JP2002233387A - 慢性腎不全の標的およびマーカーであるＣＲＦＧ−１ａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 CRFG-1aポリペプチドおよびポリヌクレオチ
ド、前記ポリペプチドの組換え法による生産方法、並び
に疾病の治療と診断アッセイにおけるそれらの使用の提
供。 【解決手段】 特定のアミノ酸配列を有するCRFG-1aポ
リペプチドをコードするヌクレオチド配列と全長におい
て少なくとも８０％同一であり、かつCRFG-1aポリペプ
チドの活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオ
チド配列、またはこのヌクレオチド配列に対して相補的
なヌクレオチド配列を含んでなる単離されたポリヌクレ
オチド。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新たに同定された
ポリヌクレオチド、このポリヌクレオチドによりコード
されるポリペプチド、前記のポリヌクレオチドおよびポ
リペプチドの使用、並びにその生産方法に関する。より
詳細には、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチ
ドは、慢性腎不全遺伝子-1a(以後CRFG-1aと略記する)と
称するＧＴＰ結合タンパク質ファミリーに関する。本発
明はまた、このようなポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドの作用を阻害または活性化することに関する。

【０００２】

【従来の技術】CRFG-1aの配列は、特性決定が行われて
いない酵母(YPL093w)ハロバクテリウム・クチルブラム
(Halobacterium cutirubrum)由来の推定ＧＴＰ結合タン
パク質およびメタノバクテリウム・サーモオートトロフ
ィカム(Methanobacterium thermoautotrophicum)由来の
GTP1/OBGファミリーのＧＴＰ結合タンパク質に類似して
いる。ＧＴＰ結合タンパク質は細胞内輸送、タンパク質
ターゲッティングおよび小胞融合において重要な役割を
担っている。こうしたことは、ＧＴＰ結合タンパク質フ
ァミリーに治療用ターゲットとしての確立され実証され
た歴史があることを示している。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】明らかに、慢性腎疾
患、腎性虚血、糖尿病性腎症、急性腎不全、神経変性疾
患およびアルツハイマー病を含むがこれらに限らない、
機能障害または疾病を予防し、改善し、治療する上で何
らかの役割を果たすＧＴＰ結合タンパク質ファミリーの
新たなメンバーを同定して特性づける必要性が存在して
いる。本発明はかかるメンバーを提供するものである。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明は、一つの態様に
おいて、CRFG-1aポリペプチドおよび組換え物質、並び
にその生産方法に関する。本発明のもう一つの態様はCR
FG-1aポリペプチドおよびポリヌクレオチドの使用方法
に関する。こうした使用には、とりわけ、慢性腎疾患、
腎性虚血、糖尿病性腎症、急性腎不全、神経変性疾患お
よびアルツハイマー病の治療が含まれる。他の態様で
は、本発明は、本発明により提供される物質を用いてア
ゴニストおよびアンタゴニストを同定する方法、並びに
同定された化合物を用いてCRFG-1aの平衡異常と関連し
た状態を治療することに関する。本発明のさらに他の態
様は、不適当なCRFG-1a活性またはCRFG-1aレベルと関連
した疾病を検出するための診断アッセイに関する。

【０００５】定義 下記の定義は、本明細書中で頻繁に使用される用語を理
解しやすくするためのものである。「CRFG-1a」とは、
特に、一般的には配列番号２で表されるアミノ酸配列を
有するポリペプチドまたはそのアレル変異体を意味す
る。「CRFG-1a活性またはCRFG-1aポリペプチド活性」ま
たは「CRFG-1aまたはCRFG-1aポリペプチドの生物学的活
性」とは、類似の活性、向上した活性、または望ましく
ない副作用が低下したこれらの活性を含めて、CRFG-1a
の代謝的または生理的機能を意味する。さらに、前記CR
FG-1aの抗原的および免疫原的活性も含まれる。「CRFG-
1a遺伝子」とは、配列番号１で表されるヌクレオチド配
列を有するポリヌクレオチドまたはそのアレル変異体お
よび／またはそれらの相補体を意味する。

【０００６】本明細書中で用いる「抗体」には、ポリク
ローナルおよびモノクローナル抗体、キメラ抗体、一本
鎖抗体、ヒト化抗体、さらにＦａｂまたは他の免疫グロ
ブリン発現ライブラリーの産物を含むＦａｂフラグメン
トが含まれる。「単離された」とは、天然の状態から
「人間の手によって」改変されたことを意味する。「単
離された」組成物または物質が天然に存在するのであれ
ば、それはそのもとの環境から変化しているか移動して
おり、またはその両方である。例えば、生存している動
物の体内に自然界で存在するポリヌクレオチドまたはポ
リペプチドは「単離された」ものではないが、その天然
状態の共存物質から分離されたポリヌクレオチドまたは
ポリペプチドは、本明細書中で用いられるように、「単
離された」ものである。

【０００７】「ポリヌクレオチド」とは、一般に任意の
ポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオ
チドをさし、これは修飾されていないＲＮＡもしくはＤ
ＮＡ、または修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡであり得
る。「ポリヌクレオチド」には、制限するものではない
が、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領
域が混じり合ったＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、
一本鎖領域と二本鎖領域が混じり合ったＲＮＡ、ＤＮＡ
とＲＮＡを含むハイブリッド分子（一本鎖でも、または
より典型的には二本鎖でもよく、一本鎖領域と二本鎖領
域が混じり合ったものでもよい）が含まれる。加えて、
「ポリヌクレオチド」はＲＮＡまたはＤＮＡまたはＲＮ
ＡとＤＮＡの両方からなる三重鎖領域を意味する。「ポ
リヌクレオチド」という用語はまた、１個以上の修飾塩
基を含有するＤＮＡまたはＲＮＡ、および安定性または
他の理由のために修飾された骨格を有するＤＮＡまたは
ＲＮＡも含む。「修飾」塩基としては、例えば、トリチ
ル化された塩基およびイノシンのような特殊な塩基があ
る。ＤＮＡおよびＲＮＡに対してさまざまな修飾が行わ
れてきた。こうして、「ポリヌクレオチド」は、自然界
に一般的に存在するポリヌクレオチドの化学的、酵素的
または代謝的に修飾された形態、並びにウイルスおよび
細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を包含
する。また、「ポリヌクレオチド」は、しばしばオリゴ
ヌクレオチドと称される比較的短いポリヌクレオチドも
包含する。

【０００８】「ポリペプチド」とは、ペプチド結合また
は修飾されたペプチド結合（すなわち、ペプチドアイソ
スター）により連結された２個以上のアミノ酸を含む任
意のペプチドまたはタンパク質を意味する。「ポリペプ
チド」は短鎖（通常はペプチド、オリゴペプチドまたは
オリゴマーという）と長鎖（一般的にはタンパク質とい
う）の両方をさす。ポリペプチドは２０種類の遺伝子コ
ード化アミノ酸以外のアミノ酸を含んでもよい。「ポリ
ペプチド」は、翻訳後プロセシングのような天然のプロ
セスで、または当技術分野で公知の化学的修飾法のいず
れかで修飾されたアミノ酸配列を含む。このような修飾
は基本的な教科書、より詳細な学術論文および研究文献
に詳述されている。修飾はペプチド骨格、アミノ酸側
鎖、アミノまたはカルボキシル末端を含めてポリペプチ
ドのどこでも行うことができる。同じタイプの修飾が所
定のポリペプチドのいくつかの部位に同程度でまたはさ
まざまに異なる程度で存在してもよい。また、所定のポ
リペプチドが多くのタイプの修飾を含んでいてもよい。
ポリペプチドはユビキチン化のために分枝していても、
分枝のある又はない環状であってもよい。環状の、分枝
した、または分枝した環状のポリペプチドは翻訳後の天
然プロセスから生じることがあり、また、合成法によっ
て製造することもできる。修飾としては、アセチル化、
アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの
共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌ
クレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の
共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架
橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有
架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形
成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、
ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチ
ル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解処理、リ
ン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸
化、アルギニル化のようなタンパク質へのアミノ酸の転
移ＲＮＡ媒介付加、ユビキチン化などがある。例えば、
PROTEINS - STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2nd
Ed., T.E. Creighton, W.H. Freeman and Company, Ne
w York, 1993; POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICAT
ION OF PROTEINS, B.C. Johnson 編, Academic Press,
New York,1983中のWold, F., Posttranslational Prote
in Modifications: Perspectivesand Prospects, pgs.
1-12; Seifter ら, “Analysis for protein modificat
ions and nonprotein cofactors", Meth Enzymol (199
0) 182:626-646; および Rattan ら, “Protein Synthe
sis: Posttranslational Modifications and Aging",An
n NY Acad Sci (1992) 663:48-62を参照のこと。

【０００９】本明細書中で用いる「変異体」とは、基準
のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと異なるが、不
可欠な性質を保持しているポリヌクレオチドまたはポリ
ペプチドのことである。典型的なポリヌクレオチドの変
異体は基準ポリヌクレオチドとヌクレオチド配列の点で
相違する。この変異体のヌクレオチド配列の変化は、基
準ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド
のアミノ酸配列を変更しても、しなくてもよい。ヌクレ
オチドの変化は、以下で述べるように、基準配列により
コードされるポリペプチドにおいてアミノ酸の置換、付
加、欠失、融合および末端切断（トランケーション）を
生じさせることができる。典型的なポリペプチドの変異
体は基準ポリペプチドとアミノ酸配列の点で相違する。
一般的には、基準ポリペプチドの配列と変異体の配列が
全般的によく類似しており、多くの領域で同一となるよ
うな相違に限られる。変異体と基準ポリペプチドは任意
に組み合わせた１以上の置換、付加、欠失によりアミノ
酸配列が相違していてよい。置換または挿入されるアミ
ノ酸残基は遺伝子コードによりコードされるものであっ
ても、なくてもよい。ポリヌクレオチドまたはポリペプ
チドの変異体はアレル変異体のように天然に存在するも
のでも、天然に存在することが知られていない変異体で
あってもよい。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの
天然に存在しない変異体は、突然変異誘発法または直接
合成により調製することができる。

【００１０】当業界で知られた「同一性」とは、ポリペ
プチド配列またはポリヌクレオチド配列の比較により決
定された、２以上のかかる配列間の関係のことである。
当業界ではまた、「同一性」はポリペプチド配列または
ポリヌクレオチド配列の鎖間のマッチ(match)により決
定された、このような配列間の配列関係の程度を意味す
る。「同一性」および「類似性」は公知の方法により難
なく算出することができ、こうした方法として、例えば
Computational Molecular Biology, Lesk, A.M.編, Ox
ford University Press, New York, 1988; Biocomputin
g: Informaticsand Genome Projects, Smith, D.W. 編,
Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis
of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M. and Griff
in, H.G. 編, Humana Press, New Jersey, 1994; Seque
nce Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G.,
Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, G
ribskov, M. and Devereux, J. 編, M Stockton Press,
New York, 1991; およびCarillo, H. and Lipman, D.,
SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988) に記載され
た方法があるが、これらに限らない。「同一性」を決定
する方法は、検討する配列間で最大級のマッチが得られ
るように設計される。さらに、「同一性」および「類似
性」を決定する方法は一般に利用可能なコンピュータプ
ログラムに編集されている。２配列間の「同一性」およ
び「類似性」を決定するコンピュータプログラム法とし
ては、ＧＣＧプログラムパッケージ (Devereux, J.ら,
Nucleic Acids Research 12(1):387 (1984))、ＢＬＡＳ
ＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ (Atschul, S.F.
ら, J. Molec. Biol. 215:403-410 (1990)) があるが、
これらに限らない。ＢＬＡＳＴ ＸプログラムはＮＣＢ
Ｉおよび他のソース (BLAST Manual, Altschul, S.ら,
NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul,S.ら, J.
Mol. Biol. 215: 403-410 (1990))から一般に入手可能
である。公知のSmith Watermanアルゴリズムも同一性の
決定に使用することができる。

