ES2708957T3 - Proteínas de fusión de apelina y usos de las mismas - Google Patents

Abstract

Polipéptido que comprende un péptido apelina fusionado con un dominio Fc de IgG humano, en el que el extremo N del péptido apelina se fusiona con el extremo C del dominio Fc a través de uno o más enlazadores Gly-Ser. en el que el péptido apelina se selecciona del grupo que consiste en apelina42-77 (apelina-36), apelina61-77 (apelina-17), apelina63-77 (apelina-15), apelina64-77 (apelina-14), apelina65-77 (apelina-13), apelina66-77 (apelina- 12), apelina67-77 (apelina-11), apelina68-77 (apelina-10), apelina73-77 (apelina-5), apelina61-76 (apelina-K16P), apelina61-75 (apelina-K15M), apelina61-74 (apelina-K14P), apelina-F13A, apelina65-76, apelina65-75, apelina66-76, apelina67-76, apelina66-75, apelina 67-75, [Pyr1]Apelina-13, SEQ ID NO: 38 (apelina-13+5G), SEQ ID NO: 42 (apelina-13+R), SEQ ID NO: 43 (apelina-13+S) y SEQ ID NO: 44 (apelina-13+H).

Description

DESCRIPCION

Protefnas de fusion de apelina y usos de las mismas

Campo de la invencion

La presente divulgacion se refiere a protefnas de fusion disenadas con componentes multimerizantes, tales como dominios Fc de inmunoglobulina humana, fusionadas al extremo N o al extremo C de peptidos apelina. Las protefnas recombinantes de la invencion y las composiciones de las mismas son utiles en el tratamiento de enfermedades cardiovasculares, isquemia-reperfusion, diabetes y otras terapias relacionadas con la apelina.

Antecedentes de la invencion

La preproapelina es una protefna de 77 aminoacidos expresada en el SNC humano y en los tejidos perifericos, por ejemplo, pulmones, corazon y glandula mamaria. Se demostro que los peptidos que comprenden fragmentos del extremo C de tamano variable del peptido apelina activan el receptor acoplado a la protefna G, el receptor APJ (Habata, y col., 1999, Biochem Biophys Acta 1452:25-35; Hosoya, y col., 2000 , JBC, 275 (28):21061-67; Lee, y col., 2000, J Neurochem 74:34-41; Medhurst, y col., 2003, J Neurochem 84:1162-1172). Muchos estudios indican que los peptidos apelina y sus analogos transmiten acciones cardiovasculares a traves de su interaccion con el receptor APJ (tambien conocido como APLNR), tales como la vasodilatacion dependiente del endotelio (Tatemoto y col., 2001, Regul Pept 99:87-92), actividades inotropicas positivas (Szokodi y col., 2002, Circ Res 91:434-440; Maguire, y col., 2009, Hypertension 54:598-604, publicacion electronica previa a la impresion el 13 de julio de 2009) e isquemia y reperfusion regional del miocardio (Pisarenko, y col., 2013, J Pharmacol Pharmacother. “Effects of structural analogues of apelin-12 in acute myocardial infarction in rats", publicacion electronica previa a la impresion). La apelina-13, en particular, es un potente inotropo que podrfa proporcionar un tratamiento para la insuficiencia cardfaca al aumentar la contractilidad del corazon (Dai, y col., 2006, Eur J Pharmacol 553(1-3): 222-228; Maquire, y col., 2009, Hypertension. 54:598-604).

El perfil transcripcional del tejido ventricular prequirurgico y postquirurgico en pacientes humanos revelo que el APLNR fue el gen mas significativamente regulado al alza (Chen y col., 2003, Circulation, 108:1432-39). Los estudios de inactivacion de la apelina (apelinâ ') y APJ (APJ'/_) en ratones sugieren que la falta de una via de apelina-APJ endogena conduce a una menor capacidad para responder al esfuerzo cardiovascular, tal como el ejercicio (Charo y col., 2009, Am J Physiol. Heart Circ. Physiol., 297: H1904-1913).

La apelina tambien se ha presentado en la regulacion de la insulina y los mecanismos de la diabetes y los trastornos relacionados con la obesidad. En modelos de obesidad en ratones, la apelina es liberada desde los adipocitos y es regulada al alza directamente por la insulina (Boucher, y col., 2005, Endocrinol 146:1764-71). Los ratones con inactivacion de apelina demuestran una sensibilidad a la insulina disminuida (Yue, y col., 2010, Am J Physiol Endocrinol Metab 298:E59-E67).

Los agentes moduladores de APLNR tambien fueron utiles en el tratamiento del VIH, ya que los peptidos apelina sinteticos inhibieron la entrada del VIH-1 en celulas que expresan CD4-APLNR (Cayabyab, M., y col., 2000, J. Virol.

74: 11972-11976). Ademas, los inhibidores de APLN^r , es decir, capaces de bloquear la angiogenesis patologica, pueden ser utiles para inhibir el crecimiento tumoral o la vascularizacion en la retina (Kojima, Y. y Quertermous, T., 2008, Arterioscler Thromb Vasc Biol; 28; 1687-1688; Rayalam, S. y col. 2011, Recent Pat Anticancer Drug Discov 6 (3):367-72). La neuroproteccion de la apelina tambien se observa cuando la apelina-13, apelina-17 y apelina-36 actuan a traves de vfas de senalizacion para promover la supervivencia neuronal (Cheng, B, y col., 2012, Peptides 37(1):171-3).

Los agentes de union a APLNR son utiles para mejorar las enfermedades cardiovasculares, asf como el cancer y la diabetes, entre otras enfermedades relacionadas con la apelina. Dado que los peptidos apelina se eliminan rapidamente de la circulacion y tienen una semivida plasmatica corta de no mas de ocho minutos (Japp, y col., 2008, J of Amer College Cardiolog, 52(11):908-13), la apelina se administra actualmente de forma continua para poder observar un efecto terapeutico.

El documento WO 2011/140086 divulga una protefna de tipo anticuerpo basada en el decimo dominio de tipo III de fibronectina (10Fn3) que se une a la albumina serica. El documento W^o 2012/125408 proporciona composiciones y procedimientos para el tratamiento de una enfermedad o trastorno asociado con apelina. Especfficamente, el documento WO 2012/125408 se refiere a una forma pegilada de apelina para proporcionar vida circulante prolongada y efectos inotropicos y, por lo tanto, trata de manera eficaz enfermedades o trastornos asociados con la apelina. Nishimura y col. (2001) J. Chem. Soc, 1960-1968 describe un nuevo sistema para la preparacion de peptidos recombinantes biologicamente activos. El documento WO 02/36762 divulga un procedimiento para producir eficazmente un peptido objetivo. Murza y col. (2012) ChemMedChem, 7, 318-325 divulgan la sfntesis de analogos de apelina-13 modificados en posiciones seleccionadas con aminoacidos no naturales. Huang (2009) Current Opinion in Biotechnology, 20, 692-699 revisa las protefnas de fusion Fc que han sido aprobadas para su uso en la clfnica y en ensayos clfnicos. Carter y col. (2011) Experimental Cell Research, 317, 1261-1269 proporciona una introduccion a la terapeutica de protefnas. Sato y col. (2006) Current Opinion in Biotechnology, 17, 638-642 analizan los peptidos terapeuticos y los avances tecnologicos que llevan a los peptidos a su desarrollo. El documento WO 2014/099984 divulga analogos agonistas del receptor de APJ que tienen una estabilidad incrementada en relacion con la apelina de tipo salvaje 13 y metodos para usar los analogos.

Existe una necesidad en la tecnica de agentes de union a apelina mejorados como agentes terapeuticos, particularmente aquellos que tienen una semivida prolongada, mientras que mantienen la actividad de union a APLNR.

Sumario de la invencion

La presente divulgacion proporciona protefnas de fusion de apelina, tales como la apelina fusionada con un dominio Fc, disenadas para administrar peptidos apelina biologicamente activos. En particular, las protefnas de fusion de apelina tienen propiedades farmacocineticas mejoradas en comparacion con los peptidos apelina de tipo salvaje mientras que mantienen la actividad de APLNR.

Un aspecto de la divulgacion proporciona un polipeptido que comprende un peptido apelina fusionado a un componente multimerizante. En un aspecto de la divulgacion, el componente multimerizante comprende una secuencia de aminoacidos que contiene al menos un residuo de cistefna. En otro aspecto de la descripcion, el componente multimerizante comprende una secuencia de aminoacidos que contiene una cremallera de leucina, un motivo helice-bucle, un motivo de helice superenrollada o un dominio derivado de inmunoglobulina. En otro aspecto de la divulgacion, el componente multimerizante comprende una secuencia de aminoacidos que contiene un dominio Fc.

En un aspecto relacionado, la divulgacion proporciona un polipeptido que comprende un peptido apelina fusionado con un dominio Fc, un fragmento de un dominio Fc, o una variante de un dominio Fc. En algunos casos, el polipeptido puede ser parte de una estructura de orden superior, tal como una protefna o un complejo multimerico. En algunos aspectos de la divulgacion, el peptido apelina se fusiona con el dominio Fc, o fragmento del mismo, a traves de uno o mas enlazadores peptfdicos. En otros aspectos, el peptido apelina se fusiona con el extremo C de dicho dominio Fc, o el peptido apelina se fusiona con el extremo N de dicho dominio Fc, o fragmento de los mismos. Especfficamente, la presente invencion proporciona un polipeptido que comprende un peptido apelina fusionado con un dominio Fc de IgG humano, en el que el extremo N del peptido apelina se fusiona con el extremo C del dominio Fc a traves de uno o mas enlazadores Gly-Ser,

en el que el peptido apelina se selecciona del grupo que consiste en apelina42-77 (apelina-36), apelina61-77 (apelina-17), apelina63-77 (apelina-15), apelina64-77 (apelina-14), apelina65-77 (apelina-13), apelina66-77 (apelina-12), apelina67-77 (apelina-11), apelina68-77 (apelina-10), apelina73-77 (apelina-5), apelina61-76 (apelina-K16P) , apelina61-75 (apelina-K15M), apelina61-74 (apelina-K14P), apelina-F13A, apelina65-76, apelina65-75, apelina66-76, apelina67-76, apelina66-75, apelina 67-75, [Pyr1]Apelina-13, SEQ ID NO: 38 (apelina-13+5G), SEQ ID NO: 42 (apelina-13+R), SEQ ID NO: 43 (apelina-13+S) y SEQ ID NO: 44 (apelina-13+H).

En una realizacion, el dominio Fc de cualquiera de las protefnas de fusion de apelina descritas en el presente documento comprende un dominio CH2 de inmunoglobulina o un dominio CH3 de inmunoglobulina. En otra realizacion, el dominio Fc comprende un dominio CH2 y CH3 de inmunoglobulina. En algunas realizaciones, el dominio Fc se selecciona del grupo que consiste en el dominio CH2 y CH3 de IgG1, el dominio CH2 y CH3 de IgG4, el dominio CH2 de IgG1 y el dominio CH3 IgG4, y el dominio CH2 de IgG4 y el dominio CH3 de IgG1. En otras realizaciones, el dominio Fc comprende un dominio bisagra de IgG. En otras realizaciones mas, el dominio Fc comprende un dominio bisagra de IgG seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 22.

En otra realizacion, el polipeptido comprende un polipeptido de fusion monomerico capaz de formar un dfmero. En algunas realizaciones, el polipeptido de fusion forma al menos un enlace disulfuro con un segundo polipeptido. En otro aspecto relacionado, la descripcion proporciona una molecula de union al receptor de apelina (APNLR) que comprende: un componente peptfdico de apelina, un dominio Fc de IgG humana y al menos un componente enlazador. En algunos aspectos de la divulgacion, la molecula de union al receptor de apelina (APNLR) es un agonista de APLNR, y en otros casos la molecula de union al receptor de apelina (APNLR) es un antagonista de APLNR.

En otro aspecto de la divulgacion, se proporciona un polipeptido de fusion de apelina o una molecula de union al receptor de apelina que tiene una semivida de plasma o suero in vivo de al menos aproximadamente 1 hora, o al menos aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 o mas horas.

En algunas realizaciones, el polipeptido de fusion de apelina de la invencion comprende un peptido apelina seleccionado del grupo que consiste en apelina 42-77 (apelina-36), apelina61-77 (apelina-17), apelina 63-77 (apelina-15), apelina 64-77 (apelina-14), apelina65-77 (apelina-13), apelina66-77 (apelina-12), apelina67-77 (apelina11), apelina68-77 (apelina-10), apelina73-77 (apelina-5 ), apelina61-76 (apelina-K16P), apelina61-75 (apelina-K15M), apelina61-74 (apelina-K14P), apelina-F13A, apelina65-76, apelina65-75, apelina66-76, apelina67-76, apelina66 -75, apelina 67-75, y [Pyr1]Apelina-13.

En ciertos aspectos, el polipeptido de fusion de apelina o la molecula de union al receptor de apelina es una protefna estable en suero. En algunos aspectos de la divulgacion, el polipeptido tiene una identidad de secuencia del 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % o mayor con la secuencia de aminoacidos que comprende SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4. En otros aspectos, el polipeptido comprende una secuencia de aminoacidos al menos el 99 % identica a SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4. En otros aspectos, el polipeptido tiene una secuencia de aminoacidos que comprende SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO : 4. En otros aspectos, el polipeptido tiene una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 39, SEQ ID nO: 40 y SEQ ID NO: 41.

En ciertos aspectos, la divulgacion proporciona un polipeptido recombinante, comprendiendo el polipeptido N'-P1m-X1n-X2-X3-P2-A1-C', en donde: N' es el extremo N y C' es el extremo C del polipeptido; P1 es un enlazador peptfdico; X1 comprende un dominio bisagra de IgG; X2 comprende un dominio CH2 de IgG; X3 comprende un dominio CH3 de IgG, P2 es un enlazador peptfdico; y A1 es una secuencia de aminoacidos que comprende un peptido de apelina humano, o un fragmento o derivado del mismo; en donde m = 0 o 1, y n = 0 o 1.

En ciertos aspectos, la divulgacion proporciona un polipeptido recombinante, comprendiendo el polipeptido N'-A1-P2-X1n-X2-X3-C', en donde: N' es el extremo N y C' es el extremo C del polipeptido; A1 es una secuencia de aminoacidos que comprende un peptido apelina humano, o un fragmento o derivado del mismo; P2 es un enlazador peptfdico; X1 comprende un dominio bisagra de IgG; X2 comprende un dominio CH2 de IgG; y X3 comprende un dominio CH3 de IgG; en donde n = 0 o 1.

En un segundo aspecto, la invencion proporciona una molecula de acido nucleico que codifica cualquier polipeptido de fusion de apelina de la invencion. La molecula de acido nucleico puede tener una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28. La molecula de acido nucleico puede codificar una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40 y SEQ ID NO: 41.

En un tercer aspecto, la invencion proporciona vectores y celulas que comprenden las moleculas de acido nucleico que codifican un polipeptido de fusion de apelina de la invencion. Los vectores pueden codificar una molecula de acido nucleico unida a una secuencia peptfdica de senal.

La divulgacion tambien proporciona vectores que codifican protefnas de fusion de apelina que comprenden una secuencia de nucleotidos que codifica un peptido de senal. La divulgacion proporciona ademas vectores que codifican protefnas de fusion de apelina que comprenden una secuencia de nucleotidos que codifica un enlazador peptfdico fusionado con el extremo C de un peptido de senal colocado aguas arriba de la protefna de fusion.

La divulgacion tambien proporciona un procedimiento para determinar la actividad APLNR de una molecula de prueba, contactando celulas que expresan APLNR, con la protefna de fusion de apelina en las mismas condiciones de prueba que la molecula de prueba, para determinar si la molecula de prueba es un agonista de APLNR o un antagonista de APLNR.

En un aspecto, la divulgacion proporciona un procedimiento para determinar la activacion de un receptor de APLN (APLNR) que comprende: (a) poner en contacto las celulas que expresan el APLNR con una molecula de prueba, en condiciones que permiten la activacion del APLNR, (b) medir la actividad del APLNR, (c) poner en contacto por separado las celulas que expresan el APLNR con una protefna de fusion de apelina de la invencion en las mismas condiciones que en la etapa (a), (d) medir la actividad del APLNR de las celulas en la etapa (c) de la misma manera que en la etapa (b), en donde la medicion de la actividad del APLNR en la etapa (b) en comparacion con la medicion de la actividad del APLNR en la etapa (d) determina que la molecula de prueba activa el APLNR.

Otro aspecto de la divulgacion proporciona un procedimiento de elaboracion de una protefna de fusion que comprende apelina, comprendiendo dicho metodo: (a) transfectar una celula huesped con una molecula de acido nucleico que codifica la protefna de fusion, en donde la molecula de acido nucleico comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un peptido de senal , fusionado con i) una secuencia de nucleotidos que codifica un dominio Fc de IgG humana unida a una secuencia de nucleotidos que codifica un peptido apelina, en el extremo N de dicho peptido apelina, o ii) una secuencia de nucleotidos que codifica un peptido apelina unido a una secuencia de nucleotidos que codifica un dominio Fc de IgG humana, en el extremo N de dicho dominio Fc, y (b) producir la protefna de fusion expresando la molecula de acido nucleico de (a) en la celula huesped. La divulgacion proporciona celulas huesped que secretan las protefnas de fusion en el medio de cultivo celular.

