CN110066341A

CN110066341A - 蛋白、缀合物、药物组合物、DNA构建体、宿主细胞及制备人SIRPα融合蛋白的方法

Info

Publication number: CN110066341A
Application number: CN201910261473.XA
Authority: CN
Inventors: 罗伯特·亚当·尤格尔; 彭卡·斯拉夫彻娃·斯拉沃娃-皮特洛娃; 厐昕黎
Original assignee: Trillium Therapeutics ULC
Current assignee: Pfizer Inc
Priority date: 2012-12-17
Filing date: 2013-12-17
Publication date: 2019-07-30
Anticipated expiration: 2033-12-17
Also published as: CN105073780A; AU2013362789B2; AU2013362789A1; AU2020202119A1; JP2018148897A; EP2931752B1; RS59591B1; CN110066341B; US20180312563A1; DK2931752T3; US20150329616A1; EP4116331A1; EP3575326A1; PL3575326T3; CA2894245C; HUE047221T2; US9969789B2; US10906954B2; CA2894245A1; EP2931752A1

Abstract

本申请公开了抑制CD47+疾病细胞的生长和/或增殖的蛋白、缀合物、药物组合物、DNA构建体、生产蛋白质的宿主细胞及制备人SIRPα融合蛋白的方法。所述蛋白是由SEQ ID NO.26构成的人SIRPα融合蛋白。该融合蛋白的有效性比缺乏效应子功能的对应物高至少5倍。

Description

蛋白、缀合物、药物组合物、DNA构建体、宿主细胞及制备人 SIRPα融合蛋白的方法

本申请是申请日为2013年12月17日，发明名称为“用SIRPα-Fc融合蛋白处理CD47+疾病细胞”的中国专利申请No.201380073010.1的分案申请。

技术领域

本发明涉及治疗性的Fc融合蛋白，其特别用于治疗具有CD47+疾病细胞的对象。所述融合蛋白基于人SIRPα的胞外区域中的结构域，并且融合了增强该融合蛋白的抗癌效果的Fc区。

背景技术

信号调节蛋白α(SIRPα)是属于免疫球蛋白超家族的跨膜蛋白，并且其是CD47的受体。Ullrich等在US 6541615中描述了人类SIRPα的克隆与表达。Sarfati等在WO1999/040940中以及Van den Berg等在WO00/66159中暗示了SIRPα和CD47参与了癌症及其他疾病的病原学，并且Van den Berg等还提出了SIRPα抑制剂的治疗应用。最近，Jaiswal等在WO2009/091601中提出了CD47抗体在治疗血癌中的应用。SIRPα和CD47之间的相互作用在调节巨噬细胞对白血病细胞和白血病干细胞(LSC)的吞噬作用中起到十分重要的作用。已经示出了阻断抗CD47抗体能够促进巨噬细胞对LSC的吞噬作用。此外，在WO 2010/130053中，Wang等提出了基于SIRPα融合蛋白的癌症治疗。对于治疗免疫功能紊乱，Smith等在US2008/0131431中提出了使用基于CD47的Fc融合蛋白。Raymond等在WO2010/070047中也教导了治疗炎症和免疫功能紊乱。

提供通过SIRPα/CD47轴抑制信号转导的制剂以用于治疗癌症和其他疾病是有用的。

发明内容

本发明提供了作为Fc融合蛋白的SIRPα，其中选择了所述融合蛋白中的成分以使得对CD47/SIRPα轴实现最佳抑制。本发明的发明人已经发现，人SIRPα胞外区内的特定的单一结构域对CD47的结合亲和性大于人SIRPα的完整的胞外区。此外，本发明证明了当恒定(Fc)区具有效应子功能时，SIRPαFc融合蛋白在体内的效力令人惊奇地大幅度提高，尽管对CD47/SIRPα轴的抑制应该不需要这样的活性，并且尽管体外实验表明无效应子的Fc区应该是优选的。

本发明的SIRPαFc融合蛋白还显示了可忽略的CD47激动作用(agonism)，这允许它们在体内作为SIRPα介导的信号转导的专一性抑制剂。作为进一步的特征，所述融合蛋白显示了可忽略的红细胞(red blood cell)结合作用。这与该轴的其他抑制剂形成鲜明对比，例如CD47抗体，其与红细胞强结合，在一些情况下引起血细胞凝集。通过使用本发明的融合蛋白，不需要为了“沉积(sink)”效应来计算剂量，在“沉积”效应中，所施用的药物以RBC结合的形式变得被螯合并且失活，或者不需要为了由RBC相互作用引起的任何不利事件来计算剂量。

在本发明的一个方面，提供了SIRPαFc融合蛋白，其用于抑制SIRPα介导的细胞-结合CD47的刺激作用，该融合蛋白包含：SIRPα蛋白成分，以及与其融合的抗体恒定区(Fc)成分，其中所述SIRPα蛋白成分由人SIRPα的V结构域构成或包含人SIRPα的V结构域，并且Fc成分为具有效应子功能的IgG恒定区。在一些实施方案中，Fc选自IgG1抗体或IgG4抗体的恒定区。

