JP2005523418A - 哺乳動物組織で脂質レベルを正常化するための方法及び組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、細胞又は組織をCGRP受容体、例えば高親和性CGRP受容体のアゴニストと接触させることにより、哺乳動物細胞及び組織において、脂肪分解を刺激する方法を提供する。アゴニストは、代謝性アミリン受容体に比較して高親和性CGRP受容体を優先的に刺激しうる。受容体アゴニストを同定するスクリーニング法は提供され、そういったアゴニストを含む医薬組成物、及びそういったアゴニストを用いる治療投与計画もまた提供される。

Description

発明の分野
[0001]本発明は、細胞又は組織において脂質レベルを調節するための、かつ脂質レベルの調節に有用な薬剤を同定するための方法及び組成物を提供する。本発明は、生物学及び医学の分野において利用される。

関連出願へのクロスリファレンス
[0002]本出願は、2001年11月26日に出願された米国仮特許出願第60/333,422号の利益を主張し、当該出願を本明細書中に援用する。

背景
[0003]脂質代謝の異常は、様々な症状及び病気で役割を担う。例えば、骨格筋における脂質の蓄積は、筋肉そのものだけではなく、肝臓、脂肪、及び別の組織においてインシュリン抵抗性の発達の根底となる主要な代謝異常であるという強い証拠がある。McGarry et al. What if Minkowski had been ageusic? An aleternative angle on diabetes. Science. 1992 Oct 30;258(5083):766-70; Ellis et al. long-chain acyl-CoA esters as indicators of lipid metabolism and insulin sensitivity in rat and human musCle. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2000 Sep;279(3):E554-60; Furler et al., A high-fat diet influences insulin-stimulated posttransport musCle glucose metabolism in rats. Metabolism. 1997 Sep;46(9):1101-6; Dobbins et al., Prolonged inhibition of musCle carnitine palmitoyltransferase-1 promotes intramyocellular lipid accumulation and insulin resistance in rats. Diabetes. 2001 Jan;50(2):123-30; Kraegen et al. Development of musCle insulin resistance after liver insulin resistance in high-fat-fed rats. Diabetes. 1991 Nov;40(11):1397-403; Unger et al., Lipotoxic diseases of nonadiposetissues in obesity. Int J Obes Relat Metab Disord. 2000 Nov;24 Suppl 4:S28-32; Kelley et al. Skeletal musCle fatty acid metabolism in associatioj with insulin resistance, obesity, and weight loss. Am J Physiol. 1999Dec;277(6Pt 1):E11130-41; Simoneau et al. Markers of capacity to utilize fatty acids in human skeltal musCle: relation to insulin resistance and obesity and effects of weight loss. FASEB J. 1999 Nov;13(14):2051-60; Manco et al. Insulin resistance directly correlates with increased saturated fatty acids in skeltal musCle triglycerides. Metabolism. 2000 Feb;49(2):220-4.

[0004]インシュリン抵抗性は、共通の根底を持つ病原性のメカニズムを有するヒトのいくつかの主要な代謝性疾患にとって最初の病原性過程であり、「代謝性症候群」又は「複合X症候群」と呼ばれる。複合X症候群に通常含まれる疾患は、2型糖尿病、高血圧、肥満、異脂肪血症、アテローム性動脈硬化、及び血栓症を含む(例えば、Zierath et al.,2000, Diabetologia 43:821-35; Bergman et al., 2001, J Investig Med. 49:119-26; Olefsky et al., 1995, Am J Clin Nutr. 61(4 Suppl):980S-986S; Ginsberg et al., 2000, J Clin Invest. 106:453-8; Groop et al., 1999, Diabetes Obes Metab. 1 Suppl 1:S1-7; Fujimoto et al., 2000, Am J Med. 17; 108 Suppl 6a:9S-14S; Ferrannini et al., 1986, N Engl J Med., 1986, 317:350-7; Landsberg et al., 1999, Clin Exp Hypertens; 21:885-894; Ferrannini et al., 1995, Metabolism, 44(9 Suppl 3):15-7; Kahn et al., 2000, J Clin Invest. 106:473-81; Ginsberg et al., 2000, J Cardiovasc Risk 7:325-31; Howard et al., 1999, Am J Cardiol. 8;84(1A): 28J-32J; Grundy et al., 1999, Am J Cardiol. 13;93(9B):25F-29F; Misra et al., 2000, J Cardiovasc Risk.7(3):215-29参照のこと)。

[0005]組織内で脂質含量を正常化するための医薬品及び治療戦略を発達させることは望ましいだろう。例えば、そういった医薬品及び治療戦略は、インシュリン抵抗性を治療するのに有用である。

発明の要約
[0006]ある側面では、本発明は、代謝性アミリンと比較して、高親和性CGRP受容体の活性を優先的に刺激する(例えば、代謝性アミリン受容体の活性を実質的に刺激することなく、高親和性CGRP受容体の活性を刺激する）有効なアゴニストの量で、組織を高親和性CGRP受容体のアゴニストと接触させることにより、哺乳動物の組織(例えば、骨格筋又は肝臓)において、脂肪分解を刺激する方法を提供する。ある態様では、アゴニストはCGRP-1である。ある態様では、組織は、約10^-15Mと約10^-10Mとの間のCGRP-1と接触される。ある態様では、量は300pM未満である。ある態様では、組織は単離される。さらなる側面では、方法は、組織における脂肪分解の刺激を検出するステップを含む。

[0007]ある側面では、本発明は哺乳動物細胞、例えば骨格筋細胞において、細胞をCGRPポリペプチド又は、生物学的に機能性のそのバリアントと接触させることにより、脂肪分解を刺激する方法を提供する。ある態様では、CGRPポリペプチドは、天然のCGRPポリペプチド、例えばヒトCGRPの配列を有する。ある態様では、CGRPポリペプチドは、ヒトCGRP-1ポリペプチド、又は生物学的に機能性のそのバリアントである。ある態様では、ポリペプチド又はバリアントは、優先的に高親和性CGRP受容体を刺激する。

[0008]ある側面では、本発明は、骨格筋又は肝臓をCGRP-1又は代謝性受容体を刺激するそのバリアントと接触させることにより、哺乳動物の骨格筋又は肝臓内で脂肪分解を刺激する方法を提供する。その方法は、(例えば、筋肉、肝臓、血液、又は別の哺乳動物の組織における遊離脂肪酸量を測定することにより)哺乳動物の組織における脂肪分解のレベルの変化をモニタリングすることをさらに含みうる。

[0009]ある側面では、本発明は、(i)骨格筋における脂質の蓄積を特徴とする病気を患っている又は病気に感受性のある哺乳動物に対して、CGRP-1ポリペプチド、生理活性を持つそのバリアント、又は代謝性受容体を刺激するそのバリアントを投与すること及び(ii)哺乳動物において脂肪分解をモニタリングすることを含む治療法を提供する。

[0010]ある側面では、本発明は、代謝性アミリン受容体がアゴニストによって刺激されず、高親和性受容体が優先的に刺激されるところの条件下において、高親和性CGRP受容体のアゴニストを投与することによって、そういった治療を必要とする哺乳動物における骨格筋脂質レベルを減ずる方法を提供し、ここで、哺乳動物は、組織における脂質の蓄積を特徴とする病気又は疾患を有する。ある態様では、哺乳動物はインシュリン抵抗性である。ある態様では、方法は、哺乳動物の組織(例えば、骨格筋、肝臓、又は血液)において遊離脂肪酸の量の変化を検出することをさらに含む。ある態様では、方法は、病気又は疾患の経過をモニタリングすることをさらに含む。ある態様では、アゴニストの投与は、哺乳動物において血液グルコースレベルの増加をもたらさない。

[0011]関連する側面では、本発明は組織をCGRPポリペプチド又は生物学的に機能性のそのバリアントと接触させることにより、組織(例えば骨格筋または肝臓)において、脂質レベルを減少させる方法を提供する。ある態様では、CGRPポリペプチド又はバリアントは、組織脂質レベルを減少するために有効な量で哺乳動物に投与される。ある態様では、哺乳動物はインシュリン抵抗性であり、かつポリペプチド又はバリアントは、哺乳動物においてインシュリン抵抗性を減少するために有効な量で投与される。ある態様では、ポリペプチド又はバリアントは、高親和性CGRP受容体を優先的に刺激する。

[0012]ある側面では、本発明は、骨格筋における脂質レベルを減少させる薬物の製造における又はインシュリン抵抗性の治療のための薬物の製造におけるCGRPポリペプチド、例えば、CGRP-1又は生物学的に機能性のそのバリアントの使用を提供する。

[0013]ある態様では、本発明は、細胞を高親和性CGRP受容体のアゴニストと接触させることにより、高親和性CGRP受容体を発現する細胞内において、脂肪分解を刺激する方法を提供する。ある態様では、アゴニストは、代謝性アミリン受容体に比較して高親和性CGRP受容体を優先的に活性化する。

[0014] 関連する側面では、本発明は、哺乳動物に対して高親和性CGRP受容体アゴニストを投与することにより、哺乳動物における脂肪分解を刺激する方法を提供する。ある態様では、アゴニストは、代謝性アミリン受容体に比較して高親和性CGRP受容体を優先的に活性化する。ある態様では、アゴニストはポリペプチドであり、例えばCGRPポリペプチド又は生物学的に機能性のそのバリアントである。様々な態様では、方法は、哺乳動物の組織(骨格筋、肝臓、血清、血漿又は血液)内で遊離脂肪酸の量を測定すること又は、哺乳動物に対するCGRPの投与が哺乳動物におけるインシュリン抵抗性に与える効果をモニタリングすることを含む。ある態様では、アゴニストは、血管拡張を刺激することなく、脂肪分解を刺激するために有効な量で投与される。関連する側面では、発明は、代謝性アミリン受容体に比較して、高親和性CGRP受容体を優先的に刺激するのに十分な高親和性CGRP受容体のアゴニストの量を投与することによって、そういった治療を必要とする哺乳動物の組織(例えば骨格筋又は肝臓)内で脂肪分解を刺激する方法を提供する。

[0015] 様々な態様では、アゴニストが投与される哺乳動物は、骨格筋(例えば、インシュリン抵抗性、X症候群、2型糖尿病)、又は肝臓(例えば肝臓の脂肪変性、つまり「脂肪肝」)において脂質の蓄積におより特徴付けられる疾患又は病気を有する。

[0016] 本発明の態様では、アゴニストは、医薬として許容されるキャリアを伴って投与される。本発明はまた、哺乳動物の組織(例えば、骨格筋又は肝臓)において脂質の蓄積を特徴とする病気又は疾患(例えば、インシュリン抵抗性又はX症候群)の治療のための薬物の製造に高親和性CGRP受容体のアゴニストの使用を提供する。関連する側面では、哺乳動物に投与されたとき、薬物が300pM未満の血中アゴニストのレベルをもたらすか、又は哺乳動物に投与されたとき、薬物が約10^-15Mと約10^-10Mとの間より少ない血中のアゴニストのレベルをもたらすところにおいて、発明は、組織(例えば骨格筋又は肝臓)において脂質の蓄積を特徴とする病気を患う又は病気に感受性の哺乳動物を治療するための薬物の製造にCGRP-1の使用を提供する。ある側面では、薬物が哺乳動物に投与されるとき、約10^-15Mと約10^-10Mとの間の血中アゴニストレベルをもたらすところにおいて、本発明は、組織(例えば骨格筋又は肝臓)における脂質の蓄積を特徴とする病気を患う又は病気に感受性の哺乳動物を治療するための薬物の製造におけるCGRP-1の使用を提供する。ある態様では、病気は、糖尿病、インシュリン抵抗性、又はX症候群である。

[0017] 本発明は、薬剤がCGRP受容体、例えば高親和性CGRP受容体のアゴニストであるかを決定することにより、薬剤が哺乳動物において脂肪分解を刺激するために有用であるかを決定する方法を提供する。ある態様では、方法は、薬剤が代謝性アミリン受容体に比較して、高親和性CGRP受容体を優先的に刺激するということを決定することをさらに含む。ある態様では、方法は、代謝性アミリン受容体により仲介される応答(例えば、糖代謝に関する影響)に影響を及ぼすことに関する薬剤のEC₅₀と、高親和性CGRP受容体により仲介される応答(骨格筋組織又は骨格筋細胞における遊離脂肪酸の増加)に影響を及ぼすことに関する薬剤のEC₅₀とを比較することをさらに含む。ある態様では、EC₅₀値は、in vitroで単離された骨格筋を用いて決定される。ある態様では、糖代謝への効果は、組織又は血清のグルコース及び/又は乳酸レベル並びに/或いは組織グリコーゲンレベルでの変化である。

[0018] 本発明はまた、薬剤が高親和性CGRP受容体及び代謝性アミリン受容体を発現する哺乳動物組織における脂肪分解を刺激するかを決定することによって；及び、高親和性CGRP受容体を優先的に刺激する薬剤が治療薬剤として有用であると決定されるところにおいて、脂肪分解を刺激する薬剤が、代謝性アミリン受容体に比較して高親和性CGRP受容体を優先的に刺激するかを決定することによって、化合物が治療薬剤として有用であるかを決定する方法を提供する。本発明のこの及び別の方法は、治療薬として有用な化合物を選別するために使われうる。ある態様では、薬剤スクリーニングは、前記の方法を少なくとも25の異なる薬剤(例えば、同時に又は経時的に)ついて行うことを含む。

[0019] ある態様では、本発明は、(i) 高親和性CGRP受容体に結合する複数の薬剤を同定すること；及び(ii)代謝性アミリン受容体に比較して高親和性CGRP受容体を優先的に刺激する薬剤を(i)から選別することを含むスクリーニング法を提供する。ある態様では、方法は、(i)高親和性CGRP受容体に結合する複数の薬剤を同定すること；及び、(ii)代謝性アミリン受容体によって仲介される応答に影響するEC₅₀であって、高親和性CGRP受容体により仲介される応答に影響を及ぼすことに関する薬剤のEC₅₀より高いEC₅₀を有する薬剤を(i)から選択することを含む。ある態様では、EC₅₀値は、(例えば、ラット由来の)単離された骨格筋を用いてin vitroで決定される。ある態様では、代謝性アミリン受容体により仲介される応答に影響するEC₅₀は、高親和性CGRP受容体により仲介される応答に影響を及ぼすことに関する薬剤のEC₅₀と比較して少なくても10倍は大きい。高親和性受容体により仲介される応答は、骨格筋組織又は骨格筋細胞における遊離脂肪酸の増加であり、及び代謝性アミリン受容体によって仲介される応答は糖代謝に関する影響でありうる。

[0020] 関連する態様では、発明は、(i)高親和性CGRP受容体を発現する組織において脂肪分解を刺激する薬剤の大多数を同定すること；及び；(ii)代謝性アミリン受容体に比較して高親和性CGRP受容体を優先的に刺激する(i)から薬剤を選択することによって、哺乳動物における脂肪分解を刺激するのに有用な薬剤であるかを決定する方法を提供する。ある態様では、組織は骨格筋(例えば、ラット由来)である。ある態様では、スクリーニングされるライブラリーは、約100を超える異なる試験薬剤を有する。

[0021] 本発明はまた、薬剤が哺乳動物における脂肪分解を刺激するために有用であるかを決定する方法であって、薬剤の脂肪分解活性をCGRPの脂肪分解活性と比較することを含む方法を提供する。

[0022] 本発明はまた、代謝性アミリン受容体を活性化することなく哺乳動物の組織における高親和性CGRP受容体を活性化するために有効な量でCGRP受容体アゴニストを投与することによって、哺乳動物におけるインシュリン抵抗性を治療する方法を提供し、ここではアゴニストが上記スクリーニング法を用いて同定される薬剤である。ある態様では、治療方法は、哺乳動物の組織において遊離脂肪酸の量を計測するか、又は哺乳動物においてインシュリン抵抗性をモニターする更なるステップを含む。

[0023] ある側面では、本発明は、(i)(a)複数の異なった投与量又は製剤形態のCGRP受容体アゴニストを実験動物にたいし投与すること；及び(b)各投与量又は製剤形態が実験動物の組織内での脂肪分解にあたえる効果を計測し、及び各投与量の副作用に対する効果を計測すること、それにより脂肪分解及び副作用の用量‐応答データを作ることによって、用量‐応答アッセイを行うこと；及び(ii)用量‐応答データから、脂肪分解を増やすが副作用を誘発しない、又はその目的のため、脂肪分解の実質的な増加及び副作用の最小限の増加がある、CGRP受容体アゴニスト製剤の投与量を決定することによって、哺乳動物における望ましくない副作用(例えば、哺乳動物における血液グルコースレベルの増加又は哺乳動物における血管拡張の刺激)を最小限にする一方で、哺乳動物の組織(例えば骨格筋又は肝臓)における脂肪分解を刺激する高親和性CGRP受容体のアゴニストの投与量又は製剤形態を決定する方法を提供する。

[0024] 本発明はまた、代謝性アミリン受容体と比較して高親和性CGRP受容体を優先的に刺激する薬剤の治療有効量及び医薬として許容される賦形剤を含む組成物を提供する。ある態様では、組成物は、哺乳動物に投与されたとき、哺乳動物において、代謝性アミリン受容体を刺激することなく高親和性CGRP受容体を刺激する。ある態様では、組成物は、血管拡張を最小限に刺激する一方で脂肪分解を刺激する。

[0025] ある側面では、発明は、哺乳動物に対する投与のための単位用量形態の医薬組成物を提供し、前記単位用量は、代謝性アミリンに比較して高親和性CGRP受容体の活性を優先的に刺激する(例えば、実質的に代謝性アミリン受容体の活性を刺激することなく、高親和性CGRP受容体の活性を刺激する）ために十分な血中アゴニストレベルを十分にもたらす量の高親和性CGRP受容体のアゴニストを含む。ある態様では、アゴニストは、CGRP-1及び医薬として許容される賦形剤である。ある態様では、アゴニストは、CGRP-1又は生物学的に機能性のそのバリアントである。ある態様では、アゴニストはCGRP-1であり、かつ血中アゴニストのレベルは300pM未満である。ある態様では、アゴニストはCGRP-1であり、かつ血中アゴニストのレベルは約10^-15Mと約10^-10Mの間である。

[0026] 本発明は、組織(例えば骨格筋又は肝臓)における脂質の蓄積を特徴とする病気を患っている又は病気に感受性の哺乳動物を治療する薬物の製造における高親和性CGRP受容体のアゴニストを使用することを提供し、ここで、薬物は、哺乳動物に対し投与されるとき、代謝性アミリンに比較して高親和性CGRP受容体の活性を優先的に刺激する(例えば、代謝性アミリン受容体の活性を実質的に刺激することなく、高親和性CGRP受容体の活性を刺激する)ために十分な哺乳動物におけるアゴニストのレベルをもたらす。ある態様ではアゴニストはCGRP-1である。

[0027] 別の側面では、本発明は、代謝性アミリン受容体及び/又は高親和性CGRP代謝性アミリン受容体のアンタゴニスト(例えば^8,37アミリン又は^8,37CGRP)を、脂肪分解を阻害する有効量で哺乳動物に対し投与することによって、哺乳動物における脂肪分解を阻害する方法を提供する。

[0028] 別の側面では、本発明は、組織を代謝性アミリン受容体のアゴニスト(例えば、CGRP)と接触させることにより、哺乳動物の組織における脂肪分解を刺激する方法を提供する。

発明の詳細な説明
I.定義
[0055] 本明細書中で使われるとき、「脂肪分解」は脂質又は脂肪貯蔵化合物、例えば中性脂肪を酵素性加水分解することを指し、遊離脂肪酸の放出をもたらす。「遊離脂肪酸(FFA)」及び「非エステル化脂肪酸(NEFA)」は本明細書中で互換性を持って使われる。

[0056] 本明細書中で使われるとき、「治療有効量」は、組織、システム、動物、又はヒトの生理的又は医薬的な応答を誘発するように計算された薬剤のあらかじめ決められた量であって、研究者、獣医師、医師、又は別の臨床師によって調べられている量を指す。例えば、脂肪分解を刺激する、又は脂質レベルを減じる、及び/又は疾患の状態又は病徴を回復する、或いは病気又は別の望ましくない病徴の進行を予防し、邪魔をし、遅延し、又は反転させて望ましい治療効果を達成するために十分な量のことである。

[0057] 本明細書中で使われるとき、「医薬として許容される担体」又は「医薬として許容される賦形剤」は、投与の際に副作用を起こさない担体のこと、及び治療薬剤が治療有効量を運ぶために十分に溶けるところのものを指す。賦形剤の例は、緩衝化された水、生理食塩水、PBS、デキストロース溶液、ハンクス液、及び不活性希釈液、例えば炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム、又はリン酸ナトリウムを含む。

[0058] 本明細書中で使われるとき、「哺乳動物」は、その通常の意味を有し、霊長類(例えば、ヒト及び非ヒト霊長類)、実験動物(例えば、げっ歯類、例えばマウス及びラット)、家畜(例えばウシ、ブタ、ヒツジ、及びウマ)、及びペット(例えばイヌ及びネコ)を含む。

[0059] 本明細書中で使われるとき、哺乳動物における病気及び/又は疾患を「治療」又は「治療する」という用語は、(i)病気又は疾患を防ぐこと、つまり病気の臨床病徴を避けること；(ii)病気又は疾患を防ぐこと、つまり臨床病徴の発達又は進行を抑止すること；及び/又は、(iii)病気又は疾患を軽減すること、つまり臨床病徴の減少をもたらすことを意味する。

[0060] 本明細書中で使われるとき「EC₅₀」は、当該技術分野における通常の意味を有し、特定化された最大生理効果の50％をもたらす化合物の濃度のことを指し、例えば、リガンド(例えばCGRP)が受容体(例えば高親和性CGRP受容体)に結合することによって仲介される生理的効果が、その最大値の2分の1であるところの濃度である。例えば、CGRPと高親和性CGRP受容体による骨格筋脂肪分解を刺激するためのEC₅₀は、基底のレベルに対し骨格筋脂肪分解の最大増強の50％をもたらす、CGRPの濃度である。リガンドは天然物でありうるし、天然物でないこともありうる。

[0061] 本明細書中で使われるとき、受容体の「アゴニスト」は、受容体の天然のリガンドが受容体に結合することに通常付随する、少なくとも1の生理応答を促進することができる薬剤(化合物又は組成物)である。例えば、骨格筋の細胞において存在する高親和性CGRP受容体のアゴニストは、高親和性受容体と相互作用(例えば結合)し、かつ筋肉細胞において用量-依存様式で脂肪分解を増やす薬剤(例えば、CGRP)である。アゴニストとCGRP受容体との間の結合性相互作用は、アゴニストが受容体への結合においてCGRP(例えば放射線標識されたCGRP)と競合する能力によって及び/又は別の競合アッセイを用いて計測されうる。

[0062] 本明細書中で使われるとき、受容体は、化合物又は薬剤の受容体(例えばリガンド結合サイトへ)への結合が受容体を発現する細胞の代謝状態の変化をもたらすとき、化合物又は薬剤によって「刺激され」又は同等に「活性化され」又は同等に「作用され」る。通常、リガンド(例えば天然リガンド又は別のアゴニスト)が結合する際、受容体は細胞内部にシグナルを伝達する。受容体を特定の化合物と接触させることが、細胞特性による応答であって、天然の(つまり天然に生じる内在性の)リガンドが結合する際観察される応答をもたらすとき、これは、化合物が受容体を刺激する又は活性化することができるということを示唆する。文法的な同義語(例えば、活性化、刺激等)は一致する意味を有する。

[0063] 本明細書中で使われるとき、「保存的な置換」は、タンパク質を記述するとき、タンパク質のアミノ酸組成物における変化を指し、そこでは、残基は実質的にタンパク質の活性を変えない構造的に似た置換基へと置き換えられる。このように特定のアミノ酸配列の「保存的に置換されたバリアント」は、タンパク質活性にとって重大な意味を持たないアミノ酸を置換すること又は、重大な意味を持つアミノ酸の置換であれ、活性を実質的に変えないように、似た性質(例えば、酸性、塩基性、正又は負に帯電された、極性又は非極性等)を有する別のアミノ酸へとアミノ酸を置換することのことを指す。機能的に同様のアミノ酸を提供する保存的置換の表は、当該技術分野において既知である。次の6のグループ各々は、互いに保存的な置換であるアミノ酸を含む：1)アラニン(A)、セリン(S)、スレオニン(T)；2)アスバラギン酸(D)、グルタミン酸(E)；3)アスバラギン(N)、グルタミン(Q)；4)アルギニン(R)、リジン(K)；5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V)；及び6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)。(Creghton (1984) Proteins, W.H. Freeman and Company参照のこと)。当該技術分野のある技術では、上記置換が唯一の可能な保存的置換ではないことを認識するだろう。例えば、荷電を有する全てのアミノ酸を、それが正電荷であれ負電荷であれ、お互い保存的な置換としてみなしうる。さらに付け加えると、1つのアミノ酸又はコード配列内の少量パーセントのアミノ酸を変化させ、付け加え、又は欠失させる、個々の置換、欠失、又は付加もまた「保存的に置換されたバリアント」となりうる。

[0064] 「ペプチド」という用語は、長さにして50残基より少ないポリペプチドのことを指す。「タンパク質」及び「ポリペプチド」は、「ペプチド」及び長いアミノ酸ポリマーの両者を含む。

[0065] 「接触する」という用語は、近くまで持ちこむという通常の意味を有する。化合物と細胞又は組織により発現される受容体を接触させる方法は、非限定的に、細胞又は組織を、化合物が受容体に結合しうる条件で化合物と供にex vivo(例えばin vitroで)でインキュベーションすること、及び化合物が循環又は動物の他のシステムによって細胞又は組織へと運ばれるように、化合物を動物に投与することを含む。あるケースでは、動物又は組織の代謝活性によって、投与された薬剤はアゴニストへ変換される(例えば、投与された薬剤の代謝物がアゴニストである)。

