JP2022530216A - 免疫グロブリンのＦｃ領域およびＧＤＦ１５を含む融合ポリペプチド - Google Patents
免疫グロブリンのＦｃ領域およびＧＤＦ１５を含む融合ポリペプチド Download PDFInfo
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Abstract
ＧＤＦ１５（Ｇｒｏｗｔｈ／ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ １５）および免疫グロブリンのＦｃ領域を含む融合ポリペプチド、前記融合ポリペプチドを含む薬学的組成物、および免疫グロブリンのＦｃ領域を融合させる段階を含むＧＤＦ１５の生体持続期間を増加させる方法に関する。
Description
ＧＤＦ１５（Ｇｒｏｗｔｈ／ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ １５）および免疫グロブリンのＦｃ領域を含む融合ポリペプチド、前記融合ポリペプチドを含む薬学的組成物、ならびに免疫グロブリンのＦｃ領域を融合させる段階を含むＧＤＦ１５の生体持続期間を増加させる方法に関する。
ほとんどのタンパク質またはペプチド薬物は体内で活性が維持される期間が短く、静脈内投与以外の方法で投与する場合には吸収率が低いため、長期間薬物を投与する治療が必要な場合にはこれらの薬物を繰り返し短い投与間隔で継続して注射しなければならないという不都合がある。このような不都合を解消するため、１回投与で薬物を持続的に放出させる技術の開発が要求される。このような要求に応じるための一環として、持続的放出のための徐放性剤形が開発されている。
例えば、タンパク質またはペプチド薬物を、生分解性高分子マトリックスで囲まれた形態の微細な粒子に製造して、投与時にマトリックス物質が体内で徐々に分解され除去されながら徐々に薬物を放出する徐放性剤形に対する研究が活発に進められている。
一方、ＧＤＦ１５（Ｇｒｏｗｔｈ／ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ １５）は、ＴＧＦ－βファミリーの一員であり、２５ｋＤａの同種二量体であり、血中で循環する分泌タンパク質である。ＧＤＦ１５の血中レベルはＢＭＩ（体格指数）と関連しており、ＧＤＦ１５がエネルギー恒常性の長期調節因子（ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）としての役割を果たす。ＧＤＦ１５はまた、心血管疾患、心筋肥大、虚血性損傷などの病的状態に対して保護する作用をする。また、ＧＤＦ１５は、１型糖尿病および２型糖尿病モデルで細尿管および間質性損傷からの保護的役割を果たす。また、ＧＤＦ１５は、年齢－関連感覚および運動神経損失に対し保護効果を有し、末梢神経損傷からの回復に寄与する。また、ＧＤＦ１５は、体重減少および体脂肪減少ならびにグルコース耐性の効果を有し、全身のエネルギー消費および酸化的代謝を増加させる効果を有する。ＧＤＦ１５は、体重－依存的および非依存的な機序により血糖値の調節効果を示す。
このような多様な薬理的効果を示すＧＤＦ１５タンパク質の体内持続性を改善するための技術の開発が要求される。
本明細書において、ＧＤＦ１５（Ｇｒｏｗｔｈ／ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ １５）またはその機能的変異体を免疫グロブリンのＦｃ領域と連結させて融合ポリペプチドを形成することによって、Ｆｃ領域と融合しない場合に比べて、ＧＤＦ１５の体内半減期が増加して体内の持続期間を増進させ、これによりＧＤＦ１５の薬理効果を増進させるか、および／または投与間隔を増加させる技術が提供される。
一実施形態は、ＧＤＦ１５またはその機能的変異体と免疫グロブリンのＦｃ領域を含む融合ポリペプチドを提供する。
前記融合ポリペプチドにおいて、前記免疫グロブリンのＦｃ領域は、前記ＧＤＦ１５またはその機能的変異体のＮ－末端に含む（連結する）ことができる。例えば、前記融合ポリペプチドは、Ｎ－末端からＣ－末端方向に（１）免疫グロブリンのＦｃ領域および（２）ＧＤＦ１５またはその機能的変異体を含む。
前記融合ポリペプチドに含まれている免疫グロブリンのＦｃ領域は、ＧＤＦ１５またはその変異体の安定性を増進させる役割を果たすものであり、例えば、半減期（ｅ．ｇ．，体内半減期）を延長させる効果を有する。一例として、前記免疫グロブリンのＦｃ領域は、ＩｇＧ１のＦｃ領域およびＩｇＧ４のＦｃ領域からなる群より選択される。前記ＩｇＧ１のＦｃ領域は、ＩｇＧ１のＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはＣＨ２＋ＣＨ３ドメインを含み、Ｎ－末端にＩｇＧ１のヒンジ領域を含むか、または含まない。ＩｇＧ４のＦｃ領域は、ＩｇＧ４のＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはＣＨ２＋ＣＨ３ドメインを含み、Ｎ－末端にＩｇＧ４のヒンジ領域を含むか、または含まない。
前記融合ポリペプチドは、免疫グロブリンのＦｃ領域とＧＤＦ１５またはその機能的変異体間にペプチドリンカーをさらに含み得る。一例として、前記ペプチドリンカーは、両側に融合したＦｃ領域とＧＤＦ１５がそれぞれ自由に機能を発揮するためには、フレキシブルリンカー（ｆｌｅｘｉｂｌｅ ｌｉｎｋｅｒ）であることが好ましい。一例として、前記ペプチドリンカーは、剛性リンカー（ｒｉｇｉｄ ｌｉｎｋｅｒ）ではない。例えば、前記ペプチドリンカーは、１つ以上のＧｌｙ（Ｇ）と１つ以上のＳｅｒ（Ｓ）を繰り返し含むＧＳリンカーであり、例えば、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ｎは、ＧＧＧＧＳ（配列番号１３）の反復回数であって、１～１０の整数または１～５の整数（１、２、３、４、または５）である）であり得るが、これらに限定されるものではない。
前記融合ポリペプチドにおいて、免疫グロブリンのＦｃ領域と融合したＧＤＦ１５またはその機能的変異体は、免疫グロブリンのＦｃ領域が融合されないＧＤＦ１５またはその機能的変異体に比べて、体内（または血中）安定性（持続期間）が増加することを特徴とする（例えば、体内または血中半減期の増加）。また、前記免疫グロブリンのＦｃ領域と融合したＧＤＦ１５またはその機能的変異体は、免疫グロブリンのＦｃ領域が融合されないＧＤＦ１５またはその機能的変異体に比べて、薬理効果（例えば、体重減少効果）が改善されることを特徴とする。
本発明は、前記融合ポリペプチドを２つ含む融合ポリペプチド二量体を提供する。前記融合ポリペプチド二量体は、前記２個の融合ポリペプチドのＧＤＦ１５またはその機能的変異体間連結（結合）されたものであり得る。
本発明は、前記融合ポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。
本発明は、前記核酸分子を含む組換えベクターを提供する。
本発明は、前記組換えベクターを含む組換え細胞を提供する。
本発明は、前記融合ポリペプチド、融合ポリペプチド二量体、融合ポリペプチドコード核酸分子、前記核酸分子を含む組換えベクター、および前記組換えベクターを含む組換え細胞からなる群より選択される１つ以上を含む、体重減少、食餌調節（食事量の減少）、または代謝性疾患の予防、改善、軽減、および／または治療用組成物（薬学組成物または健康機能性食品組成物）を提供する。また、本発明は、前記融合ポリペプチド、融合ポリペプチド二量体、融合ポリペプチドコード核酸分子、前記核酸分子を含む組換えベクター、および前記組換えベクターを含む組換え細胞からなる群より選択される１つ以上の薬学的有効量を代謝性疾患の予防、改善、軽減、および／または治療を必要とする対象に投与する段階を含む、体重減少方法、食餌調節（食事量の減少）方法、または代謝性疾患の予防、改善、軽減、および／または治療方法を提供する。前記代謝性疾患は、代謝障害によって誘発される全ての病気を意味し、肥満、糖尿病（例えば、２型糖尿病）、非アルコール性脂肪肝疾患（例えば、非アルコール性脂肪肝炎（Ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ；ＮＡＳＨ）など）などからなる群より選択される。
本発明は、前記組換えベクターを細胞で発現させる段階を含む、体内（または血中）半減期が増加したＧＤＦ１５またはその機能的変異体の製造方法、または前記体内（または血中）半減期が増加したＧＤＦ１５またはその機能的変異体を含む融合ポリペプチドまたは融合ポリペプチドを含む同種二量体の製造方法を提供する。
本発明は、ＧＤＦ１５またはその機能的変異体と免疫グロブリンのＦｃ領域を融合（または連結または結合）させる段階を含む、ＧＤＦ１５またはその機能的変異体の生体持続期間を増加させる方法を提供する。一実施形態において、前記融合させる段階は、ＧＤＦ１５またはその機能的変異体のＮ末端に免疫グロブリンのＦｃ領域をリンカーによるか、またはリンカーによらずに融合（または連結または結合）させる段階を含み得る。また、ＧＤＦ１５またはその機能的変異体と免疫グロブリンのＦｃ領域をフレキシブルリンカー（例えば、ＧＳリンカー）により融合（または連結または結合）させる段階を含む、ＧＤＦ１５、免疫グロブリンのＦｃ領域、またはこれらを含む融合ポリペプチドの免疫原性を減少させる方法を提供する。前記融合（または連結または結合）させる段階は、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で行われる。
以下、本発明をより詳しく説明する：
ＧＤＦ１５
ＧＤＦ１５は、全体３０８個アミノ酸（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ９９９８８）の中でｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅとｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅを除いた、１９７番目（Ａ）から３０８番目（Ｉ）までのアミノ酸（配列番号１；図２参照；ｍａｔｕｒｅ ｆｏｒｍ）で構成されている。
ＧＤＦ１５は、全体３０８個アミノ酸（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ９９９８８）の中でｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅとｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅを除いた、１９７番目（Ａ）から３０８番目（Ｉ）までのアミノ酸（配列番号１；図２参照；ｍａｔｕｒｅ ｆｏｒｍ）で構成されている。
本明細書において、ＧＤＦ１５は、特に記載のない限り、全長タンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ９９９８８）の１９７番目（Ａ）から３０８番目（Ｉ）までのアミノ酸配列（配列番号１、図２参照；ＡＲＮＧ ＤＨＣＰＬＧＰＧＲＣ ＣＲＬＨＴＶＲＡＳＬ ＥＤＬＧＷＡＤＷＶＬ ＳＰＲＥＶＱＶＴＭＣ ＩＧＡＣＰＳＱＦＲＡ ＡＮＭＨＡＱＩＫＴＳ ＬＨＲＬＫＰＤＴＶＰ ＡＰＣＣＶＰＡＳＹＮ ＰＭＶＬＩＱＫＴＤＴ ＧＶＳＬＱＴＹＤＤＬ ＬＡＫＤＣＨＣＩ）またはＧＤＦ１５の固有活性および構造を維持する範囲で前記アミノ酸配列と８０％以上、８５％以上、９０以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を必須に含むポリペプチドを意味する。
本明細書において、ＧＤＦ１５の機能的変異体は、ＧＤＦ１５が固有活性および構造を維持しながら、二量体構造の形成にさらに有利に変異した変異体であり得る。一例として、前記ＧＤＦ１５の機能的変異体は、配列番号１のＧＤＦ１５のアミノ酸配列のＮ－末端１４個のアミノ酸残基（つまり、配列番号１で１番目から１４番目までの総１４個のアミノ酸残基）中の１つ以上（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個）（例えば、Ｎ末端から順に１つ以上）、例えば１４個のアミノ酸残基が全て欠失したＮ－末端欠失変異体（以下、「ΔＮ１４ＧＤＦ１５」または「ＧＤＦ（ＣＲＬ）」で表される）であり得る。一実施形態において、前記ＧＤＦ１５の機能的変異体は、配列番号２（ＣＲＬＨＴＶＲＡＳＬ ＥＤＬＧＷＡＤＷＶＬ ＳＰＲＥＶＱＶＴＭＣ ＩＧＡＣＰＳＱＦＲＡ ＡＮＭＨＡＱＩＫＴＳ ＬＨＲＬＫＰＤＴＶＰ ＡＰＣＣＶＰＡＳＹＮ ＰＭＶＬＩＱＫＴＤＴ ＧＶＳＬＱＴＹＤＤＬ ＬＡＫＤＣＨＣＩ）のアミノ酸配列またはＧＤＦ１５の固有活性および構造を維持する範囲で前記アミノ酸配列と８０％以上、８５％以上、９０以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を必須に含むポリペプチドであり得る。
免疫グロブリンのＦｃ
ＧＤＦ１５またはその機能的変異体と融合する免疫グロブリンのＦｃは、前記ＧＤＦ１５またはその機能的変異体の安定性を増進させる役割を果たすもので、例えば、半減期（ｅ．ｇ．，体内半減期）を延長、および／またはｒｅｎａｌ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ減少などの効果を有する。一例として、前記免疫グロブリンのＦｃ領域は、ＩｇＧ１のＦｃおよびＩｇＧ４のＦｃの中から選択される。前記ＩｇＧ１のＦｃ領域は、ＩｇＧ１のＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはＣＨ２＋ＣＨ３ドメインを含み、Ｎ－末端にＩｇＧ１のヒンジ領域を含むか、または含まない。ＩｇＧ４のＦｃ領域は、ＩｇＧ４のＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはＣＨ２＋ＣＨ３ドメインを含み、Ｎ－末端にＩｇＧ４のヒンジ領域を含むか、または含まない。
ＧＤＦ１５またはその機能的変異体と融合する免疫グロブリンのＦｃは、前記ＧＤＦ１５またはその機能的変異体の安定性を増進させる役割を果たすもので、例えば、半減期（ｅ．ｇ．，体内半減期）を延長、および／またはｒｅｎａｌ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ減少などの効果を有する。一例として、前記免疫グロブリンのＦｃ領域は、ＩｇＧ１のＦｃおよびＩｇＧ４のＦｃの中から選択される。前記ＩｇＧ１のＦｃ領域は、ＩｇＧ１のＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはＣＨ２＋ＣＨ３ドメインを含み、Ｎ－末端にＩｇＧ１のヒンジ領域を含むか、または含まない。ＩｇＧ４のＦｃ領域は、ＩｇＧ４のＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはＣＨ２＋ＣＨ３ドメインを含み、Ｎ－末端にＩｇＧ４のヒンジ領域を含むか、または含まない。