En otro aspecto mas, la invencion proporciona una cantidad terapeuticamente eficaz de un polipeptido de la invencion para uso en un procedimiento de tratamiento de una enfermedad o afeccion relacionada con apelina en un sujeto que lo necesite, comprendiendo el procedimiento la administracion del polipeptido a dicho sujeto, en el que la enfermedad o afeccion se selecciona del grupo que consiste en enfermedad cardiovascular, insuficiencia cardfaca descompensada aguda, insuficiencia cardfaca congestiva, infarto de miocardio, cardiomiopatfa, isquemia, lesion por isquemia/reperfusion, hipertension pulmonar, diabetes, obesidad, cancer, enfermedad metastasica, homeostasis por fluidos , angiogenesis patologica, retinopatfa, fibrosis e infeccion por VIH.

La invencion proporciona ademas kits que comprenden uno o mas recipientes llenos con al menos un polipeptido de la invencion.

Breve descripcion de los dibujos

La Figura 1A muestra componentes de una protefna de fusion hFc-apelina, como la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 2. La secuencia SEQ ID NO: 2 consiste en (desde el extremo N hasta el extremo C) Fc de IgG1 humana (subrayada), enlazador de peptidos de repeticion G4S (en cursiva) y Apelina-13 (subrayado doble). La Figura 1B representa una protefna de fusion de Fc-apelina secretada y sus componentes en forma de homodfmero.

La Figura 2A representa los componentes de una protefna de fusion de Apelina-hFc, tal como la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 4. La secuencia SEQ ID NO: 4 consiste en (desde el extremo N hasta el extremo C) Apelina-13 (doble subrayado), enlazador de peptidos de repeticion G4S (en cursiva) y Fc de IgG1 humana (subrayado).

La Figura 2B representa una protefna de fusion de Apelina-Fc secretada y sus componentes en forma de homodfmero.

La Figura 3A ilustra la migracion de las protefnas de fusion Fc Apelina y el control de la escala de protefnas en un gel de SDS-PAGE. Carril 1 = medidas de marcadores de protefnas (31 y 38 kD); Carril 2 = hFc-apelina-13 (SEQ ID NO: 2); Carril 3 = protefna apelina13-hFc (SEQ ID NO: 4); Carril 4 = hFc solo.

La Figura 3B ilustra la reactividad de 10 ng o 100 ng de protefna hFc-apelina13 o apelina13-hFc aislada en una transferencia Western con anticuerpo anti-apelina.

La Figura 4 representa la curva de dosis-respuesta y las concentraciones maximas medias (EC50) de cada uno de los siguientes ligandos: apelina-13 (- • -), hFc-apelina13 (- ■ -), o apelina13-hFc (- ♦ -) en un ensayo CRE-luc mediante la medicion de la respuesta de cAMP inducida por forskolina en celulas que expresan APJ (APNLR). La Figura 5 representa la curva de dosis-respuesta y las concentraciones maximas medias (EC50) de cada uno de los siguientes ligandos: apelina-13 (- • -), hFc-apelina13 (- ■ -), apelina13-hFc (-A-), o hFc solo (- ▼ -) en un ensayo de p-arrestina.

La Figura 6 representa la curva de dosis-respuesta y las concentraciones maximas medias (EC50) del ensayo p­ ERK normalizado de hFc-apelina13 (- • -) o apelina13-hFc (- ■ -), en comparacion con hFc (- ▲ -), mostrando la activacion de las celulas que expresan APNLR por ambos ligandos. X

La Figura 7A muestra la estabilidad de 2,8 mg/kg de apelina13-hFc (- ■ -) en suero de ratones C57/BI6 a los que se administro por via subcutanea, alcanzando niveles de aproximadamente 10 pg/ml durante hasta 48 horas, en comparacion con los niveles de hFc solo (- • -).

La Figura 7B muestra la estabilidad de 5 mg/kg de hFc-apelina13 (- • -) en suero de ratones C57/BI6 a los que se administro por via subcutanea, alcanzando 3 pg/ml a las 24 h y disminuyendo gradualmente a 1 pg/ml a los 14 dfas aproximadamente.

Descripcion detallada de la invencion

Debe entenderse que la presente invencion no se limita a procedimientos particulares y a las condiciones experimentales descritas, ya que dichos procedimientos y condiciones pueden variar. Tambien debe entenderse que la terminologfa utilizada en la presente memoria descriptiva tiene el proposito de describir solo realizaciones particulares y no pretende ser limitante, ya que el alcance de la presente invencion se define en las reivindicaciones. Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “un”, “una” y “el/la” incluyen referencias plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Asf, por ejemplo, una referencia a “un procedimiento” incluye uno o mas procedimientos y/o etapas del tipo descrito en el presente documento y/o que resultaran evidentes para los expertos en la materia al leer la presente divulgacion. A menos que se defina lo contrario, todos los terminos tecnicos y cientfficos utilizados en la presente solicitud tienen el mismo significado que entiende comunmente un experto en la materia a la que pertenece la presente invencion. Si bien en la practica de la presente invencion se puede utilizar cualquier procedimiento y material similar o equivalente a los descritos en la presente memoria descriptiva, a continuacion, se describen procedimientos y materiales particulares.

Protefnas de fusion

El termino "inmunoglobulina" (Ig) se refiere a una clase de glicoprotefnas relacionadas estructuralmente que consisten en dos pares de cadenas polipeptfdicas, un par de cadenas ligeras (L) y un par de cadenas pesadas (H), que pueden estar interconectadas entre sf por enlaces de disulfuro. La estructura de las inmunoglobulinas ha sido bien caracterizada. Vease, por ejemplo, Fundamental Immunology Capftulo 7 (Paul, W., ed., 2a ed. Raven Press, N. Y. (1989)). Cada cadena pesada comprende generalmente una region variable de cadena pesada (abreviada en el presente documento como Vh o VH) y una region constante de cadena pesada (Ch o CH). La region constante de la cadena pesada comprende generalmente tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Los dominios CH1 y CH2 estan enlazados por una bisagra. La parte Fc comprende al menos los dominios CH2 y CH3.

Generalmente, la numeracion de los residuos de aminoacidos de las inmunoglobulinas se realiza de conformidad con IMGT, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991) o mediante el sistema de numeracion EU de Kabat (tambien conocido como "numeracion EU” o "fndice EU"), por ejemplo, tal como en Kabat, E.A. y col. Sequences of Proteins of Immunological interest. 5a ed. US Department of Health and Human Services, publicacion de NIH n.° 91-3242 (1991).

Tal como se usa en la memoria descriptiva, un "componente multimerizante" es cualquier macromolecula, protefna, polipeptido, peptido o aminoacido que tiene la capacidad de asociarse con un segundo componente multimerizante de estructura igual o similar. Por ejemplo, un componente multimerizante puede ser un polipeptido que comprende un dominio Ch3 de inmunoglobulina. Un ejemplo no limitante de un componente multimerizante es una parte Fc de una inmunoglobulina, por ejemplo, un dominio Fc de una IgG seleccionada de los isotipos IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, asf como cualquier alotipo dentro de cada grupo de isotipos. En ciertos aspectos de la divulgacion, el componente multimerizante es un fragmento Fc o una secuencia de aminoacidos de 1 a aproximadamente 500 aminoacidos de longitud que contiene al menos un residuo de cistefna. En otros aspectos de la divulgacion, el componente multimerizante es un residuo de cistefna o un peptido corto que contiene cistefna. Otros dominios multimerizantes incluyen peptidos o polipeptidos que comprenden o consisten en una cremallera de leucina, un motivo helice-bucle o un motivo helice superenrollada.

El termino "Fc" se refiere a una parte de una region constante de cadena pesada que comprende al menos los dominios CH2 y CH3 que generalmente se unen a un receptor de Fc, por ejemplo, un F^cyR, a saber, FcyRI (CD64), F^cyRII (CD32), F^cyRIII (CD16) o un FcRn, es decir, un receptor de Fc neonatal. Si la region CH2 y ^c H3 contiene deleciones, sustituciones y/o inserciones u otras modificaciones que lo hacen incapaz de unirse a cualquier receptor Fc, se considera que la region CH2 y CH3 no es funcional en terminos de su funcion biologica tfpica.

La frase "protefnas de fusion", y especfficamente "protefnas de fusion de apelina", incluye polipeptidos recombinantes y protefnas derivadas de apelina que se han disenado para contengan un componente multimerizante tal como se describe en el presente documento.

La frase "protefnas de fusion Fc", y especfficamente las protefnas de fusion "apelina-Fc" o "Fc-apelina", incluye polipeptidos recombinantes y protefnas derivadas de la apelina que se han disenado para contener un fragmento de Fc tal como se describe en el presente documento. Por ejemplo, una "protefna de fusion Fc de apelina" incluye una protefna quimerica que comprende una secuencia de aminoacidos de un peptido de apelina o un analogo fusionado a una secuencia de aminoacidos de un dominio Fc de Ig, ya sea en el extremo N o en el extremo C, con o sin enlazadores peptfdicos. Los ejemplos de peptidos usados en las protefnas de fusion son conocidos en la tecnica (vease, por ejemplo, Dumont, y col., 2006, Biodrugs 20(3):150-160). Las protefnas de fusion Fc tambien se conocen en la tecnica como inmunoadhesinas.

La frase "fusionado a", como se usa en este documento, significa (pero no se limita a) un polipeptido formado por la expresion de un gen quimerico creado mediante la combinacion de mas de una secuencia, generalmente mediante la clonacion de un gen en un vector de expresion en un marco con un segundo gen tal que los dos genes codifican un polipeptido continuo. Ademas de elaborarse mediante tecnologfa recombinante, las partes de un polipeptido pueden "fusionarse" entre sf mediante una reaccion qufmica u otros medios conocidos en la tecnica para elaborar polipeptidos personalizados.

El termino "protefna" pretende incluir estructuras cuaternarias, estructuras ternarias y otras macromoleculas complejas compuestas de al menos un polipeptido. El termino "protefna" incluye polipeptido.

Tal como se usa en el presente documento, un "polipeptido" es una cadena polimerica lineal unica de aminoacidos unida por enlaces peptfdicos entre los grupos carboxilo y amino de residuos de aminoacidos adyacentes. El termino "protefna" tambien se puede usar para describir un polipeptido grande, como una protefna de siete dominios transmembranales.

Los polipeptidos de la invencion comprenden secuencias de aminoacidos que se derivan de un dominio de inmunoglobulina. Una secuencia polipeptfdica o de aminoacidos "derivada de" una protefna o polipeptido designado se refiere al origen del polipeptido. Tal como se usa en el presente documento, "isotipo" se refiere a la clase o subclase de inmunoglobulina (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE o IgM) que esta codificada por los genes de la region constante de la cadena pesada.

La frase "cadena pesada" o "cadena pesada de inmunoglobulina (Ig)", tal como se usa en el presente documento, incluye la secuencia de la region constante de la cadena pesada de Ig de cualquier organismo y, a menos que se especifique lo contrario, incluye un dominio variable de cadena pesada. Los dominios variables de cadena pesada incluyen tres regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada (CDR) y cuatro regiones marco (FR), a menos que se especifique lo contrario. Los fragmentos de dominios variables de cadena pesada incluyen CDR, o CDR y FR. Una region constante (CH) de cadena pesada tfpica tiene, siguiendo el dominio variable, del extremo N al extremo C: un dominio CH1, una bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3. Un fragmento funcional de una cadena pesada, por ejemplo, en una protefna de union a antfgeno, incluye un fragmento que es capaz de reconocer especfficamente un antfgeno (por ejemplo, reconocer el antfgeno con una K^d en el intervalo micromolar, nanomolar o picomolar), que puede expresarse en una celula y secretarse de esta, y que comprende al menos una CDR.

Los procedimientos de trampa de secrecion autologa basados en citometrfa de flujo (FASTR), que utilizan un receptor de F^cy humano unido a la membrana (hFcYR) para capturar las protefnas secretadas de manera conjunta, se pueden usar para aislar rapidamente los clones de alta expresion que expresan o secretan un anticuerpo o una protefna de fusion Fc. (Vease el documento US20090137416 Al). Tales clones de alta expresion pueden emplearse para aislar celulas que expresan protefnas que comprenden una protefna de fusion Fc tal como se describe en el presente documento. Los procedimientos FASTR pueden utilizarse para seleccionar y aislar directamente celulas que expresan cualquier polipeptido recombinante o protefna de fusion Fc de la invencion.

El termino "bisagra", tal como se usa en el presente documento, pretende incluir la region de residuos de aminoacidos consecutivos que conectan el extremo C del dominio c H1 al extremo N del dominio CH2 de una inmunoglobulina. Varios aminoacidos del extremo N del dominio CH2, que estan codificados por el exon de CH2, tambien se consideran parte de la "bisagra inferior". Sin estar limitados por ninguna teorfa, los aminoacidos de la region bisagra de IgG1, IgG2 e IgG4 se han caracterizado por comprender 12-15 aminoacidos consecutivos codificados por un exon de bisagra distinto y varios aminoacidos del extremo N del dominio CH2 (codificados por el exon CH2) (Brekke, OH, y col., 1995, Immunology Today 16 (2):85-90). Por otro lado, IgG3 comprende una region de bisagra que consta de cuatro segmentos: un segmento superior que se parece a la region de bisagra de IgG1 y 3 segmentos que son repeticiones de aminoacidos identicos unicos para IgG3.

Los residuos de aminoacidos derivados de los dominios de Ig, tales como la IgG humana, se identifican en el presente documento mediante el sistema de numeracion EU de Kabat, tambien conocido como "numeracion EU" o "fndice EU" (segun Kabat, EA y col. Sequences of Proteins of Immunological interest, 5a ed., D US Department of Health and Human Services, Publicacion NIH n.° 91-3242, 1991, y actualizada segun los graficos cientfficos de IMGT®, IMGT®, el sistema internacional de informacion ImMunoGeneTics®, http: // www. imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html, creado el 17 de mayo de 2001, ultima actualizacion: 10 de enero de 2013).

Por ejemplo, la numeracion EU para los aminoacidos de la bisagra de IgG1 humana y la convencion de numeracion unica de IMGT correspondiente, y la convencion de numeracion de Kabat (segun Kabat, E.A. y col., 1991, y graficos cientfficos de IMGT® supra) se enumeran en la Tabla 1.

T l 1: n m r i n l i r I 1

T l 2: n m r i n l i r mini I 1

En un aspecto, las protefnas de fusion Fc comprenden un dominio Fc o cualquier fragmento del dominio Fc o cualquier variante del dominio Fc. En algunos aspectos, el dominio Fc comprende un dominio CH2 de Ig y un dominio CH3 de Ig, o un fragmento o variante de los mismos. En otros aspectos, el dominio Fc comprende un dominio bisagra de Ig, o un fragmento o variante del mismo, un dominio CH2 de Ig o un fragmento o variante del mismo y un dominio CH3 de Ig o un fragmento o variante del mismo. En aun otros aspectos, el dominio Fc comprende un dominio de CH1 de Ig o un fragmento o variante del mismo, un dominio de bisagra de Ig o un fragmento o variante del mismo, un dominio CH2 de Ig y un fragmento o variante del mismo, y un dominio CH3 de Ig o un fragmento o variante en esto.

El termino "quimerico", tal como se usa en el presente documento, significa que esta compuesto de partes de origen diferente. La frase "protefna quimerica", que abarca "polipeptidos quimericos", incluye un primer polipeptido de aminoacido unido a un segundo polipeptido de aminoacido que normalmente no esta enlazado de forma natural. Las secuencias de aminoacidos pueden existir normalmente como polipeptidos separados o en una disposicion diferente en el mismo polipeptido o protefna, y se reunen en un polipeptido de fusion en una nueva disposicion.

El dominio Fc puede ser quimerico, combinando secuencias Fc derivadas de mas de un isotipo de inmunoglobulina. Por ejemplo, un dominio Fc quimerico puede comprender parte o la totalidad de una secuencia CH2 derivada de una region de IgG1 humana, IgG2 humana o IgG4 humana, y parte o la totalidad de una secuencia CH3 derivada de una IgG1 humana, IgG2 humana o IgG4 humana. Un dominio Fc quimerico tambien puede contener una region de bisagra quimerica. Por ejemplo, una bisagra quimerica puede comprender una secuencia de "bisagra superior", derivada de una region bisagra de IgG1 humana, IgG2 humana o IgG4 humana, combinada con una secuencia de "bisagra inferior", derivada de una region bisagra de IgG1 humana, IgG2 humana o IgG4 humana. Un dominio Fc quimerico puede tener una union al receptor Fc alterada, que a su vez afecta a la funcion efectora de Fc.

Para ciertas terapias, el dominio Fc puede disenarse para activar todas, algunas o ninguna de las funciones efectoras normales de Fc, sin afectar las propiedades farmacocineticas de la protefna de fusion Fc deseada. Por lo tanto, los dominios Fc disenados mediante ingenierfa genetica que han alterado la union del receptor Fc pueden tener efectos secundarios reducidos. Por lo tanto, en una realizacion, la protefna comprende un dominio Fc quimerico o modificado de otra manera. Para ver un ejemplo de un dominio Fc quimerico, vease la solicitud provisional de EE. UU. n.° 61/759.578, presentada el 1 de febrero de 2013.

La divulgacion tambien proporciona protefnas de fusion Fc de apelina que comprenden secuencias de dominio Fc variantes. Dichos dominios Fc de "variante" y fragmentos de dominio Fc comprenden una o mas adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoacidos en comparacion con la secuencia de tipo salvaje, pero esencialmente funcionan tal como se desea, por ejemplo, exhiben actividad APLNR y prolongan la semivida de la protefna de fusion, tal como se describe en esta memoria descriptiva.