[0066] 本明細書中で使われるとき、「ペプチド擬似物質」又は「ペプチドミメティクス」(Fauchere, 1986, Adv. Drug Res. 15:29;Veber and Freidinger, 1985, TINS p.392; and Evans et al., 1987, J.Med.Chem 30:1229)という用語は、当該技術分野における通常の意味を有し、医薬工業において、非ペプチド薬として使われるペプチドアナログであって、テンプレートのペプチドに類似の性質を有するペプチドアナログのことを指す。ペプチドミメティクスは、通常コンピュータ処理された分子モデリングの助けを用いて開発される。治療上有効なペプチドに構造的に類似であるペプチドミメティクスは、同等の治療上又は予防上の効果を生ずるために使われうる。一般的に、ペプチドミメティクスは、構造的に類似のパラダイムポリペプチド(つまり、生物的又は医薬的な活性を有するポリペプチド)、例えば天然CGRPポリペプチドであるが、当業者に既知の方法及び以下の参照に記される方法によって、--CH₂NH--、--CH₂S--、--CH₂--CH₂--、--CH.dbd.CH--(シス及びトランス)、--COCH₂--、--CH(OH)CH₂--、及びCH₂SO--から成る群から選ばれる結合によって置き換えられた１以上のペプチド結合を有する。Spatola, A. F. in “Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins”; Morley, 1980, Trends Pharm Sci pp. 463-468; Hudson, D. et al., 1979, Int Pept Prot Res 4:177-185(--CH₂NH--,CH₂CH₂--); Spatola et al., 1986, Life Sci 38:1243-1249(--CH₂--S);Hnn, M.M., Jchem Soc Perkin Trans I (1982)307-314(--CH-CH--,シス及びトランス); Almquist, R. G. et al., J Med Chem (1980)23:1392-1398(--OCH₂--); Jennings- White et al., Tetrahedron Lett(1982) 23:2533(--OCH₂--);Szelke et al., European App. EP 45665(1982) CA: 9739405 (1982)(--CH(OH)CH₂--); Holladay, M. W. et al., Tetrahedran Lett (1983) 24:4402-4404(--C(OH)CH₂--); and Hruby, V. J., Life Sci (1982) 31:189-199(--CH₂--S--)を参照のこと。こういったペプチドミメティクスは、ポリペプチドの態様に対し有意な利点を持ちうる。例えば、より経済的な製品、優れた化学的安定性、高められた薬理学的性質(半減期、吸着、作用強度、など)、改変された特異性(例えば、生理活性の広い範囲)、減少された抗原性、及びその他を含む。ペプチドミメティクス化合物は、アミノ酸の生物学的相当物、例えば、アミノ酸のスルホン酸及びホウ酸アナログを含みうる。

[0067] 本明細書で使われるとき、「正常化する」という用語は、骨格筋における脂質含量の脈絡で使われるとき、異常に高いレベルの筋肉中性脂肪を有する個人、例えば筋肉中性脂肪の減少から利益を得うる個人の筋肉において脂質含量を減少することを指す。

[0068] 本明細書で使われるとき、「最小限の」という用語は、動物、組織又は細胞の代謝反応(例えば、血液グルコース又は乳酸レベルの増加)に関する化合物の効果についていうとき、高親和性受容体を刺激することによる脂肪分解の増加を仲介するが、アミリン代謝受容体の刺激による代謝反応を有意に増加させない化合物の効果を指す。例えば、ある態様では、「血管拡張を最小限に刺激する」「副作用を最小限に刺激する」「又は血液乳酸を最小限に増加させる」及び似た記述は、薬剤又は薬剤の量であって、それらによる以下の割合：[脂肪分解の増加]/[血液グルコースの増加/血液乳酸の上昇/血管拡張の増加/副作用の増加、など]が、代謝性アミリン受容体が飽和する量のCGRP-1(例えば、200nM)による刺激が原因となる割合より高くなる、薬剤又は薬剤の量のことを指す。通常、その割合は、少なくても約2倍高く、少なくても約4倍高いことも多く、時には少なくても約10倍高い)。薬剤又は投与量であって、それによる有意な血管拡張の増加及び/又は血中乳酸の上昇、並びに/或いは別の副作用が検出されない(つまり、分母がゼロに近いところにおいて)薬剤又は投与量は、これらの用語により強調される。

詳細な説明
緒言
[0069] カルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)は、37のアミノ酸で、ペプチドホルモンであるカルシトニンのメンバーである。CGRPは、遠心性神経に存在し、アセチルコリンを含むニューロンが骨格筋の運動終板を支配しており、そこにおいて、CGRPは神経刺激の後にシナプス間隙に放出される。CGRPはヒトでは、CGRP-1及びCGRP-2と呼ばれる少なくとも2つの主な形態で見つかっている。(表1)

[0070] CGRPは、アミリンタンパク質に対しおおよそ50％の配列相同性を有し(Cooper et al., 1987, Proc Natl Acad Sci USA 84:8628-32; Cooper et al., 1994, Endocr Rev. 15:163-201)、かつ2つのタンパク質は重複しているが、異なった生理活性のセットを有する。(例えば、Muff et al., 1995, Eur. J. Endocrinol. 133:17-20参照のこと)。その活性の中で、CGRPは、血管拡張並びに正の変時性及び変力性の効果を含む、重要な心血性の効果を有する(Nuki et al., 1993, Biochem biophys Res Commun 196:245-51; Muff et al., supra; Cooper et al., 1994, Endocr Rev. 15:163-201; Gardiner, 1991, Diabetes 40:948-951; and Takenaga, 1999, Euro. J. Pharma. 367:239-245)。付け加えると、高い濃度で投与されたとき、CGRPは、インシュリン抵抗性を導くと報告される(例えば、Leighton and Cooper, 1988, Nature 335:632-35参照のこと)。インシュリン抵抗性は、CGRPの放出又は活性を防ぐことによって治療することができると提案されてきた。(例えば、米国特許6,004,961号；米国特許5,641,744参照のこと)。ラットでは、上昇した血漿アミリン及びCGRPレベルは、インシュリン抵抗性と関連し、かつヒトでは、肥満及び2型糖尿病と関連する。筋肉中では、アミリン及びCGRPは、グリコーゲン合成を阻害することによってグルコースの取り込みを阻害し、及び非競合的に、機能的アンタゴニストとしてインシュリンの作用に対抗し、グリコーゲン分解を促進すると報告されてきた。グリコーゲン分解由来の上昇された循環性乳酸は、肝臓の糖新生の基質として役に立ち、過剰な肝臓グルコース生産をもたらす。

[0071] 本発明は、部分的に、CGRP1が骨格筋及び肝臓において脂肪分解を刺激し(つまり、トリアシル・グリセロール[中性脂肪]の分解をもたらす)、及びラットCGRP-2が筋肉において脂肪分解を刺激することを示されたという発見に関する。この分解は、遊離脂肪酸の増加として検出されうる。下記の例により示されるように、骨格筋が様々な量のラットCGRP-1にさらされる用量‐応答アッセイは、ピコモル濃度のCGRP-1において観察される最初の段階と、ナノモルの濃度のCGRP-1又は-2で観察される2番目の段階を伴う2相性の筋肉遊離脂肪酸の増加を示す。特定のメカニズムによる結合が意図されることなく、データは、筋肉の脂質においてCGRP-1の強力な脂肪分解効果が高親和性CGRP受容体を通して行われる(EC₅₀は約2.6×10^-13Ｍ[例えば、10^-11Ｍから10^-13Ｍの範囲])ということを指す。このように、高親和性受容体を発現する細胞は、ピコモルの濃度のCGRP1に応答させることを特徴とする。この濃度は、単離された筋肉標本においてインシュリン抵抗性及びグリコーゲンの合成阻害を誘発する濃度よりずっと低い(Leighton et al., 1988, Nature 335:632-635; Leighton et al., 1989, FEBS Lett 249:357-361)。脂肪分解の2つ目の段階は、より高い濃度のCGRP-1又はCGRP-2(EC₅₀は約4.5×10^-8Ｍ[例えば、10^-9Ｍから10^-8Ｍ])で生じ、及び代謝性アミリン受容体、つまり骨格筋においてCGRP及びアミリンの両者によるシグナルを伝達しうる単一の受容体によって仲介され、そこでは、代謝性アミリン受容体は、それぞれのペプチドに対する受容体として働きうる(つまり、CGRP/アミリン受容体)。

[0072] 本明細書中後半でより詳しく記述されるように、高親和性CGRP受容体のアゴニストは、骨格筋において脂肪分解を用量-依存的に刺激することにより特徴付けられ、そこでは、刺激は、CGRP-1がピコモルのEC₅₀で相互作用する受容体によって仲介される。代謝性アミリン受容体のアゴニストは、骨格筋において受容体により仲介される脂肪分解を刺激することにより特徴付けられ、その受容体を通し、CGRP-1又は-2は、アミリンが脂肪分解の効果を誘発するナノモルのEC₅₀において相互作用する。

[0073] 代謝性アミリン受容体の性質を有する受容体は、L6筋原細胞又はCOS-7細胞に対し、カルシトニン受容体(インサートネガティブ形態)[C1_ins-]をramp1とコトランスフェクションすることにより構成される。この受容体は、CGRP、アミリン、及びsCTの強い比結合性を有し、並びにCGRP及びアミリンの両者によってシグナル伝達がされる。Galeazza et al., 1991, Peptides 12:585-91は、ラット骨格筋膜標本において、おおよそ37pM及び6nMのK_d値を伴う2つのCGRP-1結合サイトが記述した。Galeazza et al.はまた、ラット肝臓膜において、おおよそ44pMと27nMのK_d値を伴う、CGRPに対する2つの特定な結合サイトを記述した。放射線標識されたCGRP-1の、肝臓非実質性細胞(例えば、内皮性、脂肪、及び平滑筋細胞の膜分画結合)に対し結合するが、実質的な肝臓細胞には結合しないことは、Stephens et al., 1991, Diabetes, 40:395-400によって報告された。Poyner et al., 2002, Pharmacol. Rev. 54:233-46も参照のこと。

[0074] 脂肪分解が高親和性CGRP受容体を通して仲介されうるという発見、及び本発明中で詳細に書かれる別の発見は、脂肪分解を刺激し、かつ細胞及び組織内の脂質の蓄積を減らすための新しい方法及び試薬を提供する。特に、発明は、骨格筋及び肝臓内における脂質の減少させるための、及び細胞及び組織における脂質の蓄積を特徴とする疾患の治療のための方法及び試薬を提供する。骨格筋における脂質の蓄積は、インシュリン抵抗性の発達の根底にある主要な代謝異常である。例えば、肥満に関連するインシュリン抵抗性では、骨格筋の代謝能力は、酸化よりは脂質のエステル化を行うようであり、食事により導かれる体重減少は、この性質を直すことはできない(Simoneau et al., 1999, FASEB J. 13:2051-60)。筋肉脂肪の正常化は、インシュリンの反応性の増加を伴うという証拠もまたある。(例えば、McGarry et al., 1992, Science 258:766-70; Ellis et al., 2000, Am J Physiol Endocrinol Metab. 279: E554-60; Oakes et al., 1997, Dibates 46:1768-74; Furler et al., 1997, Metabolism 46:1101-6: Kraegen et al., 1991, Diabetes 40:1397-403; Dobbins et al., 2001, Diabetes 50:123-30: Unger et al., 2000, Int J Obes Relat Metab Disord. 24 Suppl 4:S28-32: Manco et al., 2000, Metabolism 49:220-4; Kelley et al.,1999,Physiol(6Pt1):E1130-41)参照のこと。

[0075] 骨格筋における脂質の蓄積を特徴とする疾患及び病気は、インシュリン抵抗性及び関連する症状、例えば、X症候群(例えば2型糖尿病、高血圧、肥満、異脂肪血症、アテローム性動脈硬化症、及び血栓症)及び多嚢胞性卵巣症候群(PCOS)を含む。肝臓において脂質の蓄積を特徴とする疾患及び病気は脂肪肝(肝臓脂肪変性)を含む。肝臓脂肪変性は、溶剤傷害(例えば、四塩化炭素による)又は慢性的過度のアルコール消費を有する患者に、肥満患者に、並びに薬、例えばグルココルチコイド及び合成エストロゲンの投与の結果として、生じる。ある側面では、本発明は、これらの及び別の病気の治療のための方法及び試薬を提供する。

[0076] 本発明は、筋肉及び別の組織において脂肪分解を刺激するために有用な医薬組成物の同定及び開発のための方法を提供する。

[0077] さらに、マウスにおけるCGRP-1遺伝子のノックアウトは、心血管性の制御に影響を与えないことが観察されてきた。(Lu et al., 1999, Mol. Cell. Neuroscience 14:99-120)。このように、ある側面では、本発明は、高いCGRPの投与量の投与に通常付随する有害な副作用を最小限にし又は避ける範囲において、CGRP-1によって通常結合される高親和性CGRP受容体のアゴニストを用いて、インシュリン抵抗性を治療するための方法を提供する。循環する乳酸(例えば、グリコーゲン分解由来である)及び上昇された血液グルコース(例えば、乳酸刺激された肝臓のグルコース産出由来である)の増加を最小限にする範囲において、脂肪分解の有益な効果が達成されうるということが信じられる。

B. 組織脂質含量の減少、及び脂質レベル(骨格筋及び/又は肝臓)の減少からの利益を受ける患者の治療
[0078] ある側面では、本発明は、組織又は細胞を高親和性CGRP受容体又は代謝性アミリン受容体のアゴニストと接触させることによって、組織又は細胞(例えば、骨格筋又は肝臓)において脂質含量を減少させる方法を提供する。ある好ましい側面では、本発明は、組織又は細胞を高親和性CGRP受容体のアゴニストと接触させることにより、骨格筋又は肝臓の組織或いは骨格筋又は肝臓の細胞における脂質含量を減じる方法を提供する。上で記したように、そういった減少は、様々な有益な効果を付随する。ある態様では、組織又は細胞は、動物、典型的には哺乳動物に対してアゴニストを投与することにより、アゴニストと接触される。

[0079] 本発明は、高親和性CGRP受容体のアゴニストを投与することにより、インシュリン抵抗性及び「X症候群」複合体(例えば2型糖尿病、高血圧、肥満、異脂肪血症、アテローム性動脈硬化症、血栓症)、多嚢胞性卵巣症候群、及び肝臓脂肪変性を特に含む、筋肉脂肪の増加に関連する病気の病徴を直し、又は病気の発展見込みを減少させるために、脂質含量(例えば、骨格筋又は肝臓の)の減少を必要とする哺乳動物を治療するための方法を提供する。ある態様では、アゴニストはヒトCGRPであり、例えば、ヒトCGRP-1である。ある態様では、高親和性CGRP受容体のアゴニストは、代謝性アミン受容体を実質的に刺激しない。発明のこの及び別の方法の態様では、哺乳動物は、ヒト、霊長類、非ヒト霊長類、又は非ヒト動物でありうる。

[0080] 関連する側面では、発明は、(1)筋肉の脂肪と関連する病気(例えば、インシュリン抵抗性、2型糖尿病、高血圧、肥満、異脂肪血症、アテローム性動脈硬化症、血栓症、多嚢胞性卵巣症候群、又は肝臓脂肪変性)を有する動物を同定し、(2)高親和性CGRP受容体のアゴニストを投与し、(3)動物における脂肪分解をモニタリングすることによって、筋肉の脂肪増加と関連する病気の病徴を回復させ、又は病気の発達の見込みを減少させるために、脂肪含量(例えば骨格筋の又は肝臓の脂質含量)を減らす必要のある動物、例えばヒトを治療する方法を提供する。ある態様では、病気はインシュリン抵抗性である。ある態様では、病気は、2型糖尿病である。ある態様では、哺乳動物はインシュリン抵抗性であるが、2型糖尿病を持っていない。ある態様では、哺乳動物は、インシュリンで治療されていない。動物が前記の病気を患っていると同定することは、当該技術分野に既知の診断法(本明細書中で下に記した方法を含む)を使うことにより、容易に達成されるが、未来において既知の又は発達したいずれかの同定方法(例えば、遺伝子発現プロファイリング)を用いることで達成されうる。高親和性CGRP受容体の具体例としてのアゴニストは、ヒトCGRP-1及びヒトCGRP-1の生物学的に機能性のバリアントである。ある態様では、アゴニストの投与は、代謝性アミリン受容体を実質的に刺激しない。

[0081] ある側面では、本発明は、高親和性CGRP受容体のアゴニストの使用法を、そういった減少の利益を受けようとする患者において脂質のレベルを減らすための製品又は製剤に与える。ある側面では、発明は、X症候群、インシュリン抵抗性、2型糖尿病、高血圧、肥満、異脂肪血症、アテローム性動脈硬化症、及び血栓症を有する患者の治療のための薬物の製品又は製剤に高親和性CGRP受容体のアゴニストの使用方法を与える。

[0082] 関連する側面では、本発明は、本明細書中で記述された高親和性受容体のアゴニストを含む単位用量形態の医薬組成物を提供する。例えば、ある態様では、単位投与量は、哺乳動物、例えばヒトに投与されたとき、血中又は血漿中のアゴニストのレベルであって、活性のある薬剤の代謝性アミリン受容体に対するEC₅₀より下であるレベルをもたらす。通常、その薬剤のアゴニストの血中又は血漿中レベルは、約10^-15Mと約10^-10Mとの間で存在する。CGRP-1にとって、血漿レベルは300pMより下でありうる(下記の例参照のこと)

[0083] 適切な受容体(例えば、高親和性CGRP受容体)のアゴニストは、下記で詳細に議論されるように、様々な薬剤のいずれかであり、天然のCGRPポリペプチド(例えば、ヒトCGRP-1ポリペプチド)、CGRPポリペプチドのバリアント(例えば、生物学的に機能性のバリアント)、又は、非ポリペプチド薬剤を含む。

[0084] 患者に対するCGRP受容体アゴニストの投与(つまり、in vivoにおける接触)又は、ex vivoで組織又は細胞をアゴニストと接触させることは、脂質の含量における検出できる減少及び遊離脂肪酸における同時の増加をもたらす。細胞、例えば骨格筋細胞において脂肪分解を刺激された結果として脂質含量は減らされるということが信じられる。例えば、下記の例17参照のこと。しかしながら、出願人は、特別なメカニズムによって縛られる意図はない。このように「脂肪分解の刺激」という語句が、本明細書中で便宜のため時々使われる範囲では、減少及び増加のメカニズムを考慮することなく、組織において脂質レベルの減少及び遊離脂肪酸の増加を強調することが意図される。CGRP-受容体のアゴニストによる脂肪分解の刺激は、組織(例えば、骨格筋又は肝臓、或いは血液又は血漿)における遊離脂肪酸の量又は成分についての変化として検出されうる。通常、脂肪分解の刺激のレベルは、組織又は血液の遊離脂肪酸のレベルの基底(アゴニストがない状態でのレベル)に対し、少なくとも約2倍、しばしば少なくとも約4倍、時々少なくとも約6倍又はそれを超える上昇である。遊離脂肪酸レベルの変化を検出する方法は既知である。例えば、以下の例2に記述したように、筋肉組織(例えば、生検又は組織培養によって得た)のガスクロマトグラフィー分析が行われうる。別の手法は、構造又は代謝研究で特定の脂肪酸を調製用のスケールで分離するためのHPLC手法を含む。この技術は、揮発性の組成物、例えば短鎖脂肪酸、放射性同位体でラベルされた脂肪酸構成成分の研究、又は位置的及び構造的アイソフォームの分離に有効である。誘導体化された脂肪酸は、通常、UV分光法を用いて又は蛍光定量法によってモニターされる(Rao et al.,1995, F Chromatogr Sci 33:9-21)。非エステル化遊離脂肪酸の血漿濃度は、アシルCoA酸化酵素に基づいた比色定量法によって決定されうる(Wako Pure Chenmical Industries, Osaka, Japan)。血漿中性脂肪は、比色定量法を用いて計測されうる(Triglycerid Procedure 336, Sigma Diagnostics)。組織の長鎖CoAは、組織からの長鎖CoAの溶剤抽出、相分離、及び逆相高速液体クロマトグラフィーによる精製によって計測されうる。

[0085] ある側面では、本発明は、そういった減少から利益を得る患者において脂質レベルの減少のための薬物の製品又は製剤に、高親和性CGRP受容体アゴニストの使用方法を与える。ある側面では、本発明は、X症候群、インシュリン抵抗性、2型糖尿病、高血圧、肥満、アテローム性動脈硬化症、血栓症を有する患者の治療のための薬物の製品又は製剤に高親和性CGRP受容体のアゴニストの使用方法を与える。

[0086] 高親和性受容体に作用する薬剤は、特に興味があるが、異なる側面では、発明は、脂質含量の減少を必要とする哺乳動物を治療する方法であって、代謝性アミリン受容体のアゴニストであるが、高親和性受容体のアゴニストではない薬剤を、哺乳動物における脂肪分解を刺激するために、投与することを含む方法、並びにそういった代謝性受容体のアゴニスト及び結果を達成するためのアゴニストを含む医薬組成物を投与することによって、脂肪分解減少のための治療を必要とする哺乳動物を治療する方法を提供する。ある態様では、アゴニストはラットCGRP-2である。ある態様では、アゴニストは、受容体を刺激するCGRPのバリアントである。ある態様では、アゴニストはアミリンではない。ある代替の態様では、アゴニストはアミリンである。そういったアゴニストを投与する方法及び仕方は、本明細書中に記述される高親和性受容体のアゴニストに対する投与方法であって、投与量などに変化を加えた投与方法に類似であり、技術のある読者にとって明らかであろう。
C.高親和性CGRP受容体のアゴニスト

[0087] 本発明の実施において使われる高親和性CGRP受容体のアゴニストは、ペプチド、ペプチドミメティクス、及び非ペプチド化合物を含む様々なタイプの化合物を含む。適切なアゴニストは、下で記述され、及び/又は本明細書中で記述される方法を用いて(及び/又は本開示によってガイドされた通常の技術の人にとって明らかであろう方法によって)同定されうる。高親和性CGRP受容体のアゴニストは、骨格筋における脂肪分解を刺激する。好ましいアゴニスト及び/又は投与量は、代謝性アミリン受容体に比較して優先的な高親和性CGRP受容体の刺激をもたらす。

優先的な刺激
[0088] 本明細書中で記されるように、ある組織(例えば、骨格筋)は、高親和性受容体及び代謝性アミリン受容体の両者を発現し、かつある化合物、例えばラットCGRP-1は、高親和性CGRP受容体及び代謝性アミリン受容体のアゴニストである。上で記すように、脂肪分解は両方の受容体により仲介されうる。しかしながら、本明細書中で開示されるように、高親和性を優先して刺激するのはしばしば望ましい。「優先的な刺激」は用語の通常の意味を持ち、様々な方法で記述(検出)されうる。「優先的な刺激」は、高親和性受容体のアゴニストが、高親和性受容体のEC₅₀であって、代謝性受容体のEC₅₀より低いEC₅₀を有するとき、かつアゴニストの投与量又は濃度が代謝性アミリン受容体のEC₅₀より低いが、高親和性受容体のEC₅₀より高いときに起こる。ある態様では、「優先的な刺激」は、高親和性受容体アゴニストが、代謝性アミリン受容体の検出できる刺激を全く起こさないとき (例えば、いずれの投与量、又は代わりに、10μM未満のいずれの投与量、又は10mM未満のいずれの投与量で) 達成される。

[0089] このように本発明のある態様では、高親和性CGRP受容体のアゴニストは、代謝性アミリン受容体に比較して高親和性CGRP受容体の優先的な刺激をもたらす量が投与される。そういった優先的な刺激は、例えばアゴニストの投与量又は製剤形態を調節することによって、或いはアゴニストの性質によって達成されうる。

[0090] ある態様では、代謝性アミリン受容体に比較して高親和性CGRP受容体の優先的な刺激は、高親和性受容体の優先的な刺激をもたらすアゴニストに細胞を接触することによって達成される。ある態様では、薬剤は高親和性CGRP受容体のアゴニストであるが、代謝性アミリン受容体に実質的に作用しない。ある態様では、薬剤は、代謝性アミリン受容体を通した脂肪分解刺激に影響を及ぼすことに関する薬剤のEC₅₀であって、高親和性CGRP受容体をとおして脂肪分解刺激を行う薬剤のEC₅₀より有意に大きいEC₅₀を有する。ある態様では、骨格筋を薬剤に接触させることは、代謝性アミリン受容体の脂肪分解刺激効果によるより多い高親和性受容体の脂肪分解刺激効果によるFFA(例えば、組織又は血漿中のFFAの出現を計測したとき)の産出をもたらす。薬剤の効果が高親和性CGRP受容体の刺激の結果であるかを決定する方法は、薬剤の効果を代謝性受容体をとおして作用することが知られている(CGRPと似た用量反応曲線を有する)アミリンの効果と比較することによって評価されるだろう。

[0091] ある態様では、代謝性アミリン受容体を通した脂肪分解刺激に影響するEC₅₀であって、高親和性CGRP受容体をとおした脂肪分解刺激に影響を及ぼすことに関する薬剤のEC₅₀より実質的に大きいEC₅₀を有する薬剤は、代謝性アミリン受容体に対するより少なくても10倍少ないしばしば少なくとも約100倍少ない又は、少なくとも約500倍少ない、少なくても約1000倍少ない、少なくても約5000倍少ない又は少なくても約10,000倍少ない高親和性CGRP受容体に対するEC₅₀有する。しかしながら、最も多くの場合では、高親和性受容体に対するEC₅₀は少なくても約10⁵倍、10⁶倍、10⁷倍、又は10⁸倍少ない。低親和性受容体(“EC_{50-アミリン-R}”)に対するのEC₅₀の高親和性受容体(“EC_50-CGRP-R”)のEC₅₀に対する割合は、つまりEC_{50-アミリン-R}/EC_50-CGRP-R割合として記述されるとき、高親和性受容体をとおした刺激に対するかなり高いEC₅₀を有する薬剤の割合は、通常少なくても約10、しばしば少なくとも約10²を超え、5×10²を超え、約10³を超え、5×10³を超え、約10⁴を超え、約10⁵を超え、約10⁶を超え、約10⁷を超え、又は約10⁸を超える。

[0092] いくつかの態様では、高親和性CGRP受容体のアゴニストは、投与され並びに細胞又は組織と接触されたとき、代謝性アミリン受容体に対する有意な又は検出できる刺激性活性を全く持たない。代謝性アミリン受容体の有意な刺激性活性の計測は、生理食塩水又は別の非活性組成物を注入されたコントロール動物と比較して、アゴニストを動物(例えばラット)に注入によって起こる血液乳酸及び血液グルコース有意な増加である。有意差は、ルーチン方法、例えば計測に固有の平均値及び標準誤差によって決定される。コントロールと作用させたものの平均値との間の有意差は、基本的な分析法、例えばスチューデントのｔ検定を用いて統計的に検定された。通常、アッセイは、1より大きい、例えばより高い統計的検出力のためには少なくても7のnを用いて検定されうる。増加した乳酸産生物のアッセイ及び骨格筋中において代謝性アミリン受容体を通してなされるインシュリン刺激性グルコース取り込みの拮抗作用のアッセイは、既知である(例えば、Cooper, 1994, Endocr Rev. 15:163-201: Young et al., 1993, FEBS Lett. 344(3)317-321; and Young et al.,"Amylin Activity Assays"U.S. Patent 6,048,514)。

[0093] 別のアッセイは、人細胞又は組織、別の哺乳動物(例えばマウス又はラット)由来の細胞又は組織、細胞系列、及び組換えされた細胞をもちいて行われうる。アッセイは、細胞に基づくアッセイ；(例えば、単離されたラットヒラメ筋における)ex vivoアッセイ、及び動物そのものの研究を含む。例えば、細胞に基づいたアッセイは、以下の例で記述される細胞に基づく組換え受容体を用いて行われうる。

