液に含まれる45Caを完全に洗浄し、細胞内に取り込まれた放射活性を液体シンチレーションカウンターにより測定した。
結果を図7に示す。
【0051】
実施例8 (CRSPによる細胞増殖の抑制)
LLC−PK1細胞を24ウェルコラーゲンプレート上、DMEM(10%FCSを含む)中で2日間培養し、細胞をDMEMで一度洗った後、0,10−12〜10−6MのCRSPを含むDMEM(10%FCSを含む)に置換し培養した。2時間後、125Iで標識したブロモデオキシウリジンを含むDMEM(0.1%BSAを含む)を各ウエルに添加して、5時間後核内に取り込まれた放射活性をガンマカウンターにより測定し、細胞増殖に伴って合成されたDNA量を測定した。
結果を図8に示す。
同様に10,000細胞/ウェルのLLC−PK1細胞を24ウェルコラーゲンプレートに播き、DMEM(10%FCSを含む)で24時間培養した。各ウェルをDMEMで一度洗った後、0M、10−8M、10−6Mの濃度のCRSPを含むDMEM(10%FCSを含む)に培地を置換し培養した。24時間後、培養皿上の細胞をトリプシン−EDTA溶液で剥がし、細胞数を計数板にて計測した。
結果を図9に示す。
【0052】
実施例9 (カルシトニン受容体へのCRSPの作用)
ブタカルシトニン受容体(CTR)を哺乳類発現ベクターpcDNA3.1に導入し、アカゲザル腎細胞(COS−7)に発現させてCRSP刺激によるcAMP産生量をラジオイムノアッセイにより測定した。
結果を図10に示す。
同様にオポッサム腎細胞(OK細胞)にCTRを発現させてCRSP刺激によるcAMP産生量をラジオイムノアッセイ法により、ナトリウムイオンの取り込みを放射活性を持つ塩化ナトリウム(22Na)の取り込みをガンマカウンターで計測することにより測定した。
結果を図11及び図12にそれぞれ示す。
【0053】
実施例10 (CRSPのラットの血圧及び血漿中イオン濃度の変化)
生理食塩水に溶解した16nmol/kgに相当する量のCRSPを麻酔条件下でラット頸静脈より短期間に一度に投与した。
結果を図13及び図14に示す。
【0054】
実施例11 (CRSP−Glyペプチドの抽出、単離)
ブタ脳20kgを4倍量の水中で10分間煮沸し、冷却後、最終的に1Mになるよう酢酸を添加してホモジェナイズし、遠心分離で不溶物を除去してブタ脳抽出液を作成した。これを限外濾過(ペリコンカセットPLAC#000−05,ミリポア社)で脱塩し、脱塩後の抽出液に氷冷下、終濃度66%になるようにアセトンをゆっくり加えた。沈殿を遠心分離により除去し、上精をエバポレーターによりアセトンを除去した後、逆相のカラム(LC−SORB SPW−C−ODS、ケムコ、1.5 l)に吸着させた。カラムを3倍量の0.5M酢酸で洗浄した後、3倍量の溶出バッファー(水:アセトニトリル:10%トリフルオロ酢酸=40:60:1)でペプチド画分を溶出した。溶出液はエバポレーターによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥した。凍結乾燥標品は秤量後1M酢酸に溶解し、陽イオン交換樹脂(SP−Sephadex、ファルマシア社、3×28cm)の充填されたオープンカラムに吸着させ、素通り画分(SP−I)、2Mピリジン(pH8.0)で溶出される溶出画分(SP−II)、2Mピリジン−酢酸(pH5.0)で溶出される画分(SP−III)に分画し、SP−III強イオン性画分を得た。この画分を凍結乾燥した後1M酢酸に溶解し、ゲル濾過(SephadexG−50、ファルマシア社、7.5×145cm、1M酢酸、流速100ml/h)で分子量に応じてフラクションに分画し、分子量1kDaから5kDaに相当する部分を集めた。これを再びゲル濾過(SephadexG−25、ファルマシア社、7.5×145cm、1M酢酸、流速100ml/h)で、分子量に応じた画分に分離し、分子量2kDaから4kDaに相当する部分を集め、凍結乾燥した。
【0055】