En algunas realizaciones, el dominio Fc comprende un dominio CH2 y CH3 de IgG. En otras realizaciones, el dominio Fc comprende un dominio CH2 y CH3 de IgG1, un dominio CH2 y CH3 de IgG4, un dominio CH2 de IgG1 y un dominio CH3 de IgG4, o un dominio CH2 de IgG4 y un dominio CH3 de IgG1. En algunas realizaciones, el dominio Fc es un dominio Fc quimerico que comprende un fragmento seleccionado del grupo que consiste en el dominio CH1, el dominio bisagra, el dominio CH2 y el dominio CH3, en donde el fragmento se deriva de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE o IgM. En algunas realizaciones, el dominio Fc quimerico comprende un dominio CH2 seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 23. En algunas realizaciones, el dominio Fc quimerico comprende un dominio CH3 seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 20 y s Eq ID NO: 24. En otra realizacion, el dominio Fc comprende un dominio CH2-CH3 de IgG quimerico.

En una realizacion, el dominio Fc comprende un dominio bisagra de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. En una realizacion, el dominio de bisagra comprende SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 22. En otra realizacion, el dominio Fc comprende un dominio de bisagra quimerico. En otra realizacion, el dominio Fc comprende un dominio de bisagra quimerico que comprende un fragmento de bisagra seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 22.

Segun ciertos aspectos de la divulgacion, se proporcionan protefnas de fusion Fc que comprenden un dominio Fc que comprende una o mas mutaciones que potencian o disminuyen la union de protefnas al receptor FcRn, por ejemplo, a pH acido en comparacion con pH neutro. Por ejemplo, la presente divulgacion incluye protefnas de fusion Fc que comprenden una mutacion en la region CH2 o CH3 del dominio Fc, en donde la(s) mutacion(es) aumenta(n) la afinidad del dominio Fc con FcRn en un ambiente acido (por ejemplo, en un endosoma donde el pH varfa de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,0). Dichas mutaciones pueden dar como resultado un aumento de la semivida en suero del anticuerpo cuando se administra a un animal. Los ejemplos no limitativos de tales modificaciones de Fc incluyen, por ejemplo, una modificacion en la posicion 250 (por ejemplo, E o Q); 250 y 428 (por ejemplo, L o F); 252 (por ejemplo, L/Y/F/W o T), 254 (por ejemplo, S o T) y 256 (por ejemplo, S/R/Q/E/D o T); o una modificacion en la posicion 428 y/o 433 (por ejemplo, H/l/R/S/P/Q o K) y/o 434 (por ejemplo, H/F o Y); o una modificacion en la posicion 250 y/o 428; o una modificacion en la posicion 307 o 308 (por ejemplo, 308F, V308F) y 434. En un aspecto, la modificacion comprende una modificacion de 428L (por ejemplo, M428L) y 434S (por ejemplo, N434S); una modificacion 428L, 2591 (por ejemplo, V259I) y 308F (por ejemplo, V308F); una modificacion 433K (por ejemplo, H433K) y una modificacion 434 (por ejemplo, 434Y); una modificacion de 252, 254 y 256 (por ejemplo, 252y , 254T y 256E); una modificacion de 250Q y 428L (por ejemplo, T250Q y M428L); y una modificacion 307 y/o308 (por ejemplo, 308F o 308P).

Por ejemplo, la presente divulgacion incluye protefnas de fusion Fc que comprenden un dominio Fc que comprende uno o mas pares o grupos de mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en: 250Q y 248L (por ejemplo, T250Q y M248L); 252Y, 254T y 256E (por ejemplo, M252Y, S254T y T256E); 428L y 434S (por ejemplo, M428L y N434S); y 433K y 434F (por ejemplo, H433K y N434F). Se contemplan todas las combinaciones posibles de las anteriores mutaciones del dominio Fc y otras mutaciones dentro de las protefnas de fusion descritas en el presente documento.

Las modificaciones al dominio Fc de una protefna de fusion Fc pueden conferir una mayor estabilidad, tal como la resistencia a la degradacion. Las protefnas de fusion pueden modificarse utilizando tecnicas biologicas moleculares ordinarias y qufmica sintetica para mejorar su resistencia a la escision proteolftica o resistencia a la escision relacionada con los iones metalicos. Los analogos de dichos polipeptidos incluyen variantes de sustitucion elaboradas mediante el intercambio de un aminoacido por otro o la sustitucion por residuos distintos de los L-aminoacidos de origen natural, por ejemplo, D-aminoacidos o aminoacidos sinteticos no naturales.

En un aspecto, las protefnas de fusion Fc comprenden un peptido apelina fusionado a un dominio Fc tal como se describe en el presente documento.

En algunas realizaciones, la protefna de fusion Fc de la invencion activa el receptor APLNR y tiene una semivida mayor que la de un peptido apelina que no esta fusionado a un dominio Fc, tal como una semivida mayor de mas de ocho minutos.

Ligando de apelina y receptor de apelina

La apelina se produce endogenamente como un prepropeptido de 77 aminoacidos que se escinde para producir varios fragmentos biologicamente activos mas cortos, o peptidos apelina.

Las protefnas de fusion Fc pueden comprender un peptido apelina tal como se describe en el presente documento. En la invencion, el peptido apelina comprende un fragmento o derivado del polipeptido preproapelina (SEQ ID NO: 5) tal como se define en las reivindicaciones.

Los "peptidos apelina" incluyen fragmentos de apelina especfficos y derivados conocidos en la tecnica, por ejemplo, un peptido apelina que comprende los aminoacidos 6-77, 40-77, 42-77, 43-77, 47-77, 59-77, 61-77, 63-77, 64-77, 65-77, 66-77, 67-77, 73-77, 1-25, 6-25, 42-64, 61-64, 61-74, 61-75, 61-76, 65-76, 65-75, 66-76, 67-76, 66-75, 67-75, 42-58, 42-57, 42-56, 42-55, 42-54, 42-53, o apelina65-77 piroglutamilada ([Pyr1]Apelina-13), del polipeptido preproapelina (SEQ ID NO: 5). Vease, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 6492324, concedida el 10 de diciembre de 2002, y EI Messari y col. 2004, J Neurochem, 90: 1290-1301. En una realizacion, el peptido apelina comprende los aminoacidos 65-76, 65-75, 61-77, 63-77, 64-77, 65-77, 66-77, 67-77, 66-76, 67-76, 66-75, 67-75, o42-77 de SEQ ID NO: 5.

Se ha demostrado en el presente documento que los fragmentos de peptidos apelina, por ejemplo, los peptidos que tienen deleciones en el extremo C conservan sus actividades celulares (vease tambien EI Messari y col. 2004, J Neurochem, 90:1290-1301). En el presente documento se muestra que ciertos derivados peptfdicos de apelina, tales como los peptidos apelina y las fusiones que tienen uno o mas aminoacidos del extremo C adicionales, retienen sus actividades celulares. Otros fragmentos y derivados peptfdicos de apelina pueden prepararse mediante tecnologfa recombinante por parte de un experto en la materia.

En otros aspectos de la divulgacion, el peptido apelina se selecciona del grupo que consiste en apelina40-77 (apelina-38), apelina42-77 (apelina-36), apelina43-77 (apelina-35), apelina47-77 (apelina-31), apelina59-77 (apelina-19), apelina61-77 (apelina-17), apelina63-77 (apelina-15), apelina64-77 (apelina-14), apelina65-77 (apelina-13), apelina66-77 (apelina-12, o A12), apelina67-77 (apelina-11), apelina68-77 (apelina-10), apelina73-77 (apelina-5), apelina61-76 (apelina-K16P), apelina61-75 (apelina-K15M), apelina61-74 (apelina-K14P) y [Pyr1]Apelina-13.

En algunas realizaciones, el peptido apelina se selecciona del grupo que consiste en apelina61-77 (apelina-17; SEQ ID NO: 7), apelina65-77 (apelina-13; SEQ ID NO: 6), apelina-F13A (SEQ ID NO: 29), apelina66-77 (apelina-12, or A12, SEQ ID NO: 32), apelina67-77 (apelina-11; SEQ ID NO: 33), apelina65-76 (SEQ ID NO:30), apelina65-75 SEQ ID NO: 31), apelina67-77 (SEQ ID NO: 6), apelina66-76 (SEQ ID NO: 34), apelina67-76 (SEQ ID NO: 35), apelina 66-75 (SEQ ID NO: 36), apelina 67-75 (SEQ ID NO: 37) y [Pyr1]Apelina-13.

El peptido apelina puede modificarse para minimizar la degradacion y mejorar la estabilidad del suero. En ciertas realizaciones, el peptido apelina modificado se selecciona del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 38 (apelina-13+5G), SEQ ID NO: 42 (apelina-13+R), SEQ ID NO: 43 (apelina-13+S) y SEQ ID NO: 44 (apelina-13+H).

En una realizacion, el peptido apelina se selecciona del grupo que consiste en apelina-36 (SEQ ID NO: 8), apelina-17 (SEQ ID NO: 7), apelina-13 (SEQ ID NO: 6) y [Pyr1]Apelina-13. En otro aspecto, el peptido apelina comprende apelina 13 (SEQ ID NO: 6) o un fragmento de la misma.

Los peptidos apelina se eliminan rapidamente de la circulacion y tienen una semivida plasmatica corta de no mas de ocho minutos (Japp, y col., 2008, J of Amer College Cardiolog, 52 (11): 908-13). Las protefnas de fusion apelina de la invencion tienen una mayor semivida en comparacion con los peptidos apelina.

En la divulgacion se incluyen analogos de apelina modificados para que incluyan aminoacidos no estandar o aminoacidos modificados. Dichos peptidos que contienen aminoacidos no naturales, o naturales pero no codificados, pueden sintetizarse mediante un codigo genetico modificado artificialmente en el que se asignan uno o varios codones para que codifiquen un aminoacido que no es uno de los aminoacidos estandar. Por ejemplo, el codigo genetico codifica 20 aminoacidos estandar; sin embargo, existen tres aminoacidos proteinogenicos adicionales en la naturaleza en circunstancias particulares: selenocistefna, pirrolisina y N-formilmetionina (Ambrogelly, y col. 2007, Nature Chemical Biology, 3:29 -35; Bock, A. y col., 1991, TIBS, 16 (12):463-467 y Theobald-Dietrich, A., y col., 2005, Biochimie, 87 (9-10): 813-817). Tambien se incluyen los aminoacidos modificados postraduccionalmente, tales como el acido carboxiglutamico (y-carboxiglutamato), la hidroxiprolina y la hipusina. Otros aminoacidos no estandar incluyen, pero no se limitan a, citrulina, 4-benzoilfenilalanina, acido aminobenzoico, acido aminohexanoico, N°-metilarginina, acido a-amino-n-butfrico, norvalina, norleucina, aloisoleucina, t-leucina, acido a-amino-n-heptanoico, acido pipecolico, acido a,p-diaminopropionico, acido a,Y-diaminobutfrico, ornitina, alotreonina, homoalanina, homoarginina, homoasparagina, acido homoaspartico, homocistefna, acido homoglutamico, homoglutamina, homoisoleucina, homoleucina, homometionina , homofenilalanina, homoserina, homotirosina, homovalina, acido isonipecotico, p-alanina, acido p-amino-n-butfrico, acido p-aminoisobutfrico, acido Y-aminobutfrico, acido aaminoisobutfrico, isovalina, sarcosina, naftilalanina, acido nipecotico, N-etilglicina, N-propilglicina, N-isopropilglicina, N-metil-alanina, N-etil-alanina, N-metil-p-alanina, N-etil-p-alanina, acido octahidroindol-2-carboxflico, penicilamina acido piroglutamico, sarcosina, t-butilglicina, acido tetrahidroisoquinolina-3-carboxflico, isoserina y acido a-hidroxi-Y-aminobutfrico. Se conoce en la tecnica una variedad de formatos para expandir el codigo genetico y puede emplearse en la practica de la invencion. (Vease, por ejemplo, Wolfson, W., 2006, Chem Biol, 13(10): 1011-12.) Los analogos de apelina que incorporan tales aminoacidos no estandar o modificaciones postraduccionales pueden sintetizarse mediante procedimientos conocidos. Los analogos de apelina a modo de ejemplo incluyen el analogo de Na-metilarginina-apelina-A12, [Nle75,Tyr] apelina-36, [Glp65Nle75,Tyr77]apelina-13, (Pyr1) [Met(O)11]-apelina-13, (Pyr1) apelin-13, [d-Ala12] -A12, y acetato de amida de N-alfa-acetil-nona-D-arginina.

Tambien se incluye en la divulgacion analogos del componente de apelina de una protefna de fusion de apelina que se modifico para que sea resistente a la escision, por ejemplo, escision por la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2). Se ha demostrado que dichos analogos de apelina aumentan en comparacion con los ligandos de apelina no modificados en modelos in vivo de respuesta miocardica a la isquemia (Wang, y col., 1 de julio de 2013, J Am Heart Assoc., 2: e000249).

Tales protefnas de fusion de apelina protegidas por escision incluyen peptidos apelina que se modifican para incluir variantes de sustitucion, es decir, variantes elaboradas mediante el intercambio de un aminoacido por otro en uno o mas sitios de escision dentro de la protefna. Se preve que tales sustituciones de aminoacidos aumenten la estabilidad de la protefna. Otras protefnas de fusion de apelina protegidas por escision incluyen peptidos de apelina modificados para incluir grupos amida o acetilo terminales. En algunos aspectos, las protefnas de fusion de apelina protegidas por escision incluyen aminoacidos proteinogenicos, aminoacidos no estandar o aminoacidos modificados postraduccionalmente. Otras protefnas de fusion de apelina protegidas por escision o resistentes a la escision comprenden peptidos apelina modificados que incluyen uno o mas aminoacidos de extremo N adicionales. Es deseable que estos peptidos apelina modificados no alteren la capacidad del peptido para activar el APLNR. APLNR incluye SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, y SEQ ID NO: 44.

Se sabe que la apelina, tal como se menciono anteriormente, es un ligando de APLNR, un receptor acoplado a protefna G. El termino "ligando", tal como se usa en el presente documento, significa una molecula que se une a otra molecula, tal como un receptor. Una molecula de ligando capaz de unirse a un receptor acoplado a la protefna G (GPCR) se selecciona del grupo que consiste en un ion, una molecula organica pequena, un peptido, un polipeptido, un anticuerpo, un anticuerpo biespecffico, un fragmento de anticuerpo, una protefna y una molecula organica grande. Un ligando puede caracterizarse adicionalmente como, por ejemplo, un agonista, agonista parcial, agonista inverso, antagonista, antagonista competitivo, modulador alosterico positivo o modulador alosterico negativo dependiendo del estado de actividad que confiere a traves del receptor al que se une. Por ejemplo, para que los agonistas se unan a un GPCR, se interrumpen otras interacciones moleculares que mantienen a dicho GPCR en un estado inactivo. El termino "agonista", como se usa en el presente documento, incluye un resto que interactua con (se une directa o indirectamente) y activa un receptor, tal como el receptor APLNR, e inicia una respuesta fisiologica o farmacologica caracterfstica de ese receptor, tal como cuando se une a su ligando endogeno. Por ejemplo, al unirse a un GPCR, los restos pueden activar una respuesta intracelular, mejorar la union de GTP a las membranas celulares o internalizar el receptor. Dicho resto agonista puede ser, por ejemplo, una protefna, un polipeptido, un peptido, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, una molecula grande o una molecula pequena.

El termino "antagonista", como se usa en el presente documento, pretende significar un resto que se une de forma competitiva al receptor en el mismo sitio que un agonista (por ejemplo, el ligando endogeno), pero no activa la respuesta intracelular iniciada por la forma activa del receptor, e inhibiendo asf la respuesta intracelular por un agonista o agonista parcial. En algunos casos, los antagonistas no disminuyen la respuesta intracelular basal en ausencia de un agonista o agonista parcial. Un antagonista no tiene que funcionar necesariamente como un inhibidor de la union competitiva, pero puede actuar mediante el secuestro de un agonista, o la modulacion indirecta de un efecto posterior.

Los receptores acoplados a la protefna G (GPCR), que son receptores de siete dominios transmembrana, generalmente transducen sus senales celulares a traves de protefnas de union a nucleotidos de guanina heterotrimericas (protefnas G), que consisten en una subunidad alfa (a), beta (p) y gamma (^y), mientras que la subunidad a contiene un sitio de union para GTP/GDP, y el dfmero pY esta unido a la subunidad en un estado inactivo. Las protefnas G se producen naturalmente en el lado citoplasmico de la membrana plasmatica. La union de un ligando extracelular conduce a un cambio conformacional en la protefna del receptor que le permite hacer contacto con una protefna de union a nucleotidos de guanina (protefna G) y asf aumentar el intercambio de GTP por GDP. Despues del intercambio, el dfmero pY se disocia de la subunidad a. Tanto la subunidad a activada como el dfmero pY pueden influir en las protefnas efectoras intracelulares.

En general, los GPCR activan una familia particular de subunidades de protefnas Ga, lo que conduce a la activacion o inactivacion de una via de transduccion de senales particular. El receptor de apelina (APLNR) es un GPCR.

Tras la interaccion con un ligando o molecula de union, el receptor de apelina (APLNR) desencadena una o mas de varias cascadas de senalizacion intracelular, que incluyen la senalizacion iniciada por: 1) subunidad de protefna G inhibitoria, Gai/o, 2) activacion de ERK a traves de PKC, o 3 ) internalizacion de GPCR. En otras palabras, la respuesta farmacologica y/o fisiologica de APLNR en su estado activo se determina mediante la accion posterior de las subunidades Gai (que, por ejemplo, inhiben la adenilil ciclasa), ERK fosforiladas o APLNR internalizado. Se entiende que otros efectores intracelulares pueden ser activados por un APLNR activado.