ＩｇＧ１は、ヒトなどの霊長類またはマウス、ラットなどの齧歯類由来のものであり、例えば、ヒトＩｇＧ１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｐ０１８５７）である。ＩｇＧ４は、ヒトなどの霊長類またはマウス、ラットなどの齧歯類由来のものであり、例えば、ヒトＩｇＧ４（ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ Ｐ０１８６１）である。
前記ＩｇＧ１のＦｃ領域は、ＩｇＧ１のＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはＣＨ２＋ＣＨ３ドメインを含み、Ｎ－末端にＩｇＧ１のヒンジ領域を含むか、または含まない。ＩｇＧ４のＦｃ領域は、ＩｇＧ４のＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはＣＨ２＋ＣＨ３ドメインを含み、Ｎ－末端にＩｇＧ４のヒンジ領域を含むか、または含まない。
一実施形態において、ＩｇＧ１のＦｃは、ヒトＩｇＧ１のＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインを含むポリペプチド（配列番号３）、または前記配列番号３のアミノ酸配列のＮ－末端にヒトＩｇＧ１のヒンジ領域（配列番号４）をさらに含むポリペプチドであり得る。本明細書において、ＩｇＧ１のＦｃ領域は、ＩｇＧ１のＦｃの固有活性および構造を維持する範囲で前記配列番号３または「Ｎ末端－（配列番号４）－（配列番号３）－Ｃ末端」のアミノ酸配列と８０％以上、８５％以上、９０以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むと解釈される。
ＩｇＧ４のＦｃは、ヒトＩｇＧ４のＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインを含むポリペプチド（配列番号５）または前記配列番号５のアミノ酸配列のＮ－末端にヒトＩｇＧ４のヒンジ領域（配列番号１０）をさらに含むポリペプチドである。本明細書で使用されるＩｇＧ４のＦｃ領域は、ＩｇＧ４のＦｃの固有活性および構造を維持する範囲で前記配列番号５または「Ｎ末端－（配列番号１０）－（配列番号５）－Ｃ末端」のアミノ酸配列（または後述するＩｇＧ４の変異型Ｆｃのアミノ酸配列）と８０％以上、８５％以上、９０以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むと解釈される。
免疫グロブリンのＦｃ領域がそのＮ－末端またはＣ－末端に連結されたタンパク質の（体内）半減期を延長させる目的で使用される場合、免疫グロブリンＦｃ領域による副作用を減らすためには、Ｆｃが有する任意のエフェクター（ｅｆｆｅｃｔｏｒ）機能を最小化させることが重要である。このような側面から、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域は、他のＩｇＧサブ－タイプに比べてＦｃγＲと補体因子との結合力が低く有利である。これに加えて、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域はアミノ酸置換を含むことによって、エフェクター機能がさらに減少した。前記エフェクター機能を減少させるためのヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域のアミノ酸置換は、ヒトＩｇＧ４（ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ Ｐ０１８６１）の２３４番目のフェニルアラニン残基のアラニンへの置換および２３５番目のロイシン残基のアラニンへの置換（ＩｇＧ４ ＦｃのＣＨ２－ＣＨ３ドメイン部位に含まれる；前記アミノ酸残基番号はＥＵ番号付け方式に従う［Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．など（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｎｏ．９１－３２４２］）の中の１つ以上を含むことができる。さらに、前記ＩｇＧ４のＦｃ領域は、重鎖二量体の形成を安定化し、ハーフ（ｈａｌｆ）－ＩｇＧ４ Ｆｃ鎖の形成を防止するアミノ酸置換を含む。このようなアミノ酸置換は、ヒトＩｇＧ４（ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ Ｐ０１８６１）のＦｃ領域の２２８番目のセリンアミノ酸残基（ＥＵ番号付け方式に従う；ヒンジ領域に含まれる）のプロリンへの置換を含む。
一実施形態において、免疫原性（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）を減少させるために、Ｆｃ領域は前記変異以外の変異を含まないが、これに限定されるものではない。
一実施形態において、前記免疫グロブリンのＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ４ ＦｃのＣＨ２－ＣＨ３ドメイン（配列番号５（一般式）；配列番号６（野生型）、または配列番号７、８、または９（変異型）を含むか、前記ＣＨ２－ＣＨ３ドメインのＮ末端にヒトＩｇＧ４のヒンジ領域（配列番号１０（一般式）；配列番号１１（野生型）、または配列番号１２（変異型））をさらに含む。
一実施形態において、前記免疫グロブリンのＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ４ ＦｃのＣＨ２－ＣＨ３ドメイン（配列番号５（一般式）；配列番号６（野生型）、または配列番号７、８、または９（変異型）を含むか、前記ＣＨ２－ＣＨ３ドメインのＮ末端にヒトＩｇＧ４のヒンジ領域（配列番号１０（一般式）；配列番号１１（野生型）、または配列番号１２（変異型））をさらに含む。
本明細書で使用される免疫グロブリンのＦｃ領域を下記表１に整理した：
融合ポリペプチド
本明細書で使用される融合ポリペプチドは、免疫グロブリンのＦｃ領域および前記免疫グロブリンのＦｃ領域のＣ－末端に連結されたＧＤＦ１５またはその機能的変異体を含む。前記免疫グロブリンのＦｃ領域およびＧＤＦ１５またはその機能的変異体は上述した通りである。
本明細書で使用される融合ポリペプチドは、免疫グロブリンのＦｃ領域および前記免疫グロブリンのＦｃ領域のＣ－末端に連結されたＧＤＦ１５またはその機能的変異体を含む。前記免疫グロブリンのＦｃ領域およびＧＤＦ１５またはその機能的変異体は上述した通りである。
前記融合ポリペプチドにおいて、免疫グロブリンのＦｃ領域とＧＤＦ１５またはその機能的変異体は共有または非共有で連結されるか、または適切なリンカー（例えば、ペプチドリンカー）によるか、またはリンカーなしに直接連結される。一例として、前記ペプチドリンカーは１～２０個、１～１５個、１～１０個、２～２０個、２～１５個、または２～１０個の任意のアミノ酸からなるポリペプチドであり、それに含まれるアミノ酸種類に制限はない。本明細書において、ペプチドリンカーは、両側に融合したＦｃ領域（半減期の増加、ｒｅｎａｌ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ減少などの安定化活性）とＧＤＦ１５がそれぞれ自由に機能を発揮するためにフレキシブルリンカー（ｆｌｅｘｉｂｌｅ ｌｉｎｋｅｒ）であることが好ましい。一例として、前記ペプチドリンカーは剛性リンカー（ｒｉｇｉｄ ｌｉｎｋｅｒ）ではない。前記ペプチドリンカーは、例えば、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、およびＬｙｓからなる群より選択される１以上のアミノ酸残基を含むことができ、Ｔｈｒおよび／またはＡｌａなどの中性アミノ酸を含むこともできるが、これらに限定されず、ペプチドリンカーに適したアミノ酸配列は公知である。
一例として、前記ペプチドリンカーは、１つ以上のＧｌｙ（Ｇ）と１つ以上のＳｅｒ（Ｓ）を繰り返し含むＧＳリンカーであり、例えば、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ｎはＧＧＧＧＳ（配列番号１３）の反復回数であって、１～１０の整数または１～５の整数（１、２、３、４、または５）である）であるが、これに限定されるものではない。前記ＧＳリンカーにおいて、Ｇｌｙ（グリシン）は、Ｒ ｇｒｏｕｐが－Ｈであるアミノ酸であって、非極性で自由度（ｐｈｉ、ｐｓｉ ａｎｇｌｅ）が大きくてｍｏｂｉｌｉｔｙに優れ、Ｓｅｒ（セリン）は、Ｒ ｇｒｏｕｐが－ＣＨ２－ＯＨであるアミノ酸であって、大きさが小さいながらも極性であるので、水と水素結合を形成してリンカーの安定性維持に有利であり、ＧＳリンカーと、ＧＤＦ１５またはＦｃ領域との非特異的相互作用（ｎｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）を減らすことに寄与する。また、前記ＧＳリンカーはフレキシブル構造であるため、免疫原性が低い長所がある。また、前記ＧＳリンカーは、ＧＤＦ１５とＦｃ領域がそれぞれの機能を妨害しないように空間的に分離させる役割を果たすものであり、これにより、ＧＳリンカーのアミノ酸の長さは１５～２５個アミノ酸（ｎ＝３～５）、１５～２０個アミノ酸（ｎ＝３または４）、１５～２５個アミノ酸（ｎ＝４または５）、または２０個アミノ酸（ｎ＝４）である。一例として、本明細書で使用される融合ポリペプチドに含まれるペプチドリンカーは、前記ＧＳリンカー［（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ｎは１～１０の整数または１～５の整数）］以外のアミノ酸残基は含まない。
したがって、前記融合ポリペプチドは、免疫グロブリンのＦｃ領域とＧＤＦ１５またはその機能的変異体間にペプチドリンカーをさらに含む。また、前記ペプチドリンカーは、１つ以上のＧｌｙ（Ｇ）と１つ以上のＳｅｒ（Ｓ）を繰り返し含むＧＳリンカーであり、例えば、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ｎはＧＧＧＧＳ（配列番号１３）の反復回数であって、１～１０の整数または１～５の整数（１、２、３、４、または５）である）であるが、これに限定されるものではない。
前記融合ポリペプチドは、組換えで生産されるか、または化学的に合成される。組換えで生産される場合、前記融合ポリペプチドは、１つの転写開始調節因子（例えば、プロモーターなど）によって発現が調節される１つの解読枠（ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）によってコードされる（「一本鎖」で表現する）。
前記融合ポリペプチドにおいて、免疫グロブリンのＦｃ領域と融合したＧＤＦ１５またはその機能的変異体は、免疫グロブリンのＦｃ領域が融合されないＧＤＦ１５またはその機能的変異体、および／またはＦｃ領域とＧＤＦ１５が前記ＧＳリンカー以外のリンカーを介して融合した場合に比べて、体内（または血中）安定性（持続期間）が増加（例えば、体内または血中半減期の増加）、および／または免疫原性が減少することを特徴とする。また、前記免疫グロブリンのＦｃ領域と融合したＧＤＦ１５またはその機能的変異体は、免疫グロブリンのＦｃ領域が融合されないＧＤＦ１５またはその機能的変異体に比べて、薬理効果（例えば、体重減少効果）が改善されることを特徴とする。
融合ポリペプチド二量体
ＧＤＦ１５の機能的に活性のある形態は同種二量体（ｈｏｍｏ ｄｉｍｅｒ）形態である。
ＧＤＦ１５の機能的に活性のある形態は同種二量体（ｈｏｍｏ ｄｉｍｅｒ）形態である。
したがって、本発明の他の実施形態は、２個の融合ポリペプチド（第１融合ポリペプチドおよび第２融合ポリペプチド）が結合した融合ポリペプチド二量体を提供する。前記第１融合ポリペプチドは、第１免疫グロブリンのＦｃ領域および第１のＧＤＦ１５またはその機能的変異体を含み、第２融合ポリペプチドは、第２免疫グロブリンのＦｃ領域および第２のＧＤＦ１５またはその機能的変異体を含む。前記二量体において、第１融合ポリペプチドと第２融合ポリペプチドは、第１のＧＤＦ１５またはその機能的変異体と第２のＧＤＦ１５またはその機能的変異体が共有結合（例えば、二硫化結合など）を通して連結される。また、前記二量体において、任意に、第１免疫グロブリンのＦｃ領域と第２免疫グロブリンのＦｃ領域は共有結合（例えば、二硫化結合など）または非共有結合（例えば、ｋｎｏｂ＆ｈｏｌｅ、静電的相互作用、疎水性相互作用など）を通して互いに連結される（図１参照）。前記免疫グロブリンのＦｃ領域およびＧＤＦ１５またはその機能的変異体は上述した通りであり、第１免疫グロブリンのＦｃ領域と第２免疫グロブリンのＦｃ領域、および第１のＧＤＦ１５またはその機能的変異体と第２のＧＤＦ１５またはその機能的変異体はそれぞれ互いに同一でも異なってもよい。
一例として、前記融合ポリペプチド二量体に含まれている前記第１免疫グロブリンのＦｃ領域と第２免疫グロブリンのＦｃ領域、および第１のＧＤＦ１５またはその機能的変異体と第２のＧＤＦ１５またはその機能的変異体、およびこれらが連結されて形成された第１融合ポリペプチドおよび第２融合ポリペプチドは、それぞれ一本鎖（ｃｈａｉｎ；例えば、１つのｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅによってコードされるポリペプチド）形態であり、第１免疫グロブリンのＦｃ領域と第２免疫グロブリンのＦｃ領域、および第１のＧＤＦ１５またはその機能的変異体と第２のＧＤＦ１５またはその機能的変異体、およびこれらが連結されて形成された第１融合ポリペプチドおよび第２融合ポリペプチドの中の１つ以上が二量体形態の構造（例えば、第１または第２融合ポリペプチドに含まれている第１または第２免疫グロブリンのＦｃ領域が二本鎖（２分子）が二硫化結合などによって連結された形態の場合）は排除される。
ＧＤＦ１５の二量体構造で単量体のＮ－末端は、他のタンパク質に融合（ｆｕｓｉｏｎ）されるように露出しており、Ｃ－末端は他のタンパク質に融合されない位置にある。したがって、ＧＤＦ１５二量体形態を維持しながら融合ポリペプチドを形成するために、融合パートナー（つまり、免疫グロブリンのＦｃ領域）は、ＧＤＦ１５のＮ－末端に連結されることが好ましい。