凍結乾燥標品をイオン交換クロマトグラフィー(CM52、Whatman社、2.4×45cm、A液:10mMギ酸アンモニウム(pH6.5):アセトニトリル=9:1、B液:1Mギ酸アンモニウム(pH6.5):アセトニトリル=9:1、流速35ml/h)を用いて、10mMから0.5Mまでギ酸アンモニウムによる濃度勾配溶出を行った。
ここで各画分の1/1000量を凍結乾燥し、凍結乾燥標品をダルベッコ改変イーグル培地(DMEM、0.05% 牛血清アルブミンを含む)に溶解した培地でブタ腎臓由来の上皮細胞LLC−PK1を刺激して37℃1時間インキュベーションし、培地に分泌されるcAMP量をラジオイムノアッセイにより定量した。
方法は未知量のcAMPを含む培地及び既知濃度のcAMPを含む培地100μlに、4%になるように無水コハク酸を溶解したジオキサン−トリエチルアミン混合液(ジオキサン:トリエチルアミン=4:1)を等量加え、30分間室温で放置してcAMPをサクシニル化し、遠心エバポレーターで乾固した後、1mlの緩衝液(50mM酢酸ナトリウム(pH6.2)、1mM EDTA、0.025%アジ化ナトリウム、0.5%血清アルブミン、0.01% Triton X−100)に溶解し、その内100μlずつを試験管に取り分け、50μlずつ放射性標識したサクシニル化cAMP及び抗体を加え、4℃で48時間放置した。次に100μlの1%γ−グロブリン及び500μlの25%ポリエチレングリコールを添加してよく混和し、遠心分離を行って沈殿の放射活性をガンマカウンターを用いて測定し、既知濃度のcAMPにより作成した標準曲線の放射活性と比較することでcAMP量を定量した。
CRSP−GlyによるcAMP産生の上昇はギ酸アンモニウム(pH6.5)約0.27Mで溶出される画分に観察された。さらに陽イオン交換HPLC(TSK−gel CM−2SW、東ソー、7.8×300mm、A液:10mMギ酸アンモニウム(pH3.8):アセトニトリル=9:1、B液:1Mギ酸アンモニウム(pH3.8):アセトニトリル=9:1、流速2ml/min)でギ酸アンモニウムの濃度勾配溶出を行った。再びそれぞれの画分の1/1000量を取り、活性を測定し、活性の観察された画分(ギ酸アンモニウム(pH3.8)約0.36Mで溶出)を、さらに逆相HPLC(C18 218TP54、Vydac社、4.6×250mm、A液:水:アセトニトリル:10%トリフルオロ酢酸=90:10:1、B液:水:アセトニトリル:10%トリフルオロ酢酸=40:60:1、流速1ml/min)でアセトニトリルによる濃度勾配溶出を行い、活性を持つ画分(アセトニトリル約32%で溶出)を得た。これを再び逆相HPLC(diphenyl 219TP5215、Vydac社、2.1×150mm、A液:水:アセトニトリル:10%トリフルオロ酢酸=90:10:1、B液:水:アセトニトリル:10%トリフルオロ酢酸=40:60:1、流速0.2ml/min)にて分離し、(アセトニトリル約29%で溶出)最終的な精製標品を得た。
実際の精製行程において約50pmolのペプチドが得られた。このペプチドの分子量は4157Daで理論上の等電点は11.41と算出された。また上述の通りVydac社のC18カラム(4.6×250mm、218TP54)で0.1%TFA存在下、アセトリトリル濃度約32%で溶出される程度の疎水性を持っていた。
【0056】
実施例12 (CRSP−GlyのcAMP産生促進作用)
ブタカルシトニン受容体(CTR)を哺乳類発現ベクターpcDNA3.1に導入し、アカゲザル腎細胞(COS−7)に発現させてCRSP又は、CRSP−Gly刺激によるcAMP産生量をラジオイムノアッセイにより測定した。
結果を図15に示す。
【0057】
実施例13 (イヌ・ウシCRSPの遺伝子クローニング)