El receptor de apelina (APLNR) originalmente denominado receptor de APJ (O'Dowd, y col., 1993, Gene 136(1-2): 355-360), se aislo del ADN genomico humano como un receptor huerfano de 7 dominios transmembrana de 380 aminoacidos. (Vease NCBI RefSeq No. NP_005152, que se incorpora al presente documento como referencia). Se demostro que la apelina es el ligando endogeno para APLNR (APJ) cuando los extractos de tejido del estomago bovino revelaron peptidos apelina que estimulaban la tasa de acidificacion en las celulas CHO que expresan APLNR (APJ) en un intervalo de 0,1-100 nM (Tatemoto, y col., 1998, Biochem Biophys Res Comm 251:471-476).

La interaccion entre apelina y APLNR y, por lo tanto, la interaccion entre las protefnas de fusion de apelina y APLNR, se puede medir mediante una serie de bioensayos in vitro (por ejemplo, como en un tubo de ensayo o placa), ex vivo (por ejemplo, como en un cultivo celular de un animal vivo) e in vivo (por ejemplo, como en un animal vivo) conocidos por los expertos en la materia relevante.

En algunos aspectos, los agonistas de APLNR se seleccionan del grupo que consiste en apelina-36, apelina-19, apelina-17, apelina-13, apelina-12, analogo de W°-metilarginina-apelina-A12, [Nle75, Tyr]apelina-36, [Glp65Nle75,Tyr77]apelina-13, (Pyr1)[Met(O)11]-apelina-13 y (Pyr1)-apelina-13.

El polipeptido de fusion de apelina puede ser un agonista de APLNR seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID nO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40 y SEQ ID NO: 41 y fragmentos o derivados de los mismos.

Se sabe que los antagonistas del receptor bloquean la accion hipotensora del APLNR. El derivado peptfdico de apelina obtenido modificando la apelina-13 en su fenilalanina (F) de extremo C en alanina (A) (apelina-13 (F13A); SEQ ID NO: 29) fue descrito por Lee, y col. 2005 (Endocrinol 146 (1): 231-236) como antagonista funcional. Tambien se informo que el antagonista de APLNr , F13A, mejora la funcion circulatoria y renal en animales con cirrosis, lo que indica que el antagonista puede haber mediado los efectos hiperactivos de un sistema de apelina regulada al alza en enfermedades patogenas como la fibrosis del hfgado (Principe, A., y col. 2008, Hepatology, 48 (4): 1193-1201). En algunos aspectos, los antagonistas de APLNR se seleccionan del grupo que consiste en apelina-13 (F13A) (SEQ ID NO: 29), [d-Ala12] -A12, ciclo (1-6)CRPRLC-KH-ciclo (9-14)CRPRLC y acetato de amida de N-alfa-acetil-nona-D-arginina (ALX40-4C; n.° de registro CAS 153127-49-2).

En otro aspecto, la protefna o polipeptido de fusion de apelina comprende una molecula de union a APLNR. En otros aspectos, la protefna o polipeptido de fusion de apelina comprende un agonista de APLNR. En algunos aspectos, el polipeptido de fusion comprende un antagonista de APLNR.

Ensayos de receptores

Se entiende que se emplean ensayos de seleccion de receptores no solo para las protefnas de fusion de apelina de la invencion, sino tambien para cualquier compuesto de prueba que incluya agonistas y antagonistas de APLNR. Muhos ensayos de seleccion de receptores para determinar la activacion o inactivacion del APLNR son muy conocidos en la tecnica.

El intercambio de nucleotidos de guanina mediado por GPCR se monitoriza midiendo la union de [35S] GTP^yS a membranas plasmaticas preparadas a partir de celulas que expresan GPCR de interes. El ensayo [35S] GTP^yS generalmente es util para los receptores acoplados a Gi/o porque Gi/o es la protefna G mas abundante en la mayorfa de las celulas y tiene una tasa de cambio de GDP-GTP mas rapida que otras protefnas G (Milligan G., 2003, Trends Pharmacol Sci, 2003,24:87-90). Los kits de ensayo de proximidad por centelleo (SPA™) disponibles comercialmente permiten la medicion de la subunidad a unida a [35S] GTP^yS deseada (PerkinElmer, Waltham, MA, EE. UU.)

La activacion de los receptores acoplados a Gi/o da como resultado una actividad disminuida de la adenilil ciclasa y, por lo tanto, la inhibicion de cAMP en la celula, a traves de las subunidades alfa G, Gi o Go. Para maximizar la senal de inhibicion, la forskolina (un activador directo de adenilato ciclasa) se utiliza generalmente para estimular la adenilil ciclasa en el ensayo, y por lo tanto el cAMP, lo que hace que la senal de inhibicion sea mas facilmente detectable. Ensayos de cAMP radiometricos SPA™ de GE Healthcare (Piscataway, NJ, EE. UU.) y Flash-Plate™ de Perkin Elmer estan disponibles, asf como tambien ensayos homogeneos basados en fluorescencia o luminiscencia (por ejemplo, AlphaScreen™ de PerkinElmer, HitHunter™ de DiscoveRx (Fremont, CA, EE. UU.) y FLIPR® de Molecular Devices (Sunnyvale, CA, EE. UU.) para medir la acumulacion de cAMP intracelular.

La accion de los GPCR que modulan los niveles de cAMP, como APLNR, puede estar vinculada a la transcripcion de la luciferasa en una celula mediante un elemento de respuesta al cAMP (CRE). Un constructo CRE-luc (luciferasa sensible a CRE) codifica un gen indicador de luciferasa bajo el control de un promotor y repeticiones en tandem del elemento de respuesta transcripcional (TRE) de CRE. Tras la activacion del receptor, la acumulacion de AMPc en la celula se mide por la cantidad de luciferasa expresada en la celula despues de la adicion de reactivos de deteccion quimioluminiscentes. Para APLNR, y otros receptores acoplados a Gi, se agrega forskolina para inducir cAMP y una disminucion en la actividad de CRE (quimioluminiscencia) indica activacion de GPCR. Se encuentran disponibles diversos kits comerciales, tales como Promega (Madison, WI, EE. UU.), SABiosciences (A Qiagen Company, Valencia, CA, EE. UU.), etc.

En algunos casos, la union del agonista al receptor puede iniciar la senalizacion mediada por la arrestina, sin desencadenar la senalizacion mediada por la protefna G o ralentizar la senalizacion mediada por la protefna G. La interaccion de la beta-arrestina (p-arrestina) con los GPCR en la superficie celular puede desacoplar las protefnas G heterotrimericas al receptor y conducir a otras cascadas de senalizacion celular. Se sabe que la p-arrestina desencadena la endocitosis y la activacion de la via ERK. En un ensayo de ejemplo, la transferencia de energfa de resonancia de bioluminiscencia o BRET se ha utilizado para estudiar la interaccion de los GPCR fusionados a Renilla luciferasa (Rlu) con p-arrestina fusionada a protefna fluorescente verde (GFP). En este ejemplo, BRET se basa en la transferencia de energfa entre GPCR-Rlu expresado recombinante y p-arrestina-GFP cuando estan muy cerca despues de la adicion del sustrato de luciferasa coelentcrazine, lo que permite la medicion de la evaluacion en tiempo real de estas protefnas. Interacciones de protefnas en celulas enteras.

Se han desarrollado otros ensayos, como los analisis PathHunter® GPCR (DiscoveRx Corp., Fremont, CA, EE. UU.) que miden directamente la actividad de GPCR detectando la interaccion de la p-arrestina con el GPCR activado. Brevemente, el GPCR se fusiona en marco con el pequeno fragmento de enzima ProLink™ y se coexpresa en celulas que expresan establemente una protefna de fusion de p-arrestina y un mutante de delecion de pgalactosidasa (es decir, p-gal, un aceptor de enzimas o EA). La activacion del GPCR estimula la union de la parrestina al GPCR etiquetado con ProLink y la complementacion de los dos fragmentos de enzima da como resultado la formacion de una enzima p-gal activa. Un aumento en la actividad de la enzima (es decir, la activacion de GPCR) se puede medir utilizando reactivos de deteccion quimioluminiscentes.

Se ha demostrado que las moleculas de p-arrestina regulan la internalizacion de GPCR (es decir, la endocitosis) luego de la activacion de los GPCR, como el APLNR. La activacion agonista de los GPCR conduce a cambios conformacionales, la fosforilacion del receptor y la activacion de la p-arrestina, u otras vfas, para mediar el secuestro de receptores de la superficie celular. El mecanismo de secuestro puede ser un medio de desensibilizacion (es decir, el receptor se degrada despues de la internalizacion) o resensibilizacion (es decir, el receptor se recicla de nuevo a la superficie celular). Vease, por ejemplo, Claing, A., y col. 2002, Progress in Neurobiology 66: 61-79, para revision.

Los antagonistas de APLNR pueden bloquear la internalizacion del receptor. Los agonistas de APLNR pueden inducir la internalizacion y/ola resensibilizacion de la APLNR (Lee, DK, y col. 2010, BBRC, 395:185-189). En algunas realizaciones, el agonista de APLNR exhibe o induce un aumento de la resensibilizacion de APLNR, segun se mide mediante un ensayo de internalizacion. En otras realizaciones, el agonista de APLNR exhibe o induce una copia incrementada del receptor de la superficie celular del APLNR, segun se mide en un ensayo de internalizacion. La medicion del grado (tal como un aumento) de la internalizacion del receptor en cualquier ensayo de internalizacion se realiza determinando la diferencia entre la medicion no internalizada (es decir, las celulas sin exposicion previa al agonista) y la medicion obtenida con el agonista en el ensayo.

El secuestro del receptor de apelina y, por lo tanto, la copia del receptor de apelina, puede medirse mediante una serie de procedimientos bien conocidos en la tecnica. La estimulacion de agonistas de APLNR puede resultar en un aumento o disminucion de la copia del receptor en la superficie de una celula particular. Por ejemplo, un agonista del receptor de apelina que induce la internalizacion de APLNR puede tener un efecto sobre la presion arterial. Los ensayos de internalizacion del receptor se realizan de forma rutinaria empleando, por ejemplo, ligandos marcados por fluorescencia o radiomarcados, o marcadores inmunofluorescentes (anticuerpos anti-receptor marcados por fluorescencia), seguidos de microscopfa y tecnicas de formacion de imagen digital (vease, por ejemplo, EI Messari y col. 2004, J Neurochem, 90:1290-1301 y Evans, N., 2004, Methods of Measuring Internalization of G Protein-Coupled Receptors. Current Protocols in Pharmacology. 24: 12.6.1-12.6.22).

La ERK fosforilada (p-ERK) se puede medir en lisados celulares de celulas que expresan los receptores APLNR para determinar la activacion de APLNR. La quinasa 1 y 2 regulada por senales extracelulares endogenas (ERK1 y ERK2), pertenecen a una familia conservada de serina/treonina protefna quinasas y participan en los eventos de senalizacion celular relacionados con un intervalo de estfmulos. La actividad quinasa de las protefnas de ERK esta regulada por la fosforilacion dual en treonina 202/tirosina 204 en ERK1, y treonina 185/tirosina 187 en ERK2. MEK1 y MEK2 son las principales quinasas en sentido ascendente responsables de ERK 1/2 en esta via. Se han identificado muchos objetivos aguas abajo de ERK 1/2, incluyendo otras quinasas y factores de transcripcion. En un ejemplo, el ensayo p-ERK 1/2 utiliza un procedimiento de ensayo por inmunoabsorcion ligado a enzimas (ELISA) para medir la fosforilacion especffica de ERK 1 en lisados celulares de cultivos celulares que expresan receptores recombinantes o endogenos. En otro ejemplo, el ensayo p-ERK 1/2 utiliza un anticuerpo primario (no conjugado) que reconoce a Thr202/Tyr204 fosforilado en ERK1 o phos-Thr185/Tyr187 en ERK2 y un anticuerpo conjugado secundario que reconoce el anticuerpo primario, mientras que El mAb conjugado secundario proporciona un procedimiento de deteccion a medida que un conjugado reacciona con un sustrato agregado de forma exogena. Varios kits comerciales se encuentran disponibles, tal como AlphaScreen® SureFire™ (PerkinElmer), ThermoScientific (Waltham, MA, EE. UU.), Sigma Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.), ELISAOne (Tg R BioSciences (Australia Meridional, Australia), etc.).

Segun se usa en el presente documento, el termino "union", tal como en el contexto de la union del ligando a un receptor (por ejemplo, GPCR) o tal como la union de un anticuerpo a un antfgeno, generalmente se refiere a una interaccion o asociacion entre un mfnimo de dos entidades, o estructuras moleculares, tal como una interaccion de receptor-ligando, o una interaccion de anticuerpo-antfgeno. Por lo tanto, una "molecula de union al receptor" se refiere a un ligando u otro resto, tal como una protefna, que se une, es decir, interactua con un receptor.

Por ejemplo, la afinidad de union entre el ligando (por ejemplo, una protefna de fusion de apelina) y el receptor (por ejemplo, un APLNR o un fragmento de union a ligando de APLNR) corresponde generalmente a un valor Kd de aproximadamente 10'7 M o menos, tal como aproximadamente 10'8 M o menos, tal como alrededor de 10'9 M o menos. La afinidad de union se puede determinar mediante uno o mas de varios procedimientos, tal como mediante la resonancia de plasmones superficiales (SPR) utilizando un instrumento BIAcore 3000. Por consiguiente, el ligando se une al receptor con una afinidad correspondiente a un valor de Kd que es al menos diez veces menor, tal como al menos 100 veces menor, por ejemplo, al menos 1.000 veces menor, tal como al menos 10.000 veces menor, por ejemplo, al menos 100.000 veces menor que su afinidad para unirse a un ligando no especffico (por ejemplo, ^bS^a , casefna).

El termino "Kd" (M), como se usa en el presente documento, se refiere a la constante de equilibrio de disociacion de una interaccion de ligando-receptor particular. Existe una relacion inversa entre K^d y la afinidad de union, por lo tanto, cuanto menor sea el valor de Kd, mayor sera la afinidad. Por lo tanto, el termino "afinidad mas baja” se relaciona con una menor capacidad para formar una interaccion y, por lo tanto, con un valor de Kd mayor.

El termino "kd" (s_1 o 1/s), tal como se usa en el presente documento, se refiere a la constante de velocidad de disociacion de una interaccion de ligando-receptor particular. Dicho valor tambien se conoce como el valor koff. El termino “ka" (M-1 x s-1 o 1/M), tal como se usa en el presente documento, se refiere a la constante de velocidad de asociacion de una interaccion de ligando-receptor particular.

El termino "Ka" (M-1 o 1/M), tal como se usa en el presente documento, se refiere a la constante de equilibrio de asociacion de una interaccion de ligando-receptor particular o la constante de equilibrio de asociacion de una interaccion de anticuerpo-antfgeno. La constante de equilibrio de asociacion se obtiene dividiendo ka entre kd.

El termino "CE⁵⁰" o "CE50", tal como se usa en el presente documento, se refiere a la concentracion efectiva maxima media, que incluye la concentracion de un ligando que induce una respuesta, por ejemplo, una respuesta celular, a medio camino entre el punto de referencia y el maximo despues de una exposicion especificado. La EC⁵⁰ representa esencialmente la concentracion de un ligando donde se observa el 50 % de su efecto maximo. Por lo tanto, con respecto a la senalizacion celular, se observa mayor la actividad con un menor valor de EC⁵⁰, es decir, el valor de concentracion efectiva maxima media (se necesita menos ligando para provocar una mayor respuesta).

En un aspecto, la union disminuida se refiere a una mayor concentracion de protefna EC⁵⁰, que permite la union maxima media al receptor o a las celulas que expresan el receptor objetivo.

En algunos aspectos, la actividad disminuida se refiere a un aumento de la concentracion de protefna EC⁵⁰, que permite la activacion celular maxima media al receptor o a las celulas que expresan el receptor objetivo.

El termino "IC⁵⁰" o "IC50", tal como se usa en el presente documento, se refiere a la concentracion inhibitoria maxima media de una respuesta celular. En otras palabras, la medicion de la eficacia de un resto particular (por ejemplo, una protefna, un compuesto o una molecula) para inhibir la funcion biologica o bioqufmica, en donde un ensayo cuantifica la cantidad de dicho resto necesaria para inhibir un proceso biologico dado. Por lo tanto, con respecto a la senalizacion celular, se observa una mayor actividad inhibitoria con un valor menor de IC⁵⁰ o de una concentracion inhibitoria maxima media.

En un aspecto, la protefna de fusion de apelina es un agonista del APLNR con una EC⁵⁰ de menos de aproximadamente 100 nM, o menos de aproximadamente 50 nM, o menos de aproximadamente 25 nM, o menos de aproximadamente 10 nM, o menos de aproximadamente 1 nM, en un ensayo in vitro que mide la activacion del APLNR. En un aspecto, la protefna de fusion de apelina comprende un dominio Fc unido al extremo N de un peptido apelina y muestra una EC50 de menos de aproximadamente 1 nM, o menos de aproximadamente 500 pM.

