KR20150127596A - 아펠린 융합 단백질 및 이들의 용도 - Google Patents

아펠린 융합 단백질 및 이들의 용도 Download PDF

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파나이오티스 스테비스
예스페르 그롬마다
앤드류 머피
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리제너론 파아마슈티컬스, 인크.
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Abstract

본 발명은 다량체화 성분에 융합된 아펠린 펩티드를 포함하는 융합 단백질 또는 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명은 또한 Fc 도메인, Fc 도메인의 단편, 또는 Fc 도메인의 변이체에 융합된 아펠린 펩티드를 포함하는 융합 단백질 또는 폴리펩티드를 제공한다. 아펠린 Fc-융합 폴리펩티드는 아펠린 수용체(APLNR)에 결합할 수 있다. 아펠린 Fc-융합 폴리펩티드는 APLNR을 활성화할 수 있고, Fc 또는 Fc 단편에 융합되지 않은 아펠린 펩티드에 비해 개선된 약동학 특성을 갖는다. 아펠린 Fc-융합 폴리펩티드는 심혈관 기능, 당뇨병, 암, 비만에 관련된 질환 및 상태 그리고 다른 아펠린-관련 상태에서 유용하다.

Description

아펠린 융합 단백질 및 이들의 용도{APELIN FUSION PROTEINS AND USES THEREOF}
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 각각 이들의 전문이 참조로 특별하게 포함되는 2013. 3. 14.에 출원된 U.S. 특허 가출원 번호 61/786,172의 35 USC § 119(e) 하의 우선권을 주장하며, 2013. 11. 20.에 출원된 U.S. 특허 가출원 번호 61/906,567의 35 USC § 119(e) 하의 우선권을 주장한다.
서열 목록
본 출원은 2014. 3. 13.에 생성된 파일 8050WO_ST25.txt(43,420바이트)로 컴퓨터로 읽을 수 있는 형태로 제출된 서열 목록을 참조로 포함한다.
발명의 분야
본 발명은 다량체화 성분으로 조작된 융합 단백질, 예컨대 아펠린 펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 융합된 인간 면역글로불린 Fc 도메인에 관한 것이다. 본 발명의 재조합 단백질 및 이들의 조성물은 심혈관 질환, 허혈-재관류, 당뇨병의 치료 및 다른 아펠린-관련 치료법에서 유용하다.
발명의 배경
프리프로아펠린은 인간 CNS 및 말초 조직, 예로 폐, 심장 및 유선에서 발현되는 77 아미노산 단백질이다. 다양한 크기의 아펠린 펩티드의 C-말단 단편을 포함하는 펩티드는 G 단백질-커플링된 수용체인 APJ 수용체를 활성화시키는 것으로 나타났다(Habata, et al., 1999, Biochem Biophys Acta 1452:25-35; Hosoya, et al., 2000, JBC, 28(21061):67-2000; Lee, et al., 275, J Neurochem 74:34-41; Medhurst, et al., 2003, J Neurochem 84:1162-1172). 여러 연구에서는 아펠린 펩티드 및 유사체가 APJ 수용체(APLNR로도 알려져 있음)와 이들의 상호작용을 통해 심혈관 작용, 예컨대 내피-의존적 혈관확장(Tatemoto et al., 2001, Regul Pept 99:87-92), 촉진 수축 작용(Szokodi et al., 2002, Circ Res 91:434-440; Maguire, et al., 2009, Hypertension 54:598-604, 2009. 7. 13.에 인쇄 전 전자공개됨) 및 심근 영역 허혈과 재관류를 전달함을 시사한다(Pisarenko, et al., 2013, J Pharmacol Pharmacother. "Effects of structural analogues of apelin-12 in acute myocardial infarction in rats", 인쇄 전 전자공개됨). 특히 아펠린-13은 심장 수축을 증가시킴으로써 심부전에 대한 치료를 제공할 수 있는 강력한 수축물질이다(Dai, et al., 2006, Eur J Pharmacol 553(1-3): 222-228; Maquire, et al, 2009, Hypertension. 54:598-604).
인간 환자에서 수술-전 및 수술-후 심실 조직의 전사 프로필 분석은 APLNR이 가장 유의미하게 상향조절된 유전자임을 드러내었다(Chen et al, 2003, Circulation, 108:1432-39). 마우스에서 아펠린(아펠린 -/- ) 및 APJ(APJ -/- ) 녹아웃 연구는 내인성 아펠린-APJ 경로의 부재가 심혈관 스트레스, 예컨대 운동에 반응하는 능력 감소로 이어짐을 제시한다(Charo et al., 2009, Am J Physiol . Heart Circ. Physiol., 297:H1904-1913).
아펠린은 또한 인슐린 및 당뇨병 그리고 비만 관련 장애의 기전 조절에서 보고되었다. 비만 마우스 모델에서, 아펠린은 지방세포로부터 방출되며 인슐린에 의해 직접 상향 조절된다(Boucher, et al., 2005, Endocrinol 146:1764-71). 아펠린 녹아웃 마우스는 감소된 인슐린 감수성을 나타낸다(Yue, et al., 2010, Am J Physiol Endocrinol Metab 298:E59-E67).
합성 아펠린 펩티드가 CD4-APLNR-발현 세포 내로의 HIV-1 진입을 저해하였으므로, APLNR-조정제는 또한 HIV 치료에서 유용성을 갖는다(Cayabyab, M., et al., 2000, J. Virol . 74: 11972-11976). 또한, APLNR 저해제, 즉 병리적 혈관신생을 차단할 수 있는 제제는 망막에서 종양 성장 및 혈관형성을 저해하는데 유용할 수 있다(Kojima, Y. and Quertermous, T., 2008, Arterioscler Thromb Vasc Biol; 28;1687-1688; Rayalam, S. et al. 2011, Recent Pat Anticancer Drug Discov 6(3):367-72). 또한 아펠린-13, 아펠린-17 및 아펠린-36이 신호전달 경로를 통해 작용하여 뉴론 생존을 촉진하는 경우, 아펠린 신경보호도 나타난다(Cheng, B, et al., 2012, Peptides 37(1):171-3).
APLNR 결합제는 심혈관 질환뿐만 아니라 다른 아펠린 관련 질환 가운데 암 및 당뇨병의 완화에 유용하다. 아펠린 펩티드는 순환에서 신속히 제거되며 8분 이하의 짧은 혈장 반감기를 가지므로(Japp, et al, 2008, J of Amer College Cardiolog, 52(11):908-13), 아펠린은 현재 치료 효과를 보기 위해 연속 투여된다.
당분야에서는 치료제로서 개선된 아펠린 결합제, 특히 APLNR 결합 활성을 유지하면서 연장된 반감기를 갖는 것들이 필요하다.
발명의 요약
본 발명은 아펠린 융합 단백질, 예컨대 생물학적 활성 아펠린 펩티드를 전달하기 위해 조작된 Fc 도메인에 융합된 아펠린을 제공한다. 특히, 아펠린 융합 단백질은 APLNR 활성을 유지하면서 야생형 아펠린 펩티드에 비해 개선된 약동학 특성을 갖는다.
본 발명의 하나의 측면은 다량체화 성분에 융합된 아펠린 펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 하나의 구현예에서, 다량체화 성분은 적어도 하나의 시스테인 잔기를 함유하는 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 다량체화 성분은 류신 지퍼, 나선-루프 모티프, 감긴 코일 모티프, 또는 면역글로불린-유래 도메인을 함유하는 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 다량체화 성분은 Fc 도메인을 함유하는 아미노산 서열을 포함한다.
관련 측면에서, 본 발명은 Fc 도메인, Fc 도메인의 단편, 또는 Fc 도메인의 변이체에 융합된 아펠린 펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 일부 경우, 폴리펩티드는 더 고차원 구조, 예컨대 단백질 또는 다량체 복합체의 일부일 수 있다. 일부 구현예에서, 아펠린 펩티드는 하나 이상의 펩티드 링커를 통해 Fc 도메인, 또는 이들의 단편에 융합된다. 다른 구현예에서, 아펠린 펩티드가 상기 Fc 도메인의 C-말단에 융합되거나, 또는 아펠린 펩티드가 상기 Fc 도메인, 또는 이들의 단편의 N-말단에 융합된다.
하나의 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 아펠린 융합 단백질의 Fc 도메인은 면역글로불린 CH2 도메인 또는 면역글로불린 CH3 도메인을 포함한다. 또 다른 구현예에서, Fc 도메인은 면역글로불린 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc 도메인은 IgG1 CH2 및 CH3 도메인, IgG4 CH2 및 CH3 도메인, IgG1 CH2 및 IgG4 CH3 도메인, 및 IgG4 CH2 및 IgG1 CH3 도메인으로 구성된 군으로부터 선택된다. 다른 구현예에서, Fc 도메인은 IgG 힌지 도메인을 포함한다. 다른 구현예에서, Fc 도메인은 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 IgG 힌지 도메인을 포함한다: 서열 목록 번호 14, 서열 목록 번호 17, 서열 목록 번호 18, 서열 목록 번호 21, 및 서열 목록 번호 22.
또 다른 구현예에서, 폴리펩티드는 이량체를 형성할 수 있는 단량체성 융합 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 폴리펩티드는 제2 폴리펩티드와 적어도 하나의 디설피드 결합을 형성한다.
또 다른 관련 측면에서, 본 발명은 아펠린 펩티드 성분, 인간 IgG Fc 도메인, 및 적어도 하나의 링커 성분을 포함하는 아펠린 수용체(APNLR) 결합 분자를 제공한다. 일부 구현예에서, 아펠린 수용체(APNLR) 결합 분자는 APLNR 작용제이며, 다른 경우 아펠린 수용체(APNLR) 결합 분자는 APLNR 길항제이다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 생체 내 혈장 또는 혈청 반감기가 적어도 약 1시간, 또는 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10시간 이상인 아펠린 융합 폴리펩티드 또는 아펠린 수용체 결합 분자가 제공된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 아펠린 융합 폴리펩티드 또는 수용체 결합 분자는 아펠린42-77(아펠린-36), 아펠린61-77(아펠린-17), 아펠린63-77(아펠린-15), 아펠린64-77(아펠린-14), 아펠린65-77(아펠린-13), 아펠린66-77(아펠린-12), 아펠린67-77(아펠린-11), 아펠린68-77(아펠린-10), 아펠린73-77(아펠린-5), 아펠린61-76(아펠린-K16P), 아펠린61-75(아펠린-K15M), 아펠린61-74(아펠린-K14P), 아펠린-F13A, 아펠린65-76, 아펠린65-75, 아펠린66-76, 아펠린67-76, 아펠린66-75, 아펠린 67-75, 및 [Pyr1]아펠린-13으로 구성된 군으로부터 선택되는 아펠린 펩티드를 포함한다.
특정 측면에서, 아펠린 융합 폴리펩티드 또는 아펠린 수용체 결합 분자는 혈청 안정형 단백질이다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 서열 목록 번호 2 또는 서열 목록 번호 4를 포함하는 아미노산 서열과 95%, 또는 96%, 또는 97%, 또는 98%, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는다. 다른 측면에서, 폴리펩티드는 서열 목록 번호 2 또는 서열 목록 번호 4와 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 다른 측면에서, 폴리펩티드는 서열 목록 번호 2 또는 서열 목록 번호 4를 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 또 다른 측면에서, 폴리펩티드는 서열 목록 번호 39, 서열 목록 번호 40 및 서열 목록 번호 41로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열 을 갖는다.
특정 측면에서, 본 발명은 재조합 폴리펩티드를 제공하며, 상기 폴리펩티드는 N'-P1m-X1n-X2-X3-P2-A1-C'을 포함하고, 식 중 N'은 폴리펩티드의 N-말단이고 C'은 C-말단이며; P1은 펩티드 링커이고; X1은 IgG 힌지 도메인을 포함하고; X2는 IgG CH2 도메인을 포함하고; X3은 IgG CH3 도메인을 포함하고, P2는 펩티드 링커이고; A1은 인간 아펠린 펩티드 또는 이들의 단편 또는 유도체를 포함하는 아미노산 서열이고; 식 중 m = 0 또는 1이고 n = 0 또는 1이다.
특정 측면에서, 본 발명은 재조합 폴리펩티드를 제공하며, 상기 폴리펩티드는 N'-A1-P2-X1n-X2-X3-C'을 포함하고, 식 중 N'은 폴리펩티드의 N-말단이고 C'은 C-말단이고; A1은 인간 아펠린 펩티드 또는 이들의 단편 또는 유도체를 포함하는 아미노산 서열이고; P2는 펩티드 링커이고; X1은 IgG 힌지 도메인을 포함하고; X2는 IgG CH2 도메인을 포함하고; X3은 IgG CH3 도메인을 포함하고; 식 중 n = 0 또는 1이다.
두 번째 측면에서, 본 발명은 본 발명의 임의의 아펠린 융합 폴리펩티드 또는 아펠린 수용체 결합 분자를 인코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 하나의 구현예에서, 핵산 분자는 서열 목록 번호 27 및 서열 목록 번호 28로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 갖는다. 다른 구현예에서, 핵산 분자는 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 인코딩한다: 서열 목록 번호 2, 서열 목록 번호 4, 서열 목록 번호 39, 서열 목록 번호 40 및 서열 목록 번호 41.
세 번째 측면에서, 본 발명은 본 발명의 아펠린 융합 폴리펩티드 또는 아펠린 수용체 결합 분자를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터 및 세포를 제공한다. 하나의 구현예에서, 벡터는 신호 펩티드 서열에 연결된 핵산 분자를 인코딩한다.
본 발명은 또한 신호 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 아펠린 융합 단백질을 인코딩하는 벡터를 제공한다. 본 발명은 융합 단백질 업스트림에 배치된 신호 펩티드의 C-말단에 융합된 펩티드 링커를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 아펠린 융합 단백질을 인코딩하는 벡터를 또한 제공한다.
네 번째 측면에서, 본 발명은 평가 분자의 APLNR 활성을 결정하고, 평가 분자와 동일한 평가 조건 하에 APLNR을 발현하는 세포를 본 발명의 아펠린 융합 단백질과 접촉시켜 평가 분자가 APLNR 작용제인지 아니면 APLNR 길항제인지를 결정하는 방법을 제공한다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 하기를 포함하는 APLN 수용체(APLNR)의 활성화 결정 방법을 제공한다: (a) APLNR을 발현하는 세포를 평가 분자와, APLNR의 활성화를 허용하는 조건 하에 접촉시키는 단계 , (b) APLNR 활성을 측정하는 단계, (c) 단계 (a)에서와 동일한 조건 하에 APLNR을 발현하는 세포를 본 발명의 아펠린 융합 단백질과 별도로 접촉시키는 단계, (d) 단계 (b)에서와 동일한 방식으로 단계 (c)에서의 세포의 APLNR 활성을 측정하는 단계(여기서 단계 (d)에서의 APLNR 활성의 측정과 대비하여 단계 (b)에서의 APLNR 활성 측정은 평가 분자가 APLNR을 활성화시킴을 결정한다).
본 발명의 또 다른 측면은 하기를 포함하는, 아펠린을 포함하는 융합 단백질의 제조 방법을 제공한다: (a) 숙주 세포를 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자로 전달감염시키는 단계(여기서, 핵산 분자는 i) 상기 아펠린 펩티드의 N-말단에서 아펠린 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 연결된 인간 IgG의 Fc 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이거나, 또는 ii) 상기 Fc 도메인의 N-말단에서 인간 IgG의 Fc 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 연결된 아펠린 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에, 융합된 신호 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함함), 및 (b) 숙주 세포 내에서 (a)의 핵산 분자를 발현하여 융합 단백질을 제조하는 단계. 본 발명은 본 발명의 융합 단백질을 세포 배양 배지 내로 분비하는 숙주 세포를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 아펠린에 관련된 질환 또는 상태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 아펠린에 관련된 질환 또는 상태의 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 치료 유효량의 아펠린 융합 단백질을 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명은 또한 심혈관 질환, 급성 대사장애 심부전, 울혈성 심부전, 심근 경색, 심근병증, 허혈, 허혈/재관류 부상, 폐 고혈압, 당뇨병, 비만, 암, 전이성 질환, 체액 항상성, 병리적 혈관신생, 망막병증, 섬유증, 및 HIV 감염으로 구성된 군으로부터 선택되는 질환 또는 상태의 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 대상체에 치료 유효량의 본 발명의 아펠린 융합 단백질을 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명은 본 발명의 아펠린 융합 폴리펩티드 또는 아펠린 수용체 결합 분자를 포함하는 조성물 및 키트를 추가로 제공한다. 일부 구현예에서, 키트는 적어도 하나의 본 발명의 아펠린 융합 단백질 또는 폴리펩티드가 충전된 하나 이상의 용기를 포함한다.
도 1a는 hFc-아펠린 융합 단백질의 성분, 예컨대 서열 목록 번호 2의 아미노산 서열을 표시한다. 서열 목록 번호 2의 서열은 (N-말단에서 C-말단으로) 인간 IgG1 Fc(밑줄 표시), G4S 반복 펩티드 링커(이탤릭체 표시), 및 아펠린-13(두줄 밑줄 표시)으로 구성된다.
도 1b는 단독이량체 형태로 분비된 Fc-아펠린 융합 단백질 및 그 성분을 나타낸다.
도 2a는 아펠린-hFc 융합 단백질의 성분, 예컨대 서열 목록 번호 4의 아미노산 서열을 표시한다. 서열 목록 번호 4의 서열은 (N-말단에서 C-말단으로) 아펠린-13(두줄 밑줄 표시), G4S 반복 펩티드 링커(이탤릭체 표시), 및 인간 IgG1 Fc(밑줄 표시)로 구성된다.
도 2b는 단독이량체 형태로 분비된 아펠린-Fc 융합 단백질 및 그 성분을 나타낸다.
도 3a는 SDS-PAGE 겔 상에서 아펠린 Fc-융합 단백질 및 단백질 사다리 대조군의 이동을 나타낸다. 레인 1 = 단백질 마커 측정(31 및 38kD); 레인 2 = hFc-아펠린-13(서열 목록 번호 2); 레인 3 = 아펠린13-hFc 단백질(서열 목록 번호 4); 레인 4 = hFc 단독.
도 3b는 항-아펠린 항체를 이용한 웨스턴 블롯에서 10ng 또는 100ng의 단리된 hFc-아펠린13 또는 아펠린13-hFc 단백질의 반응성을 나타낸다.
도 4는 APJ(APNLR)-발현 세포에서 폴스콜린-유도된 cAMP 반응을 측정함으로써 CRE-luc 분석에서 각각의 하기 리간드의 용량-반응 곡선 및 최대-절반 농도(EC50)를 나타낸다: 아펠린-13(-●-), hFc-아펠린13(-■-), 또는 아펠린13-hFc(-◆-).
도 5는 β-어레스틴 분석에서 각각의 하기 리간드의 용량-반응 곡선 및 최대-절반 농도(EC50)를 나타낸다: 아펠린-13(-●-), hFc-아펠린13(-■-), 아펠린13-hFc(-▲-), 또는 hFc 단독(-▼-).
도 6은 두 리간드 모두에 의한 APNLR-발현 세포의 활성화를 나타내는, hFc(-▲-) 대비하여 hFc-아펠린13(-●-) 또는 아펠린13-hFc(-■-)의 정상화된 p-ERK 분석의 용량-반응 곡선 및 최대-절반 농도(EC50)를 나타낸다. x
도 7a는 hFc 단독 수준(-●-)에 대비하여, 48hr까지 약 10μg/mL 수준에 도달하는, 피하 투여된 C57/Bl6 마우스의 혈청 중 2.8mg/kg 아펠린13-hFc(-■-)의 안정성을 나타낸다.
도 7b는 24hr에 3μg/mL에 도달하고 약 14일에 1μg/mL로 점차 감소하는 피하 투여된 C57/Bl6 마우스의 혈청 중 5mg/kg hFc-아펠린13(-●-)의 안정성을 나타낸다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 기재된 특정 방법 및 실험 조건이 변할 수 있으므로, 이에 제한되지 않음이 이해되어야 한다. 본 발명의 범위는 특허청구범위에 의해 정의되므로, 본 명세서에서 이용된 용어가 단지 특정 구현예를 설명하기 위한 것이며 제한하려는 것이 아님이 또한 이해되어야 한다.
본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서 이용되는 단수에는 문맥 상 뚜렷이 달리 나타내지 않는 한 복수의 참조물이 포함된다. 따라서 예를 들어, "방법"의 언급에는 본원에 기재되고/기재되거나 본 개시의 독서 시 당분야 숙련가에게 자명해질 하나 이상의 방법 및/또는 유형 단계가 포함된다
달리 정의되지 않는 한, 본 출원에서 이용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 당분야의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기재된 것들과 유사하거나 동등한 임의 방법 및 재료가 본 발명의 실시에 이용될 수 있지만, 이제 특정 방법과 재료가 기재된다. 본원에 언급된 모든 문헌은 이들의 전문이 참조로 포함된다.
융합 단백질
용어 "면역글로불린"(Ig)은 전체 4개가 디설피드 결합에 의해 상호 연결될 수 있는 한 쌍의 경쇄(L) 및 한 쌍의 중쇄(H)인 2쌍의 폴리펩티드 사슬로 구성된 구조적으로 관련된 당단백질 클래스를 나타낸다. 면역글로불린의 구조는 잘 분석되어 있다. 예를 들어 [Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N. Y. (1989))]를 참고하라. 각각의 중쇄는 전형적으로 중쇄 가변 영역(본원에서 VH 또는 VH로 약칭함) 및 중쇄 불변 영역(CH 또는 CH)을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 전형적으로 3 도메인, CH1, CH2, 및 CH3을 포함한다. CH1 및 CH2 도메인은 힌지에 의해 연결된다. Fc 부분은 적어도 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다.
전형적으로, 면역글로불린의 아미노산 잔기의 번호지정은 [IMGT, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)], 또는 Kabat의 EU 번호지정 시스템("EU 번호지정" 또는 "EU 인덱스"로도 알려져 있음), 예로 [Kabat, E.A. et al. Sequences of Proteins of Immunological interest. 5th ed. US Department of Health and Human Services, NIH publication No. 91-3242 (1991)]를 따른다.