【００１１】ポリペプチド配列を比較するためのパラメ
ーターは次のものを含む： １）アルゴリズム：Needleman and Wunsch, J. Mol. Bi
ol. 48: 443-453 (1970) 比較マトリックス：Hentikoff and Hentikoff, Proc. N
atl. Acad. Sci. USA,89: 10915-10919 (1992) からのB
LOSSUM62 ギャップペナルティー：１２ ギャップ長ペナルティー：４ これらのパラメーターと共に有用なプログラムは Genet
ics Computer Group (Madison WI) から「ｇａｐ」プロ
グラムとして一般に入手可能である。前記のパラメータ
ーはペプチド比較のためのデフォルトパラメーター(def
ault parameter) である（末端ギャップのペナルティー
は無し）。

【００１２】ポリヌクレオチド配列を比較するための好
適なパラメーターは次のものを含む： １）アルゴリズム：Needleman and Wunsch, J. Mol. Bi
ol. 48: 443-453 (1970) 比較マトリックス：マッチ＝＋１０、ミスマッチ＝０ ギャップペナルティー：５０ ギャップ長ペナルティー：３ Genetics Computer Group (Madison WI)から「ｇａｐ」
プログラムとして入手可能である。前記のパラメーター
はポリヌクレオチド比較のためのデフォルトパラメータ
ーである。

【００１３】ポリヌクレオチドの好適な具体例としては
さらに、配列番号１のポリヌクレオチド基準配列に対し
て少なくとも50、60、70、80、85、90、95、97または10
0％の同一性を有するポリヌクレオチドを含んでなる単
離されたポリヌクレオチドがある。この基準配列は配列
番号１の配列と同一であっても、該基準配列に対して、
ある整数個までのヌクレオチド変異を含んでいてもよ
い。前記変異は少なくとも１個のヌクレオチドの欠失、
置換（トランジションおよびトランスバージョンを含
む）または付加よりなる群から選択され、こうした変異
は基準ヌクレオチド配列の5'もしくは3'末端位置、また
はこれらの末端位置の間のどこに存在してもよく、基準
配列中のヌクレオチドの間に個々に、または基準配列内
に１以上の連続するグループとして点在することができ
る。ヌクレオチド変異の前記の数は、配列番号１のヌク
レオチドの総数に、それぞれの同一性％を規定する数字
を掛け、その積を配列番号１のヌクレオチドの総数から
差し引くことにより、すなわち、次式： ｎｎ ≦ｘｎ −（ｘｎ ×ｙ） により求めることができる。式中、ｎｎはヌクレオチド
変異の数であり、ｘｎは配列番号１のヌクレオチドの総
数であり、ｙは50％については0.50、60％については0.
60、70％については0.70、80％については0.80、85％に
ついては0.85、90％については0.90、95％については0.
95、97％については0.97または100％については1.00で
あり、ここでｘｎとｙの非整数の積は、その積をｘｎか
ら引く前に、最も近似する整数に切り下げる。配列番号
２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を
改変すると、そのコード配列にナンセンス、ミスセンス
またはフレームシフト突然変異が生じ、こうした変異後
に該ポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチド
を改変させることもできる。

【００１４】ポリペプチドの好適な具体例としてはさら
に、配列番号２のポリペプチド基準配列に対して少なく
とも50、60、70、80、85、90、95、97または100％の同
一性を有するポリペプチドを含んでなる単離されたポリ
ペプチドがある。この基準配列は配列番号２の配列と同
一であっても、該基準配列に対して、ある整数個までの
アミノ酸変異を含んでいてもよい。前記変異は少なくと
も１個のアミノ酸の欠失、置換（同類および非同類アミ
ノ酸置換を含む）または付加よりなる群から選択され、
こうした変異は基準ポリペプチド配列のアミノもしくは
カルボキシ末端位置、またはこれらの末端位置の間のい
ずれに存在してもよく、基準配列中のアミノ酸の間に個
々に、または基準配列内に１以上の連続するグループと
して点在することができる。アミノ酸変異の前記の数
は、配列番号２のアミノ酸の総数に、それぞれの同一性
％を規定する数字を掛け、その積を配列番号２のアミノ
酸の総数から差し引くことにより、すなわち、次式： ｎａ ≦ｘａ −（ｘａ ×ｙ） により求めることができる。式中、ｎａはアミノ酸変異
の数であり、ｘａは配列番号２中のアミノ酸の総数であ
り、ｙは50％については0.50、60％については0.60、70
％については0.70、80％については0.80、85％について
は0.85、90％については0.90、95％については0.95、97
％については0.97または100％については1.00であり、
ここでｘａとｙの非整数の積は、その積をｘａから引く
前に、最も近似する整数に切り下げる。

【００１５】

【発明の実施の形態】本発明のポリペプチド 一つの態様において、本発明はCRFG-1aポリペプチド
（またはCRFG-1aタンパク質）に関する。このCRFG-1aポ
リペプチドには、配列番号２および４のポリペプチドだ
けでなく、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチ
ド、その全長において配列番号２のアミノ酸配列と少な
くとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ま
しくは少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む
ポリペプチドも含まれる。さらに、少なくとも９７〜９
９％同一であるものが特に好適である。また、その全長
において配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、
より好ましくは少なくとも９５％同一であるアミノ酸配
列を有するポリペプチドもCRFG-1aポリペプチドに含ま
れる。さらに、少なくとも９７〜９９％同一であるもの
が特に好適である。CRFG-1aポリペプチドはCRFG-1aの少
なくとも１つの生物学的活性を示すことが好ましい。

【００１６】CRFG-1aポリペプチドは「成熟」タンパク
質の形であっても、融合タンパク質のような、より大き
いタンパク質の一部であってもよい。しばしば、追加の
アミノ酸配列を含めることが有利であり、このようなア
ミノ酸配列としては、分泌すなわちリーダー配列、プロ
配列、多重ヒスチジン残基のような精製に役立つ配列、
または組換え生産の際の安定性を確保する付加的配列な
どがある。

【００１７】また、CRFG-1aポリペプチドの断片も本発
明に含まれる。こうした断片は全体的に前記CRFG-1aポ
リペプチドのアミノ酸配列の一部と同一であるが、全部
とは同一でないアミノ酸配列を有するポリペプチドであ
る。CRFG-1aポリペプチドと同様に、断片は「フリース
タンディング」（それ自体で独立）していても、より大
きいポリペプチド内に含まれていてもよく、つまりその
大きいポリペプチドの一部または一領域、最も好ましく
は一つの連続領域、を断片が構成していてもよい。本発
明のポリペプチド断片の代表的な例として、およその見
当でアミノ酸番号１−２０、２１−４０、４１−６０、
６１−８０、８１−１００、および１０１からCRFG-1a
ポリペプチドの末端までの断片が挙げられる。ここで、
「およそ」とは、上記の範囲の一端または両端で数個、
５個、４個、３個、２個または１個のアミノ酸が増えた
り減ったりした範囲を含むものである。

【００１８】好適な断片としては、例えば、アミノ末端
を含む一連の残基もしくはカルボキシル末端を含む一連
の残基の欠失、またはアミノ末端を含むものとカルボキ
シル末端を含むものとの二連の残基の欠失を除いた、CR
FG-1aポリペプチドのアミノ酸配列を有するトランケー
ション(truncation)ポリペプチドが含まれる。また、α
ヘリックスとαヘリックス形成領域、βシートとβシー
ト形成領域、ターンとターン形成領域、コイルとコイル
形成領域、親水性領域、疎水性領域、α両親媒性領域、
β両親媒性領域、可変性領域、表面形成領域、基質結合
領域、および高抗原指数領域を含む断片のような、構造
的または機能的特性により特徴づけられる断片も好適で
ある。その他の好適な断片は生物学的に活性な断片であ
る。生物学的に活性な断片は、同様の活性をもつ断片、
その活性が向上した断片、または望ましくない活性が減
少した断片を含めて、CRFG-1a活性を媒介するものであ
る。さらに、動物、特にヒトにおいて抗原性または免疫
原性がある断片も含まれる。

【００１９】これらのポリペプチド断片はどれも、抗原
活性を含めたCRFG-1aの生物学的活性を保持することが
好ましい。中でも、最も好ましい断片は配列番号４のア
ミノ酸配列を有するものである。特定された配列および
断片の変異型も本発明の一部を構成する。好適な変異型
は同類アミノ酸置換により対象物と異なるもの、すなわ
ち、ある残基が同様の性質の他の残基で置換されている
ものである。典型的なこうした置換は、Ala, Val, Leu
と Ileの間；Ser とThr の間；酸性残基 AspとGlu の
間；Asn とGln の間；塩基性残基 LysとArg の間；また
は芳香族残基 PheとTyr の間で起こる。特に、数個、５
〜１０個、１〜５個または１〜２個のアミノ酸が任意の
組合せで置換、欠失または付加されている変異型が好適
である。

【００２０】本発明のCRFG-1aポリペプチドは任意の適
当な方法で製造することができる。このようなポリペプ
チドには、単離された天然に存在するポリペプチド、組
換え的に生産されたポリペプチド、合成的に製造された
ポリペプチド、またはこれらの方法の組合せにより製造
されたポリペプチドが含まれる。このようなポリペプチ
ドの製造のための手段は当業界でよく理解されている。

【００２１】本発明のポリヌクレオチド 本発明のもう一つの態様はCRFG-1aポリヌクレオチドに
関する。CRFG-1aポリヌクレオチドには、CRFG-1a ポリ
ペプチドおよび断片をコードする単離されたポリヌクレ
オチド、並びにこれらと密接に関連したポリヌクレオチ
ドが含まれる。さらに特定すると、本発明のCRFG-1aポ
リヌクレオチドとしては、配列番号２のCRFG-1aポリペ
プチドをコードする配列番号１中に含まれるヌクレオチ
ド配列を含むポリヌクレオチド、および配列番号１およ
び３の特定配列を有するポリヌクレオチドがある。さら
に、CRFG-1aポリヌクレオチドには、配列番号２のCRFG-
1aポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と全長に
おいて少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を
含むポリヌクレオチド、および配列番号１のヌクレオチ
ド配列と全長において少なくとも８０％同一であるヌク
レオチド配列を含むポリヌクレオチドが含まれる。これ
に関連して、少なくとも９０％同一であるポリヌクレオ
チドが好適であり、特に少なくとも９５％同一であるも
のが好適である。さらに、少なくとも９７％同一である
ものがより好ましく、少なくとも９８〜９９％同一であ
るものがより一層好ましく、少なくとも９９％同一であ
るものが最も好ましい。また、増幅反応に使用できる条
件下、またはプローブやマーカーとして使用できる条件
下でハイブリダイズするのに十分な、配列番号１中に含
まれるヌクレオチド配列との同一性を有するヌクレオチ
ド配列もCRFG-1aポリヌクレオチドに含まれる。本発明
はまた、このようなCRFG-1aポリヌクレオチドと相補的
なポリヌクレオチドを提供する。