在一个相关方面，提供了一种多核苷酸，其编码作为单链多肽的SIRPαFc融合蛋白的可分泌形式。在另一个相关方面，提供了用于生产SIRPαFc融合蛋白的细胞宿主，该宿主具有被引入并可在其中表达的多核苷酸。以及，在另一个实施方案中，提供了用于获得SIRPαFc融合蛋白的方法，包括培养所述宿主或使所述宿主生长，以及回收作为二聚体蛋白的SIRPαFc融合蛋白。在一些实施方案中，所述宿主为来自任意物种的能使所表达的蛋白糖基化的真核宿主。

在另一个方面，本发明提供了一种药物组合物，其用于治疗具有CD47+疾病细胞的对象，所述组合物包括可药用的载体和能够有效地抑制CD47+疾病细胞的生长或增殖的量的SIRPαFc融合蛋白。

在另一个方面，本发明提供了用于治疗具有CD47+疾病细胞的对象的方法，该方法包括向该对象施用能够有效地抑制所述疾病细胞的生长和/或增殖的量的SIRPαFc融合蛋白。在一个相关方面，本发明提供了SIRPαFc蛋白在治疗其中存在CD47+疾病细胞的癌症或任意其他疾病中的应用。本发明还提供了SIRPαFc蛋白在制备用于治疗其中存在CD47+疾病细胞的癌症或任意其他疾病的药物中的应用。相似地，本发明提供了一种用于处理CD47+疾病细胞的药物组合物，包含SIRPα-Fc蛋白和可药用的载体。在一些实施方案中，疾病细胞为CD47+癌细胞，特别包括CD47+白血病细胞，如AML。

附图说明

现在将结合附图更加详细地描述本发明的这些和其他方面，其中：

图1利用直接结合检验(图1A)和间接竞争检验(图1B)比较了被标示为TTI-602和TTI-616的SIRPα融合蛋白与人CD47的结合。更具体而言，比较了具有单一N端SIRPαV结构域的SIRPαFc(TTI-616)的结合作用和由所有三个(V-C-C)细胞外SIRPα结构域构成的融合蛋白(TTI-602)的结合作用。A)直接结合检验。将CD47+人Jurkat T细胞与滴定的量的TTI-602或TTI-616孵育，并利用多克隆抗IgG抗体通过流式细胞仪分析结合。B)竞争性抑制检验。在滴定的量的冷的竞争物TTI-602或TTI-616的存在下，将Jurkat细胞与生物素化的SIRPαFc(TTI-601)孵育。通过流式细胞仪测定结合，并将结果转化为百分比抑制率，将0％定义为不存在竞争物时的结合。

图2示出了三种不同SIRPα融合蛋白的结合谱(Kd)。所示出的是非常相似的结合谱，其提供了几乎相同的亲和性结合(Kd)值(2.3-2.4nM)。这是预测的，因为所有三种蛋白含有相同的SIRPα区，并且预计Fc区不会影响配体结合。更具体而言，将CD47+人JurkatT细胞与滴定的量的融合蛋白孵育，并利用多克隆抗IgG抗体通过流式细胞仪分析结合。然后标准化几何平均数，并且使用非线性回归使数据拟合单位点结合模型，通过Prism(Graphpad)生成结合曲线和Kd值。

图3(也参见图6)示出了TTI-621和TTI-622表现出相似的促吞噬(pro-phagocytosis)活性，而TTI-616明显较弱(在10nM剂量时特别明显)。这表明野生型IgG4或IgG1Fc区是SIRPαFc引发的通过巨噬细胞的肿瘤细胞杀伤作用最大化所需的。更具体而言，通过在单核细胞集落刺激因子的存在下，培养人外周血CD14+单核细胞至少一周来产生巨噬细胞，然后用干扰素-γ(过夜)和LPS(1h)活化。用CFSE标记OCI/AML-2细胞，并与SIRPαFc融合蛋白以指定浓度孵育30分钟，或与1mM对照Fc蛋白(突变hIgG4 Fc(TTI-401)或hIgG1Fc(TTI-402))孵育30分钟，或是不进行处理(UT)。然后AML-2细胞和巨噬细胞共孵育2小时，巨噬细胞用麦胚凝集素Alexa555缀合物染色，并用共聚焦显微镜分析。将吞噬指数定义为每100个巨噬细胞所吞噬的AML细胞数，每个样品对至少200个巨噬细胞计数。具有突变的hIgG4 Fc区的融合蛋白用白色棒表示，野生型hIgG4用灰色棒表示，野生型IgG1用黑色棒表示。**p<0.05，*p<0.01对同种型对照(单因素ANOVA以及Dunnett’s post-检验)。

图4示出了具有IgG1 Fc区的TTI-621融合蛋白是唯一能够在移植处(注射的股骨)介导抗白血病效应的蛋白。在未注射的骨髓中，有明显的Fc依赖效应，其中TTI-621(完全Fc活性)>TTI-622(低Fc活性)>TTI-616(无Fc活性)。用源于137C g-辐照器的275cGy以亚致死量照射NOD/ShiLtJ-Prkdc^scid(NOD.SCID)小鼠(8-12周龄)，并且在经股骨内注射从人白血病患者收集的AML细胞之前用抗CD122抗体处理(以消耗NK细胞)。移植后三周开始，用SIRPαFc融合蛋白处理小鼠(8mg/kg IP每周三次)，或用相等剂量的对照Fc蛋白TTI-401(突变的人IgG4)或TTI-402(人IgG1)处理。处理四周之后，杀死小鼠，并用流式细胞仪分析注射的股骨中的、未注射的骨髓中的、和脾中的人白血病细胞，染色以观察人CD45和人CD33标记物的表达。以在各腔室中的人CD45+CD33+细胞的百分比来表示AML移入。