명세서에서 이용되는 "다량체화 성분"은 동일하거나 유사한 구조 또는 구성의 제2 다량체화 성분과 연합하는 능력을 갖는 임의의 거대분자, 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 또는 아미노산이다.　예를 들어, 다량체화 성분은 면역글로불린 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드일 수 있다.　다량체화 성분의 비제한적 예는 면역글로불린의 Fc 부분, 예로 이소형(isotype) IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4에서 선택된 IgG뿐만 아니라 각 이소형 그룹 내의 임의의 동종이형의 Fc 도메인이다.　 특정 구현예에서, 다량체화 성분은 적어도 하나의 시스테인 잔기를 함유하는 1 내지 약 500 아미노산 길이의 아미노산 서열 또는 Fc 단편이다. 다른 구현예에서, 다량체화 성분은 시스테인 잔기 또는 짧은 시스테인 함유 펩티드이다. 다른 다량체화 도메인에는 류신 지퍼, 나선-루프 모티프, 또는 감긴-코일 모티프를 포함하거나 이로 구성된 펩티드 또는 폴리펩티드가 포함된다.
용어 "Fc"는 전형적으로 Fc 수용체, 예로 FcγR, 즉 FcγRI(CD64), FcγRII(CD32), FcγRIII(CD16) 또는 FcRn, 즉 신생아 Fc 수용체에 결합하는 적어도 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 중쇄 불변 영역의 일부를 나타낸다. CH2 및 CH3 영역이 이를 임의의 Fc 수용체에 결합할 수 없게 만드는 결실, 치환, 및/또는 삽입 또는 다른 개질을 함유하는 경우, CH2 및 CH3 영역은 그 전형적인 생물학적 기능의 견지에서 기능적이 아닌 것으로 간주된다.
어구 "융합 단백질", 및 구체적으로 "아펠린 융합 단백질"에는 본원에 기재된 다량체화 성분을 함유하도록 조작된 아펠린에서 유래되는 재조합 폴리펩티드 및 단백질이 포함된다.
어구 "Fc-융합 단백질", 구체적으로 "아펠린-Fc" 또는 "Fc-아펠린" 융합 단백질에는 본원에 기재된 Fc 단편을 함유하도록 조작된 아펠린에서 유래된 재조합 폴리펩티드 및 단백질이 포함된다. 예를 들어, "아펠린 Fc-융합 단백질"에는 펩티드 링커를 포함하거나 포함하지 않고, N-말단 또는 C-말단에서 Ig의 Fc 도메인의 아미노산 서열에 융합된 아펠린 펩티드 또는 유사체의 아미노산 서열을 포함하는 키메라성 단백질이 포함된다. 융합 단백질에 이용되는 펩티드의 예는 당분야에 공지되어 있다(예로 Dumont, et al., 2006, Biodrugs 20(3):150-160 참고). Fc-융합 단백질은 또한 당분야에서 면역부착소로 불린다.
본원에서 이용되는 어구 "에 융합된"은 전형적으로 하나의 유전자를 발현 벡터 내로 제2 유전자의 프레임 내에 두 유전자가 하나의 연속 폴리펩티드를 인코딩하도록 클로닝함으로써, 둘 이상의 서열을 조합하여 제조된 키메라성 유전자의 발현에 의해 형성되는 폴리펩티드를 (비제한적으로) 의미한다. 재조합 기술에 의해 제조되는 것에 부가하여, 폴리펩티드 부분은 화학 반응에 의해 또는 통상적 폴리펩티드의 제조를 위해 당분야에 공지된 다른 수단에 의해 서로 "에 융합"될 수 있다.
용어 "단백질"은 적어도 하나의 폴리펩티드로 이루어진 4차 구조, 3차 구조 및 다른 복합 거대분자를 포함하는 것을 의미한다. 용어 "단백질"에는 폴리펩티드가 포함된다.
본원에서 이용되는 "폴리펩티드"는 인접한 아미노산 잔기의 카르복실기 및 아미노기 간의 펩티드 결합에 의해 서로 결합된 아미노산의 단일 선형 중합체 사슬이다. 용어 "단백질"은 또한 큰 폴리펩티드, 예컨대 7 막통과 도메인 단백질을 설명하기 위해 이용될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 면역글로불린 도메인에서 유래되는 아미노산 서열을 포함한다. 지정된 단백질 또는 폴리펩티드"에서 유래된" 폴리펩티드 또는 아미노산 서열은 폴리펩티드의 기원을 나타낸다. 본원에서 이용되는, "이소형(isotype)"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 인코딩되는 면역글로불린 클래스 또는 서브클래스(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE, 또는 IgM)를 나타낸다.
본원에서 이용되는 어구 "중쇄" 또는 "면역글로불린(Ig) 중쇄"에는 임의 개체로부터의 Ig 중쇄 불변 영역 서열이 포함되며, 달리 명시되지 않는 한 중쇄 가변 도메인이 포함된다. 달리 명시되지 않는 한, 중쇄 가변 도메인에는 3 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 4 프레임워크 영역(FR)이 포함된다. 중쇄 가변 도메인의 단편에는 CDR, 또는 CDR 및 FR이 모두 포함된다. 전형적인 중쇄 불변 영역(CH)은 가변 도메인에 이어, N-말단에서 C-말단으로 CH1 도메인, 힌지, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 갖는다. 예로, 항원 결합 단백질에서 중쇄의 기능적 단편에는 세포에서 발현되고 이로부터 분비될 수 있으며 적어도 하나의 CDR을 포함하는 항원을 특이적으로 인식할 수 있는(예로, 마이크로몰, 나노몰, 또는 피코몰 농도 범위의 KD로 항원을 인식할 수 있는) 단편이 포함된다.
공동 분비된 단백질을 포획하기 위해 막-결합된 인간 Fcγ 수용체(hFcγR)를 이용하는 유세포 측정 기반 자가 분비 트랩(FASTR) 방법은 항체 또는 Fc-융합 단백질을 발현하거나 분비하는 고발현 클론을 신속하게 단리하기 위해 이용될 수 있다. (본원에 참조로 포함되는 US20090137416 A1 참고). 이러한 고발현 클론은 본원에 기재된 Fc-융합 단백질을 포함하는 단백질을 발현하는 세포를 단리하기 위해 채용될 수 있다. FASTR 방법은 본 발명의 임의의 재조합 폴리펩티드 또는 Fc-융합 단백질을 발현하는 세포를 직접 스크리닝하고 단리하기 위해 이용될 수 있다.
본원에서 이용되는 용어 "힌지"는 면역글로불린의 CH1의 C-말단을 CH2 도메인의 N-말단과 연결하는 보존적 아미노산 잔기 영역을 포함하려는 것이다. CH2 엑손에 의해 코딩되는 CH2 도메인의 N-말단의 몇몇 아미노산이 또한 "하부 힌지"의 일부로 간주된다. 임의의 하나의 이론에 구애받지 않고, IgG1, IgG2 및 IgG4의 힌지 영역의 아미노산은 다른 힌지 엑손 및 CH2 도메인의 몇몇 N-말단 아미노산에 의해 인코딩되는(CH2 엑손에 의해 인코딩되는) 12-15 연속 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 한다(Brekke, O.H., et al., 1995, Immunology Today 16(2):85-90). 반면, IgG3은 4 절편으로 구성된 힌지 영역을 포함한다: IgG1의 힌지 영역과 유사한 하나의 상부 절편, 및 IgG3에 고유한 동일 아미노산 반복체인 3 절편.
Ig 도메인, 예컨대 인간 IgG에서 유래된 아미노산 잔기는 본원에서 "EU 번호지정" 또는 "EU 인덱스"로도 알려져 있는 Kabat의 EU 번호지정 시스템에 의해 확인된다(Kabat, E.A. et al. Sequences of Proteins of Immunological interest. 5th. US Department of Health and Human Services, NIH publication No. 91-3242, 1991에 따르며, IMGT® Scientific Chart, IMGT®, the international ImMunoGeneTics information system®, http://www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html, 생성일: 2001. 5. 17., 최종 업데이트일: 2013. 1. 10.).
예를 들어, 인간 IgG1 힌지 아미노산에 대한 EU 번호지정 및 대응하는 IMGT 고유 번호지정 관례, 그리고 Kabat 번호지정 관례(상기 Kabat, E.A. et al, 1991, 및 IMGT® Scientific Chart에 따름)를 표 1에 기재한다.
표 1: IgG1 힌지 번호지정
Figure pct00001
표 2: IgG1 C-도메인 힌지 번호지정
Figure pct00002
엑손 스플라이싱으로 생성된 아미노산을 괄호로 나타낸다.
a 최신 업데이트된 IMGT Scientific Chart에 따른 번호지정
b [Kabat, EA, et al. 1991]에 최초 보고된 EU 인덱스에 따른 번호지정
예로, [Lefranc, M.-P. et al., Devel Comp Immunol, 29, 185-203 (2005); and Edelman, G.M. et al. PNAS USA, 63:78-85 (1969)]도 참고하라.
하나의 구현예에서, 본 발명의 Fc-융합 단백질은 Fc 도메인 또는 임의의 Fc 도메인 단편 또는 임의의 Fc 도메인 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, Fc 도메인은 Ig CH2 및 Ig CH3 도메인, 또는 이들의 단편 또는 변이체를 포함한다. 다른 구현예에서, Fc 도메인은 Ig 힌지 도메인, 또는 이들의 단편 또는 변이체, Ig CH2 도메인 또는 이들의 단편 또는 변이체 및 Ig CH3 도메인 또는 이들의 단편 또는 변이체를 포함한다. 다른 구현예에서, Fc 도메인은 Ig CH1 도메인 또는 이들의 단편 또는 변이체, Ig 힌지 도메인 또는 이들의 단편 또는 변이체, Ig CH2 도메인 또는 이들의 단편 또는 변이체, 및 Ig CH3 도메인 이들의 단편 또는 변이체를 포함한다.
본원에서 이용되는 용어 "키메라성"은 상이한 기원의 부분들로 이루어짐을 의미한다. "키메라성 폴리펩티드"를 포괄하는 어구 "키메라성 단백질"에는 자연에서는 보통 연결되어 있지 않은 제2 아미노산 폴리펩티드에 연결된 제1 아미노산 폴리펩티드가 포함된다. 아미노산 서열은 보통 별도 폴리펩티드로서 또는 동일한 폴리펩티드 또는 단백질 상에서 상이한 배열로 존재할 수 있고, 융합 폴리펩티드를 새로운 배열로 모은다.
Fc 도메인은 둘 이상의 면역글로불린 이소형에서 유래된 Fc 서열을 조합하는 키메라성일 수 있다. 예를 들어, 키메라성 Fc 도메인은 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4 CH2 영역에서 유래된 CH2 서열의 일부 또는 전부, 및 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4에서 유래된 CH3 서열의 일부 또는 전부를 포함할 수 있다. 키메라성 Fc 도메인은 또한 키메라성 힌지 영역을 함유할 수 있다. 예를 들어, 키메라성 힌지는 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4 힌지 영역에서 유래된 "저부 힌지" 서열과 조합된, 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4 힌지 영역에서 유래된 "상부 힌지" 서열을 포함할 수 있다. 키메라성 Fc 도메인은 변형된 Fc 수용체 결합을 가질 수 있고, 이는 다시 Fc 효과기 기능에 영향을 미친다.
특정 치료법에 있어서, Fc 도메인은 원하는 Fc-융합 단백질의 약동학 특성에 영향을 미치지 않고, 정상적인 Fc 효과기 기능의 전부, 일부를 활성화시키거나 활성화지시키 않도록 조작될 수 있다. 따라서 변형된 Fc 수용체 결합을 갖는 조작된 Fc 도메인은 감소된 부작용을 가질 수 있다. 따라서 하나의 구현예에서, 단백질은 키메라성 또는 다르게 개질된 Fc 도메인을 포함한다. 키메라성 Fc 도메인의 예로서, 본원에 그 전문이 참조로 포함되는, 2013. 2. 1.에 출원된 US 가출원 번호 61/759,578을 참고하라.
본 발명은 또한 변이체 Fc 도메인 서열을 포함하는 아펠린 Fc-융합 단백질을 제공한다. 이러한 "변이체" Fc 도메인 및 Fc 도메인 단편은 야생형 서열과 비교할 때 하나 이상의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 포함하지만, 본질적으로는 원하는 대로 작용한다, 예로 본 명세서에 기재된 바와 같이 APLNR 활성을 나타내고 융합 단백질의 반감기를 연장시킨다.
일부 구현예에서, Fc 도메인은 IgG CH2 및 CH3 도메인을 포함한다. 다른 구현예에서, Fc 도메인은 IgG1 CH2 및 CH3 도메인, IgG4 CH2 및 CH3 도메인, IgG1 CH2 도메인 및 IgG4 CH3 도메인, 또는 IgG4 CH2 도메인 및 IgG1 CH3 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc 도메인은 CH1 도메인, 힌지 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인으로 구성된 군으로부터 선택되는 단편을 포함하는 키메라성 Fc 도메인이며, 여기서 단편은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE, 또는 IgM에서 유래된다. 일부 구현예에서, 키메라성 Fc 도메인은 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 CH2 도메인을 포함한다: 서열 목록 번호 15, 서열 목록 번호 19, 및 서열 목록 번호 23. 일부 구현예에서, 키메라성 Fc 도메인은 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 CH3 도메인을 포함한다: 서열 목록 번호 16, 서열 목록 번호 20, 및 서열 목록 번호 24. 또 다른 구현예에서, Fc 도메인은 키메라성 IgG CH2-CH3 도메인을 포함한다. 따라서, 이러한 Fc 도메인의 변이체 및 단편도 본 발명의 일부이다.
하나의 구현예에서, Fc 도메인은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 힌지 도메인을 포함한다. 하나의 구현예에서, 힌지 도메인은 하기를 포함한다: 서열 목록 번호 14, 서열 목록 번호 17, 서열 목록 번호 18, 서열 목록 번호 21 또는 서열 목록 번호 22. 또 다른 구현예에서, Fc 도메인은 키메라성 힌지 도메인을 포함한다. 또 다른 구현예에서, Fc 도메인은 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 힌지 단편을 포함하는 키메라성 힌지 도메인을 포함한다: 서열 목록 번호 14, 서열 목록 번호 18, 및 서열 목록 번호 22.
본 발명의 특정 구현예에 따르면, 예로, 중성 pH에 비해 산성 pH에서 FcRN 수용체에 대한 단백질 결합을 증강시키거나 감소시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 Fc 도메인을 포함하는 Fc-융합 단백질이 제공된다. 예를 들어, 본 발명에는 Fc 도메인의 CH2 또는 CH3 영역에서 돌연변이를 포함하는 Fc-융합 단백질이 포함되며, 상기 돌연변이(들)는 산성 환경에서(예로, pH가 약 5.5 내지 약 6.0 범위인 엔도솜에서) FcRn에 대한 Fc 도메인의 친화도를 증가시킨다. 이러한 돌연변이는 동물에 투여되는 경우, 항체의 혈청 반감기를 증가시킬 수 있다. 이러한 Fc 개질의 비제한적 예에는, 예로 위치 250(예로, E 또는 Q); 250 및 428(예로, L 또는 F); 252(예로, L/Y/F/W 또는 T), 254(예로, S 또는 T), 및 256(예로, S/R/Q/E/D 또는 T)에서의 개질; 또는 위치 428 및/또는 433(예로, H/L/R/S/P/Q 또는 K) 및/또는 434(예로, H/F 또는 Y)에서의 개질; 또는 위치 250 및/또는 428에서의 개질; 또는 위치 307 또는 308(예로, 308F, V308F), 및 434에서의 개질이 포함된다. 하나의 구현예에서, 개질은 428L(예로, M428L) 및 434S(예로, N434S) 개질; 428L, 259I(예로, V259I), 및 308F(예로, V308F) 개질; 433K(예로, H433K) 및 434(예로, 434Y) 개질; 252, 254, 및 256(예로, 252Y, 254T, 및 256E) 개질; 250Q 및 428L 개질(예로, T250Q 및 M428L); 및 307 및/또는 308 개질(예로, 308F 또는 308P)을 포함한다.
예를 들어, 본 발명에는 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 돌연변이의 하나 이상의 페어 또는 그룹을 포함하는 Fc 도메인을 포함하는 Fc-융합 단백질이 포함된다: 250Q 및 248L(예로, T250Q 및 M248L); 252Y, 254T 및 256E(예로, M252Y, S254T 및 T256E); 428L 및 434S(예로, M428L 및 N434S); 및 433K 및 434F(예로, H433K 및 N434F). 본원에 개시된 융합 단백질 내의 상기 Fc 돌연변이 및 다른 돌연변이의 모든 가능한 조합이 본 발명의 범위 내에 고려된다.
Fc-융합 단백질의 Fc 도메인에 대한 개질은 증가된 안정성, 예컨대 분해에 대한 내성을 부여할 수 있다. 융합 단백질은 이들의 단백분해 절단에 대한 내성 또는 금속 이온 관련된 절단에 대한 내성을 개선하기 위해 통상적인 분자 생물학 기법 및 합성 화학을 이용하여 개질될 수 있다. 이러한 폴리펩티드 유사체에는 한 아미노산의 다른 아미노산으로의 교환 또는 천연 생성 L-아미노산 이외의 잔기, 예로 D-아미노산 또는 비천연 생성 합성 아미노산으로의 치환으로 제조되는 치환 변이체가 포함된다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 Fc-융합 단백질은 본원에 기재된 바와 같이, Fc 도메인에 융합된 아펠린 펩티드를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 Fc-융합 단백질은 APLNR 수용체를 활성화시키고, Fc 도메인에 융합되지 않은 아펠린 펩티드에 비해 더 큰 반감기, 예컨대 8분을 초과하는 반감기를 갖는다.
아펠린 리간드 및 아펠린 수용체
아펠린은 절단되어 더 짧은 몇몇 생물학적 활성 단편 또는 아펠린 펩티드를 생성하는 77 아미노산의 프리프로펩티드로서 내인성으로 생산된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 Fc-융합 단백질은 본원에 기재된 바와 같이 아펠린 펩티드를 포함한다.
일부 구현예에서, 아펠린 펩티드는 프리프로아펠린 폴리펩티드(서열 목록 번호 5).
"아펠린 펩티드"에는 당분야에 공지된 특정 아펠린 단편 및 유도체, 예로 프리프로아펠린 폴리펩티드(서열 목록 번호 5)의 아미노산 6-77, 40-77, 42-77, 43-77, 47-77, 59-77, 61-77, 63-77, 64-77, 65-77, 66-77, 67-77, 73-77, 1-25, 6-25, 42-64, 61-64, 61-74, 61-75, 61-76, 65-76, 65-75, 66-76, 67-76, 66-75, 67-75, 42-58, 42-57, 42-56, 42-55, 42-54, 42-53을 포함하는 아펠린 펩티드, 또는 피로글루타밀화 아펠린65-77([Pyr1]아펠린-13). 예로 둘 다 본원에 참조로 포함되는, 2002. 12. 10.에 허여된 US 특허 번호 6492324, 및 [El Messari et al. 2004, J Neurochem , 90:1290-1301]을 참고하라. 하나의 구현예에서, 아펠린 펩티드는 서열 목록 번호 5의 아미노산 65-76, 65-75, 61-77, 63-77, 64-77, 65-77, 66-77, 67-77, 66-76, 67-76, 66-75, 67-75, 또는 42-77을 포함한다.
본원에서 아펠린 펩티드의 단편, 예를 들어 C-말단 결실을 갖는 펩티드는 이들의 세포 활성을 보유하는 것으로 나타났다(또한, El Messari et al. 2004, J Neurochem, 90:1290-1301 참고). 특정한 아펠린 펩티드 유도체, 예컨대 추가적인 하나 이상의 C-말단 아미노산을 갖는 아펠린 펩티드 및 융합물은 본원에서 이들의 세포 활성을 보유하는 것으로 나타났다. 이와 같이, 본 명세서에 기재된 아펠린 펩티드의 단편 및 유도체가 본 발명에 포함된다. 당분야 숙련가는 아펠린 펩티드의 다른 단편 및 유도체를 재조합 기술로 제조할 수 있다.
다른 구현예에서, 아펠린 펩티드는 아펠린40-77(아펠린-38), 아펠린42-77(아펠린-36), 아펠린43-77(아펠린-35), 아펠린47-77(아펠린-31), 아펠린59-77(아펠린-19), 아펠린61-77(아펠린-17), 아펠린63-77(아펠린-15), 아펠린64-77(아펠린-14), 아펠린65-77(아펠린-13), 아펠린66-77(아펠린-12, 또는 A12), 아펠린67-77(아펠린-11), 아펠린68-77(아펠린-10), 아펠린73-77(아펠린-5), 아펠린61-76(아펠린-K16P), 아펠린61-75(아펠린-K15M), 아펠린61-74(아펠린-K14P), 및 [Pyr1]아펠린-13으로 구성된 군으로부터 선택된다.
다른 구현예에서, 아펠린 펩티드는 하기로 구성된 군으로부터 선택된다: 아펠린61-77(아펠린-17; 서열 목록 번호 7), 아펠린65-77(아펠린-13; 서열 목록 번호 6), 아펠린-F13A(서열 목록 번호 29), 아펠린66-77(아펠린-12, 또는 A12, 서열 목록 번호 32), 아펠린67-77(아펠린-11; 서열 목록 번호 33), 아펠린65-76(서열 목록 번호 30), 아펠린65-75 서열 목록 번호 31), 아펠린67-77(서열 목록 번호 6), 아펠린66-76(서열 목록 번호 34), 아펠린67-76(서열 목록 번호 35), 아펠린 66-75(서열 목록 번호 36), 아펠린 67-75(서열 목록 번호 37), 및 [Pyr1]아펠린-13.
일부 구현예에서, 아펠린 펩티드는 분해를 최소화하고 혈청 안정성을 증강시키기 위해 개질된다. 특정 구현예에서, 개질된 아펠린 펩티드는 하기로 구성된 군으로부터 선택된다: 서열 목록 번호 38(아펠린-13+5G), 서열 목록 번호 42(아펠린-13+R), 서열 목록 번호 43(아펠린-13+S), 및 서열 목록 번호 44(아펠린-13+H).
하나의 구현예에서, 아펠린 펩티드는 하기로 구성된 군으로부터 선택된다: 아펠린-36(서열 목록 번호 8), 아펠린-17(서열 목록 번호 7), 아펠린-13(서열 목록 번호 6) 및 [Pyr1]아펠린-13. 또 다른 구현예에서, 아펠린 펩티드는 아펠린-13(서열 목록 번호 6), 또는 이들의 단편을 포함한다.