ＧＤＦ１５は、その受容体であるＧＦＲＡＬ（ＧＤＮＦ ｆａｍｉｌｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ－ｌｉｋｅ；例えば、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＮＰ_９９７２９３．２）と結合してＧＤＦ１５－ＧＦＲＡＬ複合体構造を形成する。前記複合体構造で、ＧＤＦ１５単量体とＧＦＲＡＬ単量体がそれぞれ結合しており、ＧＤＦ１５のＮ－末端はＧＤＦ１５二量体の中間部分に位置する。ＧＤＦ１５に融合されるＮ－末端４個のアミノ酸残基はＸ－ｒａｙ構造で観察されないので、特定の構造をなさないと予測される。ＧＤＦ１５のＮ－末端１４個のアミノ酸残基は、Ｃｙｓ７－Ｃｙｓ１４ジスルフィド結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄ）で固定しており、ＧＤＦ１５二量体内の単量体間の相互作用（ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）に関与しない。また、ＧＤＦ１５のＮ－末端１４個のアミノ酸残基は、構造的にＧＦＲＡＬ受容体と相互作用（結合）できない距離に位置するので、ＧＤＦ１５のＮ－末端１４個のアミノ酸残基が欠失してもＧＤＦ１５がＧＦＲＡＬ受容体に結合するのに影響はないと予想される。
ＧＤＦ１５単量体は、分子内４つのジスルフィド結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄｓ）と二量体分子の間に１個のジスルフィド結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄ）を有している。分子内ジスルフィド結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄｓ）は、構造を安定化する役割を果たすものと推定され、Ｃｙｓ７－Ｃｙｓ１４を連結するジスルフィド結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄ）は、単量体構造の末端に位置し、Ｎ－末端のｌｏｏｐ構造を固定する役割を果たす。Ｎ－末端１４個のアミノ酸残基は、ＧＦＲＡＬ受容体結合に直接的な役割を果たさないので、これらのうちの１つ以上を除去してもＧＤＦ１５の機能および構造に影響を与えないが、Ｃｙｓ１５は、Ｃｙｓ８８とジスルフィド結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄ）を形成するので、Ｃｙｓ１５を除去する場合、ＧＤＦ１５の３次元構造に影響を与える。したがって、ＧＤＦ１５の機能および構造を維持しながら除去可能な部位は、Ｎ－末端の１４個アミノ酸まで（つまり、配列番号１で、Ａｌａ１からＣｙｓ１４までの１４個アミノ酸のうちの１個以上、例えば、Ｎ－末端から順に１個以上（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個））である。一例として、ＧＤＦ１５単量体は、野生型（配列番号１）または野生型でＮ末端の１４個アミノ酸が欠失した形態（ΔＮ１４ＧＤＦ１５；配列番号２）である。
ｗｔＧＤＦ１５（配列番号１）またはΔＮ１４ＧＤＦ１５（配列番号１でＮ末端の１４個アミノ酸が欠失した形態）とその受容体であるＧＦＲＡＬが結合した複合体構造で、ｗｔ（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）ＧＤＦ１５Ｎ－末端（１－１４番目のアミノ酸残基）部分はＣｙｓ７－Ｃｙｓ１４ジスルフィド結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄ）によって固定しており、Ｎ－末端がそれぞれ左側下方および右側下方に露出している。ｗｔＧＤＦ１５でＮ－末端１４個のアミノ酸を除去した場合、Ｎ－末端がそれぞれ左側上方および右側上方に露出している。
このような構造によって免疫グロブリンのＦｃタンパク質をＧＤＦ１５と融合させて融合タンパク質を形成する場合、Ｎ－末端１４個のアミノ酸残基を除去したΔＮ１４ＧＤＦ１５とＦｃタンパク質のＣ－末端が形態的に自然に連結される（図３ａ参照）。一方、ｗｔＧＤＦ１５の場合、Ｎ－末端がＦｃタンパク質と連結するのに多少難しい方向に位置し得る（図３ｂ参照）。
Ｆｃ－ΔＮ１４ＧＤＦ１５またはＦｃ－ｗｔＧＤＦ１５とＧＦＲＡＬが結合した複合体構造で、ＧＤＦ１５とＦｃは機能的に二量体形態であり、Ｆｃ－ΔＮ１４ＧＤＦ１５の場合、それぞれＦｃ ｄｉｍｅｒ形成とΔＮ１４ＧＤＦ１５ ｄｉｍｅｒ形成が容易な構造的配列をしている。したがって、Ｆｃ－ΔＮ１４ＧＤＦ１５がＦｃ－ｗｔＧＤＦ１５よりＧＦＲＡＬとの複合体形成に妨害せずとも二量体形成の側面において有利である。
本明細書で提供される融合ポリペプチドまたは融合ポリペプチド二量体に含まれているＧＤＦ１５またはその機能的変異体の哺乳類での体内（血中）半減期は、免疫グロブリンのＦｃ領域が融合されないＧＤＦ１５またはその機能的変異体に比べて、約１．５倍以上、約２倍以上、約２．５倍以上、約３倍以上、約３．５倍以上、約４倍以上、約４．５倍以上、約５倍以上、約５．５倍以上、約６倍以上、約７倍以上、約８倍以上、約９倍以上、または約１０倍以上増加したものであり得る。
このように、増加したＧＤＦ１５またはその機能的変異体の半減期によって、免疫グロブリンのＦｃ領域が結合した融合ポリペプチド形態のＧＤＦ１５またはその機能的変異体は、免疫グロブリンのＦｃ領域が連結されない形態のＧＤＦ１５またはその機能的変異体に比べて、投与間隔を長くすることができる利点がある。
融合ポリペプチドの生産
ＧＤＦ１５またはその機能的変異体と免疫グロブリンのＦｃ領域を含む融合ポリペプチドは、通常の化学的合成方法または組換え方法によって生産され、天然由来（ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）のものではないこともある。
ＧＤＦ１５またはその機能的変異体と免疫グロブリンのＦｃ領域を含む融合ポリペプチドは、通常の化学的合成方法または組換え方法によって生産され、天然由来（ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）のものではないこともある。
本明細書において、用語「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」は、宿主細胞で目的遺伝子を発現させるための発現手段を意味するもので、例えば、プラスミドベクター、コズミドベクター、そして、バクテリオファージベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターおよびアデノ連関ウイルスベクターのようなウイルスベクターなどからなる群より選択される。一例として、前記組換えベクターに用いられるベクターは、プラスミド（例えば、ｐｃＤＮＡシリーズ、ｐＳＣ１０１、ｐＧＶ１１０６、ｐＡＣＹＣ１７７、ＣｏｌＥ１、ｐＫＴ２３０、ｐＭＥ２９０、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ８／９、ｐＵＣ６、ｐＢＤ９、ｐＨＣ７９、ｐＩＪ６１、ｐＬＡＦＲ１、ｐＨＶ１４、ｐＧＥＸシリーズ、ｐＥＴシリーズ、ｐＵＣ１９など）、ファージ（例えば、λｇｔ４λＢ、λ－Ｃｈａｒｏｎ、λΔｚ１、Ｍ１３など）またはウイルス（例えば、ＳＶ４０など）を基本にして製作されるが、これらに限定されるものではない。
前記組換えベクターで前記融合ポリペプチドをコードする核酸分子はプロモーターに作動的に結合される。用語「作動的に結合された（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」は、核酸発現調節配列（例えば、プロモーター配列）と他の核酸配列の間の機能的な結合を意味する。前記調節配列は「作動的に結合（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」されることによって他の核酸配列の転写および／または翻訳を調節することができる。
前記組換えベクターは、典型的にクローニングのためのベクターまたは発現のための発現ベクターとして構築され得る。前記発現ベクターは、当業界で植物、動物または微生物で外来のタンパク質を発現するために使用される通常のものを使用することができる。前記組換えベクターは、当業界に公知の多様な方法により構築され得る。
前記組換えベクターは、真核細胞を宿主として発現される。真核細胞の宿主で発現させる場合、組換えベクターは、発現させようとする核酸分子および上述したプロモーター、リボソーム結合シート、分泌信号配列（韓国特許公開第２０１５－０１２５４０２号参照）および／または転写／翻訳終結配列以外に、真核細胞で作動する複製起点は、ｆ１複製原点、ＳＶ４０複製起点、ｐＭＢ１複製起点、アデノ複製起点、ＡＡＶ複製起点、および／またはＢＢＶ複製起点などを含み得るが、これらに限定されるものではない。また、哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター（例えば、メタロチオニンプロモーター）または哺乳動物ウイルス由来のプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、融合プロモーター（ＫＲ１０－１０３８１２６またはＫＲ１０－１８６８１３９）、またはＨＳＶのｔｋプロモーター）が用いられ、分泌シグナル配列として通常使用可能なすべての分泌シグナル配列を使用することができ、例えば、韓国特許公開第２０１５－０１２５４０２号に記載された分泌シグナル配列を使用することができるが、これに限定されるものではなく、転写終結配列としてポリアデニル化配列を含み得る。
前記組換え細胞は、前記組換えベクターを適切な宿主細胞に導入（形質転換または形質感染）させることによって得られる。前記宿主細胞は、前記組換えベクターを安定的かつ連続的にクローニングまたは発現させる全ての真核細胞の中から選択される。宿主として使用可能な真核細胞としては、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、昆虫細胞、植物細胞、および動物細胞などがあり、例えば、マウス（例えば、ＣＯＰ、Ｌ、Ｃ１２７、Ｓｐ２／０、ＮＳ－０、ＮＳ－１、Ａｔ２０、またはＮＩＨ３Ｔ３）、ラット（例えば、ＰＣ１２、ＰＣ１２ｈ、ＧＨ３、またはＭｔＴ）、ハムスター（例えば、ＢＨＫ、ＣＨＯ、ＧＳ遺伝子欠失ＣＨＯ、またはＤＨＦＲ遺伝子欠失ＣＨＯ）、サル（例えば、ＣＯＳ（ＣＯＳ１、ＣＯＳ３、ＣＯＳ７など）、ＣＶ１またはＶｅｒｏ）、ヒト（例えば、ＨｅＬａ、ＨＥＫ－２９３、角膜－由来ＰＥＲ－Ｃ６、二倍体線維芽細胞由来の細胞、骨髄腫細胞またはＨｅｐＧ２、その他動物細胞（例えば、ＭＤＣＫなど）、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞、Ｔｎ－３６８細胞、ＢＴＩ－ＴＮ－５Ｂ１－４細胞など）、ハイブリドーマなどがあるが、これらに限定されるものではない。
本明細書で提供される融合ポリペプチドをコードする核酸分子を上述した適切な宿主細胞で発現させることによって、融合しない形態に比べて、体内安定性が増進したＧＤＦ１５またはその機能的変異体またはこれを含む融合ポリペプチドまたは融合ポリペプチド二量体を製造することができる。前記融合ポリペプチドまたは融合ポリペプチド二量体の製造方法は、前記核酸分子を含む組換え細胞を培養する段階を含み得る。前記培養する段階は通常の培養条件で行うことができる。また、前記製造方法は、培養段階以後に、培養物から融合ポリペプチドまたは融合ポリペプチド二量体を分離および／または精製する段階をさらに含み得る。
前記核酸分子またはこれを含む組換えベクターの宿主細胞内への送達（導入）は、当業界で広く知られた送達方法を使用することができる。前記送達方法は、例えば、宿主細胞が真核細胞である場合、微細注入法、リン酸カルシウム沈殿法、電気穿孔法、リポソーム媒介形質感染法および遺伝子ボンバードメントなどを使用することができるが、これらに限定されない。
前記形質転換（組換えベクターの導入）された宿主細胞を選別する方法は、選択標識によって発現する表現型を用いて、当業界で広く知られた方法により容易に行うことができる。例えば、前記選択標識が特定の抗生剤耐性遺伝子である場合には、前記抗生剤が含まれている培地で培養することによって、組換えベクターが導入された組換え細胞を容易に選別することができる。
医薬用途
融合ポリペプチド、融合ポリペプチド二量体、融合ポリペプチドコード核酸分子、前記核酸分子を含む組換えベクター、および前記組換えベクターを含む組換え細胞からなる群より選択される１つ以上を含む、体重減少、食餌調節（食事量の減少）、または代謝性疾患の予防、改善、軽減、および／または治療用組成物（薬学組成物または健康機能性食品組成物）；および／または前記融合ポリペプチド、融合ポリペプチド二量体、融合ポリペプチドコード核酸分子、前記核酸分子を含む組換えベクター、および前記組換えベクターを含む組換え細胞からなる群より選択される１つ以上の薬学的有効量を代謝性疾患の予防、改善、軽減、および／または治療を必要とする対象に投与する段階を含む、体重減少方法、食餌調節（食事量の減少）方法、または代謝性疾患の予防、改善、軽減、および／または治療方法が提供される。
融合ポリペプチド、融合ポリペプチド二量体、融合ポリペプチドコード核酸分子、前記核酸分子を含む組換えベクター、および前記組換えベクターを含む組換え細胞からなる群より選択される１つ以上を含む、体重減少、食餌調節（食事量の減少）、または代謝性疾患の予防、改善、軽減、および／または治療用組成物（薬学組成物または健康機能性食品組成物）；および／または前記融合ポリペプチド、融合ポリペプチド二量体、融合ポリペプチドコード核酸分子、前記核酸分子を含む組換えベクター、および前記組換えベクターを含む組換え細胞からなる群より選択される１つ以上の薬学的有効量を代謝性疾患の予防、改善、軽減、および／または治療を必要とする対象に投与する段階を含む、体重減少方法、食餌調節（食事量の減少）方法、または代謝性疾患の予防、改善、軽減、および／または治療方法が提供される。
前記代謝性疾患は、代謝障害によって誘発される全ての病気を意味し、肥満、糖尿病（例えば、２型糖尿病）、非アルコール性脂肪肝疾患（例えば、非アルコール性脂肪肝炎（Ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ；ＮＡＳＨ）など）などからなる群より選択される。