[0094] あるアッセイでは、単離されたラットのヒラメ筋が使われる。ラットのヒラメ筋は、高親和性CGRP受容体及び代謝性アミリン受容体の両者を含み、そして単離されたラットヒラメ筋は、異なる受容体に関する異なる効果を区別するのに特に有効である。ヒラメ筋は、高脂肪食又は通常食を与えられてきた動物由来であり、及び用意された化合物に対する用量作用曲線は作られ、そこでは、(ｉ)アッセイは、高親和性CGRP受容体及び代謝性アミリン受容体の両者をとおして生じうる過程を反映し(例えば、筋肉の遊離脂肪酸及び中性脂肪含量の計測)、及び(ｉｉ)アッセイは、代謝性アミリン受容体を通して生じる過程を反映する(例えば、最大限に刺激するインシュリンの存在下で筋肉グリコーゲン含量、及び[¹⁴C]-グルコースのグリコーゲンへの取り込みを計測すること)。アミリン及びCGRPの両者がグリコーゲン代謝に関する似たような効果、特にインシュリンに刺激されるグリコーゲンへのグルコース取り込みの非競合的拮抗作用、を有することは以前に示されてきた(具体例としてのアッセイでは、例えばMuff et al., supra;Cooper et al., 1994, Endocr Rev. 15:163-201; Gardiner, 1991, Diabetes 40:948-951; Takenaga, 1999, Euro.J.Pharma.367:239-245, Leighton et al., 1998, Nature 335:632-5; Cooper et al., 1988, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A 85:7763-6)。高親和性CGRP受容体の刺激を指す効果を誘発するが、代謝性アミリン受容体に特異的な刺激を指す効果を誘発しない薬剤、投与量、又は製剤形態は、代謝性アミリン受容体に実質的に作用しない高親和性CGRP受容体の考えられたアゴニストである。ある態様では、高親和性及び代謝性の受容体に対する効果は、高親和性及び/又は代謝性受容体の選択的アンタゴニストによって区別されうる。(例えば、アゴニストにさらされていない)コントロールの組織、細胞、又は動物と比較して、代謝性アミリン受容体の活性の有意な変化(例えば受容体に仲介される脂肪分解の増加)が起こさない薬剤又は治療は、代謝性アミリン受容体の活性を実質的に刺激しないと考えられる。高親和性受容体の優先的な刺激を決定するためのさらなるアッセイは、本明細書中で提供される(例えば、例を参照のこと)。

[0095] 上記の様に、発明のある態様では、高親和性受容体のアゴニストは、低親和性骨格筋代謝性アミリン受容体を実質的に刺激することなく、宿主において骨格筋の高親和性CGRP受容体を刺激するのに十分な投与量で、動物に投与される(又は単離された組織と接触される)。このように高濃度において高親和性受容体及び代謝性アミリン受容体の両者を刺激する薬剤の効果は、投与される量を調節する(例えば、計測された量の活性のある化合物が放出され、及び受容体との相互作用を可能にするように製剤形態を調節する)ことによって、代謝性アミリン受容体のいずれの刺激に関し最大限にするために調節されうる。本明細書中で使われるとき、「投与量」は、ex vivoにおいて組織を薬剤と接触させることを含むように意図される。

[0096] 高親和性受容体のアゴニストを動物(例えばヒト)に投与するための好ましい投与量の範囲は、骨格筋又は肝臓の脂質において、少なくても約15％、好ましくは少なくとも約25％、より好ましくは少なくとも約30％、さらに好ましくは少なくとも約50％、又はさらに好ましくは、例えば約75％(例えば、遊離脂肪酸又は中性脂肪の変化を計測したとき)の減少がもたらされる最小限の濃度である。

[0097] 高親和性受容体のアゴニストを動物(例えばヒト)に対し投与するための別の好ましい投与量の範囲は、哺乳動物の骨格筋において血管拡張を刺激することなく、又は最小限に刺激し、脂肪分解を刺激することをもたらす量である。この量は、いくつかの方法によって、例えば、(i)CGRP受容体アゴニスト製剤の複数の異なった投与量を実験哺乳動物に投与すること(例えば、I.V.、I.P.、経口、又は別の経路により)により、用量‐応答アッセイを行うこと；(ii)実験哺乳動物の筋肉における脂肪分解に関する各投与量の効果を計ること、及び実験哺乳動物における血管拡張に関する各投与量の効果を計ること、それにより、脂肪分解及び血管拡張に対する用量‐応答データを作成すること；(iii)用量‐応答データから、CGRP受容体アゴニスト製剤の投与量であって、哺乳動物において脂肪分解を促進するが実質的に血管拡張を増加させないか、又は血管拡張を最小限に増加させる投与量を決定することによって決定されうる。血管拡張は、様々なアッセイのいずれかを使って計測くされうる。(例えば、Nuki et al., 1993, Biochem Biophys Res Commun 196:245-51参照のこと)。ヒトにおいては、血管拡張は、収縮期血圧及び動脈圧の平均値を計測することでモニターされうる。

[0098] 哺乳動物(例えば、ヒト)に対し、高親和性受容体のアゴニストを投与するための別の好ましい投与量範囲は、血中グルコース及び/又は乳酸のレベルの増加を刺激することなく、又は最小限に刺激するのみで、骨格筋において脂肪分解を刺激することをもたらす量である。この量は、いくつかの方法によって、例えば、(i)CGRP受容体アゴニスト製剤を実験動物に複数の異なる濃度で投与すること(例えば、I.V.、I.P.,経口、又は別の経路によって)によって用量‐応答アッセイを行うこと；(ii)実験動物における筋肉における脂肪分解に関する各投与量の効果を計測し、かつ実験動物におけるグルコース及び/又は乳酸のレベルに関する各投与量の効果計測することによって、脂肪分解及びグルコース/乳酸レベルの用量‐応答データを作ること；(iii)用量‐応答データから、CGRP受容体アゴニスト製剤の投与量であって、脂肪分解を増加させるが、動物においてグルコース及び/又は乳酸レベルを増加させないか又は最小限のみ増加させる投与量を決定することによって決定されうる。血液グルコース及び乳酸は、ルーチンな方法、例えば固定化された酵素化学、例えば基本的グルコース分析装置(グルコース酸化酵素、L-乳酸酸化酵素、分析器モデル2300-STAT、Yellow Springs Instruments, Yellow Springs, Ohio)を通して計測されうる。簡潔に説明すると、基質は酵素層に入ると酸化され、過酸化水素を産生し、それはセルロースアセテートをを通過して白金電極に到達し、そこで過酸化水素は酸化される。結果の電流は、基質の濃度に比例的である。例えば、Ye et al., 2001, Diabetes, 50:411-417; Ellis et al., 2000, Am. J. Phys. 279:E554-E560を参照のこと。

[0099] 天然のCGRP-1ポリペプチド(例えば、ヒトCGRP-1)の場合では、高親和性CGRP受容体に対するEC₅₀の範囲内であるが、代謝性アミリン受容体に対するEC₅₀より低いCGRP-1の血漿又は血清濃度をもたらす医薬組成物は特に有用である。CGRP-1及び生理能を持つバリアントにとっては、具体例としての投与量は、約10^-15Mと約10^-10Mとの間、約10^-15Mと約10^-11Mとの間、又は約10^-15Mと約10^-12Mとの間の血漿又は血清レベルをもたらす。有用な血漿又は血清レベルは、通常＜10^-10Mである。こういった範囲は具体例であり、非限定的であることは理解されるだろう。化合物(非ペプチド化合物を含む)の血漿及び血清レベルは、ルーチンな手法、(例えば、ELISA、RIA、分光法、酵素アッセイ、又は他の手法)によって計測されうる。

[00100] 本明細書中での指示によってガイドされる様々な方法は、化合物、組成物、投与量、及び製剤形態であって、代謝性アミリン受容体に比較して、優先的に高親和性CGRP受容体に作用し、又は高親和性CGRP受容体を刺激する化合物、組成物、投与量及び製剤形態を同定するために使われうる。こういった方法が、インシュリン抵抗性及び別の病気を治療するために有用である薬剤をスクリーニングするために使われうる事は明らかであろう。

[0100] 組換え受容体を用いた競合性結合アッセイは、化合物と代謝性アミリン受容体との固有結合親和性(例えばK_i値)に関する情報を与え、及び、興味のある化合物が受容体に仲介されるメカニズムを通して作用するかどうかを決定する。例えば、興味のある化合物が、代謝性アミリン受容体においてアミリン又はCGRPによる2番目のメッセンジャー産物を阻害することができるなら、それは、その化合物がアンタゴニストであるということを示している。もし、化合物自身が、アミリン又はCGRPがない状態で2番目のメッセンジャー反応を起こしうるなら、それは、取り上げている化合物はアゴニストであることを示す。化合物の比較有効性に関する情報は、例えばEC₅₀パラメーターによって計測されるとき、受容体を飽和するために十分な化合物濃度における2番目のメッセンジャー(例えばcAMP)応答から求められる。適切な濃度は、化合物の固有結合親和性に基づいて決定されうる。
具体例のアゴニスト

[0101] ポリペプチド及びペプチドミメティクス、並びに非ペプチド化合物、例えば小さい有機分子(例えば、分子量＜1000)を含む様々な化合物が、高親和性CGRP受容体に作用しうる。

[0102] ある態様では、高親和性CGRP受容体アゴニストはポリペプチドである。ある態様では、ポリペプチドは、天然のCGRP-1ポリペプチド(例えばヒト1ポリペプチド又はラット、ブタ、ウシ、ウサギ、トリ、サケ、又はその他の種由来のホモログ；Cooper et al., 1994, Encocr Rev. 15:163-201参照のこと)と類似の有意な配列に同一な又は有意な配列を有する配列を持つ。この脈絡では、特定化されたポリペプチドが、最適整合に配列比較したとき少なくても約75％、ときには少なくても約80％及び、ときには少なくても約90％の天然CGRP-1ポリペプチド(例えばヒト)の残基に一致するアミノ酸配列を含むとき、特定化されたポリペプチドは、天然のCGRP-1ポリペプチドと類似な有意の配列を有する。ある態様では、受容体アゴニストの配列は、CGRP-１(例えばヒトCGRP-１)と、保存的な置換の点だけ異なる。

[0103] 関連する態様では、高親和性CGRP受容体アゴニストは、CGRP-1ポリペプチドの生物学的に機能性のバリアント、例えば、ポリペプチド又はペプチドアナログ(例えばペプチドミメティクス)である。CGRP-1の生物学的に機能性のバリアント(実質的な配列の同一性及び保存的に置換されたバリアントを有するポリペプチドを含む)は、以下の性質を特徴とする。(i)CGRP-1の生物学的に機能性のバリアントは骨格筋において脂肪分解を刺激し、(ii)CGRP-1の生物学的に機能性のバリアントは、代謝性アミリン受容体を通して脂肪分解刺激を行うEC₅₀であって、高親和性CGRP受容体を通して脂肪分解の刺激を行うEC₅₀より実質的に大きいEC₅₀を持ち(つまり、CGRP-1の生物学的に機能性のバリアントは優先的に高親和性CGRP受容体を刺激する)、及び通常(iii) CGRP-1の生物学的に機能性のバリアントは、最適整合で配列比較したとき、バリアントの長さの範囲で天然のCGRP-1配列、例えばヒトCGRP-1配列の少なくても約60％、ときには少なくても約75％、ときには少なくても約80％、及びときには少なくても約90％の残基に一致するアミノ酸配列を含む(つまり実質的に類似である)。

[0104] 本開示によってガイドされるとき、バリアントはアゴニスト活性を設計され、試験されうる。ムタジェネシスの慣用的な方法(例えば、部位特異的ムタジェネシス、アラニンスキャニング、及び本明細書中で記述される又は当該技術分野に既知の方法を使う分析)は、CGRP-1の生物学的に機能性のバリアントを同定するために使われうる。ある側面では、本発明は、高親和性CGRP受容体の非天然アゴニストであって、(i)天然CGRPポリペプチド(例えばヒトCGRP-1)の配列を獲得すること；(ii)置換又は欠失によって少なくとも1のアミノ酸残基を修飾し、CGRPバリアントを作ること；(iii)高親和性CGRP受容体によって仲介される1以上の活性(例えば、骨格筋における脂肪分解刺激活性)を刺激するバリアントの能力を試験すること；(iv)代謝性アミリン受容体と比較して高親和性CGRP受容体に優先的に作用しうるバリアントを高親和性CGRP受容体の非天然アゴニストであって治療上の組成物を調製するときに有用なアゴニストとして同定することによって治療薬剤の調製において有用であるアゴニストを作る方法を提供する。

[0105] 高親和性CGRP受容体のアゴニストを設計し又は選別するとき、少なくとも天然CGRPのアミの末端における環状構造の部位が、高親和性受容体アゴニストの活性を含む活性に必要とされていそうである (つまり、環状構造を欠如する切断されたCGRPペプチドはあるCGRP活性のアンタゴニストになる)ことは、当業者によって認識されるだろう。²Cys-⁷Cysジスルフィド架橋(これは6アミノ酸を含む「環状構造」を形成する)及びC末端アミドは、全生物的活性に必要とされると報告される(Cooper et al.,1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:7763-66)。このように、ある態様では、高親和性CGRP-1受容体のアゴニストとして作用するCGRP-1の生物学的に機能性のバリアントは、そういったアミノ酸環状構造、又はその同等物(例えば、非ペプチド構造的ホモログ)を含み、及び/又はアミド化される。ある態様では、アゴニストは、CGRPファミリーの報告されたコンセンサス配列の定型を有するポリペプチドである。そのコンセンサス配列はXxx Cys Xxx Thr Ala Thr Cys Val Thr His Arg Leu Ala Xxx Xxx Leu Xxx Arg Ser Gly Gly Xxx Xxx Xxx Xxx Asn Phe Val Pro Thr Xxx Val Gly Xxx Xxx Ala Pheであり、ここでXxxはいずれかのアミノ酸である。Cooper et al., Endocr Rev. 1994 15:163-201参照のこと。

[0106] いくつかの態様では、アゴニストは、CGRPポリペプチドの断片であるか又は断片に一致する(例えば、少なくとも6残基、より頻度が高いのは少なくても約20，25、30又は35残基)。本発明のある態様では、溶剤はキメラCGRPポリペプチドの配列を有し、そこでは、ある種(例えばヒト)からの天然配列中の１以上のアミノ酸が、１以上の異なった種(例えばラット)由来のCGRP-1の対応する配列に見つけられる異なったアミノ酸と置き換えられる。

[0107] CGRPペプチド(例えば、生物学的に機能性のバリアントを含む)は、それらのタンパク質の既知配列を使って、ルーチンな合成又は組換え法により調製されうる。本発明の実行の際に有効な組換え技術及び別の方法は、当該時術分野に既知であり、例えばSambrook and Russel(2001) Molcular Cloning: A Laboratory Manual (3rd Edition) Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel et al., (1987) Current Protocols In Molecular Biology(as supplemented through 2001), John Willey & Sons, New York.に記述される。ポリペプチドの新規の化学合成は、既知であり、かつCGRPポリペプチドを調製するために使われうる(例えば、Caruthers et al., 1980, NuCleic Acids Res. Symp. Ser., 215-223; and Horn et al., 1980, NuCleic Acids Res. Symp. Serl., 225-232)。例えば、ペプチド合成は、自動合成(例えば、パーキンエルマーABI 431A ペプチド合成機を製造者により与えられた指示に従って用いること)を含む様々な固相技術(Roberge, Et al., 1995, Science 269:202)を用いて行われうる。新しく合成されたペプチドは、例えば高速液体クロマトグラフィー(例えば、Creighton,Proteins, Structures And Molecular Principles, WH Freeman and Co, New York NY[1983])により実質的に精製されうる。CGRPポリペプチド又はそのいずれかの部位のアミノ酸配列は、直接合成の間に変えられ、及び/又は化学的方法を用いて別のたんぱく質からの配列(特に、同じ又は別の動物種からのホモログCGRPポリペプチド由来の配列)と混ぜられ、本発明の様々なポリペプチドのバリアントを産生する。代わりとして、CGRPポリペプチドは、天然原料から単離されうる。

[0108] CGRPポリヌクレオチド及びポリペプチドのヌクレオチド及びアミノ酸配列(ゲノム及びcDNA)は既知であり、科学文献及びGenBank(例えば、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Database/index.html)内で、「CGRP」及び「calcitonin gene-related peptide」という検索語を用いて見つけられる。CGRPポリペプチドのGenBank受入番号は表2に与えられる。

[0109] 本発明の方法及び様々な組成物のある態様では、アゴニスト、或いはテスト化合物又は薬剤(例えば選別に使われる)は、CGRP以外の化合物であることは考慮される。例えば、本発明は、薬剤が高親和性CGRP受容体のアゴニストであるかを決定することにより、薬剤が哺乳動物において脂肪分解を刺激するために有用であるかを決定する方法を提供すことが考慮される。本方法の考慮される態様では、薬剤はCGRPではない。

[0110] ある態様では、アゴニストは、CGRP関連ポリペプチド以外である。例えば、アゴニストは、関連のない配列のポリペプチドであるか、又は代わりに、非ポリペプチド分子でありうる。具体例である非ポリペプチドアゴニストは、化合物、例えば炭水化物、例えばオリゴ糖及び多糖類；ポリ核酸；脂質またはリン脂質；脂肪酸；ステロイド；ジペプチド、アミノ酸アナログ、及び有機分子、例えば小分子でありうる。ある態様では、アゴニストはヒトCGRP-1以外であり、哺乳動物のCGRP-１ポリペプチド以外である。

[0111] ある態様では、ポリペプチド又は非ポリペプチドのアゴニストは、合理的なドラッグデザイン法を使って(例えば、標的分子の構造分析、合成化学、及び高度なコンピューターを使ったツール、を含む方法論の統合されたセットを用いることで)調製される。例えば、Kim et al., 2000, Comb Chem High Throughput Screen. 3:167-83 and Colderen, 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:6635-40を参照のこと。

[0112] ある態様では、アゴニストは、本明細書中下記のスクリーニング法に従って同定される化合物である。

[0113] ある側面では、本発明は、アゴニストを上記のとおりに調製し、及びアゴニストを医薬として許容できる賦形剤と混ぜることによって医薬組成物を調整する方法を提供する。ある態様では、医薬組成物は無菌で実質的に等張で及び米国食品医薬品局の全ての品質管理規則(GMP)に遵守した物として剤形される。

[0114] 異なる側面では、本発明は、代謝性アミリン受容体に対するCGRP-1の結合が、脂肪分解を刺激するという発見に基づいて、CGRP-1又はポリペプチドであって、代謝性受容体を刺激するCGRP-1のバリアントであるポリペプチドを用いて、高親和性CGRP受容体、代謝性アミリン受容体、又はその両者のいずれかを刺激することにより、脂肪分解を刺激する方法を提供する。哺乳動物の組織(例えば、哺乳動物の筋肉、肝臓、血液又は別の組織中の遊離脂肪酸量を計測することにより)又は単離された組織において脂肪分解のレベルの変化をモニターする更なるステップがある。代謝性受容体を刺激するCGRP-1のバリアントは、以下の性質：(i)バリアントは、骨格筋において脂肪分解を刺激し、及び(ii)バリアントは、最適整合に配列比較したとき、バリアントの長さを通じて、天然のCGRP-1配列、例えばヒトCGRP-1配列の、少なくても約60％、ときには少なくても約75％、ときには少なくても約80％、及びときには少なくても約90％の残基に一致するアミノ酸配列を含む、を特徴とする。ある側面では、本発明は、骨格筋又は肝臓をCGRP-1又は代謝性受容体を刺激するそのバリアントと接触させることにより、哺乳動物の骨格筋又は肝臓における脂肪分解を刺激する方法を提供する。

[0115] ある側面では、本発明は、(i)CGRP-1ポリペプチド、その生物学的に機能性のバリアント、又は代謝性受容体を刺激するそのバリアントを骨格筋における脂肪の増加を特徴とする病気を患っている、及び病気に感受性の動物に対し投与すること、並びに(ii)哺乳動物において脂肪分解をモニターすることを含む治療計画を提供する。
D.アゴニストの投与及び投与形態

[0116] ある側面では、本発明によると、高親和性CGRP受容体のアゴニスト(例えば、CGRP-1ポリペプチド)の治療有効量は、組織の脂質含量(例えば、骨格筋脂質含量)を減少することから利益を受ける対象(例えば患者又は患畜)に対して投与される。上記の通り、そういった脂質含量の低下は、様々な病気、例えばインシュリン抵抗性、2型糖尿病、高血圧、肥満、異脂肪血症、アテローム性動脈硬化症、血栓症を有する患者にとって有益である。本発明の薬剤を投与するための投与量の範囲は、望ましい効果(例えば、脂質含量の低下、並びに病徴の回復、または病気の進行の回復)を産生するのに十分な量である。

[0117] 関連する側面では、本発明は、患者に対して投与する単位用量形態の高親和性CGRP受容体のアゴニストを提供する。本明細書中で使われるとき、「単位用量形態」は、一回の投与が疾患又は病気を患う対象を治療することを意図される組成物のことをさす。各単位用量形態は典型的に、本発明の活性のある成分と医薬として許容される賦形剤の各々を含む。単位用量形態の例は、個々の錠剤、個々のカプセル、粉末原体、溶液、坐薬、エマルジョン、又は懸濁液である。疾患又は病気の治療は、単位用量形態の周期的な投与、例えば：1日に1単位用量形態を２以上の回数で、1単位用量形態を各食事ごとに、1単位用量形態を四時間ごと又は別のインターバルで、或いは１単位用量形態を1日あたり１回で、を必要とされる。「経口単位用量形態」の発現は、経口で摂取されるようにデザインされた単位用量を指す。注射のための製剤形態は、例えばアンプル又は多用量容器内に、単位用量形態で存在しうる。

[0118] 本発明の単位用量形態は、治療有効量の受容体アゴニストを含む。ある態様では、単位用量形態の投与は、(代謝性アミリン受容体に比較して)高親和性受容体を優先的に刺激するアゴニストの哺乳動物におけるレベルをもたらす。このように、本発明のある態様では、高親和性CGRP受容体のアゴニスト(例えばCGRP-1タンパク質又はその生物学的に機能性のバリアント)は、代謝性アミリン受容体に対する結合を飽和しない(例えば、代謝性アミリン受容体を通して生じる既知の効果、例えば血液又は血漿乳酸及びグルコースレベルの増加をモニターされるような)濃度において投与される。ある態様では投与量は、(あったとしても)血液又は血漿乳酸及びグルコースの最小限の増加又は最小限の血管拡張だけをもたらす。

[0119] 特定の投与量は、特定のアゴニストの分子構造及び化学的性質に依存するが、薬理学の分野における当業者は、適切な投与量はルーチンな技術を用いて、決定されうるということを本明細書中の開示から理解するだろう。例えば、高親和性CGRP受容体のアゴニストの投与量又は製剤形態であって、哺乳動物において望ましくない副作用(例えば、血液グルコース、血液乳酸レベルの増加、又は血管拡張を誘発することなく、又は最小限でのみ誘発し、動物の骨格筋において脂肪分解を刺激する投与量または製剤形態は様々な方法で決定されうる。この脈絡で使われるとき、「増加されたレベル」は、前もって決定されたレベルにまで増加することを指す(つまり、副作用の閾値のレベルを指す)。そういった決定を行う方法は、(i)(a)実験哺乳動物に対し、複数の異なった濃度のCGRP受容体アゴニストを投与すること；及び(b)実験哺乳動物の組織における脂肪分解に関する各投与量又は製剤形態の効果を測定すること及び副作用に関する各投与量の効果を計測すること、それにより脂肪分解と副作用に対する用量‐応答データを作ることによって、用量‐応答アッセイを行うこと；並びに(ii)用量‐応答データから、脂肪分解を刺激するが副作用を誘発しないCGRP受容体アゴニスト製剤の投与量を決定すること、を含む。ある態様では、各投与量または製剤形態の脂肪分解に対する効果は、動物組織における遊離脂肪酸レベルを測定することにより決定される。動物自体の代わりに単離された組織を用いて、類似の方法が行われうる。さらに、本明細書中の指示に基づいて、様々な方法のいづれかを用いて望ましい投与量を決定することは、当業者の能力の範囲内である。

[0120] 通常、非ポリペプチド化合物のアゴニストの濃度は、10^-16Mから10^-5Mまでの濃度内になる(例えば、１以上の筋肉、血液、血清、又は血漿内で計測されるとき)。上で記されたとき、CGRP-1ポリペプチド(例えばヒトCGRP-1)のケースでは、高親和性CGRP受容体のEC₅₀の範囲(10^-11Mから10^-13M)内であるが、代謝性アミリン受容体のEC₅₀の範囲(10^-9Mから10^-8M)より低いCGRP-1の血液又は血漿濃度をもたらす投与量は、特に有用である。CGRP-1及び生物学的に機能性のバリアントにとって、具体例としての投与量は、約10^-15Mと約10^-10Mのあいだの血清又は血漿レベルをもたらす。ある態様では、血清レベルは300pM未満である。

[0121] 薬剤の望ましいレベル又は濃度を達成するために動物に投与される薬剤の量は、開業医に既知の多くの因子、例えば、化合物の半減期(例えば血清の半減期)、並びに投与の頻度及び仕方に依存する。例として、非限定的に、CGRP-1ポリペプチドの投与量は、一日に、20pgから1gの範囲、多くの場合は3ngと50μgの間の範囲内である。様々な態様では、単位投与量は、約10μg未満、約1μg未満、約100ng未満、約10ng未満、約1ng未満、約100pg未満、又は10pg未満である。

[0122] ポリペプチド及び非ポリペプチドの別の範囲は、上記のとおりである最初の用量‐応答曲線からのデータ及びルーチン手法によって獲得されうる別のデータに基づいて、技術のある開業医に対して明らかあろう。

[0123] 本発明は、医薬として許容される賦形剤と混ぜた高親和性CGRP受容体のアゴニストを含む組成物を提供する。ある態様では、薬剤及び賦形剤は、アミリン受容体を活性化させず、高親和性CGRP受容体を選択的に活性化するように剤形される。別の態様では、薬剤及び賦形剤は、有害な副作用、例えば血管拡張又は血液グルコース又は乳酸レベルの上昇を刺激することなく、又は最小限にのみ刺激して、選択的に脂肪分解を刺激するために剤形される。

[0124] CGRPポリペプチド又は別のアゴニストは、別の活性のある薬剤と一緒に剤形されるか、又は一緒に(例えば、薬剤は、それのみ又はCGRP、減少した脂肪、遊離脂肪酸、及び/又は長鎖CoAレベルを組み合わせて)投与されうる。ある態様では、本発明のアゴニストはインシュリンと一緒に投与されないということが考慮される。ある側面では、高親和性受容体のアゴニストは、代謝性アミリン受容体の活性化を阻害するが高親和性受容体の活性化を阻害しない薬剤(例えば、抗受容体抗体)と一緒に投与される。