图5：将CD47+人Jurkat T细胞与SIRPαFc融合蛋白或对照Fc(3mM)共孵育过夜、或不处理(UT)过夜，然后对Annexin-V染色并用流式细胞仪分析。使用1mM的促凋亡试剂星形孢菌素(Staur)作为阳性对照。含有TTI-602的样品用阻断CD47的抗体B6H12预处理。

图6示出了使用图3中所述的方法得到的结果，但是数据集更详细。

图7A)人红细胞用滴定量的抗CD47抗体B6H12或TTI-616染色并用流式细胞仪分析。B)人红细胞用一组抗CD47单克隆抗体(2D3、B6H12、BRIC126和CC2C6)或SIRPαFc融合蛋白TTI-622染色，并用流式细胞仪分析。每种试剂以之前的优化实验中确定的饱和浓度使用。TTI-401用作对照Fc。所示数据采集自六个提供者。C)AML-2肿瘤细胞用CD47抗体或TTI-622染色，并用流式细胞仪分析。对每种试剂的单一高剂量(660nM)示出数据。

发明详述

本发明涉及人SIRPα蛋白，其为直接或间接与抗体恒定区或Fc区融合的形式。除非另有说明，本发明所使用的术语“人SIRPα”是指野生型、内源的成熟形式的人SIRPα。在人类中，发现SIRPα蛋白主要有两种形式。一种形式(变体1或V1型)的氨基酸序列作为NCBIRefSeq NP_542970.1列出(残基27-504构成成熟型)。另一种形式(变体2或V2型)有13个氨基酸不同并且氨基酸序列在GenBank中作为CAA71403.1列出(残基30-504构成成熟型)。这两种形式的SIRPα构成了存在于人类中的大约80％的各种类型的SIRPα，并且上述这两种形式均被本发明的术语“人SIRPα”涵盖。本发明的术语“人SIRPα”还包括SIRPα的少数形式，其是人类内源性的、并且具有相同的通过与CD47结合而通过CD47引发信号转导的特性。本发明更具体地涉及变体2型或V2。

本发明的SIRPαFc融合蛋白包括位于人SIRPα胞外区域中的三个所谓的免疫球蛋白(Ig)结构域之一。更具体而言，本发明的SIRPαFc蛋白包括人SIRPα的残基32-137(106-mer)，根据目前的命名法，其构成并定义了V2型的IgV结构域。该SIRPα序列如下所示，在本文中称为SEQ ID No.1。

EELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGHFPRVTTVSESTKRENMDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGA[SEQ ID No.1]

在一个优选的实施方案中，SIRPαFc融合蛋白引入了如SEQ ID No.1所述的IgV结构域，除此以外还引入了该SIRPα序列中的相邻的侧翼残基。该优选形式的IgV结构域由V2型人SIRPα的残基31-148表示，其为具有如下所示的SEQ ID No.22的118-mer：

EEELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGHFPRVTTVSESTKRENMDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKPS[SEQ ID No.22]

令人惊奇的是，发现在CD47结合亲和性方面，相对于SIRPα的整个胞外结构域的CD47结合亲和性而言，V2型人SIRPα的活性更高。该结合亲和性比整个胞外结构域的结合亲和性高至少2倍。在一些实施方案中，V2结构域的亲和性比整个胞外结构域高至少3倍、4倍、5倍或更高。在本文实施例1记载的直接结合检验中，引入该SIRPα结构域的融合蛋白的结合亲和性比引入整个SIRPα胞外结构域的融合蛋白的结合亲和性高大约10倍。类似地，在本文实施例1记载的间接竞争检验中，V2/IgV单一结构域融合蛋白提供了比引入SIRPα的整个胞外结构域的融合蛋白更高的CD47结合亲和性。因此，基于该优选的V结构域的SIRPαFc融合蛋白在抑制通过与SIRPα结合而促进的CD47信号转导中有潜力具有更高的有效性。

本发明的SIRPα融合蛋白还引入了具有效应子功能的Fc区。对效应子功能的偏好是完全令人惊讶地，并且用关于CD47/SIRPα轴的现有信息很难解释。可以预料的是，无效应子Fc区的活性足以抑制该轴，并且整合效应子功能不会获得更多的效果。然而，本文特别是实施例5所示的数据清楚地示出，在融合蛋白的体内抗白血病活性方面，效应子活性Fc是有利的。根据实施例4所示的结果，这是特别令人惊奇的，在实施例4中，融合蛋白的体外吞噬活性对于融合蛋白是基于效应子活性的Fc成分还是基于无效应子的Fc成分没有显示出特别的偏好。