Protefnas de fusion de apelina

Los procedimientos para preparar protefnas de fusion son conocidos en la tecnica. En uno de estos procedimientos, se disena un vector de expresion de ADN para que contenga una secuencia de acido nucleico que codifica apelina unida en el marco a una secuencia de acido nucleico que codifica Fc de tal manera que el vector de expresion de ADN exprese un polipeptido de fusion contiguo. El peptido apelina puede estar unido al extremo C o al extremo N del polipeptido que contiene Fc. Se espera que las protefnas de fusion de apelina de la invencion sean mas estables que los peptidos apelina solos. Las protefnas estables en suero incluyen protefnas que confieren resistencia a la degradacion o tienen un aclaramiento reducido de la circulacion. Las protefnas de fusion de apelina estables en suero a modo de ejemplo incluyen SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40 y SEQ ID NO: 41. En el contexto de la construccion de protefnas de fusion, la frase "unido en el marco" significa que los componentes estan unidos entre sf de tal manera que sea posible su traduccion, uso u operacion completa y, por lo tanto, no se interrumpa. Por ejemplo, una protefna de fusion que comprende al menos dos polipeptidos puede tener o no una secuencia enlazadora o espaciadora entre los polipeptidos y, por lo tanto, los polipeptidos se unen en el marco como un polipeptido continuo, manteniendo cada polipeptido su funcionalidad. Dos o mas polipeptidos unidos o fusionados juntos en una protefna de fusion se derivan generalmente de dos o mas fuentes independientes y, por lo tanto, una protefna de fusion comprende dos o mas polipeptidos unidos que normalmente no se encuentran unidos en la naturaleza. Ademas, el ADN que codifica tales protefnas de fusion puede contener secuencias de enlace que mantienen la traduccion operable en el marco (por ejemplo, el codon triplete) de las moleculas de ARNm transcrito que codifican dichos polipeptidos.

La frase "unido de forma operativa", tal como en el contexto de construcciones de vectores de expresion de ADN, una secuencia de control, por ejemplo, un promotor u operador, se coloca de manera adecuada en una posicion relativa a una secuencia de codificacion de tal manera que la secuencia de control dirija la produccion de un polipeptido codificado por la secuencia codificante.

El termino "peptido de senal" o "secuencia peptfdica de senal" se define en el presente documento como una secuencia peptfdica generalmente presente en el extremo N de los polipeptidos secretores o de membrana recien sintetizados que dirige el polipeptido a traves de o en una membrana celular de la celula (la membrana plasmatica en procariotas y la membrana de retfculo endoplasmico en eucariotas). Por lo general, se elimina posteriormente por escision enzimatica. En algunos aspectos, dicho peptido de senal puede ser capaz de dirigir el polipeptido hacia la via secretora de una celula. En algunos aspectos, el peptido de senal comprende la secuencia de aminoacidos de 1­ 29 de raton ROR1, n.° de acceso de GenBank BAA75480 (SEQ ID NO: 10). En otros aspectos, el peptido de senal tiene al menos aproximadamente el 96 %, o al menos aproximadamente el 97 %, o al menos aproximadamente el 98 %, o al menos aproximadamente el 99 % de homologfa con la secuencia de aminoacidos del peptido de senal mostrado en SEQ ID NO: 9. En otros aspectos, el peptido de senal esta codificado por un nucleotido que tiene al menos aproximadamente el 96 %, o al menos aproximadamente el 97 %, o al menos aproximadamente el 98 %, o al menos aproximadamente el 99 % de homologfa con la secuencia del acido nucleico del peptido de senal que se muestra en SEQ ID NO: 9.

En la invencion, los componentes o peptidos de la protefna de fusion de Fc estan separados por un peptido enlazador (o "espaciador"). Tales enlazadores peptfdicos son bien conocidos en la tecnica (por ejemplo, poliglicina) y generalmente permiten el plegamiento adecuado de uno o ambos componentes de la protefna de fusion. El enlazador proporciona una region de union flexible del componente de la protefna de fusion, permitiendo que los dos extremos de la molecula se muevan independientemente, y puede desempenar un papel importante en la retencion de cada una de las funciones apropiadas de los dos grupos. Por lo tanto, la region de union actua en algunos casos como un enlazador, que combina las dos partes, y como un espaciador, que permite que cada una de las dos partes forme su propia estructura biologica y no interfiera con la otra parte. Ademas, la region de union debe crear un epitope que no sera reconocido por el sistema inmune del sujeto como extrano, en otras palabras, no se considerara inmunogenico. La seleccion del enlazador tambien puede tener un efecto sobre la actividad de union de la molecula de fusion. (Vease Huston, y col., 1988, PNAS, 85:16:5879-83; Robinson & Bates, 1998, PNAS 95(11):5929-34; Arai, y col. 2001, PEDS, 14(8):529 -32, y Chen, X. y col., 2013, Advanced Drug Delivery Reviews 65:1357-1369.) En un aspecto de la divulgacion, el peptido apelina esta conectado al extremo C o al extremo N del polipeptido que contiene Fc, o fragmento del mismo, a traves de uno o mas enlazadores peptfdicos.

La longitud de la cadena enlazadora puede ser 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 15 o mas residuos de aminoacidos, pero generalmente esta entre 5 y 25 residuos. Los ejemplos de enlazadores incluyen enlazadores de poliglicina, tales como Gly-Gly, Gly-Gly-Gly (3Gly), 4Gly, 5Gly, 6Gly, 7Gly, 8Gly or 9Gly. Los ejemplos de enlazadores tambien incluyen enlazadores peptfdicos Gly-Ser tales como Ser-Gly, Gly-Ser, Gly-Gly-Ser, Ser-Gly-Gly, Gly-Gly-Gly-Ser, Ser-Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-Gly-Gly-Ser, Ser-Gly-Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser, Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser, Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly, (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n y (Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)n, en donde n = 1 a 10. (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n y (Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)n tambien se conocen como (G4S)n y (S4G)n, respectivamente.

En la invencion, el peptido apelina esta conectado al extremo C del polipeptido que contiene Fc a traves de uno o mas enlazadores peptfdicos Gly-Ser.

En una realizacion, el enlazador peptfdico es (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)¹, (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)² , (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3, o (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)4. En una realizacion, el enlazador peptfdico comprende (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3 (SEQ ID NO: 11).

En algunos aspectos, el peptido de senal esta conectado al extremo N del polipeptido de fusion Fc a traves de uno o mas enlazadores o espaciadores peptfdicos. En algunos aspectos, el peptido de senal se codifica aguas arriba de la protefna de fusion Fc en un vector de expresion y un espaciador se codifica en el marco entre el peptido de senal y el extremo N de la protefna de fusion Fc. En otro aspecto, el enlazador o espaciador peptfdico comprende RSTGSPGSG (SEQ ID NO: 12).

Polipeptidos de fusion de apelina modificados

En otros aspectos, la secuencia de cualquier protefna de fusion Fc de la invencion puede modificarse de modo que no comprenda ningun sitio aceptor para la glicosilacion unida a N. En aun otros aspectos, la secuencia de cualquier protefna de fusion Fc de la invencion puede modificarse para potenciar o disminuir la union del anticuerpo al receptor FcRn, por ejemplo, a pH acido en comparacion con pH neutro. En otros aspectos, la secuencia de cualquier protefna de fusion Fc de la invencion puede modificarse para resistir la escision o degradacion. Como tal, la adicion de uno o mas aminoacidos de extremo C al peptido apelina de una protefna de fusion de Fc de apelina puede conferir una mayor estabilidad, tal como resistencia a la degradacion. Sin estar limitado por una teorfa, los aminoacidos de extremo C adicionales pueden eliminar la susceptibilidad a los sitios de escision dentro del peptido o la protefna de fusion. La estabilidad puede ser conferida debido a un aclaramiento disminuido o lento de la circulacion (es decir, excrecion o aclaramiento renal). Tales modificaciones a los peptidos apelina no alteran su capacidad para activar el APLNR. Los peptidos apelina modificados a modo de ejemplo se incluyen en las Tablas 3 y 4, por ejemplo, SEQ ID NO: 38, SEQ iD NO: 42, SEQ ID NO: 43 y SEQ ID NO: 44. Las protefnas de fusion de apelina de la invencion a modo de ejemplo incluyen SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40 y SEQ ID NO: 41.

En general, las protefnas, incluidas las protefnas de fusion Fc descritas en el presente documento, pueden modificarse mediante la inclusion de cualquier numero adecuado de tales aminoacidos modificados (incluidos los aminoacidos no estandar, indicados anteriormente) y/o asociaciones con sustituyentes conjugados. La idoneidad en este contexto generalmente se determina por la capacidad de retener al menos sustancialmente la selectividad y/o especificidad asociadas de la protefna de fusion Fc, por ejemplo, la union a APLNR. El aminoacido modificado puede seleccionarse, por ejemplo, entre un aminoacido glicosilado, un aminoacido PEGilado, un aminoacido farnesilado, un aminoacido geranil-geranilado, un aminoacido acetilado, un aminoacido biotinilado, un aminoacido conjugado con un resto lipfdico, o un aminoacido conjugado con un agente de derivatizacion organico, o similares. La inclusion de uno o mas aminoacidos modificados puede ser ventajosa, por ejemplo, para aumentar aun mas la semivida en suero del polipeptido, reducir la antigenicidad del polipeptido o aumentar la estabilidad de almacenamiento del polipeptido. Los aminoacidos se modifican, por ejemplo, de forma cotraduccional o postraduccional durante la produccion recombinante (por ejemplo, la glicosilacion ligada a N en los motivos N-X-S/T durante la expresion en celulas de mamfferos) o se modifican por medios sinteticos. Los ejemplos no limitantes de un aminoacido modificado incluyen un aminoacido glicosilado, un aminoacido sulfatado, un aminoacido prenilado (por ejemplo, farnesilado, geranilgeranilado), un aminoacido acetilado, un aminoacido acilado, un aminoacido acilado graso, un aminoacido PEGilado, un aminoacido biotinilado, un aminoacido carboxilado, un aminoacido fosforilado y similares. Las referencias adecuadas para guiar a un experto en la modificacion de aminoacidos son abundantes en la bibliograffa. Ejemplos de protocolos se encuentran en Walker, 1998, Protein Protocols en CD-Rom, Humana Press, Totowa, NJ

Las protefnas, incluidas las protefnas de fusion Fc de la invencion, tambien pueden modificarse qufmicamente mediante conjugacion covalente con un polfmero para, por ejemplo, aumentar aun mas su semivida circulante. Polfmeros a modo de ejemplo y procedimientos para unirlos a peptidos se ilustran en, por ejemplo, los documentos US 4.766.106, US 4.179.337, US 4.495.285 y US 4.609.546. Polfmeros ilustrativos adicionales incluyen polioles polioxietilados y polietilenglicol (PEG) (por ejemplo, un PEG con un peso molecular de entre aproximadamente 1.000 y aproximadamente 40.000, tal como entre aproximadamente 2.000 y aproximadamente 20.000, por ejemplo, aproximadamente 3.000-12.000 g/mol). Vease, por ejemplo, el documento WO2012/125408, que describe un pEgapelina-36, un polipeptido con efectos inotropicos prolongados en ratas.

En un aspecto, se proporcionan protefnas que incluyen protefnas de fusion Fc que comprenden uno o mas aminoacidos radiomarcados. Un anticuerpo radiomarcado se puede usar para fines tanto diagnosticos como terapeuticos. En otro aspecto, las protefnas, incluidas las protefnas de fusion Fc de la presente invencion, pueden conjugarse con una molecula que es un agente terapeutico o un marcador detectable. En un aspecto, el agente terapeutico es un agente citotoxico, tal como un radioisotopo. Los ejemplos de radioisotopos para polipeptidos incluyen, pero no se limitan a, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc e 125I, 131I, 186Re y 225Ac. Los procedimientos para preparar aminoacidos radiomarcados y derivados peptfdicos relacionados son conocidos en la tecnica (vease, por ejemplo, Junghans y col., en Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 (2a edicion, Chafner y Longo, eds., Lippincott Raven (1996)) y los documentos US 4.681.581, US 4.735.210, US 5.101.827, US 5.102.990 (US RE35.500), US 5.648.471 y US 5.697.902. Por ejemplo, un radioisotopo puede conjugarse por un procedimiento de cloramina T. En otros aspectos, un marcador detectable puede ser una radioetiqueta, una enzima, un cromoforo o una etiqueta fluorescente.

Sistemas de expresion

La invencion proporciona un vector de expresion que codifica un polipeptido, por ejemplo, una protefna de fusion de apelina Fc de la invencion. Tales vectores de expresion se pueden usar para la produccion recombinante de los polipeptidos de la invencion.

Un vector de expresion en el contexto de la presente invencion puede ser cualquier vector adecuado, incluyendo vectores de acidos nucleicos cromosomicos, no cromosomicos y sinteticos (una secuencia de acidos nucleicos que comprende un conjunto adecuado de elementos de control de expresion). Los ejemplos de dichos vectores incluyen derivados de SV40, plasmidos bacterianos, ADN de fagos, baculovirus, plasmidos de levadura, vectores derivados de combinaciones de plasmidos y ADN de fagos y vectores de acidos nucleicos virales (ARN o ADN). En una realizacion, una protefna de fusion Fc o una molecula de acido nucleico que codifica un polipeptido esta comprendida en un vector de ADN o ARN desnudo, que incluye, por ejemplo, un elemento de expresion lineal (tal como se describe en, por ejemplo, Sykes y Johnston, Nat Biotech 12, 355-59 (1997)), un vector de acido nucleico compactado (tal como se describe en, por ejemplo, los documentos US 6.077.835 y/o WO 00/70087), o un vector plasmfdico tal como pBR322, pUC 19/18, o pUC 118/119. Dichos vectores de acido nucleico y el uso de los mismos son muy conocidos en la tecnica (veanse, por ejemplo, los documentos US 5.589.466 y US 5.973.972).

El vector comprende una molecula de acido nucleico que codifica un polipeptido de la invencion, que incluye un vector de expresion que comprende las moleculas de acido nucleico descritas, en donde la molecula de acido nucleico esta unida de forma operativa a una secuencia de control de expresion.

En una realizacion, el vector es adecuado para la expresion de un polipeptido de la invencion en una celula bacteriana. Los ejemplos de tales vectores incluyen vectores de expresion tales como BlueScript (Stratagene), vectores pIN (Van Heeke & Schuster, 1989, J Biol Chem 264, 5503-5509), vectores pET (Novagen, Madison, WI) y similares.

Un vector de expresion tambien puede ser, o de manera alternativa, un vector adecuado para la expresion en un sistema de levadura. Se puede emplear cualquier vector adecuado para la expresion en un sistema de levadura. Los vectores adecuados incluyen, por ejemplo, vectores que comprenden promotores constitutivos o inducibles, tales como el factor alfa de levadura, alcohol oxidasa y PGH (revisado en: F. Ausubel y col., Ed., 1987, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing y Wiley InterScience Nueva York y Grant y col., 1987, Methods in Enzymol 153, 516-544).

En otras realizaciones, el vector de expresion es adecuado para la expresion en celulas de insectos infectadas con baculovirus. (Kost, T; y Condreay, JP, 1999, Current Opinion in Biotechnology 10(5):428-33.)

Se proporciona un vector que comprende una molecula de acido nucleico de la invencion, en el que la molecula de acido nucleico esta unida de forma operativa a una secuencia de control de expresion adecuada para la expresion en una celula huesped de mamffero.

Las secuencias de control de expresion estan disenadas para controlar y dirigir la transcripcion de genes de interes y la expresion posterior de protefnas en varios sistemas celulares. Los plasmidos combinan un gen de interes expresable con secuencias de control de la expresion (es decir, casetes de expresion) que comprenden elementos deseables tales como, por ejemplo, promotores, potenciadores, marcadores seleccionables, operadores, etc. En un vector de expresion de la invencion, la protefna de fusion Fc o las moleculas de acido nucleico que codifican anticuerpos pueden comprender o estar asociadas con cualquier promotor, potenciador, marcador seleccionable, operador, protefna represora, secuencias de terminacion poliA y otros elementos facilitadores de la expresion.

"Promotor", tal como se usa en el presente documento, indica una secuencia de ADN suficiente para dirigir la transcripcion de una secuencia de ADN a la cual esta unida de forma operativa, es decir, que esta unida de tal manera que permite la transcripcion de la protefna de fusion Fc o la secuencia de nucleotidos que codifican anticuerpos cuando las senales apropiadas estan presentes. La expresion de una protefna de fusion Fc o secuencia de nucleotidos que codifica un anticuerpo se puede colocar bajo el control de cualquier elemento promotor o potenciador conocido en la tecnica. Los ejemplos de tales elementos incluyen promotores de expresion fuertes (por ejemplo, promotor/potenciador IE de CMV humano o promotor IE principal de CMV (CMV-MIE), asf como rSv , promotor tardfo de SV40, promotores de SL3-3, MMTV, ubiquitina (ubi), ubiquitina C (UbC) y LTR de VIH).

En algunas realizaciones, el vector comprende un promotor seleccionado del grupo que consiste en SV40, CMV, CMV-IE, CMV-MIE, RSV, SL3-3, MMTV, Ubi, UbC y LTR de VIH.

Las moleculas de acido nucleico de la invencion tambien pueden unirse de forma operativa a una secuencia de terminacion poli (A) eficaz, un origen de replicacion para el producto plasmido en E. coli, un gen de resistencia a antibioticos como marcador seleccionable y/o un sitio de clonacion conveniente (por ejemplo, un polienlazador). Los acidos nucleicos tambien pueden comprender un promotor inducible regulable (inducible, reprimible, regulado por el desarrollo) a diferencia de un promotor constitutivo como el IE de CMV (el experto en la materia reconocera que dichos terminos son en realidad descriptores de un grado de expresion genica en ciertas condiciones).