아펠린 펩티드는 순환에서 신속히 제거되며, 8분 이하의 짧은 혈장 반감기를 갖는다(Japp, et al, 2008, J of Amer College Cardiolog , 52(11):908-13). 본 발명의 아펠린 융합 단백질은 아펠린 펩티드에 비해 증가된 반감기를 갖는다.
비표준 아미노산 또는 개질된 아미노산을 포함하도록 개질된 아펠린 유사체가 본 발명에 포함된다. 비천연이거나 천연이지만 코드화되지 않는 아미노산을 함유하는 이러한 펩티드는 하나 이상의 코돈이 표준 아미노산이 아닌 아미노산을 인코딩하도록 할당되는 인공적으로 개질된 유전 코드에 의해 합성될 수 있다. 예를 들어, 유전 코드는 20개의 표준 아미노산을 인코딩하지만, 특정 상황 하에서는 자연에서 3개의 추가적 단백질성 아미노산 셀레노시스테인, 피로라이신 및 N-포르밀-메티오닌이 생성된다(Ambrogelly, et al. 2007, Nature Chemical Biology, 3:29-35; Bock, A. et al, 1991, TIBS , 16 (12): 463-467; 및 Theobald-Dietrich, A., et al., 2005, Biochimie, 87(9-10):813-817). 번역 후 개질된 아미노산, 예컨대 카르복시글루탐산(γ-카르복시글루타메이트), 히드록시프롤린, 및 하이퓨신도 포함된다. 다른 비표준 아미노산에는 비제한적으로 시트룰린, 4-벤조일페닐알라닌, 아미노벤조산, 아미노헥산산, N α -메틸아르기닌, α-아미노-n-부티르산, 노르발린, 노르류신, 알로이소류신, t-류신, α-아미노-n-헵탄산, 피페콜산, α,β-디아미노프로피온산, α,γ-디아미노부티르산, 오르니틴, 알로트레오닌, 호모알라닌, 호모아르기닌, 호모아스파라긴, 호모아스파르트산, 호모시스테인, 호모글루탐산, 호모글루타민, 호모이소류신, 호모류신, 호모메티오닌, 호모페닐알라닌, 호모세린, 호모티로신, 호모발린, 이소니페코트산, β-알라닌, β-아미노-n-부티르산, β-아미노이소부티르산, γ-아미노부티르산, α-아미노이소부티르산, 이소발린, 사르코신, 나프틸알라닌, 니페코트산, N-에틸 글리신, N-프로필 글리신, N-이소프로필 글리신, N-메틸 알라닌, N-에틸 알라닌, N-메틸 β-알라닌, N-에틸 β-알라닌, 옥타히드로인돌-2-카르복실산, 페니실아민, 피로글루탐산, 사르코신, t-부틸글리신, 테트라히드로-이소퀴놀린-3-카르복실산, 이소세린, 및 α-히드록시-γ-아미노부티르산이 포함된다. 유전 코드를 확장하기 위한 다양한 형식은 당분야에 공지되어 있고 본 발명의 실시에 채용될 수 있다. (예로, Wolfson, W., 2006, Chem Biol, 13(10): 1011-12.)
이러한 비표준 아미노산 또는 번역 후 개질을 도입하는 아펠린 유사체는 공지된 방법에 의해 합성될 수 있다. 예시적인 아펠린 유사체에는 N α-메틸아르기닌-아펠린-A12 유사체, [Nle75, Tyr]아펠린-36, [Glp65Nle75,Tyr77]아펠린-13, (Pyr1)[Met(O)11]-아펠린-13, (Pyr1)-아펠린-13, [d-Ala12]-A12, 및 N-알파-아세틸-노나-D-아르기닌 아미드 아세테이트가 포함된다.
또한 절단, 예를 들어 안지오텐신 전환 효소 2(ACE2)에 의한 절단에 내성이 되도록 개질된 아펠린 융합 단백질의 아펠린 성분의 유사체가 본 발명에 포함된다. 이러한 아펠린 유사체는 허혈에 대한 심근 반응의 생체 내 모델에서 비개질 아펠린 리간드에 비해 유효성이 현저히 증가하는 것으로 나타났다(Wang, et al. July 1, 2013, J Am Heart Assoc. 2: e000249).
이러한 절단-보호된 아펠린 융합 단백질은 치환 변이체, 즉 단백질 내의 하나 이상의 절단 부위에서 하나의 아미노산의 다른 아미노산으로의 교환에 의해 제조된 변이체를 포함하도록 개질된 아펠린 펩티드를 포함한다. 이러한 아미노산 치환은 단백질의 다른 기능 또는 특성의 손실 없이 증가된 안정성을 부여하도록 고려된다. 다른 절단-보호된 아펠린 융합 단백질은 말단 아미드기 또는 아세틸기를 포함하도록 개질된 아펠린 펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 절단-보호된 아펠린 융합 단백질은 단백질성 아미노산, 비표준 아미노산 또는 번역 후 개질된 아미노산을 포함한다. 다른 절단-보호된 또는 절단-내성 아펠린 융합 단백질은 하나 이상의 추가적인 N-말단 아미노산을 포함하는 개질된 아펠린 펩티드를 포함한다. 이러한 개질된 아펠린 펩티드가 APLNR을 활성화시키는 펩티드의 능력을 변형하지 않는 것이 바람직하다. APLNR을 활성화시키는 본 발명의 예시적인 개질된 아펠린 펩티드 및 융합 단백질에는 서열 목록 번호 38, 서열 목록 번호 39, 서열 목록 번호 40, 서열 목록 번호 41, 서열 목록 번호 42, 서열 목록 번호 43, 및 서열 목록 번호 44를 포함한다.
상기 언급된 바와 같이, 아펠린은 G 단백질 커플링된 수용체인 APLNR의 리간드인 것으로 알려져 있다. 본원에서 이용되는 용어 "리간드"는 다른 분자, 예컨대 수용체에 결합하는 분자를 의미한다. G 단백질 커플링된 수용체(GPCR)에 결합할 수 있는 리간드 분자는 이온, 유기 소분자, 펩티드, 폴리펩티드, 항체, 이중특이적 항체, 항체 단편, 단백질, 유기 대분자로 구성된 군으로부터 선택된다. 리간드는 이것이 결합하는 수용체를 통해 부여하는 활성의 상태에 따라, 예를 들어 작용제, 부분 작용제, 역작용제, 길항제, 경쟁적 길항제, 양성 알로스테릭 조정제 또는 음성 알로스테릭 조정제인 것을 추가 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, GPCR에 결합하는 작용제에 있어서, 해당 GPCR을 불활성 상태로 유지하는 다른 분자 상호작용이 손상된다.
본원에서 이용되는 용어 "작용제"에는 수용체, 예컨대 APLNR 수용체(에 직접 또는 간접 결합하여)와 상호작용하고 이를 활성화시키며, 예컨대 그 내인성 리간드에 결합되는 경우 해당 수용체의 생리적 또는 약물학적 반응 특징을 개시하는 모이어티가 포함된다. 예를 들어, GPCR로의 결합 시, 모이어티는 세포 내 반응을 활성화시키거나, 세포막에 대한 GTP 결합을 증강시키거나, 또는 수용체를 내재화할 수 있다. 이러한 작용제 모이어티는, 예를 들어 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 항체, 항체 단편, 대분자 또는 소분자일 수 있다.
본원에서 이용되는 용어 "길항제"는 작용제(예를 들어 내인성 리간드)와 동일한 부위에서 수용체에 경쟁적으로 결합하지만, 수용체의 활성 형태에 의해 개시되는 세포 내 반응을 활성화시키지 않고, 이에 따라 작용제 또는 부분 작용제에 의한 세포 내 반응을 저해하는 모이어티를 의미하기 위한 것이다. 일부 경우, 길항제는 작용제 또는 부분 작용제의 부재 하에 기준선 세포 내 반응을 감소시키지 않는다. 길항제가 경쟁적 결합 저해제로서 작용할 필요는 없지만, 작용제를 격리시키거나 다운스트림 효과를 간접적으로 조정함으로써 작용할 수 있다.
7 막통과(seven transmembrane) 도메인 수용체인 G 단백질-커플링된 수용체(GPCR)는 전형적으로 알파(α), 베타(β), 및 감마(γ) 서브유닛으로 구성된 이종삼량체성 구아닌 뉴클레오티드-결합 단백질(G 단백질)을 통해 이들의 세포 신호를 전달하며, α 서브유닛은 GTP/GDP에 대한 결합 부위를 함유하고, βγ 이량체는 불활성 상태에서 α 서브유닛에 결합된다. G 단백질은 형질막의 세포질쪽에서 천연 생성된다. 세포외 리간드의 결합은 구아닌-뉴클레오티드 결합 단백질(G 단백질)과 접촉하도록 허용하는 수용체 단백질의 입체형태 변화를 야기하며, 이에 따라 GDP에 대한 GTP의 교환을 증강시킨다. 교환 시, βγ 이량체는 α 서브유닛에서 해리된다. 활성화된 α 서브유닛 및 βγ 이량체가 모두 세포 내 이팩터 단백질에 영향을 미칠 수 있다.
일반적으로, GPCR은 특정한 Gα 단백질 서브유닛 패밀리를 활성화시키며, 이는 특정한 신호 전달 경로의 활성화 또는 불활성화로 이어진다. 아펠린 수용체(APLNR)는 GPCR이다.
리간드 또는 결합 분자와의 상호작용 시, 아펠린 수용체(APLNR)는 하기에 의해 개시되는 신호전달을 포함하는 몇몇 세포 내 신호전달 케스케이드 중 하나 이상을 유발한다: 1) 저해성 G 단백질 서브유닛, Gαi /o, 2) PKC를 통한 ERK의 활성화, 또는 3) GPCR의 내재화. 다시 말하면, 그 활성 상태에서 APLNR의 약물학적 및/또는 생리적 반응은 Gαi 서브유닛의 다운스트림 작용(예로, 아데닐릴 사이클라아제를 저해하는 작용), 인산화된 ERK 또는 내재화된 APLNR에 의해 결정된다. 다른 세포 내 효과인자가 활성화된 APLNR에 의해 관여될 수 있음이 이해된다.
원래 APJ 수용체로 명명된 아펠린 수용체(APLNR)(O'Dowd, et al., 1993, Gene 136(1-2):355-360)는 380 아미노산의 7-막통과 도메인 희귀 수용체로서 인간 게놈 DNA로부터 단리되었다. (본원에 참조로 포함된 NCBI RefSeq 번호 NP_005152 참고). 소 위로부터의 조직 추출물이 0.1-100nM 범위로 APLNR(APJ)을 발현하는 CHO 세포에서 산성화율을 자극하는 아펠린 펩티드로 드러난 경우, 아펠린이 APLNR(APJ)에 대한 내인성 리간드로 나타났다(Tatemoto, et al., 1998, Biochem Biophys Res Comm 251:471-476).
아펠린 및 APLNR 간 상호작용, 그리고 이에 따른 아펠린 융합 단백질 및 APLNR 간 상호작용은 관련 분야의 숙련가에게 공지된 여러 시험관 내(예로 시험관 또는 플레이트에서), 생체 외(예로 살이있는 동물로부터의 세포 배양에서) 그리고 생체 내(예로 살아있는 동물에서) 생체분석에 의해 측정될 수 있다.
일부 구현예에서, APLNR 작용제는 아펠린-36, 아펠린-19, 아펠린-17, 아펠린-13, 아펠린-12, N α-메틸아르기닌-아펠린-A12 유사체, [Nle75, Tyr]아펠린-36, [Glp65Nle75,Tyr77]아펠린-13, (Pyr1)[Met(O)11]-아펠린-13, 및 (Pyr1)-아펠린-13으로 구성된 군으로부터 선택된다.
하나의 구현예에서, 아펠린 융합 폴리펩티드는 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 APLNR 작용제이다: 서열 목록 번호 2, 서열 목록 번호 4, 서열 목록 번호 39, 서열 목록 번호 40 및 서열 목록 번호 41, 및 이들의 단편 또는 유도체.
수용체의 길항제는 APLNR의 혈압저하 작용을 차단하는 것으로 알려져 있다. 아펠린-13을 그 C-말단 페닐알라닌(F)에서 알라닌(A)으로 개질하여 제조된 아펠린 펩티드 유도체(아펠린-13(F13A); 서열 목록 번호 29)가 문헌(Lee, et al. 2005(Endocrinol 146(1):231-236))에 기능성 길항제로 기재되어 있다. APLNR 길항제 F13A는 또한 경변 동물에서 순환 및 신장 기능을 개선하는 것으로 보고되어, 상기 길항제가 간 섬유화와 같은 병리적 질환에서 상향조절된 아펠린 시스템의 과활동성 효과를 매개할 수 있음을 시사하였다(Principe, A., et al. 2008, Hepatology, 48(4):1193-1201). 일부 구현예에서, APLNR 길항제는 하기로 구성된 군으로부터 선택된다: 아펠린-13(F13A)(서열 목록 번호 29), [d-Ala12]-A12, 시클로(1-6)CRPRLC-KH-시클로(9-14)CRPRLC, 및 N-알파-아세틸-노나-D-아르기닌 아미드 아세테이트(ALX40-4C; CAS 레지스트리 번호 153127-49-2).
또 다른 구현예에서, 아펠린 융합 단백질 또는 폴리펩티드는 APLNR 결합 분자를 포함한다. 다른 구현예에서, 아펠린 융합 단백질 또는 폴리펩티드는 APLNR 작용제를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 융합 폴리펩티드는 APLNR 길항제를 포함한다.
수용체 분석
수용체 스크리닝 분석이 본 발명의 대상 아펠린 융합 단백질뿐만 아니라 APLNR의 작용제 및 길항제를 포함하는 임의의 평가 화합물에 채용됨이 이해된다. APLNR의 활성화 또는 불활성화를 결정하기 위한 여러 수용체 스크리닝 분석이 당분야에 널리 공지되어 있으며, 하기 실시예는 본 발명자들이 자신의 발명으로 간주하는 범위를 제한하려는 것이 아니다.
GPCR-매개된 구아닌 뉴클레오티드 교환은 관심 GPCR을 발현하는 세포로부터 제조되는 형질막에 대한 [35S]GTPγS 결합을 측정하여 모니터링된다. [35S]GTPγS 분석은 Gi/o가 대부분의 세포에서 가장 풍부한 G 단백질이고 다른 G 단백질에 비해 더 빠른 GDP-GTP 교환율을 가지므로, Gi/o-커플링된 수용체에 있어서 일반적으로 유용하다(Milligan G., 2003, Trends Pharmacol Sci , 2003, 24:87-90). 시판되는 신틸레이션 근접 분석(SPATM) 키트는 원하는 [35S]GTPγS-결합 α 서브유닛의 측정을 허용한다(PerkinElmer, Waltham, MA, USA).
Gi/o-커플링된 수용체의 활성화는 아데닐릴 사이클라아제 활성을 감소시키고, 이에 따라 G 알파 서브유닛 Gi 또는 Go를 통해 세포 내 cAMP의 저해를 일으킨다. 저해 신호를 최대화하기 위해, 폴스콜린(아데닐레이트 사이클라아제의 직접적 활성화제)은 전형적으로 분석에서 아데닐릴 사이클라아제, 이에 따라 cAMP를 자극하기 위해 이용되며, 이에 따라 저해 신호를 더 쉽게 검출 가능하도록 만든다. 세포 내 cAMP의 축적을 측정하기 위해 Radiometric GE Healthcare SPATM(Piscataway, NJ, USA) 및 Perkin Elmer Flash-PlateTM cAMP 분석뿐만 아니라 형광 또는 발광 기반 동종성 분석(예로 PerkinElmer AlphaScreenTM, DiscoveRx HitHunterTM(Fremont, CA, USA), 및 Molecular Devices FLIPR®(Sunnyvale, CA, USA))이 이용 가능하다.
APLNR과 같이 cAMP 수준을 조정하는 GPCR의 작용은 cAMP 반응 요소(CRE)에 의해 세포에서 루시퍼라아제 전사에 연관될 수 있다. CRE-luc 작제물(CRE-반응성 루시퍼라아제)은 프로모터 및 CRE 전사 반응 요소(TRE)의 일렬 반복체의 제어 하에 루시퍼라아제 리포터 유전자를 인코딩한다. 수용체의 활성화 후, 세포 내 cAMP 축적은 화학발광 검출 시약의 첨가 후 세포에서 발현되는 루시퍼라아제의 양에 의해 측정된다. APLNR, 및 다른 Gi-커플링된 수용체에 있어서, cAMP를 유도하기 위해 폴스콜린이 첨가되며, CRE 활성(화학발광)의 감소는 GPCR 활성화를 시사한다. 다양한 시판 키트가, 예컨대 Promega(Madison, WI, USA), SABiosciences(A Qiagen Company, Valencia, CA, USA) 등으로부터 입수 가능하다.
일부 예에서, 수용체에 대한 작용제 결합은 G 단백질-매개된 신호전달의 유발 또는 G 단백질-매개된 신호전달의 완화 없이 어레스틴-매개된 신호전달을 개시할 수 있다. 세포-표면에서 GPCR과 베타-어레스틴(β-어레스틴)의 상호작용은 수용체에 대한 이종삼량체성 G 단백질의 커플링을 해제하고 다른 세포 신호전달 케스케이드를 야기할 수 있다. β-어레스틴은 세포 내 섭취 및 ERK 경로의 활성화를 유발하는 것으로 알려져 있다. 하나의 예시적 분석에서, 생체발광 공명 에너지 전달 또는 BRET은 Renilla 루시퍼라아제(Rlu)에 융합된 GPCR과 녹색 형광 단백질(GFP)에 융합된 β-어레스틴의 상호작용을 연구하기 위해 이용되었다. 상기 예에서, BRET은 이들이 루시퍼라아제 기질 코엘렌트크라진의 부가 후 가까이에 있는 경우 재조합 발현된 GPCR-Rlu 및 β-어레스틴-GFP 간의 에너지 전달에 기반하며, 이에 따라 전체 세포에서 이들 단백질-단백질 상호작용의 실시간 평가를 측정할 수 있게 한다.
PathHunter® GPCR 분석(DiscoveRx Corp., Fremont, CA, USA)과 같이 활성화된 GPCR과 β-어레스틴의 상호작용을 검출함으로써 GPCR 활성을 직접 측정하는 것과 같은 다른 분석들이 개발되었다. 간략하게, GPCR은 작은 효소 단편 ProLink™와 프레임 내 융합되며, β-어레스틴 및 β-갈락토시다아제의 결실 돌연변이체(즉 β-gal, 효소 수용체, 또는 EA)의 융합 단백질을 안정적으로 발현하는 세포에서 공동 발현된다. GPCR의 활성화는 ProLink-태그화된 GPCR에 대한 β-어레스틴의 결합 및 두 효소 단편의 보완을 촉진하여 활성 β-gal 효소를 형성시킨다. 효소 활성(즉 GPCR 활성화)의 증가는 화학발광 검출 시약을 이용하여 측정될 수 있다.
β-어레스틴 분자는 GPCR, 예컨대 APLNR의 활성화 후 GPCR 내재화(즉 세포 내 섭취)를 조절하는 것으로 나타났다. GPCR의 작용제-활성화는 수용체의 입체형태 변화, 인산화, 및 β-어레스틴의 활성화, 또는 다른 경로로 이어져서 세포 표면으로부터 수용체 격리를 매개한다. 격리 기전은 탈감작(즉 수용체가 내재화 후 분해됨) 또는 재감작(즉 수용체가 세포 표면으로 다시 재생됨)에 의할 수 있다. 검토를 위해, 예로 [Claing, A., et al. 2002, Progress in Neurobiology 66: 61-79]를 참고하라.
APLNR 길항제는 수용체의 내재화를 차단할 수 있다. APLNR 작용제는 APLNR의 내재화 및/또는 재감작을 유도할 수 있다(Lee, DK, et al. 2010, BBRC, 395:185-189). 일부 구현예에서, APLNR 작용제는 내재화 분석에서 측정되는 바와 같이, APLNR 재감작 증가를 나타내거나 유도한다. 다른 구현예에서, APLNR 작용제는 내재화 분석에서 측정되는 바와 같이, APLNR의 세포-표면 수용체 복제 증가를 나타내거나 유도한다. 임의의 내재화 분석에서 수용체 내재화 정도(예컨대 증가)의 측정은 내재화되지 않은 측정(즉 작용제에 대해 사전 노출되지 않은 세포) 및 분석에서 작용제로 수득된 측정 간 차이를 결정함으로써 수행된다.
아펠린 수용체 격리, 그리고 이에 따른 아펠린 수용체 복제는 당분야에 널리 공지된 여러 방법에 의해 측정될 수 있다. APLNR 작용제 자극은 특정 세포의 표면 상에서 증가되거나 감소된 수용체 복제를 일으킬 수 있다. 예를 들어, APLNR 내재화를 유도하는 아펠린 수용체 작용제는 혈압 상 효과를 가질 수 있다. 수용체 내재화 분석은, 예를 들어 형광 표지된 또는 방사선 표지된 리간드, 또는 면역형광 표지(형광-태그화된 항-수용체 항체)에 이어 현미경 및 디지털 조영 기법을 사용하여 일상적으로 수행된다(예로, El Messari et al. 2004, J Neurochem , 90:1290-1301; 및 Evans, N., 2004, Methods of Measuring Internalization of G Protein-Coupled Receptors. Current Protocols in Pharmacology. 24: 12.6.1-12.6.22).