【００２２】本発明のCRFG-1aは、ヒトCRFG-1aをコード
するｃＤＮＡの配列決定の結果により示されるように、
ＧＴＰ結合タンパク質ファミリーの他のタンパク質と構
造的に関連している。配列番号１のｃＤＮＡ配列は配列
番号２の６３４個のアミノ酸からなるポリペプチドをコ
ードするオープンリーディングフレーム（ヌクレオチド
番号３−１９０４）を含んでいる。表２のアミノ酸配列
（配列番号２）は６３４個のアミノ酸残基において酵母
由来のハイポセティカルタンパク質(Hypothetical prot
ein) YPL093w (H. Busseyら, Nature 387 (6632 Supp
l), 103-105,1997）に対して約４６．１％の同一性を有
する（ＦＡＳＴＡ使用）。表１のヌクレオチド配列（配
列番号１）は１３５１個のヌクレオチド残基においてサ
ッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)
染色体XVIコスミド8059/8047(H. Busseyら, Nature 387
(6632 Suppl), 103-105, 1997) に対して約５９．７％
の同一性を有する（ＦＡＳＴＡ使用）。したがって、本
発明のCRFG-1aポリペプチドおよびポリヌクレオチド
は、とりわけ、それらの相同ポリペプチドおよびポリヌ
クレオチドと同様の生物学的機能／特性をもつことが予
測され、それらの有用性は当業者には自明である。

【００２３】

【表１】 AGCATGGCACATTACAACTTCAAGAAAATTACGGTGGTGC 40 CGTCCGCCAAGGACTTCATAGACCTCACGTTGTCCAAGAC 80 TCAACGAAAGACTCCAACCGTTATTCATAAACATTACCAA 120 ATACATCGCATTAGACATTTTTACATGAGAAAAGTCAAAT 160 TTACTCAACAGAATTACCATGATAGACTTTCACAAATTCT 200 AACAGATTTCCCCAAATTGGATGATATTCATCCGTTCTAT 240 GCTGATTTGATGAATATTCTCTACGACAAGGATCATTACA 280 AGTTGGCTCTGGGGCAAATAAATATTGCCAAAAATTTAGT 320 GGACAATGTTGCTAAAGATTATGTGCGACTGATGAAGTAT 360 GGCGACTCTCTCTACCGCTGCAAACAGCTGAAGCGTGCGG 400 CCCTGGGACGGATGTGCACAGTGATCAAGAGGCAGAAGCA 440 GAGTTTGGAGTATTTGGAGCAAGTGCGTCAGCATTTATCC 480 CGTTTGCCAACCATTGATCCGAATACCAGGACCCTGCTTT 520 TGTGTGGGTACCCAAATGTTGGGAAGTCCAGCTTCATCAA 560 CAAGGTGACGAGAGCAGACGTGGATGTCCAGCCCTATGCG 600 TTCACAACCAAGTCTCTGTTTGTTGGGCACATGGATTATA 640 AGTATCTACGTTGGCAGGTTGTAGACACTCCTGGGATCCT 680 GGACCACCCTCTGGAGGATAGGAACACCATCGAGATGCAG 720 GCCATCACTGCCCTGGCCCACCTCCGTGCTGCGGTCCTGT 760 ATGTGATGGATTTGTCTGAGCAGTGTGGGCATGGGCTGAG 800 GGAACAGCTAGAACTCTTCCAGAACATCAGACCTCTCTTC 840 ATCAACAAGCCTCTCATAGTTGTAGCCAACAAATGTGATG 880 TGAAGAGAATAGCTGAACTTTCTGAAGATGATCAGAAAAT 920 ATTTACAGATTTGCAGTCTGAAGGATTCCCTGTAATAGAG 960 ACCAGCACCCTGACTGAGGAAGGTGTTATTAAAGTTAAAA 1000 CAGAGGCTTGCGATAGGCTTTTGGCTCATCGAGTGGAAAC 1040 CAAAATGAAGGGAAATAAAGTGAATGAGGTGCTGAATAGA 1080 CTGCACCTGGCTATCCCAACCAGGAGGGACGATAAGGAGA 1120 GGCCCCCTTTCATCCCTGAAGGAGTGGTGGCTCGCAGGAA 1160 GAGGATGGAAACTGAGGAGTCCAGGAAGAAGAGGGAACGA 1200 GATCTTGAGCTGGAAATGGGAGATGATTATATTTTGGATC 1240 TTCAGAAGTACTGGGATTTAATGAATTTGTCTGAAAAACA 1280 TGATAAGATACCAGAAATCTGGGAAGGCCATAATATAGCT 1320 GATTATATTGATCCAGCCATCATGAAGAAATTGGAAGAAT 1360 TAGAAAAAGAAGAAGAGCTGAGAACAGCTGCTGGAGAGTA 1400 TGACAGTGTATCTGAGAGTGAAGACGAAGAGATGCTGGAA 1440 ATCCGACAGCTGGCAAAGCAAATTCGAGAGAAAAAGAAGT 1480 TGAAAATTCTGGAGTCCAAAGAAAAGAATACACAGGGACC 1520 CAGGATGCCGCGAACTGCTAAGAAGGTTCAGAGGACAGTT 1560 TTGGAGAAGGAGATGCGTAGTCTTGGTGTTGACATGGACG 1600 ATAAAGACGATGCCCATTACGCAGTCCAGGCAAGAAGATC 1640 CCGGAGCATCACTAGGAAAAGAAAGCGGGAAGACTCTGCT 1680 CCCCCGTCCTCTGTGGCCCGGAGTGGGAGTTGCTCTCGAA 1720 CTCCACGTGACGTTTCTGGTCTTAGGGATGTCAAGATGGT 1760 GAAGAAAGCCAAGACTATGATGAAGAATGCTCAGAAGAAG 1800 ATGAATCGGTTGGGGAAGAAAGGGGAGGCGGATAGACACG 1840 TGTTTGATATGAAGCCCAAGCACTTGCTGTCTGGGAAGAG 1880 GAAAGCTGGTAAAAAGGACAGGAGATAGTATCCGTTTGGT 1920 TGGCGTGGCTTCGCTAGAGTGTTGCTGTTTATTTCCTGTT 1960 TTGGCACAGTATGGTTTCATGAAATTGGAGCTCTGTATAA 2000 ACTGAAAAAGACAAAATAAGTAAAGCACTTGTTGCTTTGC 2040 TGAAAACTATGGTTAACCCTATATAGGTGTGGGAAATTTT 2080 TGTCACTGCATAATATTACAAATATTTTGAGTAGACAGTG 2120 TTTCCACATTTAATGGAGTATCAGTTGCTTCAGATTTTCA 2160 GAACTGGGAAGATTTACTGGTGTAACTGGGTTGTTTTTGA 2200 TGGAGAAAAACCTTATTTTCTTTTGTAAGAGCTGGGAGCA 2240 AACACGTTTATGAGTGTGTCGGAATCCCGTGCTTAAAATA 2280 CGCTCTTAAATTATTTTCTAGTCTTATTTCACAATGTCTC 2320 ATTGTAGTCTGTCTTCAACTATTTTATCCAAAATANACCT 2360 CCAGAAGAAAG 2371 ヒトCRFG-1aのヌクレオチド配列（配列番号１）

【００２４】

【表２】 MAHYNFKKITVVPSAKDFIDLTLSKTQRKTPTVIHKHYQI 40 HRIRHFYMRKVKFTQQNYHDRLSQILTDFPKLDDIHPFYA 80 DLMNILYDKDHYKLALGQINIAKNLVDNVAKDYVRLMKYG 120 DSLYRCKQLKRAALGRMCTVIKRQKQSLEYLEQVRQHLSR 160 LPTIDPNTRTLLLCGYPNVGKSSFINKVTRADVDVQPYAF 200 TTKSLFVGHMDYKYLRWQVVDTPGILDHPLEDRNTIEMQA 240 ITALAHLRAAVLYVMDLSEQCGHGLREQLELFQNIRPLFI 280 NKPLIVVANKCDVKRIAELSEDDQKIFTDLQSEGFPVIET 320 STLTEEGVIKVKTEACDRLLAHRVETKMKGNKVNEVLNRL 360 HLAIPTRRDDKERPPFIPEGVVARRKRMETEESRKKRERD 400 LELEMGDDYILDLQKYWDLMNLSEKHDKIPEIWEGHNIAD 440 YIDPAIMKKLEELEKEEELRTAAGEYDSVSESEDEEMLEI 480 RQLAKQIREKKKLKILESKEKNTQGPRMPRTAKKVQRTVL 520 EKEMRSLGVDMDDKDDAHYAVQARRSRSITRKRKREDSAP 560 PSSVARSGSCSRTPRDVSGLRDVKMVKKAKTMMKNAQKKM 600 NRLGKKGEADRHVFDMKPKHLLSGKRKAGKKDRR 634 ヒトCRFG-1aのアミノ酸配列（配列番号２）

【００２５】CRFG-1aをコードする本発明の一つのポリ
ヌクレオチドは、標準的なクローニングおよびスクリー
ニングにより、ヒト腎臓および精巣の細胞中のｍＲＮＡ
から誘導されたｃＤＮＡライブラリーから、エクスプレ
スド・シークエンス・タグ（expressed sequence tag:
EST)分析 (Adams, M.D.ら, Science (1991) 252:1651-1
656; Adams, M.D. ら, Nature (1992) 355:632-634; Ad
ams, M.D.ら, Nature(1995) 377 Supp:3-174) を用いて
得ることができる。また、本発明のポリヌクレオチドは
ゲノムＤＮＡライブラリーのような天然源から得ること
ができ、商業的に入手可能な公知の技法を用いて合成す
ることもできる。

【００２６】配列番号２のCRFG-1aポリペプチドをコー
ドするヌクレオチド配列は、表１中に含まれるポリペプ
チドコード配列（配列番号１のヌクレオチド番号３−１
９０４）と同一であっても、遺伝子コードの重複性（縮
重）のため、やはり配列番号２のポリペプチドをコード
する配列であってもよい。

【００２７】本発明のポリヌクレオチドをCRFG-1aポリ
ペプチドの組換え生産のために用いる場合、そのポリヌ
クレオチドには、成熟ポリペプチドのコード配列または
その断片単独、他のコード配列（例えば、リーダーもし
くは分泌配列、プレ−、プロ−もしくはプレプロ−タン
パク質配列、または他の融合ペプチド部分をコードする
もの）と同じリーディングフレーム内にある成熟ポリペ
プチドのコード配列またはその断片が含まれる。例え
ば、融合ポリペプチドの精製を容易にするマーカー配列
がコードされ得る。本発明のこの態様の好ましい具体例
として、マーカー配列は、ｐＱＥベクター(Qiagen, In
c.)により提供されかつGentz ら, Proc. Natl. Acad. S
ci. USA (1989) 86:821-824に記載されるようなヘキサ
−ヒスチジンペプチド、またはＨＡタグである。また、
このポリヌクレオチドは5'および3'非コード配列、例え
ば、転写されるが翻訳されない配列、スプライシングお
よびポリアデニル化シグナル、リボソーム結合部位、お
よびｍＲＮＡ安定化配列を含んでいてもよい。

【００２８】さらに好適な具体例は、数個、５〜１０
個、１〜５個、１〜３個、１〜２個、または１個のアミ
ノ酸残基が任意の組合せで置換、欠失または付加されて
いる、表２のCRFG-1aポリペプチドのアミノ酸配列（配
列番号２）を含むCRFG-1a変異型をコードするポリヌク
レオチドである。中でも、本発明の好ましいポリヌクレ
オチドは表４のアミノ酸配列（配列番号４）をコードす
る表３（配列番号３）中に含まれるポリヌクレオチドで
ある。