Los marcadores seleccionables son elementos muy conocidos en la tecnica. Bajo las condiciones selectivas, solo las celulas que expresan el marcador seleccionable apropiado pueden sobrevivir. Comunmente, los genes marcadores seleccionables expresan protefnas, generalmente enzimas, que confieren resistencia a varios antibioticos en cultivos celulares. En otras condiciones selectivas, las celulas que expresan un marcador de protefna fluorescente se hacen visibles y, por lo tanto, son seleccionables. Las realizaciones incluyen beta-lactamasa (bla) (gen de resistencia a antibioticos beta-lactamicos o de resistencia a ampicilina o ampR), bls (gen de la acetil transferasa de la resistencia a blasticidina), bsd (gen de la resistencia a la blasticidina-S-desaminasa), bsr (gen de resistencia a la blasticidina-S), Sh ble (gen de resistencia a Zeocin®), higromicina fosfotransferasa (hpt) (gen de resistencia a higromicina), tetM (gen de resistencia a tetraciclina o tetR), neomicina fosfotransferasa II (npt) (gen de resistencia a neomicina o neoR), kanR (gen de resistencia a kanamicina) y pac (gen de resistencia a puromicina).

En ciertas realizaciones, el vector comprende uno o mas genes marcadores seleccionables seleccionados del grupo que consiste en bla, bls, BSD, bsr, Sh ble, hpt, tetR, tetM, npt, kanR y pac. En otras realizaciones, el vector comprende uno o mas genes marcadores seleccionables que codifican protefna fluorescente verde (GFP), protefna fluorescente verde mejorada (eGFP), protefna fluorescente ciano (CFP), protefna fluorescente ciano mejorada (eCFP) o protefna fluorescente amarilla (YFP).

Para los fines de la presente invencion, la expresion genica en celulas eucariotas puede estar fuertemente regulada usando un promotor fuerte que esta controlado por un operador que, a su vez, esta regulado por una protefna reguladora, que puede ser una "protefna de fusion reguladora" (RFP) recombinante. La RFP consiste esencialmente en un dominio de bloqueo de la transcripcion y un dominio de union a ligando que regula su actividad. Ejemplos de tales sistemas de expresion se describen en el documento US20090162901A1.

Tal como se usa en el presente documento, "operador" indica una secuencia de ADN que se introduce en o cerca de un gen de tal manera que el gen pueda ser regulado por la union de la RFP al operador y, como resultado, evite o permita la transcripcion del gen de interes, es decir, un nucleotido que codifica un polipeptido de la invencion. Se han caracterizado varios operadores en celulas procariotas y bacteriofagos (Neidhardt, ed., Escherichia coli and Salmonella; Cellular and Molecular Biology 2d, Vol 2 ASM Press, Washington D.C. 1996). Estos incluyen, pero no se limitan a, la region operadora del gen LexA de E. coli, que se une al peptido LexA, y los operadores de lactosa y triptofano, que se unen a las protefnas represoras codificadas por los genes LacI y trpR de E. coli. Estos tambien incluyen los operadores de bacteriofagos de lambda P^r y los genes P22 ant/mn de fagos, que se unen a las protefnas represoras codificadas por lambda cl y P22 arc. En algunas realizaciones, cuando el dominio de bloqueo de la transcripcion de la RFP es una enzima de restriccion, como Notl, el operador es la secuencia de reconocimiento de dicha enzima. Un experto en la materia reconocera que el operador debe estar ubicado adyacente al promotor, o 3', de modo que sea capaz de controlar la transcripcion por parte del promotor. Por ejemplo, la patente de EE.UU. n.° 5.972.650 especifica que las secuencias tetO deben estar a una distancia especffica de la caja TATA. En realizaciones especfficas, el operador se coloca preferiblemente aguas abajo del promotor. En otras realizaciones, el operador se coloca dentro de 10 pares de bases del promotor.

En ciertas realizaciones, el operador se selecciona del grupo que consiste en el operador tet (tetO), la secuencia de reconocimiento Notl (no del conocimiento de la presente invencion; segun el conocimiento de la presente invencion Notl es una enzima de restriccion), el operador LexA, el operador de lactosa, el operador de triptofano y el operador de Arc (AO). En algunas realizaciones, la protefna represora se selecciona del grupo que consiste en TetR, LexA, LacI, TrpR, Arc, LambdaC1 y GAL4. En otras realizaciones, el dominio de bloqueo de la transcripcion se deriva de una protefna represora eucariota, por ejemplo, un dominio represor derivado de GAL4. Los operadores bacterianos pueden emplearse en mamfferos y otros sistemas de celulas huesped (vease, por ejemplo, el documento US 20090162901A1).

En un sistema de expresion celular a modo de ejemplo, las celulas se disenan para expresar la protefna represora de tetraciclina (TetR) y una protefna de interes se coloca bajo el control transcripcional de un promotor cuya actividad esta regulada por TetR. Dos operadores TetR en tandem (tetO) se colocan inmediatamente aguas abajo de un promotor/potenciador CMV-MIE en el vector. La transcripcion del gen que codifica la protefna de interes dirigida por el promotor CMV-MIE en dicho vector puede ser bloqueada por TetR en ausencia de tetraciclina o algun otro inductor adecuado (por ejemplo, doxiciclina). En presencia de un inductor, la protefna TetR es incapaz de unirse a tetO, por lo tanto, se produce la transcripcion y luego la traduccion (expresion) de la protefna de interes. (Vease, por ejemplo, la patente de EE.UU. n.° 7.435.553).

Otro ejemplo de sistema de expresion celular incluye protefnas de fusion reguladoras, tales como la protefna de fusion TetR-ERLBDT2, en la que el dominio de bloqueo de la transcripcion de la protefna de fusion es TetR y el dominio de union al ligando es el dominio de union al ligando del receptor de estrogeno (ERlbd) con mutaciones T2 (ERlbdT2; Feil y col., 1997, Biochem. Biophys. Res. Commun. 237:752-757). Cuando las secuencias de tetO se colocan corriente abajo y cerca del promotor CMV-MIE potente, la transcripcion de la secuencia de nucleotidos de interes del promotor CMV-MIE/tetO se bloqueo en presencia de tamoxifeno y se desbloqueo mediante la eliminacion de tamoxifeno. En otro ejemplo, el uso de la protefna de fusion Atc2-ERlbdT2, una protefna de fusion que consiste en un dfmero de cadena unica que consiste en dos protefnas Arc conectadas por un enlazador de 15 aminoacidos y el ERlbdT2 (supra), implica un operador de Arco (AO), mas especfficamente dos operadores de Arc en tandem inmediatamente corriente abajo del promotor/potenciador CMV-MIE. Las lfneas celulares pueden ser reguladas por Arc2-ERLBDT2, en donde las celulas que expresan la protefna de interes son impulsadas por un promotor c MV-MIE/ArcO2 y son inducibles mediante la eliminacion de tamoxifeno. (Vease, por ejemplo, el documento US 20090162901A1).

En algunas realizaciones, un vector de la invencion comprende un promotor hfbrido de CMV-MIE/TetO o CMV-MIE/AO2.

Los vectores de la invencion tambien pueden emplear herramientas de recombinacion Cre-lox para facilitar la integracion de un gen de interes en un genoma huesped. Una estrategia de Cre-lox requiere al menos dos componentes: 1) Cre recombinasa, una enzima que cataliza la recombinacion entre dos sitios loxP; y 2) sitios loxP (por ejemplo, una secuencia de 34 pares de base pb especffica que consiste en una secuencia nucleo de 8 pb, donde tiene lugar la recombinacion, y dos repeticiones invertidas flanqueantes de 13 pb) o sitios lox mutantes. (Vease, por ejemplo, Araki y col., 1995, PN^a S 92: 160-4; Nagy, A. y col., 2000, Genesis 26:99-109; Araki y col., 2002, Nuc Acids Res 30(19):e103 y el documento US20100291626A1). En otra estrategia de recombinacion, la FLP recombinasa derivada de levadura se puede utilizar con la secuencia de consenso FRT (vease tambien, por ejemplo, Dymecki, S.M., 1996, PNAS 93 (12): 6191-6196).

En otro aspecto, un gen (es decir, una secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido recombinante de la invencion) se inserta dentro de una secuencia que potencia la expresion del casete de expresion y esta opcionalmente unido de forma operativa a un promotor, en donde el gen unido al promotor esta flanqueado 5' por un primer sitio de reconocimiento de recombinasa y 3' por un segundo sitio de reconocimiento de recombinasa. Dichos sitios de reconocimiento de recombinasa permiten la recombinacion mediada por Cre en la celula huesped del sistema de expresion. En algunos casos, un segundo gen unido a un promotor esta aguas arriba (3') del primer gen y esta flanqueado 3' por el segundo sitio de reconocimiento de la recombinasa. En otros casos, un segundo gen unido a un promotor esta flanqueado 5' por el segundo sitio de recombinasa, y flanqueado 3' por un tercer sitio de reconocimiento de recombinasa En algunas realizaciones, los sitios de reconocimiento de recombinasa se seleccionan de un sitio loxP, un sitio lox511, un sitio lox2272 y un sitio FRT. En otras realizaciones, los sitios de reconocimiento de recombinasa son diferentes. En una realizacion adicional, la celula huesped comprende un gen capaz de expresar una recombinasa Cre.

En algunas realizaciones, el vector comprende ademas un gen de la protefna de union X-box 1 (mXBP1) capaz de aumentar la produccion de protefnas/la secrecion de protefnas mediante el control de la expresion de los genes implicados en el plegamiento de protefnas en el retfculo endoplasmico (ER). (Vease, por ejemplo, Ron D, y Walter P., 2007, Nat Rev Mol Cell Biol. 8: 519-529).

El termino "celula" incluye cualquier celula que sea adecuada para expresar una secuencia de acido nucleicos recombinantes. Las celulas incluyen las procariotas y eucariotas (de una sola celula o de multiples celulas), celulas bacterianas (por ejemplo, cepas de E. coli, Bacillus spp., Streptomyces spp., etc.), celulas de micobacterias, celulas fungicas, celulas de levadura (por ejemplo, S. cerevisiae, S. pombe, P. partoris, P. methanolica, etc.), celulas vegetales, celulas de insecto (por ejemplo, SF-9, SF-21, celulas de insecto infectadas con baculovirus, Trichoplusia ni, etc.), celulas animales no humanas, celulas de mamfferos, celulas humanas o fusiones celulares tales como, por ejemplo, hibridomas o cuadromas. En ciertas realizaciones, la celula es una celula humana, de mono, simio, hamster, rata o raton. En otras realizaciones, la celula es eucariota y se selecciona de las siguientes celulas: CHO (por ejemplo, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS (por ejemplo, COS-7), celulas retinianas, Vero, CV1, rinon (por ejemplo, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK21), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo25, HB 8065, HL-60, Jurkat, Daudi, A431 (epidermica), CV-1, U937, 3T3, Celulas L, celulas C127, SP2/0, NS-0, celulas MMT, celulas tumorales y una lfnea celular derivada de una celula mencionada anteriormente. En algunas realizaciones, la celula comprende uno o mas genes virales, por ejemplo, una celula retiniana que expresa un gen viral (por ejemplo, una celula PER.C6®).

En algunas realizaciones, la celula es una celula CHO. En otras realizaciones, la celula es una celula CHO K1. Por ejemplo, en una realizacion, la presente invencion proporciona una celula huesped que comprende un acido nucleico integrado de manera estable en el genoma celular que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica la expresion de un polipeptido recombinante de la presente invencion. En otra realizacion, la presente invencion proporciona una celula que comprende un acido nucleico no integrado (es decir, episomal), tal como un plasmido, cosmido, fagemido o elemento de expresion lineal, que comprende una secuencia que codifica la expresion de un polipeptido recombinante de la invencion. En otras realizaciones, la presente invencion proporciona una lfnea celular producida transfectando de manera estable una celula huesped con un plasmido que comprende un vector de expresion de la invencion.

En un aspecto adicional, la divulgacion se refiere a un procedimiento para producir una protefna de fusion Fc de la invencion, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de a) cultivar una celula huesped de la invencion como se describe en el presente documento anteriormente y b) purificar la protefna fusion Fc (supra) de los medios de cultivo. Usos terapeuticos y diagnosticos

En un aspecto adicional, la divulgacion se refiere a una composicion que comprende un polipeptido o protefna de fusion de apelina tal como se define en el presente documento.

Las composiciones pueden formularse con vehfculos o diluyentes farmaceuticamente aceptables, asf como adyuvantes y excipientes conocidos de acuerdo con tecnicas convencionales tales como las descritas en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19a edicion, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995, y utilizando la experimentacion de ensayo y error.

Los vehfculos o diluyentes farmaceuticamente aceptables, asf como cualquier otro adyuvante y excipiente conocidos, deben ser adecuados para la fusion de apelina elegida o la protefna de fusion Fc de apelina de la presente invencion y el modo de administracion elegido. Los niveles de dosificacion reales de los ingredientes activos en las composiciones farmaceuticas de la presente invencion pueden variarse para obtener una cantidad del ingrediente activo que sea eficaz para lograr la estabilidad apropiada de la sustancia farmacologica, la respuesta terapeutica deseada para un paciente, la composicion y el modo de administracion particular. El nivel de dosificacion seleccionado dependera de una variedad de factores farmacocineticos.

La composicion farmaceutica se puede administrar por cualquier via y modo adecuados. Las vfas adecuadas de administracion de una protefna de fusion de apelina de la presente invencion in vivo son muy conocidas en la tecnica y pueden ser seleccionadas por los expertos en la materia. (Daugherty, AL, y Msrny, RJ, 2006, Adv Drug Delivery Rev, 58 (5-6): 686-706).

Las protefnas de fusion de apelina son agentes administrados para el tratamiento de afecciones cardiovasculares, tales como agentes inotropicos, especfficamente agentes inotropicos positivos. Sin limitarse a una teorfa particular, los agentes inotropicos positivos aumentan la contractilidad miocardica y se usan para sostener la funcion cardfaca en afecciones como la insuficiencia cardfaca congestiva, el infarto de miocardio, la miocardiopatfa y otras. (Vease Dai, y col., 2006, Eur J Pharmacol 553 (1-3): 222-228; Maquire, y col., Hypertension. 2009; 54: 598-604; y Berry, M., y col., 2004 Circulation, 110:11187-11193.) La vasodilatacion inducida por apelina puede brindar proteccion en la lesion por isquemia-reperfusion. La promocion de la angiogenesis y la induccion de grandes vasos no permeables mediante peptidos apelina pueden contribuir a la recuperacion funcional de la isquemia. (Eyries M, y col., 2008, Circ Res 103: 432-440; Kidoya H, y col., 2010, Blood 115: 3166-3174).

Los agonistas del receptor de apelina se consideran agentes proangiogenicos que se administran para aumentar la respuesta cardfaca, mejorar la funcion cardfaca, estabilizar la funcion cardfaca, limitar la disminucion de la funcion cardfaca o promover el crecimiento de nuevos vasos sangufneos en una zona isquemica o danada del corazon u otro tejido. Por lo tanto, los agonistas del receptor de apelina de la invencion son utiles para promover la angiogenesis y, por lo tanto, tratar la isquemia, reestablecer el flujo sangufneo a los organos y tejidos isquemicos, por ejemplo, para tratar la isquemia de las extremidades, la isquemia periferica, la isquemia renal, la isquemia ocular, la isquemia cerebral o cualquier enfermedad isquemica.

Las protefnas de fusion de apelina de la invencion son agentes administrados para aumentar el flujo sangufneo o aumentar la contractilidad cardfaca, como para tratar o aliviar la isquemia y la insuficiencia cardfaca.

Las protefnas de fusion de apelina son agentes que se administran para tratar o aliviar la lesion por isquemia y reperfusion, tal como para limitar la lesion por isquemia/reperfusion (I/R) o retrasar la aparicion de necrosis del tejido cardfaco o proporcionar un tratamiento preventivo, por ejemplo, para proteger el corazon de la lesion por isquemia/reperfusion (I/R), mejorar la funcion cardfaca o limitar el desarrollo del infarto de miocardio.

Las protefnas de fusion de apelina son agentes que se administran para tratar afecciones metabolicas relacionadas con la diabetes y la obesidad. La apelina mejora la tolerancia a la glucosa y potencia la utilizacion de la glucosa, por parte del tejido muscular, en ratones obesos resistentes a la insulina (Dray y col., 2008, Cell Metab 8: 437-445). Los ratones con inactivacion de la apelina presentan una menor sensibilidad a la insulina (Yue y col., 2010, Am J Physiol Endocrinol Metab 298: E59-E67). Por lo tanto, las protefnas de fusion de apelinan son agentes administrados para mejorar la tolerancia a la glucosa en el tratamiento de la diabetes resistente a la insulina.

Los cambios en los niveles de ARNm de la apelina muscular tambien se correlacionan con las mejoras de la sensibilidad a la insulina en todo el cuerpo (Besse-Patin, A. y col., 27 de agosto de 2013, Int J Obes (Lond). doi: 10.1038/ijo.2013.158, publicacion electronica previa a la impresion). Debido a tales mejoras metabolicas en el tejido muscular y a la vasodilatacion inducida por apelina, las protefnas de fusion de apelina agonistas tambien se pueden administrar para estimular el crecimiento y la resistencia muscular.

Se ha demostrado que los aislamientos primarios de VIH-1 tambien pueden usar APLNR como correceptor y que los peptidos apelina sinteticos inhibieron la entrada de VIH-1 en celulas que expresan CD4-APLNR (Cayabyab, M., y col., 2000, J. Virol. 74: 11972-11976). Las protefnas de fusion de apelina se administran para tratar la infeccion por VIH.