[0125] 本発明の実施の際に使われるアゴニスト(又はアンタゴニスト)は、治療すべきホストにたいして直接投与されうる。場合により、投与は滅菌状態下で行われる。しかしながら、活性のある成分が、それ自身のみで投与されることが可能である範囲で、医薬組成物として存在させることが好ましい。製剤は、典型的に1以上の許容されるそのキャリアを伴って、少なくても1の活性のある成分を含む。各キャリアは、別の成分と適合性を持ち、対象にとって有害でないという意味で医薬として及び物理的に許容されるべきである。治療製剤は、医薬の分野で既知の方法のいずれかにより調製されうる。例えば、Gilman et al., (eds.)(1990) Goodman and Gliman's:The Pharmacological Bases of Therapeutics(8th ed.) Pergamon Press; and (1990) Remington, The Science of Practice and Pharmacy, 20th Edition, Mack Publishing Co.,Easton, P.A.; Avis et al(eds.)(1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications Dekker, N.Y.; Lieberman et al.(eds) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets Dekker, N.Y.; and Lieberman et al(eds.)(1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems Dekker, N.Y参照のこと。

[0126] 本発明の化合物は、経口、非経口によって(例えば、筋肉内、腹腔内、静脈内、ICV、大槽内注射又は輸液、皮下注射、或いは移植)、吸入スプレーによって、鼻、膣、腸、舌、又は局所的な投与経路によって投与されうるし、かつ、慣用的な毒性のない医薬として許容される担体、補助剤、及び媒体であって各投与ルートに適切である担体、補助剤、及び媒体を含む適切な用量単位製剤に、単独又は一緒に、剤形される。アゴニストがポリペプチドであるとき、投与は非経口(例えば、静脈内)投与になることが多いだろう。

[0127] もし望まれるなら、(例えば、特定の血漿濃度を維持するために)アゴニストは、患者に対し、制御された運搬製剤の形態で投与されうる。様々な適切に制御された運搬システムは既知であり、経口、非経口、及び別の投与ルートに適した形態を含む。例えば、Bogner et al., 1997 U.S. Pharmacist 1997;22(Suppl.):3-12; and Guidance for industry. Extended release oral dosage forms: development, evaluation, and application of the in vitro/in vivocorrelations. Rockville, MD: Center for Drug Evaluation and Research, Food and Drug Administration, 1997.制御される薬の製剤形態の例は基本の参考図書で見つけられる(例えば、Sweetman, S. C. (Ed.). Martindale. The Complete Drug Reference, 33rd Edition, Pharmaceutical press, Chicago, 2002, 2483pp.;及びAulton, M.E.(E.d.) Pharmaceutics The Science of Dosage Form Design. Chrchill Livingstone, Edinburgh, 2000, 734pp.;及びAnsel, H.C., Allen, L. V. and Popovich, N. G. Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery systems, 7th Ed., Lippincott 1999, 676 pp.参照のこと。薬デリバリーシステムの製品中に使われる賦形剤は、様々な出版物に記述され、当業者に既知である。(例えば、Kibbe, E. H. Handbook of Phrmaceutical Excipients 3rd Ed., American Pharmaceutical Association, Washington, 2000, 665pp.t参照のこと)。USPは多くの修飾放出される経口投与形態の例を提供する(例えば、The United States Pharmacopeia 23/National Formulary 18, The United States Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville MD, 1995参照のこと)。この出版物は、錠剤及びカプセルの延長された放出及び遅らされる放出の薬剤放出能力を決定するための総論及び特定の試験を示す。発明のある側面では、アゴニストは、対象において、運動による中性脂肪の分解を高めるために、運動のプログラムと合わせて投与される。

[0128] 医薬組成物は、無菌の注射できる水性又は有機性の懸濁液の形態でありうる。この懸濁液は、既知の技術分野に従って、適切な分散又は湿潤剤及び懸濁剤を用いて剤形される。無菌の注射可能な調製物は、無毒の非経口的に許容される希釈液又は溶媒中の無菌の注射可能な溶液又は懸濁液でありうる。使われうる許容される媒体及び溶媒は、水、リンゲル溶液、及び等張塩化ナトリウム溶液である。しかしながら、特定の患者に対する特定の投与量のレベル及び投与量の頻度は、代わりうるし、かつ使われる特定の化合物の活性、代謝的安定性、及び化合物の効果の長さ、年齢、体重、健康、性別、食事、投与の仕方及び時間、排出の割合、薬の組み合わせ、及び病気の重症度を含む様々な因子に依存するだろう。いくつかの態様では、日々の又は毎週のアゴニスト投与が考慮される。

E.脂肪含量、血液グルコースレベル、血液乳酸レベル、血管拡張、インシュリン抵抗性、及び別の病気のモニタリング
[0129] 本発明のいくつかの態様では、CGRP受容体アゴニストは哺乳動物に投与され、かつ哺乳動物は、哺乳動物又は哺乳動物の組織(例えば、哺乳動物の骨格筋)において、脂肪分解の刺激又は脂質含量の減少がモニターされた。脂肪分解は、標的となる組織(例えば骨格筋、血液、血漿)において遊離脂肪酸の量又は組織の変化を検出することにより通常モニターされる。遊離脂肪酸レベルの変化を検出する方法は良く知られている。例えば、以下の例1に記述されたように、筋肉組織(生検又は組織培養により得られた)のガスクロマトグラフィーによる分析は、行われうる。別の方法は、アシルCoA酸化酵素に基づく比色アッセイ(Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan.)することを含む。血漿中性脂肪は、比色アッセイ(Triglyceride Procedure 336, Sigma Diagnostics)を用いて計測されうる。最近の証拠は、長鎖アシルCoAエステルは、ラット及びヒト筋肉における脂質代謝及びインシュリン感受性のマーカーとして働く(Bronwyn et al., 2000, Am.J.Phys. 279:E554-E560参照のこと)。組織の長鎖CoA(例えば筋肉生検由来)は、組織からの長鎖CoAの溶媒抽出、層分離、及び逆層高速液体クロマトグラフィーによる精製によって計測されうる(Bronwyn et al., 2000, Am.J.Phys. 279:E554-E560参照のこと)。さらに、筋肉内中性脂肪含量を計測する新しい方法論が使われうる。新しい方法論は、非観血方法、例えばコンピュータ化された断層撮影法、核共鳴分光法(例えば、Kelley et al., 1991, J. Clin. Nutr. 54:509-515; Krssak et al., 1999, Diabetologia 42:113-116; Jacob et al., 1999, Diabetes, 48:1113-1119参照のこと)を含む。

[0130] 発明のいくつかの態様では、CGRP受容体アゴニストは、哺乳動物に対し投与され、かつ哺乳動物において血管拡張が計測された。CGRP-1及びCGRP-2は、強力な血管拡張剤である(例えば、Muff et al., 1995, Eur. J. Endocrinol. 133:17-20; Nuki et al., supra参照のこと)。しかしながら、CGRP-1(及び高親和性CGRP受容体の別のアゴニスト)の骨格筋脂肪分解効果は、(例えば、高親和性受容体に作用するが、代謝性アミリン受容体に作用しない(又は活性を最小限にする)薬剤のタイプ、製剤又は投与量によって)血管拡張効果により少なくても部分的には脱共役されうる。本発明のある態様では、薬剤は、哺乳動物に投与され、かつ哺乳動物における血管拡張が計測される。血管拡張の適切なアッセイのいづれかが、使われうる(例えば、Nuki et al., 1993, Biochem Biophys Res Commun 196:245-51参照のこと)。ヒトにおいて、血管拡張は、収縮血圧及び動脈圧の平均値を測定することにより計測されうる。

[0131] 本発明のいくつかの態様では、CGRP受容体アゴニストは哺乳動物に投与され、かつ血液グルコース生産及び/又は乳酸レベルが計測される。上記の通り、高親和性受容体による脂肪分解は、代謝性アミリン受容体による望ましくない効果(例えば血液グルコースレベルの上昇)なしに達成されうる。

[0132] 本発明のいくつかの態様では、CGRP受容体アゴニストは哺乳動物に投与され、かつ哺乳動物は、筋肉脂肪の増加に関連する症状の病徴の軽減をモニターされた。発明のいくつかの側面では、少なくても疾患の経過が、重症度、病徴、又は病気の進行の減少があるかどうかを決定するのに十分な期間モニターされる。本発明のいくつかの態様では、CGRP受容体アゴニストは、哺乳動物(例えば、脂肪分解刺激を必要とする哺乳動物)に投与され、その哺乳動物において1以上の疾患又は生理的な病気がモニターされる。例えば、本発明のいくつかの側面では、CGRP受容体アゴニストは哺乳動物に投与され、かつ哺乳動物はインシュリン抵抗性に関するアゴニストの投与の効果をモニターされる。哺乳動物におけるインシュリン抵抗性は、当該技術分野に既知の様々な方法のいずれかにより査定されうる。例えば、ヒトにおいては、インシュリン抵抗性は、経口糖付加試験つまりOGTTを用いてモニターされうる(例えば、Bergman et al., 1985, Endocrinology Review 6:45-86参照のこと)。通常、75g、OGTT2時間値が140mg/dlより大きい個人は、インシュリン抵抗性とみなされ、及び2時間値が120mg/dlより小さい個人は通常とみなされる。インシュリン抵抗性は、定常状態血液グルコース試験を用いてモニターされる(例えば、Reaven et al., 1979, Diabetologia 16:17-24参照のこと)。SSPG値が180mg/dlより大きい個人は、通常インシュリン抵抗性とみなされ；SSPG値が150mg/dl未満の個人は通常とみなされる。別の方法は、インシュリン抵抗性のマーカーとしてHbA1c及びC-ペプチドの計測を含む(del Prato, 1999, Drugs 58: Supp 1:3-6; Ferranini et al., 1998, Hypertension 16:895-906)。

[0133] 上記のモニター活動のいずれかは、組み合わせて行われうる；例えば、ある態様では、血管拡張及びインシュリン抵抗性は、アゴニストが投与される哺乳動物でモニターされる。病気(例えばインシュリン感受性/抵抗性)又はアゴニストの投与の効果(例えば脂肪分解)がモニターされる態様においては、計測は、薬剤の投与に先立って(例えば、基底を作るため)、及び/又は１以上の投与後時間点において(又は複数回の投与の場合、１以上の投与後に)行われた。

[0134] 本発明の態様では、アゴニストはインシュリン抵抗性と診断される個人に対し投与される。ある態様では、個人はインシュリン抵抗性を患っていると診断されるが、糖尿病とは診断されない(例えば、2型糖尿病を患う)。

[0135] 本明細書中のガイダンス、例えばCGRP(又は別のCGRP受容体アゴニスト)の脂肪分解及び血管拡張活性は、少なくとも部分的には脱共役されうることの開示が与えられるとき、血管拡張及び望ましい結果(脂肪分解の増加、インシュリン感受性の増加、及びそのようなもの)をモニターすることにより、哺乳動物が、血管拡張の増加を誘発することなく、又は血管拡張を最小限に誘発し、脂肪分解を刺激する(それにより筋肉脂肪増加を減少させる)のに十分である量のCGRP又は別のアゴニストを投与されるということは熟練の開業医にとって明らかであろう。
F.スクリーニング方法

[0136] ある側面では、本発明は、薬剤がCGRP受容体のアゴニストであるかを決定することにより、哺乳動物又は哺乳動物細胞において、例えば哺乳動物の骨格筋において、薬剤が脂肪分解を刺激するために有用であるかどうかを決定する方法を提供する。ある態様では、(代謝性アミリン受容体に比較して)高親和性CGRP受容体を優先的に活性化する薬剤が同定される。上記の通り、そういった薬剤は、治療組成物を作る際、及び病気及び疾患を治療する際に有用である。本明細書中の以下で記されるとおりに、高親和性受容体の優先的な刺激は、代謝性アミリン受容体によって仲介される応答(例えば、糖代謝に対する効果)を起こす薬剤のEC₅₀と薬剤のEC₅₀であって、高親和性CGRP受容体によって仲介される応答(骨格筋組織又は骨格筋細胞における遊離脂肪酸の増加)を起こすEC₅₀を比較することを含む、様々な方法により決定されうる。

[0137] 本明細書中に記述される同定及びスクリーニングの方法は、治療上有用な活性があるかで化合物単体又は複数の化合物を選別するために使われうるということが理解されるだろう。複数は、少なくても3つの薬剤、よくある場合少なくても25、さらによくある場合少なくとも50、通常少なくとも100であり、かつ多数(＞1000)の薬剤をスクリーニングすることを含む。スクリーニングは、ハイスループットであり、及び/又は経時的又は同時に行われるアッセイを含みうる(別の薬剤のアッセイが始まったのちだが、完了する前に、他の薬剤のアッセイが始まることを含む。)

[0138] 代謝性アミリン受容体を通した脂質分解を刺激する薬剤のEC₅₀と比較して、高親和性CGRP受容体受容体を通した脂質分解を刺激する薬剤のEC₅₀の基底を同定すること(例えば組織中のトリアシルグリセリド含量の減少、又は遊離脂肪酸の上昇を計測することにより、)、及び/又は本明細書中で記述された別のアッセイを使って同定すること(例えばII(B)及び例を参照のこと)を含む(が非限定的に)、いずれかの適切なアッセイは優先的な活性化を同定するために使われうる。そういったアッセイが複数の薬剤、例えばハイスループット形式における化合物のライブラリーをスクリーニングするために使われうることは理解されるべきであろう。高親和性CGRP受容体の存在及び異なった効果が本明細書中で導かれるとき、様々な方法は、代謝性アミリン受容体に比較して高親和性CGRP受容体を優先的に作用し、又は刺激する化合物、組成物、投与量、製剤形態を同定するために使われうる。こういった方法がインシュリン抵抗性及び別の病気を治療するのに有用な薬剤をスクリーニングするために使われうることは、明らかであろう。

[0139] 本発明のスクリーニングアッセイは、非限定的に、例えば、化合物が、動物、細胞、又は組織において脂質濃度の減少に有用であるかを決定するために、動物、in vitro組織又は器官培養(例えば、単離された骨格筋)、細胞、並びに細胞系列を用いて行われうる。代替的に、アゴニストは単離された細胞系列に投与されうる。以下の例を参照のこと。

[0140] ある態様では、本発明は、(i)高親和性CGRP受容体に結合する少なくても1の薬剤、及び通常複数の薬剤を同定すること(例えば、CGRP-1置換アッセイを用いて)；及び(ii)代謝性アミリン受容体に比較して高親和性CGRP受容体を優先的に刺激する薬剤を選択することによって、哺乳動物において薬剤が脂肪分解を刺激するために有用であるかを決定する方法を提供する。関連する態様では、本発明は、(i)少なくても1の薬剤及び通常は複数の薬剤であって、高親和性CGRP受容体を発現する組織において脂肪分解を刺激する薬剤を同定すること、及び(ii)(i)由来の薬剤であって、代謝性アミリン受容体に比較して優先的に高親和性受容体を刺激する薬剤を選択することによって、ある薬剤が哺乳動物において脂肪分解を刺激するのに有用であるかを決定する方法を提供する。ある態様では、方法は、(i)少なくても1及び通常は複数の薬剤であって、高親和性CGRP受容体に結合する薬剤；及び(ii)(i)から、代謝性アミリン受容体に比較して高親和性受容体を優先的に刺激する薬剤を選択することを含む。ある態様では、組織は骨格筋(例えば、ラット由来)である。ある態様では、方法は、(i)高親和性CGRP受容体に結合する少なくとも1の薬剤、及び通常は複数の薬剤；及び(ii)(i)から高親和性CGRP受容体により仲介される応答を起こす薬剤のEC₅₀より高いEC₅₀であって、代謝性アミリン受容体により仲介される応答を起こすEC₅₀を有する薬剤を選ぶことを含む。ある態様では、組織は骨格筋(例えばラット由来の)である。

[0141] 別の態様では、本発明は、代謝性アミリン受容体及び高親和性CGRP受容体によって仲介される応答、本明細書中で記述されるとおり通常は脂肪分解のEC₅₀の基底値に基づいて哺乳動物において薬剤が脂肪分解を刺激するのに有効であるかを決定する方法を提供する。ある態様では、代謝性受容体によって仲介される応答を行う薬剤のEC₅₀は、高親和性受容体をとおした応答を起こすEC₅₀より、少なくても約10倍高い、少なくても100倍高い、少なくても約1000倍高い、及び好ましくは少なくても約10,000倍高い、少なくても約100,000高い、又は少なくても約1,000,000倍高い。

[0142] ある態様では、ヒラメ筋(例えば単離されたヒラメ筋)は、化合物の脂肪分解活性を決定するために使われる。(この文脈で使われるとき、脂肪分解活性は、細胞又は組織において脂肪分解を刺激する薬剤の能力の事を指す)。ヒラメ筋は、高脂肪食又は通常食を与えられてきた動物由来であり、調製された化合物に対する用量‐応答曲線が作られ、そこでは、(i)アッセイは、高親和性CGRP受容体及び代謝性アミリン受容体をとおしておこりうる過程を反映し(例えば、筋肉中の脂肪酸及び中性脂肪の含量を計測すること)、かつ(ii)アッセイは、代謝性アミリン受容体をとおして起こる過程を反映する(例えば、最大限に刺激をするインシュリンの存在下において、筋肉グリコーゲン含量の計測及び[¹⁴C]-グルコースのグリコーゲンへの取り込みを計測すること)。EC₅₀の値(例えば、相対的EC₅₀の値)は、用量-依存曲線から決定されうる。化合物の投与量は、(i)及び(ii)の結果から選ばれるだろう。(i)における代謝性効果を誘発するが、(ii)における効果を誘発しない化合物の濃度が特に興味があるだろう。異なる化合物の比較においては、この濃度は、相対化合物効力の計測となるだろう。例えば、EC₅₀値の基底値に関し、もし低い相対濃度で(i)の効果を誘発するが、(ii)の効果を誘発しないなら、化合物は、別の化合物に対し高い相対効力を有すると定義されるだろう。

[0143] 関連する側面では、(代謝性アミリン受容体に比較して)高親和性CGRP受容体を優先的に活性化する薬剤の同定は、高親和性CGRP受容体(例えば、骨格筋CGRP受容体)及び代謝性アミリン受容体(例えば骨格筋アミリン受容体)に対し異なる結合性を検出するステップを含む。結合試験は、たくさんのいくつかのアプローチを用いた放射線リガンドの結合試験を通して、簡便に行われうる。例えば、テスト薬剤は、適切な放射線標識(例えば¹²⁵I又は³H)により放射線標識され、かつ高親和性CGRP受容体を含む調製品(例えば骨格筋膜)と過剰量の非標識リガンドの存在下及び非存在下でインキュベーションされた。飽和曲線が作られ、結合パラメーター、K_d(半量飽和に必要とされるテスト薬剤の濃度)は比結合性をもたらした。別の例では、高親和性CGRP受容体に関する試験薬剤の非結合パラメーターは、放射線標識されたCGRPリガンドの競合置換により決定されうる。この場合、放射線標識されたCGRPは、高親和性CGRP受容体受容体を含む調製品(例えば骨格筋の膜)と、標識されていないテスト薬剤の量を増やす条件下で、インキュベーションされうる。結合したCGRPリガンドの標識されていない試験薬剤の濃度(log)に対するプロットは、シグモイド曲線になり、そこでは、阻害定数、K_iが、テスト薬剤にもたらされる。結合アッセイを行う方法並びに応答及びデータを分析する方法は、当該技術分野に既知である。例えば、www.graphpad.com/prism/, 及びRBI Handbook of Receptor Classification and Singal Transduction, K. K. Watling, J. W. Kebebian, J.L. Neumeyer, eds. Research Biochemicals International, Ntick, Mass., 1995, 及びそこでの参考図書を参照のこと。分析方法は、T. kenakin, Pharmacologic Analysis of Drug-Receptor Interactions, 2nd Ed. Raven Press, New York,1993, 及びそこでの参考図書で，見つけることがきる。

[0144] 本発明のある側面では、動物(例えば動物組織)において化合物が脂質含量の低下に有用であるかを決定するためのスクリーニングアッセイにおいて、高親和性CGRP受容体アゴニスト(又は、アゴニストでありうるテスト化合物)は、動物に投与される。例えば、アゴニストは、筋肉脂肪増加と関連するヒトの疾患又は病気のモデルとして使われる非ヒト動物に対し投与されうる。そういった実験モデルの例は、インシュリン抵抗性の動物モデル、例えば、ob/ob(Kreutter, 1991 Diabetes 40[Suppl 1]:159A (緒言); Bretherton, Endocrinol 129[Suppl]:91A(緒言)) db/db(Kreutter,1991 Diabetes 40 [Suppl1]:159A (緒言),及びobese-diabetic生存可能な黄色種マウス、及びLA/N-cp (Huang, 1992 Hypertension 19[Suppl I]:101-109)(図14)、SHR/N-cp(Dunning, 1991 Diabetes 40[Suppl 1],obese Aucker(Kotanyi L1992 Diabetes 41:685-680),及びobese-diabetic Zucker(Geduolin, 1991 Biochem Biophys Res Commun 180:782-789)種のラット、並びに、インシュリン抵抗性をグルコルチコイド(Jamal H. 1990 Endocrinol 126:425-429)、金チオグルコース(Tokuyama, 1991 Endocrinology 128:2739-2744),視床下部腹内側の破壊(Tokuyama,1992 Diabetes Res Clin Pract 15:23-29);Tokuyama, 1991 Endocrinology 128:2739-2744)により仕向けられたところの動物を含む。脂質の含量(例えばFFAの出現)に加え、効果、例えば血液グルコース及び乳酸レベル、並びに血管拡張の程度は、望ましくない効果を起こさない化合物を同定するために査定されうる。組織及び細胞に基づくアッセイからの情報が、ex vivoにおいて用量‐応答研究を行うために最も有用な化合物濃度が決められるために使われうる。動物自体におけるスクリーニング研究は、化合物又は投与量を評価する際に使われうる。具体例としてのプロトコルは、Ji-Ming et al., 2001, Am.J. Physiol. Endocrinol.Metab. 280:E562-569により、アミリンに対して記述されたプロトコルと類似である。本明細書中で記述されるアッセイのある態様では、実験の間又は後に、実験動物は屠殺されることは、理解されるだろう。

[0145] 薬剤(又は試験薬剤の混合物であって、例えば、ハイスループットスクリーニングのスクリーニング形式中の混合物)のEC₅₀であって高親和性CGRP受容体及び/又は代謝性アミリン受容体に対するEC₅₀が決定されるべきとき、様々なアッセイが使われうる。例えば、特定化された化合物、受容体、及び効果に対するEC₅₀は、CGRP-1が高親和性CGRP受容体に結合する際、及び薬剤濃度対遊離脂肪酸の放出の用量‐応答曲線を作る際、様々な濃度のリガンドの効果を測定することにより、決定されうる。ある態様では、高親和性CGRP受容体の場合、様々な濃度の試験薬剤は、組織の生存度が維持される状態で、単離されたヒラメ筋の片とインキュベーションされる。決められたインキュベーション期間の後、中性脂肪及び遊離脂肪酸は、抽出され、定量化され、テスト薬剤濃度のlogに対してプロットされた。シグモイド曲線は、データ及び最大刺激の50％に対し必要な試験薬剤の濃度由来のEC₅₀に適合される。具体例としてのアッセイ及び用量‐応答データの結果は、以下の例に記述される。例4をを参照のこと。通常、CGRPの濃度の範囲は、受容体の集団(例えば骨格筋)を含むサンプルへと添加されうる。CGRP濃度を、CGRP結合による効果の指標(例えば、遊離脂肪酸濃度の増加)に対してプロットすることにより、CGRP結合に対するEC₅₀が、決定された最大刺激の半分の効果(例えば遊離脂肪酸の産出)をもたらすCGRP濃度として決定されうる。

[0146] ある態様では、ある薬剤(又は貯蔵所又は以下で記述されるハイスループットスクリーニング形式内の複数の薬剤)は、(a)高親和性CGRP受容体(例えば骨格筋CGRP受容体)をとおした脂肪分解を刺激する薬剤のEC₅₀、つまり「EC_50-CGRP-R」を決定するためアッセイされ、及び(b)脂肪分解を刺激するためのEC₅₀、つまり「EC_{50-アミリン-R}」を決定するためにアッセイされる。二つのEC₅₀は比較され、EC_{50-アミリン-R}/EC_50-CGRP-R率が約10を超える率を持つ薬剤が、アミリン受容体に対するEC₅₀より有意に低い高親和性受容体EC₅₀を有すると考えられる。好ましくは、EC_{50-アミリン-R}/EC_50-CGRP-R率は少なくても約10であり、多くの場合、少なくても約10²より大きく、5×10²より大きく、約10³より大きく、5×10³より大きく、約10⁴より大きく、約10⁵より大きく、約10⁶より大きく、約10⁷より大きく，又は約10⁸より大きい。

[0147] スクリーニングは様々なタイプの化合物及び組成物を使うことによって、行われうる。適切なテスト薬剤は、天然及び合成化合物又は組成物を含む。適切な試験薬剤の例は、ポリペプチド(タンパク質及び短いペプチド、例えば、本明細書中で記述されるCGRP関連ペプチドを含む)、炭水化物、例えばオリゴ糖及び多糖類；ポリヌクレオチド；脂質又はリン脂質；脂肪酸；ステロイド；ジペプチド、アミノ酸アナログ、有機分子、例えば、小分子(例えば、分子量1000未満)を含む。テスト化合物は、非限定的に、複素環式化合物、炭素環式化合物、-ラクタム、ポリカルバミン酸を含む様々な化学型でありうる。ある態様では、薬剤は、化合物ライブラリーをスクリーニングすることによって同定される。合成分子の巨大なライブラリーを作り及びスクリーニングすることはコンビナトリアル化学において既知の技術を用いて行われうる、例えば、van Breemen, 1997, Anal Chem 69:2159^64; Lam, 1997, Anticancer Drug Des 12:145-67; Gold, 1995, J.Biol. Chem. 270:13581-84)参照のこと。さらに、多くの数の潜在的に有用な活性が修飾された化合物は、原料物質として天然物からの抽出物内でスクリーニングされうる。そういった抽出物の原料は、多量の種の菌類、放線菌、藻類、昆虫、原生生物、植物、及び細菌由来でありうる。活性を示すそれらの抽出物は、次に活性のある分子を単離するために分析されうる。例えば、Turner, 1996, J. Ethnopharmacol 51:3943;Suh, 1995, Anticancer Res. 15:233-39参照のこと。多くの別のテスト薬剤及びライブラリーは、当該技術分野に既知である。多くの態様では、テスト薬剤のライブラリーは少なくとも100の異なるテスト化合物又は薬剤を含む。