本明細書で使用される薬学的有効量は、所望の効果を得ることができる有効成分の含有量または投与量を意味する。前記薬学組成物内の有効成分（ＧＤＦ１５またはその機能的変異体と免疫グロブリンのＦｃ領域を含む融合ポリペプチド、融合ポリペプチド二量体、融合ポリペプチドコード核酸分子、前記核酸分子を含む組換えベクター、および前記組換えベクターを含む組換え細胞からなる群より選択される１種以上）の含有量または投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、食べ物、投与時間、投与間隔、投与経路、排泄速度および反応感応性などの要因によって多様に処方される。例えば、前記有効成分の１回投与量は、０．００１～１０００ｍｇ／ｋｇ、０．０１～１００ｍｇ／ｋｇ、０．０１～５０ｍｇ／ｋｇ、０．０１～２０ｍｇ／ｋｇ、０．０１～１０ｍｇ／ｋｇ、０．０１～５ｍｇ／ｋｇ、０．１～１００ｍｇ／ｋｇ、０．１～５０ｍｇ／ｋｇ、０．１～２０ｍｇ／ｋｇ、０．１～１０ｍｇ／ｋｇ、０．１～５ｍｇ／ｋｇ、１～１００ｍｇ／ｋｇ、１～５０ｍｇ／ｋｇ、１～２０ｍｇ／ｋｇ、１～１０ｍｇ／ｋｇ、または１～５ｍｇ／ｋｇの範囲であり得るが、これらに限定されるものではない。別の例において、薬学組成物内の有効成分の含有量は、薬学組成物の総重量を基準にして、０．０１重量％～９９．９重量％、０．０１重量％～９０重量％、０．０１重量％～８０重量％、０．０１重量％～７０重量％、０．０１重量％～６０重量％、０．０１重量％～５０重量％、０．０１重量％～４０重量％、０．０１重量％～３０重量％、１重量％～９９．９重量％、１重量％～９０重量％、１重量％～８０重量％、１重量％～７０重量％、１重量％～６０重量％、１重量％～５０重量％、１重量％～４０重量％、１重量％～３０重量％、５重量％～９９．９重量％、５重量％～９０重量％、５重量％～８０重量％、５重量％～７０重量％、５重量％～６０重量％、５重量％～５０重量％、５重量％～４０重量％、５重量％～３０重量％、１０重量％～９９．９重量％、１０重量％～９０重量％、１０重量％～８０重量％、１０重量％～７０重量％、１０重量％～６０重量％、１０重量％～５０重量％、１０重量％～４０重量％、または１０重量％～３０重量％であり得る。
本明細書で提供される有効成分またはこれを含む薬学組成物の投与間隔（隣接する２回投与間の時間的間隔）は、有効成分の濃度または状態（変異の有無など）、または患者の状態または症状などによって調節可能であり、例えば２日以上、３日以上、４日以上、５日以上、６日以上、７日以上、８日以上、９日以上、１０日以上、２週以上、３週以上、４週以上、６週以上、８週以上、１０週以上、または１２週以上であり得る。最大投与間隔は、約２週、約３週、約４週、約１ヶ月、約２ヶ月、または約３ヶ月であり得るが、これに限定されず、有効成分の濃度または状態（変異の有無など）、または患者の状態または症状などにより増減可能である。一実施形態において、前記投与間隔は約１週～約３ヶ月以内で適宜処方される。
また、前記薬学組成物は、前記有効成分以外に、薬学的に許容可能な担体をさらに含み得る。前記担体は、タンパク質、核酸、または細胞を含む薬物の製剤化に通常用いられるものとして、ラクトース、テクストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルジネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ミネラルオイルなどからなる群より選択される１種以上であり得るが、これらに限定されるものではない。前記薬学組成物はまた、薬学組成物の製造に通常使用される希釈剤、賦形剤、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などからなる群より選択される１種以上をさらに含み得る。
前記薬学組成物の投与対象は、ヒト、サルなどを含む霊長類、マウス、ラットなどを含む齧歯類などを含む哺乳類、またはこれらに由来する細胞、組織、細胞培養物または組織培養物であり得る。
前記薬学組成物は、経口投与または非経口的投与によって投与されるか、または細胞、組織、または体液に接触させることによって投与される。具体的には、非経口投与である場合には、皮下注入、筋肉注入、静脈内注入、腹腔注入、内皮投与、局所投与、鼻腔内投与、肺内投与および直腸内投与などで投与することができる。経口投与時、タンパク質またはペプチドは消化されるため、経口用組成物は、活性薬剤をコーティングするか、または胃腸での分解から保護されるように剤形化されなければならない。
また、前記薬学組成物は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液、シロップ剤または乳化液の形態であるか、またはエキス剤、散剤、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤などの形態で剤形化され、剤形化のために分散剤または安定化剤をさらに含み得る。
他の実施形態は、ＧＤＦ１５またはその機能的変異体と免疫グロブリンのＦｃ領域を融合（または連結または結合）させる段階を含む、ＧＤＦ１５またはその機能的変異体の生体持続期間を増加させる方法を提供する。一実施形態において、前記融合させる段階は、ＧＤＦ１５またはその機能的変異体のＮ末端に免疫グロブリンのＦｃ領域をリンカーを介するか、または介せずに融合（または連結または結合）させる段階を含み得る。他の実施形態は、ＧＤＦ１５またはその機能的変異体と免疫グロブリンのＦｃ領域をフレキシブルリンカーを介して融合（または連結または結合）させる段階を含む、ＧＤＦ１５、免疫グロブリンのＦｃ領域、またはこれらを含む融合ポリペプチドの免疫原性を減少させる方法を提供する。前記フレキシブルリンカーは上述した通りである。前記融合（または連結または結合）させる段階は、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で行われる。
本発明で提供される免疫グロブリンのＦｃ領域と融合したＧＤＦ１５またはその機能的変異体は、免疫グロブリンのＦｃ領域と融合しない場合に比べて、体内投与時に持続期間が長くなり、投与間隔を延ばすことができ、これにより投与容量を減らすことができるので、投与便宜性および／または経済的側面において有利な効果を有し、薬理効果も優れているので、ＧＤＦ１５またはその機能的変異体の治療が必要な分野で有用に適用される。
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。しかし、これらの実施例は本発明を例示したものに過ぎず、本発明の範囲はこれらの実施例によって限定されるものではない。
実施例１：融合ポリペプチドの製造
１．１．融合ポリペプチドをコードする遺伝子のクローニングおよび培養
Ｈｉｎｇｅが含まれるかまたは含まれない免疫グロブリンＦｃ（ＩｇＧ１－Ｆｃ（ヒンジ含まず：配列番号３；ＨＩｇＧ１－Ｆｃ（ヒンジ含む；［配列番号４］－［配列番号３］）、Ｍｕｔａｔｅｄ ＩｇＧ４－Ｆｃ（ヒンジ含まず；配列番号７）またはＭｕｔａｔｅｄ ＨＩｇＧ４－Ｆｃ（ヒンジ含む：［配列番号１２］－［配列番号７］）が目的ポリペプチドのＭａｔｕｒｅ ＧＤＦ１５（ＧＤＦまたはＧＤＦ１５で表示；配列番号１）、またはＧＤＦ１５変異体（ＧＤＦ（ＣＲＬ）で表示；Ｎ末端１４個のアミノ酸欠失：配列番号２）と融合した融合ポリペプチドＩｇＧ１－ＧＤＦ（ＣＲＬ）、ＨＩｇＧ１－ＧＤＦ（ＣＲＬ）、ＩｇＧ４－ＧＤＦ、ＨＩｇＧ４－ＧＤＦ、ＩｇＧ４－ＧＤＦ（ＣＲＬ）、およびＨＩｇＧ４－ＧＤＦ（ＣＲＬ）（図１参照）を製造した。前記融合ポリペプチドに含まれている各部分のアミノ酸配列を下記の表２、表３および表４に整理した。
１．１．融合ポリペプチドをコードする遺伝子のクローニングおよび培養
Ｈｉｎｇｅが含まれるかまたは含まれない免疫グロブリンＦｃ（ＩｇＧ１－Ｆｃ（ヒンジ含まず：配列番号３；ＨＩｇＧ１－Ｆｃ（ヒンジ含む；［配列番号４］－［配列番号３］）、Ｍｕｔａｔｅｄ ＩｇＧ４－Ｆｃ（ヒンジ含まず；配列番号７）またはＭｕｔａｔｅｄ ＨＩｇＧ４－Ｆｃ（ヒンジ含む：［配列番号１２］－［配列番号７］）が目的ポリペプチドのＭａｔｕｒｅ ＧＤＦ１５（ＧＤＦまたはＧＤＦ１５で表示；配列番号１）、またはＧＤＦ１５変異体（ＧＤＦ（ＣＲＬ）で表示；Ｎ末端１４個のアミノ酸欠失：配列番号２）と融合した融合ポリペプチドＩｇＧ１－ＧＤＦ（ＣＲＬ）、ＨＩｇＧ１－ＧＤＦ（ＣＲＬ）、ＩｇＧ４－ＧＤＦ、ＨＩｇＧ４－ＧＤＦ、ＩｇＧ４－ＧＤＦ（ＣＲＬ）、およびＨＩｇＧ４－ＧＤＦ（ＣＲＬ）（図１参照）を製造した。前記融合ポリペプチドに含まれている各部分のアミノ酸配列を下記の表２、表３および表４に整理した。
１．１．１組換え発現ベクターの製造
１．１．１．１．Ｍａｔｕｒｅ ＧＤＦ１５
Ｍａｔｕｒｅ ＧＤＦ１５をコードする遺伝子を得るために、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ Ｑ９９９６８のアミノ酸を参照してＭａｔｕｒｅ ＧＤＦ１５をコードする遺伝子（配列番号１４）をバイオニア社で合成した。
配列番号１４（３３９ｂｐ）
１ ＧＣＣＣＧＧＡＡＣＧ ＧＣＧＡＣＣＡＣＴＧ ＣＣＣＣＣＴＧＧＧＧ ＣＣＣＧＧＡＣＧＧＴ ＧＣＴＧＣＣＧＧＣＴ
５１ ＧＣＡＣＡＣＣＧＴＧ ＣＧＧＧＣＣＴＣＣＣ ＴＧＧＡＧＧＡＣＣＴ ＧＧＧＣＴＧＧＧＣＣ ＧＡＣＴＧＧＧＴＧＣ
１０１ ＴＧＴＣＣＣＣＡＡＧ ＧＧＡＧＧＴＧＣＡＡ ＧＴＧＡＣＣＡＴＧＴ ＧＣＡＴＣＧＧＣＧＣ ＣＴＧＣＣＣＡＴＣＴ
１５１ ＣＡＧＴＴＣＣＧＧＧ ＣＣＧＣＣＡＡＣＡＴ ＧＣＡＣＧＣＴＣＡＧ ＡＴＣＡＡＧＡＣＣＡ ＧＣＣＴＧＣＡＣＣＧ
２０１ ＧＣＴＧＡＡＧＣＣＣ ＧＡＣＡＣＣＧＴＧＣ ＣＣＧＣＣＣＣＣＴＧ ＣＴＧＣＧＴＧＣＣＣ ＧＣＣＴＣＣＴＡＣＡ
２５１ ＡＣＣＣＣＡＴＧＧＴ ＧＣＴＧＡＴＴＣＡＧ ＡＡＧＡＣＣＧＡＣＡ ＣＣＧＧＣＧＴＧＡＧ ＣＣＴＧＣＡＧＡＣＣ
３０１ ＴＡＣＧＡＣＧＡＣＣ ＴＧＣＴＧＧＣＣＡＡ ＧＧＡＣＴＧＣＣＡＣ ＴＧＣＡＴＣＴＡＡ
（＊アンダーライン部分がＧＤＦ（ＣＲＬ）である）
１．１．１．１．Ｍａｔｕｒｅ ＧＤＦ１５
Ｍａｔｕｒｅ ＧＤＦ１５をコードする遺伝子を得るために、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ Ｑ９９９６８のアミノ酸を参照してＭａｔｕｒｅ ＧＤＦ１５をコードする遺伝子（配列番号１４）をバイオニア社で合成した。
配列番号１４（３３９ｂｐ）
１ ＧＣＣＣＧＧＡＡＣＧ ＧＣＧＡＣＣＡＣＴＧ ＣＣＣＣＣＴＧＧＧＧ ＣＣＣＧＧＡＣＧＧＴ ＧＣＴＧＣＣＧＧＣＴ
５１ ＧＣＡＣＡＣＣＧＴＧ ＣＧＧＧＣＣＴＣＣＣ ＴＧＧＡＧＧＡＣＣＴ ＧＧＧＣＴＧＧＧＣＣ ＧＡＣＴＧＧＧＴＧＣ
１０１ ＴＧＴＣＣＣＣＡＡＧ ＧＧＡＧＧＴＧＣＡＡ ＧＴＧＡＣＣＡＴＧＴ ＧＣＡＴＣＧＧＣＧＣ ＣＴＧＣＣＣＡＴＣＴ
１５１ ＣＡＧＴＴＣＣＧＧＧ ＣＣＧＣＣＡＡＣＡＴ ＧＣＡＣＧＣＴＣＡＧ ＡＴＣＡＡＧＡＣＣＡ ＧＣＣＴＧＣＡＣＣＧ
２０１ ＧＣＴＧＡＡＧＣＣＣ ＧＡＣＡＣＣＧＴＧＣ ＣＣＧＣＣＣＣＣＴＧ ＣＴＧＣＧＴＧＣＣＣ ＧＣＣＴＣＣＴＡＣＡ
２５１ ＡＣＣＣＣＡＴＧＧＴ ＧＣＴＧＡＴＴＣＡＧ ＡＡＧＡＣＣＧＡＣＡ ＣＣＧＧＣＧＴＧＡＧ ＣＣＴＧＣＡＧＡＣＣ
３０１ ＴＡＣＧＡＣＧＡＣＣ ＴＧＣＴＧＧＣＣＡＡ ＧＧＡＣＴＧＣＣＡＣ ＴＧＣＡＴＣＴＡＡ
（＊アンダーライン部分がＧＤＦ（ＣＲＬ）である）
１．１．１．２．ＩｇＧ１－Ｆｃ
Ｈｉｎｇｅを含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃをコードする遺伝子またはＨｉｎｇｅを含まないヒトＩｇＧ１ Ｆｃをコードする遺伝子は、ヒトＩｇＧ１のｃｏｒｅ ＨｉｎｇｅとＩｇＧ１ Ｆｃをコードする遺伝子を含んでいるプラスミドを用いてＰＣＲにより得た。
配列番号１５（６７８ｂｐ）
１ ＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣ ＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣ ＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡ ＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣ ＴＣＣＴＧＧＧＧＧＧ
５１ ＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣ ＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣ ＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣ ＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣ ＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴ
１０１ ＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣ ＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡ ＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧ ＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧ ＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣ
１５１ ＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡ ＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧ ＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣ ＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧ ＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣ
２０１ ＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧ ＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧ ＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡ ＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣ ＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡ
２５１ ＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣ ＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣ ＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣ ＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡ ＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧ
３０１ ＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴ ＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣ ＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣ ＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡ ＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣ
３５１ ＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡ ＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣ ＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡ ＧＧＴＧＴＡＴＡＣＣ ＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴ
４０１ ＣＣＣＧＧＧＡＴＧＡ ＧＣＴＧＡＣＣＡＡＧ ＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡ ＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧ ＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡ
４５１ ＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣ ＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴ ＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧ ＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡ ＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣ
５０１ ＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣ ＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡ ＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴ ＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣ ＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴ
５５１ ＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡ ＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣ ＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡ ＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧ ＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧ
６０１ ＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴ ＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴ ＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧ ＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡ ＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣ
６５１ ＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣ ＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴ ＣＴＣＣＧＧＧＴ
（＊アンダーライン部分がＩｇＧ１ Ｃｏｒｅ Ｈｉｎｇｅをコードする遺伝子である）
Ｈｉｎｇｅを含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃをコードする遺伝子またはＨｉｎｇｅを含まないヒトＩｇＧ１ Ｆｃをコードする遺伝子は、ヒトＩｇＧ１のｃｏｒｅ ＨｉｎｇｅとＩｇＧ１ Ｆｃをコードする遺伝子を含んでいるプラスミドを用いてＰＣＲにより得た。
配列番号１５（６７８ｂｐ）
１ ＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣ ＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣ ＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡ ＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣ ＴＣＣＴＧＧＧＧＧＧ
５１ ＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣ ＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣ ＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣ ＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣ ＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴ
１０１ ＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣ ＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡ ＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧ ＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧ ＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣ
１５１ ＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡ ＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧ ＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣ ＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧ ＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣ
２０１ ＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧ ＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧ ＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡ ＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣ ＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡ
２５１ ＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣ ＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣ ＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣ ＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡ ＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧ
３０１ ＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴ ＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣ ＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣ ＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡ ＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣ
３５１ ＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡ ＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣ ＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡ ＧＧＴＧＴＡＴＡＣＣ ＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴ
４０１ ＣＣＣＧＧＧＡＴＧＡ ＧＣＴＧＡＣＣＡＡＧ ＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡ ＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧ ＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡ
４５１ ＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣ ＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴ ＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧ ＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡ ＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣ
５０１ ＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣ ＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡ ＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴ ＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣ ＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴ
５５１ ＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡ ＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣ ＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡ ＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧ ＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧ
６０１ ＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴ ＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴ ＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧ ＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡ ＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣ
６５１ ＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣ ＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴ ＣＴＣＣＧＧＧＴ
（＊アンダーライン部分がＩｇＧ１ Ｃｏｒｅ Ｈｉｎｇｅをコードする遺伝子である）
１．１．１．３．ＩｇＧ４－Ｆｃ
Ｈｉｎｇｅを含むヒトＩｇＧ４ Ｆｃをコードする遺伝子またはＨｉｎｇｅを含まないヒトＩｇＧ４ Ｆｃをコードする遺伝子は、ヒトＩｇＧ４のＨｉｎｇｅとＩｇＧ４ Ｆｃをコードする遺伝子を含んでいるプラスミドを用いてＰＣＲにより得た。
配列番号１６（６８４ｂｐ）
１ ＧＡＧＴＣＣＡＡＡＴ ＡＴＧＧＴＣＣＣＣＣ ＡＴＧＣＣＣＡＣＣＣ ＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣ ＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣ
５１ ＣＧＧＧＧＧＡＣＣＧ ＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣ ＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣ ＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧ ＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡ
１０１ ＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧ ＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧ ＧＴＣＡＣＧＴＧＣＧ ＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡ ＣＧＴＧＴＣＣＣＡＧ
１５１ ＧＡＧＧＡＣＣＣＣＧ ＡＧＧＴＧＣＡＧＴＴ ＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣ ＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧ ＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡ
２０１ ＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧ ＡＣＣＡＡＧＣＣＣＣ ＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡ ＧＴＴＣＡＡＣＴＣＣ ＡＣＣＴＡＣＣＧＧＧ
２５１ ＴＧＧＴＧＴＣＣＧＴ ＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧ ＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧ ＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡ ＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧ
３０１ ＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡ ＡＧＧＴＧＴＣＣＡＡ ＣＡＡＧＧＧＣＣＴＧ ＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡ ＴＣＧＡＧＡＡＧＡＣ
３５１ ＣＡＴＣＴＣＣＡＡＧ ＧＣＣＡＡＧＧＧＣＣ ＡＧＣＣＣＣＧＧＧＡ ＧＣＣＣＣＡＧＧＴＧ ＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣ
４０１ ＣＣＣＣＣＴＣＣＣＡ ＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧ ＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣ ＡＧＧＴＧＴＣＣＣＴ ＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧ
４５１ ＧＴＧＡＡＧＧＧＣＴ ＴＣＴＡＣＣＣＣＴＣ ＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣ ＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧ ＡＧＴＣＣＡＡＣＧＧ
５０１ ＣＣＡＧＣＣＣＧＡＧ ＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡ ＡＧＡＣＣＡＣＣＣＣ ＣＣＣＣＧＴＧＣＴＧ ＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧ
５５１ ＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴ ＣＣＴＧＴＡＣＴＣＣ ＣＧＧＣＴＧＡＣＣＧ ＴＧＧＡＣＡＡＧＴＣ ＣＣＧＧＴＧＧＣＡＧ
６０１ ＧＡＧＧＧＣＡＡＣＧ ＴＧＴＴＣＴＣＣＴＧ ＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧ ＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣ ＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡ
６５１ ＣＴＡＣＡＣＣＣＡＧ ＡＡＧＴＣＣＣＴＧＴ ＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴ ＧＧＧＣ
（＊アンダーライン部分がＩｇＧ４ Ｈｉｎｇｅをコードする遺伝子である）
Ｈｉｎｇｅを含むヒトＩｇＧ４ Ｆｃをコードする遺伝子またはＨｉｎｇｅを含まないヒトＩｇＧ４ Ｆｃをコードする遺伝子は、ヒトＩｇＧ４のＨｉｎｇｅとＩｇＧ４ Ｆｃをコードする遺伝子を含んでいるプラスミドを用いてＰＣＲにより得た。
配列番号１６（６８４ｂｐ）
１ ＧＡＧＴＣＣＡＡＡＴ ＡＴＧＧＴＣＣＣＣＣ ＡＴＧＣＣＣＡＣＣＣ ＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣ ＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣ
５１ ＣＧＧＧＧＧＡＣＣＧ ＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣ ＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣ ＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧ ＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡ
１０１ ＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧ ＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧ ＧＴＣＡＣＧＴＧＣＧ ＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡ ＣＧＴＧＴＣＣＣＡＧ
１５１ ＧＡＧＧＡＣＣＣＣＧ ＡＧＧＴＧＣＡＧＴＴ ＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣ ＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧ ＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡ
２０１ ＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧ ＡＣＣＡＡＧＣＣＣＣ ＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡ ＧＴＴＣＡＡＣＴＣＣ ＡＣＣＴＡＣＣＧＧＧ
２５１ ＴＧＧＴＧＴＣＣＧＴ ＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧ ＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧ ＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡ ＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧ
３０１ ＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡ ＡＧＧＴＧＴＣＣＡＡ ＣＡＡＧＧＧＣＣＴＧ ＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡ ＴＣＧＡＧＡＡＧＡＣ
３５１ ＣＡＴＣＴＣＣＡＡＧ ＧＣＣＡＡＧＧＧＣＣ ＡＧＣＣＣＣＧＧＧＡ ＧＣＣＣＣＡＧＧＴＧ ＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣ
４０１ ＣＣＣＣＣＴＣＣＣＡ ＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧ ＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣ ＡＧＧＴＧＴＣＣＣＴ ＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧ
４５１ ＧＴＧＡＡＧＧＧＣＴ ＴＣＴＡＣＣＣＣＴＣ ＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣ ＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧ ＡＧＴＣＣＡＡＣＧＧ
５０１ ＣＣＡＧＣＣＣＧＡＧ ＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡ ＡＧＡＣＣＡＣＣＣＣ ＣＣＣＣＧＴＧＣＴＧ ＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧ
５５１ ＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴ ＣＣＴＧＴＡＣＴＣＣ ＣＧＧＣＴＧＡＣＣＧ ＴＧＧＡＣＡＡＧＴＣ ＣＣＧＧＴＧＧＣＡＧ
６０１ ＧＡＧＧＧＣＡＡＣＧ ＴＧＴＴＣＴＣＣＴＧ ＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧ ＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣ ＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡ
６５１ ＣＴＡＣＡＣＣＣＡＧ ＡＡＧＴＣＣＣＴＧＴ ＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴ ＧＧＧＣ
（＊アンダーライン部分がＩｇＧ４ Ｈｉｎｇｅをコードする遺伝子である）
１．１．１．４．発現ベクターの製造
ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｖ７９０－２０）の変形体であるｐＤＨＤＤ－Ｄ１Ｇ１（ＫＲ１０－１８６８１３９Ｂ１のＰｒｏｍｏｔｅｒを含む）をＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩで切断し、そこに前記遺伝子（Ｍａｔｕｒｅ ＧＤＦ１５、ＩｇＧ１－Ｆｃ、ＩｇＧ４－Ｆｃ）を組み合わせて下記の構造（図４参照）を有する遺伝子を挿入してそれぞれの組換えベクターを用意した。
ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｖ７９０－２０）の変形体であるｐＤＨＤＤ－Ｄ１Ｇ１（ＫＲ１０－１８６８１３９Ｂ１のＰｒｏｍｏｔｅｒを含む）をＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩで切断し、そこに前記遺伝子（Ｍａｔｕｒｅ ＧＤＦ１５、ＩｇＧ１－Ｆｃ、ＩｇＧ４－Ｆｃ）を組み合わせて下記の構造（図４参照）を有する遺伝子を挿入してそれぞれの組換えベクターを用意した。
ｐＨＩｇＧ１－ＧＤＦ（ＣＲＬ）
‘（Ｎ－末端）－［ＢａｍＨＩ制限部位－シグナルペプチド（配列番号１７）－ＩｇＧ１ Ｃｏｒｅ Ｈｉｎｇｅ（配列番号４）－ＩｇＧ１ ＣＨ２－ＣＨ３（配列番号３）－ＧＳ Ｌｉｎｋｅｒ（配列番号１８）－ＧＤＦ（ＣＲＬ）（配列番号２）－ＮｏｔＩ制限部位］－（Ｃ－末端）’
‘（Ｎ－末端）－［ＢａｍＨＩ制限部位－シグナルペプチド（配列番号１７）－ＩｇＧ１ Ｃｏｒｅ Ｈｉｎｇｅ（配列番号４）－ＩｇＧ１ ＣＨ２－ＣＨ３（配列番号３）－ＧＳ Ｌｉｎｋｅｒ（配列番号１８）－ＧＤＦ（ＣＲＬ）（配列番号２）－ＮｏｔＩ制限部位］－（Ｃ－末端）’
ｐＩｇＧ１－ＧＤＦ（ＣＲＬ）
‘（Ｎ－末端）－［ＢａｍＨＩ制限部位－シグナルペプチド（配列番号１７）－ＩｇＧ１ ＣＨ２－ＣＨ３（配列番号３）－ＧＳ Ｌｉｎｋｅｒ（配列番号１８）－ＧＤＦ（ＣＲＬ）（配列番号２）－ＮｏｔＩ制限部位］－（Ｃ－末端）’
‘（Ｎ－末端）－［ＢａｍＨＩ制限部位－シグナルペプチド（配列番号１７）－ＩｇＧ１ ＣＨ２－ＣＨ３（配列番号３）－ＧＳ Ｌｉｎｋｅｒ（配列番号１８）－ＧＤＦ（ＣＲＬ）（配列番号２）－ＮｏｔＩ制限部位］－（Ｃ－末端）’
ｐＨＩｇＧ４－ＧＤＦ１５
‘（Ｎ－末端）－［ＢａｍＨＩ制限部位－シグナルペプチド（配列番号１７）－ＩｇＧ４ Ｈｉｎｇｅ（配列番号１２）－ＩｇＧ４ ＣＨ２－ＣＨ３（配列番号７）－ＧＳ Ｌｉｎｋｅｒ（配列番号１８）－ＧＤＦ１５（配列番号１）－ＮｏｔＩ制限部位］－（Ｃ－末端）’
‘（Ｎ－末端）－［ＢａｍＨＩ制限部位－シグナルペプチド（配列番号１７）－ＩｇＧ４ Ｈｉｎｇｅ（配列番号１２）－ＩｇＧ４ ＣＨ２－ＣＨ３（配列番号７）－ＧＳ Ｌｉｎｋｅｒ（配列番号１８）－ＧＤＦ１５（配列番号１）－ＮｏｔＩ制限部位］－（Ｃ－末端）’
ｐＩｇＧ４－ＧＤＦ１５
‘（Ｎ－末端）－［ＢａｍＨＩ制限部位－シグナルペプチド（配列番号１７）－ＩｇＧ４ ＣＨ２－ＣＨ３（配列番号７）－ＧＳ Ｌｉｎｋｅｒ（配列番号１８）－ＧＤＦ１５（配列番号１）－ＮｏｔＩ制限部位］－（Ｃ－末端）’
‘（Ｎ－末端）－［ＢａｍＨＩ制限部位－シグナルペプチド（配列番号１７）－ＩｇＧ４ ＣＨ２－ＣＨ３（配列番号７）－ＧＳ Ｌｉｎｋｅｒ（配列番号１８）－ＧＤＦ１５（配列番号１）－ＮｏｔＩ制限部位］－（Ｃ－末端）’
ｐＨＩｇＧ４－ＧＤＦ（ＣＲＬ）
‘（Ｎ－末端）－［ＢａｍＨＩ制限部位－シグナルペプチド（配列番号１７）－ＩｇＧ４ Ｈｉｎｇｅ（配列番号１２）－ＩｇＧ４ ＣＨ２－ＣＨ３（配列番号７）－ＧＳ Ｌｉｎｋｅｒ（配列番号１８）－ＧＤＦ（ＣＲＬ）（配列番号２）－ＮｏｔＩ制限部位］－（Ｃ－末端）’
‘（Ｎ－末端）－［ＢａｍＨＩ制限部位－シグナルペプチド（配列番号１７）－ＩｇＧ４ Ｈｉｎｇｅ（配列番号１２）－ＩｇＧ４ ＣＨ２－ＣＨ３（配列番号７）－ＧＳ Ｌｉｎｋｅｒ（配列番号１８）－ＧＤＦ（ＣＲＬ）（配列番号２）－ＮｏｔＩ制限部位］－（Ｃ－末端）’
ｐＩｇＧ４－ＧＤＦ（ＣＲＬ）
‘（Ｎ－末端）－［ＢａｍＨＩ制限部位－シグナルペプチド（配列番号１７）－ＩｇＧ４ ＣＨ２－ＣＨ３（配列番号７）－ＧＳ Ｌｉｎｋｅｒ（配列番号１８）－ＧＤＦ（ＣＲＬ）（配列番号２）－ＮｏｔＩ制限部位］－（Ｃ－末端）’
‘（Ｎ－末端）－［ＢａｍＨＩ制限部位－シグナルペプチド（配列番号１７）－ＩｇＧ４ ＣＨ２－ＣＨ３（配列番号７）－ＧＳ Ｌｉｎｋｅｒ（配列番号１８）－ＧＤＦ（ＣＲＬ）（配列番号２）－ＮｏｔＩ制限部位］－（Ｃ－末端）’
１．１．２．融合ポリペプチドをコードする遺伝子の培養
前記用意された組換え発現ベクターｐＨＩｇＧ１－ＧＤＦ（ＣＲＬ）、ｐＩｇＧ１－ＧＤＦ（ＣＲＬ）、ｐＨＩｇＧ４－ＧＤＦ（ＣＲＬ）、ｐＩｇＧ４－ＧＤＦ（ＣＲＬ）、ｐＨＩｇＧ４－ＧＤＦおよびｐＩｇＧ４－ＧＤＦをＥｘｐｉＣＨＯ－ＳＴＭ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に導入し、ＥｘｐｉＣＨＯ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；４００ｍＬ）で１２日間培養（Ｆｅｄ－Ｂａｔｃｈ Ｃｕｌｔｕｒｅ；Ｄａｙ１＆Ｄａｙ５ Ｆｅｅｄｉｎｇ）して、前記融合ポリペプチドＨＩｇＧ１－ＧＤＦ（ＣＲＬ）、ＩｇＧ１－ＧＤＦ（ＣＲＬ）、ＨＩｇＧ４－ＧＤＦ（ＣＲＬ）、ＩｇＧ４－ＧＤＦ（ＣＲＬ）、ＨＩｇＧ４－ＧＤＦおよびＩｇＧ４－ＧＤＦを発現させた。