인산화된 ERK(p-ERK)는 APLNR 활성화를 결정하기 위해, APLNR 수용체를 발현하는 세포로부터 세포 용해액 중에서 측정될 수 있다. 내인성 세포 외 신호-조절된 키나아제 1 및 2(ERK1 및 ERK2)는 세린/트레오닌 단백질 키나아제의 보존된 패밀리에 속하며, 여러 자극에 연관된 세포 신호전달 이벤트에 관여된다. ERK 단백질의 키나아제 활성은 ERK1에서 트레오닌 202/티로신 204, 그리고 ERK2에서 트레오닌 185/티로신 187에서의 이중 인산화에 의해 조절된다. MEK1 및 MEK2는 상기 경로에서 ERK 1/2에 관여하는 일차 업스트림 키나아제이다. 다른 키나아제 및 전사 인자를 포함하여, ERK 1/2의 여러 다운스트림 표적이 확인되었다. 하나의 예에서, p-ERK 1/2 분석은 재조합 또는 내인성 수용체를 발현하는 세포 배양의 세포 용해액 중 ERK 1의 특이적 인산화를 측정하기 위해 효소-연관된 면역흡착 분석(ELISA) 방법을 이용한다. 다른 예에서, p-ERK 1/2 분석은 ERK1에서 인산화된 Thr202/Tyr204 또는 ERK2에서 phos-Thr185/Tyr187을 인식하는 일차(비-콘주게이트) 항체 및 일차 항체를 인식하는 이차 콘주게이트 항체를 이용하는 반면, 이차 콘주게이트 mAb는 콘주게이트가 외인성으로 첨가된 기질과 반응하는 것과 같은 검출 방법을 제공한다. 다양한 시판 키트, 예컨대 AlphaScreen® SureFire™(PerkinElmer), ThermoScientific(Waltham, MA, USA), Sigma Aldrich(St. Louis, MO, USA), ELISAOne(TGR BioSciences(South Australia, Australia) 등)이 이용 가능하다.
본원에서 이용되는 용어 "결합"은 수용체(예로 GPCR)에 대한 리간드 결합 또는 항원에 대한 항체 결합의 맥락에서 최소 두 대상체 또는 분자 구조 간 상호작용 또는 연합, 예컨대 수용체-리간드 상호작용, 또는 항체-항원 상호작용을 전형적으로 나타낸다. 따라서 "수용체 결합 분자"는 수용체에 결합하는, 즉 수용체와 상호작용하는 리간드 또는 다른 모이어티, 예컨대 단백질을 언급한다.
예를 들어, 리간드(예로, 아펠린 융합 단백질) 및 수용체(예로, APLNR 또는 APLNR의 리간드 결합 단편) 간 결합 친화도는 전형적으로 KD값 약 10-7M 이하, 예컨대 약 10-8M 이하, 예컨대 약 10-9M 이하에 해당한다. 결합 친화도는 몇몇 방법 중 임의의 하나 이상, 예컨대 BIAcore 3000 기구를 이용하는 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 결정될 수 있다. 따라서, 리간드는 적어도 10배 미만의 KD값에 해당하는 친화도로, 예컨대 비특이적 리간드(예로, BSA, 카제인)에 대한 결합 친화도에 비해 적어도 100배 미만, 예를 들어 적어도 1,000배 미만, 예컨대 적어도 10,000배 미만, 예를 들어 적어도 100,000배 미만의 친화도로 수용체에 결합한다.
본원에서 이용되는 용어 "KD"(M)는 특정한 리간드-수용체 상호작용의 해리 평형 상수를 나타낸다. KD 및 결합 친화도 간에는 역의 상관관계가 있으므로, KD값이 작을수록 친화도가 높다. 따라서 용어 "더 낮은 친화도"는 더 작은 상호작용 형성 능력에, 이에 따라 더 큰 KD값에 관련된다.
본원에서 이용되는 용어 "kd"(초-1 또는 1/s)는 특정한 리간드-수용체 상호작용의 해리 속도 상수를 나타낸다. 상기 값은 또한 koff 값으로 불린다.
본원에서 이용되는 용어 "ka"(M-1 x 초-1 또는 1/M)는 특정한 리간드-수용체 상호작용의 연합 속도 상수를 나타낸다.
본원에서 이용되는 용어 "KA"(M-1 또는 1/M)는 특정한 리간드-수용체 상호작용의 연합 평형 상수, 또는 항체-항원 상호작용의 연합 평형 상수를 나타낸다. 연합 평형 상수는 ka를 kd로 나누어 수득된다.
본원에서 이용되는 용어 "EC50" 또는 "EC50"은 반응, 예를 들어 기준선 및 명시된 노출 시간 후 최대 간 절반에서 세포 반응을 유도하는 리간드의 농도를 포함하는, 절반 최대 유효 농도를 나타낸다. EC50은 그 최대 효과의 50%가 관찰되는 리간드의 농도를 본질적으로 나타낸다. 따라서 세포 신호전달에 관해서, 증가된 활성은 감소된 EC50값, 즉 절반 최대 유효 농도값(더 큰 반응을 일으키기 위해 더 적은 리간드가 필요함)으로 관찰된다.
하나의 구현예에서, 감소된 결합은 증가된 EC50 단백질 농도를 나타내며, 이는 표적 수용체 또는 수용체-발현 세포에 대한 절반-최대 결합을 구현한다.
일부 구현예에서, 감소된 활성은 증가된 EC50 단백질 농도를 나타내며, 이는 표적 수용체 또는 수용체-발현 세포에 대한 절반-최대 세포 활성화를 구현한다.
본원에서 이용되는 용어 "IC50" 또는 "IC50"은 세포 반응의 절반 최대 저해 농도를 나타낸다. 다시 말하면, 생물학적 또는 생화학적 기능의 저해에서 특정 모이어티(예로, 단백질, 화합물, 또는 분자)의 유효성 척도에서, 분석은 주어진 생물학적 절차를 저해하는데 필요한 이러한 모이어티의 양을 정량한다. 따라서 세포 신호전달에 관해, 더 큰 저해 활성이 감소된 IC50, 또는 절반 최대 저해 농도값으로 관찰된다.
하나의 구현예에서, 아펠린 융합 단백질은 APLNR의 활성화를 측정하는 시험관 내 분석에서, 약 100nM 미만, 또는 약 50nM 미만, 또는 약 25nM 미만, 또는 약 10nM 미만, 또는 약 1nM 미만의 EC50을 갖는 APLNR의 작용제이다. 하나의 구현예에서, 아펠린 융합 단백질은 아펠린 펩티드의 N-말단에 연결된 Fc 도메인을 포함하며, 약 1nM 미만, 또는 약 500pM 미만의 EC50을 나타낸다.
본 발명의 아펠린 융합 단백질
융합 단백질의 제조 방법은 당분야에 공지되어 있다. 하나의 이러한 방법에서, DNA 발현 벡터는 상기 DNA 벡터가 하나의 근접 융합 폴리펩티드를 발현하도록 Fc-인코딩 핵산 서열로 프레임 내 연결된 아펠린-인코딩 핵산 서열을 함유하도록 조작된다. 아펠린 펩티드는 Fc-함유 폴리펩티드의 C-말단 또는 N-말단에 연결될 수 있다. 본 발명의 아펠린 융합 단백질은 아펠린 펩티드 단독에 비해 더 안정할 것으로 예상된다. 혈청 안정형 단백질에는 분해에 내성을 부여하거나 순환으로부터의 제거가 감소된 단백질이 포함된다. 본 발명의 예시적인 혈청 안정형 아펠린 융합 단백질에는 하기가 포함된다: 서열 목록 번호 2, 서열 목록 번호 4, 서열 목록 번호 39, 서열 목록 번호 40 및 서열 목록 번호 41.
융합 단백질 구축의 맥락에서, 어구 "프레임 내(in-frame) 연결된"은 성분들이 이들의 완벽한 번역, 이용 또는 작동이 가능하도록 함께 연결되고, 이에 따라 손상되지 않음을 의미한다. 예를 들어, 적어도 2 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질은 폴리펩티드 간 링커 또는 스페이서 서열을 가질 수도 갖지 않을 수도 있고, 이에 따라 폴리펩티드는 각각의 폴리펩티드가 그 작동성을 유지하면서 하나의 연속 폴리펩티드로서 프레임 내 연결된다. 융합 단백질에서 함께 연결되거나 융합된 둘 이상의 폴리펩티드는 전형적으로 둘 이상의 독립적 원천에서 유래되며, 이에 따라 융합 단백질은 자연에서 보통 연결되어 발견되지 않는 둘 이상의 연결된 폴리펩티드를 포함한다. 또한, 이러한 융합 단백질을 인코딩하는 DNA는 이러한 폴리펩티드를 인코딩하는 전사된 mRNA 분자의 작동 가능한 프레임 내(예로, 삼중자 코돈) 번역을 유지하는 링커 서열을 함유할 수 있다.
예컨대 DNA 발현 벡터 작제물의 맥락에서의 어구 "작동 가능하게 연결된"은, 제어 서열, 예로 프로모터 또는 작동인자가 제어 서열이 코딩 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩티드의 생산을 지시하도록 하는 코딩 서열에 대한 위치에서 적절히 배치된다.
용어 "신호 펩티드" 또는 "신호 펩티드 서열"은 본원에서 세포의 세포막(원핵생물에서 형질막 및 진핵생물에서 소포체막)을 거쳐 또는 그 내부로 폴리펩티드를 보내는 새로 합성된 분비성 또는 막 폴리펩티드의 N-말단에 보통 존재하는 펩티드 서열로 정의된다. 이는 보통 이후에 효소 절단에 의해 제거된다. 일부 구현예에서, 상기 신호 펩티드는 세포의 분비 경로 내로 폴리펩티드를 보낼 수 있다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드는 마우스 ROR1, GenBank 접근 번호 BAA75480(서열 목록 번호 10)의 1-29의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 신호 펩티드는 서열 목록 번호 9에 나타낸 신호 펩티드의 아미노산 서열과 적어도 약 96%, 또는 적어도 약 97%, 또는 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 상동성을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 신호 펩티드는 서열 목록 번호 9에 나타낸 신호 펩티드의 핵산 서열과 적어도 약 96%, 또는 적어도 약 97%, 또는 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 상동성을 갖는 뉴클레오티드에 의해 인코딩된다.
일부 구현예에서, Fc-융합 단백질의 성분 또는 펩티드는 링커(또는 "스페이서") 펩티드에 의해 분리된다. 이러한 펩티드 링커는 당분야에 널리 공지되어 있고(예로, 폴리글리신) 융합 단백질 성분의 하나 또는 둘 다의 적절한 폴딩을 전형적으로 허용한다. 링커는 융합 단백질 성분의 가요성 접합 영역을 제공하여 분자의 두 말단이 독립적으로 움직일 수 있게 하며, 각각의 두 모이어티의 적절한 기능 보유에 중요한 역할을 담당할 수 있다. 따라서 일부 경우 접합 영역은 두 부분을 함께 조합하는 링커로 작용하며, 이는 각각의 두 부분이 그 고유한 생물학적 구조를 형성하면서 다른 부분을 방해하지 않도록 한다. 또한, 접합 영역은 대상체의 면역계에 의해 외래로 인식되지 않을, 다시 말하면 면역원성으로 간주되지 않을 에피토프를 생성해야 한다. 또한 링커 선택은 융합 분자의 결합 활성에 영향을 줄 수 ㅇ있다. (참조 Huston, et al, 1988, PNAS, 85:16:5879-83; Robinson & Bates, 1998, PNAS 95(11):5929-34; Arai, et al. 2001, PEDS, 14(8):529-32; and Chen, X. et al., 2013, Advanced Drug Delivery Reviews 65:1357-1369.) 한 구현예에서, 아펠린 펩티드는 하나 이상의 펩티드 링커에 의해 Fc-함유 폴리펩티드, 또는 이들의 단편의 C-말단 또는 N-말단에 연결된다.
링커 사슬의 길이는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 이상의 아미노산 잔기일 수 있지만, 전형적으로는 5 내지 25 잔기이다. 링커의 예에는 폴리글리신 링커, 예컨대 Gly-Gly, Gly-Gly-Gly(3Gly), 4Gly, 5Gly, 6Gly, 7Gly, 8Gly 또는 9Gly가 포함된다. 링커의 예에는 또한 Gly-Ser 펩티드 링커, 예컨대 Ser-Gly, Gly-Ser, Gly-Gly-Ser, Ser-Gly-Gly, Gly-Gly-Gly-Ser, Ser-Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-Gly-Gly-Ser, Ser-Gly-Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser, Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser, Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly, (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n, 및 (Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)n이 포함되며, 식 중 n = 1 내지 10이다. (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n 및 (Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)n은 또한 각각 (G4S)n 및 (S4G)n으로 알려져 있다.
본 발명의 하나의 이러한 구현예에서, 아펠린 펩티드는 하나 이상의 Gly-Ser 펩티드 링커에 의해 Fc-함유 폴리펩티드, 또는 이들의 단편의 C-말단 또는 N-말단에 연결된다.
하나의 구현예에서, 펩티드 링커는 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)1, (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2, (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3, 또는 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)4이다. 하나의 구현예에서, 펩티드 링커는 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3(서열 목록 번호 11)를 포함한다.
일부 구현예에서, 신호 펩티드는 하나 이상의 펩티드 링커 또는 스페이서를 통해 Fc-융합 폴리펩티드의 N-말단에 연결된다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드는 발현 벡터에서 Fc-융합 단백질의 상류에 인코딩되며, 스페이서는 Fc-융합 단백질의 신호 펩티드 및 N-말단 간에 프레임 내 인코딩된다. 또 다른 구현예에서, 펩티드 링커 또는 스페이서는 RSTGSPGSG(서열 목록 번호 12)을 포함한다.
개질된 아펠린 융합 폴리펩티드
다른 구현예에서, 본 발명의 임의의 Fc-융합 단백질의 서열은 이것이 N-연관된 글리코실화에 대한 임의의 수신체 부위를 포함하지 않도록 개질될 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 임의의 Fc-융합 단백질의 서열은, 예로 중성 pH에 비해 산성 pH에서 FcRn 수용체에 대한 항체 결합을 증강시키거나 감소시키기 위해 개질될 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 임의의 Fc-융합 단백질의 서열은 절단 또는 분해에 내성이 있도록 개질될 수 있다. 이와 같이, 아펠린-Fc-융합 단백질의 아펠린 펩티드에 대한 하나 이상의 C-말단 아미노산의 부가는 증가된 안정성, 예컨대 분해에 대한 내성을 부여할 수 있다. 하나의 이론에 구애받지 않고, 추가적인 C-말단 아미노산이 펩티드 또는 융합 단백질 내의 절단 부위에 대한 감수성을 제거할 수 있다. 순환으로부터 감소되거나 완화된 제거(즉 신장 배출 또는 제거)로 인해 안정성이 부여될 수 있다. 아펠린 펩티드에 대한 이러한 개질은 APLNR을 활성화시키는 이들의 능력을 변형시키지 않는다. 예시적인 개질된 아펠린 펩티드가 표 3 및 4에, 예로, 서열 목록 번호 38, 서열 목록 번호 42, 서열 목록 번호 43, 및 서열 목록 번호 44에 포함되어 있다. 본 발명의 예시적인 아펠린 융합 단백질에는 서열 목록 번호 39, 서열 목록 번호 40 및 서열 목록 번호 41을 포함한다.
일반적으로, 본원에 기재된 Fc-융합 단백질을 포함하는 단백질은 임의의 적합한 수의 이러한 개질된 아미노산(상기 논의된 비표준 아미노산 포함)의 함유 및/또는 콘주게이트된 치환체와의 연합에 의해 개질될 수 있다. 상기 맥락에서의 적합성은 일반적으로 적어도 실질적으로 선택성 및/또는 특이성에 연관된 Fc-융합 단백질을 보유하는 능력, 예를 들어 APLNR에 대한 결합에 의해 결정된다. 예를 들어, 개질된 아미노산은 글리코실화 아미노산, PEG화 아미노산, 파르네실화 아미노산, 게라닐-게라닐화 아미노산, 아세틸화 아미노산, 바이오티닐화 아미노산, 지질 모이어티에 콘주게이트된 아미노산, 또는 유기 유도체화 제제에 콘주게이트된 아미노산 등으로부터 선택될 수 있다. 하나 이상의 개질된 아미노산의 함유는, 예를 들어 폴리펩티드 혈청 반감기의 추가 증가, 폴리펩티드 항원성의 감소, 또는 폴리펩티드 저장 안정성의 증가에 유리할 수 있다. 아미노산(들)은, 예를 들어 재조합 생산 동안 번역과 동시에 또는 번역 후에 개질되거나(예로, 포유류 세포에서의 발현 동안 N-X-S/T 모티프에서의 N-연관 글리코실화) 합성 수단에 의해 개질된다. 개질된 아미노산의 비제한적 예에는 글리코실화 아미노산, 황화 아미노산, 프레닐화(예로, 파르네실화, 게라닐-게라닐화) 아미노산, 아세틸화 아미노산, 아실화 아미노산, 지방 아실화 아미노산, PEG화 아미노산, 바이오티닐화 아미노산, 카르복실화 아미노산, 인산화 아미노산 등이 포함된다. 아미노산 개질에서 당분야 숙련가의 안내에 적절한 참고문헌은 본 문헌에 걸쳐 제공된다. 예시적인 프로토콜은 [Walker, 1998, Protein Protocols On CD-Rom, Humana Press, Totowa, NJ]에서 확인된다.
본 발명의 Fc-융합 단백질을 포함하는 단백질은 또한, 예를 들어 이들의 순환 반감기를 추가 증가시키기 위해 중합체에 대한 공유 콘주게이션에 의해 화학적으로 개질될 수 있다. 예시적인 중합체, 및 이들을 펩티드에 부착하기 위한 방법은, 예를 들어 US 4,766,106, US 4,179,337, US 4,495,285 및 US 4,609,546에 예시된다. 추가적인 예시적 중합체에는 폴리옥시에틸화 폴리올 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG)(예로, 분자량 약 1,000 내지 약 40,000, 예컨대 약 2,000 내지 약 20,000, 예로 약 3,000-12,000g/mol의 PEG)이 포함된다. 예로, 래트에서 연장된 근육수축 효과를 갖는 폴리펩티드인 PEG-아펠린-36을 기재한 WO2012/125408을 참고하라.
하나의 구현예에서, 하나 이상의 방사선 표지된 아미노산을 포함하는 Fc-융합 단백질을 포함하는 단백질이 제공된다. 방사선 표지된 항체는 진단 및 치료 목적 모두를 위해 이용될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 Fc-융합 단백질을 포함하는 단백질은 치료제 또는 검출 가능한 마커인 분자에 콘주게이트될 수 있다. 하나의 구현예에서, 치료제는 세포독성제, 예컨대 방사선 동위원소이다. 폴리펩티드에 대한 방사선 동위원소의 예에는 비제한적으로 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 및 125I, 131I, 186Re, 그리고 225Ac가 포함된다. 방사선 표지된 아미노산 및 관련된 펩티드 유도체의 제조 방법은 당분야에 공지되어 있다(예를 들어 Junghans et al., in Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655-686(2nd edition, Chafner and Longo, eds., Lippincott Raven (1996)) 및 US 4,681,581, US 4,735,210, US 5,101,827, US 5,102,990(US RE35,500), US 5,648,471 및 US 5,697,902 참고). 예를 들어, 방사선 동위원소는 클로라민 T 방법에 의해 콘주게이트될 수 있다. 추가 구현예에서, 검출 가능한 마커는 방사선 표지, 효소, 발색단, 또는 형광 표지일 수 있다.
발현 시스템
본 발명은 폴리펩티드, 예로 본 발명의 아펠린 Fc-융합 단백질을 인코딩하는 발현 벡터를 제공한다. 이러한 발현 벡터는 본 발명의 폴리펩티드의 재조합 생산을 위해 이용될 수 있다.
본 발명의 맥락에서 발현 벡터는 염색체, 비-염색체 및 합성 핵산 벡터(적합한 세트의 발현 제어 요소를 포함하는 핵산 서열)를 포함하는 임의의 적합한 벡터일 수 있다. 이러한 벡터의 예에는 SV40의 유도체, 박테리아 플라스미드, 파지 DNA, 배큘로바이러스, 효모 플라스미드, 플라스미드와 파지 DNA의 조합에서 유래된 벡터, 및 바이러스 핵산(RNA 또는 DNA) 벡터가 포함된다. 하나의 구현예에서, Fc-융합 단백질 또는 폴리펩티드-인코딩 핵산 분자는, 예를 들어 선형 발현 요소(예를 들어 [Sykes and Johnston, Nat Biotech 12, 355-59 (1997)]에 기재됨)를 포함하는 네이키드 DNA 또는 RNA 벡터, 압축된 핵산 벡터(예를 들어 US 6,077,835 및/또는 WO 00/70087에 기재됨), 또는 플라스미드 벡터, 예컨대 pBR322, pUC 19/18, 또는 pUC 118/119로 이루어진다. 이러한 핵산 벡터 및 이들의 이용은 당분야에 널리 공지되어 있다(예를 들어, US 5,589,466 및 US 5,973,972 참고).
또 다른 구현예에서, 벡터는 기재된 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터를 포함하는 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하며, 상기 핵산 분자는 발현 제어 서열에 작동 가능하게 연결된다.
하나의 구현예에서, 벡터는 박테리아 세포에서 본 발명의 폴리펩티드의 발현에 적합하다. 이러한 벡터의 예에는 발현 벡터, 예컨대 BlueScript(Stratagene), pIN 벡터(Van Heeke & Schuster, 1989, J Biol Chem 264, 5503-5509), pET 벡터(Novagen, Madison, WI) 등이 포함된다.
발현 벡터는 부가적으로 또는 대안적으로 효모 시스템에서의 발현에 적합한 벡터일 수 있다. 효모 시스템에서의 발현에 적합한 임의의 벡터가 채용될 수 있다. 효모 시스템에서의 발현에 적합한 임의의 벡터가 채용될 수 있다. 적합한 벡터에는, 예를 들어 항상성 또는 유도성 프로모터, 예컨대 효모 알파 인자, 알코올 산화효소 및 PGH를 포함하는 벡터가 포함된다(하기 문헌에서 검토된다: F. Ausubel et al., ed., 1987, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley InterScience New York; and Grant et al., 1987, Methods in Enzymol 153, 516-544).
다른 구현예에서, 발현 벡터는 배큘로바이러스-감염된 곤충 세포에서의 발현에 적합하다. (Kost, T; and Condreay, JP, 1999, Current Opinion in Biotechnology 10(5):428-33.)
본 발명의 핵산 분자를 포함하는 벡터가 제공되며, 상기 핵산 분자는 포유류 숙주 세포에서의 발현에 적합한 발현 제어 서열에 작동 가능하게 연결된다.