RNAはイヌ及びウシの甲状腺より、酸性グアニジンフェノールクロロホルム抽出法により抽出した。mRNAの精製は宝酒造Oligotex−dT30mRNA精製キットを用いて行った。相補的DNAλファージライブラリーはイヌ及びウシの甲状腺mRNA(3μg)よりファルマシア社Time savercDNA作成キット及びStratagene社 λZAPIIを用いて作成した。プローブはブタカルシトニン受容体刺激ペプチドの全長約700bpを用いた。スクリーニングの方法は大腸菌をλファージ(約30万個の独立したクローンを持つ)に感染させてLB培地を含む0.7%アガロースと混合し、LB培地を含む1.5%寒天培地を敷いた培養皿に播き、37℃で8時間ほど培養した。冷蔵庫で2時間ほど冷却した後、形成したプラークをナイロンフィルターに転写し、アルカリ変性(0.5M水酸化ナトリウム+1.5M塩化ナトリウム溶液で2分間、0.5Mトリス−塩酸塩(pH7.5)+1.5M塩化ナトリウム溶液で2分間、45mMクエン酸ナトリウム(pH7.0)+450mM塩化ナトリウムで5分間処理を行う)後、フィルターを80℃で2時間処理した。次にフィルターをプレハイブリダイゼーション液(20%ホルムアミド、0.09Mクエン酸ナトリウム(pH7.0)、0.9M塩化ナトリウム、0.5%牛血清アルブミン、0.5%フィコール、0.5%ポリビニルピロリドン、0.5%ラウリル硫酸ナトリウム)に37℃で2時間浸し、そこに32Pで標識したプローブを加え、42℃で16時間ハイブリダイゼーションを行った。フィルターは洗浄液で洗浄(30mMクエン酸ナトリウム(pH7.0)、300mM塩化ナトリウム、0.1%ラウリル硫酸ナトリウム溶液、室温5分間を2回、15mMクエン酸ナトリウム(pH7.0)、150mM塩化ナトリウム、0.1%ラウリル硫酸ナトリウム溶液、60℃1時間を2回行う)後、X線フィルムに感光させ、放射線により感光する部分を培養皿上のプラークと照合し、プラークから陽性クローンを単離した。単離された陽性λファージクローンはStratagene社ヘルパーファージR408を用いてDNAシーケンスに適したベクターであるプラスミドpBluescriptに変換し、塩基配列はサンガー法により決定した。
決定されたウシCRSPをコードするcDNAの塩基配列を後記配列表の配列番号7に示し、そのコードするウシCRSPの前駆体ペプチドのアミノ酸配列を配列番号8に示す。また、ウシCRSPのアミノ酸配列を配列番号6に示す。
決定されたイヌCRSPをコードするcDNAの塩基配列を後記配列表の配列番号10に示し、そのコードするイヌCRSPの前駆体ペプチドのアミノ酸配列を配列番号11に示す。また、イヌCRSPのアミノ酸配列を配列番号9に示す。
【0058】
実施例14(ウシCRSP又はイヌCRSP刺激によるcAMP産生量の定量)
LLC−PK1細胞を栄養培地(10%牛胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM))中で培養した。2日後、細胞を0.05%牛血清アルブミンを含むDMEMで2回洗浄し、培養皿中の培地を0.5mMの3−イソブチル−1−メチルキサンチン(3−isobutyl−1−methylxanthine)及び0.05%牛血清アルブミンを含むDMEM(DMEM/BSA/IBMX)に置き換えて37℃で30分間インキュベーションした。インキュベーション後、培地を0M及び10−12〜10−6MになるようCRSPを溶解したDMEM/BSA/IBMXに置換し、37℃で10分間インキュベーションした。インキュベーション後、培養皿中の培地を除き、そこにエタノールを加え、細胞を破砕するために培養皿を冷凍庫で一回凍結させた。次にエタノールを試験管に移し、遠心エバポレーターを用いて標品を乾固させた。乾固した標品はDMEMに溶解し、100μlずつ取り分け、4%になるように無水コハク酸を溶解したジオキサン−トリエチルアミン混合液(ジオキサン:トリエチルアミン=4:1)を等量加え、30分間室温で放置してcAMPをサクシニル化させた。再び遠心エバポレーターで乾固した後、1mlの緩衝液(50mM酢酸ナトリウム(pH6.2)、1mM EDTA、0.025%アジ化ナトリウム、0.5%血清アルブミン、0.01% Triton X−100)に溶解し、その内100μlずつを試験管に取り分け、50μlの放射性標識したサクシニル化cAMP及び50μlの抗体を加え、4℃で48時間放置した。次に100μlの1% γ−グロブリン及び500μlの25%ポリエチレングリコールを添加してよく混和し、遠心分離を行って沈殿の放射活性をガンマカウンターを用いて測定し、既知濃度のcAMPにより作成した標準曲線の放射活性と比較することでcAMP量を定量した。