La neuroproteccion de la apelina tambien se observa cuando los peptidos apelina actuan a traves de vfas de senalizacion para promover la supervivencia neuronal (Cheng, B, y col., 2012, Peptides, 37(1):171-3). Las protefnas de fusion de apelina se administran para promover o aumentar la supervivencia de las neuronas.

Un agonista del receptor de apelina tambien se describe como un supresor de sofocos. (Vease el documento WO2012/133825, publicado el 4 de octubre de 2012.) Las protefnas de fusion de apelina de la invencion tambien pueden administrarse para tratar, mejorar o suprimir los sfntomas de sofocos en un sujeto.

El peptido apelina puede promover la obesidad a traves de la expansion del tejido adiposo. La apelina es inducida por la hipoxia y produce la angiogenesis dentro del interior hipoxico del tejido adiposo en expansion. (Kunduzova O, y col., 2008, FASEB J, 22:4146-4153). Sin embargo, algunas protefnas de fusion de apelina son antagonistas de la APLNR que actuan como agentes inhibidores de este mecanismo, de manera especffica para el tejido, para promover la perdida de peso o tratar la obesidad. Por lo tanto, las protefnas de fusion de apelina son agentes de bloqueo que se administran para tratar la obesidad y para promover la perdida de peso.

La angiogenesis patologica, que participa en la promocion del crecimiento tumoral o la neovascularizacion en la retina, puede responder a la apelina o al antagonista de APLNR. (Kojima, Y. y Quertermous, T., 2008, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 28:1687-1688; Rayalam, S. y col. 2011, Discovery Anticancer Drug Discov 6(3):367-72). Por lo tanto, las protefnas de fusion de apelina son agentes inhibidores que se administran para retardar el crecimiento del tumor o la metastasis o para tratar el cancer y la enfermedad metastasica. Las protefnas de fusion de apelina tambien se administran para tratar la retinopatfa.

Los antagonistas de APLNR tambien pueden reducir la angiogenesis y mejorar la funcion, como en los tejidos fibroticos, mejorando los efectos de un sistema de apelina hiperactivo causado por una enfermedad patogenica (Principe, y col., 2008; Reichenbach, y col., 2012, JPET 340(3):629-637). Sin limitarse a ninguna teorfa, el bloqueo del sistema de apelina puede retardar la formacion de tejido conjuntivo fibroso en exceso en un organo o tejido en un proceso reparador o reactivo, tal como en una afeccion patologica como la cirrosis. Por lo tanto, las protefnas de fusion de apelina se pueden usar como agentes inhibidores que se administran para retardar o prevenir la progresion de la fibrosis, o para tratar la fibrosis.

En algunos aspectos de la divulgacion, las protefnas de fusion Fc de la invencion proporcionan un procedimiento para el tratamiento de una enfermedad o afeccion, comprendiendo el procedimiento la administracion a un sujeto que lo necesite de una cantidad terapeuticamente eficaz de una protefna de fusion de apelina suficiente para tratar la enfermedad o afeccion.

En un aspecto de la divulgacion, en el presente documento se proporciona un procedimiento para el tratamiento de una enfermedad o afeccion relacionada con la apelina en un sujeto que lo necesite, comprendiendo el procedimiento la administracion al sujeto de una cantidad terapeuticamente eficaz de una protefna de fusion de apelina.

En algunos aspectos, la protefna de fusion de apelina comprende un polipeptido que comprende un peptido apelina fusionado a un dominio Fc, o un fragmento del mismo.

Las enfermedades o afecciones se seleccionan del grupo que consiste en enfermedades cardiovasculares, insuficiencia cardfaca descompensada aguda, insuficiencia cardfaca congestiva, infarto de miocardio, cardiomiopatfa, isquemia, lesion por isquemia/reperfusion, hipertension pulmonar, diabetes, obesidad, cancer, enfermedad metastasica, homeostasis de fluidos, angiogenesis patologica, retinopatfa e infeccion por VIH.

En algunas realizaciones, la protefna de fusion de apelina es un agonista de APLNR util para tratar una enfermedad o afeccion seleccionada del grupo que consiste en enfermedad cardiovascular, insuficiencia cardfaca descompensada aguda, insuficiencia cardfaca congestiva, infarto de miocardio, cardiomiopatfa, isquemia, lesion por isquemia/reperfusion, hipertension pulmonar, diabetes, sfntomas de sofocos, homeostasis de fluidos e infeccion por VIH. En otra realizacion, la protefna de fusion de apelina es un agonista de APLNR que promueve la supervivencia de las celulas neuronales. En otra realizacion, la protefna de fusion de apelina es un agonista de APLNR que disminuye la sensibilidad a la insulina.

En algunas realizaciones, la protefna de fusion de apelina es un antagonista de APLNR util para tratar una enfermedad o afeccion seleccionada del grupo que consiste en obesidad, cancer, enfermedad metastasica, retinopatfa, fibrosis y angiogenesis patologica. En una realizacion, la protefna de fusion de apelina es un antagonista de APLNR que promueve la perdida de peso. En una realizacion, la protefna de fusion de apelina es un antagonista de APLNR que disminuye la angiogenesis patologica o la neovascularizacion. En otras realizaciones, la protefna de fusion de apelina es un antagonista de APLNR que disminuye o inhibe el crecimiento tumoral.

Tal como se usa en el presente documento, una "cantidad terapeuticamente eficaz" de una protefna de fusion Fc significa una cantidad suficiente para mejorar, aliviar o detener parcialmente las manifestaciones clfnicas de una enfermedad dada y sus complicaciones en una intervencion terapeutica que comprende la administracion de dicha protefna. Una cantidad adecuada para lograr esto se define como "cantidad terapeuticamente eficaz". Las cantidades eficaces para cada proposito dependeran de la gravedad de la enfermedad o lesion, asf como del peso y el estado general del sujeto.

En el presente contexto, los terminos "tratamiento" y "tratar" se refieren al manejo y cuidado de un paciente con el fin de combatir una afeccion, como una enfermedad o un trastorno. El termino pretende incluir el espectro completo de tratamientos para una afeccion determinada que sufre el paciente, como la administracion del ingrediente activo (protefna de fusion Fc) para aliviar o mitigar los sfntomas y/o complicaciones, para retrasar la progresion de la enfermedad, trastorno o afeccion y/o para curar o eliminar la enfermedad, el trastorno o la afeccion, asf como para prevenir la afeccion, en el que la prevencion debe entenderse como el manejo y cuidado de un paciente con el fin de detener la progresion de la enfermedad e incluye la administracion de los ingredientes activos para prevenir la aparicion de los sfntomas o complicaciones. No obstante, los tratamientos preventivos, paliativos y terapeuticos (curativos) son aspectos de la invencion. El sujeto que se ha de tratar es un mamffero, en particular un ser humano. El tratamiento puede ser tratamiento de mantenimiento, prevencion de recurrencias o estabilizacion de la enfermedad o afeccion.

La presente divulgacion incluye composiciones y formulaciones terapeuticas que comprenden cualquiera de las protefnas de fusion de apelina descritas en el presente documento en combinacion con uno o mas componentes terapeuticamente activos adicionales y procedimientos de tratamiento que comprenden la administracion de dichas combinaciones a sujetos que lo necesiten.

Dichos componentes terapeuticamente activos adicionales incluyen inhibidores de VEGF, medicamentos para la presion arterial, bloqueadores de los canales de calcio, digitalicos, antiarrftmicos, inhibidores de ACE, anticoagulantes, inmunosupresores, analgesicos, vasodilatadores, etc.

Las protefnas de fusion de apelina de la invencion proporcionan agentes con propiedades farmacocineticas mejoradas, tales como la semivida y la estabilidad en suero circulante en comparacion con los peptidos apelina que no tienen un dominio Fc o fragmento de un dominio Fc. En una realizacion, el nivel serico posterior a la inyeccion de la protefna de fusion de apelina aumenta o se eleva en mas de aproximadamente 1 hora, o mas de aproximadamente 2 horas, o mas de aproximadamente 3 horas, o mas de aproximadamente 4 horas, o mas de aproximadamente 5 horas horas, o mas de aproximadamente 10 horas, o mas de aproximadamente 24 horas. En otras realizaciones, la protefna de fusion de apelina tiene una semivida en suero o plasma de mas de aproximadamente 10 minutos, o mas de aproximadamente 1 hora, o mas de aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o mas de aproximadamente 10 horas, o mas de aproximadamente 24 horas.

Las protefnas de fusion de apelina marcadas de la invencion pueden usarse con fines de diagnostico para detectar, diagnosticar o controlar enfermedades o trastornos. La divulgacion proporciona la deteccion o el diagnostico de una enfermedad o trastorno, que comprende: (a) evaluar la existencia del receptor de apelina (APLNR) en celulas o muestras de tejido de un sujeto usando una o mas protefnas de fusion de apelina que se unen inmunoespecfficamente al APLNR objetivo; y (b) comparar el nivel de APLNR con un nivel de control, por ejemplo, niveles en muestras de tejido normal, donde un aumento del nivel analizado de APLNR en comparacion con el nivel de control de APLNR es indicativo de la enfermedad o el trastorno, o indicativo de la gravedad de la enfermedad o del trastorno.

Las protefnas de fusion de apelina de la invencion se pueden usar para analizar los niveles de APLNR en una muestra biologica usando procedimientos inmunohistoqufmicos muy conocidos en la tecnica. Otros procedimientos basados en apelina utiles para detectar la protefna APLNR incluyen inmunoensayos como el inmunoensayo unido a enzimas (ELISA) y el radioinmunoensayo (RIA). En tales kits y procedimientos se pueden usar marcadores de protefnas de fusion de apelina, incluyendo los marcadores conocidos en la tecnica marcadores de enzimas, tales como la fosfatasa alcalina y la glucosa oxidasa; etiquetas de radioisotopos, como yodo (115I, 131I), carbono (14C), azufre (35S), tritio (3H), indio C21In y tecnecio (99mTc); y etiquetas luminiscentes, tales como luminol y luciferasa; y etiquetas fluorescentes, tales como fluorescefna y rodamina.

La presencia de protefnas de fusion de apelina marcadas puede detectarse in vivo con fines de diagnostico. En un aspecto, el diagnostico comprende: a) administrar a un sujeto una cantidad eficaz de protefnas de fusion de apelina marcadas; b) esperar durante un intervalo de tiempo despues de la administracion para permitir que la protefna de fusion de apelina marcada se concentre en los sitios en los que se puede detectar APLNR y para permitir que la protefna de fusion de apelina marcada no unida se aclare hasta alcanzar el nivel de referencia; c) determinar un nivel de referencia; y d) detectar la protefna de fusion de apelina marcada en el sujeto, de modo que la deteccion de la protefna de fusion de apelina marcada por encima del nivel de referencia sea indicativa de que el sujeto presenta un aumento de protefna APLNR, que tiene la enfermedad o trastorno, o que el aumento de la protefna APLNR es indicativo de la gravedad de la enfermedad o trastorno. De acuerdo con dicho aspecto, la protefna de fusion de apelina esta marcada con un resto de formacion de imagenes adecuado para la deteccion utilizando un sistema de formacion de imagenes particular conocido por los expertos en la materia. Los niveles de referencia pueden determinarse mediante diversos procedimientos conocidos en la tecnica, incluyendo la comparacion de la cantidad de protefna de fusion de apelina marcada detectada con un valor estandar previamente determinado para un sistema de formacion de imagenes en particular. Los procedimientos y sistemas que se pueden usar en los procedimientos de diagnostico incluyen, pero no se limitan a, tomograffa computarizada (TC), exploracion corporal toal, como tomograffa por emision de positrones (TEP), imagenes por resonancia magnetica (IRM) y ecograffa. La invencion tambien proporciona un kit (por ejemplo, un kit farmaceutico) que comprende uno o mas recipientes llenos con al menos una protefna de fusion activadora de la invencion. Los kits de la invencion se pueden usar en cualquier procedimiento aplicable, incluyendo, por ejemplo, el diagnostico. Opcionalmente asociado con dicho(s) recipiente(s) puede haber un aviso en la forma prescrita por un organismo gubernamental que regula la fabricacion, el uso o la venta de productos farmaceuticos o productos biologicos, que refleje la autorizacion por parte de tal organismo de la fabricacion, el uso o la venta para administracion humana, (b) instrucciones de uso, o (c) tanto la autorizacion para la fabricacion como las instrucciones de uso.

Ensayos ex vivo e in vivo

Las protefnas de fusion Fc de apelina de la invencion mantienen una actividad sustancial con respecto al APLNR al tiempo que prolongan la semivida en suero. La transduccion de senales de APLNR proporciona el nexo entre las protefnas de fusion Fc de apelina y los efectos terapeuticos y biologicos conocidos de la apelina. Por lo tanto, cualquier demostracion de un efecto de la protefna de fusion Fc de apelina sobre la actividad de APLNR in vitro, ex vivo o in vivo proporciona pruebas razonables de un efecto biologico o medico in vivo de la protefna de fusion Fc de apelina en un paciente o animal. Entre otros estudios, se ha demostrado que apelina/APLNR es un sistema de proteccion endogeno contra la lesion por isquemia/reperfusion (I/R) miocardica y los efectos antiapoptoticos de la activacion de apelina/APLNR, especfficamente PERK, que protege contra dicha lesion (Zeng, y col. 2009, Peptides, 30(6):1144-52, publicacion electronica de 24 de febrero de 2009).

Los agonistas de APLNR, incluyendo los peptidos apelina endogenos, los analogos de apelina y los peptidos apelina modificados, demuestran la actividad terapeutica en varios ensayos in vivo (por ejemplo, PEG-apelina-36, como en el documento WO2012125408 y agonistas de apelina no peptfdicos como en Iturrioz, X. y col. 2010, FASEB J, 24(5):1506-17. Publicacion electronica de 29 de diciembre de 2009).

Se ha demostrado que el antagonismo de APLNR produce un aumento de la frecuencia cardfaca y la contractilidad cardfaca (Ashley, eA, y col. 2005, Cardiovasc Res. 65 (1): 73-82). Ademas, se ha demostrado que el peptido apelina altera la electrofisiologfa de los cardiomiocitos. Se utilizaron tecnicas de fijacion de membranas de celulas completas para investigar el potencial de accion (AP) y las corrientes ionicas en miocitos aislados de auricula izquierda (LA) de conejo antes y despues de la administracion de apelina (vease, por ejemplo, Farkasfalvi, K., y col., 2007, Biochem Biophys Res Commun. 357(4):889-95. Publicacion electronica de 12 de abril de 2007; y Cheng, CC, y col., 2013, Eur J Clin Invest. 43(1):34-40. Publicacion electronica de 28 de octubre, 2012). La isotropfa inducida por el agonismo de apelina tambien se puede evaluar midiendo los parametros de ECG en corazones aislados de ratones o ratas utilizando un sistema de Langendorf o de funcionamiento del corazon. Dichas tecnicas electrofisiologicas e in vivo, como el microultrasonido o la ecocardiograffa, se utilizan para evaluar la accion terapeutica de los polipeptidos de la invencion.

Los efectos protectores de los polipeptidos de fusion Fc de apelina pueden evaluarse despues de una lesion por isquemia/reperfusion (I/R) miocardica o hipoxia/reoxigenacion (H/R) en corazones de ratas o ratones aislados como en el sistema de Langendorf (ver, por ejemplo, Zeng, y col. 2009, Peptides, 30(6):1144-52, publicacion electronica de 24 de febrero de 2009; Pisarenko, y col. 2010, Kardiologiia, 50(10):44-9 y Pisarenko, y col., 2013, J Pharmacol Pharmacother. "Effects of structural analogues of apelin-12 in acute myocardial infarction in rats", publicacion electronica previa a la impresion).

Tambien se puede realizar ligadura de LAD transitoria con administracion de agonista de apelina antes de la reperfusion. (Vease Pisarenko, y col. 2011, Bull Exp Biol Med. 152(1):79-82; Li, L. y col., 2012, Am J Physiol Heart Circ Physiol, 303(5):H605-18, publicacion electronica de 29 de junio de 2012 y Tao, J., y col., 2011, Am J Physiol Heart Circ Physiol, 301(4):H1471-86, publicacion electronica de 29 de julio de 2011).Despues de la lesion cardfaca, se pueden utilizar los parametros de microultrasonido para medir la funcion con respecto a la mejora, asf como la evaluacion del tamano del infarto.

Los siguientes ejemplos se proporcionan para describir a los expertos en la tecnica el modo de elaboracion y el uso de los procedimientos y composiciones de la invencion, y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores consideran su invencion. Se han realizado esfuerzos para garantizar la precision con respecto a los numeros utilizados (por ejemplo, cantidades, concentraciones, temperatura, etc.), pero se deben tener en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales.

Ejemplos

Ejemplo 1- Clonacion de construcciones de expresion

Se utilizaron fragmentos de genes sinteticos para generar fusiones de hFc de extremo N y extremo C con apelina-13. Se inserto ADN que codifica las fusiones resultantes, hFc-Apelina13 (SEQ ID NO: 1) y Apelina13-hFc (SEQ ID NO: 3) en vectores de expresion aguas abajo de un promotor de CMV, utilizando tecnicas estandar de clonacion molecular. Se generaron lmeas celulares estables de CHO y se usaron para la produccion de protemas de fusion, que luego se purificaron mediante procedimientos de afinidad. Las protemas de fusion hFc-Apelina13 de extremo N y Apelina13-hFc de extremo C migran en geles SDS-PAGE compatibles con sus masas previstas. (Vease la Figura 3A). Se utilizo el analisis de transferencia Western, realizado con el anticuerpo anti-apelina (Abcam, #ab59469), para confirmar la presencia de apelina en hFc-Apelina13 y Apelina13-hFc. (Vease la Figura 3B.)