발현 제어 서열은 관심 유전자의 전사, 및 이후 다양한 세포 시스템에서 단백질의 발현을 제어하고 유도하기 위해 조작된다. 플라스미드는 발현 가능한 관심 유전자를 원하는 요소, 예컨대 프로모터, 인핸서, 선택 가능한 마커, 작동인자 등을 포함하는 발현 제어 서열(즉, 발현 카세트)와 조합한다. 본 발명의 발현 벡터에서, Fc-융합 단백질 또는 항체-인코딩 핵산 분자는 임의의 적합한 프로모터, 인핸서, 선택 가능한 마커, 작동인자, 억제인자 단백질, 폴리A 종결 서열 및 다른 발현 촉진 요소를 포함하거나 이와 연관될 수 있다.
본원에서 이용되는 "프로모터"는 이것이 작동 가능하게 연결된, 즉 적절한 신호가 존재하는 경우 Fc-융합 단백질 또는 항체-인코딩 뉴클레오티드 서열의 전사를 허용하는 방식으로 연결된 DNA 서열의 전사를 지시하기에 충분한 DNA 서열을 나타낸다. Fc-융합 단백질 또는 항체-인코딩 뉴클레오티드 서열의 발현은 당분야에 공지된 임의의 프로모터 또는 인핸서 요소의 제어 하에 배치될 수 있다. 이러한 요소의 예에는 강한 발현 프로모터(예로, 인간 CMV IE 프로모터/인핸서 또는 CMV 주요 IE(CMV-MIE) 프로모터뿐만 아니라 RSV, SV40 후기 프로모터, SL3-3, MMTV, 유비퀴틴(Ubi), 유비퀴틴 C(UbC), 및 HIV LTR 프로모터)가 포함된다.
일부 구현예에서, 벡터는 SV40, CMV, CMV-IE, CMV-MIE, RSV, SL3-3, MMTV, Ubi, UbC 및 HIV LTR로 구성된 군으로부터 선택되는 프로모터를 포함한다.
본 발명의 핵산 분자는 또한 효과적인 폴리(A) 종결 서열, 이. 콜라이에서의 플라스미드 산물을 위한 복제 기원, 선택 가능한 마커로서의 항생제 내성 유전자, 및/또는 편리한 클로닝 부위(예로, 폴리링커)에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 핵산은 또한 CMV IE와 같은 항상성 프로모터와 대비되어 조절 가능한 유도성 프로모터(유도성, 억제 가능, 발달적으로 조절되는)를 포함할 수 있다(당분야 숙련가는 이러한 용어가 특정 조건 하에 유전자 발현 정도의 실제 설명자임을 인지할 것임).
선택 가능한 마커는 당분야에 널리 공지된 요소이다. 선택 조건 하에, 적절한 선택 가능한 마커를 발현하는 세포만 생존할 수 있다. 선택 조건 하에, 적절한 선택 가능한 마커를 발현하는 세포만 생존할 수 있다. 일반적으로, 선택 가능한 마커 유전자는 단백질, 보통 세포 배양에서 다양한 항생제에 내성을 부여하는 효소를 발현한다. 구현예에는 베타-락타마아제(bla) (베타-락탐 항생제 내성 또는 앰피실린 내성 유전자 또는 ampR), bls(블라스티시딘 내성 아데틸 트랜스퍼라아제 유전자), bsd(블라스티시딘-S 데아미나아제 내성 유전자), bsr(블라스티시딘-S 내성 유전자), Sh ble(Zeocin® 내성 유전자), 히그로마이신 포스포트랜스퍼라아제(hpt) (히그로마이신 내성 유전자), tetM(테트라사이클린 내성 유전자 또는 tetR), 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 II(npt) (네오마이신 내성 유전자 또는 neoR), kanR(카나마이신 내성 유전자), 및 pac(퓨로마이신 내성 유전자)이 포함된다.
특정 구현예에서, 벡터는 bla, bls, BSD, bsr, Sh ble, hpt, tetR, tetM, npt, kanR 및 pac으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 선택 가능한 마커 유전자를 포함한다. 다른 구현예에서, 벡터는 녹색 형광 단백질(GFP), 증강된 녹색 형광 단백질(eGFP), 시아노 형광 단백질(CFP), 증강된 시아노 형광 단백질(eCFP), 또는 황색 형광 단백질(YFP)을 인코딩하는 하나 이상의 선택 가능한 마커 유전자를 포함한다.
본 발명의 목적을 위해, 진핵생물 세포에서의 유전자 발현은 작동인자에 의해 제어되며, 다시 재조합 "조절 융합 단백질"(RFP)일 수 있는 조절 단백질에 의해 조절되는 강한 프로모터를 이용해서 엄격하게 조절될 수 있다. RFP는 본질적으로 전사 차단 도메인, 및 그 활성을 조절하는 리간드-결합 도메인으로 구성된다. 이러한 발현 시스템의 예는, 본원에 그 전문이 참조로 포함되는 US20090162901A1에 기재되어 있다.
본원에서 이용되는 "작동인자"는 유전자가 RFP의 작동인자로의 결합에 의해 조절되고, 그 결과 관심 유전자, 즉 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드의 전사를 방지하거나 허용할 수 있는 방식으로 유전자 내부 또는 근처에 도입되는 DNA 서열을 나타낸다. 원핵생물 세포 및 박테리오파지의 여러 작동인자는 잘 분석되어 있다(Neidhardt, ed., Escherichia coli and Salmonella; Cellular and Molecular Biology 2d. Vol 2 ASM Press, Washington D.C. 1996). 이들에는 비제한적으로 LexA 펩티드에 결합하는 LexA 유전자(이. 콜라이)의 작동인자 영역, 및 LacI 및 trpR 유전자(이. 콜라이)에 의해 인코딩되는 억제인자 단백질에 결합하는 락토오스 및 트립토판 작동인자가 포함된다. 이들에는 또한 람다 PR 및 파지 P22 ant/ mnt 유전자로부터의 박테리오파지 작동인자가 포함되며, 이는 람다 cI 및 P22 arc에 의해 인코딩되는 억제인자 단백질에 결합한다. 일부 구현예에서, RFP의 전사 차단 도메인이 제한 효소, 예컨대 NotI인 경우, 작동인자는 그 효소에 대한 인식 서열이다. 당분야 숙련가는 작동인자가 프로모터에 의한 전사를 제어할 수 있도록 프로모터에 인접하거나 3'에 위치해야 함을 인식할 것이다. 예를 들어, U.S. 특허 번호 5,972,650(본원에 참조로 포함됨)은 tetO 서열이 TATA 박스로부터 특정 거리 내임을 특정한다. 특정 구현예에서, 작동인자는 바람직하게는 프로모터의 바로 다운스트림에 배치된다. 특정 구현예에서, 작동인자는 바람직하게는 프로모터의 바로 다운스트림에 배치된다. 다른 구현예에서, 작동인자는 프로모터의 10 염기쌍 내에 배치된다.
특정 구현예에서, 작동인자는 tet 작동인자(tetO), NotI 인식 서열(이는 친숙하지 않음; NotI은 제한 효소로 알고 있음), LexA 작동인자, 락토오스 작동인자, 트립토판 작동인자 및 Arc 작동인자(AO)로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 억제인자 단백질은 TetR, LexA, LacI, TrpR, Arc, LambdaC1 및 GAL4로 구성된 군으로부터 선택된다. 다른 구현예에서, 전사 차단 도메인은 진핵생물 억제인자 단백질, 예로 GAL4에서 유래된 억제인자 도메인으로부터 유래된다. 박테리아 작동인자는 포유류 및 다른 숙주 세포 시스템에서 채용될 수 있다(예로, 본원에 참조로 포함되는 US 20090162901A1 참고).
예시적인 세포 발현 시스템에서, 세포는 테트라사이클린 억제인자 단백질(TetR)을 발현하도록 조작되며, 관심 단백질은 그 활성이 TetR에 의해 조절되는 프로모터의 전사 제어 하에 놓인다. 두 일렬 TetR 작동인자(tetO)는 벡터에서 CMV-MIE 프로모터/인핸서의 바로 다운스트림에 배치된다. 이러한 벡터에서 CMV-MIE 프로모터에 의해 지시되는 관심 단백질을 인코딩하는 유전자의 전사는 테트라사이클린 또는 일부 다른 적합한 유도제(예로, 독시사이클린)의 부재 하에 TetR에 의해 차단될 수 있다. 유도제의 존재 하에, TetR 단백질은 tetO에 결합할 수 없으므로, 관심 단백질의 전사, 이어서 번역(발현)이 일어난다. (예로 본원에 그 전문이 참조로 포함된, US 특허 번호 7,435,553 참고).
또 다른 예시적인 세포 발현 시스템에는 조절 융합 단백질, 예컨대 TetR-ERLBDT2 융합 단백질이 포함되며, 상기 융합 단백질의 전사 차단 도메인은 TetR이고 리간드-결합 도메인은 T2 돌연변이를 갖는 에스트로겐 수용체 리간드-결합 도메인(ERLBD)이다. (ERLBDT2; Feil et al., 1997, Biochem . Biophys . Res. Commun. 237:752-757). tetO 서열이 강한 CMV-MIE 프로모터의 하류에 인접하여 배치되는 경우, CMV-MIE/tetO 프로모터로부터 관심 뉴클레오티드 서열의 전사는 타목시펜의 존재 하에 차단되고 타목시펜의 제거에 의해 차단이 해제되었다. 또 다른 예에서, 융합 단백질 Arc2-ERLBDT2의 이용에는 Arc 작동인자(AO), 보다 구체적으로 CMV-MIE 프로모터/인핸서의 바로 하류의 두 일렬 arc 작동인자가 관여되며, 융합 단백질은 15 아미노산 링커에 의해 연결된 두 Arc 단백질로 구성된 단일쇄 이량체 및 ERLBDT2(상기)로 구성된다. 세포주는 Arc2-ERLBDT2에 의해 조절될 수 있고, 여기서 관심 단백질을 발현하는 세포는 CMV-MIE/ArcO2 프로모터에 의해 유도되며, 타목시펜의 제거로 유도 가능하다. (예로, 본원에 참조로 포함된 US 20090162901A1 참고).
일부 구현예에서, 본 발명의 벡터는 CMV-MIE/TetO 또는 CMV-MIE/AO2 하이브리드 프로모터를 포함한다.
본 발명의 벡터는 또한 관심 유전자의 숙주 게놈 내 통합을 촉진하기 위한 Cre-lox 재조합 도구를 채용할 수 있다. Cre-lox 전략에는 적어도 두 성분이 필요하다: 1) 두 loxP 부위 간 재조합을 촉매하는 효소인 Cre 재조합효소; 및 2) loxP 부위(예로, 재조합이 일어나는 8-bp 코어 서열로 구성되는 특정한 34-염기쌍 bp 서열, 및 두 인접 13-bp 역전 반복체) 또는 돌연변이체 lox 부위. (예로, 모두 본원에 참조로 포함되는 Araki et al., 1995, PNAS 92:160-4; Nagy, A. et al., 2000, Genesis 26:99-109; Araki et al., 2002, Nuc Acids Res 30(19):e103; 및 US20100291626A1 참고). 다른 재조합 전략에서, 효모-유래 FLP 재조합효소는 공통 서열 FRT와 함께 이용될 수 있다(예로, Dymecki, S.M., 1996, PNAS 93(12): 6191-6196).
또 다른 측면에서, 유전자(즉 본 발명의 재조합 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열)는 발현 카세트의 발현-증강 서열 내에 삽입되며, 선택적으로 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 상기 프로모터-연결된 유전자는 제1 재조합효소 인식 부위에 의해 5'에 그리고 제2 재조합효소 인식 부위에 의해 3'에 인접한다. 이러한 재조합효소 인식 부위는 발현 시스템의 숙주 세포에서 Cre-매개된 재조합을 허용한다. 일부 예에서, 제2 프로모터-연결된 유전자는 제1 유전자의 다운스트림(3')에 있고 제2 재조합효소 인식 부위에 의해 3'에 인접한다. 다른 예에서, 제2 프로모터-연결된 유전자는 제2 재조합효소 부위에 의해 5'에 인접하고 제3 재조합효소 인식 부위에 의해 3'에 인접한다. 일부 구현예에서, 재조합효소 인식 부위는 loxP 부위, lox511 부위, lox2272 부위, 및 FRT 부위로부터 선택된다. 다른 구현예에서, 재조합효소 인식 부위는 상이하다. 추가 구현예에서, 숙주 세포는 Cre 재조합효소를 발현할 수 있는 유전자를 포함한다.
일부 구현예에서, 벡터는 소포체(ER)에서 단백질 폴딩에 관여되는 유전자의 발현 제어를 통해 단백질 생산/단백질 분비를 증강시킬 수 있는 X-박스-결합 단백질 1(mXBP1) 유전자를 추가로 포함한다. (예로, Ron D, and Walter P., 2007, Nat Rev Mol Cell Biol. 8:519-529 참고).
용어 "세포"에는 재조합 핵산 서열을 발현하기 적합한 임의의 세포가 포함된다. 세포에는 원핵생물 및 진핵생물의 세포(단세포 또는 다세포), 박테리아 세포(예로, 이. 콜라이 계통, 바실러스종, 스트렙토마이세스종 등), 미코박테리아 세포, 진균 세포, 효모 세포(예로, 에스, 세레비시애, 에스, 폼베, 피. 파스토리스, 피. 메타놀리카 등), 식물 세포, 곤충 세포(예로, SF-9, SF-21, 배큘로바이러스-감염된 곤충 세포, 트리코플러시아 나이 등), 비-인간 동물 세포, 포유류 세포, 인간 세포, 또는 세포 융합물, 예를 들어 하이브리도마 또는 쿼드로마가 포함된다. 특정 구현예에서, 세포는 인간, 원숭이, 유인원, 햄스터, 래트 또는 마우스 세포이다. 다른 구현예에서, 세포는 진핵생물 세포이고 하기 세포로부터 선택된다: 다른 구현예에서, 세포는 진핵생물 세포이고 하기 세포로부터 선택된다: CHO(예로, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS(예로, COS-7), 망막 세포, Vero, CV1, 신장(예로, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK21), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo25, HB 8065, HL-60, Jurkat, Daudi, A431(표피), CV-1, U937, 3T3, L 세포, C127 세포, SP2/0, NS-0, MMT 세포, 종양 세포, 및 상기 언급된 세포에서 유래된 세포주. 일부 구현예에서, 세포는 하나 이상의 바이러스 유전자, 예로 바이러스 유전자를 발현하는 망막 세포(예로, PER.C6® 세포)를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포는 CHO 세포이다. 다른 구현예에서, 세포는 CHO K1 세포이다.
예를 들어 하나의 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 재조합 폴리펩티드의 발현을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 세포 게놈 내로 안정적으로 통합된 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 재조합 폴리펩티드의 발현을 코딩하는 서열을 포함하는, 통합되지 않은(즉, 에피솜) 핵산, 예컨대 플라스미드, 코스미드, 파지미드, 또는 선형 발현 요소를 포함하는 세포를 제공한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 숙주 세포를 본 발명의 발현 벡터를 포함하는 플라스미드로 안정적으로 전달감염하여 생산된 세포주를 제공한다.
추가 측면에서, 본 발명은 본 발명의 Fc-융합 단백질의 생산 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 a) 본원에 상술된 본 발명의 숙주 세포의 배양 단계, 및 b) 배양 배지로부터 Fc-융합 단백질(상기)의 정제 단계를 포함한다.
본 발명의 치료 및 진단 용도
추가 측면에서, 본 발명은 본원에 정의된 아펠린 융합 폴리펩티드 또는 단백질을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제뿐만 아니라 공지된 보강제 및 부형제로 통상적 기법, 예컨대 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995]에 따라 시행 착오 실험을 이용하여 제형화될 수 있다.
약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제뿐만 아니라 임의의 다른 공지된 보강제 및 부형제는 선택된 본 발명의 아펠린 융합물 또는 아펠린 Fc-융합 단백질 및 선택된 투여 경로에 적합해야 한다. 본 발명의 약학 조성물에서 활성 성분의 실제 투여 수준은 약물 성분의 적절한 안정성, 특정 환자에 대해 원하는 치료 반응, 조성 및 투여 경로를 달성하기 위해 효과적인 활성 성분의 양을 수득하기 위해 변할 수 있다. 선택된 투여 수준은 다양한 약동학 인자에 의존할 것이다.
약학 조성물은 임의의 적합한 경로 및 방식으로 투여될 수 있다. 약학 조성물은 임의의 적합한 경로 및 방식으로 투여될 수 있다. 본 발명의 아펠린 융합 단백질의 적합한 생체 내 투여 경로는 당분야에 널리 공지되어 있고, 당업자에 의해 선택될 수 있다. (Daugherty, AL, and Msrny, RJ, 2006, Adv Drug Delivery Rev, 58(5-6): 686-706).
아펠린 융합 단백질은 심혈관 상태의 관리를 위해 투여되는 제제, 예컨대 근육수축제, 구체적으로 촉진 근육수축제이다. 특정한 이론에 구애받지 않고, 촉진 근육수축제는 심근 수축을 증가시키며, 울혈성 심부전, 심근 경색, 심근병증 등의 상태에서 심장 기능을 지지하기 위해 이용된다. (Dai, et al., 2006, Eur J Pharmacol 553(1-3): 222-228; Maquire, et al, Hypertension. 2009;54:598-604; 및 Berry, M.,. et al., 2004 Circulation, 110:II187-II193 참고). 아펠린-유도된 혈관확장은 허혈-재관류 부상에서 보호성일 수 있다. 아펠린 펩티드에 의한 혈관신생의 촉진 및 더 큰 비누출성 혈관의 유도는 허혈로부터의 기능적 회복에 기여할 수 있다.(Eyries M, et al., 2008, Circ Res 103:432-440; Kidoya H, et al., 2010, Blood 115:3166-3174).
아펠린 수용체 작용제는 심장 출력을 증가시키거나, 심장 기능을 개선하거나, 심장 기능을 안정화하거나, 심장 기능의 감소를 제한하거나, 심장 또는 다른 조직의 허혈성 또는 손상된 영역에서 새로운 혈관 성장을 촉진하기 위해 투여되는 친-혈관신생 제제로 간주된다. 따라서, 본 발명의 아펠린 수용체 작용제는 혈관신생을 촉진하며, 이에 따라 허혈을 치료하고, 허혈성 기관 및 조직으로의 혈류를 복원하고, 예를 들어 수족 허혈, 말초 허혈, 신장 허혈, 눈 허혈, 뇌 허혈 또는 임의의 허혈성 질환을 치료하는데 유용하다.
본 발명의 아펠린 융합 단백질은 혈류를 증가시키거나 심장 수축을 증가시키기 위해, 예컨대 허혈 및 심부전을 치료하거나 완화하기 위해 투여되는 제제이다.
아펠린 융합 단백질은 허혈 및 재관류 부상을 치료하거나 완화하기 위해, 예컨대 허혈/재관류(I/R) 부상을 제한하거나 심장 조직의 괴사 개시를 지연하기 위해, 또는 예방적 치료를 제공하기 위해, 예를 들어 심장을 허혈/재관류(I/R) 부상으로부터 보호하거나, 심장 기능을 개선하거나 또는 심근 경색의 발생을 제한하기 위해 투여되는 제제이다.
아펠린 융합 단백질은 당뇨병 및 비만에 관련된 대사 상태의 관리를 위해 투여되는 제제이다. 아펠린은 비만 인슐린 내성 마우스에서 근육 조직에 의해 글루코오스 관용성을 개선하며, 글루코오스 이용을 증강시킨다(Dray et al., 2008, Cell Metab 8:437-445). 아펠린 KO 마우스는 감소된 인슐린 감수성을 갖는다(Yue at al., 2010, Am J Physiol Endocrinol Metab 298:E59-E67). 이와 같이, 아펠린 융합 단백질은 인슐린-내성 당뇨병 치료에서 글루코오스 관용성을 개선하기 위해 투여되는 제제이다.
근육 아펠린 mRNA 수준의 변화는 또한 전신 인슐린 감수성 개선에 연관된다(Besse-Patin, A. et al., 2013 Aug 27, Int J Obes (Lond). doi: 10.1038/ijo.2013.158, 인쇄 전 전자공개됨). 10.1038/ijo.2013.158, 인쇄 전 전자공개됨). 근육 조직에서 이러한 대사적 개선 및 아펠린-유도된 혈관확장으로 인해, 작용성 아펠린 융합 단백질은 또한 근육 성장 및 내구성을 자극하기 위해 투여될 수 있다.
일차 HIV-1 단리물은 공동수용체로서 APLNR을 또한 이용할 수 있고, 합성 아펠린 펩티드가 CD4-APLNR-발현 세포 내로 HIV-1의 진입을 저해함을 나타내었다(Cayabyab, M., et al., 2000, J. Virol ., 74: 11972-11976). 아펠린 융합 단백질은 HIV 감염을 치료하기 위해 투여된다.
아펠린 펩티드가 뉴론 생존을 촉진하기 위한 신호전달 경로를 통해 작용하는 경우 아펠린-신경보호가 또한 나타난다(Cheng, B, et al., 2012, Peptides, 37(1):171-3). 아펠린 융합 단백질은 뉴론의 생존을 촉진하거나 증가시키기 위해 투여된다.
아펠린 수용체 작용제는 또한 전신 열감 억제제로 기재되어 있다. (2012. 10. 4.에 공개된 WO2012/133825 참고). 본 발명의 아펠린 융합 단백질은 또한 대상체에서 전신 열감 증상을 치료하거나, 개선하거나, 또는 억제하기 위해 투여될 수 있다.
아펠린 펩티드는 지방 조직 증식을 통해 비만을 촉진할 수 있다. 아펠린은 저산소증에 의해 유도되고 증식하는 지방 조직의 저산소증 내부에서 혈관신생을 유도한다.(Kunduzova O, et al., 2008, FASEB J, 22:4146-4153). 그러나 일부 아펠린 융합 단백질은 체중 감소를 촉진하거나 비만을 치료하기 위해 조직 특이적 방식으로 상기 기전의 저해제로 작용하는 APLNR의 길항제이다. 따라서 아펠린 융합 단백질은 비만을 치료하고 체중 감소를 촉진하기 위해 투여되는 차단제이다.