結果を図16に示す。
【0059】
実施例15(CRSP−2及びCRSP−3/CT−2前駆体遺伝子のクローニング)
ブタ遺伝子ライブラリーはクローンテック社から購入した。プローブはブタカルシトニン受容体刺激ペプチドの前駆体cDNA全長約700bpを用いた。スクリーニングの方法は大腸菌をブタ遺伝子が挿入されたλファージ(約100万個の独立したクローンを持ち、その内約30万個について行った)に感染させてLB培地を含む0.7%アガロースと混合し、LB培地を含む1.5%寒天培地を敷いた培養皿に播き、37℃で8時間ほど培養した。冷蔵庫で2時間ほど冷却した後、形成したプラークをナイロンフィルターに転写し、アルカリ変性(0.5M水酸化ナトリウム+1.5M塩化ナトリウム溶液で2分間、0.5Mトリス−塩酸塩(pH7.5)+1.5M塩化ナトリウム溶液で2分間、45mMクエン酸ナトリウム(pH7.0)+450mM塩化ナトリウムで5分間処理を行う)後、フィルターを80℃で2時間処理した。次にフィルターをプレハイブリダイゼーション液(20%ホルムアミド、0.09Mクエン酸ナトリウム(pH7.0)、0.9M塩化ナトリウム、0.5%牛血清アルブミン、0.5%フィコール、0.5%ポリビニルピロリドン、0.5%ラウリル硫酸ナトリウム)に37℃で2時間浸し、そこに32Pで標識したプローブを加え、42℃で16時間ハイブリダイゼーションを行った。フィルターは洗浄液で洗浄(30mMクエン酸ナトリウム(pH7.0)、300mM塩化ナトリウム、0.1%ラウリル硫酸ナトリウム溶液、室温5分間を2回、7.5mMクエン酸ナトリウム(pH7.0)、75mM塩化ナトリウム、0.1%ラウリル硫酸ナトリウム溶液、55℃、1時間を2回行った)後、X線フィルムに感光させ、放射線により感光する部分を培養皿上のプラークと照合し、プラークから陽性クローンを単離した。単離された陽性λファージクローンは種々の制限酵素を用いて切断し、サザンブロッティング法により解析を行って制限酵素地図を作製した後、適当な制限酵素を用いて陽性クローンを含むDNAをpBluescriptにサブクローニングした。塩基配列はサンガー法により決定した。スクリーニングの結果、25個の陽性クローンを得ることができた。制限酵素による解析及び塩基配列決定の結果、10個のクローンはCRSPの遺伝子をコードしていることが判明した(図17)。残りの15個のクローンの内、9個は別の遺伝子を(図18及び図19)、6個はさらに別の遺伝子をコードしていることが判った。9個の遺伝子はCRSPと相同性を持つ配列を有していた。この遺伝子をCRSP−2と名付けた。また別の6個の遺伝子はCRSPとCTに相同性を有する配列を持っていた。これら遺伝子をCRSP−3及びCT−2と名付けた。図17〜19において下線部がエクソンを示す。
CRSP遺伝子の塩基配列を後記配列表の配列番号5に記載する。また、CRSP−2遺伝子を配列表の配列番号15に記載する。CRSP−3遺伝子とCT−2遺伝子を含むDNA断片の塩基配列を配列表の配列番号23に記載する。
【0060】
CRSPやCT/CGRPの遺伝子配列を参考に推定したcDNA配列は図20〜22に示す(図20:CRSP−2、図21:CRSP−3、図22:CT−2)。図20〜22において、実線で囲まれた部分が成熟ペプチドで、灰色がアミドに変換されると推定されるグリシン、斜体部がシグナルペプチド、図22における成熟体のN末端側にあるグルタミンはピログルタミン酸に変換されると推定される。また各CRSPとCGRPやAM、CT−2とCTのアミノ酸の比較を行ったものが図23である。
CRSP−2のcDNAの塩基配列を後記配列表の配列番号13に、CRSP−3のcDNAを配列番号17に、CT−2のcDNAを配列番号21に記載する。
CRSP−2、CRSP−3とCT−2の成熟体アミノ酸配列は以下であると予想される。
CRSP−2のアミノ酸配列を後記配列表の配列番号12に、CRSP−3を配列番号16に、CT−2を配列番号19に記載する。