[0148] ある側面では、本発明は、薬剤の脂肪分解活性をCGRPの脂肪分解活性と比較することにより、薬剤が哺乳動物において脂肪を分解するのに有用であるかを決定するための方法を提供する。このアッセイによれば、CGRP(等量のモル基礎量において比較されるとき)と同等か、又はより良い細胞又は組織(例えば、骨格筋又は肝臓)における脂肪分解を刺激する薬剤は、哺乳動物において脂肪分解を刺激するために有用であると考えられ、及び動物又はヒト治療の候補化合物である。比較のステップは、平行(同時の行われる)アッセイにおいて行われうる。代わりに、脂肪分解の活性(例えば、産生されたFFA/薬剤のmol/特定の条件下のユニット時間)は、以前に記録された(コンピュータが読むことができる培地、又はその他の中で)標準値と比較されうる。比較は、間接的でありうる。例えば、化合物Aの脂肪分解活性は、CGRPと比較しうるし、かつテスト薬剤の脂肪分解活性は、化合物Aの脂肪分解活性と比較しうる(そしてそのようにして間接的にCGRPと比較される)。ある側面では、高親和性受容体によって仲介されるとき、CGRPの脂肪分解活性は、比較元として使われる。例えばある態様では、比較は、300pM未満の濃度におけるCGRPの脂肪分解活性に対してである。例えば、ある態様では、比較は、代謝性アミリン受容体の脂肪分解を実質的に刺激しない濃度におけるCGRPの脂肪分解活性に対してである。別の態様では、高親和性受容体及び代謝性受容体の両者に仲介される、又は代謝性受容体にのみ仲介される、CGRPの脂肪分解活性は、比較元として使われうる。ある態様では、骨格筋における脂肪分解を刺激するCGRPのいずれかの形態が使われ；関連する態様では、(前記から明らかであろうが)CGRPの形態は、高親和性受容体をとおした脂肪分解を刺激する形態である。CGRPの具体例としての形態は、非限定的にラット及びヒトのCGRP-1である。

[0149] G. 脂肪分解を阻害する方法
別の側面では、本発明は、高親和性受容体及び/又は代謝性受容体のアンタゴニストを投与することによって、骨格筋において脂肪分解を阻害する方法を提供する。組織における脂肪分解の阻害は、実験上及び治療上の設定内で有用である。例えば、アンタゴニストの慢性的投与は、筋肉及び肝臓における代償性代謝過程であって、脂質利用の増加を導き(例えば、β-酸化の上方制御)及び筋肉脂肪の望ましい減少をもたらす過程を誘発する。脂肪分解を阻害する薬剤はまた、(例えば、脂肪分解調整剤の同定のためのポジティブ及びネガティブコントロールとして)薬のスクリーニングアッセイで使われる。アンタゴニストは、薬剤例えば、CGRP又はアミリンによって刺激される脂肪分解を阻害するいずれかの化合物でありうる。アンタゴニストは、高親和性CGRP受容体又は低親和性代謝性アミリン受容体(例えば以下の例4参照のこと)に対する結合を阻害する又は競合しうる。アンタゴニストは、天然化合物、例えばタンパク質、ペプチド、ポリヌクレオチド、又は小さいエフェクター分子であり、或いは、合成的に作リ出されうる。ある態様では、アンタゴニストは、^8,37アミリン又は^8,37CGRPである。^8,37CGRP及び^8,37アミリンは、CGRP及びアミリンのバリアントのことそれぞれ指し、そこでは、C末端における最初の7つのアミノ酸が取り除かれている(Cooper, 2001, "The endocrine pancreas and regulation of metabolism" in Handbook of Physiology, II(7) The Endocrine System, Jefferson, L.S. Cherrington, A.D., eds., Oxford Univesity Press)。非ペプチド型CGRPアンタゴニストも使われうる。例は、BIBN4096BS(Wu et al., 2002, Biochem Soc. Trans. 30:468-73参照のこと)、「化合物-1」及び「化合物-2」を含む。(Mallee et a.,2002、J Biol Chem. 277:4294-98)。

[0150] アンタゴニストは、脂肪分解を阻害することを必要とする動物に対し治療有効量で投与されうる。受容体アンタゴニストは、医薬として許容される賦形剤と混合され、動物に投与されうる。投与の方式は、上記で受容体アゴニストに対し記述された方式に類似である。

例1
材料と方法
[0151] 本例は例2〜7で記述される実験で使われる材料と方法を記述する。

[0152] 材料。別段に記載がない限り、全ての化合物は分析用グレード又はそれ以上であった。ネンブタールはVirbac Laboratories Ltdから購入された。ラットのアミリン、ラットのアミリン-(8-37)、ラットCGRP1及びヒトCGRP1-(8-37)(図1参照のこと)は、Bachem, Switzerlandから購入された。NaHCO₃、CaCl₂、D-グルコース、NaCl、KH₂PO₄、クロロホルム、メタノール、HCl、NH₄OH、エタノール及びトライトンX-100はBDHから；MgSO₄・7H₂OはSigmaから；及びKClはRiedel-de Heanから購入された。テフロンカラム(16ml)、テフロンフリット、及びVac Elut器具はAlltechから購入された。アミノプロピルが結合したシリカ40μ(結合溶出)カラムパッキングはPhenomenexから；ヘキサン及びジエチルエーテルはLabscanから購入された。ヘプタンはWaters Associates Incから購入され、ボロン・トリフルオリド-メタノール複合体(メタノール中のBF3)はAldrich Chemical Company Inc.から購入された。ブチル化されたヒドロキシトルエン及び全ての脂肪酸メチルエステル標準物質はSigmaから購入された。GLCカラムDB225(30ｍ×25ｍｍ I.D.)は、J&WScientificから獲得された。トリ-n-オクチルアミンは、Acros Organicsから購入された；トリクロロアセチル酸はAjax Chemicals Ltd；から購入され、グリセロールはScharlauから購入された。遊離脂肪酸、半量マイクロテストは、Boeheringer Mannheimから購入された。グリセロールテスト及び中性脂肪テストのためのリパーゼ・フリー・リージェント粉末はPointe Scientific Incから購入された。

[0153] 動物モデル。通常にえさを与えられたラット。全てのプロトコルは、オークランド大学動物倫理委員会により承認された。オスのウィスターラット、(日齢＝50d)重量200-250ｇは定常12h/12h-明/暗サイクルで飼育され、通常のラット固形飼料(Diet86、NRM、Auckland)、水を適宜与えられた。通常食は、主に牛脂から構成される5％脂肪(w/w)を含む。この食餌の代表的なサンプルの中性脂肪、全量及び遊離脂肪酸含量は分析され、及び表3に示された。ラットは、ペントバルビタールナトリウム(45mg/kg体重)の腹腔内注射によって麻酔され、次に頚椎脱臼により屠殺された。

[0154] 高脂肪食を与えられたラット。オスのウィスターラットの群(n=21/食餌)は、40％(ｗ/ｗ)のラード、コーン油、又はオリーブ油が添加された通常ラット固形飼料を含む高脂肪食を、離乳時期(日齢＝21d)から50dで屠殺するまで与えられた。ラード由来のトリアシルグリセロールは、主に飽和された脂肪酸を含み、コーン油由来のトリアシルグリセリドは主に1つの未飽和部位を持つ脂肪酸を含み；オリーブ油由来のトリアシルグリセリドは主に複数の未飽和部位を有する脂肪酸を含む。

[0155] ヒラメ筋組織の単離とインキュベーション。液浸及びインキュベーションメディウムは、118.5mM NaCl、4.75mM KCl、1.18mM MgSO₄・7H₂O、及びKH₂PO₄、24.8ｍM NaHCO₃、2.54mM CaCl₂及び10mM d-Glucoseから成るクレブス-ハンスレイト緩衝液(Krebs-Henseleit buffer(KHB)であった。メディウムは継続的に95％O₂/5％CO₂のガスで満たされた。インキュベーションは、KHBのみ又は様々な濃度のCGRP、アミリン、ノルエピネフリン、インシュリン、又はCGRP及び適切であるアミリンアンタゴニストを含むKHBで行われた。両足のヒラメ筋は、組織をKHBに液浸を続けて切除され；筋肉は二つの等しい部分に分けられ、インキュベーションフラスコに移された。インキュベーションが完了した際、筋肉は液体窒素中で急激に凍らせ、そして次に結合組織と全ての見える脂肪とを切り分けた。筋肉片は-80℃で分析まで貯蔵された。

[0156] 脂質抽出及び脂肪酸のクロマトグラフィーによる分離。全脂質は、ブリー(Bligh)及びダイヤー(Dyer)(Gorski et al., 1988, Mol & Cell Biochem 178:113-118; 1. Bligh et al., 1959, Can J Biochem Physiol 37:911-917)の方法の改変された版によって筋肉片から抽出された。筋肉は、0.4mlの脱イオン水中でホモジェナイズ(Soniprep 150)された。本明細書中で使われる溶媒の体積は、(Bligh ＆ Dyer, 上記)で記されたように、筋肉の水含量に従って変化された。0.005％ブチレートヒドロキシトルエン及び1体積量のクロロホルムを含む2体積量のメタノールは、筋肉懸濁液に添加された。ホモジェネートは、最大速度で2分間ボルテックスされ、2500gで4分間遠心分離された。上清は、回収され、ペレットは2体積量のメタノール、1体積量のクロロフォルム及び0.8体積量の0.2N HClで再抽出がされた；残渣は、2分間ボルテックスされ、3,500g3分間遠心された。遠心後、混合された上清は、2体積量のミリQ水及びクロロホルムで各々希釈され、そして、相は3500Gで4分間の遠心によって分離された。下相のクロロホルム相が回収され、0.2N メタノーリック(methanolic)NH₄OHを滴下することにより中和され、N₂下で蒸発された。サンプルは、必要とされるまで-80℃で貯蔵された。

[0157] アミノプロピル相(250mg)は、テフロンフリットと供に16mlテフロンカラムに充填され、結合された相をさかさまに静置された。カラムは、Vac Elut器具に置かれ、2mlの量のヘキサンで2回洗われた(Prasad et al., 1988, J Chromato 428:221-228; Kaluzny et al., 1985, J Lipd Res 26: 135-140)。乾燥した脂質サンプルは、二つの0.150mlの量のクロロホルムに溶かされ、大気圧の元で、カラムに加えられた。吸着の後に、中性の脂肪は、4mlのクロロホルム-2-プロパノール(2:1,v/v)で溶出され、遊離脂肪酸はジエチルエーテル中2％の酢酸4mlで溶出された。遊離脂肪酸を含む溶媒は、N₂の流れの元で乾燥された。

[0158] ガス-液体クロマトグラフィー分析。乾燥した遊離脂肪酸残渣は、3フッ化ボロン-メタノール法(Prasad、以下の)により、メチルエステルを誘導されるよう加工された。メタノール中における1ｍLの3フッ化ボロン(BF3)は、各サンプルへと加えられた。サンプルバイアルは、70℃で5分間加熱され、精力的に攪拌され、さらに10分間焼かれた。サンプルが一度室温に達すると、0.5mlのミリQ水が添加され、サンプルバイアルは攪拌され、0.1mlのヘプタンが添加され、サンプルは再び攪拌された。0.05mlの最上部ヘプタン相は、GLC分析のため取り除かれた。DB-225カラムを装備するModel HP5890 Plus Series 2(Hewlett-Packard)ガスクロマトグラフィーは、遊離脂肪酸のメチルエステルを分離するために使われ、Model HP 5973 MS(Hewlett-Packard)を有するModel HP 5890 GC、GC/MSは、各遊離脂肪酸の同定するために使われた。温度のプログラムは、最初の温度80℃から最終温度210度まで3℃/minの割合で直線的に増加し、続いて最終温度10分間保持されることから成った。組織の脂肪酸の量は、脂肪酸メチルエステル標準物質の反応時間及び、相対的な理論的反応因子に基づいた。遊離脂肪酸は、標準物質及びGC/MSクロマトグラフィーにもとづいて確かめられた。

[0159] 組織の遊離脂肪酸及びトリアシル・グリセロール濃度の酵素学的分析による決定
遊離脂肪酸は、全脂肪から分けられ、N₂の流れの元で、蒸発され、そして、分析まで-80℃で貯蔵された。サンプルは、50μLの暖めたエタノール(35〜40℃)、に溶かされ、そしてエタノールは室温に達っすると0.625mlのトライトンX-100(6％w/v)溶液が加えられた。溶液は30分間攪拌され、次にトライトン溶液で0.825mlに近づけられた。遊離脂肪酸は、マイクロ分析(Cobas Mira, Roche Diagnostics)に適用させた商業的な方法(Boehringer Mannheim)を使ってパルミチン酸標準物質を用いて定量された。トリアシル・グリセロールレベルは、グリセロール標準物質を用いて全脂質分各(Pointe Scientific)中で定量された。

[0160] 組織グリセロールの酵素的分析
凍結した筋肉サンプルは、粉末化され、2mlエッペンドルフチューブに秤量された。0.5mlの10％(w/v)トリクロロ酢酸は、各サンプルへと添加され、サンプルは次に4分間氷上でホモジェナイズされた。ホモジェネートは、何回か遠心及びボルテックスされ、2分間氷上に置かれ、次に10,000rpmで5分間遠心された。0.4mlの上清は新しいチューブへと移され、そこに0.5mlのトリ-n-オクタルアミン/フレオン113(1:2.03ｖ/ｖ)が添加された。溶液は、混合され、氷上で5分間置かれた。上部の水相のpＨが決定され、サンプルは中性のpＨが達成されるまで混合され遠心された。0.2ｍｌの上相は、取られ、グリセロールの含量が調べられた。

[0161] 統計的分析
全ての結果は、平均値±Ｓ.Ｅ.Ｍとして存在する。脂肪代謝に関するホルモンの影響を評価するために、1元配置分散分析(ＡＮＯＶＡ)が行われた。治療と対応するコントロールの値との間との違いを分析するためにデュネットの多重比較検定が適応された。全ての統計的分析は、Machintosh Graph Pad Prism Programpower PC Versionを用いて行われた。P＜0.05の値は、統計的に有意差があると考えられた。

例2
[0162] 通常食を与えられたラット由来の骨格筋における、アミリン、CGRP、ノルエピネフリン、及びインシュリンの脂質代謝効果
本例は、単離されたラットヒラメ筋組織における脂肪代謝のレベルに関して様々な薬剤により誘発される刺激を記述する。筋組織は、アミリン、CGRP、ノルエピネフリン、又はインシュリンで処理され、そして、遊離脂肪酸、グリセロール、及び中性脂肪のレベルはコントロールのレベルと比較された。

[0163] 単離されたヒラメ筋における遊離脂肪酸に関するアミリン、CGRP、インシュリン、及びノルエピネフリンの効果が図2Aに示される。アミリン、CGRP、及びノルエピネフリンを処理されたヒラメ筋の遊離脂肪酸含量をコントロールの筋肉と比較すると、有意差があった。CGRPとのインキュベーションは、ノルエピネフリン(295±27nmol/g vs.78±21、P＜0.01)及びアミリン(216±22nmol/g vs.78±21、P＜0.05)と比較して、筋肉中の遊離脂肪酸を最も増加をさせる(325±56nmol/g vs.78±21、P＜0.01)。ヒラメ筋を最大限に刺激するインシュリンとインキュベーションすることは、コントロール組織と比較して筋肉内の遊離脂肪酸濃度を変化させない(67±9nmol/g vs. 78±21)。

[0164] アミリン、CGRP、及びノルエピネフリンは、図2Bに見られるように、筋肉内グリセロールの低下を誘起する。アミリンと1時間インキュベーションした後の、グリセロールの濃度は(0.03±0.004nmol/g vs. 0.07±0.007、P＜0.01)であり、CGRPとのインキュベーションの後のグリセロール濃度は(0.04±0.008nmol/g vs. 0.07±0.007、P＜0.01)であり、ノルエピネフリン処理後のグリセロール濃度は(0.04±0.005nmol/g vs. 0.07±0.007、P＜0.01)であった。

[0165] 図2Cは、60分のインキュベーションの後のヒラメ筋におけるトリアシルグリセロール含量を示す。ノルエピネフリンの処理は中性脂肪濃度を低下させる(0.81±0.09μmol/g vs. 1.17±0.15)。アミリン及びCGRP処理により上昇した筋肉中性脂肪の傾向がある(1.7±0.26μmol/g(アミリン)、1.9±0.23(CGRP) vs. 1.17±0.15)が、それらの効果はコントロールの値に対し有意差はなかった。

[0166] 全3種のホルモン処理由来のインキュベーションメディウムは、同じ酵素に基づく方法論を用いて試験された(各処理ごと、n＝7)。遊離脂肪酸又はグリセロールのメディウムへの放出は検出されなかった(結果は示していない)。

例3
[0167] 骨格筋における、各遊離脂肪酸含量に関するホルモンの効果
本例は、CGRP、アミリン、又はノルエピネフリンの処理に対応しておこる筋肉組織に放出される各遊離脂肪酸の量を記述する。全ての手順は、質量分析法によって同定することを伴い個々の遊離脂肪酸を定量するため、ガスクロマトグラフィー(GC-MS)を用いた。表5は、全脂質サンプルを分析することにより決定される、残りのヒラメ筋における全ての脂質分各の脂肪酸レベルを示す。ヒラメ筋の残りの脂肪酸組成物を決定するために、質量分析法により各脂肪酸を同定することを伴い、全ての基底の脂質サンプルはガスクロマトグラフィーにより分析された。値は平均値±S.E.M.(各点で、n＝8)である。

[0168] 表6は、ホルモンに誘起される各遊離脂肪酸の放出を示す。これは、C16:0は、ヒラメ筋において最も豊富な遊離脂肪酸であるが、ホルモンの存在下でのインキュベーションが、濃度の増加を起こさないということを示す。C16:1(n-9)の筋肉内の濃度は、アミリンで処理した際(0.013±0.0011nmol/g vs. 0.008±0.0013、P＜0.05)、CGRPで処理した際(0.013±0.0011nmol/g vs. 0.008±0.0006、P＜0.01)、ノルエピネフリンで処理した際(0.013±0.0011nmol/g vs. 0.007±0.0007、P＜0.01)減少する。

[0169] 各長鎖、ポリ不飽和脂肪酸の濃度は、ホルモン処理により増加する。筋肉内アラキドン酸(C20:4)濃度は、アミリン(0.005±0.001nmol/g vs. 0.016±0.002、P＜0.01)、CGRP(0.005±0.001nmol/g vs. 0.018±0.002、P＜0.01)、及びノルエピネフリン(0.005±0.001nmol/g vs. 0.015±0.0007、P＜0.01)で処理した際に増加する。セルボン酸もまた、全ての3のホルモンを処理した際に増加し：アミリン(0.01±0.0008nmol/g vs. 0.03±0.004、P＜0.01)、CGRP(0.01±0.0008nmol/g vs. 0.022±0.002、P＜0.01)、及びノルエピネフリン(0.01±0.0008nmol/g vs. 0.022±0.0015、P＜0.05)である。

[0170] 表7は、全脂肪酸量に比較された筋肉内の遊離脂肪酸含量のパーセンテージを示す。この表は、ホルモン処理後の利用できる遊離脂肪酸の含量の変化を示す。

[0171] 上の表3は、標準ラット固形飼料に含まれる遊離脂肪酸のレベル及び全脂肪酸レベルを示す。

例4
[0172] 高脂肪食を与えられたラットのヒラメ筋中性脂肪含量に関するアミリン、CGRP、及びノルエピネフリンの効果
高脂肪食を与えられたラットは、インシュリン抵抗性のモデルであり、2型糖尿病の研究において(通常食を与えられた動物に比較して)特に有用である。上の表4は、高脂肪食を作るために使われる脂肪の組成を示す。表8,9,及び10は、3つの高脂肪食のうち一つを与えられたラットからのヒラメ筋の各遊離脂肪酸含量を示す。図16は、高脂肪食を与えられたラットが、ヒラメ筋のインシュリン応答によって決定されるならば、インシュリン抵抗性であることを示す。インシュリン用量‐応答曲線が、通常食を与えられたラットのヒラメ筋において(黒四角)、又は高脂肪食を与えられたラットヒラメ筋において(下向き黒三角)51日で計測された。インシュリン応答は、様々なインシュリン濃度で、2時間インキュベーションの後に、D[¹⁴C(U)]グルコースの筋肉グリコーゲンへの取り込みを通して計測される。筋肉のグリコーゲンは、次に抽出され、液体シンチレーション分光測定によって、D[¹⁴C(U)]グルコースを分析される。用量‐応答曲線は、シグモイド用量‐応答アルゴリズムに適合された。結果は、平均値±SEM(各ポイントでn=12〜18筋肉片)である。面積の合計分析は、2つの曲線の間における高い有意差を明らかにした(P＜10^-5)。

[0173] 図6は、3つの高脂肪食のうち一つを与えられたラットのヒラメ筋において、中性脂肪含量に関する、3つのホルモンの効果を示す。40％の添加されたラード含む食餌を与えられたグループでは(図6A)、全ての3のホルモンは、対応するコントロールに比較すると、ヒラメ筋中性脂肪含量を有意な減少をもたらす(0.75±0.08(CGRP)、0.71±0.07(アミリン)、及び0.69±0.09(ノルエピネフリン)μmol/g vs. 1.14±0.16μmol/g、各ケースでP＜0.05)。40％のコーン油を与えられたグループでは(図6B)(0.48±0.06(CGRP)及び0.49±0.07(アミリンμmol/g vs. 0.89±0.06μmol/g、各ケースでP＜0.05)、或いは、40％のオリーブ油の場合(図6C)(0.52±0.08(CGRP)及び0.44±0.4(アミリン)μmol/g vs. 0.83±0.1μmol/g、各ケースでP＜0.05)、アミリン及びCGRPのみコントロールと比較して有意差をもたらす。

[0174] 図7は、3の高脂肪食のうち1つを与えられたラットのヒラメ筋における遊離脂肪酸含量に関して3つのホルモンの効果を示す。40％の添加されたラードを含む食餌を与えられたグループでは、アミリン及びノルエピネフリンは、対応するコントロールと比較してヒラメ筋遊離脂肪酸含量の有意な増加をもたらす(102±12(アミリン、P＜0.01)、75±7(ノルエピネフリン、P＜0.05nmol/g vs. 43±8)。CGRPは、遊離脂肪酸の増加を誘起する傾向を示すが、これはコントロールの値のとの有意差ではない(64±7nmol/g vs. 43±8)。40％コーン油を与えられたグループでは、(図7B)(75±9(アミリン、P＜0.05)及び99±17(CGRP、P＜0.01)nmol/g vs. 35±4nmol/g)、又は40％オリーブ油を与えられたグループでは、(図7C)(85±12(アミリン、P＜0.01)及び55±14(CGRP、P＜0.05)nmol/g vs. 15±3nmol/g)、CGRP及びアミリンの両者はヒラメ筋遊離脂肪酸含量の有意な増加をもたらす。

[0175] 類似のEC₅₀用量‐応答値によって示される様に、高脂肪食を与えられた動物に対するCGRP-1の投与による中性脂肪及び遊離脂肪酸の効果は、高親和性CGRP1サイトを通して起こる。図17Aは、CGRP-1が、通常食を与えられた動物からの筋肉で観測される高親和性サイトと近いEC₅₀を有する筋肉NEFA含量の用量-依存性の増加を誘起したことを示す(0.7pM±0.4から1.0；平均値±95％C.I.)。図17Bは、NEFA含量の増加に関連して、全筋肉内の中性脂肪含量の用量-依存性の減少は、通常食を与えられた動物からのヒラメ筋では観測されなかった効果であるということを示す。筋肉内中性脂肪の減少のEC₅₀(0.25pM±0.03から1.96；平均値±95％ C.I.)は、観測されるNEFA含量の増加のEC₅₀における実験誤差の範囲内で同じであった。高脂肪食を与えられた動物から筋肉における基底の中性脂肪含量は、通常食を与えられた動物からの筋肉と比較して、有意な上昇があった。この実験では、動物は、飽和脂肪(ラード)の高い食餌を、離乳期から30日間与えられた。

例5
通常食及び高脂肪食を与えられたラットからの骨格筋においてホルモンに仲介される脂質代謝の調節に関するアミリン-(8-37)及びCGRP-(8-37)の効果
A. 通常食を与えられたラットからの骨格筋における、ホルモンに仲介される脂質代謝の調節に関するアミリン-(8-37)及びCGRP-(8-37)の効果

[0176] 単離されたヒラメ筋片のin vitroの研究は、酵素的分析に基づいており、10μMアミリン-(8-37)又は10μM CGRP-(8-37)が、100nMアミリンと合わせて使われるとき、100nMアミリン単体のインキュベーションと比較して、筋肉内の遊離脂肪酸含量を各々有意に減少させる(18.5±6nmol/g vs. 216±26、P＜0.01)及び(65±8nmol/g vs. 216±6、P＜0.01)ということを示した。図3Ａ参照のこと。これらの直鎖アンタゴニストのペプチドは、両者とも最初の7つのアミノ酸を欠いており、それゆえそれらが由来するところの完全長ペプチドにより共有される相同性のNH₂末端のcys2〜cys7ジスルフィドリング構造を欠く。両者は、CGRP及びアミリンによって誘起される多くの生物的効果を逆転させ、かついくつかの異なる組織において、対応する放射線標識されたアナログに対し様々な有効性と競合する(Wang et al., 1991, FEBS Lett. 291:195-198; Chantry et al., 1991, Biochem J. 277:139-143; Beaumont et al., 1998, Am J. Physiol. 274:F51-62; Aiyar et al., 1995, J.Neurochem. 65:1131-1138; Bhogal et al., 1994, peptides 15:1383-1390; Perry et al., 1997, Endocrinology 138:3486-3496; Zimmermann et al., 1997, J.Endocrinol. 155:423-431)。アミリン-(8-37)は、CGRP-100nMがヒラメ筋遊離脂肪酸含量を増加させる能力を、100nMのCGRP単体でのインキュベーションと比較し、抑制する(34±5nmol/g vs. 334±52、P＜0.01)。図3B参照のこと。CGRPアンタゴニスト、CGRP-(8-37)はまた、100nMのCGRPにより誘起される遊離脂肪酸の増加を逆転させた(90±7nmol/g vs. 334±52、P＜0.01)。最大限に刺激をするインシュリンの添加は、100nMのアミリン(216±26nmol/g vs. 100±11、P＜0.01)又はCGRP(334±52nmol/g vs. 107±17、P＜0.01)のヒラメ筋遊離脂肪酸含量を増加させる能力を抑制する。このように、インシュリンは、両方のホルモンの骨格筋において脂肪酸の放出を誘発する効果と拮抗する。

[0177] 1pMのCGRP濃度において、100pMのCGRP-(8-37)及びアミリン-(8-37)は、ヒラメ筋の遊離脂肪酸濃度を有意に減少しうる(68±8nmol/g vs. 166±18、P＜0.01)及び(86±20nmol/g vs. 166±18、P＜0.01)。図3C参照のこと。