因此，在本发明的SIRPαFc融合蛋白中，合适的Fc成分是具有效应子功能的那些。“具有效应子功能”的Fc成分是具有至少某些效应子功能的Fc成分，例如至少对抗体依赖的细胞毒性有一些贡献或锚定补体的一些能力。此外，该Fc至少会结合至Fc受体。这些特性可以通过针对该目的而建立的检验而体现。功能性检验包括检测靶细胞裂解的标准铬释放试验。通过这种确定方式，野生型IgG1或IgG4的Fc区具有效应子功能，而突变为消除了效应子功能(例如通过引入一系列包括Pro233、Val234、Ala235的改变以及删除Gly236(EU))的人IgG4的Fc区被认为不具有效应子功能。在一个优选的实施方案中，Fc基于IgG1同种型的人抗体。这些抗体的Fc区是本领域技术人员容易确认的。在一些实施方案中，Fc区包括下部的铰链-CH2-CH3结构域。

在一个具体的实施方案中，Fc区基于在UniProtKB/Swiss-Prot中作为P01857列出的人IgG1的氨基酸序列，残基104-330，并且具有如下所示的氨基酸序列，本文中记为SEQID No.2：

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*[SEQ ID No.2]

因此，在一些实施方案中，Fc区具有IgG1恒定区的野生型序列或共有序列。在可选的实施方案中，融合蛋白中引入的Fc区来源于具有典型效应子活性恒定区的任意IgG1抗体。这样的Fc区的序列可以对应于例如如下任意IgG1序列(均引自GenBank)的Fc区，例如：BAG65283(残基242-473)、BAC04226.1(残基247-478)、BAC05014.1(残基240-471)、CAC20454.1(残基99-320)、BAC05016.1(残基238-469)、BAC85350.1(残基243-474)、BAC85529.1(残基244-475)和BAC85429.1(残基238-469)。

在其他实施方案中，Fc区具有野生型人IgG4恒定区的序列。在可选的实施方案中，融合蛋白中引入的Fc区来源于具有有效应子活性的恒定区的任意IgG4抗体，所述效应子活性存在但天然地显著弱于IgG1 Fc区。这样的Fc区的序列可以对应于例如如下任意IgG4序列的Fc区：来自UniProtKB/Swiss-Prot的P01861(残基99-327)和来自GenBank的CAC20457.1(残基99-327)。

在一个具体的实施方案中，Fc区基于UniProtKB/Swiss-Prot中作为P01861列出的人IgG4的氨基酸序列，残基99-327，并且具有如下所示的氨基酸序列并且记为SEQ IDNo.23：

ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK[SEQ ID No.23]

在一些实施方案中，Fc区引入一个或多个改变，通常不多于约5个这样的改变，包括影响某些Fc特性的氨基酸置换。在一个具体并优选的实施方案中，Fc区在第228位(EU编号方式)引入改变，其中该位的丝氨酸被脯氨酸置换(S²²⁸P)，由此稳定Fc二聚体内的二硫键。Fc区内的其他改变可以包括改变糖基化的置换，如用甘氨酸或丙氨酸置换Asn²⁹⁷；半衰期增强的改变，如US62777375中教导的T²⁵²L、T²⁵³S和T²⁵⁶F；以及许多其他的改变。特别有用的是在保持构象不变(例如保持Fc受体结合性)的同时能增强Fc特性的那些改变。

在一个具体的实施方案中，在Fc成分为IgG4 Fc的情况中，Fc至少引入了S²²⁸P突变，并且具有如下所示的氨基酸序列并且记为SEQ ID No.24：

ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK[SEQ ID No.24]

因此，本发明提供了有利于抑制人SIRPα与人CD47结合的融合蛋白，从而抑制或减少了通过SIRPα-结合的CD47介导的信号传送，该融合蛋白包含人SIRPα成分，以及与其融合的Fc成分，其中SIRPα成分包含人SIRPαV2的单一IgV结构域或由人SIRPαV2的单一IgV结构域构成，并且Fc成分为具有效应子功能的人IgG恒定区。

在一个实施方案中，融合蛋白包含SIRPα成分，该SIRPα成分至少由V2型的野生型人SIRPα的残基32-137构成，即SEQ ID No.1。在一个优选的实施方案中，SIRPα成分由V2型的人SIRPα的残基31-148构成，即SEQ ID No.22。在另一个实施方案中，Fc成分是记为P01857的人IgG1的Fc成分，在一个具体的实施方案中，具有引入其下部的铰链-CH2-CH3区的氨基酸序列，即SEQ ID No.2。

因此，在一个优选的实施方案中，本发明提供了作为表达的单链多肽和作为分泌的二聚体融合体这两种形式的SIRPαFc融合蛋白，其中该融合蛋白引入了具有SEQ ID No.1(并且优选SEQ ID No.22)的SIRPα成分，以及与其融合的具有效应子功能且具有SEQ IDNo.2的Fc区。当所述SIRPα成分为SEQ ID No.1时，该融合蛋白包含如下所示的SEQ IDNo.3：

EELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGHFPRVTTVSESTKRENMDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*[SEQ ID No.3]

当所述SIRPα成分为SEQ ID No.22时，该融合蛋白包含如下所示的SEQ ID No.25：

EEELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGHFPRVTTVSESTKRENMDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKPSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK[SEQ ID No.25]

在可选的实施方案中，所述融合蛋白的Fc成分基于IgG4，优选基于引入了S²²⁸P突变的IgG4。在融合蛋白引入了SEQ ID No.22所示的优选的SIRPαIgV结构域的情况中，所得的基于IgG4的SIRPα-Fc蛋白具有如下所示的SEQ ID No.26：

EEELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLIPVGPIQWFRGAGPARELIYNQKEGHFPRVTTVSESTKRENMDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKPSESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK[SEQ ID No.26]

在本发明的优选实施方案中，融合蛋白包含SEQ ID No.22所示的序列作为该融合蛋白的SIRPαIgV结构域。优选的SIRPαFc为SEQ ID No.25。

在SIRPαFc融合蛋白中，SIRPα成分和Fc成分直接或间接融合以提供单链多肽，其最终以二聚体形式产生，其中所述单链多肽通过在Fc区内形成的链内二硫键连接。融合区的性质不是关键的。融合可以是两个成分之间直接融合，其中SIRP成分构成融合蛋白的N末端并且Fc成分构成C末端。或者，融合可以通过连接物间接形成，所述连接物由一个或多个氨基酸，理想的是遗传编码的氨基酸构成，如由2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸构成，或者由介于5个和100个之间的氨基酸(例如介于5个和50个之间、介于5个和30个之间、或介于5个和20个之间的氨基酸)中的任意数目的氨基酸构成。连接物可包括由构建有限制酶位点的DNA编码的多肽，所述限制酶位点如BamHI、ClaI、EcoRI、HindIII、PstI、SalI和XhoI位点等。

通常并且理想的是，连接物氨基酸提供一定的柔性，从而使Fc和SIRP成分能够采取其活性构象。允许这样的柔性的残基通常为Gly、Asn和Ser，由此实际上连接物中的这些残基(特别是Gly和Ser)的任意组合都可能提供期望的连接效果。在一个例子中，这样的连接物基于所谓的G₄S序列(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)，其可作为(G₄S)_n重复，其中n为1、2、3或更大；或基于(Gly)n、(Ser)n、(Ser-Gly)n或(Gly-Ser)n等。在另一个实施方案中，连接物为GTELSVRAKPS(SEQ ID No.21)。该序列以C端侧翼连接IgV结构域而构成SIRPα序列(应当理解为该侧翼序列可以被认为是连接物，或者当与上文所述的IgV最小序列连接时可以被认为是IgV结构域的不同形式)。仅仅融合区域或连接物使得所述成分采取其活性构象是必需的，这可以通过用于本领域的任意形式的连接物来实现。

SIRPαFc融合蛋白有利于抑制SIRPα和CD47之间的相互作用，从而阻断通过该轴的信号传递。已知SIRPα通过CD47对巨噬细胞的刺激作用能够通过使肌球蛋白-II和收缩性细胞骨架活性失活来抑制巨噬细胞介导的吞噬作用，所述肌球蛋白-II和收缩性细胞骨架活性参与将目标拉入巨噬细胞。因此，该级联反应的激活对于CD47+疾病细胞的存活是重要的，并且阻断该通路能使巨噬细胞消灭CD47+疾病细胞群。

术语“CD47+”用于表示由本发明的多肽结合的靶细胞的表型。CD47+的细胞可使用CD47抗体作为亲和配体通过流式细胞仪来鉴定。用于该目的的带有合适的标记的CD47抗体是市购可得的(例如克隆B6H12可购自Santa Cruz Biotechnology公司)。用于检验CD47表型的细胞可包括标准肿瘤活组织检查样品，其包括(特别是)从被怀疑具有内源性CD47+癌细胞的对象中获得的血液样品。特别关注的作为本发明的融合蛋白治疗靶标的CD47疾病细胞为“过表达”CD47的那些。这些CD47+细胞通常为疾病细胞，并且在其表面具有密度超过指定细胞类型所具有的正常CD47密度的CD47。不同细胞类型的CD47过表达程度不同，但在本文中是指，(例如)通过本文所示例的流式细胞仪或通过免疫染色或通过基因表达分析等被确定为高于具有CD47表型的相应细胞的对于该细胞类型而言正常可检测水平的任意CD47水平。

因此，对于治疗应用，本发明提供了一种药物组合物，包括可药用的载体和治疗有效量的本发明所述的SIRPαFc融合蛋白。如本文所用，“可药用的载体”是指在蛋白质/抗体制剂领域中任意和所有的生理学相容且有益的溶剂、分散介质、包覆层、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。可药用的载体的例子包括水、盐水、磷酸盐缓冲液、葡萄糖、甘油、乙醇等中的一者或多者、及其它们的组合。在许多情况中，在组合物中优选地包括等渗剂，例如：糖类、多元醇(如甘露醇、山梨醇)或氯化钠。可药用的载体还可包括少量的辅助物质，如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，其增加药学试剂的保质期或有效性。在一些实施方案中，采用治疗抗体制剂领域的实践标准来配制SIRPαFc融合蛋白。适合静脉给药(如注射或输注)的溶液是特别有用的。

可通过将所需量的活性化合物混入适当的溶剂中，根据需要加入上述成分中的一种或组合，然后灭菌微孔过滤，从而制备无菌注射液。通常，通过将活性化合物混入含有基本分散介质的无菌载体，加入所需的选自上文所列举的例子中的其他成分，从而制备分散体。在用于制备的无菌粉末为真空干燥和冷冻干燥(冻干)的情况中，从预先灭菌过滤的溶液中产生活性成分以及任何其他所需成分的粉末。