前記用意された組換え発現ベクターｐＨＩｇＧ１－ＧＤＦ（ＣＲＬ）、ｐＩｇＧ１－ＧＤＦ（ＣＲＬ）、ｐＨＩｇＧ４－ＧＤＦ（ＣＲＬ）、ｐＩｇＧ４－ＧＤＦ（ＣＲＬ）、ｐＨＩｇＧ４－ＧＤＦおよびｐＩｇＧ４－ＧＤＦをＥｘｐｉＣＨＯ－ＳＴＭ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に導入し、ＥｘｐｉＣＨＯ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；４００ｍＬ）で１２日間培養（Ｆｅｄ－Ｂａｔｃｈ Ｃｕｌｔｕｒｅ；Ｄａｙ１＆Ｄａｙ５ Ｆｅｅｄｉｎｇ）して、前記融合ポリペプチドＨＩｇＧ１－ＧＤＦ（ＣＲＬ）、ＩｇＧ１－ＧＤＦ（ＣＲＬ）、ＨＩｇＧ４－ＧＤＦ（ＣＲＬ）、ＩｇＧ４－ＧＤＦ（ＣＲＬ）、ＨＩｇＧ４－ＧＤＦおよびＩｇＧ４－ＧＤＦを発現させた。
１．２．融合ポリペプチドの精製
プロテインＡ親和性クロマトグラフィー（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を用いて前記実施例１．１で用意された細胞培養物から融合ポリペプチドを精製した。
プロテインＡ親和性クロマトグラフィー（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を用いて前記実施例１．１で用意された細胞培養物から融合ポリペプチドを精製した。
まず、細胞が除去された融合ポリペプチドの培養液を０．２２μｍのフィルターでろ過した。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅＴＭ ｐｃｃ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）レジンがパッキングされたカラムをＡＫＴＡＴＭ Ｐｕｒｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に装着し、Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ、１０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を流してカラムを平衡化した。０．２２μｍのフィルターでろ過された培養液を前記平衡化されたカラムに注入した後、再びＰＢＳを流してカラムを洗浄した。カラムの洗浄作業が終わった後、溶出バッファー（０．１Ｍ Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｉｔｒａｔｅ ｐＨ３．５）をカラムに流して目的の融合ポリペプチドを溶出させた。溶出液は直ちに１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５を付加して中性ｐＨとなるようにした。溶出分画中の融合ポリペプチドの濃度が高く、純度が高い分画を集めて冷凍保管した。
動物実験のために、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ Ｆｉｌｔｅｒ Ｄｅｖｉｃｅ（ＭＷＣＯ １０Ｋ、Ｍｅｒｃｋ）と遠心分離機を用いて、前記融合ポリペプチドを含む溶出分画試料をＰＢＳまたは２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌで濃縮およびバッファー交換を行った。
融合ポリペプチドの定量分析は、ＵＶ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｇ１１３Ａ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で２８０ｎｍおよび３４０ｎｍの吸光度を測定し、下記の計算式によりタンパク質濃度を算定して行った。各物質の吸光係数は、アミノ酸配列を用いて理論的に計算された値（表５）を使用した。
＊Ｅｘｔｉｎｃｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ（０．１％）：タンパク質濃度が０．１％（１ｇ／Ｌ）であり、Ｐｒｉｍａｒｙ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ上の全てのＣｙｓｔｅｉｎｅが酸化されてジスルフィド結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄ）を形成すると仮定すると、２８０ｎｍでの理論的な吸光度として、ＰｒｏｔＰａｒａｍ ｔｏｏｌ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ／）により計算される。
実施例２．融合ポリペプチドの薬理効果（ｉｎ ｖｉｖｏ）
２．１．試験過程
前記実施例１で生産および精製された融合ポリペプチドの薬理効果をｍｏｕｓｅ（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、６週齢、雄、１００匹；ラオンバイオ（株））で試験した。
２．１．試験過程
前記実施例１で生産および精製された融合ポリペプチドの薬理効果をｍｏｕｓｅ（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、６週齢、雄、１００匹；ラオンバイオ（株））で試験した。
本実施例では前記Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにｈｉｇｈ－ｆａｔ ｄｉｅｔを８週間給餌して肥満を誘導したＤＩＯマウスモデル（Ｍｏｕｓｅ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ－ＤＩＯ、雄、１００匹、１４週齢（高脂肪飼料８週間給餌））を使用した。前記ＤＩＯマウスモデルは、高脂血症、インスリン抵抗性、高血糖などの２型糖尿病の臨床的な特徴を表すので、糖尿病およびインスリン抵抗性の改善効能の評価に幅広く使用される動物モデルであり、肥満、糖尿病および高脂血症などの代謝性疾患研究のために比較すべき基礎資料が多く蓄積されており、本実施形態の薬理効果試験に好適であるので、該モデルを選択した。
前記８週間高脂肪飼料を給餌したマウスモデルに対して２週間の検疫および順化期間を経て、該期間中の毎日１回、一般的な症状を観察して元気で、実験の実施に適合性の要否を確認して健康な動物を選別した。順化期間中には、入手時に動物の尻尾に赤油性ペンを利用して個体表示（ｔａｉｌ ｍａｒｋｉｎｇ）をし、飼育箱には検疫順化期間中の臨時個体識別カード（試験名、個体番号、入庫時期）を付着した。群分離時に動物の尻尾に黒油性ペンを利用して個体表示をし、各ケージ上に個体識別カード（試験名、群情報、個体番号、性別、入庫時期、投与期間）を付着した。
試験物質（融合ポリペプチド）の皮下投与で実験動物が受けるストレスを最少化するために、試験物質投与３日前から１ｍＬ注射器を用いてすべての動物に滅菌蒸留生理食塩水を２００ｕＬ／ｈｅａｄ皮下投与して、皮下投与に対する事前の適応訓練を行った。
検疫および順化期間中に異常が発見されない健康な動物は、順化期間終了後に全個体を対象にして体重および飼料摂取量を測定した。
体重および飼料摂取量を測定し、体重を基準にしてグループ間の２つの測定値の平均が同じであるように群分離を行った。試験物質投与は群分離翌日から開始した。選択されない残余動物は、群分離終了後に試験系から除外した。
前記Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ－ＤＩＯに給餌される高脂肪飼料（高脂肪食；Ｈｉｇｈ ｆａｔ ｄｉｅｔ（ＨＦＤ））の情報は次の通りである：
５．２４ｋｃａｌ／ｇ、脂肪６０重量％、タンパク質２０重量％、およびｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｃａｌｏｒｉｅｓ２０重量％；Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔ Ｉｎｃ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．；Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｎｏ．Ｈｉｇｈ ｆａｔ ｄｉｅｔ（Ｆａｔ ６０ｋｃａｌ％、Ｄ１２４９２）。
５．２４ｋｃａｌ／ｇ、脂肪６０重量％、タンパク質２０重量％、およびｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｃａｌｏｒｉｅｓ２０重量％；Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔ Ｉｎｃ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．；Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｎｏ．Ｈｉｇｈ ｆａｔ ｄｉｅｔ（Ｆａｔ ６０ｋｃａｌ％、Ｄ１２４９２）。
前記飼料は、自由給餌（純化および試験期間の間に給餌）方式で給餌した。
飲水方式は、上水道水をフィルター流水殺菌装置でろ過後、紫外線を照射し、ポリカーボネート材質の飲水瓶（２５０ｍＬ）を用いて自由摂取させた。
２．１．１．ＨＩｇＧ１－ＧＤＦ（ＣＲＬ）ａｎｄ ＩｇＧ１－ＧＤＦ（ＣＲＬ）
試験物質（ＨＩｇＧ１－ＧＤＦ（ＣＲＬ）とＩｇＧ１－ＧＤＦ（ＣＲＬ））と対照物質ＧＤＦ１５（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）投与は、群分離した後翌日から行い、投与時間は毎日午前９時に行った。対照物質および試験物質いずれも皮下投与した。前記対照物質および試験物質の投与経路は、予定臨床投与経路によって皮下経路を選択した。
試験物質（ＨＩｇＧ１－ＧＤＦ（ＣＲＬ）とＩｇＧ１－ＧＤＦ（ＣＲＬ））と対照物質ＧＤＦ１５（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）投与は、群分離した後翌日から行い、投与時間は毎日午前９時に行った。対照物質および試験物質いずれも皮下投与した。前記対照物質および試験物質の投与経路は、予定臨床投与経路によって皮下経路を選択した。
対照物質および試験物質はいずれも投与液量を５ｍＬ／ｋｇとし、個体別投与液量は最近測定した体重を基準にして算出し、使い捨て注射器（１ｍＬ）を用いて試験開始日に１回皮下内に注射投与した。試験物質は、試験開始日に１回のみ投与した。比較のために、対照物質ＧＤＦ１５を投与した対照群を用意し、ＧＤＦ１５を投与した比較群の場合１日１回ずつ５日間総５回投与し、すべての投与は午前９時から行った。
試験群の構成および投与容量などを下記表６に整理した：
前記試験群に対する観察、測定および検査日程は、投与開始日をＤａｙ０とし、投与開始日から７日間を投与１週目とした。
前記検査日程を表７に整理した：
すべての動物に対して１日一回一般的な臨床症状を観察し、１日２回動物の瀕死および死亡の有無を確認し、このような観察は投与１日から投与終了時まで行った。観察時に異常症状がある場合にのみ記録紙に記録した。
試験物質投与開始日（投与前）に各マウスの体重を測定し、その後、毎日体重を測定した（最大９日まで測定）。試験物質投与液量は、最も最近測定した体重を基準にして決定した。
また、マウスに試験物質を投与した後、毎日飼料摂取量を測定し、飼育箱別に電子秤を用いて給餌量を測定した後、残量を測定して１日飼料摂取量を計算した。飼料をひどくかじって食べる個体の場合測定から除外した。
本実施形態で得られた全ての実験結果は平均値±標準誤差で表示し、Ｐｒｉｓｍ５（ｖｅｒｓｉｏｎ５．０１）を使用して検定した。すべての資料に対してｏｎｅ－ｗａｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖａｒｉａｎｃｅ（ＡＮＯＶＡ）を行い、有意性が観察されると対照群との有意差がある試験群を知るためにＤｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｔｅｓｔを行った（有意水準：両側５％および１％、０．１％）。
２．１．２．ＩｇＧ４－ＧＤＦ ａｎｄ ＩｇＧ４－ＧＤＦ（ＣＲＬ）
試験物質（ＩｇＧ４－ＧＤＦおよびＩｇＧ４－ＧＤＦ（ＣＲＬ））と対照物質Ｓｅｍａｇｌｕｔｉｄｅ（Ｂａｃｈｅｍ）全てに皮下投与した。対照物質および試験物質いずれも投与液量を５ｍＬ／ｋｇとし、個体別投与液量は、最近測定した体重を基準にして算出し、使い捨て注射器（１ｍＬ）を用いて試験開始日に１回皮下内に注射投与した。試験物質は試験開始日に１回のみを投与し、比較のために、対照物質Ｓｅｍａｇｌｕｔｉｄｅを投与した対照群を用意し、Ｓｅｍａｇｌｕｔｉｄｅを投与した比較群の場合１日１回ずつ連日投与し、すべての投与は午前９時から行った。
試験物質（ＩｇＧ４－ＧＤＦおよびＩｇＧ４－ＧＤＦ（ＣＲＬ））と対照物質Ｓｅｍａｇｌｕｔｉｄｅ（Ｂａｃｈｅｍ）全てに皮下投与した。対照物質および試験物質いずれも投与液量を５ｍＬ／ｋｇとし、個体別投与液量は、最近測定した体重を基準にして算出し、使い捨て注射器（１ｍＬ）を用いて試験開始日に１回皮下内に注射投与した。試験物質は試験開始日に１回のみを投与し、比較のために、対照物質Ｓｅｍａｇｌｕｔｉｄｅを投与した対照群を用意し、Ｓｅｍａｇｌｕｔｉｄｅを投与した比較群の場合１日１回ずつ連日投与し、すべての投与は午前９時から行った。
試験群の構成および投与容量などを下記表８に整理した：
前記試験群に対する観察、測定および検査日程は投与開始日をＤａｙ０とし、２．１．１項と同様に行った。
試験物質投与開始日（投与前）に各マウスの体重を測定し、その後、毎日体重を測定した（最大１９日まで測定）。試験物質投与液量は、最も最近測定した体重を基準にして決定した。
また、マウスに試験物質を投与した後、毎日飼料摂取量を測定し、飼育箱別に電子秤を用いて給餌量を測定した後、残量を測定して１日飼料摂取量を計算した。飼料をひどくかじって食べる個体の場合測定から除外した。
２．２．体重減少試験結果
２．２．１．ＨＩｇＧ１－ＧＤＦ（ＣＲＬ）ａｎｄ ＩｇＧ１－ＧＤＦ（ＣＲＬ）
前記実施例２．１．１で測定された体重変化を図５および図６、および表９（Ｂｏｄｙ Ｗｅｉｇｈｔ（Ｇｒｏｕｐ、％ ｏｆ ｉｎｉｔｉａｌ）に示す。
２．２．１．ＨＩｇＧ１－ＧＤＦ（ＣＲＬ）ａｎｄ ＩｇＧ１－ＧＤＦ（ＣＲＬ）
前記実施例２．１．１で測定された体重変化を図５および図６、および表９（Ｂｏｄｙ Ｗｅｉｇｈｔ（Ｇｒｏｕｐ、％ ｏｆ ｉｎｉｔｉａｌ）に示す。
図５および表９は、融合タンパク質ＩｇＧ１－ＧＤＦ（ＣＲＬ）１回投与時の体重変化を陰性対照群（ｖｅｈｉｃｌｅ投与群）および陽性対照群（ＧＤＦ１５連日投与群）と比較して示す。また、図６は、図５の結果の中から７日目の結果を抽出して示すグラフである。
前記結果から分かるように、陰性対照群（ｖｅｈｉｃｌｅ投与群）の場合、体重変化が殆どない反面、ＧＤＦ１５連日投与群（Ｄａｙ５から投与中断）の場合には、投与中断後、１日目のＤａｙ６から体重減少効果が見られないことを確認することができた。反面、ＧＤＦ１５（ＣＲＬ）がＩｇＧ１またはＨｉｎｇｅが含まれているＦｃと融合した融合ポリペプチドの場合には、Ｄａｙ０に１回投与後、即時的に体重減少効果が現れ、試験期間（９日間）中に体重減少効果が減少せず持続的に現れ、時間の経過に伴って濃度体重減少効果が増加し、体重減少効果は濃度依存的であることを確認することができた。このような融合ポリペプチドの体重減少効果は、試験期間中にＤＦ１５を１日１回投与した場合に匹敵すると言える。