[0178] ^8,37アミリン及び^8,37CGRPは、つまり構成されたCGRP/アミリン受容体において競合アンタゴニストとして作用することにより、アミリン及びCGRPにより誘起される筋肉内の遊離脂肪酸の上昇を阻害できるという直接的な証拠を提供する。アミリン由来のアンタゴニスト、^8,37アミリンは、対応するCGRP由来アンタゴニスト、^8,37CGRPが示すより高いK_iであって、構成された受容体に対するK_iを示した。結合能力のおおよそ20倍の違いは、定量的にグルコース取り込みに関するアミリンの作用を^8,37CGRPがより効果的に阻害することに一致している。10nMアミリンにより仲介されるインシュリン刺激性グルコース取り込み阻害を1μM及び10μMの^8,37CGRPにより逆転されたことは、これらのペプチドの構成されたC1_ins-/ramp 1受容体に対する観測された結合親和性に一致する。このようにアンタゴニスト、^8,37CGRP及び^8,37アミリンのL6筋原細胞におけるC1_ins-/ramp1受容体に対する計測された結合親和性は、単離されたヒラメ筋におけるその相対的な作用強度に一致する。同様に、^8,37CGRPの相互反応性は、このアンタゴニストの完全に逆転する能力であって、インシュリン刺激性グリコーゲン合成のアミリンによる阻害、及びアミリンによる血中に一致する(Wang et al., 1991, FEBS Lett. 291:195-198)。アンタゴニスト作用強度のオーダー、アンタゴニストのオーダーは、CGRP及びアミリンが内在性C1_ins-/Ramp1受容体に結合を通して骨格筋内でグルコース代謝の効果を誘発するという過程に一致する。

B.CGRPの受容体アンタゴニストは、高脂肪食を与えられたラットの筋肉脂質に関するCGRP-1の効果を逆転させる。
[0179] 離乳の日齢(21日)から30日間(51日まで)高脂肪食(40％ラード)を与えられたウィスターラットからのヒラメ筋は、切除され、かつin vitroでCGRP1とCGRPアンタゴニスト、アミリン-(8-37)又はCGRP-(8-37)の存在下又は非存在下で1時間インキュベーションされた。全脂質は、抽出され、かつ定量化された。結果は、図18AのNEFA及び図18Bの中性脂肪で示される。

[0180] 通常に食事を与えられたラットでは、CGRP受容体アンタゴニストは、CGRPの効果を逆転させる。1pM又は100nMのCGRP1により誘発される中性脂肪含量の減少は、どちらのアンタゴニストの10倍モル過剰量により阻害された。高親和性CGRP受容サイトでは、100pMのアンタゴニストの濃度は、ヒラメ筋の中性脂肪及び遊離脂肪酸含量に関する1pMのCGRPの効果を回復するのに十分である。

例6
インキュベーションされたラットヒラメ筋において遊離脂肪酸含量を刺激するアミリンの用量-依存性効果
[0181] インキュベーションされたラットヒラメ筋において遊離脂肪酸含量を刺激するCGRPの用量-依存性効果
CGRP-1用量‐応答研究からのデータは、図4A及び4Bに示される。これらの研究は、CGRPがインキュベーションされたラットヒラメ筋において遊離脂肪酸含量の増加を誘発する2つの濃度範囲があることを明らかにした。最初の相のEC₅₀値は、0.25pM±(13-0.5pM[95％信頼区間])であり、対応するｒ²値0.84を有する。2つ目の相のEC₅₀値は、45nM±(8.5から95)であり、対応するｒ²値0.51を有する。CGRP-2の用量‐応答研究からのデータは図4Cに示される。本研究は、CGRP-2が異なったメカニズムの行動を有し、それが実際アミリンに類似していることを示す。EC₅₀値は5.2nM±(2.3から11.5；平均値±95％ C.I.)であり、対応する対応するｒ²値0.78を有する。

[0182] インキュベーションされたラットヒラメ筋における、遊離脂肪酸含量を刺激するアミリンの用量-依存性効果。
インキュベーションされたラット筋肉において、アミリンが遊離脂肪酸含量を刺激する用量依存性効果は、図5Aに例示される。インキュベーションメディウム内のアミリン濃度の連続的増加は、ラットヒラメ筋において遊離脂肪酸含量を増加させる。この効果のEC₅₀は、7.8nM±(4.1から14.7；平均値±95％ C.I.)であり、対応するｒ²値0.87を有する。

[0183] CGRP(100pM)の存在下でインキュベーションされたラットヒラメ筋における、遊離脂肪酸含量を刺激するアミリンの用量-依存性効果。

[0184] 図5Bは、100pMのCGRP存在下で獲得されたアミリンの用量‐応答曲線を示す。EC₅₀値は、11.6nM±(4.8〜27；平均値±95％ C.I.)であり、対応するｒ²値0.79を有する。
[0185] ホルモン処理後の骨格筋における遊離脂肪酸から利用できる計算される代謝エネルギー
表11は、ヒラメ筋をアミリン、CGRP、及びノルエピネフリンと60分処理したことに続いて、放出される遊離脂肪酸から利用できる潜在的代謝エネルギーを示す。全レベルは、GCデータから獲得される。個々の遊離脂肪酸から利用できる潜在的なエネルギーの量は、完全なミトコンドリアの脂肪酸β酸化からの潜在的なATP生産に基づいて計算された(Mathews et al., 2000, Biochemistry, 3rd Ed., Benjamin Cummings Pub. Co., California.)。これらの計算は、100％の理想的なエネルギー変換を想定している。アミリン及びCGRPにより誘起された増加した筋肉内の遊離脂肪酸の含量は、コントロールに比較して有意に大きいポテンシャルエネルギーを与える(2.73±0.28μmol/g vs. 1.97±0.31、P＜0.01)、(2.96±0.22μmol/g vs. 1.97±0.31、P＜0.01)。ノルエピネフリン処理の後の遊離脂肪酸から利用できる潜在的な代謝エネルギーは、コントロールに対し有意差がなかった(2.24±0.17μmol/g)。

例7
材料と方法
[0186] 本例は、例8〜14で記述された実験で使われた材料と方法を記述し、組換え受容体を発現する細胞の調製も含む。

[0187] ペプチド、放射化学、及び別の分析試薬
その配列がマウスのアミリンと同一であり(Cooper et al., 1994, Endocr. Rev. 15:163-201,1994)、以降「アミリン」と名づけるところのラットアミリン(lot 0538912)；ラットCGRP-1(「CGRP]；lot 501460)；ラットカルシトニン(lot ZJ375)；サーモンカルシトニン(「sCT」；lot ZM423)；^8,37ラットアミリン(lot 515439)；及び^8,37ラットCGRP-1(lot 501395)は、Bachem(スイス)から購入された。ヒトのアドレノメジュリンは以前に記述されたとおりに合成された(Heller et al., 2000, Anal. Biochem. 285 :100-104)。全てのペプチド調製品の完全度及び純度は、質量分析法により確認された。(マトリックスに補助された、レーザー脱離、イオン化、飛空時間MS、MALDI-TOF；Hewlett-Packard G2025A；4-OH-ケイヒ酸マトリックス)。可溶性ヒトインシュリンは、インシュリンアゴニストとして使われた(「インシュリン」；Actrapid 100U、Novo Nordisk)。大量合成のペプチドは、-80℃アルゴン大気下で乾燥された粉末として使うまで保存された。それらは、18MΩの2重に脱イオン化された水に溶かされストック溶液を生成し、ストック溶液は、前記の最終濃度を達成するために必要とされるだけ反応培地へ添加された。[2-³H]2-デオキシ-D-グルコース([³H]2-DOG；lot 2711-158、30.6 Ci/mmol)及びD[¹⁴C(U)]グルコース(lot 2643-217、10.6ｍCi/mmol)は、New England NuClearから購入され、D[¹⁴C(U)]ソルビトール(lot no 950314, 320mCi/mmol)は、Ameridan Radiolabeled Chemicals Inc.から購入され、及び[α-³²P]dCTPはAmersham(lot AO 25694； 3000 Ci/mmol)から購入された。全ての別の試薬は、別段の規定がない場合分析用グレードであった。

[0188] 放射線標識されたホルモンアナログの合成及び分析
CGRP、アミリン、及びsCTは、[³H]NaBH₄を用いた還元性のメチル化により放射線標識され、以前記述されたとおりに生成された(Cornish et al., 1997, Am. J. Phys 36:E1113-E1120)。³Hでラベル化されたペプチドは、ゲルろ過の次にRP-HPLCにより精製され、[³H]メチル標識の取り込みは、MALDITOF-MSによって確かめられた。計測された[³H]放射線リガンドに対する比活性は：CGRP、26.2GBq/mmol;アミリン、24.0GBq/mmol；及びsCT、23.2GBq/mmolであった。放射線リガンドは、乾燥されアルゴン大気下-80℃で貯蔵されたとき、12ヶ月以上は有効であった。

[0189] マウスramp1、マウスramp3、及び、インサートネガティブ形態のマウスカルシトニン受容体(C1 _ins- )のクローニング
分子生物学プロトコルは、記述された通りであった(Sambrook J., 1989, Molecular Cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press)。ramp1及びramp3(Genbank受入番号は、それぞれAA5444629及びAF146524)は、マウスヒラメ筋から抽出された全RNA(1μg)からRT-PCRによりクローン化された。これは、65℃で10分加熱し、ランダムヘキサマーを用いて初回反応させた。逆転写は、Expand(商標)-RTを用いて30℃10分間、次に42℃45分間行われた。反応条件は：tris-HCL(50mM)；KCl(40mM)；MgCl₂(5mM)；Tween-20(0.5％)；ジチオスレイトール(10mM)；RNase阻害剤(20U)；Expand(商標)逆転写酵素(50U)(Boehringer Mannheim)；dNTP’s(1mM)；pH8.3であった。ramp1及びramp3それぞれに対するオリゴヌクレオチドプライマーは、5-TTAGGATCCGTTGCCATGGCCCGGCTGCGGCTCCCG-3 (センス) /5-CGAGAATTCCTCATCACCCGGGATACCTA-3 (アンチセンス) 及び5-ATAGGATCCTGCCATCTTAGTTGGCCATGA-3 (センス)/5-ATAGAATTCATCCAGCAGATCCTCAAGC-3(アンチセンス)であった。アンダーラインを引いたヌクレオチドはそれぞれ、クローニングを促進するために導入されたBamHI及びEcoRI切断部位である。PCR増幅は、Eppendorf MastercyCler R gradient Thermal cyClerで、94℃(1分)、55℃(2分)、72℃(3分)を40サイクル行った。反応条件は：tris-HCL(10mM)、KCl(50mM)、MgCl₂(1.1mM)、オリゴヌクレオチド(0.5μM)、ゼラチン(0.01％w/v)、dNTP’s(200μM)、2.5U REDTaq(商標)DNAポリメラーゼ(Sigma、Saint Louis)、cDNAのテンプレート(10ng)、pH8.3であった。PCR産物は、単離され、pcDNA3.1＋(Invitogen)にBamHI及びEcoR1の制限酵素サイトを通してサブクローンされた。配列分析は、ramp1及びramp3の配列の忠実度を確かめた。

[0190] カルシトニン受容体のインサートネガティブ形態、C1_ins-(Genbank受入番号U18542)は、マウスの脳全RNAから、オリゴヌクレオチドプライマー 5-CCATCCCTGCCTGCAGATGC-3 (センス)及び 5-CTCTATTTCTAGACTGACTCCC-3 (アンチセンス)を用いたRT-PCRによりクローン化された。アンダーラインが引かれた残基は、PstI及びXbaI切断サイトのことを指し、クローニングを促進するために導入された。一方、太字の残基は、切断サイトを導くポイントミューテーションを指す。RT-PCRはElongase(商標)を用いて行われた。増幅は、94℃(30秒)、56℃(30秒)、68℃(2分)を5サイクル行い、次に94℃(30秒)、60℃(30秒)、68℃(2分)を30サイクル行われた。カルシトニン受容体C1_ins-に対応する1.9kbpのPCR産物は、pGEM-T(Promega)にサブクローニングされ、次に、EcoRI及びXbaIで切断された。C1_ins-由来の2つのフラグメント生成物は、次にEcoRI及びXbaIサイトを通したダブルクローニングステップを通してpcDNA3.1にサブクローニングされた。マウスC1_ins-配列の忠実度は、配列分析により確かめられた。我々はさらに、クローン化された産物の配列をもちいてRT-PCRクローニングを行い、C1_ins-に対応するRNAがラットのヒラメ筋において発現しており、計算結果によれば、そのRNAは主要なRNA種であることを示した(結果未掲載)。

[0191] L6筋原細胞及びCOS-7細胞へのトランスフェクション及び放射線リガンドの結合分析。
L6筋原細胞及びCOS-7細胞は、ATCCから手に入れた。両方の細胞系列は、10％ウシ胎児血清(Gibco/BRL, Gaitherburg, MD)、L-グルタミン(2mM)、ペニシリン(100U/ml； Sigma)、ストレプトマイシン(100mg/ml； Sigma)、生理食塩水(0.85％)、を添加されたDulbecco's modified Eagle's medium(DMEM;Gibco/BRL、高グルコース)で5％CO₂/95％空気下37℃で培養された。トランスフェクション前日、細胞はトリプシン処理され、6-ウェルプレート2.9×10⁵細胞/ウェルの濃さで同じ培養液中に撒かれた。トランスフェクションのため、細胞は、Qiagen(Qiagen, Valencia, CA)で精製したC1_ins-と供にramp1又はramp3を含む各プラスミド1μgとFugene試薬(6μl；Boehringer Mannheim)をOpti-Mem I メディウム(Gibco/BRL)中に含む混合液とインキュベーションされた。複合体は、血清と供に細胞へとに加えられ、それはさらに48時間インキュベーションされた。

[0192] 結合実験では、放射線リガンド(単独で又は記した放射線標識されていないリガンドの最終濃度と一緒に)は、結合実験が行われるより前に、0.1％BSA(結合緩衝液)を含むDMEMに1時間溶かされた。結合条件は、以前のタイムコース実験を元にして選択された。(データ未掲載)。細胞は、この緩衝液で2回洗われ、次に放射線リガンドが加えられた同じ液1mlと4時間室温(21℃)でインキュベーションされた。次に細胞は氷冷した結合緩衝液で2回洗われ、細胞に結合した放射性活性は、0.5M水酸化ナトリウムで2回洗われて細胞を移した後液体シンチレーション分光測定により計測された。

[0193] ノーザンブロット分析
全量のRNAは、Trizol(商標)試薬(Life Technologies)を用いて製品の説明書に従って単離された。全量RNA(5μg/レーン)は、ホルムアルデヒド/アガロースゲル(1％w/v)で電気泳動され、Nylon Hybond(商標)膜(Amersham Pharmacia Biotech)に転写され、次に、Stratalinker2400(Stratagene, La Jolla, CA)でクロスリンクされた。マウス、ramp1及びramp3cDNAハイブリダイゼーションプローブは、[α-³²P]dCTPと一緒にランダムに初回反応された。膜は、65℃で2時間、Church-Gilbert溶液(0.25Mリン酸水素ナトリウム、7％SDS、1mM EDTA）でプレハイブリダイズされ、次に65℃で一晩、同じ緩衝液に25ng/mlのラベルされたプローブを含む緩衝液でハイブリダイゼーションを行った。膜は、2×SSC、0.1％SDS、65℃で30分かけ2回洗われ、続いて1×SSC、0.1％SDS及び1×SSC、0.5％SDSで2回30分かけて洗われた。ノーザン・ブロットは、ホスフォイメージャーによって可視化された。

[0194] ヒラメ筋の調製
全ての実験は、実験動物倫理委員会に承認されたプロトコルに従い実施された。5〜6週齢のオスのウィスター・ラット(160g)は、12:12時間の明/暗サイクルを維持され、食餌と水は適宜与えられた。動物は、50mg/kgのネンブタール(ペントバルビタールナトリウム)で麻酔され、次に頚椎脱臼によって屠殺された。ヒラメ筋は、酸素を含ませたKHB(118mM NaCl, 4.75mM KCl, 1.2mM MgSO₄, 24.8mM NaHCO₃, 1.2mM KH₂PO₄, 2.54mM CaCl₂, 10mM glucose, pH 7.4)で解剖され、半分に引き裂かれ、次に下で記述されるとおりにインキュベーションされた。

[0195] 培養細胞及びヒラメ筋片におけるcAMPの決定
cAMP濃度は、6ウェルプレートに撒かれ、かつ記述された通りにトランスフェクションされた細胞において計測された。吸引に続き、細胞は、記述した結合緩衝液中のリガンド濃度の存在下において15分間室温でインキュベーションされた。イソブチルメチルキサンチン(Sigma)は、終濃度で0.5mMになるように加えられ、記述された濃度のペプチドと一緒にされ、反応は吸引により終わらされた。細胞は、0.5mlの氷冷TE緩衝液(10mM Tris/HCl,1mM EDTA,pH7.6)で洗われ、すばやくエッペンドルフチューブ内の同じ緩衝液1mlに移され、次に5分間沸騰された。4℃、12,000g、5分間の遠心に続いて、氷上で冷やされ、2つに分けた50μlの一定量が、競合結合に基づいたアッセイシステム(Amersham Pharmacia)を用いて製品の説明書に従ってcAMPを分析された。

[0196] 筋肉中のcAMPを計測するために、単離されたヒラメ筋片は、前記の濃度のペプチドとインキュベーションされ、次に脂肪分解され、タンパクが除かれた。各片は、5mM EDTA(ホスホジエステラーゼ阻害剤)を有する0.5M HCLO₄の400μl中に置かれ、20秒で3回超音波処理された。チューブは沸騰した水中で3〜5分熱せられ、タンパク質を凝集させ、次に遠心された(12,000g、4℃、2分)。上清(300μl)が取られ、75μlの2M NH₄OHで、pHは7.0へと調節された。タンパク質を沈殿させるため、サンプルは冷蔵され(4℃、2時間)、次に上と同じ条件で遠心され、50μlがcAMPの計測に取られた。

[0197] インキュベーションされたヒラメ筋片におけるグルコース輸送の割合の決定
4〜5筋肉片は、10ml DMEMを含む各フラスコへ加えられた。筋肉片は、振盪水浴において30℃で30分間、示した通りにホルモンとプレインキュベーションされ、その後5μlの2[³H]DOG(0.5μCi/ml)及び5μlのD[¹⁴C(U)]ソルビトール(0.05μCi/ml)が添加され、次にさら30分間インキュベーションされた。インシュリンのフラスコへの非特異結合を防ぐため、RIAグレードのBSAが0.9％(w/v)になるよう添加された。インキュベーションに続いて、筋肉片は、超過の[³H]DOG及び[¹⁴C]ソルビトールを取り除くため、氷冷されたKHBに5〜10分間移された。それらは、次にブロットされ、凍結され、腱が切除され、次にさらに48時間凍結乾燥された。筋肉は、次に重さを測られ、シンチレーションバイアルに移され、0.5mlの1M NaOHで60℃1時間分解された。シンチレーション液(4ml)は各バイアルに添加され、サンプルはベックマン液体シンチレーション分光器で計測され、¹⁴Cと³Hのチャンネルを同時にカウントするようにセットされた。サンプルに存在する各アイソトープの量は、決定され、細胞外領域及び細胞内の[³H]DOG濃度計算するために使われた。細胞内[³H]DOGの増加、筋肉グルコースの取り込みの計測は、細胞外領域[³H]DOGの濃度から対応する全筋肉[³H]DOGを引くことにより計算され；細胞外[³H]DOGは筋肉の[¹⁴C]ソルビトール濃度を測る事により定量化される。

[0198] 単離され、インキュベーションされたヒラメ筋のグリコーゲン代謝の計測
D[¹⁴C(U)]グルコースの筋肉グリコーゲンへの取込みを計測するために、筋肉片は、DMEM中で30分間プレインキュベーションされ、続いて23.7nMインシュリンの存在下又は非存在下で2時間0.5μCi D[¹⁴C(U)]グルコース及びアミリン、CGRP又はsCTの前記濃度で、供にインキュベーションされた。筋肉片は、即座に凍結され、凍結乾燥され、重量が測られ、次に60％(w/v)水酸化カリウムで溶解し(乾燥筋肉5mg/0.4ml 10.7M水酸化カリウム)、45分間70℃で時々攪拌された。グリコーゲンは96％エタノール(1.2ml)を加え-20℃で一晩置き、次に8000g(15分、4℃)で遠心することにより沈殿された。ペレットは、同じ量のエタノールで2回洗われ、次に水(0.6ml)に溶解された。一定量(0.3ml)は、液体シンチレーション分光器により、D[¹⁴C(U)]グルコース含量を分析された。

[0199] 全グリコーゲン含量は、乾燥とそれに続く0.2M酢酸ナトリウム/酢酸緩衝液(pH4.8)中のアミログルコシデース(Sigma)20U/100mlを用いてグリコーゲンをD-グルコースへと加水分解することによって、そして、μmol「グルコシル」units/g 乾燥筋肉重量を明示することにより、筋肉片中で計測される。上清における遊離グルコースは、D-グルコース酸化酵素を固定化した酵素化学を用いて、グルコース/乳酸分析器(YSI 2300STAT、Yellow Springs Corporation)で計測された。

[0200] データ分析
一元配置分散分析、デュネットの多重比較検定、及び独立スチューデントのｔ検定が、適切なものとして、統計的有意差を計算するために使われた。用量‐応答曲線は、以下の様にシグモイド用量‐応答アルゴリズムに適合させた：Y=最小値＋(最大値-最小値)/(1＋10 log₅₀ ^(EC-X))を2-DOG取り込みへ；及び4のパラメーター論理モデル、Y＝最小値＋(最大値-最小値)/(1＋10 log₅₀ ^{(EC-X)Hill-Coefficient})全量のグリコーゲン及び[¹⁴C]グルコース取り込みに対してである。計算は、最大半減有効濃度値(EC₅₀)を引き出すために、Prism v2.0(GraphPad Software, San Diego, CA)を用いて行われた。トランスフェクションされた細胞で放射標識された結合したリガンドを非放射線のリガンドと競合し導いた置換曲線は、Prism v2.0を用いて、競合が適合するサイトに従い計算された。

例8
[0201] マウスramp1及びC1 _ins- をコトランスフェクションされたL6筋原細胞に対する放射線標識されたリガンドの結合
アミリンに応答する受容体が出現することは、カルシトニン受容体のインサートネガティブアイソフォーム、C1_ins-、がramp1又はramp3のヒトアイソフォームと共発現された場合について、以前報告されてきた(Muff et al., 1999, Endocrinology 140:2924-2927; Christopoulos et al., 1999, Mol. Pharmacol. 56:235-242)。ここで、対応するマウス受容体のアイソフォームであって、マウスramp1及びマウスC1_ins-がL6(マウス)筋原細胞にコトランスフェクションされたときに構成されたアイソフォームの性質を計測した(図8)。ベクターのみ(図8A)、ramp1のみ(図8B)、又はC1_ins-のみ(図8C)をトランスフェクションされた細胞では、アミリンの有意な比結合は検出されなかった。一方sCTは、ramp1のみがトランスフェクションされた細胞において、低いが、有意な比結合を示した(図8B)。アミリンではなくsCTが、がC1_ins-のみがトランスフェクションされた細胞に対し有意な結合を示した(図8C)。その一方逆に、アミリン及びsCTの両方の比結合の有意な増加は、ramp1及びC1_ins-コンストラクトがコトランスフェクションされたときに起こった(図8D)。タイムコース実験は、[³H]アミリンの結合が平行に達するために必要なインキュベーション期間を確立した(結果未掲載)。

例9
トランスフェクションされたL6筋原細胞からの結合した[ ³ H]アミリンの置換
[0202] CGRP-1及びアミリンは、特異的に結合した[³H]アミリンを、近いK_i及びEC₅₀値を有するC1_ins-及びramp1でコトランスフェクションされたL6筋原細胞から置換される(図9A)。この発見は、両者のペプチドが細胞表面上の単一分子サイトへの結合に競合することに一致する。対照的に、sCTは、高親和性及び低いK_iを有しており、その高い結合割合に一致している(表12；図8C及びD)。ラットカルシトニン及びヒトアドレノメジュリン、このペプチドファミリーの第5メンバーの代表は、アミリンがトランスフェクションされた細胞へ結合することに非常に弱く競合する(図9Ａ)。全長ペプチドの類似の結合特性に対照的に、結合親和性の有意差は、アンタゴニストとして作用する直鎖の切断されたペプチド、^8,37アミリン及び^8,37CGRPとの間で観測された。^8,37CGRPは、それらの細胞への結合のK_iでは^8,37アミリンに比較し、おおよそ20倍低いK_i値を示した。計測されたＩC₅₀及び求められたK_i値は表12に要約される。

[0203] 本研究におけるラットアミリンに対するK_i値は、[³H]アミリンに対する飽和実験から出てきたK_d値と近い(9.2±0.2nM、平均値±S.E.M；Bmax＝1.5pMol/ウェル)。これらの観察は、[³H]メチル化されたリガンドにおける完全な機能の保持と一致する。

例10
トランスフェクションされたL6筋原細胞において、CGRP及びアミリンに誘発されるcAMP産物に関するペプチドアンタゴニストの効果
[0204] ペプチドに誘起されるシグナル伝達のアンタゴニストとしての役割を調査するために、CGRP及びアミリンにより誘発されるcAMP生産に関する^8,37CGRP及び^8,37アミリンの効果が、構成されたramp1/C1_ins-受容体表現系について研究される(図10)。CGRP及びアミリンの両者は、コトランスフェクションされた筋原細胞ではcAMP生産の用量依存的な増加を誘発するが、この反応の規模は、全ての研究された濃度のおいて、アミリンにとって顕著に少ない(図10A及びB)

[0205] 5μM ^8,37CGRPは、実験した全ての濃度(10pMから100nM；図10A)におけるCGRPによって誘発されるcAMPの上昇を無効にした。この濃度は、受容体を飽和するのに十分であり、CGRP及びアミリンの計測されたK_i値より約250倍大きい。CGRPのK_i値と^8,37CGRPのK_i値との類似性に一致して、アプライされた高濃度のCGRP(100nM)は、^8,37CGRPの50倍超過量(5μM)によって効果的に競合された。対照的に、しかしながら、5μM^8,37アミリンは、アミリンのアンタゴニストとしては有意に効果的でなく、cAMPの中度の減少だけを誘起する(図10B)。

例11
ramp3及びC1 _ins- のトランスフェクションに続いて、細胞に対する放射線標識リガンドの結合
[0206] マウスramp3及びC1_ins-を筋原細胞にコトランスフェクションすることは、用いた放射線リガンドとの有意な比結合をもたらさない(結果未掲載)。COS-7細胞のコトランスフェクションは、以前に[¹²⁵I]-ラットアミリン又は[¹²⁵I]-ヒトアミリンのC1_ins-/ramp1及びC1_ins-/ramp3ヒト受容体アイソフォームに対し結合することを報告した(Muff et al., 1999, Endocrinology 140:2924-2927; Christopoulos et al., 1999, Mol. Pharmacol. 56:235-242)。我々は、そういった細胞において、対応するマウスアイソフォームに関し比較の研究を行った。我々のC1_ins-/ramp1のコトランスフェクションの結果は、公表されている結果と同様であった(図11AからC)。しかしながら、L6筋原細胞における我々の結果に一致して、マウスのC1_ins-/ramp3でのトランスフェクションは、比結合をもたらさなかった。COS細胞でramp3のコンストラクトからの転写は、ノーザン分析によって確かめられた(図12右)。しかしながら、転写産物は、ramp1に対応する転写量より低かった(図12左)。しかしながら、ramp-3プラスミド由来の転写効率の変化は、このシステムで観測されない(データ未掲載)。トランスフェクトされていないCOS-7細胞は、少ないが十分な内在性の3つ全ての[³H]ペプチドに対する比結合を示し、低いレベルの共通の受容体を発現しうることを示す。実に、RT-PCRは、L6及びCOS-7細胞の両者がC1_ins-を発現することを明らかにし、観測された結合親和性の違いは、内在性のramp1又はramp3の発現の変化によるものでありうる)いうことを示した。