【0061】
実施例16(CRSP−2の前駆体cDNAクローニング)
cDNAライブラリーはCRSPのcDNAクローニングを行った時に作成したブタ視床下部cDNAが挿入されたλファージライブラリーを用いた。プローブはブタカルシトニン受容体刺激ペプチドの全長約700bpを用いた。スクリーニングの方法は大腸菌をブタ視床下部cDNAが挿入されたλファージに感染させてLB培地を含む0.7%アガロースと混合し、LB培地を含む1.5%寒天培地を敷いた培養皿に播き、37℃で8時間ほど培養した。冷蔵庫で2時間ほど冷却した後、形成したプラークをナイロンフィルターに転写し、アルカリ変性(0.5M水酸化ナトリウム+1.5M塩化ナトリウム溶液で2分間、0.5Mトリス−塩酸塩(pH7.5)+1.5M塩化ナトリウム溶液で2分間、45mMクエン酸ナトリウム(pH7.0)+450mM塩化ナトリウムで5分間処理を行う)後、フィルターを80℃で2時間処理した。次にフィルターをプレハイブリダイゼーション液(20%ホルムアミド、0.09Mクエン酸ナトリウム(pH7.0)、0.9M塩化ナトリウム、0.5%牛血清アルブミン、0.5%フィコール、0.5%ポリビニルピロリドン、0.5%ラウリル硫酸ナトリウム)に37℃で2時間浸し、そこに32Pで標識したプローブを加え、42℃で16時間ハイブリダイゼーションを行った。フィルターは洗浄液で洗浄(30mMクエン酸ナトリウム(pH7.0)、300mM塩化ナトリウム、0.1%ラウリル硫酸ナトリウム溶液、室温5分間を2回、15mMクエン酸ナトリウム(pH7.0)、150mM塩化ナトリウム、0.1%ラウリル硫酸ナトリウム溶液、60℃1時間を2回行う)後、X線フィルムに感光させ、放射線により感光する部分を培養皿上のプラークと照合し、プラークから陽性クローンを単離した。単離された陽性λファージクローンはStratagene社ヘルパーファージR408を用いてDNAシーケンスに適したベクターであるプラスミドpBluescriptに変換し、塩基配列はサンガー法により決定した。以上の結果、13個の陽性クローンを得ることができた。その内6個は全てCRSP前駆体cDNAのほぼ全長を含むクローンであり、また別の6個は全てCRSP−2前駆体cDNAのほぼ全長を含むクローンであった(図20)。残りの1個はCRSP−3の3’非翻訳領域をコードする短いクローンであった。
【0062】
実施例17(CRSP−3及びCT−2 cDNAのクローニング)
ブタ視床下部cDNA(mRNAで20ng分)を鋳型にし、プライマー
(CRSP−3:GCCCAGCTTACGTCTCCTTT及びTCAGGTAACTGCAATGATTT、CT−2:AGCAGCTTTGATTCTGCCAC及びACCTCCTCTCTGATATTCCA)及び宝酒造PyrobestDNAポリメラーゼを用いて、94℃15秒−55℃15秒−72℃1分−30サイクルのPCR法を行った。増幅されたDNAはアガロースゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマイドで染色されたバンドをアガロースゲルから回収した後、Stratagene社pBluescriptIIにサブクローニングし、サンガー法により塩基配列を決定した。
CRSP−3のプライマーを用いて増幅されたDNAの塩基配列の解析を行った結果、CRSP−3をコードしている事が判明した(図5)。一方CT−2のプライマーを用いたPCRではDNAの増幅が観察されなかった。
【0063】
実施例18(RT−PCRによるCRSP、CRSP−2、CRSP−3、CT−2、CT、CGRP、GAPDHの遺伝子発現量の高感度定量)
ブタの各組織のtotal RNA(4μg)及びoligo dTプライマー及び東洋紡Revertra Ace逆転写酵素キットを用いて鋳型cDNAを作成し、そのうち1/40をRT−PCRに用いた。各遺伝子cDNAを増幅するためのPCRは東洋紡rTaqポリメラーゼを用いて94℃15秒−60℃15秒−72℃1分−30サイクルで行い、プライマーは以下の配列を用いた。