【００２９】

【表３】 gACTCTGCTC CCCCGTCCTC TGTGGCCCGG AgTGGGAGTT GCTCTCGAAC TCCACGTGAC GTTTCTGGTC TTAGGGATGT 80 CAAgATGGTG AAgAAAGCCA AGACTATGAT GAAGAATGCT CAgAAgAAgA TGAATCGGTT GGGGAAgAAA GGGGAGGCGG 160 ATATACACTT gTTTGATATG AAGCCCAAgC ACTTGCTGTC TGGGAAgAGG AAAGCTGGTa AAAAGGACAG GAGATAgTAT 240 CCGTTTGGTT GGCGTGGCTT CGCTAgAgTG TTGCTGTTTA TTTCCTGGTT TGGCACAGTA TGGTTTCaTG AAATTGGAGC 320 TCTGTaTAAA CTGAAAAAGA CAAAATAAGT AAAGCACTTG TTGCTTTGCT GAAAACTATG GTTAACCCTA TATAGGTGTG 400 GGAAATTTTT GTCaCTGCAT AATATTACaA ATATTCTGAG TAGACAGtGT TTCCACATTT AATGGAGTAT CAGTTGCTTC 480 AGATTTTCAG AACTGGGAAG ATTTACTGGT GTAACTGGGT TGTTTTTGAT GGAGAAAAAC CTTATTTTCT TTTGTAAGAG 560 CTGGGAGCAA ACACGTTTAT GAGTGTGTCG GAATCCCGTG CTTAAAATAC GCTCTTAAAT tATTTTCTAG TCCTTATTTT 640 ACAATGTCTC ATTGTAGTCT GTCTTCAACT ATTTTATCCA AAATAAACCT CCAGAAGGAA AAAAAAAAAA AAAAAA 716 ヒトCRFG-1aの部分ヌクレオチド配列（配列番号３）

【００３０】

【表４】 HEDKDDAHYAVQARRSRSITRKRKREDSAPPSSVARSGSC 40 SRTPRDVSGLRDVKMVKKAKTMMKNAQKKMNRLGKKGEAD 80 IHLFDMKPKHLLSGKRKAGKKDRR 104 ヒトCRFG-1aの部分アミノ酸配列（配列番号４）

【００３１】本発明はさらに、前記の配列とハイブリダ
イズするポリヌクレオチドに関する。これに関して、本
発明は特にストリンジェントな条件下で前記のポリヌク
レオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドに関す
る。本明細書中で用いる「ストリンジェントな条件」と
は、配列間に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも
９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より一層好
ましくは少なくとも９７〜９９％の同一性があるときだ
けハイブリダイゼーションが起こる条件を指す。

【００３２】配列番号１中に含まれるヌクレオチド配列
またはその断片と同一であるか実質的に同一である本発
明のポリヌクレオチドは、CRFG-1aポリペプチドをコー
ドする全長ｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離するた
めに、また、CRFG-1a遺伝子との配列類似性が高い他の
遺伝子（ヒト以外の種に由来する相同体およびオーソロ
グ体(ortholog)をコードする遺伝子を含む）のｃＤＮＡ
およびゲノムクローンを単離するために、ｃＤＮＡおよ
びゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーションプローブとし
て用いることができる。このようなハイブリダイゼーシ
ョン技法は当業者には公知である。一般的に、これらの
ヌクレオチド配列は対象物のヌクレオチド配列と８０
％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％同一であ
る。プローブはたいてい１５個以上のヌクレオチドを含
み、好ましくは３０個以上を含み、５０個以上のヌクレ
オチドを有していてもよい。特に好ましいプローブは３
０〜５０個の範囲のヌクレオチドを有するものである。

【００３３】一実施態様において、CRFG-1aポリペプチ
ド（ヒト以外の種に由来する相同体およびオーソログ体
を含む）をコードするポリヌクレオチドを得ることは、
配列番号１のヌクレオチド配列またはその断片を有する
標識プローブを用いて、ストリンジェントなハイブリダ
イゼーション条件下で適当なライブラリーをスクリーニ
ングし、前記のポリヌクレオチド配列を含む全長ｃＤＮ
Ａおよびゲノムクローンを単離する各工程を含んでな
る。このようなハイブリダイゼーション技法は当業者に
公知である。かくして、もう一つの態様では、本発明の
CRFG-1aポリヌクレオチドはさらに、配列番号１のヌク
レオチド配列またはその断片（配列番号３の断片を含
む）とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする
ヌクレオチド配列を含んでなるヌクレオチド配列を含む
ものである。CRFG-1aポリペプチドも、前記のハイブリ
ダイゼーション条件により得られたヌクレオチド配列に
よりコードされるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチ
ドを含む。ストリンジェントなハイブリダイゼーション
条件は上で定義したとおりであるか、または、50% ホル
ムアミド、５×SSC (150mM NaCl, 15mM クエン酸三ナト
リウム) 、50mMリン酸ナトリウム (pH7.6)、５×Denhar
dt溶液、10% デキストラン硫酸および20μg/mlの変性し
剪断したサケ精子ＤＮＡを含有する溶液中で４２℃で一
夜インキュベートし、次いでフィルターを 0.1×SSC 中
約６５℃で洗浄する条件である。

【００３４】本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドは、動物およびヒトの疾病に対する治療薬および診
断薬を探索するための研究用の試薬および材料として利
用することができる。

【００３５】ベクター、宿主細胞、発現 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含有するベ
クター、このベクターにより遺伝子操作された宿主細
胞、および組換え法による本発明のポリペプチドの生産
に関する。本発明のＤＮＡ構築物から誘導されたＲＮＡ
を用いてこの種のタンパク質を生産するための無細胞翻
訳系も使用することができる。

【００３６】組換え体生産に関しては、本発明のポリヌ
クレオチドの発現系またはその一部を組み入れるため
に、宿主細胞が遺伝子操作される。宿主細胞へのポリヌ
クレオチドの導入は、Davis ら, BASIC METHODS IN MOL
ECULAR BIOLOGY (1986) およびSambrook ら, MOLECULAR
CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Sprin
g Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.
Y. (1989) などの多くの標準的な実験室マニュアルに記
載される方法、例えば、リン酸カルシウムトランスフェ
クション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェク
ション、トランスベクション(transvection)、マイクロ
インジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェク
ション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレー
プローディング(scrape loading)、射出導入(ballistic
introduction)または感染により行うことができる。

【００３７】適当な宿主の代表的な例として、細菌細胞
（例：ストレプトコッカス、スタフィロコッカス、大腸
菌、ストレプトミセス、枯草菌）、真菌細胞（例：酵
母、アスペルギルス）、昆虫細胞（例：ドロソフィラＳ
２、スポドプテラＳｆ９）、動物細胞（例：ＣＨＯ、Ｃ
ＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ 127、３Ｔ３、ＢＨＫ、ＨＥＫ 29
3、Bowes メラノーマ細胞）および植物細胞が挙げられ
る。

【００３８】多種多様な発現系を使用することができ
る。こうした発現系として、特に、染色体、エピソーム
およびウイルス由来の系、例えば、細菌プラスミド由
来、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来、酵
母エピソーム由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エ
レメント由来、ウイルス（例：バキュロウイルス、ＳＶ
４０のようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、ア
デノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レ
トロウイルス）由来のベクター、およびこれらの組合せ
に由来するベクター、例えば、コスミドやファージミド
のようなプラスミドとバクテリオファージの遺伝的要素
に由来するものがある。この発現系は発現を起こさせる
だけでなく発現を調節する制御配列を含んでいてもよ
い。一般的に、宿主内でのポリペプチドの産生のために
ポリヌクレオチドを維持し、増やし、発現するのに適し
た系またはベクターはどれも使用することができる。Sa
mbrookら, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL
(前掲) に記載されるような、日常的に用いられる公知
の技法のいずれかにより、適当なヌクレオチド配列を発
現系に挿入することができる。

【００３９】翻訳されたタンパク質を小胞体の内腔に、
細胞周辺腔に、または細胞外の環境に分泌させるため
に、適当な分泌シグナルを目的のポリペプチドに組み込
むことができる。これらのシグナルは目的のポリペプチ
ドに対して内因性であっても、異種シグナルであっても
よい。

【００４０】スクリーニングアッセイで使用するためCR
FG-1aポリペプチドを発現させようとする場合、そのポ
リペプチドを細胞の表面に産生させることが好適であ
る。この場合は、スクリーニングアッセイでの使用に先
立って細胞を回収する。CRFG-1aポリペプチドが培地に
分泌される場合は、そのポリペプチドを回収し精製する
ために培地を回収する。細胞内に産生される場合は、そ
の細胞をまず溶解し、その後にポリペプチドを回収する
必要がある。

【００４１】組換え細胞培養物からCRFG-1aポリペプチ
ドを回収し精製するには、硫酸アンモニウムまたはエタ
ノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロ
マトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィ
ー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティ
ークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマ
トグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含め
た公知の方法を用いることができる。最も好ましくは、
高速液体クロマトグラフィーが精製に用いられる。ポリ
ペプチドが単離および／または精製中に変性されるとき
は、タンパク質を再生させるための公知の技法を用い
て、活性のあるコンフォメーションを復元することが可
能である。

【００４２】診断アッセイ 本発明はまた、診断薬としてのCRFG-1aポリヌクレオチ
ドの使用に関する。機能障害と関連したCRFG-1a遺伝子
の変異型の検出は、CRFG-1aの過少発現、過剰発現また
は変化した発現により生ずる疾病またはその罹病性の診
断に追加しうる、またはその診断を下しうる診断用ツー
ルを提供するだろう。CRFG-1a遺伝子に変異がある個体
を、さまざまな技法によりＤＮＡレベルで見つけ出すこ
とができる。

【００４３】診断用の核酸は、被験者の細胞、例えば血
液、尿、唾液、組織の生検または剖検材料から得ること
ができる。検出のためにゲノムＤＮＡを直接使用して
も、分析前にＰＣＲまたは他の増幅法を使って酵素的に
増幅してもよい。同様の方法でＲＮＡまたはｃＤＮＡを
使用することもできる。欠失および挿入変異は、正常な
遺伝子型と比較したときの増幅産物のサイズの変化によ
り検出できる。点突然変異は増幅ＤＮＡを標識CRFG-1a
ヌクレオチド配列とハイブリダイズさせることで同定で
きる。完全にマッチした配列とミスマッチの二重鎖とは
ＲＮアーゼ消化により、または融解温度の差異により区
別できる。また、ＤＮＡ配列の差異は、変性剤を用いる
または用いないゲルでのＤＮＡ断片の電気泳動の移動度
の変化により、または直接ＤＮＡ配列決定によっても検
出できる（例えば、Myersら, Science (1985) 230:1242
を参照のこと）。特定位置での配列変化はヌクレアー
ゼプロテクションアッセイ（例えば、ＲＮアーゼおよび
Ｓ１プロテクション）または化学的開裂法によっても確
認できる（Cottonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (19
85) 85:4397-4401を参照のこと）。別の実施態様では、
例えば、遺伝子変異の効率のよいスクリーニングを行う
ため、CRFG-1aヌクレオチド配列またはその断片を含む
オリゴヌクレオチドプローブのアレイを構築することが
できる。アレイ技法は公知で、一般的な適用可能性を有
し、遺伝子発現、遺伝的連鎖および遺伝的変異性を含め
た分子遺伝学のさまざまな問題を解きあかすために用い
られている（例えば、M. Cheeら, Science, Vol.274, p
p.610-613 (1996) を参照のこと）。

【００４４】診断アッセイは、前記の方法によりCRFG-1
a遺伝子の変異を検出することで、慢性腎疾患、腎性虚
血、糖尿病性腎症、急性腎不全、神経変性疾患およびア
ルツハイマー病への罹りやすさを診断または判定する方
法を提供する。

【００４５】さらに、被験者から得られたサンプルから
CRFG-1aポリペプチドまたはCRFG-1a ｍＲＮＡのレベル
の異常な低下または増加を測定する方法により、慢性腎
疾患、腎性虚血、糖尿病性腎症、急性腎不全、神経変性
疾患およびアルツハイマー病の診断を下すことができ
る。発現の低下または増加は、当技術分野で公知のポリ
ヌクレオチド定量法のいずれか、例えばＰＣＲ、ＲＴ−
ＰＣＲ、ＲＮアーゼプロテクション、ノーザンブロッ
ト、その他のハイブリダイゼーション法によりＲＮＡレ
ベルで測定することができる。宿主から得られたサンプ
ル中のCRFG-1aポリペプチドのようなタンパク質のレベ
ルを測定するためのアッセイ法は当業者によく知られて
いる。こうしたアッセイ法として、ラジオイムノアッセ
イ、競合結合アッセイ、ウエスタンブロット分析、ＥＬ
ＩＳＡアッセイなどがある。