例12
ヒラメ筋のcAMP濃度に関するCGRP及びアミリンの効果。
[0207] 骨格筋におけるCGRP/アミリンのシグナルとcAMP代謝との間の関係は、議論の余地が有り、異なる報告された研究間に不一致があることが部分的には原因である。初期の仕事は、アミリンは骨格筋のcAMP含量に影響を与えず、cAMPに独立したシグナルメカニズムの存在に一致することを示唆した(Deems et al., 1991, Biochem. Biophys. Res. Commun. 174:716-720; Kreutter et al., 1993, Am. J. Physiol. 264:E606-613)。これらの発見は、アミリンによる、骨格筋におけるcAMP及びアデニル・シクラーゼ活性の強い刺激を報告する別の報告と対照的になる。(pittner et al., 1995, Biochimica Biophys. Acta 1267:75-82)。

a)ナノモル濃度のCGRP及びアミリンは、代謝性アミリン受容体を通したcAMPの生産を誘発する。
[0208] ここで、ヒラメ筋においてcAMPの産出に関するCGRP(図13A)及びアミリン(図13B)のin vitroでの効果は、計測され、C1_ins-/ramp1をコトランスフェクトされた細胞におけるcAMP生産に関するその効果と比較された(図10A及びB)。ヒラメ筋におけるcAMP濃度に関するアミリンの効果は、アミリンを添加した後5分で最大になることが示され(2倍の増加P＜0.01、データ未掲載)、単離され、還流された心臓におけるイソプロテレノール(β-アドレナリン作用性アゴニスト)に対する応答の以前報告されたタイムコースと比較することができる。CGRPは、5nM及び100nMで、インシュリン23.7nMの存在又は比存在下のどちらにおいても筋肉のcAMP含量を有意な増加を誘発した(図13A)。アミリンは、10nM又は100nMで加えられたとき(図13B)、cAMP含量の約2倍の最大限増加を誘起し；この効果の規模は、インシュリン(23.7nM)の存在下又は非存在下で異ならない。ピコモル濃度のアミリンは、筋肉cAMPレベルに効果を持たず、アミリン及びCGRP-1の活性の違いを例示する(図13C)。

[0209] CGRP及びアミリンの生物学的効果は、C1_ins-/ramp1をトランスフェクションされたL6筋原細胞において、cAMPを刺激する効果に一致する(図10)。さらに、競合性アンタゴニスト、^8,37アミリンによるアミリンに仲介されるcAMP刺激の抑制は、アミリンが、C1_ins-/ramp1受容体を通した生理的な筋肉の効果を誘起するという視点と一致する。

b)ピコモル濃度のCGRP1は、高親和性受容体を通したcAMPの産出を誘発する
[0210] 通常食を与えられた動物からのヒラメ筋では、100nMのCGRP(6.9±0.8 vs. 3.9±0.2pmol/mg、P＜0.01)及びアドレナリン(9.6±0.7 vs. 3.9±0.2pmol/mg、P＜0.01)は、cAMPの有意な増加を誘起した。CGRP-(8-37)(4.8±0.2 vs. 6.9±0.8pmol/mg、P＜0.01)又はアミリン-(8-37)(2.9±0.1 vs. 6.9±0.8pmol/mg、P＜0.01)の10倍モル超過は、この増加を逆転させた。1pM CGRPとの1時間のインキュベーションの後、cAMPの有意な増加は観測されなかった。図19A参照のこと。

[0211] 高脂肪食を与えられた動物から単離されたヒラメ筋では、100nM CGRP1(9.3±1 vs. 5.7±0.2pmol/mg、P＜0.001)はまた、cAMP含量の有意な増加を誘起し、それは10倍過剰量のアミリン-(8-37)(4.3±0.8pmol/mg；P＜0.001)又はCGRP-(8-37)(5.4±0.4；P＜0.001によって逆にされる。しかしながら、通常食を与えられた動物からのヒラメ筋とは対照的に、1pM CGRPとのインキュベーションは、有意にcAMP含量を増加させる(8.6±0.4 vs. 5.7±0.2pmol/mg、P＜0.001)。10モル超過量のアミリン-(8-37)又はCGRP-(8-37)は、この増加を8.6±0.4pmol/mgから4.4±0.4pmol/mg(P＜0.001)及び4.7±0.5pmol/mg(P＜0.001)へとそれぞれ逆にした。図19B参照のこと。

[0212] 通常食と高脂肪食を与えられた休んでいるヒラメ筋との間で、基底のcAMP含量における有意差がある。(5.7±0.2 vs. 3.9±0.2pmol/mg、P＜0.01)

例13
アミリンに仲介されるグルコース輸送の抑制に関する競合アンタゴニストの効果
[0213] ヒラメ筋における基底の及びインシュリン刺激性のグルコース輸送に関するアミリン(10nM)の効果は、2DOGを30分のインキュベーションの後に計測され、表13に報告される。インシュリンは、グルコース取り込みを3.2倍刺激する(P＜0.01)一方で、アミリンのみの処理は、グルコース取り込みに有意に影響しなかった。対照的に、アミリン(10nM)は、インシュリン刺激性グルコース取り込みを31％に減少させ、基底から有意差がない値にする。

[0214] ^8,37アミリン及び^8,37CGRPは、CGRP及びアミリンの効果を様々な組織で拮抗する。(Cooper, 2001, in Handbook of Physiology. Section7: The endocrine system VolumeII: The endocrine panceas and regulation of metabolism(Jefferson, LScherrijgton,A D, eds.), Oxford University Press)。ここで、ヒラメ筋片は、in vitroでアミリン(10nM)およびインシュリン(23.7nM)とプレインキュベーションされ、さらに前記最終濃度の^8,37アミリン又は^8,37CGRPが加えられた(図14)。^8,37CGRPは、1μM及び10μMの濃度では、アミリンのインシュリン刺激性グルコース取り込みに関する阻害性効果を19.5±3.6nmol/g乾燥筋肉重量/分(n=5)から30.4±3.0(n=4、P＜0.05)まで効果的に拮抗した(図14A)。対照的に、^8,37アミリンは、10μMであっても、アミリンに仲介されるグルコース取り込みの抑制に関して有意な効果を与えない(図14B)。

例14
ヒラメ筋におけるグリコーゲン代謝に関するCGRP及びアミリンの効果の比較
[0215] 以前の実験は、全グリコーゲン産物及びD[¹⁴C(U)]グルコースのグリコーゲンへの取り込みが、単離されたヒラメ筋において23.7nMのインシュリンで最大になることを確立した(結果未掲載)。CGRP、アミリン、及びsCTの濃度増加の、全グリコーゲン含量に対する効果は、インシュリンのこの濃度での存在下又は非存在下で、2時間のインキュベーションの後で、計測される(図15)。グリコーゲン含量に対する濃度-反応曲線は、10nMアミリンが、全グリコーゲン含量において、基底の割合90.8±3.7μmol/g乾燥筋肉重量/時間(n＝15)から65.6±9.1(n＝4；P＜0.05)までの有意な減少を誘起することを示した。10nM CGRPにおいて、グリコーゲン含量における類似の減少もまた、71.4±7.7μmol/ｇ乾燥筋肉重量/時間にまで見られたが、この差は、統計的有意差にはいたらなかった(n＝4、p＝N.S.)。インシュリンの存在下では、両ペプチドの阻害的効果は、より明白であった(図15B)。10nMアミリンの処理は、全グリコーゲン含量を138±4.8μmol/g乾燥筋肉重量/時間(n＝12)から86.7μmol/g乾燥筋肉重量/時間(n＝4；P＜0.01)まで減少させた。対照的に、10nMのCGRPのインキュベーションは、113±6.9μmol/g乾燥筋肉重量/時間(P＝N.S.)にまでしかグリコーゲン含量を減少させなかった。筋肉グリコーゲン含量に関するアミリンの最大効果は、CGRPの効果より明白である。sCTのグリコーゲン含量に対する効果は、CGRPの効果と有意差はない(図15A及びB)

[0216] D[¹⁴C(U)]グルコースのグリコーゲンへの取り込みの割合は、骨格筋において新規のグリコーゲン合成の測定である。D[¹⁴C(U)]グルコースは、ペプチドと一緒にインキュベーションメディウムに添加され、2時間のインキュベーションに続いて、グリコーゲンへの取り込みの割合が筋肉片において計測された。インシュリン非存在下で10nMアミリンの処理は、グルコース取り込みの割合を、4.8±0.3μmol/g乾燥筋肉重量/時間(n＝16)から2.7±0.8(n＝5、P＜0.01；図15C)まで減少させる。同様に、10nMのCGRPは、グルコース取り込みの、2.8±0.3(n＝7、P＜0.01)までの減少を誘起した。最大限インシュリンの存在下において、10nMのアミリンは、放射線標識されたグルコース取り込みを、27.6±1.4(n＝11)から16.0±2.5(n＝4、P＜0.05)まで減少させた(図15D)が、一方、同じCGRPの濃度は、グルコース取り込みを13.7±0.7μmol/g乾燥筋肉重量/時間(n＝4、P＜0.01)まで抑える。インシュリンの非存在下では、sCTに対する応答は、CGRP又はアミリンに対する応答より有意に強い(図15C)が、一方、インシュリンの存在下では、sCT応答は、CGRPの応答と等しい(図15D)。3のペプチド全てによって誘起されるグルコース取り込の計測された減少は、筋肉グリコーゲン含量を減少させる条件下で起こり、それゆえラットのグリコーゲン合成割合の減少を示す。

[0217] EC₅₀値及び95％C1(信頼区間)は、濃度-反応曲線(表14)から得られた。インシュリンの存在下では、アミリンは、他の二つのペプチドと比較して有意に弱い。グリコーゲン合成の最大阻害の点に関してペプチド間における有意差が観測された。これらの発見は、受容体のサブタイプ間にいくつかの不均一性があり、その不均一性を通し、3つのペプチドは生理的骨格筋においてグリコーゲン合成の最大阻害を誘起するということを示す。

[0218] これらの実験は、代謝性アミリン受容体の特徴を有する受容体が、カルシトニン受容体(インサートネガティブ形態)[C1_ins-]をramp1とL6筋原細胞又はCOS-7細胞へとコトランスフェクションフェクションすることにより構成されることを示す。この受容体はCGRP、アミリン、及びsCTの強い特異的な結合を構成し、及びCGRP及びアミリンにより、シグナル伝達を構成する。対照的に、ラットカルシトニン及び人アドレノメデュリン、CGRP/アミリンペプチドファミリーの更なる代表は、この受容体にずっと低い結合親和性を持つ。上の例に示すように、これらのペプチドの再構成された受容体に対するリガンドとしての生理効果は、単離されたラットヒラメ筋であって、これらのペプチドの知られている医薬の標的組織の一つであるヒラメ筋における作用と比較された。ペプチドリガンドのC1_ins-/ramp1受容体における計測された結合親和性は、無処理の骨格筋におけるグリコーゲン合成を阻害する各々のEC₅₀値と同じ相対量の順番を有する。このアゴニストの順番は、sCT＞CGRP＝アミリン＞＞ラットカルシトニン、ヒトアドレノメジュリンである。CGRP及びアミリンのこの受容体に対する同様の親和性は、それらのペプチドのcAMPを刺激に対する同様のEC₅₀値と適合性がある。組織分配研究は、C1_ins-は、ラット骨格筋においてCalcrから転写される主な分子であることを示した。これらの結果は、骨格筋のC1_ins-/ramp1受容体のアゴニストとしての作用により、CGRP及びアミリンに誘起されるグリコーゲン合成阻害に一致する。別のCGRP受容体サブタイプは、分子のレベルで特徴付けられてきており、それは、rampコンストラクトとC1_ins-又は関連するG共役受容体、カルシトニン受容体様受容体、つまりCRLRをコトランスフェクションフェクションすることにより構成される。(MClatchie et al., 1998, Nature 393:333-339; and Buhlmann et al., 1999, Endocrinology 140:2883-2890)参照のこと。

[0219] インシュリン作用のアンタゴニストとしてのラットCGRP-1及びアミリンの作用は、高脂肪食を与えられたラットから単離されるヒラメ筋において行われた。高脂肪食を与えられた筋肉における脂質含量に対する効果は、望ましくないアンタゴニストによって脱共役されるということが示されている高脂肪食を与えられた筋肉において、インシュリン作用の非競合的アンタゴニストとしてのCGRPに作用強度に変化がないことは、インシュリン刺激されるグルコースのグリコーゲンへの取り込みに影響するということがこれらの実験により示される。

例15
通常の食を与えられたラットにおいて急激なCGRPの注入(1時間)の後における、組織脂質及び代謝に対する効果
方法
外科手術
[0220] 実験は、オスのウィンスターラットにおいて行われた。動物は、以下に概要されるとおりに実験グル-プへと割り当てられた。3〜5％のハロタン及び2L酸素によって外科的麻酔は導入され維持された。最初の血液サンプルは、血液グルコース及び乳酸、電解質、酸塩基、及び酸素状態の基底のレベル、並びに遊離脂肪酸、中性脂肪、及びコレステロールの血清レベルを計測するため、尻尾の動脈から取られた。このすぐ後に、気管はカニューレ処置され、動物は、酸素を補われた空気を60〜70呼吸/分で人工呼吸された。呼吸数及び、吐息圧(10〜15cmH₂O)は、調節され吐息のCO₂は35〜40mmHgになるように調節された。体温は、温板を用いて手術及び実験を通し37℃に維持された。頚動脈及び頚静脈は、固体の血圧トランスデューサー及び生理食塩水で満たされるPE50カテーテルを用いてカニューレ処置された。アンタゴニスト注入研究のため、手術は上記と同じようであり、頚動脈及び頚静脈の両方が、生理食塩水を満たしたPE50カテーテルを用いてカニューレ処理されるという変更を伴った。液体(生理食塩水又は生理食塩水に溶かしたホルモン)は、2つの管を合わせるためのYコネクタを用いて静脈へと送られた。動脈管は、血圧トランスデューサーに結び付けられた。血液サンプルはこの管から、0(基底)、30分、及び20分毎に実験の終了する90分までにおいて採取された。

[0221] 輸液
手術及び少なくても15分の安定化期間の後に、動物は、生理食塩水(コントロール)又はCGRP(100pmol・kg^-1・分^-1、Bachem)を、1ml・H^-1で1時間の割合で輸液された。この注入は、見積もられる溶液の損失を置き換えるために154mmol/L NaCl溶液を3.3ml/kg/ｈｒの割合で静脈投与により補われた。血液グルコースの計測は、尻尾の細管から5分の間隔を置いて、実験の期間を通し行われた。輸液の終わりでは、最後の血液サンプルは、心臓穿刺により取られ、並びに基礎のサンプルごとに様々な代謝及びホルモンについて分析された。血清及び血漿サンプルは、-80℃で将来の分析のときまで貯蔵された。動物は、頚椎脱臼で殺し、組織を取り(脳、肝臓、腎臓、ヒラメ筋、長指伸筋、左心室、腹膜後部の及び精巣上体の脂肪部)、液体窒素で急激に凍結され、-80℃で将来分析するときまで貯蔵された。アンタゴニストの研究では、プロトコルは以下の変更を持つ上記と同じ物であった：輸液は、アンタゴニスト、CGRP又は生理食塩水の組み合わせであった。動物は、アンタゴニスト又は生理食塩水を、最初の30分間、1ml/kg/hの割合でうけ、CGRP又は生理食塩水を適切に含む2つ目のラインが、再び1ml/kg/hの割合で始まった。

[0222] 平均動脈圧(MAP)、心拍数(HR、MAPの波形から派生される)酸素飽和度(Nonin 8600VPulse Oximeter)、及び中心体温は、PowerLab/16sデータ獲得モジュールを用いて実験を通じて継続的にモニターされた。較正されたシグナルは、スクリーンに映し出され、各変動の2秒平均として保存された。

結果
[0223] CGRPの注入は、血漿中、肝臓中、及びヒラメ筋中の脂質含量に特定の効果をもたらす。
麻酔された動物における100pmol/kg/hの投与量でのCGRPの注入は、生理食塩水を投与されたコントロール動物と比較して、血漿CGRPの増加をもたらした(6.3±0.8コントロール vs. 325±75 p;P＜0.01)(表15)。インシュリン、アミリン、エピネフリン、及びノルエピネフリンの有意な濃度変化はなかった。

[0224] 生理食塩水の注入(-0.1mmol/Lコントロール vs. 0.4mmol/L、P＜0.01)に比較して血漿遊離脂肪酸濃度の有意な増加は、CGRP注入で観察された(表16)。対照的に、CGRPアンタゴニスト、(CGRP-(8-37)は10nmol/kg/ｈの投与量で、遊離脂肪酸レベルの有意な減少を導き(-0.1mmol/Lコントロール vs. -0.3、P＜0.05)、アンタゴニストが内在性CGRPペプチドの活性を防ぐことができることを立証した。注入のタイムコースの間、CGRPは血漿中性脂肪の減少を誘起し(0.2mmol/Lコントロール vs. -0.7mmol/L、P＜0.01)、一方、アンタゴニストは反対の効果を示し、中性脂肪レベルを90分の注入の間有意なレベルまで増加させた(0.2mmol/Lコントロール vs. 0.9mmol/L、P＜0.01)。両ペプチドの組合せ(CGRP-(8-37)90分間＋CGRP60分間)は、コントロールのレベルに比較して血漿遊離脂肪酸又は中性脂肪含量に変化をもたらさなかった。

[0225] アンタゴニスト、CGRP-(8-37)の存在下又は非存在下におけるCGRPの注入に続く組織脂質の分析は、ヒラメ筋及び肝臓で特定の効果を明らかにした(表17)。心臓、精巣上体の脂肪、又は腎臓において、中性脂肪及び遊離脂肪酸含量の有意な変化は起こらなかった。CGRP注入は、ヒラメ筋及び肝臓において、遊離脂肪酸の有意な上昇及び中性脂肪含量の減少をもたらした。対照的に、アンタゴニストのみの注入は、これらの脂質に関し逆の効果をもたらし、内在性CGRPの作用の阻害を示した。CGRPをアンタゴニストと一緒に注入することに続いて、脂質含量の有意な変化はなかった(表17)。

例16
CGRP100pmol/kg/hの投与量のCGRP注入は、糖代謝及び血管拡張の効果を誘起する。
[0226] 例15に記述したCGRPの60分間注入の間、動脈圧の平均値の減少があり、動脈圧は最後の10分間、有意な下落に達した(図20)。同様に、CGRP注入はまた、血液グルコース濃度の有意な増加をもたらす(図21)。CGRP及びそのアンタゴニスト、CGRP-(8-37)の組合せはまた、コントロールの動物)比較したとき、血液グルコースの増加をもたらす。乳酸レベルは、コントロールレベルと比較しCGRP注入の間増加した(0.3mmol/L vs. 1.7mmol/L、P＜0.01)、及び再びアンタゴニストはそのアゴニストに対する反対の効果を示し、少量の減少(0.3mmol/Lコントロール vs. 0.02、P＜0.05)を伴った。アンタゴニストは、乳酸レベルの関連する変化を伴わず、CGRPによってグルコース濃度の増加を防ぐことができた(0.3mmol/L生理食塩水 vs. 0.4mmol/L、P=NS)。

[0227] 例15及び16の実験は、100pmol/kg/hrの注入に達するCGRPの投与量が乳酸及びグルコース産物、脂質代謝、及び血管拡張に対する効果を十分に誘起するということを示す。300pMのCGRP-1血清濃度は、100pmol/kg/hrを投与された動物で観測され、注入期間の間定常状態の濃度を示した。(in vivoにおけるCGRP-1の浄化半減時間を10分と想定するなら、この濃度は、2〜3の半減期間、つまり20〜30分の後に達成される。)これよりも低い血清濃度をもたらす投与量は、代謝性アミリン受容体の活性下の効果を起こすことなく、低親和性受容体を活性化するのに有用である。

例17
マソプロコル、不飽和脂肪酸酸化酵素阻害剤は、ヒラメ筋において、筋肉脂質含量に関するCGRP-1に誘起される効果を逆転させる。
[0228] マソプロコル、(ノルジヒドログアヤレチック酸)は、不飽和脂肪酸酸化酵素阻害剤であり、クレオソート・ブッシュの抽出物の活性成分として同定されてきている。この化合物の経口投与は、フルクトースが引き起こした高中性脂肪血症を有するラットにおいて、血清NEFA及び中性脂肪濃度を減少させ(Gowri et al. 2000, Am. J. Physiol. 279: E593-E600)、かつ高脂肪食/ストレプトゾシンを与えられたラットモデルにおいて、血液グルコース及び中性脂肪濃度を減少させる(Reed et al. 1999, Diabetologia 42: 102-106)。マソプロコルは、脂肪細胞においてホルモン感受性リパーゼの阻害を通して、その抗脂肪分解作用を発揮することを示されてきた(Gowri et al., 2000, Am. J. PHysiol. 279: E593-E600)ので、高脂肪食を与えられたラットからのヒラメ筋において、NEFA及び中性脂肪含量に対する効果であって、CGRP-1に誘起される効果は、調べられた。ヒラメ筋片を50μMマソプロコルのみとインキュベーションすることは、NEFA(74±30nmol/g 基底 vs. 55.77±21.08mmol/g)(A)又は中性脂肪(3.9nmol/ｇ基底 vs. 4.5±0.9mmol/ｇ)(B)含量に有意な効果を持たなかった。しかしながら、マソプロコルは、100nM CGRP1(533±114nmol/g；P＜0.001)及び1pM CGRP1(482±99nmol/g；P＜0.05)によってNEFAの上昇を完全に逆転させた。同様に、マソプロコルは、100nM CGRP1(1.2mmol/g±0.3mmol/g；P＜0.05)及び1pM CGRP1(1.2mmol/g±0.1nmol/g；P＜0.05)により、ヒラメ筋中性脂肪含量の減少を完全に逆転させた。

[0229] 本明細書中に記述される例及び態様は、例示の目的あり、及び本明細書中の例及び態様を鑑みれば、様々な修飾又は変化は、当業者に明らかであり、本出願の範囲及び特許請求の範囲に含まれべきであるということは理解される。本明細書中で引用される全ての刊行物、特許、特許出願、及び受入番号(本出願及び/又は優先権を主張する出願日付けのポリヌクレオチド及びポリペプチド配列並びに対応するアノテーション)は、各刊行物、特許、特許出願が、特に及び個々に援用されるのと同じ程度に、全ての目的のためにそれら全てを本明細書中に援用する。

[0029]図1は、本研究で使用されたペプチドのアミノ酸配列を示す。使用されたペプチドは、ラットのアミリン、ラットのCGRP-1(CGRP1)、ラットのアミリン-(8-37)及びヒトCGRP-(8-37)である。全てのペプチドは、2番目と7番目のCys残基との間で分子間ジスルフィド結合を有する。カルボキシ末端における「NH₂」は、ホルモンのアミド化を示す。

[0030]図2Aは、アミリン、CGRP、ノルエピネフリン、及びインシュリンの筋肉の遊離脂肪酸含量に対する効果を示す。ヒラメ筋は、KHB緩衝液(コントロール)、100nMアミリン又はCGRP-1、4.4μMノルエピネフリン、又は23.7nMインシュリン中で1時間インキュベーションされた。数値は平均値±S.E.M(各群で、n＝8)。＊コントロールに対する有意差(P＜0.05)。＊＊コントロールに対する有意差(P＜0.01)。

[0031]図2Bは、アミリン、CGRP、及びノルエピネフリンの筋肉のグリセロール含量における効果を示す。ヒラメ筋は、KHB緩衝液(コントロール)、100nMアミリン又はCGRP-1、又は4.4μMノルエピネフリン中で1時間インキュベーションされた。数値は平均値±S.E.M(各群で、n＝8)。＊コントロールに対する有意差(P＜0.05)。＊＊コントロールに対する有意差(P＜0.01)。

[0032]図2Cは、アミリン、CGRP、及びノルエピネフリンが筋肉の中性脂肪に影響を与えない実験を示す。ヒラメ筋は、KHB緩衝液(コントロール)、100nMアミリン又はCGRP-1、又は4.4μMノルエピネフリン中で1時間インキュベーションされた。数値は平均値±S.E.M(各群で、n＝8)。

[0033]図3Aは、アミリン-(8-37)、CGRP-(8-37)、及びインシュリンの筋肉内遊離脂肪酸を増加させるアミリンの能力に対する効果を示す。ヒラメ筋は、KHB緩衝液(コントロール)、100nMアミリン、10μMアミリン-(8-37)(A/A)又はヒトCGRP-(8-37)(A/C)を有する100nMアミリン、10μMアミリン-(8-37)(A-8-37)或いは100nMアミリン＋23.7nMインシュリン(A＋I)中で1時間インキュベーションされた。数値は平均値±S.E.M(各点で、n＝7)。＊＊コントロールに対する有意差(P＜0.01)。

[0034]図3Bは、アミリン-(8-37)、CGRP-(8-37)、及びインシュリンの、筋肉内遊離脂肪酸を増加させるCGRP-1の能力に対する効果を示す。ヒラメ筋は、KHB緩衝液(コントロール)、100nM CGRP-1、10μMヒトCGRP-(8-37)(C/C)又はアミリン-(8-37)(C/A)を有する100nM CGRP-1、10μMヒトCGRP-(8-37)(C-8-37)又は100nM CGRP+23.7nMインシュリン(C+I)中でインキュベーションされた。数値は平均値±S.E.M(各点で、n＝7)。＊＊コントロールに対する有意差(P＜0.01)。

[0035]図3Cは、筋肉内の遊離脂肪酸を増加させるCGRP-1の能力に関してアミリン-(8-37)及びCGRP-(8-37)の効果を示す。ヒラメ筋は、ヒラメ筋は、KHB(コントロール)、1pM CGRP、1pM CGRP＋100pM CGRP-(8-37)、又は1pM CGRP+100pM アミリン-(8-37)中でインキュベーションされた。数値は平均値±S.E.M(各点で、n＝7)。＊＊コントロールに対する有意差(P＜0.01)。

[0036]図4A及び図4Bは、インキュベーションされたラットヒラメ筋内で遊離脂肪酸含量を刺激するCGRP-1の用量依存性の効果を示す。 [0036]図4A及び図4Bは、インキュベーションされたラットヒラメ筋内で遊離脂肪酸含量を刺激するCGRP-1の用量依存性の効果を示す。 図4Cは、インキュベーションされたラットヒラメ筋内で遊離脂肪酸含量を刺激するCGRP-2の効果を示す。ヒラメ筋は、KHB(コントロール)、又はCGRP濃度のある範囲中で1時間インキュベーションされた。数値は平均値±S.E.M(各点で、n＝7)。