CRSP:CTCTCTGAGGAGGAATCACG及び GAGTTCAGAGTCATAGTAACC
CRSP−2: CTCACAGAGGAGGAAGTGTC及びTAGAGTTCAGTTCCTTGGTG
CRSP−3: AGCAGCTTTGATTCTGCCAC及びTGCAGTGAAAGCAACTTGAG
CT−2: AGCAGCTTTGATTCTGCCAC及びACCTCCTCTCTGATATTCCA
CT: GCCACTCAGTGAGAAGGAAG及びTGAGGCATGAGGGATGAAGC
CGRP:GCCACTCAGTGAGAAGGAAG及びTCACCTTACATGTGTCCCCA
GAPDH:TCACTGCCACCCAGAAGACT及びAGTGGTCGTTGAGGGCAATG
増幅されたDNAは3%アガロースゲルで電気泳動を行い、フジフィルムFLA2000を用いて解析した。結果としてCRSP−2及びCRSP−3は中枢及び甲状腺、卵巣に発現が観察された。一方CT−2は何れの組織でもバンドが増幅されず、発現が観察されなかった(図24)。CT−2は図24に示された組織以外に限局して発現しているものと考えられる。
【0064】
【発明の効果】
本発明は、中枢神経に発現し、カルシトニン受容体に強く作用する新規かつ有用なペプチドを提供するものである。本発明のペプチドは、カルシトニン遺伝子関連ペプチドと高い相同性を有し、カルシトニンよりも強い作用を有する。また中枢神経系に多量に発現しており、新規なカルシトニン様ペプチドとして骨粗鬆症や鎮痛剤などとして極めて有用なペプチドである。
【0065】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図1】図1は、本発明のペプチドのCRSPの構造を模式的に示すものである。
【図2】図2は、本発明のペプチドのCRSP(pCRSP)のアミノ酸配列と、ブタカルシトニン遺伝子関連ペプチド(pCGRP−I)、ヒトカルシトニン遺伝子関連ペプチドI(hCGRP−I)、ヒトカルシトニン遺伝子関連ペプチドII(hCGRP−II)、ヒトアミリン(hAmylin)、ブタカルシトニン(pCT)、及びヒトアドレノメデュリン(hAM)のアミノ酸配列との比較を示すものである。
【図3】図3は、本発明のペプチドのCRSPの発現部位を調べるためにノーザンブロッティングを行った結果を示す図面に代わる写真である。図3中の矢印は、CRSPの位置を示している。
【図4】図4は、LLC−PK1細胞を用いた本発明のペプチドのCRSPのcAMP産生活性を検討した結果を示すものである。図4の縦軸はcAMPの産生量(pmol/105細胞/30分)を示し、横軸は各ペプチドの濃度の逆対数(−log(ペプチド濃度(M))を示す。図4の黒丸(●)は本発明のCRSPを示し、白丸(○)はブタカルシトニン遺伝子関連ペプチド(pigCGRP)を示し、白菱形(◇)はブタカルシトニン(pigCT)をそれぞれ示す。
【図5】図5は、LLC−PK1細胞を用いた本発明のペプチドのCRSPによるEIPA非存在下でのナトリウムイオンの取り込み試験の結果を示すものである。図5の縦軸は各イオンの取り込み量(cpm)を示し、横軸に左端はコントロール(ペプチド無添加)を示し、その右は各濃度のCRSPを示す。***はp<0.001で有意差があったことを示す。
【図6】図6は、LLC−PK1細胞を用いた本発明のペプチドのCRSPによるEIPA存在下でのナトリウムイオンの取り込み試験の結果を示すものである。図6の縦軸は各イオンの取り込み量(cpm)を示し、横軸に左端はコントロール(ペプチド無添加)を示し、その右は各濃度のCRSPとEIPAを示す。***はp<0.001で有意差があったことを示す。
【図7】図7は、LLC−PK1細胞を用いた本発明のペプチドのCRSPによるカルシウムイオンの取り込み試験の結果を示すものである。図7の縦軸は各イオンの取り込み量(cpm)を示し、横軸に左端はコントロール(ペプチド無添加)を示し、その右はsCT(サケカルシトニン)及びCRSPを示す。*はp<0.05で、**はp<0.01で有意差があったことを示す。