【００４６】かくして、もう一つの態様において、本発
明は、疾病、特に慢性腎疾患、腎性虚血、糖尿病性腎
症、急性腎不全、神経変性疾患およびアルツハイマー病
または該疾病への罹りやすさを診断するためのキットに
関し、このキットは、(a) CRFG-1aポリヌクレオチド
（好ましくは、配列番号１のヌクレオチド配列）もしく
はその断片、(b) (a) のヌクレオチド配列に相補的なヌ
クレオチド配列、(c) CRFG-1aポリペプチド（好ましく
は、配列番号２のポリペプチド）もしくはその断片、ま
たは(d) CRFG-1aポリペプチド（好ましくは、配列番号
２のポリペプチド）に対する抗体、を含んでなる。この
ようなキットにおいて、(a) 、(b) 、(c) または (d)が
実質的な構成成分であることが理解されよう。

【００４７】染色体アッセイ 本発明のヌクレオチド配列はまた、染色体の同定にも有
用である。この配列は個々のヒト染色体上の特定の位置
を標的指向し、その特定位置とハイブリダイズすること
ができる。本発明に従って関連配列の染色体地図を作成
することは、これらの配列と遺伝子関連疾患とを相関さ
せる上で重要な第一段階である。ひとたび配列が正確な
染色体位置にマッピングされたら、その染色体上のその
配列の物理的位置を遺伝地図データと相関させることが
できる。この種のデータは、例えば、V. McKusick, Men
delian Inheritance in Man (Johns Hopkins Universit
yWelch Medical Library からオンラインで入手可能)
中に見いだせる。その後、同一の染色体領域にマッピン
グされた遺伝子と疾患との関係を連鎖分析（物理的に隣
接した遺伝子の共遺伝）により同定する。患者と正常個
体とのｃＤＮＡまたはゲノム配列の差異も調べることが
できる。患者の一部または全部に変異が観察されて、ど
の正常個体にも観察されない場合は、その変異が疾病の
原因である可能性がある。CRFG-1a遺伝子（配列番号
１）は染色体10p15.2-15.3に存在し、この位置は脳のグ
リオーマ（グリア芽細胞腫）と関連している。

【００４８】抗体 本発明のポリペプチドまたはその断片もしくは類似体、
またはそれらを発現する細胞は、CRFG-1aポリペプチド
に免疫特異的な抗体を産生するための免疫原としても使
用することができる。「免疫特異的」とは、その抗体が
従来技術における他の関連ポリペプチドに対するその親
和性よりも本発明のポリペプチドに対して実質的に高い
親和性を有することを意味する。

【００４９】CRFG-1aポリペプチドに対する抗体は、慣
用のプロトコールを用いて、動物（好ましくはヒト以
外）に該ポリペプチドまたはエピトープを含む断片、類
似体もしくは細胞を投与することにより得られる。モノ
クローナル抗体の調製には、連続細胞系の培養物により
産生される抗体をもたらす任意の技法を用いることがで
きる。例を挙げると、ハイブリドーマ技法 (Kohler, G.
およびMilstein, C., Nature (1975) 256:495-497)、ト
リオーマ技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法 (Kozbor
ら, Immunology Today (1983) 4:72) およびＥＢＶ−ハ
イブリドーマ技法(Coleら, MONOCLONAL ANTIBODIES AND
CANCER THERAPY, pp.77-96, Alan R. Liss, Inc., 198
5) などがある。

【００５０】本発明のポリペプチドに対する一本鎖抗体
をつくるために、一本鎖抗体の調製法（米国特許第4,94
6,778 号）を適応させることができる。また、ヒト化抗
体を発現させるために、トランスジェニックマウスまた
は他の哺乳動物を含む他の生物を利用することができ
る。前記の抗体を用いて、そのポリペプチドを発現する
クローンを単離・同定したり、アフィニティークロマト
グラフィーでそのポリペプチドを精製することもでき
る。CRFG-1aポリペプチドに対する抗体は、とりわけ、
慢性腎疾患、腎性虚血、糖尿病性腎症、急性腎不全、神
経変性疾患およびアルツハイマー病の治療に使用できる
可能性がある。

【００５１】ワクチン 本発明の別の態様は、哺乳動物において免疫学的応答を
引き出す方法に関し、この方法は、特に慢性腎疾患、腎
性虚血、糖尿病性腎症、急性腎不全、神経変性疾患およ
びアルツハイマー病から前記動物を防御するための抗体
および／またはＴ細胞免疫応答を生ずるのに十分なCRFG
-1aポリペプチドまたはその断片を哺乳動物に接種する
ことを含んでなる。本発明のさらに別の態様は、哺乳動
物を疾病から防御する抗体を産生させるような免疫学的
応答を引き出すために、in vivoでCRFG-1aポリヌクレオ
チドの発現を指令するベクターを介してCRFG-1aポリペ
プチドを供給することを含んでなる、哺乳動物において
免疫学的応答を引き出す方法に関する。

【００５２】本発明の更なる態様は、哺乳動物宿主に導
入したとき、その哺乳動物においてCRFG-1aポリペプチ
ドに対する免疫学的応答を引き出す免疫学的／ワクチン
製剤（組成物）に関し、この組成物はCRFG-1aポリペプ
チドまたはCRFG-1a遺伝子を含有する。ワクチン製剤は
適当な担体をさらに含んでいてもよい。CRFG-1aポリペ
プチドは胃の中で分解されうるので、非経口的（皮下、
筋肉内、静脈内、皮内等への注射を含む）に投与するこ
とが好ましい。非経口投与に適した製剤としては、酸化
防止剤、緩衝液、静菌剤およびこの製剤を受容者の血液
と等張にする溶質を含みうる水性および非水性の無菌注
射液、並びに懸濁化剤または増粘剤を含みうる水性およ
び非水性の無菌懸濁液がある。こうした製剤は１回量容
器または数回量容器（例えば、密閉アンプルおよびバイ
アル）で提供することができ、また、使用直前に無菌の
液状担体を添加するだけでよい凍結乾燥状態で保管する
こともできる。ワクチン製剤はこの製剤の免疫原性を増
強するためのアジュバント系、例えば水中油型のアジュ
バント系や当技術分野で公知の他のアジュバント系を含
んでいてもよい。投与量はワクチンの比活性で変化し、
ルーチンな実験操作により簡単に決定できる。

【００５３】スクリーニングアッセイ 本発明のCRFG-1aポリペプチドは、このポリペプチドを
活性化する化合物（アゴニスト）またはその活性を阻害
する化合物（アンタゴニスト、または阻害剤ともいう）
のスクリーニング法において使用することができる。こ
うして、本発明のポリペプチドは、例えば、細胞、無細
胞調製物、化学物質ライブラリーおよび天然産物の混合
物からアゴニストまたはアンタゴニストを評価し同定す
るためにも用いられる。これらのアゴニストまたはアン
タゴニストは、本発明のポリペプチドの、場合によっ
て、天然のまたは修飾された基質、リガンド、受容体、
酵素などであってよく、また、本発明のポリペプチドの
構造的または機能的な模擬物であってもよい（Coligan
ら, Current Protocols in Immunology 1(2): Chapter
5 (1991)を参照のこと）。

【００５４】CRFG-1aポリペプチドは多くの病理を含め
て多数の生物学的機能に関与している。したがって、一
方ではCRFG-1aポリペプチドを刺激し、他方ではCRFG-1a
ポリペプチドの機能を阻害し得る化合物および薬物を見
つけ出すことが望まれる。一般的に、アゴニストは慢性
腎疾患、腎性虚血、糖尿病性腎症、急性腎不全、神経変
性疾患およびアルツハイマー病のような症状の治療およ
び予防目的で用いられる。アンタゴニストは慢性腎疾
患、腎性虚血、糖尿病性腎症、急性腎不全、神経変性疾
患およびアルツハイマー病のような症状のさまざまな治
療および予防目的で使用しうる。

【００５５】一般に、こうしたスクリーニング法はCRFG
-1aポリペプチドを発現する適当な細胞、またはCRFG-1a
ポリペプチドに応答する適当な細胞を用いるものであ
る。この種の細胞には哺乳動物、酵母、ショウジョウバ
エ由来の細胞または大腸菌細胞が含まれる。次いで、CR
FG-1aポリペプチドを発現する細胞（もしくは発現され
たポリペプチドを含む細胞膜）またはCRFG-1aポリペプ
チドに応答する細胞を試験化合物と接触させて、その結
合または機能的応答の刺激もしくは阻害を観察する。候
補化合物と接触させた細胞の能力を、接触させなかった
同一細胞とCRFG-1a活性に関して比較する。

【００５６】これらのアッセイでは候補化合物の結合を
簡単に試験することができ、そこでは候補化合物と直接
または間接に結合された標識により、または標識した競
合物質との競合を用いるアッセイにより、CRFG-1aポリ
ペプチドを担持する細胞への付着が検出される。さら
に、これらのアッセイでは、CRFG-1aポリペプチドを担
持する細胞に適した検出系を用いて、候補化合物がCRFG
-1aポリペプチドの活性化により生ずるシグナルを結果
的にもたらすか否かを試験することができる。一般的
に、活性化の阻害剤は既知のアゴニストの存在下でアッ
セイされ、そして候補化合物の存在がアゴニストによる
活性化に与える影響が調べられる。

【００５７】さらに、これらのアッセイは、候補化合物
とCRFG-1aポリペプチドを含む溶液とを混ぜ合わせて混
合物をつくり、この混合物中のCRFG-1a活性を測定し、
そしてこの混合物のCRFG-1a活性を標準と比較する各ス
テップを単に含むだけでよい。

【００５８】また、CRFG-1aのｃＤＮＡ、タンパク質ま
たはこのタンパク質に対する抗体を用いて、細胞内での
CRFG-1a ｍＲＮＡまたはタンパク質の生産に及ぼす添加
化合物の作用を検出するためのアッセイを組み立てるこ
とができる。例えば、当技術分野で公知の標準方法によ
りモノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いて、
CRFG-1aタンパク質の分泌レベルまたは細胞結合レベル
を測定するためのＥＬＩＳＡを構築することができ、こ
れは適切に操作された細胞または組織からのCRFG-1aの
生産を抑制または増強する物質（それぞれアンタゴニス
トまたはアゴニストともいう）の探索に用いることがで
きる。

【００５９】膜結合受容体または可溶性受容体が存在す
るのであれば、当技術分野で公知の標準的な受容体結合
法によりこの種の受容体を同定するためにCRFG-1aタン
パク質を用いることができる。こうした受容体結合法に
は、限定するものではないが、リガンド結合および架橋
アッセイがあり、このアッセイでは、CRFG-1aを放射性
アイソトープ（例：１２５I）で標識するか、化学的に
修飾（例：ビオチン化）するか、または検出や精製に適
したペプチド配列に融合させ、そして推定上の受容体源
（細胞、細胞膜、細胞上清、組織抽出物、体液など）と
インキュベートする。その他の方法としては、表面プラ
ズモン共鳴および分光学のような生物物理的方法があ
る。受容体の精製およびクローニングに用いることに加
えて、これらの結合アッセイは、もし存在するのであれ
ば、CRFG-1aのその受容体への結合と競合するCRFG-1aの
アゴニストまたはアンタゴニストを同定するために用い
ることもできる。スクリーニングアッセイを行うための
標準的な方法は当技術分野でよく理解されている。