종양 성장 또는 망막 내의 신혈관생성의 촉진에 관여되는 병리적 혈관신생은 아펠린 또는 APLNR 길항제에 반응성일 수 있다. (Kojima, Y. and Quertermous, T., 2008, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 28:1687-1688; Rayalam, S. et al. 2011, Recent Pat Anticancer Drug Discov 6(3):367-72). 이와 같이, 아펠린 융합 단백질은 종양 성장 또는 전이를 완화시키거나 종양 및 전이성 질환을 치료하기 위해 투여되는 저해제이다. 아펠린 융합 단백질은 또한 망막병증을 치료하기 위해 투여된다.
APLNR 길항제는 또한 병리적 질환에 의해 야기되는 과활동성 아펠린 시스템의 효과를 완화시킴으로써, 섬유성 조직에서와 같이 혈관신생을 감소시키고 기능을 개선할 수 있다(Principe, et al., 2008; Reichenbach, et al., 2012, JPET 340(3):629-637). 임의의 한 이론에 구애받지 않고, 아펠린 시스템의 차단은 경변과 같은 병리적 상태에서와 같이 보수 또는 반응 절차에서 기관 또는 조직 내의 과도한 섬유성 연결 조직 형성을 완화시킬 수 있다. 이와 같이, 아펠린 융합 단백질은 섬유화 진행을 완화 또는 방지하기 위해 또는 섬유화를 치료하기 위해 투여되는 저해제로 이용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 Fc-융합 단백질은 질환 또는 상태의 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 질환 또는 상태를 치료하기 충분한 치료 유효량의 아펠린 융합 단백질을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.
하나의 구현예에서, 이를 필요로 하는 대상체에서 아펠린에 관련된 질환 또는 상태의 치료 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 치료 유효량의 아펠린 융합 단백질을 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 아펠린 융합 단백질은 Fc 도메인, 또는 이들의 단편에 융합된 아펠린 펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.
질환 또는 상태는 심혈관 질환, 급성 대사장애 심부전, 울혈성 심부전, 심근 경색, 심근병증, 허혈, 허혈/재관류 부상, 폐 고혈압, 당뇨병, 비만, 암, 전이성 질환, 체액 항상성, 병리적 혈관신생, 망막병증, 및 HIV 감염으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 아펠린 융합 단백질은 심혈관 질환, 급성 대사장애 심부전, 울혈성 심부전, 심근 경색, 심근병증, 허혈, 허혈/재관류 부상, 폐 고혈압, 당뇨병, 전신 열감 증후군, 체액 항상성, 및 HIV 감염으로 구성된 군으로부터 선택되는 질환 또는 상태의 치료에 유용한 APLNR 작용제이다. 또 다른 구현예에서, 아펠린 융합 단백질은 뉴론 세포 생존을 촉진하는 APLNR 작용제이다. 또 다른 구현예에서, 아펠린 융합 단백질은 인슐린에 대한 감수성을 감소시키는 APLNR 작용제이다.
일부 구현예에서, 아펠린 융합 단백질은 비만, 암, 전이성 질환, 망막병증, 섬유화, 및 병리적 혈관신생으로 구성된 군으로부터 선택되는 질환 또는 상태의 치료에 유용한 APLNR 길항제이다. 하나의 구현예에서, 아펠린 융합 단백질은 체중 감소를 촉진하는 APLNR 길항제이다. 하나의 구현예에서, 아펠린 융합 단백질은 병리적 혈관신생 또는 신혈관형성을 감소시키는 APLNR 길항제이다. 다른 구현예에서, 아펠린 융합 단백질은 종양 성장을 감소시키거나 저해하는 APLNR 길항제이다.
본원에서 이용되는 Fc-융합 단백질의 "치료 유효량"은 상기 단백질의 투여를 포함하는 치료적 개입에서 주어진 질환 및 그 합병증의 임상적 발현을 완화하거나, 경감하거나 또는 부분적으로 정지시키기 충분한 양을 의미한다. 이를 달성하기 적절한 양이 "치료 유효량"으로 정의된다. 각각의 목적을 위한 유효량은 질환 또는 부상의 중증도뿐만 아니라 대상체의 체중 및 일반 상태에 의존할 것이다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "치료" 및 "치료하다"는 상태, 예컨대 질환 또는 장애의 박멸을 목적으로 하는 환자의 관리 및 케어를 의미한다. 상기 용어는 환자가 겪는 주어진 상태에 대한 전범위 치료, 예컨대 증상 및/또는 합병증을 경감하거나 완화하기 위한, 질환, 장애 또는 상태의 진행을 지연시키기 위한, 및/또는 질환, 장애 또는 상태를 구제하거나 제거하기 위한 것뿐만 아니라 상태를 방지하기 위한 활성 성분(Fc-융합 단백질)의 투여를 포함하려는 것이며, 여기서 방지는 질환 진행의 중지를 목적으로 하는 환자의 관리 및 케어로서 이해되어야 하며, 증상 또는 합병증의 개시를 방지하기 위한 활성 성분의 투여가 포함된다. 마찬가지로, 방지적, 완화적, 및 치료적(근치적) 처리가 본 발명의 각 측면이다. 치료받을 대상체는 포유류, 특히 인간이다. 치료받을 대상체는 포유류, 특히 인간이다.
일부 구현예에서, 치료는 질환 또는 상태의 관리 치료, 재발 방지 또는 안정화이다.
본 발명에는 하나 이상의 추가적 치료 활성 성분과 조합된, 본원에 기재된 임의의 아펠린 융합 단백질을 포함하는 조성물 및 치료 제형물, 그리고 이러한 조합을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법이 포함된다.
이러한 추가적 치료 활성 성분에는 VEGF 저해제, 혈압약, 칼슘 채널 차단제, 디기탈리스, 항-부정맥제, ACE 저해제, 항응고제, 면역억제제, 진통제, 혈관확장제 등이 포함된다.
본 발명의 아펠린 융합 단백질은 Fc 도메인 또는 Fc 도메인의 단편을 갖지 않는 아펠린 펩티드에 비해 개선된 약동학 특성, 예컨대 순환 혈청 반감기 및 안정성을 갖는 제제를 제공한다. 하나의 구현예에서, 아펠린 융합 단백질의 주사 후 혈청 수준은 약 1시간 초과, 또는 약 2시간 초과, 또는 약 3시간 초과, 또는 약 4시간 초과, 또는 약 5시간 초과, 또는 약 10시간 초과, 또는 약 24시간 초과 동안 증가되거나 상승된다. 다른 구현예에서, 아펠린 융합 단백질은 약 10분 초과, 또는 약 1시간 초과, 또는 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9시간 초과, 또는 약 10시간 초과, 또는 약 24시간 초과의 혈청 또는 혈장 반감기를 갖는다.
본 발명의 표지된 아펠린 융합 단백질은 질환 또는 장애를 검출, 진단 또는 모니터링하기 위한 진단 목적으로 이용될 수 있다. 본 발명은 하기를 포함하는, 질환 또는 장애의 검출 또는 진단을 제공한다: (a) 표적 APLNR에 면역특이적으로 결합하는 하나 이상의 아펠린 융합 단백질을 이용하여 대상체의 세포 또는 조직 표본 중 아펠린 수용체(APLNR)의 존재를 분석하는 단계; 및 (b) APLNR 수준을 대조군 수준, 예로 정상 조직 표본 중 수준과 비교하는 단계(이에 따라 APLNR의 대조군 수준 대비 APLNR의 분석된 수준의 증가는 질환 또는 장애를 시사하거나 질환 또는 장애의 중증도를 시사함).
본 발명의 아펠린 융합 단백질은 당분야에 널리 공지된 면역조직화학 방법을 이용하여 생물학적 표본 중 APLNR 수준을 분석하기 위해 이용될 수 있다. APLNR 단백질을 검출하는데 유용한 다른 아펠린-기반 방법에는 면역분석, 예컨대 효소 연관 면역분석(ELISA) 및 방사선면역분석(RIA)이 포함된다. 적합한 아펠린 융합 단백질 표지가 이러한 키트 및 방법에서 이용될 수 있고, 당분야에 공지된 표지에는 효소 표지, 예컨대 알칼린 포스파타아제 및 글루코오스 산화효소; 방사선동위원소 표지, 예컨대 요오드(125I, 131I), 탄소(14C), 황(35S), 삼중수소(3H), 인듐(121In), 및 테크네티움(99 m Tc); 및 발광 표지, 예컨대 루미놀 및 루시퍼라아제; 그리고 형광 표지, 예컨대 플루오레신 및 로다민이 포함된다.
표지된 아펠린 융합 단백질의 존재는 진단 목적을 위해 생체 내 검출될 수 있다. 하나의 구현예에서, 진단은 a) 대상체에 유효량의 표지된 아펠린 융합 단백질을 투여하는 단계; b) 투여 후 일정 시기 동안 APLNR이 검출될 수 있는 부위에 표지된 아펠린 융합 단백질이 농축되고 표지된 미결합 아펠린 융합 단백질이 배경 수준까지 제거될 수 있도록 하는 시간 동안 기다리는 단계; c) 배경 수준을 결정하는 단계; 및 d) 대상체에서 표지된 아펠린 융합 단백질을 검출하는 단계를 포함하며, 배경 수준을 초과하는 표지된 아펠린 융합 단백질의 검출은 대상체가 증가된 APLNR 단백질을 가짐을 시사하거나, 질환 또는 장애가 있음을 시사하거나, 또는 APLNR 단백질의 증가는 질환 또는 장애의 중증도를 시사한다. 이러한 구현예에 따라, 아펠린 융합 단백질은 당분야 숙련가에게 공지된 특정 조영 시스템을 이용하여 검출에 적합한 조영 모이어티로 표지된다. 배경 수준은, 표지된 아펠린 융합 단백질의 검출량을 특정 조영 시스템에 대해 이전에 결정된 표준 값과 비교하는 단계를 포함하는 당분야에 공지된 다양한 방법에 의해 결정될 수 있다. 본 발명의 진단 방법에서 이용될 수 있는 방법 및 시스템에는 비제한적으로 컴퓨터 단층촬영(CT), 전신 스캔, 예컨대 양전자 방출 단층촬영(PET), 자기 공명 조영(MRI) 및 초음파 검사가 포함된다.
본 발명은 또한 본 발명의 적어도 하나의 활성화 융합 단백질로 충전된 하나 이상의 용기를 포함하는 팩 또는 키트(예로, 약학 팩 또는 키트)를 제공한다. 본 발명의 키트는, 예를 들어 진단적인 것을 포함하는 임의의 적용 가능한 방법에서 이용될 수 있다. 선택적으로 이러한 용기(들)에는 약학제 또는 생물학적 제품의 제조, 이용 또는 판매를 규제하는 정부 당국에 의해 처방된 형태의 통지가 연관될 수 있고, 이 통지는 (a) 당국에 의한 인간 투여를 위한 제조, 이용 또는 판매의 승인, (b) 이용 지침, 또는 (c) 제조 및 이용 지침 모두에 대한 승인을 반영한다.
생체 외 및 생체 내 분석
본 발명의 아펠린 Fc-융합 단백질은 혈청 반감기를 연장하면서 APLNR에 대해 실질적 활성을 유지한다. APLNR 신호 전달은 아펠린 Fc-융합 단백질 및 아펠린의 공지된 치료적 및 생물학적 효과 간 관련성을 제공한다. 따라서, 시험관 내, 생체 외, 또는 생체 내 APLNR 활성에 대한 아펠린 Fc-융합 단백질 효과의 임의 표시는 환자 또는 동물에서 아펠린 Fc-융합 단백질의 생체 내 생물학적 또는 의학적 효과의 합리적인 증거를 제거한다. 다른 연구 중에서, 아펠린/APLNR은 심근 허혈/재관류(I/R) 부상에 대한 내인성 보호 시스템이며, 아펠린/APLNR 활성화, 특히 pERK의 항-아폽토시스 효과는 이러한 부상에 대해 보호함이 나타났다(Zeng, et al. 2009, Peptides, 30(6):1144-52, 2009. 2. 24.에 전자공개됨).
내인성 아펠린 펩티드, 아펠린 유사체, 및 개질된 아펠린 펩티드를 포함하는 APLNR의 작용제는 여러 생체 내 분석에서 치료 활성을 나타낸다(예로, WO2012125408에서의 PEG-아펠린-36, 및 [Iturrioz, X. et al. 2010, FASEB J, 24(5):1506-17.2009. 12. 29.에 전자공개됨]에서의 비펩티드성 아펠린 작용제).
APLNR 작용성은 심박율 및 심장 수축 증가를 일으키는 것으로 나타났다(Ashley, EA, et. al. 2005, Cardiovasc Res. 65(1):73-82). 또한, 아펠린 펩티드는 심근세포의 전기생리를 변형시키는 것으로 나타났다. 전세포 패치-클램프 기법이 아펠린 투여 전후에 단리된 토끼 좌심방(LA) 심근세포에서 활동 전위(AP) 및 이온 전류를 조사하기 위해 이용되었다(예로, Farkasfalvi, K., et al., 2007, Biochem Biophys Res Commun. 357(4):889-95. (2007. 4. 12.에 전자공개됨) 참고; 및 Cheng, CC, et al., 2013, Eur J Clin Invest. 43(1):34-40. 2012. 10. 28.에 전자공개됨; 둘 다 본원에 참조로 포함됨). 아펠린 작용성에 의해 유도된 등방성은 또한 랑겐도르프(Langendorf) 또는 작동 심장 시스템을 이용하여 마우스 또는 래트로부터 단리된 심장에서 ECG 파라미터를 측정하여 평가될 수 있다. 이러한 전기생리적 및 생체 내 기법, 예컨대 마이크로-초음파 또는 심장초음파 검사가 본 발명의 폴리펩티드의 치료 작용을 평가하기 위해 이용된다.
아펠린 Fc-융합 폴리펩티드의 보호 효과는 단리된 래트 또는 마우스 심장에서 심근 허혈/재관류(I/R) 부상 또는 저산소증/재산소화(H/R) 후, 예컨대 랑겐도르프 시스템에서와 같이 평가될 수 있다(예로, Zeng, et al. 2009, Peptides, 30(6):1144-52, 2009. 2. 24.에 전자공개됨; Pisarenko, et al. 2010, Kardiologiia, 50(10):44-9; 및 Pisarenko, et al., 2013, J Pharmacol Pharmacother. "Effects of structural analogues of apelin-12 in acute myocardial infarction in rats"(인쇄 전 전자공개됨) 참고).
일시적 LAD 결찰은 또한 재관류 전에 투여되는 아펠린 작용제와 함께 수행될 수 있다.(참고 Pisarenko, et al. 2011, Bull Exp Biol Med. 152(1):79-82; Li, L. et al, 2012, Am J Physiol Heart Circ Physiol , 303(5):H605-18, 2012. 6. 29.에 전자공개됨; 및 Tao, J., et al, 2011, Am J Physiol Heart Circ Physiol, 301(4):H1471-86(2011. 7. 29.에 전자공개됨)). 심장 부상 후, 마이크로초음파 파라미터가 개선에 대해 심장 기능의 측정뿐만 아니라 경색 크기의 평가를 위해 이용될 수 있다.
하기 실시예는 당업자에게 본 발명의 제조 및 이용 방법과 조성물을 설명하기 위해 제공되며, 본 발명자들이 자신의 발명으로 간주하는 범위를 제한하기 위한 것이 아니다. 이용되는 숫자(예로, 양, 농도, 온도 등)에 대한 정확성을 보장하기 위해 노력했으나, 일부 실험적 오류 및 편차가 고려되어야 한다.
실시예
실시예 1- 발현 작제물의 클로닝
합성 유전자 단편을 아펠린-13과 N-말단 및 C-말단 hFc 융합물을 생성하기 위해 이용하였다. 생성 융합물, hFc-아펠린13(서열 목록 번호 1) 및 아펠린13-hFc(서열 목록 번호 3)을 인코딩하는 DNA를 표준 분자 클로닝 기법을 이용해서 CMV 프로모터의 다운스트림 발현 벡터 내로 삽입하였다. 융합 단백질의 생산을 위해 CHO 안정형 세포주를 생성하고 이용한 후 친화도 방법에 의해 정제하였다. N-말단 hFc-아펠린13 및 C-말단 아펠린13-hFc 융합 단백질은 이들의 예측 질량과 일치되게 SDS-PAGE 겔 상에서 이동한다.(도 3a 참고). 항-아펠린 항체(Abcam, #ab59469)로 수행한 웨스턴 블롯 분석을 이용하여 hFc-아펠린13 및 아펠린13-hFc 상에서 아펠린의 존재를 확인하였다.(도 3b 참고).
실시예 2- cAMP-리포터 분석에서 아펠린 Fc 융합 단백질의 역가 및 유효성
개질되지 않은 아펠린 펩티드(Bachem, # H-4568.0001) 및 본 발명의 아펠린 13 융합 단백질에 의한 세포 내 cAMP 수준의 조정을 hAPLNR의 활성화를 검출하기 위해 개발된 생체분석을 이용해서 평가하였다. 루시퍼라아제 리포터[cAMP 반응 요소(CRE,4X)-루시퍼라아제]와 함께 전장 인간 hAPLNR(접근 번호 NP_005152.1의 아미노산 1-380)을 안정적으로 발현하기 위해 HEK293 세포주를 전달감염시켰다. 생성 세포주, HEK293/CRE-luc/hAPLNR을 10% FBS, NEAA, 페니실린/스트렙토마이신, 및 100μg/mL 히그로마이신 B를 함유하는 DMEM 중에 유지하였다. 생체분석을 위해, HEK293/CRE-luc/hAPLNR 세포를 0.1% FBS 및 페니실린/스트렙토마이신/L-글루타민이 보강된 80μL OPTIMEM 중에 20,000세포/웰로 96-웰 분석 플레이트 상에 접종하고, 37℃, 5% CO2에서 16시간 동안 인큐베이션하였다. 다음 날, hAPLNR 활성화를 통해 폴스콜린-유도된 cAMP 생산의 저해를 측정하기 위해, 개질되지 않은 아펠린 펩티드 및 아펠린 13 융합 단백질을 연속 희석한 뒤(1:3) 분석 완충액 중 폴스콜린(Sigma, # F6886)과 혼합하고(5μM 최종 폴스콜린 농도), 세포에 첨가하였다. 37℃, 5% CO2에서 5시간 인큐베이션 후, Victor X 기구(Perkin Elmer)를 이용해서 One Glo 시약(Promega, # E6051)의 첨가 후 발광을 측정하였다. 데이터를 Prism 5 소프트웨어(GraphPad)를 이용한 4-파라미터 로지스틱 공식으로 비선형 회귀에 의해 피팅하였다.
hFc-아펠린13 융합 단백질은 174ρM의 EC50값으로 폴스콜린-자극된 HEK293/CRE-luc/hAPLNR 세포로부터의 cAMP 방출 저해를 촉진하였고, 아펠린13-hFc는 22.1nM의 EC50값으로 활성화시켰다. 상기 분석에서, 아펠린-13은 36.5ρM의 EC50값으로 활성화시켰다. (도 4 참고).
실시예 3- β-어레스틴 분석에서 Fc 융합 단백질의 역가 및 유효성
DiscoverX PathHunter® 플랫폼은 관련 리간드를 이용한 처리에 반응하는 GPCR에 대한 β-어레스틴의 모집에 기반한다. 상기 분석 형식에서, β-어레스틴은 β-갈락토시다아제(β-gal)의 N-말단 결실 돌연변이체에 융합되며 세포에서 안정적으로 발현되는 반면, GPCR은 더 작은(42개 아미노산), 약하게 상보적인 β-gal 단편에 융합된다. 상기 분석에서 GPCR의 리간드 자극은 GPCR에 대한 β-어레스틴의 모집을 일으켜서, 두 β-gal 단편의 보완을 일으키고 기질을 검출 가능한 신호로 전환하는 기능적 효소를 형성시킨다(DiscoverX Corporation, Fremont, CA, USA).
분석을 위해, CHO-K1/hAPLNR DiscoverX 세포를 분석 매질 중 웰 당 10,000세포로 접종하였고(DiscoverX Corporation; #93-0250E2) 37℃, 5% CO2에서 48시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 세포를 개질되지 않은 아펠린-13 펩티드 또는 아펠린-13 융합 단백질의 1:10 연속 희석액으로 처리하였다. 37°C에서 1.5시간 인큐베이션 후, 검출 시약을 제조업체의 사양에 따라 첨가하고 RT에서 1시간 동안 인큐베이션 후 Victor 기구(Perkin-Elmer)를 이용해서 발광을 측정하였다.
hFc-아펠린13, 아펠린-13, 및 아펠린13-hFc 단백질은 각각 992ρM, 17.6ρM, 및 44.2nM의 EC50값(외삽값)으로 용량 의존적 방식으로 CHO-K1/hAPLNR DiscoverX 세포를 활성화시켰다(도 5).
실시예 4- pERK 분석에서 Fc 융합 단백질의 역가 및 유효성
APLNR 신호전달 경로에서 본 발명의 아펠린-13 융합 단백질의 효과를 측정하기 위해, APLNR 발현 세포주로부터 인산화된 ERK1/2(pERK1/2) 및 총 ERK의 양을 정량하기 위해 분석을 이용하였다. 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주를 독시사이클린-유도성 CMV 프로모터의 제어 하에 전장 인간 APLNR(hAPLNR; 접근 번호 NP_005152.1의 아미노산 1-380)을 안정적으로 발현하도록 전달감염시켰다. 생성 세포주, CHO/hAPLNR을 10% FBS, 페니실린/스트렙토마이신, L-글루타민, 및 250ug/mL 히그로마이신 B를 함유하는 Ham F12 배지 중에 유지하였다.
분석을 위해, CHO/hAPLNR 세포를 10% FBS, L-글루타민, 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 200μL의 Ham F12 중에 10,000세포/웰의 96웰 분석 플레이트 상에 접종하고 37℃, 5% CO2에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 다음 날, APLNR의 발현을 유도하고 pERK 분석을 위한 세포를 제조하기 위해, 먼저 세포를 250μL의 1xPBS(Life Technologies; #20012-043)로 1회 세척한 뒤, 0.1% FBS, 1% BSA, L-글루타민, 페니실린/스트렙토마이신, 0.5μg/mL 독시사이클린을 함유하는 Ham F12 중에서 24시간 동안 혈청 결핍시켰다. 분석 당일에, 세포를 1% BSA, 페니실린/스트렙토마이신, L-글루타민으로 보강된 Ham F12 중 개질되지 않은 아펠린 펩티드 또는 융합 단백질의 1:10 연속 희석액으로 37℃, 5% CO2에서 15분 동안 처리하였다. 인큐베이션 말기에, 세포를 200uL의 PBS로 세척한 뒤 100uL의 ELISAone 용해 완충액(TGR BioSciences; #EBF001)으로 용해시켰다. 이어서 추출물을 제조업체의 사양(TGR Biosciences, #EKT001)에 따라 인산화된 ERK(pERK1/2) 및 총 ERK 수준에 대해 분석하였다. 이어서 형광 신호를 Spectramax 플레이트 검출기(Molecular Devices)를 이용해서 측정하였다. 측정된 pERK1/2 대 측정된 총 ERK의 비를 계산하고, 결과를 GraphPad Prism을 이용해서 분석하였다.
pERK 분석에서, hFc-아펠린13 및 아펠린13-hFc는 각각 216pM 및 33nM의 EC50값으로 CHO/hAPLNR 세포에서 pERK1/2 대 총 ERK1/2의 비를 용량 의존적 방식으로 증가시켰다(도 6).