【図8】図8は、LLC−PK1細胞における本発明のペプチドのCRSPによる細胞増殖に伴って合成されたDNA量の測定結果を示す。図8の縦軸は125I−DUの取り込み量(×100cpm/ウエル)を示し、横軸は各ペプチドの濃度の逆対数(−log(ペプチド濃度(M)))を示す。図8の黒丸(●)は本発明のCRSPを示し、白丸(○)はブタカルシトニン(ブタCT)を示し、白菱形(◇)はサケカルシトニン(サケCT)をそれぞれ示す。
【図9】図9は、LLC−PK1細胞における本発明のペプチドのCRSPによる細胞増殖に伴う細胞数を計数板にて計測結果を示す。図9の縦軸は細胞数(×1,000 細胞/ウエル)を示し、横軸は左端はコントロール(CRSP無添加)を示し、その右は各濃度のCRSPを示す。*印はp<0.05で有意差があったことを示す。
【図10】図10は、遺伝子工学的にカルシトニン受容体を発現している細胞(COS−7)における本発明のペプチドのCRSP刺激によるcAMP産生能測定結果を示す。図10の縦軸はcAMPの産生量(pmol/ウエル/30分)を示し、横軸は各ペプチド(リガンド)の濃度の逆対数(−log(リガンド濃度(M))を示す。図10の黒丸(●)は本発明のCRSPを示し、白菱形(◇)はブタカルシトニン(pCT)をそれぞれ示す。
【図11】図11は、ブタカルシトニン受容体(CTR)を発現させたオポッサム腎上皮細胞における本発明のペプチドのCRSP刺激によるcAMP産生能測定結果を示す。図11の縦軸はcAMPの産生量(fmol/ウエル/1時間)を示し、横軸はCRSPの濃度の逆対数(−log(CRSP濃度(M)))を示す。図11の黒丸(●)はブタカルシトニン受容体(CTR)を導入したオポッサム腎上皮細胞の場合を示し、黒四角(■)はオポッサム腎上皮細胞(OK細胞)の場合を示す。
【図12】図12は、ブタカルシトニン受容体(CTR)を発現させたオポッサム腎上皮細胞における本発明のペプチドのCRSP刺激によるナトリウムイオンの取り込み試験の結果を示す。図12の縦軸はナトリウムイオンの取り込み量の比(コントロールを100とする)を示し、横軸はCRSPの濃度の逆対数(−log(CRSP濃度(M)))を示す。図12の黒丸(●)はブタカルシトニン受容体(CTR)を導入したオポッサム腎上皮細胞の場合を示し、黒四角(■)はオポッサム腎上皮細胞(OK細胞)の場合を示す。 図12中の***印はp<0.001で有意差があったことを示す。
【図13】図13は、ラットにおける本発明のペプチドのCRSP投与による血中カルシウム濃度の変化を測定した結果を示す。図13の縦軸は血中カルシウム濃度(mM)を示し、横軸は時間(分)を示す。図13中の**印はp<0.01で有意差があったこと示す。
【図14】図14は、ラットにおける本発明のペプチドのCRSP投与による血圧の変化を測定した結果を示す。図14の縦軸は血圧(mmHg)を示し、横軸は時間(分)を示す。
【図15】図15は、ブタカルシトニン受容体(CTR)を哺乳類発現ベクターpcDNA3.1に導入し、アカゲザル腎細胞(COS−7)に発現させた細胞に対し、CRSP又はCRSP−Gly刺激によるcAMP産生量をラジオイムノアッセイにより測定した結果を示す。縦軸はcAMPの産生量(pmol/ウエル/130分)を示し、横軸はCRSPの濃度の逆対数(−log(CRSP濃度(M)))を示す。
【図16】図16は、LLC−PK1細胞を用いた本発明のペプチドのブタCRSP、ウシCRSP及びイヌCRSPのcAMP産生促進活性を検討した結果を示すものである。縦軸はcAMPの産生量(pmol/ウエル/10分)を示し、横軸はCRSPの濃度の逆対数(−log(CRSP濃度(M)))を示す。図16の(■)はブタCRSPを示し、(●)はウシCRSPを示し、(▲)はイヌCRSPをそれぞれ示す。
【図17】図17は、CRSP遺伝子の塩基配列を示す。下線部がエクソンを示す。下線部の下にCRSP遺伝子のコードするアミノ酸配列を示す。
【図18】図18は、CRSP−2遺伝子の塩基配列の前半部分(1〜3840塩基)を示す。