【００６０】CRFG-1aポリペプチドの潜在的なアンタゴ
ニストの例としては、抗体、ある場合には、CRFG-1aポ
リペプチドの、場合により、リガンド、基質、受容体、
酵素などと密接な関係があるオリゴヌクレオチドもしく
はタンパク質（例えば、リガンド、基質、受容体、酵素
などの断片）、または本発明のポリペプチドと結合する
が応答を誘導しない（それゆえポリペプチドの活性を妨
げる）小分子などがある。

【００６１】かくして、他の態様において、本発明は、
CRFG-1aポリペプチドのアゴニスト、アンタゴニスト、
リガンド、受容体、基質、酵素など、またはCRFG-1aポ
リペプチドの生産を低下または増加させる化合物を同定
するためのスクリーニングキットに関し、このキット
は、 (a) CRFG-1aポリペプチド（好ましくは、配列番号２の
ポリペプチド） (b) CRFG-1aポリペプチド（好ましくは、配列番号２の
ポリペプチド）を発現する組換え細胞、 (c) CRFG-1aポリペプチド（好ましくは、配列番号２の
ポリペプチド）を発現する細胞膜、または (d) CRFG-1aポリペプチド（好ましくは、配列番号２の
ポリペプチド）に対する抗体、を含んでなる。このよう
なキットにおいて、(a) 、(b) 、(c) または (d)が実質
的な構成成分であることが理解されよう。

【００６２】予防および治療法 本発明は、CRFG-1aポリペプチド活性の過剰量と不足量
のどちらにも関係した慢性腎疾患、腎性虚血、糖尿病性
腎症、急性腎不全、神経変性疾患、アルツハイマー病な
どの異常な状態の治療法を提供する。CRFG-1aポリペプ
チドの活性が過剰である場合は、いくつかのアプローチ
が利用可能である。一つのアプローチは、例えば、リガ
ンド、基質、受容体、酵素などの結合をブロックするこ
とにより、または第２のシグナルを抑制することで異常
な状態を軽減することにより、CRFG-1aポリペプチドの
機能を阻害するのに有効な量で、前記の阻害剤化合物
（アンタゴニスト）を製剤学上許容される担体とともに
患者に投与することを含んでなる。もう一つのアプロー
チでは、内因性のCRFG-1aポリペプチドとの競合状態で
リガンド、基質、酵素、受容体などと結合する能力がま
だある可溶性形態のCRFG-1aポリペプチドを投与するこ
とができる。このような競合剤の典型的な例はCRFG-1a
ポリペプチドの断片である。

【００６３】別のアプローチでは、内因性のCRFG-1aポ
リペプチドとの競合状態でリガンドと結合する能力がま
だある可溶性形態のCRFG-1aポリペプチドを投与するこ
とができる。このような競合剤の典型的な例はCRFG-1a
ポリペプチドの断片である。

【００６４】さらに別のアプローチでは、発現阻止法を
使って内因性CRFG-1aポリペプチドをコードする遺伝子
の発現を抑制することができる。こうした公知技術は、
体内で生成されるか別個に投与されるアンチセンス配列
の使用を必要とする。例えば、Oligodeoxynucleotides
as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRCPre
ss, Boca Raton, FL (1988)中のO'Connor, J Neurochem
(1991) 56:560 を参照のこと。あるいはまた、この遺
伝子と共に三重らせんを形成するオリゴヌクレオチドを
供給することもできる。例えば、Lee ら, Nucleic Acid
s Res (1979) 6:3073; Cooney ら, Science (1988) 24
1:456; Dervanら, Science (1991) 251:1360 を参照の
こと。これらのオリゴマーはそれ自体を投与することも
できるし、関連オリゴマーをin vivo で発現させること
もできる。

【００６５】CRFG-1aおよびその活性の過少発現に関係
した異常な状態を治療する場合も、いくつかのアプロー
チを取ることができる。一つのアプローチは、治療上有
効な量のCRFG-1aポリペプチドを活性化する化合物（す
なわち、前記のアゴニスト）を製剤学上許容される担体
とともに患者に投与して、異常な状態を緩和することを
含んでなる。別法として、患者の関連細胞においてCRFG
-1aを内因的に産生させるために遺伝子治療を用いるこ
とができる。例えば、上で述べたような複製欠損レトロ
ウイルスベクターによる発現のために本発明のポリヌク
レオチドを遺伝子操作する。次にレトロウイルス発現構
築物を単離し、本発明のポリペプチドをコードするＲＮ
Ａを含有するレトロウイルスプラスミドベクターで形質
導入されたパッケージング細胞に導入する。その結果、
パッケージング細胞は対象の遺伝子を含有する感染性の
ウイルス粒子を産生するようになる。in vivo での細胞
処理およびin vivo でのポリペプチド発現のために、こ
れらの産生細胞を患者に投与する。遺伝子治療の概論に
関しては、Human Molecular Genetics, T Strachanand
A P Read, BIOS Scientific Publishers Ltd (1996) 中
のChapter 20, GeneTherapy and other Molecular Gene
tic-based Therapeutic Approaches(およびその中の引
用文献) を参照のこと。もう一つのアプローチは治療量
のCRFG-1aポリペプチドを適当な製剤学上の担体ととも
に投与することである。

【００６６】製剤および投与 可溶性形態のCRFG-1aポリペプチドのようなペプチド、
アゴニストおよびアンタゴニストペプチド、または小分
子は適当な製剤学上の担体と組み合わせて製剤化するこ
とができる。このような製剤は治療上有効な量のポリペ
プチドまたは化合物と、製剤学上許容される担体または
賦形剤を含有する。この種の担体としては、食塩水、生
理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノ
ール、およびこれらの組合せがあるが、これらに限らな
い。製剤は投与様式に適合させるべきであり、これは当
技術分野の技量の範囲内である。本発明はさらに、前記
の本発明組成物の１以上の成分を充填した１以上の容器
を含んでなる医薬用パックおよびキットに関する。本発
明のポリペプチドおよび他の化合物は単独で使用して
も、他の化合物、例えば治療用化合物と一緒に使用して
もよい。

【００６７】医薬組成物を全身投与するときの好ましい
形態は、注入（注射）、典型的には静注である。皮下、
筋肉内または腹腔内のような他の注入経路も使用でき
る。全身投与の別の手段は、胆汁酸塩、フシジン酸、そ
の他の界面活性剤などの浸透剤を用いた経粘膜および経
皮投与である。さらに、腸溶剤またはカプセル剤として
適切に製剤化されているのであれば、経口投与も可能で
ある。これらの化合物は軟膏、ペースト、ゲルなどの剤
形で局所に投与しても、かつ／または局在化させてもよ
い。

【００６８】必要な投与量範囲はペプチドの選択、投与
経路、製剤の性質、患者の状態、そして医師の判断に左
右される。しかし、適当な投与量は患者の体重１kgあた
り0.1 〜100 μg の範囲である。利用可能な化合物が多
種多様であり、それぞれの投与経路の効率も異なるた
め、必要とされる投与量は広範に変動することを予想す
べきである。例えば、経口投与は静注による投与よりも
高い投与量を必要とすることが予想される。こうした投
与量レベルの変動は、当技術分野でよく理解されている
ような、標準的経験的な最適化手順を用いて調整するこ
とができる。

【００６９】治療に用いるポリペプチドは、上述したよ
うな「遺伝子治療」と称する治療法において、患者の体
内で産生させることもできる。例えば、患者由来の細胞
を、ex vivo でポリペプチドをコードするＤＮＡまたは
ＲＮＡのようなポリヌクレオチドにより、例えばレトロ
ウイルスプラスミドベクターを用いて、遺伝子工学的に
操作する。その後、この細胞を患者に導入する。

【００７０】慢性腎不全に介入する標的を提供すべく、
２つの動物モデル系が研究されてきた。CRFG-1aは慢性
腎不全の３つの動物モデル、肥満Zuckerラットおよび腎
臓の５／６を摘出したラットにおいてダウンレギュレー
ションされることがディファレンシャル・ディスプレー
ＰＣＲにより確認された新規な遺伝子である。さらに、
老齢のFisher 344ラット（24ヶ月齢）は腎臓が肥大して
腎機能が低下しているが、このラットもCRFG-1aの発現
が減少している。腎不全におけるこの遺伝子の発現低下
は腎臓が正常に働くうえでのその重要な役割を示してい
る可能性がある。

【００７１】慢性腎不全を発症している５ヶ月齢の肥満
Zuckerラットでは、CRFG-1aのｍＲＮＡが痩せて健康な
同月齢の対照ラットにおいて見られるレベルの１／３以
下に減少している。蛋白尿とCRFG-1a発現との相関関係
はないので、CRFG-1aの減少は標準的な臨床指示物質が
出現する前の腎障害の初期マーカーとなる。

【００７２】ラットのCRFG-1aは2.5 kbと1.5 kbの２つ
のｍＲＮＡサイズを有するが、ヒトではただ１つの分子
量種が2.7 kbに同定されている。ヒトCRFG-1aはヒト染
色体10p15.2-15.3にマップされた。第10染色体のこの領
域は、171840ホスホフルクトキナーゼ、血小板型；6004
49 ジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ、タイプ１；601
070 インターロイキン-15 受容体、α；600448 プロテ
インキナーゼＣ、ζ型；147270 インターαトリプシン
阻害剤、Ｈ鎖-1；176870プロテインHC；137800 脳のグ
リオーマ；300007 インターロイキン-9受容体；および1
47680 インターロイキン-2にリンクしている。

【００７３】多数の組織での正常ｍＲＮＡ発現のノーザ
ンブロットにより、骨格筋＞精巣＞膵臓＞心臓＞胸腺＞
胎盤＞腎臓＞白血球＞脾臓＞卵巣＞結腸＞脳＞前立腺に
おける発現が確認される。

【００７４】

【実施例】実施例１ CRFG-1aの存在は、Liang P.およびPardee A.B.(Scienc
e, 1992 Aug. 14, Vol. 257, pp. 967-71)により開発さ
れたディファレンシャル・ディスプレー・ポリメラーゼ
連鎖反応（ＤＤＰＣＲ）を用いて決定した。痩せている
Zuckerラットと肥満したZuckerラットの腎臓に由来する
ＲＮＡから相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成するために
オリゴヌクレオチドプライマー（プライマーＩ）5'-ACC
ACACATCTGA-3'(配列番号５) を用いた。0.5μg のＲＮ
Ａ、１μM のプライマーＩ、20μMのdNTP、400 単位のM
-MLV 逆転写酵素(Promega, Madison, WI)および製造業
者から提供された１×標準逆転写酵素緩衝液を用いて20
μl の容量にてｃＤＮＡを合成した。この反応サンプル
を65℃まで５分加熱した後、42℃で１時間インキュベー
トした。次に、上で得られた４μl のｃＤＮＡ合成反応
物を1.5mM MgCl２、20μM dNTP、１μM のプライマー
Ｉ、１μM のプライマーII (5'-TGTTGGGAACAAG-3')（配
列番号６）、２μCiの[３３P]-d-α-ATP、1.25単位のAm
plitaqポリメラーゼ(Perkin elmer, Foster City, CA)
および製造業者から提供された１×標準ＰＣＲ緩衝液と
共に用いて20μl の反応容量にてポリメラーゼ連鎖反応
（ＰＣＲ）を行った。ＰＣＲのサイクル条件は、94℃で
30秒、42℃で２分、72℃で30秒を40サイクル行い、最後
に72℃で５分の伸長反応を行うものであった。痩せてい
るZuckerラットと肥満したZuckerラットの腎臓ＲＮＡか
らの標識ＰＣＲ断片を12％ＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲルで分離し、Ｘ線フィルムに16時間露出した。225 個
のヌクレオチドからなるＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片は、痩せ
ている同月齢の対照ラットと比べて、肥満したZuckerラ
ットの腎臓では減少していることが確認された。この断
片を乾燥ポリアクリルアミドゲルから切り出し、ＤＮＡ
を沸騰水で溶出した。この溶出ＤＮＡを上記と同じ条件
でＰＣＲにかけた。次に、ＰＣＲ反応物の２μl アリコ
ートを用いて、製造業者の標準反応条件によりＰＣＲ断
片をpCRIIベクター(Invitrogen, Carlsbad, CA)にサブ
クローニングした。その後、ｃＤＮＡインサートの配列
をfmol配列決定キット(Promega, Madison, WA)により決
定した。この配列情報を用いて、Marathon RACE キット
(Clonetech, Palo, Alto, CA)により追加の5'配列のク
ローニングのためのアンチセンスプライマーを作製し
た。次に、Marathon RACE キットから得られた607 ヌク
レオチドの配列を用いて、ＢＬＡＳＴ配列分析アルゴリ
ズムによりヒト相同体を同定した。Marathon Raceキッ
トを用いて腎臓ｍＲＮＡから全長ヒトｃＤＮＡをクロー
ニングした。このヒト配列は配列番号１で表される。