２．２．２．ＩｇＧ４－ＧＤＦ ａｎｄ ＩｇＧ４－ＧＤＦ（ＣＲＬ）
前記実施例２．１．２で測定された体重変化を図７および表１０（Ｂｏｄｙ Ｗｅｉｇｈｔ（Ｇｒｏｕｐ、％ ｏｆ ｉｎｉｔｉａｌ）に示す。
前記実施例２．１．２で測定された体重変化を図７および表１０（Ｂｏｄｙ Ｗｅｉｇｈｔ（Ｇｒｏｕｐ、％ ｏｆ ｉｎｉｔｉａｌ）に示す。
図７、図８および表１０は、融合タンパク質ＩｇＧ４－ＧＤＦとＩｇＧ４－ＧＤＦ（ＣＲＬ）の１回投与時の体重変化を陰性対照群（ｖｅｈｉｃｌｅ投与群）および陽性対照群（Ｓｅｍａｇｌｕｔｉｄｅ連日投与群）と比較して示す。また、図８は、図７の結果の中から７日目と１４日目の結果を抽出して示すグラフである。
前記結果から分かるように、陰性対照群（ｖｅｈｉｃｌｅ投与群）の場合、体重が若干増加した反面、陽性対照群（Ｓｅｍａｇｌｕｔｉｄｅ連日投与群）は持続的に体重が減少することを確認することができた。ＩｇＧ４－ＧＤＦ１５を単回投与した場合、Ｄｏｓｅに関係なしに最大９日目まで体重減少効果が持続した。反面ＩｇＧ４－ＧＤＦ（ＣＲＬ）を単回１ｎｍｏｌ／ｋｇ投与した場合最大１０日目まで、１０ｎｍｏｌ／ｋｇを単回投与した場合には最大１５日目までずっと体重減少効果が持続的に現れ、時間の経過に伴って濃度体重減少効果が増加し、体重減少効果は濃度依存的であることを確認することができた。また、Ｈｉｎｇｅが含まれていないＩｇＧ４のＦｃ（Ｍｕｔａｔｅｄ）とのＧＤＦ（ＣＲＬ）融合ポリペプチドの場合、Ｈｉｎｇｅが含まれているＩｇＧ４のＦｃ（Ｍｕｔａｔｅｄ）とのＧＤＦ（ＣＲＬ）融合ポリペプチドに比べて同一容量で体重減少効果が優れていることが確認された。このようなＩｇＧ４ Ｆｃ融合ポリペプチドの体重減少効果は、試験期間中にＳｅｍａｇｌｕｔｉｄｅを１日１回投与した場合に匹敵すると言える。
２．３．食餌摂取量の試験結果
２．３．１．ＨＩｇＧ１－ＧＤＦ（ＣＲＬ）およびＩｇＧ１－ＧＤＦ（ＣＲＬ）
前記実施例２．１．１で測定された飼料摂取量の変化を表１１および図９（６日目までの累積摂取量）にそれぞれ示す。
２．３．１．ＨＩｇＧ１－ＧＤＦ（ＣＲＬ）およびＩｇＧ１－ＧＤＦ（ＣＲＬ）
前記実施例２．１．１で測定された飼料摂取量の変化を表１１および図９（６日目までの累積摂取量）にそれぞれ示す。
前記結果から分かるように、ＧＤＦ（ＣＲＬ）Ｈｉｎｇｅが含まれているＩｇＧ１ Ｆｃまたは含まれていないＩｇＧ１のＦｃと融合した融合ポリペプチド投与群の場合、陰性対照群（Ｖｅｈｉｃｌｅ投与群）に比べて試験期間（９日間）中に飼料摂取量の減少効果を示し、飼料摂取量の減少効果は濃度依存的であることを確認することができた。このような融合ポリペプチドの飼料摂取量の減少効果は、試験期間中にＧＤＦ１５を１日１回投与した場合に匹敵すると言える。
２．３．２．ＩｇＧ４－ＧＤＦ ａｎｄ ＩｇＧ４－ＧＤＦ（ＣＲＬ）
前記実施例２．１．２で測定された飼料摂取量の変化を表１２および図１０（７日目まで、１４日目と１９日目の累積摂取量）に示す。
前記実施例２．１．２で測定された飼料摂取量の変化を表１２および図１０（７日目まで、１４日目と１９日目の累積摂取量）に示す。
前記結果から分かるように、ＧＤＦ１５またはＧＤＦ（ＣＲＬ）がＨｉｎｇｅが含まれていないＩｇＧ４ Ｆｃ（ｍｕｔａｔｅｄ）と融合した融合ポリペプチド投与群の場合、陰性対照群（Ｖｅｈｉｃｌｅ投与群）に比べて試験期間（１９日間）中に飼料摂取量の減少効果を示すことを確認することができた。このような融合ポリペプチドの飼料摂取量の減少効果は、試験期間中にＳｅｍａｇｌｕｔｉｄｅを１日１回連日投与した場合に匹敵すると言える。ＧＤＦ１５またはＧＤＦ（ＣＲＬ）がＨｉｎｇｅが含まれていないＩｇＧ４ Ｆｃ（Ｍｕｔａｔｅｄ）と融合した融合ポリペプチド１０ｎｍｏｌ／ｋｇの投与群同士を比較すると、全長ＧＤＦ１５が融合した融合ポリペプチド投与群の場合、食餌抑制能は約１０日ほど持続され、ＧＤＦ（ＣＲＬ）が融合した融合ポリペプチド投与群の場合、食餌抑制能は約２週間ほど持続された。つまり、全長ＧＤＦ１５融合ポリペプチドに比べてＧＤＦ（ＣＲＬ）融合ポリペプチドの場合１０ｎｍｏｌ／ｋｇの容量で体重減少効果が若干優れていることが確認された。
実施例３．融合ポリペプチド（ＩｇＧ４－ＧＤＦまたはＩｇＧ４－ＧＤＦ（ＣＲＬ））の薬物動態学的試験
３．１．試験群および対照群の血清の用意
各ポリペプチドをラットに皮下投与時の薬物動態学的特性評価のために、ポリペプチドＩｇＧ４－ＧＤＦまたはＩｇＧ４－ＧＤＦ（ＣＲＬ）をＳＤ Ｒａｔ（コアテック社製、雄、７週齢、約２５０ｇ；各ｎ＝３；試験群）にそれぞれ２ｍｇ／ｋｇの量で皮下投与して定めた時間に尾静脈を通して約２００ｕｌ程度の採血を行った。採血時間は、融合ポリペプチド投与前、投与後、１、２、４、８、２４、４８、７２、９６、１６８、２４０および３３６時間に行った。薬物動態学的特性の比較のための対照群で、上記と同様の方法でＧＤＦ１５（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を２ｍｇ／ｋｇの量で皮下投与してＧＤＦ１５投与群を用意した。
３．１．試験群および対照群の血清の用意
各ポリペプチドをラットに皮下投与時の薬物動態学的特性評価のために、ポリペプチドＩｇＧ４－ＧＤＦまたはＩｇＧ４－ＧＤＦ（ＣＲＬ）をＳＤ Ｒａｔ（コアテック社製、雄、７週齢、約２５０ｇ；各ｎ＝３；試験群）にそれぞれ２ｍｇ／ｋｇの量で皮下投与して定めた時間に尾静脈を通して約２００ｕｌ程度の採血を行った。採血時間は、融合ポリペプチド投与前、投与後、１、２、４、８、２４、４８、７２、９６、１６８、２４０および３３６時間に行った。薬物動態学的特性の比較のための対照群で、上記と同様の方法でＧＤＦ１５（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を２ｍｇ／ｋｇの量で皮下投与してＧＤＦ１５投与群を用意した。
前記のようにＳＤ Ｒａｔに投与した後、Ｔｉｍｅ－ｐｏｉｎｔ別に採取した血液を遠心分離してＳｅｒｕｍを得て、Ｈｕｍａｎ ＧＤＦ１５ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（ＳＧＤ１５０、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＥＬＩＳＡを行い、各ポリペプチドの時間に応じたｓｅｒｕｍ内濃度を測定した。該資料を利用してＰＫ分析用ソフトウェア（ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（Ｃｅｒｔａｒａ Ｌ．Ｐ．）など）を用いてＡＵＣ（ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｃｕｒｖｅ）を含むＰａｒａｍｅｔｅｒ値を求めた。
３．２薬物動態学的試験の結果
上記で得られた融合ポリペプチドの薬物動態学的パラメータを表１３に示し、時間に応じた融合ポリペプチドの濃度変化を図１１に示す：
上記で得られた融合ポリペプチドの薬物動態学的パラメータを表１３に示し、時間に応じた融合ポリペプチドの濃度変化を図１１に示す：
前記結果から分かるように、ＧＤＦ１５（半減期：１９時間）に比べて、ＩｇＧ４－ＧＤＦ１５（半減期：１０１時間）およびＩｇＧ４－ＧＤＦ（ＣＲＬ）（半減期：１１４時間）融合タンパク質の場合、血液（血清）内安全性が顕著に増加（５倍以上）することを確認することができた。
以上の説明から、本発明の属する技術分野における当業者は、本発明の技術的な思想や必須的な特徴を変更せず、他の実施形態で実施され得ることが理解されるであろう。これに関連して、上述した実施形態はすべての面で例示的なものであり、限定的ではないと理解すべきである。本発明の範囲は、詳細な説明よりも後述する特許請求の範囲の意味および範囲、そしてその等価概念から導出されるすべての変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれると解釈されるべきである。
Claims (21)
- ＧＤＦ１５（Ｇｒｏｗｔｈ／ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ １５）またはその機能的変異体、および
免疫グロブリンのＦｃ領域を含み、
前記免疫グロブリンのＦｃ領域は単一鎖のＩｇＧ１ Ｆｃ領域またはＩｇＧ４ Ｆｃ領域であり、前記ＧＤＦ１５またはその機能的変異体のＮ－末端にフレキシブルペプチドリンカーを介して連結され、
前記ＧＤＦ１５の機能的変異体は、配列番号１のアミノ酸配列のうちの１番目から１４番目までの１４個アミノ酸中の１つ以上が欠失した欠失変異体であり、
前記フレキシブルペプチドリンカーは（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ｎは１、２、３、４または５）で表される、融合ポリペプチド。 - 前記免疫グロブリンのＦｃ領域はヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域である、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
- 前記ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域は、
（１）配列番号５のアミノ酸配列を含むか、
（２）配列番号５のアミノ酸配列のＮ末端に配列番号１０のアミノ酸配列をさらに含む、請求項２に記載の融合ポリペプチド。 - 前記ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域は、
（１）配列番号６～９の中から選択されるアミノ酸配列を含むか、
（２）配列番号６～９の中から選択されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号１１または配列番号１２のアミノ酸配列をさらに含む、請求項３に記載の融合ポリペプチド。 - 前記ＧＤＦ１５の機能的変異体は、配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
- 前記融合ポリペプチド内の免疫グロブリンのＦｃ領域と連結されたＧＤＦ１５またはその機能的変異体は、免疫グロブリンのＦｃ領域と結合しないＧＤＦ１５またはその機能的変異体に比べて、体内半減期が１．５倍以上増加する、請求項１～５のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
- 請求項１～５のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドを２つ含む、融合ポリペプチド二量体。
- 請求項１～５のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドをコードする、核酸分子。
- 請求項８に記載の核酸分子を含む、組換えベクター。
- 請求項９に記載の組換えベクターを含む、組換え細胞。
- 請求項１０に記載の組換え細胞を培養する段階を含む、ＧＤＦ１５またはその機能的変異体および免疫グロブリンのＦｃ領域を含む、融合ポリペプチドの製造方法。
- 単一鎖のＩｇＧ１ Ｆｃ領域またはＩｇＧ４ Ｆｃ領域をＧＤＦ１５またはその機能的変異体のＮ末端にフレキシブルペプチドリンカーを介して連結させる段階を含み、
前記ＧＤＦ１５の機能的変異体は、配列番号１のアミノ酸配列のうちの１番目から１４番目までの１４個アミノ酸中の１つ以上が欠失した欠失変異体であり、
前記フレキシブルペプチドリンカーは（ＧＧＧＧＳ）ｎ［（配列番号１３）ｎ；ｎは、１、２、３、４または５］で表される、ＧＤＦ１５またはその機能的変異体の体内安定性増進方法。 - 前記免疫グロブリンのＦｃ領域はヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域である、請求項１２に記載のＧＤＦ１５またはその機能的変異体の体内安定性増進方法。
- 前記ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域は、
（１）配列番号５のアミノ酸配列を含むか、
（２）配列番号５のアミノ酸配列のＮ末端に配列番号１０のアミノ酸配列をさらに含む、請求項１３に記載のＧＤＦ１５またはその機能的変異体の体内安定性増進方法。 - 前記ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域は、
（１）配列番号６～配列番号９の中から選択されるアミノ酸配列を含むか、
（２）配列番号６～配列番号９の中から選択されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号１１または配列番号１２のアミノ酸配列をさらに含む、請求項１４に記載のＧＤＦ１５またはその機能的変異体の体内安定性増進方法。 - 前記ＧＤＦ１５の機能的変異体は、配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載のＧＤＦ１５またはその機能的変異体の体内安定性増進方法。
- 前記免疫グロブリンのＦｃ領域と連結されたＧＤＦ１５またはその機能的変異体は、免疫グロブリンのＦｃ領域と結合しないＧＤＦ１５またはその機能的変異体に比べて、体内半減期が１．５倍以上増加する、請求項１２～１６のいずれか一項に記載のＧＤＦ１５またはその機能的変異体の体内安定性増進方法。
- 請求項１～５のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド、前記融合ポリペプチドを２つ含む融合ポリペプチド二量体、前記融合ポリペプチドをコードする核酸分子、前記核酸分子を含む組換えベクター、および前記組換えベクターを含む組換え細胞からなる群より選択される１つ以上を含む、体重減少用組成物。
- 請求項１～５のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド、前記融合ポリペプチドを２つ含む融合ポリペプチド二量体、前記融合ポリペプチドをコードする核酸分子、前記核酸分子を含む組換えベクター、および前記組換えベクターを含む組換え細胞からなる群より選択される１つ以上を含む、食餌調節用組成物。
- 請求項１～５のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド、前記融合ポリペプチドを２つ含む融合ポリペプチド二量体、前記融合ポリペプチドをコードする核酸分子、前記核酸分子を含む組換えベクター、および前記組換えベクターを含む組換え細胞からなる群より選択される１つ以上を含む、代謝性疾患の予防または治療用薬学組成物。
- 前記代謝性疾患は、肥満、糖尿病、または非アルコール性脂肪肝疾患である、請求項２０に記載の薬学組成物。
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