실시예 6- Fc 융합의 혈청 안정성을 평가하기 위한 약동학 연구
C57/Bl6 마우스(군 당 n=3)에 hFc(2.5mg/kg) 또는 아펠린13-hFc(2.8mg/kg)를 피하(s.c.) 투여하고(도 7a) 1, 4, 24, 및 48시간에 혈장을 수집하였다. 별도 실험에서, hFc-아펠린13 5mg/kg을 C57/Bl6 마우스(군 당 n=3)에 s.c.로 주사하고, 0, 1, 2, 4, 5, 6, 24시간 및 2, 3, 7, 14, 21일에 혈청을 수집하였다(도 7b).
투여된 단백질의 혈청/혈장 수준을 평가하기 위해, 96-웰 ELISA 플레이트를 PBS 중 1μg/mL의 농도로 100μL/웰의 염소 항-인간 IgG 항체(Jackson ImmunoLab; 109-005-098)로 18시간 동안 4℃에서 코팅하였다. 이후 플레이트를 300μL/웰의 1X우유 희석제/차단 용액(KPL; # 100108)으로 실온(RT)에서 1시간 동안 차단하였다. 이어서 100μL 희석제 중 hFc(표준 곡선을 위해) 및 혈청 표본의 희석액을 플레이트에 첨가하였다. RT에서 2시간 동안 인큐베이션 후, 웰을 세척하고, 플레이트-결합된 인간 Fc를 RT에서 7분 동안 플레이트에 호스-래디쉬(horse-radish) 페록시다아제 콘주게이트된 항-인간 IgG 항체(Jackson ImmuLab; #109-035-098)의 첨가에 의해 검출하였다. 표본을 7분 동안 TMB 용액(MP Biomedical; # 152346)으로 발색시켜 비색 반응을 일으킨 뒤 Spectramax 플레이트 측정기(Molecular Devices) 상에서 450nm 파장으로 흡광도를 측정하기 전에 100μL/웰의 2.0N H2SO4(Mallinckrodt; # H381-05)로 중화시켰다. SoftMax 소프트웨어를 이용해서 데이터를 분석하여 혈청 중 표본 농도를 결정하였다.
아펠린13-hFc 혈청 수준은 ~4시간에 최대 10μg/mL(380nM)에 도달하였고, 48시간 후 hFc 수준에 필적하게 유지되었다(도 7a). hFc-아펠린13 혈청 수준은 24시간에 최대 3μg/mL(100nM)에 도달하였고, 14일째에 1μg/mL(38nM)으로 점차 감소되었다(도 7b).
실시예 7- CRE 분석에서 아펠린 펩티드의 역가 및 유효성
그 N-말단에 속박된 Fc를 갖는 아펠린-13(hFc-아펠린13)은 상기 실시예 2 내지 6에서 나타낸 바와 같이, 그 C-말단에 속박된 Fc를 갖는 아펠린-13(아펠린-hFc) 보다 더 우수한 역가를 나타낸다. 개질된 아펠린-13 펩티드, 예컨대 N-말단 또는 C-말단에서 결실되거나 이에 부가된 하나 이상의 아미노산(들)을 갖는 아펠린-13 펩티드를 APLNR 활성화에 대한 이들의 상대 역가에 대해 평가하였다.
개질되지 않은 아펠린-13 펩티드(Bachem, # H-4568.0001) 및 본 발명의 개질된 아펠린 펩티드에 의한 cAMP 수준의 조정을 실시예 2의 방법(상기)에 따라, hAPLNR의 활성화를 검출하기 위해 개발된 생체분석을 이용해서 평가하였다. 결과를 Prism 5 소프트웨어(GraphPad)로 비선형 회귀(4-파라미터 로지스틱)를 이용해서 분석하였다.
표 3에 나타낸 바와 같이, 아펠린-13은 여전히 전체 유효성을 보유하고 아펠린-13에 비해 상이한 정도의 감소된 역가를 나타내면서, N-말단 및 C-말단 모두로부터의 아미노산 결실을 관용할 수 있다. 또한, 아펠린-13은 그 C-말단에 대한 아미노산 잔기, 예컨대 5개 글리신 잔기의 부가를 관용할 수 있고, 여전히 전체 유효성을, 그러나 아펠린-13에 비해 감소된 역가로 보유한다. Fc-아펠린 융합 단백질의 유사한 변형은 이들의 유효성을 유지할 것으로 고려된다.
표 3: 아펠린 펩티드 및 유도체는 CRE 분석에서에 유효성을 유지함
Figure pct00003
실시예 8- CRE 분석에서 개질된 아펠린 융합 단백질의 역가 및 유효성
다양한 아펠린-Fc 융합 단백질을 hFc에 융합된 개질된 아펠린 펩티드, 예컨대 서열 목록 번호 42, 서열 목록 번호 43 및 서열 목록 번호 44를 갖는 것을 제외하고 실시예 1과 유사하게 제조하였다. 이러한 hFc-아펠린13 융합 단백질은 아펠린 펩티드 성분의 C-말단에서 추가적인 C-말단 아미노산을 갖는다. 각 펩티드의 N-말단에 속박된 hFc를 갖는 개질된 아펠린-13 펩티드(hFc-Apelin13+)에 비해 아펠린-13 펩티드에 의한 cAMP 수준의 조정을 실시예 2 및 실시예 7의 방법(상기)과 유사하게 CRE 생체분석을 이용하여 평가하였다. 결과를 Prism 5 소프트웨어(GraphPad)로 비선형 회귀(4-파라미터 로지스틱)를 이용해서 분석하였다.
표 4에 나타낸 바와 같이, 개질된 아펠린 융합 단백질(아펠린 펩티드 성분의 N-말단에 Fc 및 C-말단에 추가적인 아미노산을 가짐)은 개질되지 않은 아펠린-13과 유사한 APLNR에서의 활성을 나타낸다. C-말단에 추가적인 아르기닌을 갖는 hFc-아펠린13 융합 단백질은 60ρM의 EC50값으로 HEK293/CRE-luc/hAPLNR 세포를 활성화시켰다. C-말단에 추가적인 세린을 갖는 hFc-아펠린13 융합 단백질, 및 C-말단에 추가적인 히스티딘을 갖는 hFc-아펠린13 융합 단백질은 각각 96ρM 및 203ρM의 EC50값으로 APLNR을 활성화시켰다. 상기 분석에서, 아펠린-13은 56ρM의 EC50값으로 활성화시켰다.
표 4: 개질된 아펠린 융합 단백질은 CRE 분석에서 유효성을 유지함
Figure pct00004
실시예 9- 아펠린 Fc 융합의 심혈관 평가
본 발명의 아펠린 Fc-융합 단백질의 효과를 마취된 마우스 및 래트에서 심전도에 의해, 특히 RR 간격(심박률 지표)뿐만 아니라 이온 채널 활성의 지표로서의 QT 간격에 대한 효과로 평가한다. 　
마우스 및 래트에서 원격 측정에 의한 혈압, 심박율 및 활성에 대한 APLNR 작용제의 효과를 본 발명의 아펠린 Fc-융합 단백질에 의해 평가하였다. 　상기 방법에는 연속적 데이터 모니터링으로 동맥 혈압, 심박율 및 활성을 측정하기 위한 경동맥 내 압력 변환기의 삽입이 관여된다.
심장 기능을 또한 생체 내 APLNR 작용제에 의해 심장 수축의 변화를 결정하여 평가한다. 하나의 방법은 마우스 또는 래트에서 마이크로-초음파 또는 심장초음파 검사(ECG)의 이용이다. 　마우스 또는 래트에서 아펠린 Fc-융합 단백질의 적용 시, 좌심실 심장 기능의 변형을 좌심실 확장기말 및 수축기말 부피(EDV 및 ESV)의 측정을 이용해서 모니터링한다. 마이크로-초음파 스캔의 기록된 영상으로부터 심장 출력(CO), 박출율(EF), 일회 박출량(SV), 분획 단축(FS)을 계산하기 위해, 다른 파라미터, 예컨대 심실 지름 및 심박율을 또한 기록한다.
APNLR 작용제에 의해 유도되거나 길항제에 의해 차단되는 등방성을, 또한 랑겐도르프 또는 작동 심장 시스템을 이용하여 마우스 또는 래트로부터 단리된 심장에서 ECG에 의해 좌심실압, 및 dP/dT(경시적인 압력 변화), 심박율 및 심장 전도를 측정하여 평가한다. 　
심근 허혈/재관류: 아펠린 Fc-융합 폴리펩티드의 효과를 단리된 래트 또는 마우스 심장에서 심근 허혈/재관류(I/R) 부상 또는 저산소증/재산소화(H/R) 후, 랑겐도르프 시스템(예로, Zeng, et al. 2009, Peptides, 30(6):1144-52(2009. 2. 24.에 전자공개됨) 참고)에서와 같이 평가할 수 있다. 일시적 LAD 결찰을 재관류 전에 투여된 아펠린 Fc-융합 폴리펩티드로 수행한다. (예로 Pisarenko, et al. 2011, Bull Exp Biol Med . 152(1):79-82 참고). 심장 기능의 마이크로초음파 측정(본원에 상술됨)을 적용하여 상기 맥락에서 개선을 결정한다. 경색 크기를 표준 조직학 기법에 의해 평가한다.
사전-수축된 동맥 고리의 이완을 하기와 같이 평가한다: 마우스 또는 래트로부터 흉부 대동맥의 생체 외 제조물을 티타늄 와이어에 의해 부유시켜 변환기에 힘을 가한다. 　고리를 혈관수축제(예컨대 페닐에프린, 노르에피네프린, 또는 노르아데레날린, 엔도텔린 또는 안지오텐신 II)로 사전-수축시킨다. 힘 변환기에 의해 측정된 힘 감소 및 지름 증가는 혈관이완을 유도하는 능력을 시사한다. (참고 Iturrioz, X. et al. 2010, FASEB J, 24(5):1506-17, 2009. 12. 29.에 전자공개됨; 및 Zhong, et al., 2007, Cardiovasc Res 74(3): 388-395에서와 같은 the Multi Myograph system.)
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Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 65 70 75 80 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 100 105 <210> 21 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe 1 5 10 15 Leu Gly <210> 22 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly 1 5 10 <210> 23 <211> 104 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 1 5 10 15 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln 20 25 30 Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 35 40 45 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr 50 55 60 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 65 70 75 80 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile 85 90 95 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 100 <210> 24 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu 1 5 10 15 Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly 65 70 75 80 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 100 105 <210> 25 <211> 882 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 25 atgcacagac ctagacgtcg tggaactcgt ccacctccac tggcactgct cgctgctctc 60 ctcctggctg cacgtggtgc tgatgcaaga tctaccggta gcccgggctc cggagacaaa 120 actcacacat gcccaccgtg cccagcacct gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc 180 ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg 240 gtggtggacg tgagccacga agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg 300 gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg 360 gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag 420 gtctccaaca aagccctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 480 ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg atgagctgac caagaaccag 540 gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag 600 agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc 660 tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 720 ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gtccctctcc 780 ctgtctccgg gtaaaggtgg aggcggttca ggcggaggtg gctctggcgg tggcggatcg 840 cagaggccca ggctgagcca caagggcccc atgcccttct ga 882 <210> 26 <211> 855 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 26 atgcacagac ctagacgtcg tggaactcgt ccacctccac tggcactgct cgctgctctc 60 ctcctggctg cacgtggtgc tgatgcacag aggcccaggc tgagccacaa gggccccatg 120 cccttcggtg gaggcggttc aggcggaggt ggctctggcg gtggcggatc ggacaaaact 180 cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc 240 cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg 300 gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 360 gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc 420 agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc 480 tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 540 cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc 600 agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 660 aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 720 ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 780 tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagtc cctctccctg 840 tctccgggta aatag 855 <210> 27 <211> 768 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 27 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 60 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 120 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 180 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 240 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 300 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 360 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 420 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 480 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 540 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 600 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagtcc 660 ctctccctgt ctccgggtaa aggtggaggc ggttcaggcg gaggtggctc tggcggtggc 720 ggatcgcaga ggcccaggct gagccacaag ggccccatgc ccttctga 768 <210> 28 <211> 768 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 28 cagaggccca ggctgagcca caagggcccc atgcccttcg gtggaggcgg ttcaggcgga 60 ggtggctctg gcggtggcgg atcggacaaa actcacacat gcccaccgtg cccagcacct 120 gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg 180 atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccctgag 240 gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg 300 gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac 360 tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aagccctccc agcccccatc 420 gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc 480 ccatcccggg atgagctgac caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc 540 tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag 600 accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg 660 gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg 720 cacaaccact acacgcagaa gtccctctcc ctgtctccgg gtaaatag 768 <210> 29 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 29 Gln Arg Pro Arg Leu Ser His Lys Gly Pro Met Pro Ala 1 5 10 <210> 30 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 30 Gln Arg Pro Arg Leu Ser His Lys Gly Pro Met Pro 1 5 10 <210> 31 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 31 Gln Arg Pro Arg Leu Ser His Lys Gly Pro Met 1 5 10 <210> 32 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 32 Arg Pro Arg Leu Ser His Lys Gly Pro Met Pro Phe 1 5 10 <210> 33 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 33 Pro Arg Leu Ser His Lys Gly Pro Met Pro Phe 1 5 10 <210> 34 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 34 Arg Pro Arg Leu Ser His Lys Gly Pro Met Pro 1 5 10 <210> 35 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 35 Pro Arg Leu Ser His Lys Gly Pro Met Pro 1 5 10 <210> 36 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 36 Arg Pro Arg Leu Ser His Lys Gly Pro Met 1 5 10 <210> 37 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 37 Pro Arg Leu Ser His Lys Gly Pro Met 1 5 <210> 38 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 38 Gln Arg Pro Arg Leu Ser His Lys Gly Pro Met Pro Phe Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Gly <210> 39 <211> 256 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 39 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 225 230 235 240 Gly Ser Gln Arg Pro Arg Leu Ser His Lys Gly Pro Met Pro Phe Arg 245 250 255 <210> 40 <211> 256 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 40 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 225 230 235 240 Gly Ser Gln Arg Pro Arg Leu Ser His Lys Gly Pro Met Pro Phe Ser 245 250 255 <210> 41 <211> 256 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 41 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 225 230 235 240 Gly Ser Gln Arg Pro Arg Leu Ser His Lys Gly Pro Met Pro Phe His 245 250 255 <210> 42 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 42 Gln Arg Pro Arg Leu Ser His Lys Gly Pro Met Pro Phe Arg 1 5 10 <210> 43 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 43 Gln Arg Pro Arg Leu Ser His Lys Gly Pro Met Pro Phe Ser 1 5 10 <210> 44 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 44 Gln Arg Pro Arg Leu Ser His Lys Gly Pro Met Pro Phe His 1 5 10

Claims (132)

  1. Fc 도메인, Fc 도메인의 단편, 또는 Fc 도메인의 변이체에 융합된 아펠린 펩티드를 포함하는 폴리펩티드.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 아펠린 펩티드가 다음으로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리펩티드: 아펠린42-77(아펠린-36), 아펠린61-77(아펠린-17), 아펠린63-77(아펠린-15), 아펠린64-77(아펠린-14), 아펠린65-77(아펠린-13), 아펠린66-77(아펠린-12), 아펠린67-77(아펠린-11), 아펠린68-77(아펠린-10), 아펠린73-77(아펠린-5), 아펠린61-76(아펠린-K16P), 아펠린61-75(아펠린-K15M), 아펠린61-74(아펠린-K14P), 아펠린-F13A, 아펠린65-76, 아펠린65-75, 아펠린66-76, 아펠린67-76, 아펠린66-75, 아펠린 67-75, 및 [Pyr1]아펠린-13, 또는 이들의 단편 또는 유도체.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 아펠린 펩티드가 아펠린-13, 또는 이들의 단편 또는 유도체인 폴리펩티드.
  4. 청구항 2에 있어서, 상기 아펠린 펩티드 유도체가 서열 목록 번호 42, 서열 목록 번호 43 및 서열 목록 번호 44로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
  5. 청구항 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 상기 아펠린 펩티드가 하나 이상의 펩티드 링커들을 통해 상기 Fc 도메인, 또는 이들의 단편에 융합되는 폴리펩티드.
  6. 청구항 4에 있어서, 상기 아펠린 펩티드가 하나 이상의 Gly-Ser 링커들을 통해 상기 Fc 도메인, 또는 이들의 단편에 융합되는 폴리펩티드.
  7. 청구항 5에 있어서, 상기 아펠린 펩티드가 하나 이상의 Gly-Ser 링커들을 통해 상기 Fc 도메인의 C-말단, 또는 이들의 단편에 융합되는 폴리펩티드.
  8. 청구항 5에 있어서, 상기 아펠린 펩티드가 하나 이상의 Gly-Ser 링커들을 통해 상기 Fc 도메인의 N-말단, 또는 이들의 단편에 융합되는 폴리펩티드.
  9. 청구항 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 상기 Fc 도메인이 IgG1 CH2 도메인 및 IgG1 CH3 도메인; IgG4 CH2 도메인 및 IgG4 CH3 도메인; IgG1 CH2 도메인 및 IgG4 CH3 도메인; 및 IgG4 CH2 도메인 및 IgG1 CH3 도메인으로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리펩티드.
  10. 청구항 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 상기 Fc 도메인이 IgG 힌지 도메인, 또는 이들의 단편 또는 변이체를 포함하는 폴리펩티드.
  11. 청구항 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 상기 Fc 도메인이 서열 목록 번호 14, 서열 목록 번호 17, 서열 목록 번호 18, 서열 목록 번호 21, 또는 서열 목록 번호 22를 포함하는 IgG 힌지 도메인을 포함하는 폴리펩티드.
  12. 청구항 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리펩티드가 제2 폴리펩티드와 적어도 하나의 디설피드 결합을 형성하는 폴리펩티드.
  13. 청구항 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리펩티드가 이량체를 형성할 수 있는 단량체성 융합 폴리펩티드인 폴리펩티드.
  14. 청구항 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리펩티드가 서열 목록 번호 2를 포함하는 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드.
  15. 청구항 13에 있어서, 서열 목록 번호 2를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
  16. 청구항 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리펩티드가 서열 목록 번호 4를 포함하는 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드.
  17. 청구항 15에 있어서, 서열 목록 번호 4를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
  18. 청구항 1 내지 16 중 어느 하나의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산.
  19. 청구항 1 내지 16 중 어느 하나의 폴리펩티드를 포함하는 단백질.
  20. 하기를 포함하는 아펠린 수용체(APNLR) 결합 분자:
    a. 아펠린 펩티드 성분,
    b. 인간 IgG Fc 도메인, 및
    c. 적어도 하나의 링커 성분.
  21. 청구항 20에 있어서, 상기 아펠린 펩티드가 다음으로 구성된 군으로부터 선택되는 수용체 결합 분자: 아펠린42-77(아펠린-36), 아펠린61-77(아펠린-17), 아펠린63-77(아펠린-15), 아펠린64-77(아펠린-14), 아펠린65-77(아펠린-13), 아펠린66-77(아펠린-12), 아펠린67-77(아펠린-11), 아펠린68-77(아펠린-10), 아펠린73-77(아펠린-5), 아펠린61-76(아펠린-K16P), 아펠린61-75(아펠린-K15M), 아펠린61-74(아펠린-K14P), 아펠린-F13A, 아펠린65-76, 아펠린65-75, 아펠린66-76, 아펠린67-76, 아펠린66-75, 아펠린 67-75, 및 [Pyr1]아펠린-13, 또는 이들의 단편 또는 유도체.
  22. 청구항 20 또는 21에 있어서, 상기 아펠린 펩티드가 아펠린-13(서열 목록 번호 6), 또는 이들의 단편 또는 유도체인 수용체 결합 분자.
  23. 청구항 21에 있어서, 상기 아펠린 펩티드 유도체가 서열 목록 번호 42, 서열 목록 번호 43 및 서열 목록 번호 44로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 수용체 결합 분자.
  24. 청구항 20 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 상기 Fc 도메인이 다음으로 구성된 군으로부터 선택되는 수용체 결합 분자: IgG1 CH2 도메인 및 IgG1 CH3 도메인; IgG4 CH2 도메인 및 IgG4 CH3 도메인; IgG1 CH2 도메인 및 IgG4 CH3 도메인; 및 IgG4 CH2 도메인 및 IgG1 CH3 도메인; 또는 이들의 단편 또는 변이체.
  25. 청구항 20 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 상기 Fc 도메인이 IgG 힌지 도메인, 또는 이들의 단편 또는 변이체를 포함하는 수용체 결합 분자.
  26. 청구항 20 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 상기 Fc 도메인이 서열 목록 번호 14, 서열 목록 번호 17, 서열 목록 번호 18, 서열 목록 번호 21, 및 서열 목록 번호 22로 구성된 군으로부터 선택되는 IgG 힌지 도메인을 포함하는 수용체 결합 분자.
  27. 청구항 20 내지 27 중 어느 하나에 있어서, 상기 수용체 결합 분자가 약 50nM 미만, 또는 약 25nM 미만, 또는 약 10nM 미만, 또는 약 1nM 미만의 EC50을 나타내는 APLNR 작용제인 수용체 결합 분자.
  28. 청구항 20 내지 27 중 어느 하나에 있어서, 상기 수용체 결합 분자가 적어도 약 1시간, 또는 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10시간의 생체 내 반감기를 갖는 수용체 결합 분자.