【００７５】実施例２ ラット腎臓由来のＲＮＡでのノーザンブロットによりCR
FG-1a ｍＲＮＡを検出した。グアニジニウムチオシアネ
ート変性および酸性化フェノール-クロロホルム抽出(CH
OMCZYNSKI P, SACCHI N: Analyt Biochem 162:156-159,
1987) により腎皮質から全ＲＮＡを抽出した。0.2Mホ
ルムアルデヒド-１％アガロースゲル上で全ＲＮＡ(10μ
g)を分画化し、４×標準塩水クエン酸塩中のナイロン膜
(Nylon-1, Gibco-BRL, Gaithersburg, MD)に移行させ
た。等しい負荷(loading)および移行をメチレンブルー
染色により確かめた。1.5kb と2.5kb でラット由来のｍ
ＲＮＡを認識する、CRFG-1aのためのアンチセンス[３２
P]ｃＤＮＡプローブを作製した。ノーザンブロット分析
により、腎不全を発症している肥満Zuckerラット由来の
腎臓ではCRFG-1a ｍＲＮＡが減少していることがわかっ
た。全腎臓塊の５／６を摘出する部分腎切除後の腎臓で
もCRFG-1a ｍＲＮＡが減少していた。この動物モデルは
慢性腎疾患を発症する(Shea SM, Raskova J, Morrison
AB Am J Pathol 1980 Aug; 100(2): 513-528) 。また、
老齢F344ラットの腎臓においてもCRFG-1a ｍＲＮＡが減
少していた。F344ラットは加齢とともに腎疾患を発症し
(McDermott GF, Ingram A, Scholey J, Kirkland JL, W
hiteside CI J Gerontol A Biol Sci Med Sci 1996 Ma
r; 51(2):M80-M85)、このことはCRFG-1aが腎疾患におい
て減少することを示唆している。

【００７６】本明細書中に引用された、特許および特許
出願明細書を含めた全ての刊行物は、あたかも各刊行物
が明確にかつ個々に示されているかのように、その全体
を参考としてここに組み入れるものとする。

【００７７】

【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：２３７１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 AGCATGGCAC ATTACAACTT CAAGAAAATT ACGGTGGTGC CGTCCGCCAA GGACTTCATA 60 GACCTCACGT TGTCCAAGAC TCAACGAAAG ACTCCAACCG TTATTCATAA ACATTACCAA 120 ATACATCGCA TTAGACATTT TTACATGAGA AAAGTCAAAT TTACTCAACA GAATTACCAT 180 GATAGACTTT CACAAATTCT AACAGATTTC CCCAAATTGG ATGATATTCA TCCGTTCTAT 240 GCTGATTTGA TGAATATTCT CTACGACAAG GATCATTACA AGTTGGCTCT GGGGCAAATA 300 AATATTGCCA AAAATTTAGT GGACAATGTT GCTAAAGATT ATGTGCGACT GATGAAGTAT 360 GGCGACTCTC TCTACCGCTG CAAACAGCTG AAGCGTGCGG CCCTGGGACG GATGTGCACA 420 GTGATCAAGA GGCAGAAGCA GAGTTTGGAG TATTTGGAGC AAGTGCGTCA GCATTTATCC 480 CGTTTGCCAA CCATTGATCC GAATACCAGG ACCCTGCTTT TGTGTGGGTA CCCAAATGTT 540 GGGAAGTCCA GCTTCATCAA CAAGGTGACG AGAGCAGACG TGGATGTCCA GCCCTATGCG 600 TTCACAACCA AGTCTCTGTT TGTTGGGCAC ATGGATTATA AGTATCTACG TTGGCAGGTT 660 GTAGACACTC CTGGGATCCT GGACCACCCT CTGGAGGATA GGAACACCAT CGAGATGCAG 720 GCCATCACTG CCCTGGCCCA CCTCCGTGCT GCGGTCCTGT ATGTGATGGA TTTGTCTGAG 780 CAGTGTGGGC ATGGGCTGAG GGAACAGCTA GAACTCTTCC AGAACATCAG ACCTCTCTTC 840 ATCAACAAGC CTCTCATAGT TGTAGCCAAC AAATGTGATG TGAAGAGAAT AGCTGAACTT 900 TCTGAAGATG ATCAGAAAAT ATTTACAGAT TTGCAGTCTG AAGGATTCCC TGTAATAGAG 960 ACCAGCACCC TGACTGAGGA AGGTGTTATT AAAGTTAAAA CAGAGGCTTG CGATAGGCTT 1020 TTGGCTCATC GAGTGGAAAC CAAAATGAAG GGAAATAAAG TGAATGAGGT GCTGAATAGA 1080 CTGCACCTGG CTATCCCAAC CAGGAGGGAC GATAAGGAGA GGCCCCCTTT CATCCCTGAA 1140 GGAGTGGTGG CTCGCAGGAA GAGGATGGAA ACTGAGGAGT CCAGGAAGAA GAGGGAACGA 1200 GATCTTGAGC TGGAAATGGG AGATGATTAT ATTTTGGATC TTCAGAAGTA CTGGGATTTA 1260 ATGAATTTGT CTGAAAAACA TGATAAGATA CCAGAAATCT GGGAAGGCCA TAATATAGCT 1320 GATTATATTG ATCCAGCCAT CATGAAGAAA TTGGAAGAAT TAGAAAAAGA AGAAGAGCTG 1380 AGAACAGCTG CTGGAGAGTA TGACAGTGTA TCTGAGAGTG AAGACGAAGA GATGCTGGAA 1440 ATCCGACAGC TGGCAAAGCA AATTCGAGAG AAAAAGAAGT TGAAAATTCT GGAGTCCAAA 1500 GAAAAGAATA CACAGGGACC CAGGATGCCG CGAACTGCTA AGAAGGTTCA GAGGACAGTT 1560 TTGGAGAAGG AGATGCGTAG TCTTGGTGTT GACATGGACG ATAAAGACGA TGCCCATTAC 1620 GCAGTCCAGG CAAGAAGATC CCGGAGCATC ACTAGGAAAA GAAAGCGGGA AGACTCTGCT 1680 CCCCCGTCCT CTGTGGCCCG GAGTGGGAGT TGCTCTCGAA CTCCACGTGA CGTTTCTGGT 1740 CTTAGGGATG TCAAGATGGT GAAGAAAGCC AAGACTATGA TGAAGAATGC TCAGAAGAAG 1800 ATGAATCGGT TGGGGAAGAA AGGGGAGGCG GATAGACACG TGTTTGATAT GAAGCCCAAG 1860 CACTTGCTGT CTGGGAAGAG GAAAGCTGGT AAAAAGGACA GGAGATAGTA TCCGTTTGGT 1920 TGGCGTGGCT TCGCTAGAGT GTTGCTGTTT ATTTCCTGTT TTGGCACAGT ATGGTTTCAT 1980 GAAATTGGAG CTCTGTATAA ACTGAAAAAG ACAAAATAAG TAAAGCACTT GTTGCTTTGC 2040 TGAAAACTAT GGTTAACCCT ATATAGGTGT GGGAAATTTT TGTCACTGCA TAATATTACA 2100 AATATTTTGA GTAGACAGTG TTTCCACATT TAATGGAGTA TCAGTTGCTT CAGATTTTCA 2160 GAACTGGGAA GATTTACTGG TGTAACTGGG TTGTTTTTGA TGGAGAAAAA CCTTATTTTC 2220 TTTTGTAAGA GCTGGGAGCA AACACGTTTA TGAGTGTGTC GGAATCCCGT GCTTAAAATA 2280 CGCTCTTAAA TTATTTTCTA GTCTTATTTC ACAATGTCTC ATTGTAGTCT GTCTTCAACT 2340 ATTTTATCCA AAATANACCT CCAGAAGAAA G 2371

【００７８】 配列番号：２ 配列の長さ：６３４ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Ala His Tyr Asn Phe Lys Lys Ile Thr Val Val Pro Ser Ala Lys 1 5 10 15 Asp Phe Ile Asp Leu Thr Leu Ser Lys Thr Gln Arg Lys Thr Pro Thr 20 25 30 Val Ile His Lys His Tyr Gln Ile His Arg Ile Arg His Phe Tyr Met 35 40 45 Arg Lys Val Lys Phe Thr Gln Gln Asn Tyr His Asp Arg Leu Ser Gln 50 55 60 Ile Leu Thr Asp Phe Pro Lys Leu Asp Asp Ile His Pro Phe Tyr Ala 65 70 75 80 Asp Leu Met Asn Ile Leu Tyr Asp Lys Asp His Tyr Lys Leu Ala Leu 85 90 95 Gly Gln Ile Asn Ile Ala Lys Asn Leu Val Asp Asn Val Ala Lys Asp 100 105 110 Tyr Val Arg Leu Met Lys Tyr Gly Asp Ser Leu Tyr Arg Cys Lys Gln 115 120 125 Leu Lys Arg Ala Ala Leu Gly Arg Met Cys Thr Val Ile Lys Arg Gln 130 135 140 Lys Gln Ser Leu Glu Tyr Leu Glu Gln Val Arg Gln His Leu Ser Arg 145 150 155 160 Leu Pro Thr Ile Asp Pro Asn Thr Arg Thr Leu Leu Leu Cys Gly Tyr 165 170 175 Pro Asn Val Gly Lys Ser Ser Phe Ile Asn Lys Val Thr Arg Ala Asp 180 185 190 Val Asp Val Gln Pro Tyr Ala Phe Thr Thr Lys Ser Leu Phe Val Gly 195 200 205 His Met Asp Tyr Lys Tyr Leu Arg Trp Gln Val Val Asp Thr Pro Gly 210 215 220 Ile Leu Asp His Pro Leu Glu Asp Arg Asn Thr Ile Glu Met Gln Ala 225 230 235 240 Ile Thr Ala Leu Ala His Leu Arg Ala Ala Val Leu Tyr Val Met Asp 245 250 255 Leu Ser Glu Gln Cys Gly His Gly Leu Arg Glu Gln Leu Glu Leu Phe 260 265 270 Gln Asn Ile Arg Pro Leu Phe Ile Asn Lys Pro Leu Ile Val Val Ala 275 280 285 Asn Lys Cys Asp Val Lys Arg Ile Ala Glu Leu Ser Glu Asp Asp Gln 290 295 300 Lys Ile Phe Thr Asp Leu Gln Ser Glu Gly Phe Pro Val Ile Glu Thr 305 310 315 320 Ser Thr Leu Thr Glu Glu Gly Val Ile Lys Val Lys Thr Glu Ala Cys 325 330 335 Asp Arg Leu Leu Ala His Arg Val Glu Thr Lys Met Lys Gly Asn Lys 340 345 350 Val Asn Glu Val Leu Asn Arg Leu His Leu Ala Ile Pro Thr Arg Arg 355 360 365 Asp Asp Lys Glu Arg Pro Pro Phe Ile Pro Glu Gly Val Val Ala Arg 370 375 380 Arg Lys Arg Met Glu Thr Glu Glu Ser Arg Lys Lys Arg Glu Arg Asp 385 390 395 400 Leu Glu Leu Glu Met Gly Asp Asp Tyr Ile Leu Asp Leu Gln Lys Tyr 405 410 415 Trp Asp Leu Met Asn Leu Ser Glu Lys His Asp Lys Ile Pro Glu Ile 420 425 430 Trp Glu Gly His Asn Ile Ala Asp Tyr Ile Asp Pro Ala Ile Met Lys 435 440 445 Lys Leu Glu Glu Leu Glu Lys Glu Glu Glu Leu Arg Thr Ala Ala Gly 450 455 460 Glu Tyr Asp Ser Val Ser Glu Ser Glu Asp Glu Glu Met Leu Glu Ile 465 470 475 480 Arg Gln Leu Ala Lys Gln Ile Arg Glu Lys Lys Lys Leu Lys Ile Leu 485 490 495 Glu Ser Lys Glu Lys Asn Thr Gln Gly Pro Arg Met Pro Arg Thr Ala 500 505 510 Lys Lys Val Gln Arg Thr Val Leu Glu Lys Glu Met Arg Ser Leu Gly 515 520 525 Val Asp Met Asp Asp Lys Asp Asp Ala His Tyr Ala Val Gln Ala Arg 530 535 540 Arg Ser Arg Ser Ile Thr Arg Lys Arg Lys Arg Glu Asp Ser Ala Pro 545 550 555 560 Pro Ser Ser Val Ala Arg Ser Gly Ser Cys Ser Arg Thr Pro Arg Asp 565 570 575 Val Ser Gly Leu Arg Asp Val Lys Met Val Lys Lys Ala Lys Thr Met 580 585 590 Met Lys Asn Ala Gln Lys Lys Met Asn Arg Leu Gly Lys Lys Gly Glu 595 600 605 Ala Asp Arg His Val Phe Asp Met Lys Pro Lys His Leu Leu Ser Gly 610 615 620 Lys Arg Lys Ala Gly Lys Lys Asp Arg Arg 625 630