【図19】図19は、CRSP−2遺伝子の塩基配列の後半部分(3841〜7673塩基)を示す。下線部がエクソンを示す。下線部の下にCRSP−2遺伝子のコードするアミノ酸配列を示す。
【図20】図20は、CRSP−2のcDNA塩基配列を示す。図20において、実線で囲まれた部分が成熟ペプチドで、灰色がアミドに変換されると推定されるグリシンを示す。
【図21】図21は、CRSP−3のcDNA塩基配列を示す。図21において、実線で囲まれた部分が成熟ペプチドで、灰色がアミドに変換されると推定されるグリシンを示す。
【図22】図22は、CT−2のcDNA塩基配列を示す。図22において、実線で囲まれた部分が成熟ペプチドで、灰色がアミドに変換されると推定されるグリシンを示す。図22における成熟体のN末端側にあるグルタミンはピログルタミン酸に変換されると推定される。
【図23】図23は、各CRSPとCGRPやAM、CT−2とCTのアミノ酸の比較を行った図を示す。
本発明のペプチドのCRSP(pCRSP)、CRSP−2(pCRSP−2)、CRSP−3(pCRSP−3)、CT−2(pCT−2)のアミノ酸配列と、ブタカルシトニン遺伝子関連ペプチド(pCGRP)、ブタカルシトニン(pCT)、及びブタアドレノメデュリン(pAM)のアミノ酸配列との比較を示すものである。
【図24】図24は、CRSP、CRSP−2、CRSP−3、CT−2、CT、CGRPの遺伝子発現量をRT−PCRにより高感度定量した結果を示す。図の縦軸に各種遺伝子を、横軸に遺伝子発現量を測定したブタの組織を示す。トータルRNA量の補正のためにGAPDH(グリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵素)の発現量についても測定した。
Claims (9)
- 次の(1)〜(6)の性質、
(1)中枢神経系において発現し、(2)カルシトニン受容体に強く作用し、(3)細胞のcAMP産生能を促進させ、(4)ナトリウムイオンを濃度依存的に取り込む作用を有し、(5)カルシウムイオンの取り込みを抑制し、(6)細胞増殖を抑制する作用を有するペプチド。 - 少なくとも次ぎのアミノ酸配列、
Ser−Cys−Asn−Thr−Ala−Thr−Cys−Met−Thr−His− 10
Arg−Leu−Val−Gly−Leu−Leu−Ser−Arg−Ser−Gly− 20
Ser−Met−Val−Arg−Ser−Asn−Leu−Leu−Pro−Thr− 30
Lys−Met−Gly−Phe−Lys−Val−Phe−Gly−NH2 38
又はこれらのアミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加を受けたアミノ酸配列を有する請求項1に記載のペプチド。 - ペプチドが少なくとも配列表の配列番号1、配列番号2、配列番号6、配列番号9、配列番号12、配列番号16、若しくは配列番号19で示されるアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加を受けたアミノ酸配列を有する請求項1又は2に記載のペプチド。
- 哺乳動物由来のペプチドである請求項1〜3のいずれかに記載のペプチド。
- 請求項1〜4のいずれかに記載のペプチドをコードする遺伝子。
- 遺伝子が、配列表の配列番号3、配列番号7、配列番号10、配列番号13、配列番号17、又は配列番号20で示される塩基配列を有するものである請求項5に記載の遺伝子。
- 請求項1〜4のいずれかに記載のペプチド、及び製薬上許容される担体とからなる医薬組成物。
- 医薬組成物が、骨粗鬆症の予防・治療剤、癌の予防・治療剤、利尿剤、食欲抑制剤、又は鎮痛剤である請求項7に記載の医薬組成物。
- 医薬組成物が、降圧剤、又はPTCA(経皮的冠動脈形成術)後の再狭窄を防ぐための薬剤である請求項7に記載の医薬組成物。
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Cited By (5)
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