  29. 청구항 20 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 상기 아펠린 펩티드가 상기 Fc 도메인의 C-말단에 융합되는 수용체 결합 분자.
  30. 청구항 29에 있어서, 서열 목록 번호 2를 포함하는 아미노산 서열과 95% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 수용체 결합 분자.
  31. 청구항 30에 있어서, 서열 목록 번호 2를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 수용체 결합 분자.
  32. 청구항 29에 있어서, 서열 목록 번호 39를 포함하는 아미노산 서열과 95% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 수용체 결합 분자.
  33. 청구항 32에 있어서, 서열 목록 번호 39를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 수용체 결합 분자.
  34. 청구항 29에 있어서, 서열 목록 번호 40을 포함하는 아미노산 서열과 95% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 수용체 결합 분자.
  35. 청구항 34에 있어서, 서열 목록 번호 40을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 수용체 결합 분자.
  36. 청구항 29에 있어서, 서열 목록 번호 41을 포함하는 아미노산 서열과 95% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 수용체 결합 분자.
  37. 청구항 36에 있어서, 서열 목록 번호 41을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 수용체 결합 분자.
  38. 청구항 20 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 상기 아펠린 펩티드가 상기 Fc 도메인의 N-말단에 융합되는 수용체 결합 분자.
  39. 청구항 38에 있어서, 서열 목록 번호 4를 포함하는 아미노산 서열과 95% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 수용체 결합 분자.
  40. 청구항 39에 있어서, 서열 목록 번호 4를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 수용체 결합 분자.
  41. 청구항 20 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 상기 아펠린 펩티드가 하나 이상의 Gly-Ser 링커들을 통해 상기 Fc 도메인의 C-말단 또는 상기 Fc 도메인의 N-말단에 융합되는 수용체 결합 분자.
  42. 청구항 20 내지 41 중 어느 하나의 수용체 결합 분자를 포함하는 조성물.
  43. 청구항 20 내지 41 중 어느 하나의 아펠린 수용체 결합 분자를 인코딩하는 핵산 분자.
  44. 청구항 43에 있어서, 신호 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 연결되는 핵산 분자.
  45. 청구항 44에 있어서, 서열 목록 번호 25 및 서열 목록 번호 26으로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자.
  46. 청구항 43 내지 45 중 어느 하나의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  47. 청구항 46에 있어서, 상기 핵산 분자가 숙주 세포에서의 발현에 적합한 발현 제어 서열에 작동 가능하게 연결되는 벡터.
  48. 청구항 47에 있어서, 상기 발현 제어 서열이 SV40, CMV, CMV-IE, CMV-MIE, UbC, RSV, SL3-3, MMTV, Ubi 및 HIV LTR로 구성된 군으로부터 선택되는 프로모터를 포함하는 벡터.
  49. 청구항 46 또는 47에 있어서, 상기 발현 제어 서열이 CMV-MIE 프로모터에 의해 유도되는 TetR-ERLBDT2 융합 유전자, SV40 프로모터에 의해 유도되는 블라스티시딘 내성 유전자, 및 CMV-MIE 프로모터에 의해 유도되는 Arc-ERLBDT2 융합 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 발현 카세트를 포함하는 벡터.
  50. 청구항 48 또는 49에 있어서, 상기 프로모터가 CMV-MIE/TetO 또는 CMV-MIE/Arc 하이브리드 프로모터인 벡터.
  51. 청구항 46 내지 50 중 어느 하나에 있어서, bla, bls, BSD, bsr, Sh ble, hpt, tetR, tetM, npt, kanR 및 pac으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 선택 가능한 마커 유전자를 포함하는 벡터.
  52. 청구항 43 내지 45 중 어느 하나의 핵산 분자를 포함하는 세포.
  53. 청구항 52에 있어서, 청구항 46 내지 51 중 어느 하나의 벡터를 포함하는 세포.
  54. 청구항 52 또는 53에 있어서, 상기 핵산이 상기 세포의 게놈 내로 통합되는 세포.
  55. 청구항 52 내지 54 중 어느 하나에 있어서, 단백질 발현 인핸서를 인코딩하는 핵산을 포함하는 세포.
  56. 청구항 52 내지 56 중 어느 하나에 있어서, XBP 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 세포.
  57. 청구항 52 내지 56 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포가 진핵생물 세포인 세포.
  58. 청구항 52 내지 57 중 어느 하나에 있어서, 상기 숙주 세포가 CHO, COS, 망막 세포, Vero, CV1, 293, MDCK, HaK, BHK, HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo25, HB 8065, HL-60, Jurkat, Daudi, A431(표피), CV-1, U937, 3T3, L 세포, C127 세포, SP2/0, NS-0, MMT 세포, 종양 세포, 상기 언급된 임의 세포에서 유래되는 세포주, 및 PER.C6® 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 세포.
  59. 청구항 52 내지 58 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포가 동물 세포인 세포.
  60. 청구항 52 내지 59 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포가 포유류 세포인 세포.
  61. 청구항 52 내지 60 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포가 CHO 세포인 세포.
  62. 청구항 52 내지 61 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포가 CHO-K1 세포인 세포.
  63. 하기를 포함하는, APLN 수용체(APLNR)의 활성화 결정 방법:
    a. APLNR의 활성화를 허용하는 조건 하에, APLNR을 발현하는 세포들을 평가 분자와 접촉시키는 단계,
    b. APLNR 활성을 측정하는 단계,
    c. 단계 (a)에서와 동일한 조건들 하에 APLNR을 발현하는 세포들을 아펠린 Fc-융합 단백질과 별도로 접촉시키는 단계, 및
    d. 단계 (b)에서와 동일한 방식으로 단계 (c)의 세포들의 APLNR활성을 측정하는 단계 (여기서 단계 (d)의 APLNR 활성의 측정과 대비하여 단계 (b)에서의 APLNR 활성의 상기 측정은 상기 평가 분자가 상기 APLNR을 활성화시킴을 결정함).
  64. 청구항 63에 있어서, 단계 (d)와 대비하여 단계 (b)에서의 APLNR 활성의 더 높은 측정은 상기 평가 분자가 APLNR 작용제임을 시사하는 방법.
  65. 청구항 64에 있어서, 단계 (b)에서의 상기 활성의 더 높은 측정이 약 50nM 미만의 EC50인 방법.
  66. 청구항 65에 있어서, 단계 (b)에서의 상기 활성의 더 높은 측정이 약 1nM 미만의 EC50인 방법.
  67. 청구항 63에 있어서, 단계 (a)가 세포들을 상기 평가 분자 및 상기 아펠린 Fc-융합 단백질과 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 단계 (d)와 대비하여 단계 (b)에서의 APLNR 활성의 더 낮은 측정은 상기 평가 분자가 APLNR 길항제임을 시사하는 방법.
  68. 재조합 폴리펩티드에 있어서, 상기 폴리펩티드가 N'-P1m-X1n-X2-X3-P2-A1-C'을 포함하는 재조합 폴리펩티드:
    여기서
    (a) N'은 상기 폴리펩티드의 N-말단이고 C'은 상기 폴리펩티드의 C-말단이며,
    (b) P1은 펩티드 링커이고,
    (c) X1은 IgG 힌지 도메인, 또는 이들의 단편 또는 변이체를 포함하고,
    (d) X2는 IgG CH2 도메인, 또는 이들의 단편 또는 변이체를 포함하고,
    (e) X3은 IgG CH3 도메인, 또는 이들의 단편 또는 변이체를 포함하고,
    (f) P2는 펩티드 링커이고, 그리고
    (g) A1은 인간 아펠린 펩티드 또는 이들의 단편 또는 유도체를 포함하는 아미노산 서열이며,
    식 중에서, m = 0 또는 1이고, n = 0 또는 1이다.
  69. 재조합 폴리펩티드에 있어서, 상기 폴리펩티드가 N'-A1-P2-X1n-X2-X3-C'을 포함하는 재조합 폴리펩티드:
    여기서
    (a) N'은 상기 폴리펩티드의 N-말단이고 C'은 C-말단이며,
    (b) A1은 인간 아펠린 펩티드 또는 이들의 단편 또는 유도체를 포함하는 아미노산 서열이고,
    (c) P2는 펩티드 링커이고,
    (d) X1은 IgG 힌지 도메인, 또는 이들의 단편 또는 변이체를 포함하고,
    (e) X2는 IgG CH2 도메인, 또는 이들의 단편 또는 변이체를 포함하고, 그리고
    (f) X3은 IgG CH3 도메인 또는 이들의 단편 또는 변이체를 포함하며,
    식 중에서, n = 0 또는 1이다.
  70. 청구항 68에 있어서, m = 0인 재조합 폴리펩티드.
  71. 청구항 68에 있어서, m=1이고 P1이 RSTGSPGSG(서열 목록 번호 12)를 포함하는 재조합 폴리펩티드.
  72. 청구항 68 또는 69에 있어서, P2가 하나 이상의 GlySer 링커들을 포함하는 재조합 폴리펩티드.
  73. 청구항 72에 있어서, 상기 GlySer 링커가 서열 목록 번호 11을 포함하는 재조합 폴리펩티드.
  74. 청구항 72 또는 73에 있어서, A1이 다음으로 구성된 군으로부터 선택되는 재조합 폴리펩티드: 아펠린42-77(아펠린-36), 아펠린61-77(아펠린-17), 아펠린63-77(아펠린-15), 아펠린64-77(아펠린-14), 아펠린65-77(아펠린-13), 아펠린66-77(아펠린-12), 아펠린67-77(아펠린-11), 아펠린68-77(아펠린-10), 아펠린73-77(아펠린-5), 아펠린61-76(아펠린-K16P), 아펠린61-75(아펠린-K15M), 아펠린61-74(아펠린-K14P), 아펠린-F13A, 아펠린65-76, 아펠린65-75, 아펠린66-76, 아펠린67-76, 아펠린66-75, 아펠린 67-75, 및 [Pyr1]아펠린-13, 또는 이들의 단편 또는 유도체.
  75. 청구항 68 내지 74 중 어느 하나에 있어서, X1이 인간 IgG 중쇄 힌지 도메인의 단편을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 재조합 폴리펩티드.
  76. 청구항 68 내지 75 중 어느 하나에 있어서, X1이 서열 목록 번호 14, 서열 목록 번호 17, 서열 목록 번호 18, 서열 목록 번호 21 및 서열 목록 번호 22로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 재조합 폴리펩티드.
  77. 청구항 68 내지 76 중 어느 하나에 있어서, X2가 위치 238 내지 340(EU 번호지정)의 인간 IgG1 CH2 도메인 또는 인간 IgG4 CH2 도메인을 포함하는 재조합 폴리펩티드.
  78. 청구항 68 내지 77 중 어느 하나에 있어서, X3이 위치 341 내지 447(EU 번호지정)의 인간 IgG1 CH3 도메인 또는 인간 IgG4 CH3 도메인을 포함하는 재조합 폴리펩티드.
  79. 청구항 68 내지 78 중 어느 하나에 있어서, X2가 서열 목록 번호 15 또는 서열 목록 번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 재조합 폴리펩티드.
  80. 청구항 68 내지 79 중 어느 하나에 있어서, X3이 서열 목록 번호 16 또는 서열 목록 번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 재조합 폴리펩티드.
  81. 청구항 68에 있어서, 상기 폴리펩티드가 서열 목록 번호 2, 서열 목록 번호 39, 서열 목록 번호 40, 및 서열 목록 번호 41로 구성된 군으로부터 선택되는 상기 폴리펩티드와 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 재조합 폴리펩티드.
  82. 청구항 69에 있어서, 상기 폴리펩티드가 서열 목록 번호 4의 아미노산 서열과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 재조합 폴리펩티드.
  83. 청구항 68 내지 82 중 어느 하나의 재조합 폴리펩티드를 포함하는 조성물.
  84. 청구항 68 내지 82 중 어느 하나의 재조합 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자.
  85. 청구항 84에 있어서, 서열 목록 번호 2 또는 서열 목록 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 재조합 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자.
  86. 청구항 84 또는 85에 있어서, 서열 목록 번호 27 또는 서열 목록 번호 28의 뉴클레오티드 서열과 99%를 초과하는 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자.
  87. 청구항 84 내지 86 중 어느 하나에 있어서, 이량체를 형성할 수 있는 단량체성 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자.
  88. 청구항 84 내지 87 중 어느 하나에 있어서, 상기 핵산 분자가 신호 펩티드를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 분자.
  89. 청구항 88에 있어서, 상기 재조합 폴리펩티드가 상기 폴리펩티드를 분비할 수 있는 숙주 세포에서 발현되는 핵산 분자.
  90. 청구항 84 내지 89 중 어느 하나에 있어서, 서열 목록 번호 25 또는 서열 목록 번호 26의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자.
  91. 청구항 84 내지 90 중 어느 하나의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  92. 청구항 91에 있어서, 상기 핵산 분자가 숙주 세포에서 발현에 적합한 발현 제어 서열에 작동 가능하게 연결되는 벡터.
  93. 청구항 92에 있어서, 상기 발현 제어 서열이 SV40, CMV, CMV-IE, CMV-MIE, UbC, RSV, SL3-3, MMTV, Ubi 및 HIV LTR로 구성된 군으로부터 선택되는 프로모터를 포함하는 벡터.
  94. 청구항 93에 있어서, 상기 발현 제어 서열이 CMV-MIE 프로모터에 의해 유도되는 TetR-ERLBDT2 융합 유전자, SV40 프로모터에 의해 유도되는 블라스티시딘 내성 유전자, 및 CMV-MIE 프로모터에 의해 유도되는 Arc-ERLBDT2 융합 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 발현 카세트를 포함하는 벡터.
  95. 청구항 92 또는 93에 있어서, 상기 프로모터가 CMV-MIE/TetO 또는 CMV-MIE/Arc 하이브리드 프로모터인 벡터.
  96. 청구항 91 내지 95 중 어느 하나에 있어서, bla, bls, BSD, bsr, Sh ble, hpt, tetR, tetM, npt, kanR 및 pac으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 선택 가능한 마커 유전자를 포함하는 벡터.
  97. 청구항 84 내지 90 중 어느 하나의 핵산 분자를 포함하는 세포.
  98. 청구항 97에 있어서, 청구항 91 내지 96 중 어느 하나의 벡터를 포함하는 세포.
  99. 청구항 97 또는 98에 있어서, 상기 핵산이 상기 세포의 게놈 내로 통합되는 세포.
  100. 청구항 97 내지 99 중 어느 하나에 있어서, 단백질 발현 인핸서를 인코딩하는 핵산을 포함하는 세포.
  101. 청구항 97 내지 100 중 어느 하나에 있어서, XBP 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 세포.
  102. 청구항 97 내지 102 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포가 진핵생물 세포인 세포.
  103. 청구항 97 내지 102 중 어느 하나에 있어서, 상기 숙주 세포가 다음으로 구성된 군으로부터 선택되는 세포: CHO, COS, 망막 세포, Vero, CV1, 293, MDCK, HaK, BHK, HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo25, HB 8065, HL-60, Jurkat, Daudi, A431(표피), CV-1, U937, 3T3, L 세포, C127 세포, SP2/0, NS-0, MMT 세포, 종양 세포, 상기 언급된 임의 세포에서 유래되는 세포주, 및 PER.C6® 세포.
  104. 청구항 97 내지 103 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포가 동물 세포인 세포.
  105. 청구항 97 내지 104 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포가 포유류 세포인 세포.
  106. 청구항 97 내지 105 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포가 CHO 세포인 세포.
  107. 청구항 97 내지 106 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포가 CHO-K1 세포인 세포.
  108. 청구항 97 내지 107 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 폴리펩티드가 분비될 수 있는 세포.
  109. 하기를 포함하는, 아펠린 펩티드를 포함하는 단리된 융합 단백질의 제조 방법:
    a. 숙주 세포를 상기 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자로 전달감염시키는 단계로서, 상기 핵산 분자는
    i) 상기 아펠린 펩티드의 N-말단에서 아펠린 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 연결된 인간 IgG의 Fc 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이거나,
    ii) 상기 Fc 도메인의 N-말단에서 인간 IgG의 Fc 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 연결된 아펠린 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열
    에 융합된 신호 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단계, 및
    b. 상기 숙주 세포에서 (a)의 상기 핵산 분자를 발현함으로써 상기 융합 단백질을 제조하는 단계.
  110. 청구항 109에 있어서, 상기 신호 펩티드가 서열 목록 번호 9를 포함하는 방법.
  111. 청구항 109 또는 110에 있어서, 상기 융합 단백질이 선택적으로 상기 신호 펩티드의 C-말단에 융합된 펩티드 링커를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 방법.
  112. 청구항 109 내지 111 중 어느 하나에 있어서, 단계 (b)의 상기 숙주 세포를 배양하고(상기 숙주 세포는 상기 융합 단백질을 세포 배양 배지 내로 분비함); 그리고 상기 융합 단백질을 상기 세포 배양 배지로부터 단리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  113. 청구항 109 내지 112 중 어느 하나에 있어서, 상기 단리된 융합 단백질이 서열 목록 번호 2, 서열 목록 번호 4, 서열 목록 번호 39, 서열 목록 번호 40, 및 서열 목록 번호 41로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 방법.
  114. 청구항 109 내지 113 중 어느 하나에 있어서, 상기 융합 단백질이 이량체를 형성할 수 있는 단량체성 융합 폴리펩티드를 포함하는 방법.
  115. 청구항 109 내지 114 중 어느 하나에 있어서, 상기 숙주 세포가 다음으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법: CHO, COS, 망막 세포, Vero, CV1, 293, MDCK, HaK, BHK, HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo25, HB 8065, HL-60, Jurkat, Daudi, A431(표피), CV-1, U937, 3T3, L 세포, C127 세포, SP2/0, NS-0, MMT 세포, 종양 세포, 상기 언급된 임의 세포로부터 유래되는 세포주, 및 PER.C6® 세포.
  116. 아펠린에 관련된 질환 또는 상태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 아펠린에 관련된 질환 또는 상태의 치료 방법으로서, 청구항 1의 상기 폴리펩티드의 치료 유효량을 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  117. 청구항 116에 있어서, 상기 질환 또는 상태가 심혈관 질환, 급성 대사장애 심부전, 울혈성 심부전, 심근경색, 심근병증, 허혈, 허혈/재관류 부상, 폐 고혈압, 당뇨병, 비만, 암, 전이성 질환, 체액 항상성, 전신 열감 증후군, 병리적 혈관신생, 망막병증, 섬유화 및 HIV 감염으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  118. 청구항 1 내지 117 중 어느 하나의 적어도 하나의 아펠린 융합 단백질 또는 폴리펩티드로 충전된 하나 이상의 용기를 포함하는 키트.
  119. 다량체화 성분에 융합된 아펠린 펩티드를 포함하는 폴리펩티드.
  120. 청구항 119에 있어서, 상기 다량체화 성분이 류신 지퍼, 나선-루프 모티프, 감긴-코일 모티프, Fc 도메인, Fc 도메인의 단편, 또는 Fc 도메인의 변이체를 포함하는 폴리펩티드.
  121. 청구항 119 또는 120에 있어서, 상기 아펠린 펩티드가 다음으로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리펩티드: 아펠린42-77(아펠린-36), 아펠린61-77(아펠린-17), 아펠린63-77(아펠린-15), 아펠린64-77(아펠린-14), 아펠린65-77(아펠린-13), 아펠린66-77(아펠린-12), 아펠린67-77(아펠린-11), 아펠린68-77(아펠린-10), 아펠린73-77(아펠린-5), 아펠린61-76(아펠린-K16P), 아펠린61-75(아펠린-K15M), 아펠린61-74(아펠린-K14P), 아펠린-F13A, 아펠린65-76, 아펠린65-75, 아펠린66-76, 아펠린67-76, 아펠린66-75, 아펠린 67-75, 및 [Pyr1]아펠린-13, 또는 이들의 단편 또는 유도체.
  122. 청구항 119 내지 121 중 어느 하나에 있어서, 상기 아펠린 펩티드가 아펠린-13인 폴리펩티드.
  123. 청구항 119 내지 122 중 어느 하나에 있어서, 상기 아펠린 펩티드가 하나 이상의 펩티드 링커들을 통해 다량체화 도메인에 융합되는 폴리펩티드.
  124. 청구항 123에 있어서, 상기 다량체화 도메인이 Fc 도메인, 또는 이들의 단편이고, 그리고 상기 아펠린 펩티드가 하나 이상의 Gly-Ser 링커들을 통해 Fc 도메인 또는 Fc 도메인 단편에 융합되는 폴리펩티드.
  125. 청구항 124에 있어서, 상기 아펠린 펩티드가 하나 이상의 Gly-Ser 링커들을 통해 상기 Fc 도메인의 C-말단, 또는 이들의 단편에 융합되는 폴리펩티드.
  126. 청구항 125에 있어서, 상기 아펠린 펩티드가 하나 이상의 Gly-Ser 링커들을 통해 상기 Fc 도메인의 N-말단, 또는 이들의 단편에 융합되는 폴리펩티드.
  127. 청구항 119 내지 126 중 어느 하나에 있어서, 상기 다량체화 도메인이 다음으로 구성된 군으로부터 선택되는 Fc 도메인인 폴리펩티드: IgG1 CH2 도메인 및 IgG1 CH3 도메인; IgG4 CH2 도메인 및 IgG4 CH3 도메인; IgG1 CH2 도메인 및 IgG4 CH3 도메인; 및 IgG4 CH2 도메인 및 IgG1 CH3 도메인.
  128. 청구항 119 내지 127 중 어느 하나에 있어서, 상기 Fc 도메인이 IgG 힌지 도메인, 또는 이들의 단편 또는 변이체를 포함하는 폴리펩티드.
  129. 청구항 128에 있어서, 상기 Fc 도메인이 서열 목록 번호 14, 서열 목록 번호 17, 서열 목록 번호 18, 서열 목록 번호 21, 또는 서열 목록 번호 22를 포함하는 IgG 힌지 도메인을 포함하는 폴리펩티드.
  130. 청구항 119 내지 129 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리펩티드가 제2 폴리펩티드와 적어도 하나의 디설피드 결합을 형성하는 폴리펩티드.
  131. 청구항 119 내지 130 중 어느 하나의 상기 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산.
  132. 청구항 119 내지 131 중 어느 하나의 상기 폴리펩티드를 포함하는 다량체화 단백질.
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