Ejemplo 2- Potencia y eficacia de las protemas de fusion de apelina Fc en un ensayo de indicador de cAMP Se evaluo la modulacion de los niveles de cAMP intraceulular mediante el peptido apelina no modificado (Bachem, # H-4568.0001) y las protemas de fusion de la apelina 13 de la invencion mediante un bioensayo que se desarrollo para detectar la activacion de hAPLNR. Se transfecto una lmea celular HEK293 para expresar de forma estable la hAPLNR humana de longitud completa (aminoacidos 1-380 de numero de acceso NP_005152.1), junto con un indicador de luciferasa [elemento de respuesta cAMP (CRE,4X)-luciferasa]. La lmea celular resultante, HEK293/CRE-luc/hAPLNR, se mantuvo en DMEM que contema FBS al 10 %, NEAA, pencilina/estreptomicina y 100 pg/ml de higromicina B. Para el bioensayo, se sembraron celulas HEK293/CRE-luc/hAPLNR en placas de ensayo de 96 pocillos a 20.000 celulas/pocillo en 80 pl de OPTIMEM suplementado con FbS al 0,1 % y penicilina/estreptomicina/l-glutamina y se incubaron durante 16 horas a 37 °C con CO² al 5 %. A la manana siguiente, para medir la inhibicion de la produccion de cAMP inducida por forskolina a traves de la activacion de hAPLNR, el peptido apelina no modificado y las protemas de fusion de apelina 13 se diluyeron en serie (1: 3) y luego se mezclaron con forskolina (Sigma, # F6886) en un tampon de ensayo (5 pM de concentracion final de forskolina) y se anadieron a las celulas. Despues de 5 horas de incubacion a 37 °C en CO² al 5 %, se midio la luminiscencia despues de la adicion del reactivo One Glo (Promega, # E6051) utilizando un instrumento Victor X (Perkin Elmer). Los datos se ajustaron por regresion no lineal a una ecuacion logfstica de 4 parametros con el software Prism 5 (GraphPad).

La protefna de fusion hFc-Apelina13 promovio la inhibicion de la liberacion de cAMP a partir de celulas HEK293/CRE-luc/hAPLNR estimuladas con forskolina con un valor de EC⁵⁰ de 174 pM y Apelina13-hFc activada con un valor de EC⁵⁰ de 22,1 nM. En este ensayo, apelina-13 se activo con un valor de EC⁵⁰ de 36,5 pM. (Vease la Figura 4).

Ejemplo 3- Potencia y eficacia de las protefnas de fusion de Fc en un ensayo de p-arrestina

La plataforma PathHunter® de DiscoverX se basa en el reclutamiento de p-arrestina para GPCR en respuesta al tratamiento con un ligando relevante. En este formato de ensayo, la p-arrestina se fusiona con un mutante de delecion en el extremo N de la p-galactosidasa (p-gal) y se expresa de forma estable en las celulas, mientras que el GPCR se fusiona con un fragmento de p-gal de complementacion debil mas pequeno (42 aminoacidos). La estimulacion del ligando de GPCR en este ensayo da como resultado el reclutamiento de p-arrestina en el GPCR, lo que obliga a la complementacion de los dos fragmentos de p-gal y da como resultado la formacion de una enzima funcional que convierte el sustrato en senal detectable (DiscoverX Corporation, Fremont, CA, EE.UU.).

Para el ensayo, las celulas DiscoverX CHO-K1/hAPLNR se colocaron en placas a 10.000 celulas por pocillo en medios de ensayo (DiscoverX Corporation; #93-0250E2) y se incubaron durante 48 horas a 37 °C en CO² AL 5 %. Las celulas se trataron luego con una dilucion en serie de 1:10 de un peptido apelina-13 no modificado o las protefnas de fusion apelina-13. Despues de 1,5 horas de incubacion a 37 °C, se anadieron reactivos de deteccion segun las especificaciones del fabricante y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente, seguido de una medicion de luminiscencia con un instrumento Victor (PerkinElmer)

Las protefnas hFc-Apelina13, apelina-13 y Apelina13-hFc activaron las celulas DiscoverX CHO-K1/hAPLNR de manera dependiente de la dosis, con valores de EC⁵⁰ de 992 pM, 17,6 pM, y 44,2 nM (valor extrapolado), respectivamente (Figura 5).

Ejemplo 4- Potencia y eficacia de las protefnas de fusion Fc en un ensayo de pERK

Para medir el efecto de las protefnas de fusion apelina-13 de la invencion sobre la via de senalizacion de APLNR, se uso un ensayo para cuantificar la cantidad de ERK1/2 fosforilada (pERK1/2) y el ERK total de una lfnea celular que expresa APLNR. Se transfecto una lfnea celular de ovario de hamster chino (CHO) para expresar de manera estable el APLNR humano de longitud completa (hAPLNR; aminoacidos 1-380 de numero de acceso NP_005152.1) bajo el control de un promotor de CMV inducible por doxiciclina. La lfnea celular resultante, CHO/hAPLNR se mantuvo en medio F12 de Ham que contenfa FBS al 10 %, penicilina/estreptomicina, L-glutamina e higromicina B a 250 pg/ml. Para el ensayo, las celulas CHO/hAPLNR se sembraron en placas de ensayo de 96 pocillos a 10.000 celulas/pocillo en 200 pl de F12 de Ham que contenfan FBS al 10 %, L-glutamina, penicilina/estreptomicina y se incubaron a 37 °C en CO² al 5 % durante 24 horas. Al dfa siguiente, para inducir la expresion del APLNR y preparar las celulas para el ensayo de pERK, primero se lavaron las celulas una vez con 250 pl de 1x PBS (Life Technologies; #20012-043), luego se privaron de suero en F12 de Ham que contenfa FBS al 0,1 %, BSA al 1 %, L-glutamina, penicilina/estreptomicina, 0,5 pg/ml de doxiciclina durante 24 horas. El dfa del ensayo, las celulas se trataron con una dilucion en serie 1:10 de peptido apelina no modificado o protefnas de fusion en F12 de Ham complementado con BSA al 1 %, penicilina/estreptomicina, L-glutamina durante 15 minutos a 37 °C en CO² al 5 %. Al final de la incubacion, las celulas se lavaron con 200 pl de PBS y posteriormente se lisaron con 100 pl de tampon de lisis ELISAone (TGR BioSciences; # EBF001). Luego se analizaron los extractos para determinar los niveles de ERK fosforilado (pERK1/2) y de ERK total, segun las especificaciones del fabricante (TGR Biosciences, # EKT001). Las senales de fluorescencia se midieron utilizando un lector de placas Spectramax (Molecular Devices). Se calculo la relacion de pERK1/2 medido con respecto a ERK total medido y los resultados se analizaron utilizando GraphPad Prism.

En el ensayo de pERK, hFc-Apelina13 y Apelina13-hFc aumentaron la proporcion de pERK1/2 a ERK1/2 total en celulas CHO/hAPLNR de una manera dependiente de la dosis, con valores de CE⁵⁰ de 216 pM y 33 nM, respectivamente (Figura 6).

Ejemplo 6- Estudio farmacocinetico para evaluar la estabilidad en suero de las fusiones de Fc

A los ratones C57/BI6 (n=3 por grupo) se les administro por via subcutanea (sc) hFc (2,5 mg/kg) o Apelina13-hFc (2,8 mg/kg) (Figura 7A) y se recogio el plasma a 1, 4, 24 y 48 horas. En un experimento separado, se inyecto hFc-Apelina13 s.c. en ratones C57/BI6 (n=3 por grupo) a 5 mg/kg y el suero se recogio en 0, 1, 2, 4, 5, 6, 24 horas y 2, 3, 7, 14, 21 dfas (Figura 7B).

Para evaluar los niveles de suero/plasma de las protefnas administradas, se recubrieron placas ELISA de 96 pocillos durante 18 horas a 4 °C con 100 pl/pocillo de anticuerpo de IgG antihumano de cabra (Jackson ImmunoLab; 109­ 005-098) a una concentracion de 1 pg/ml en PBS. Las placas se bloquearon posteriormente durante 1 hora a temperatura ambiente (TA) con 300 pl/pocillo de 1X solucion de bloqueo/diluyente de leche (KPL; #100108). Luego se anadieron a la placa diluciones de hFc (para la curva estandar) y muestras de suero en 100 pl de diluyente. Despues de incubar durante 2 horas a temperatura ambiente, los pocillos se lavaron y se detecto un Fc humano unido a la placa mediante la adicion de un anticuerpo de IgG antihumano conjugado con peroxidasa de rabano picante (Jackson ImmuLab; #109-035-098) a la placa durante 7 minutos a temperatura ambiente. Las muestras se desarrollaron durante 7 minutos con una solucion de TMB (MP Biomedical; # 152346) para producir una reaccion colorimetrica y luego se neutralizaron con 100 pl/pocillo de H²SO⁴2,0N (Mallinckrodt; # H381-05) antes de medir la absorbancia a 450 nm de longitud de onda en un lector de placas Spectramax (Molecular Devices). Los datos se analizaron utilizando el software SoftMax para determinar las concentraciones de las muestras en suero.

Los niveles en suero de Apelina13-hFc alcanzaron un maximo de 10 pg/ml (380 nM) a ~ 4 horas y se mantuvieron comparables a los de hFc despues de 48 horas (Figura 7A). Los niveles en suero de hFc-Apelina13 alcanzaron un maximo de 3 pg/ml (100 nM) a las 24 horas y disminuyeron gradualmente a 1 pg/ml (38 nM) en el dfa 14 (Figura 7B).

Ejemplo 7- Potencia y eficacia de los peptidos apelina en un ensayo CRE

La apelina-13 que tiene un Fc atado a su extremo N (hFc-Apelina13) muestra mejor potencia que la apelina-13 que tiene Fc atado a su extremo C (Apelina-hFc), tal como se observa en los Ejemplos 2 a 6 anteriores. Los peptidos Apelina-13 modificados, tales como los peptidos Apelina-13 que tienen uno o mas aminoacidos delimitados o agregados al extremo N o al extremo C, se analizaron para determinar sus potencias relativas con respecto a la activacion de APLNR.

La modulacion de los niveles de cAMP mediante el peptido apelina-13 no modificado (Bachem, # H-4568.0001) y los peptidos apelina modificados de la invencion se evaluaron usando un bioensayo que se desarrollo para detectar la activacion de hAPLNR, segun el procedimiento del Ejemplo 2 (supra). Los resultados se analizaron mediante regresion no lineal (logfstica de 4 parametros) con el software Prism 5 (GraphPad).

Tal como se muestra en la Tabla 3, apelina-13 puede tolerar deleciones de aminoacidos tanto en el extremo N como en el extremo C, a la vez que conserva toda la eficacia y muestra diferentes grados de potencia reducida en comparacion con la apelina-13. Ademas, apelina-13 puede tolerar la adicion de residuos de aminoacidos a su extremo C, como cinco residuos de glicina y aun asf retener la eficacia total, pero con una potencia reducida, en relacion con la apelina-13. Se preve que variaciones similares de las protefnas de fusion de Fc-apelina mantendran su eficacia.

Tabl : L i riv lin m ni n n l fi i n l n CRE

Ejemplo 8- Potencia y eficacia de las protefnas de fusion de apelina modificadas en un ensayo CRE Varias protefnas de fusion apelina-Fc se elaboraron de manera analoga al Ejemplo 1, excepto que tenfan peptidos apelina modificados, tales como SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43 y SEQ ID No : 44, fusionadas con la hFc. Dichas protefnas de fusion hFc-Apelina13 tienen un aminoacido de extremo C adicional en el extremo C del componente peptfdico de apelina. La modulacion de los niveles de AMPc por el peptido apelina-13 en comparacion con los peptidos Apelina-13 modificados con hFc unido a cada extremo N del peptido (hFc-Apelina13+) se evaluo utilizando el bioensayo de CRE de forma analoga a los procedimientos del Ejemplo 2 y del Ejemplo 7 (supra). Los resultados se analizaron mediante regresion no lineal (logfstica de 4 parametros) con el software Prism 5 (GraphPad).

Tal como se muestra en la Tabla 4, las protefnas de fusion de apelina modificadas (que tienen un Fc en el extremo N y un aminoacido adicional en el extremo C del componente de peptido apelina) exhiben actividad en el APLNR similar a la de la apelina-13 no modificada. La protefna de fusion hFc-Apelina13 que tiene una arginina adicional en las celulas HEK293/CRE-luc/hAPLNR activadas en el extremo C con un valor de EC⁵⁰ de 60 pM. La protefna de

Claims (16)

REIVINDICACIONES

1. Polipeptido que comprende un peptido apelina fusionado con un dominio Fc de IgG humano, en el que el extremo N del peptido apelina se fusiona con el extremo C del dominio Fc a traves de uno o mas enlazadores Gly-Ser. en el que el peptido apelina se selecciona del grupo que consiste en apelina42-77 (apelina-36), apelina61-77 (apelina-17), apelina63-77 (apelina-15), apelina64-77 (apelina-14), apelina65-77 (apelina-13), apelina66-77 (apelina-12), apelina67-77 (apelina-11), apelina68-77 (apelina-10), apelina73-77 (apelina-5), apelina61-76 (apelina-K16P), apelina61-75 (apelina-K15M), apelina61-74 (apelina-K14P), apelina-F13A, apelina65-76, apelina65-75, apelina66-76, apelina67-76, apelina66-75, apelina 67-75, [Pyr1]Apelina-13, SEQ ID NO: 38 (apelina-13+5G), SEQ ID NO: 42 (apelina-13+R), SEQ ID NO: 43 (apelina-13+S) y SEQ ID NO: 44 (apelina-13+H).

2. El polipeptido de la reivindicacion 1, en el que el peptido apelina se selecciona del grupo que consiste en apelina42-77 (apelina-36), apelina61-77 (apelina-17), apelina63-77 (apelina-15), apelina64-77 (apelina-14), apelina65-77 (apelina-13), apelina66-77 (apelina-12), apelina67-77 (apelina-11), apelina68-77 (apelina-10), apelina73-77 (apelina-5), [Pyr1]Apelina-13, SEQ ID NO: 38 (apelina-13+5G), SEQ ID NO: 42 (apelina-13+R), SEQ ID NO: 43 (apelina-13+S), and SEQ ID NO: 44 (apelina-13+H).

3. El polipeptido de la reivindicacion 1 o 2, en el que el uno o mas enlazadores Gly-Ser comprenden la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 11.

4. El polipeptido de la reivindicacion 1, 2 o 3, en el que el dominio Fc se selecciona del grupo que consiste en dominio Ch2 de IgG1 y dominio CH3 de IgG1; dominio CH2 de IgG4 y dominio CH3 de IgG4; dominio CH2 de IgG1 y dominio CH3 de IgG4; y dominio CH2 de IgG4 y dominio CH3 de IgG1.

5. El polipeptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el dominio Fc comprende un dominio bisagra de IgG, en el que opcionalmente el dominio bisagra comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 22.

6. El polipeptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el peptido forma un homodfmero.

7. El polipeptido de la reivindicacion 1, que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 2.

8. El polipeptido de la reivindicacion 1, que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 39.

9. El polipeptido de la reivindicacion 1, que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 40.

10. El polipeptido de la reivindicacion 1, que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 41.

11. Acido nucleico que codifica el polipeptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

12. Vector que comprende una molecula de acido nucleico de la reivindicacion 11, en el que opcionalmente:

(a) la molecula de acido nucleico esta unida de forma operativa a una secuencia de control de expresion adecuada para la expresion en una celula huesped; y/o

(b) el vector comprende uno o mas genes marcadores seleccionables.

13. Celula que comprende una molecula de acido nucleico de la reivindicacion 11, en la que opcionalmente:

(a) la celula comprende un vector de la reivindicacion 12; y/o

(b) el acido nucleico esta integrado en el genoma de la celula; y/o

(c) la celula comprende un acido nucleico que codifica un potenciador de la expresion de protefnas; y/o

(d) la celula es una celula eucariota.

14. La celula de la reivindicacion 13, en la que la celula:

(a) se selecciona del grupo que consiste en CHO, COS, celula retiniana, Vero, CV1, 293, MDCK, HaK, BHK, HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo25, HB 8065, HL-60, Jurkat, Daudi, A431, CV-1, U937, 3T3, celula L, celula C127, SP2/0, NS-0, celula MMT, celula tumoral y una celula PER.C6®; y/o

(b) es una celula animal; y/o

(c) es una celula de mamffero; y/o

(d) es una celula CHO; y/o

(e) es una celula CHO-K1.

15. Cantidad terapeuticamente eficaz del polipeptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para su uso en un procedimiento para el tratamiento de una enfermedad o afeccion relacionada con apelina en un sujeto que lo necesite, comprendiendo el procedimiento la administracion del polipeptido a dicho sujeto, en el que la enfermedad o afeccion se selecciona del grupo que consiste en enfermedad cardiovascular, insuficiencia cardfaca descompensada aguda, insuficiencia cardfaca congestiva, infarto de miocardio, cardiomiopatfa, isquemia, lesion por isquemia/reperfusion, hipertension pulmonar, diabetes, obesidad, cancer, enfermedad metastasica, homeostasis de fluidos, sfntomas de sofocos, angiogenesis patologica, retinopatfa, fibrosis e infeccion por VIH.

16. Kit que comprende uno o mas recipientes llenos con al menos un polipeptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.