如本文所用，“有效量”是指经过必要的特定时期达到所需治疗效果的有效剂量。药剂的治疗有效量可根据各种因素而变化，如个体的疾病状态、年龄、性别和重量、以及所述药剂在个体中引起所需反应的能力。治疗有效量还具有如下特性：药剂的治疗有益效果超过药剂的任何毒性或不利影响。

可通过用于蛋白质递送的任何途径向对象施用SIRPαFc融合蛋白，特别是经静脉、皮内和皮下注射或输注、或是经口或鼻内给药。通常以0.5mg/kg至15mg/kg受试者体重的剂量每天施用融合蛋白。应当理解有效量(治疗疾病或病症的有效量，其通过癌细胞或癌细胞团的生长或增殖速度减缓或尺寸减小而体现)根据包括受试者的年龄和总体健康状况、以及待治疗疾病的严重程度等一系列因素而不同。

可与载体材料组合以制备单一剂量形式的活性成分的量会根据待治疗的对象以及给药的具体方式而不同。用于制备单一单位剂量形式所需的活性成分的量通常是组合物产生治疗效果的量。通常，以活性成分和可药用载体的量为100％计，所述有效量为约0.01％至约99％的活性成分，优选为约0.1％至约70％，例如约1％至约30％的活性成分。

可以利用本领域已知的各种方法中的一种或多种，通过一种或多种给药途径来施用本发明的组合物。本领域技术人员将能够理解，给药途径和/或方式根据所需结果的不同而不同。施用本发明所述的融合蛋白的优选途径包括：(例如)通过注射或输注，经静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内、皮下、脊柱或其他肠胃外途径给药。术语“肠胃外给药”包括例如经静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。

可供选择地，本发明的融合蛋白可以通过非肠胃外途径给药，例如，(例如)经鼻内、口腔、阴道、直肠或舌下通过滴注给药或通过局部、表皮或粘膜途径给药。

调整剂量方案以提供最佳的期望响应(例如，治疗响应)。例如，可以施用单一的剂量，或者在一定时间内施用几个分开的剂量，或者该剂量可随着治疗情况而适当地减少或增加。特别有利地是，配制单位剂量形式的肠胃外组合物以易于给药和保证剂量的均一性。本文所用的“单位剂量形式”是指适合作为用于待治疗对象的单位剂量的物理上独立的单位；每个单位包含预定量的、经计算与所需的药用载体一起产生期望的治疗效果的活性化合物。本发明的单位剂量形式的规格由以下来因素确定并且直接取决于以下因素：(a)活性化合物的独特性质以及期望实现的特定治疗效果，以及(b)本领域对于个体治疗敏感性而对利用该活性化合物的固有限制。

对于施用该融合蛋白，单位剂量在约0.0001mg/kg至100mg/kg宿主体重，更通常在0.01mg/kg至5mg/kg宿主体重的范围内。例如，剂量可以为0.3mg/kg体重、1mg/kb体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重，或在1mg/kg至10mg/kg体重的范围内。示例性治疗方案限定每周给药一次、每两周给药一次、每三周给药一次、每四周给药一次、每月给药一次、每三个月给药一次或每三个月至六个月给药一次。本发明融合蛋白的优选的剂量方案包括通过静脉施用1mg/kg体重或3mg/kg体重，其中采用以下给药方案之一施用该融合蛋白；(i)每四周六个剂量，然后每三个月；(ii)每三周；(iii)一次3mg/kg体重，然后每三周1mg/kg体重。在一些方法中，调整剂量以实现血浆融合蛋白浓度为约1ug/ml至1000ug/ml，在一些方法中为约25ug/ml至300ug/ml。

本发明的融合蛋白显示出与血红细胞可忽略的结合。因此，当建立有效剂量方案时，不需要计算RBC“沉积”。相对于与RBC结合的其他SIRPα/CD47抑制剂，预计本发明的SIRP-Fc融合蛋白在小于药物(如CD47抗体)变得与RBC结合所需剂量的一半的剂量下是有效的。

此外，所述SIRPα-Fc融合蛋白是SIRPα介导的信号的专一拮抗剂，当其与CD47结合时其表现出可忽略的CD47激动作用。因此，在建立医学有用的单位剂量方案时，不需要计算由该药物诱导的任何刺激作用。

所述融合蛋白也可以作为持续释放制剂施用，在这种情况中，不需要频繁的给药。剂量和频率根据融合蛋白在患者体内的半衰期而改变。给药的剂量和频率可以根据该处理是预防性的还是治疗性的而改变。在预防性应用中，在长的时间内以较少的时间间隔施用较低的剂量。一些患者在他们的余生中持续接受处理。在治疗性应用中，有时需要以较短的时间间隔施用较高的剂量，直到疾病进程减轻或终止，并且优选直到患者表现出疾病症状部分或完全改善。此后，可以使用预防性方案处理患者。