【００７９】 配列番号：３ 配列の長さ：７１６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 GACTCTGCTC CCCCGTCCTC TGTGGCCCGG AGTGGGAGTT GCTCTCGAAC TCCACGTGAC 60 GTTTCTGGTC TTAGGGATGT CAAGATGGTG AAGAAAGCCA AGACTATGAT GAAGAATGCT 120 CAGAAGAAGA TGAATCGGTT GGGGAAGAAA GGGGAGGCGG ATATACACTT GTTTGATATG 180 AAGCCCAAGC ACTTGCTGTC TGGGAAGAGG AAAGCTGGTA AAAAGGACAG GAGATAGTAT 240 CCGTTTGGTT GGCGTGGCTT CGCTAGAGTG TTGCTGTTTA TTTCCTGGTT TGGCACAGTA 300 TGGTTTCATG AAATTGGAGC TCTGTATAAA CTGAAAAAGA CAAAATAAGT AAAGCACTTG 360 TTGCTTTGCT GAAAACTATG GTTAACCCTA TATAGGTGTG GGAAATTTTT GTCACTGCAT 420 AATATTACAA ATATTCTGAG TAGACAGTGT TTCCACATTT AATGGAGTAT CAGTTGCTTC 480 AGATTTTCAG AACTGGGAAG ATTTACTGGT GTAACTGGGT TGTTTTTGAT GGAGAAAAAC 540 CTTATTTTCT TTTGTAAGAG CTGGGAGCAA ACACGTTTAT GAGTGTGTCG GAATCCCGTG 600 CTTAAAATAC GCTCTTAAAT TATTTTCTAG TCCTTATTTT ACAATGTCTC ATTGTAGTCT 660 GTCTTCAACT ATTTTATCCA AAATAAACCT CCAGAAGGAA AAAAAAAAAA AAAAAA 716

【００８０】 配列番号：４ 配列の長さ：１０４ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 His Glu Asp Lys Asp Asp Ala His Tyr Ala Val Gln Ala Arg Arg Ser 1 5 10 15 Arg Ser Ile Thr Arg Lys Arg Lys Arg Glu Asp Ser Ala Pro Pro Ser 20 25 30 Ser Val Ala Arg Ser Gly Ser Cys Ser Arg Thr Pro Arg Asp Val Ser 35 40 45 Gly Leu Arg Asp Val Lys Met Val Lys Lys Ala Lys Thr Met Met Lys 50 55 60 Asn Ala Gln Lys Lys Met Asn Arg Leu Gly Lys Lys Gly Glu Ala Asp 65 70 75 80 Ile His Leu Phe Asp Met Lys Pro Lys His Leu Leu Ser Gly Lys Arg 85 90 95 Lys Ala Gly Lys Lys Asp Arg Arg 100

【００８１】 配列番号：５ 配列の長さ：１３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 ACCACACATC TGA 13

【００８２】 配列番号：６ 配列の長さ：１３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 TGTTGGGAAC AAG 13

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 3/10 Ａ６１Ｐ 13/12 ４Ｃ０８４ 9/10 25/28 ４Ｃ０８６ 13/12 Ｃ０７Ｋ 14/47 ４Ｈ０４５ 25/28 16/18 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/18 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/02 5/10 1/68 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 33/50 Ｚ 1/68 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/50 5/00 Ａ 33/566 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 バーバラ オルソン アメリカ合衆国 19403 ペンシルバニア 州，ノリスタウン，デフォード プレイス 5069 エー. (72)発明者 ユアン ズ アメリカ合衆国 19422 ペンシルバニア 州，ブルー ベル，オークモント ドライ ブ 203 Ｆターム(参考） 2G045 AA25 AA40 DA36 FB03 4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 CA11 GA11 HA01 HA12 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ02 QQ03 QQ08 QQ13 QQ43 QQ53 QQ79 QR32 QR56 QR62 QR77 QR80 QS16 QS24 QS25 QS34 QS38 4B064 AC01 CA01 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AA19X AA26X AA50X AA53X AA60X AA72X AA88X AA90X AA93X CA24 CA44 CA46 4C084 AA02 AA03 AA13 AA19 BA01 BA08 BA20 BA22 BA23 BA35 BA44 CA17 CA18 MA02 MA66 NA14 ZA022 ZA162 ZA362 ZA812 ZC352 4C086 AA01 EA16 MA02 MA04 MA66 NA14 ZA02 ZA16 ZA36 ZA81 ZC35 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 EA21 EA26 FA72 FA73 FA74

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号２のCRFG-1aポリペプチドをコ
   ードするヌクレオチド配列と全長において少なくとも８
   ０％同一であり、かつCRFG-1aポリペプチドの活性を有
   するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、また
   はこのヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド
   配列を含んでなる単離されたポリヌクレオチド。
2. 【請求項２】 前記のポリヌクレオチドが、配列番号２
   のCRFG-1aポリペプチドをコードする配列番号１中に含
   まれるヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１に記載
   のポリヌクレオチド。
3. 【請求項３】 前記のポリヌクレオチドが、その全長に
   おいて配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも８０
   ％同一であるヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１
   に記載のポリヌクレオチド。
4. 【請求項４】 配列番号１のポリヌクレオチドである、
   請求項３に記載のポリヌクレオチド。
5. 【請求項５】 ＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項１に
   記載のポリヌクレオチド。
6. 【請求項６】 配列番号２のCRFG-1aポリペプチドのア
   ミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が付加、
   欠失または置換されており、かつCRFG-1aポリペプチド
   の活性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド
   配列を含んでなるポリヌクレオチド。
7. 【請求項７】 下記発現系が適合性の宿主細胞内に存在
   するとき配列番号２のポリペプチドと少なくとも８０％
   同一であるアミノ酸配列を含むCRFG-1aポリペプチドを
   産生することができる発現系を含んでなるＤＮＡまたは
   ＲＮＡ分子。
8. 【請求項８】 請求項７に記載の発現系を含有する宿主
   細胞。
9. 【請求項９】 CRFG-1aポリペプチドを産生させるのに
   十分な条件下で請求項８に記載の宿主細胞を培養し、こ
   の培養物から前記ポリペプチドを回収することを含んで
   なる、CRFG-1aポリペプチドの産生方法。
10. 【請求項１０】 宿主細胞が適当な培養条件下でCRFG-1
    aポリペプチドを産生するように、請求項７に記載の発
    現系を用いて宿主細胞を形質転換またはトランスフェク
    ションすることを含んでなる、CRFG-1aポリペプチドを
    産生する細胞の作製方法。
11. 【請求項１１】 全長において配列番号２のアミノ酸配
    列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んで
    なるCRFG-1aポリペプチド。
12. 【請求項１２】 配列番号２のアミノ酸配列を含む、請
    求項１１に記載のポリペプチド。
13. 【請求項１３】 請求項１１に記載のCRFG-1aポリペプ
    チドに免疫特異的な抗体。
14. 【請求項１４】 請求項１１に記載のCRFG-1aポリペプ
    チドの活性増加または発現増加を必要としている患者を
    治療するための医薬組成物であって、治療上有効な量
    の、 (a) 前記ポリペプチドに対するアゴニスト、および／ま
    たは (b) 前記ポリペプチド活性のin vivo 生産をもたらす形
    の、配列番号２のCRFG-1aポリペプチドをコードするヌ
    クレオチド配列と全長において少なくとも８０％同一で
    あるヌクレオチド配列、または前記ヌクレオチド配列に
    対して相補的なヌクレオチド配列を含んでなる単離され
    たポリヌクレオチド、を含んでなる医薬組成物。
15. 【請求項１５】 請求項１１に記載のCRFG-1aポリペプ
    チドの活性または発現を抑制する必要がある患者を治療
    するための医薬組成物であって、治療上有効な量の、 (a) 前記ポリペプチドに対するアンタゴニスト、および
    ／または (b) 前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の
    発現を抑制する核酸分子、および／または (c) 前記ポリペプチドのリガンド、基質または受容体に
    関して前記ポリペプチドと競合するポリペプチド、を含
    んでなる医薬組成物。
16. 【請求項１６】 請求項１１に記載のCRFG-1aポリペプ
    チドの発現または活性と関連した被験者の疾病またはそ
    の罹病性の検出方法であって、 (a) 前記被験者由来のゲノム中にCRFG-1aポリペプチド
    をコードするヌクレオチド配列の突然変異があるかどう
    かを調べる、および／または (b) 前記被験者から得られたサンプル中のCRFG-1aポリ
    ペプチド発現の存在または量を分析する、ことを含んで
    なる方法。
17. 【請求項１７】 請求項１１に記載のCRFG-1aポリペプ
    チドを阻害（拮抗）する化合物の同定方法であって、 (a) CRFG-1aポリペプチドを発現している細胞（もしく
    はCRFG-1aポリペプチドを発現している細胞膜）またはC
    RFG-1aポリペプチドに応答する細胞と候補化合物とを接
    触させ、そして (b) その結合、または機能的応答の刺激もしくは抑制を
    観察するか、または候補化合物と接触させた細胞（また
    は細胞膜）の能力を、接触させなかった同一の細胞と、
    CRFG-1aポリペプチド活性に関して比較する、ことを含
    んでなる方法。
18. 【請求項１８】 請求項１７に記載の方法により同定さ
    れたアンタゴニスト。
19. 【請求項１９】 請求項１０に記載の方法により作製さ
    れた組換え宿主細胞、またはCRFG-1aポリペプチドを発
    現しているその膜。