[0037]図5Aは、インキュベーションされたラットヒラメ筋内で遊離脂肪酸含量を刺激するアミリンの用量依存性の効果を示す。ヒラメ筋は、KHB(コントロール)、又はアミリン濃度のある範囲中で1時間インキュベーションされた。数値は平均値±S.E.M(各点で、n＝7)。

[0038]図5Bは、100pM CGRPの存在下で遊離脂肪酸含量を刺激するアミリンの用量依存性の効果を示す。ヒラメ筋は、KHB(コントロール)、又はアミリン濃度のある範囲＋100pM CGRP中でインキュベーションされた。数値は平均値±S.E.M(各点で、n＝7)。

[0039]図6A、6B、及び6Cは、高脂質食が与えられたラットのヒラメ筋の中性脂肪含量に関するアミリン、CGRP、及びノルエピネフリンの効果が示される。ラットは、40％ラード(6A)、コーン油(6B)、又はオリーブ油(6C)から成る食事を与えられた。ヒラメ筋は、KHB(コントロール)、100nMアミリン又はCGRP-1、或いはノルエピネフリン4.4μM中でインキュベーションされた。数値は平均値±S.E.M(各点で、n＝7)。＊コントロールに対する有意差(P＜0.05)。＊＊コントロールに対する有意差(P＜0.01)。

[0040]図7A、7B、及び7Cは、高脂肪食が与えられたラットのヒラメ筋の遊離脂肪酸含量に関するアミリン、CGRP、及びノルエピネフリンの効果が示される。ラットは、40％ラード(7A)、コーン油(7B)、又はオリーブ油(7C)から成る食事を与えられた。ヒラメ筋は、KHB(コントロール)、100nMアミリン又はCGRP-1、或いはノルエピネフリン4.4μM中でインキュベーションされた。数値は平均値±S.E.M(各点で、n＝7)。＊コントロールに対する有意差(P＜0.05)。＊＊コントロールに対する有意差(P＜0.01)。

[0041]図8は、記述したようにインサートを含むベクターを一過性にトランスフェクションされた培養L6筋原細胞に対する、[³H]ラットアミリン又は[³H]サケのカルシトニン(sCT)の全量及び非特異的の結合を示す。筋原細胞は、以下のとおりにトランスフェクションされた：A,ベクターのみ；B,マウスramp1を含むベクター；C,インサートネガティブなラットカルシトニン受容体1のアイソフォーム、C1_ins-を含むベクター；及びD，マウスのramp1及びマウスのC1_ins-を各々含むベクターを一緒にトランスフェクションした。結合は、対応する非標識ペプチドがない(全(T))又は1μMの濃度で存在する(非特異的(NS))状態で、各放射線リガンド10nMの濃度を用いて行われた。比結合は、各ケースにおいて対応する全結合から非特異的結合を引くことによって獲得されうる。各バーは、3つの独立した筋原細胞のトランスフェクション体由来の、少なくとも2回の繰り返し行った実験からの結合平均値(±S.E.M)を示す。＊、P＜0.05；＊＊＊P＜0.01；全量の結合と対応する非特異的結合との差の有意差は、独立スチューデントのｔ検定を用いて決定された。 [0041]図8は、記述したようにインサートを含むベクターを一過性にトランスフェクションされた培養L6筋原細胞に対する、[³H]ラットアミリン又は[³H]サケのカルシトニン(sCT)の全量及び非特異的の結合を示す。筋原細胞は、以下のとおりにトランスフェクションされた：A,ベクターのみ；B,マウスramp1を含むベクター；C,インサートネガティブなラットカルシトニン受容体1のアイソフォーム、C1_ins-を含むベクター；及びD，マウスのramp1及びマウスのC1_ins-を各々含むベクターを一緒にトランスフェクションした。結合は、対応する非標識ペプチドがない(全(T))又は1μMの濃度で存在する(非特異的(NS))状態で、各放射線リガンド10nMの濃度を用いて行われた。比結合は、各ケースにおいて対応する全結合から非特異的結合を引くことによって獲得されうる。各バーは、3つの独立した筋原細胞のトランスフェクション体由来の、少なくとも2回の繰り返し行った実験からの結合平均値(±S.E.M)を示す。＊、P＜0.05；＊＊＊P＜0.01；全量の結合と対応する非特異的結合との差の有意差は、独立スチューデントのｔ検定を用いて決定された。 [0041]図8は、記述したようにインサートを含むベクターを一過性にトランスフェクションされた培養L6筋原細胞に対する、[³H]ラットアミリン又は[³H]サケのカルシトニン(sCT)の全量及び非特異的の結合を示す。筋原細胞は、以下のとおりにトランスフェクションされた：A,ベクターのみ；B,マウスramp1を含むベクター；C,インサートネガティブなラットカルシトニン受容体1のアイソフォーム、C1_ins-を含むベクター；及びD，マウスのramp1及びマウスのC1_ins-を各々含むベクターを一緒にトランスフェクションした。結合は、対応する非標識ペプチドがない(全(T))又は1μMの濃度で存在する(非特異的(NS))状態で、各放射線リガンド10nMの濃度を用いて行われた。比結合は、各ケースにおいて対応する全結合から非特異的結合を引くことによって獲得されうる。各バーは、3つの独立した筋原細胞のトランスフェクション体由来の、少なくとも2回の繰り返し行った実験からの結合平均値(±S.E.M)を示す。＊、P＜0.05；＊＊＊P＜0.01；全量の結合と対応する非特異的結合との差の有意差は、独立スチューデントのｔ検定を用いて決定された。 [0041]図8は、記述したようにインサートを含むベクターを一過性にトランスフェクションされた培養L6筋原細胞に対する、[³H]ラットアミリン又は[³H]サケのカルシトニン(sCT)の全量及び非特異的の結合を示す。筋原細胞は、以下のとおりにトランスフェクションされた：A,ベクターのみ；B,マウスramp1を含むベクター；C,インサートネガティブなラットカルシトニン受容体1のアイソフォーム、C1_ins-を含むベクター；及びD，マウスのramp1及びマウスのC1_ins-を各々含むベクターを一緒にトランスフェクションした。結合は、対応する非標識ペプチドがない(全(T))又は1μMの濃度で存在する(非特異的(NS))状態で、各放射線リガンド10nMの濃度を用いて行われた。比結合は、各ケースにおいて対応する全結合から非特異的結合を引くことによって獲得されうる。各バーは、3つの独立した筋原細胞のトランスフェクション体由来の、少なくとも2回の繰り返し行った実験からの結合平均値(±S.E.M)を示す。＊、P＜0.05；＊＊＊P＜0.01；全量の結合と対応する非特異的結合との差の有意差は、独立スチューデントのｔ検定を用いて決定された。

[0042]図9は、マウスramp1及びインサート-ネガティブ・ラット・カルシトニン受容体イソフォーム1(C1_ins-)を含むベクターをコトランスフェクションされたL6筋原細胞から、結合された[³H]ラット・アミリンの置換を示す。マウスramp1及びC1_ins-をコトランスフェクションされた筋原繊維は、示した非標識リガンドの濃度の存在下で[³H]ラットアミリン(20nM)を伴い21℃で3時間インキュベーションされる。次に細胞は洗われ、そして結合した放射性活性は、液体シンチレーション計測によって決定される。A,ラットCGRP-1(・)；ラットのアミリン(○)；サケのカルシトニン(★)ラットカルシトニン(8)；またはヒトのアドレノメジュリン(：)による[³H]アミリンの置換、B,^8,37CGRP(△)；又は^8,37アミリン(6)による[³H]アミリンの置換。各点は、3の独立した筋原細胞トランスフェクション体の平均値±SEMであって、少なくとも2回繰り返された実験からの平均値±SEMを示す。

[0043]図10は、マウス受容体活性を修飾するタンパク質1、ramp1、及びインサートネガティブなマウスカルシトニン受容体のアイソフォーム1、C1_ins-で一過性にトランスフェクションされた、かつラットCGRP-1又はラットアミリンでインキュベーションされたL6筋原細胞において、切断されたペプチドアンタゴニスト、^8,37ラットCGRP-1及び^8,37ラットアミリンのcAMP濃度に関する影響を示す。トランスフェクションされた筋原細胞は、示されたA,CGRPの濃度又はB,アミリンの濃度で15分間インキュベーションされた。A:(・)CGRP；(△)CGRP＋^8,37CGRP(5μM)。B:(○)アミリン；(6)アミリン+^8,37アミリン(5μM)。細胞は洗われ、そして、筋肉のcAMP含量が決定された。各点は、少なくとも2回行われた実験からの3つの独立したトランスフェクション体の平均値(±SEM)を示す。

[0044]図11は、指示された通りにベクター構築体を一過性にトランスフェクションされたCos-7細胞に対して、A、[³H]ラットCGRP-1、CGRP、B[³H]ラットアミリン、アミリン、及びC[³H]-sCTの全結合のパーセントとして示した比結合を示す。比結合は、対応する標識されていないリガンド(1μM)の存在下又は非存在下において、各放射線リガンド(各ケースで20nM)の全結合量との間における差由来である。各点は、少なくとも2回行われた実験から3つの独立したトランスフェクション体の平均値を示す。＊＊、ベクターのみをトランスフェクションされた細胞に対する結合性と比較してP＜0.01。

[0045]図12は、記したベクターコンストラクトを一過性にトランスフェクションしたCos-7細胞において、マウス受容体の活性を修飾するタンパク質1、つまりramp1、又はマウスramp3に対応するRNAの発現を図示するノーザンブロットでを示す。(上段のパネル)：ベクターのみ、ベクター；又はマウスramp1又はramp3に対応するインサートを含むベクターをトランスフェクションされたCOS-7細胞から抽出され、ramp1(左のパネル)又はramp3(右のパネル)に対応するラベルされたcDNAでプローブ化されたRNAのノーザンブロットである。(下段のパネル)：COS-7細胞由来の全RNA量がノーザンブロット解析に使用され、各ゲルのレーンにおいて等しい量の添加がなされたことを示すために、18S及び28SのrRNAのバンドを示した。

[0046]図13は、CGRP及びアミリンのラット骨格筋におけるcAMPに対する効果を示す。ヒラメ筋片は、示した濃度において、in vitroでラットCGRP-1(13A)、又はラットアミリン(13B、13C)とインキュベーションされた。インキュベーションは、ヒトインシュリン(23.7nM)の非存在下、又は存在下で行われた。統計的有意差は、一元配置分散分析によって検定され、次にDunnett's Multiple Comparisons Testを使った多重比較によって検定された。A,＊P＜0.05、＊＊P＜0.01、コントロールに対し；及びB、＊P＜0.05、＊＊P＜0.01コントロールに対し。1μMイソプロテレノールで処理されたヒラメ筋において計測されるcAMP含量は、3.5±0.2pmol/mg(P＜0.05)及び3.8±0.2pmol/mg(P＜0.01)A及びBそれぞれコントロールに対し。 [0046]図13は、CGRP及びアミリンのラット骨格筋におけるcAMPに対する効果を示す。ヒラメ筋片は、示した濃度において、in vitroでラットCGRP-1(13A)、又はラットアミリン(13B、13C)とインキュベーションされた。インキュベーションは、ヒトインシュリン(23.7nM)の非存在下、又は存在下で行われた。統計的有意差は、一元配置分散分析によって検定され、次にDunnett's Multiple Comparisons Testを使った多重比較によって検定された。A,＊P＜0.05、＊＊P＜0.01、コントロールに対し；及びB、＊P＜0.05、＊＊P＜0.01コントロールに対し。1μMイソプロテレノールで処理されたヒラメ筋において計測されるcAMP含量は、3.5±0.2pmol/mg(P＜0.05)及び3.8±0.2pmol/mg(P＜0.01)A及びBそれぞれコントロールに対し。 [0046]図13は、CGRP及びアミリンのラット骨格筋におけるcAMPに対する効果を示す。ヒラメ筋片は、示した濃度において、in vitroでラットCGRP-1(13A)、又はラットアミリン(13B、13C)とインキュベーションされた。インキュベーションは、ヒトインシュリン(23.7nM)の非存在下、又は存在下で行われた。統計的有意差は、一元配置分散分析によって検定され、次にDunnett's Multiple Comparisons Testを使った多重比較によって検定された。A,＊P＜0.05、＊＊P＜0.01、コントロールに対し；及びB、＊P＜0.05、＊＊P＜0.01コントロールに対し。1μMイソプロテレノールで処理されたヒラメ筋において計測されるcAMP含量は、3.5±0.2pmol/mg(P＜0.05)及び3.8±0.2pmol/mg(P＜0.01)A及びBそれぞれコントロールに対し。

[0047]図14は、インシュリンに刺激されるグルコース輸送の抑制であって、アミリンに仲介される抑制に関してin vitroラットヒラメ筋におけるペプチドアンタゴニストの影響を示す。ラットヒラメ筋は単離され、剥がされ、そしてアミリン(10nM)及びインシュリン(23.7)と、並びに示された濃度のA、^8,37ラットアミリン又はB、^8,37ラットCGRP-1でインキュベーションされ、そして、グルコース輸送は、2-デオキシ-D-グルコース(2-DOG；nmol/g-乾燥 wt/min)の取り込みとして決定される。点は、n＝4の独立した実験からの平均値(±S.E.M)を表す。効果の統計的有意差は、一元配置分散分析によって検定され、次にDunnett's Multiple Comparisons Testを使った多重比較によって検定された。[インシュリン(23.7nM)+アミリン(10nM)]のみ(アンタゴニストなし)に対応するコントロールの値に対し＊P＜0.05、＊＊P＜0.01。

[0048]図15は、ラット骨格筋におけるin vitroで、基底及びインシュリン刺激性代謝に関してCGRP及び関連ペプチドの効果を示す用量‐応答曲線は、指示された濃度のラットアミリン、アミリン(O)；ラットCGRP-1、CGRP(σ)；又はサケカルシトニン、sCT(E)の存在下でインキュベーションされた単離されたラットヒラメ筋における、(A,B)、グリコーゲン全含量；及び(C,D)、D[¹⁴C(U)]グルコースをグリコーゲンへの取込み割合である。インキュベーションは、最大限に効果的なヒトインシュリン(23.7nM)の非存在下(A,C)、又は存在下(B,D)で行われた。各点は、n=4〜5の独立した実験(全グリコーゲン)及びn=3〜6(D[¹⁴C(U)]グルコース取込み)からの平均値(±S.E.M.)を示し、並びにそれぞれ独立したn＝15又は12の実験由来の基底値を除外して、決定は3回行われた。 [0048]図15は、ラット骨格筋におけるin vitroで、基底及びインシュリン刺激性代謝に関してCGRP及び関連ペプチドの効果を示す用量‐応答曲線は、指示された濃度のラットアミリン、アミリン(O)；ラットCGRP-1、CGRP(σ)；又はサケカルシトニン、sCT(E)の存在下でインキュベーションされた単離されたラットヒラメ筋における、(A,B)、グリコーゲン全含量；及び(C,D)、D[¹⁴C(U)]グルコースをグリコーゲンへの取込み割合である。インキュベーションは、最大限に効果的なヒトインシュリン(23.7nM)の非存在下(A,C)、又は存在下(B,D)で行われた。各点は、n=4〜5の独立した実験(全グリコーゲン)及びn=3〜6(D[¹⁴C(U)]グルコース取込み)からの平均値(±S.E.M.)を示し、並びにそれぞれ独立したn＝15又は12の実験由来の基底値を除外して、決定は3回行われた。 [0048]図15は、ラット骨格筋におけるin vitroで、基底及びインシュリン刺激性代謝に関してCGRP及び関連ペプチドの効果を示す用量‐応答曲線は、指示された濃度のラットアミリン、アミリン(O)；ラットCGRP-1、CGRP(σ)；又はサケカルシトニン、sCT(E)の存在下でインキュベーションされた単離されたラットヒラメ筋における、(A,B)、グリコーゲン全含量；及び(C,D)、D[¹⁴C(U)]グルコースをグリコーゲンへの取込み割合である。インキュベーションは、最大限に効果的なヒトインシュリン(23.7nM)の非存在下(A,C)、又は存在下(B,D)で行われた。各点は、n=4〜5の独立した実験(全グリコーゲン)及びn=3〜6(D[¹⁴C(U)]グルコース取込み)からの平均値(±S.E.M.)を示し、並びにそれぞれ独立したn＝15又は12の実験由来の基底値を除外して、決定は3回行われた。 [0048]図15は、ラット骨格筋におけるin vitroで、基底及びインシュリン刺激性代謝に関してCGRP及び関連ペプチドの効果を示す用量‐応答曲線は、指示された濃度のラットアミリン、アミリン(O)；ラットCGRP-1、CGRP(σ)；又はサケカルシトニン、sCT(E)の存在下でインキュベーションされた単離されたラットヒラメ筋における、(A,B)、グリコーゲン全含量；及び(C,D)、D[¹⁴C(U)]グルコースをグリコーゲンへの取込み割合である。インキュベーションは、最大限に効果的なヒトインシュリン(23.7nM)の非存在下(A,C)、又は存在下(B,D)で行われた。各点は、n=4〜5の独立した実験(全グリコーゲン)及びn=3〜6(D[¹⁴C(U)]グルコース取込み)からの平均値(±S.E.M.)を示し、並びにそれぞれ独立したn＝15又は12の実験由来の基底値を除外して、決定は3回行われた。

[0049]図16は、高脂肪食を与えたラットからのヒラメ筋におけるインシュリンの用量反応曲線を示す。インシュリン用量反応曲線は、通常食(黒四角)又は高脂肪食(下向き黒三角)を51日間与えられたラットからのヒラメ筋において計測された。インシュリン反応は、様々な濃度のインシュリンと2時間インキュベーションした後、筋肉グリコーゲンへのD[¹⁴C(U)]グルコースの取り込みを通して計測された。筋肉グリコーゲンは抽出され、液体シンチレーション分光測定によってD[¹⁴C(U)]グルコース含量に関し分析された用量‐応答曲線は、シグモイド用量反応アルゴリズムに適合させた。結果は、平均値±SEM(各点で、n＝12〜18)として示される。2乗和分析は、2つの曲線の間における有意差を示した(P＜10^-5)。

[0050]図17A及び図17Bは、高脂肪食を与えられた動物における筋肉及び中性脂肪に関するCGRP-1の影響を示す。

[0051]図18は、高脂肪食を与えられたラットにおいて筋肉脂質に関しCGRP-1が影響する際に、CGRP受容体アンタゴニストの効果を示す。示された結果の統計的有意差は、一元配置分散分析によって検定され、次にTukey's Testを使った多重比較によって検定された。基底に対し^***P＜0.001、100nM CGRPに対し^*P＜0.05；1pM CGRPに対し^###P＜0.001^!!!P＜0.001。

[0052]図19は、通常食を与えられた及び高脂肪食を与えられた動物からのヒラメ筋におけるcAMP含量に関するCGRP-1の効果を示す。

[0053]図20は、ラットCGRP1(100pmol/kg/min)又は生理食塩水を注入されたウィスター系ラットにおける動脈圧の平均値の低下を示す。動脈圧の平均値は、固体血圧トランスデューサーを用いて継続的に計測され、パワーラボ/16sデータ・アクイジション・モジュール(PowerLab/16s data acquisition module)を用いてモニターされた。較正されたシグナルは、画面に表示され、各変動の2秒平均としてディスクに保存された。＊P＜0.05。

[0054]図21は、CGRP-1又はCGRP-1活性のアンタゴニストを注入したことによる血液グルコースレベルに対する効果を示す。血液グルコースレベルは、5分間隔でアドバンテージメーター及び示したとおりに90分間注入された動物からの尻尾の血液サンプルを用いて決定された。

Claims (31)

1. 薬剤が哺乳動物において脂肪分解を刺激するために有用であるかを決定する方法であって、上記薬剤が高親和性CGRP受容体のアゴニストであるかを決定することを含む上記方法。
2. 前記薬剤が、代謝性アミリン受容体に比較して高親和性CGRP受容体を優先的に刺激することを確定することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
3. 代謝性アミリン受容体によって仲介される応答に影響を及ぼすことに関する前記薬剤のEC₅₀と高親和性CGRP受容体によって仲介される応答に影響を及ぼすことに関する前記薬剤のEC₅₀とを比較することをさらに含む、請求項2に記載の方法。
4. 前記EC₅₀値が、単離された骨格筋を用いてin vitroで測定される、請求項3に記載の方法。
5. 高親和性受容体により仲介される応答が、骨格筋組織における遊離脂肪酸の増加であり、そして前記代謝性アミリン受容体により仲介される応答が、糖代謝に対する効果である、請求項3に記載の方法。
6. 以下の：
   (i)高親和性CGRP受容体及び代謝性アミリン受容体を発現する哺乳動物組織において、薬剤が脂肪分解を刺激するかどうかを確定すること；及び
   (ii)上記(i)からの薬剤が、代謝性アミリン受容体に比較して高親和性CGRP受容体を優先的に刺激するかどうかを確定すること、
   を含む、薬剤が治療薬剤として有用であるかを確定する方法であって、ここで、高親和性CGRP受容体を優先的に刺激する前記薬剤が、治療薬剤として有用であると決定される前記方法。
7. 前記組織が骨格筋である、請求項6に記載の方法。
8. 薬剤が、哺乳動物において脂肪分解を刺激するために有用であるかどうかを確定する方法であって、上記薬剤の脂肪分解活性をCGRPの脂肪分解活性と比較することを含む前記方法。
9. 薬剤が、哺乳動物において脂肪分解を刺激するために有用であるかどうかを確定する方法であって、上記薬剤の脂肪分解活性をCGRPの脂肪分解活性と比較することを含む前記方法。
10. 哺乳動物において不所望の副作用を顕出することなく、哺乳動物の骨格筋において脂肪分解を刺激する高親和性CGRP受容体のアゴニストの投与量又は剤形を決定する方法であって、上記不所望の副作用は、血中グルコース、血中乳酸レベルの増加、又は血管拡張であり、以下：
    (i)以下：
    a)上記CGRP受容体アゴニストの複数の異なる投与量又は剤形を実験哺乳動物に投与し；
    b)上記実験哺乳動物の組織における脂肪分解に対する各投与量又は製剤形態の効果を計測し、かつ上記副作用に対する各投与量の効果を計測し、それにより、脂肪分解及び上記副作用に関する用量‐応答データを作成する；
    ことによって用量‐応答アッセイを実施し、そして
    ii)上記用量‐応答データから、脂肪分解を刺激するが、上記副作用を顕出しないCGRP受容体アゴニスト製剤の投与量を決定する、
    ことを含む前記方法。
11. 前記の脂肪分解に対する各投与量又は剤形の効果が、前記動物の組織における遊離脂肪酸レベルを計測することによって決定される、請求項10に記載の方法。
12. 哺乳動物に投与するための単位用量形態の医薬組成物であって、ここで、上記単位用量が、代謝性アミリン受容体に比較して高親和性受容体を優先的に刺激するために十分な血中アゴニスト・レベルをもたらすために十分な量の高親和性CGRP受容体のアゴニスト、及び医薬として許容される賦形剤を含む前記医薬組成物。
13. 前記アゴニストがCGRP-1又は生物学的に機能性のそのバリアントである、請求項12に記載の単位用量形態の医薬組成物。
14. 前記アゴニストがCGRP-1であり、かつ血中アゴニスト・レベルが300pM未満である、請求項12に記載の単位用量形態の医薬組成物。
15. 前記アゴニストがCGRP-1であり、かつ血中アゴニスト・レベルが約10^-15M〜約10^-10Mとの間にある、請求項12に記載の単位用量形態の医薬組成物。
16. 骨格筋における脂質の蓄積を特徴とする病気を患っているか、又はそれに感受性のある哺乳動物を治療する薬物の製造におけるCGRPの使用であって、ここで、上記薬物は、哺乳動物に投与されるとき、300pM未満の血中アゴニスト・レベルをもたらす前記使用。
17. 前記病気が、糖尿病、インシュリン抵抗性、又はX症候群である、請求項16に記載の使用。
18. 骨格筋における脂質の蓄積を特徴とする病気を患っているか、又はそれに感受性のある哺乳動物の治療用薬物の製造におけるCGRPの使用であって、ここで、上記薬物は、哺乳動物に投与されるとき、約10^-15M〜約10^-10の間の血中アゴニスト・レベルをもたら前記使用。
19. 骨格筋における脂質の蓄積を特徴とする病気を患っているか、又はそれに感受性のある哺乳動物の治療用薬物の製造における高親和性CGRP受容体のアゴニストの使用であって、ここで、上記薬物は、哺乳動物に投与されるとき、代謝性アミリン受容体に比較して、高親和性受容体を優先的に刺激するために十分であるアゴニスト・レベルを上記哺乳動物においてもたらす前記使用。
20. 前記アゴニストがCGRP-1である、請求項19に記載の使用。
21. 哺乳動物の単離された細胞又は組織において脂肪分解を刺激する方法であって、上記細胞又は組織を、高親和性CGRP受容体及び/又は代謝性アミリン受容体のアゴニストと接触させ、そして上記組織における脂肪分解レベルの変化を計測することを含む前記方法。
22. 前記脂肪分解レベルの変化が、遊離脂肪酸量の変化として検出される、請求項21に記載の方法。
23. 哺乳動物の単離された細胞又は組織において脂肪分解を刺激する方法であって、上記方法は、上記細胞又は組織を高親和性CGRP受容体のアゴニストと接触させることを含み、ここで、上記組織が、骨格筋又は肝臓由来であり、かつ上記組織が、代謝性アミリン受容体に比較して高親和性CGRP受容体の活性を優先的に刺激するため効果的な量のアゴニストと接触される前記方法。
24. 前記アゴニストがCGRP-1である、請求項23に記載の方法。
25. 前記CGRP-1の量が、約10^-15M〜約10^-10Mの間にある、請求項24に記載の方法。
26. 前記組織における脂肪分解の刺激を検出するステップをさらに含む、請求項23に記載の方法。
27. 哺乳動物の単離された骨格筋または肝臓における脂肪分解を阻害する方法であって、上記骨格筋又は肝臓を、脂肪分解を阻害するために十分な量の代謝性アミリン受容体及び/又は高親和性CGRP受容体のアンタゴニストと接触させることを含む前記方法。
28. 前記アンタゴニストが、^8,37アミリン又は^8,37CGRPである、請求項27に記載の方法。
29. 哺乳動物の骨格筋における脂肪分解を刺激する方法であって、その組織を代謝性アミリン受容体のアゴニストと接触させることを含む前記方法。
30. 前記アゴニストがCGRPである、請求項29に記載の方法。
31. 以下の：
    (i)骨格筋における脂質の蓄積を特徴とする病気を患っているか、又はそれに感受性のある哺乳動物に、CGRP-1ポリペプチド、生物学的に機能性のそのバリアント、又は代謝性受容体刺激性のそのバリアントを投与し、そして
    (ii)上記哺乳動物における脂肪分解をモニタリングする
    ことを含む治療法。

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