本发明的SIRPαFc蛋白在处理各种CD47+疾病细胞中是有益的。这些特别包括CD47+癌细胞，包括液体和实体瘤。在一个实施方案中，SIRPαFc蛋白用于抑制血液癌症的生长或增殖。如本文所用，“血液癌症”是指血液的癌症，其中包括白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。“白血病”是指血液的一种癌症，其中产生了过多的对抵抗感染不起作用的白细胞，由此挤占了组成血液的其他部分，如血小板和红细胞。可以理解，白血病的例子分为急性的或慢性的。白血病的某些形式可以为(例如)急性淋巴细胞白血病(ALL)；急性髓细胞白血病(AML)；慢性淋巴细胞白血病(CLL)；慢性粒细胞白血病(CML)；骨髓增殖性失调/肿瘤(MPDS)；和骨髓增生异常综合征。“淋巴瘤”可以指霍奇金淋巴瘤、惰性和侵袭性非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、和滤泡性淋巴瘤(小细胞和大细胞)等。骨髓瘤可指多发性骨髓瘤(MM)、巨细胞骨髓瘤、重链骨髓瘤(heavy chain myeloma)、和轻链骨髓瘤(light chain myeloma)或本斯-琼斯氏骨髓瘤(Bence-Jones myeloma)。

在一些实施方案中，用SIRPαFc蛋白处理的血液癌症为优选选自急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性粒细胞白血病和骨髓增生异常综合征中的CD47+白血病，优选为人急性髓细胞白血病。

在其他实施方案中，用SIRPαFc蛋白处理的血液癌症为选自霍奇金淋巴瘤、惰性和侵袭性非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤(小细胞和大细胞)、多发性骨髓瘤(MM)、巨细胞骨髓瘤、重链骨髓瘤、和轻链骨髓瘤或本斯-琼斯氏骨髓瘤以及平滑肌肉瘤中的CD47+淋巴瘤或骨髓瘤。

实体瘤也可用本发明的融合蛋白处理以减小其尺寸、数量或生长速率以及控制癌干细胞的生长。这样的实体瘤包括位于膀胱、脑、胸、肺、结肠、卵巢、前列腺、肝和其他组织中的CD47+肿瘤。

SIRPαFc蛋白可作为单一疗法单独施用，或是与用于治疗目的适应症的任意其他试剂组合施用。

SIRPαFc蛋白还用于检测CD47+细胞的存在。这可通过首先将该蛋白与检测细胞以及融合蛋白共孵育，然后用可与融合蛋白结合的可检测试剂进行探查、或者直接提供标记形式的融合蛋白来实现。

在另一方面，本发明的特征在于所述融合蛋白与诊断或治疗基团缀合，所述诊断或治疗基团例如可检测的标记物、细胞毒素、药物或放射性毒素。包含一种或多种细胞毒素的缀合物称为“免疫毒素”或药物缀合物。细胞毒素或细胞毒性试剂包括对细胞不利(如杀伤)的任意试剂。实例包括紫杉醇、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、长春新碱、长春花碱、秋水仙碱、阿霉素、道诺霉素、米托蒽醌、光辉霉素和放线菌素D。治疗剂还包括(例如)：抗代谢物(例如氨甲蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤和阿糖胞苷)；烷化剂(例如环磷酰胺、白消安、丝裂霉素C和顺铂)；蒽环类药物(例如道诺霉素和阿霉素)；以及抗生素(例如更生霉素(dactinomycin，前述放线菌素)、博来霉素、光辉霉素和氨茴霉素(AMC))；以及抗有丝分裂剂(例如长春新碱和长春花碱)。

融合蛋白可与其缀合的可检测标记物的非限制性例子包括：荧光素、花青苷、Cy-3、生物素、放射性同位素(包括I-¹²³和I-¹²⁵)等。可通过本领域已知的方法用这样的可检测标记物标记融合蛋白。

可利用本领域已知的连接物技术将细胞毒素与本发明的融合蛋白缀合。已用于将细胞毒素与融合蛋白缀合的连接物种类的例子包括但不限于：含有腙、硫醚、酯、二硫化物和肽的连接物。

本发明的融合蛋白还可与放射性同位素缀合，从而产生细胞毒性放射性药物，也称为放射性缀合物。可与融合蛋白缀合以用于诊断或治疗的放射性同位素的例子包括但不限于：碘¹³¹、铟¹¹¹、钇⁹⁰和镥¹⁷⁷。制备放射性缀合物的方法是本领域已有的。

在一个实施方案中，融合蛋白可以用于检测CD47的水平、或在其膜表面含有CD47的细胞的水平。可以通过例如在允许融合蛋白与CD47之间形成复合物的条件下，将样品(如体外样品)和对照样品与融合蛋白接触来实现利用SIRPαFc融合蛋白检测CD47。检测样品和对照中的融合蛋白与CD47之间所形成的任意复合物，并进行比较。可以对本发明的组合物进行(例如)本领域公知的标准检测方法，例如ELISA和流式细胞法检验。

因此，所述融合蛋白有利于诊断目的，包括样品检测和体内成像，并且有利于治疗目的以治疗以具有CD47上调的疾病细胞为特点的疾病。

对于每种目的，所述融合蛋白可与合适的试剂缀合以形成药物缀合物。适合用于治疗疾病的试剂包括细胞毒试剂，如化疗剂和放疗剂。对于诊断目的，合适的试剂为可检测的标记物，其包括用于全身成像的放射性同位素、和用于样品检测的放射性同位素、酶、荧光素标记物和其他合适的抗体标签。

对于CD47检测，可检测的标记物可以为目前用于体外诊断领域中的各种类型的任意标记物，包括：颗粒标记物，包括金属溶胶(如胶体金)；同位素，如(例如)与N2S2、N3S或N4型的肽螯合剂共存的I¹²⁵或Tc⁹⁹；生色基团，包括荧光标记物、发光标记物、磷光标记物等；以及酶标记物，其将给定底物转化为可检测的标记物；和多核苷酸标签，其通过如聚合酶链式反应在扩增后示出。合适的酶标记物包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等。例如，所述标记物可以为碱性磷酸酶，其通过以下方法检测：使1,2-二氧杂环丁烷底物(如金刚烷基甲氧基磷酰氧基苯基二氧环丁烷(AMPPD)、3-(4-(甲氧基螺{1,2-二氧杂环丁烷-3,2'-(5'-氯)三环{3.3.1.13,7}癸基}-4-基)苯基磷酸二钠(CSPD))、以及CDP和或本领域已知的其他发光底物(如合适的镧系元素如铽(III)和铕(III)的螯合物)转化后，测量化学发光的存在或产生。检测手段由所选的标记物决定。当标记物为颗粒物并以合适的水平积累的情况中，可用裸眼观察标记物或其反应产物的显现，或者使用诸如分光光度计、光度计、荧光计等仪器，均根据标准实践操作。

对于基于SIRPαFc融合蛋白的治疗，细胞毒素可通过非共价相互作用与融合蛋白缀合，但是更期望的是，直接或更优选地通过合适的连接物通过共价连接缀合。在一个优选的实施方案中，所述缀合物包括细胞毒素和融合蛋白。利用以下物质制备融合蛋白和细胞毒素的缀合物：各种双官能蛋白偶联试剂，如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二巯基)丙酸酯、亚胺基硫烷；亚氨酸酯的双官能衍生物，如二甲基己二酰亚胺盐HCl(dimethyladipimidate HCl)；活性酯，如二琥珀酰亚胺辛二酸酯；醛，如戊二醛；双叠氮化合物，如双-(p-重氮苯甲酰基)-乙二胺)；二异氰酸酯，如甲苯2,6-二异氰酸酯；以及双活性氟化合物，如1,5-二氟-2,4-二硝基苯。C¹⁴-标记的1-异硫氰苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)为适合用于放射性核素与抗体缀合的螯合剂。

免疫缀合物的细胞毒素成分可以为化疗剂、治疗抗体、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段、或小分子毒素)、或放射性同位素(如²¹²Bi、¹³¹I、¹³¹In、¹¹¹In、⁹⁰Y和¹⁸⁶Re)、或能够抑制癌细胞生长或增殖的任意其他试剂。

用于产生这样的药物缀合物的化疗剂包括：美登素类化合物，包括DM-1和DM-4、阿里他汀(auristatins)、多柔比星(adriamycin)、阿霉素、表柔比星、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷(“Ara-C”)、环磷酰胺、噻替哌、白消安、细胞毒素、紫杉烷类物质(如紫杉醇和多西他奇)、泰素帝、氨甲蝶呤、顺铂、美法仑、长春花碱、博来霉素、依托泊苷、异环磷酰胺(ifosamide)、丝裂霉素C、米托蒽醌、长春新碱、长春瑞滨、卡铂、替尼泊苷、道诺霉素、洋红霉素、氨基蝶呤、更生菌素、丝裂霉素、埃斯培拉霉素、5-FU、6-硫代鸟嘌呤、6-巯基嘌呤、放线菌素D、VP-16、苯丁酸氮芥、美法仑以及其他相关的氮芥类物质。还包括调控或抑制荷尔蒙对肿瘤的作用的激素类试剂，如它莫西芬和奥那司酮。可使用的毒素及其片段包括：白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、霍乱毒素、肉毒毒素、外毒素A链(来自绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa))、蓖麻毒素A链、相思豆毒素A链、蒴莲根毒素A链、α-八叠球菌素、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素(dianthin)蛋白、美洲商陆蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂、麻风树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草、芦笋抑制剂、白树毒素、皂草素、mitogellin、局限曲菌素、酚霉素、伊诺霉素和单端孢霉烯。小分子毒素包括：例如卡奇霉素、美登素类化合物、水螅毒素和CC1065。

融合蛋白选择性地与目的抗原CD47结合，并且根据本发明的一个方面用于筛选癌症和其他疾病细胞以检测高密度呈现CD47抗原的那些。在一个优选的实施方案中，对取自作为SIRPαFc融合蛋白治疗候选人的受试者的癌细胞样品进行筛选。然后可安排被检测为高密度呈现CD47抗原的癌细胞阳性的受试者使用本发明的融合蛋白或其缀合杂合物来进行治疗。可以与本发明所述的融合蛋白组合，使用标准技术来筛选癌细胞。期望地，该融合蛋白包括可检测的标记物。所述标记物可以自身可被检测到(如放射性同位素标记物或荧光标记物)，或者在酶标记物的情况中，可催化可检测的底物化合物或组合物发生化学改变。可用作可检测的标记物的放射性核素包括(例如)I-¹³¹、I-¹²³、I-¹²⁵、Y-⁹⁰、Re-¹⁸⁸、Re-¹⁸⁶、At-²¹¹、Cu-⁶⁷、Bi-²¹²和Pd-¹⁰⁹。

可利用本发明的抗体或其片段，通过免疫荧光或免疫电子显微技术进行与CD47+癌细胞的结合的原位检测。为了该目的，从患者中取出组织标本，并且对其施用标记形式的融合蛋白，优选将抗体覆盖在生物样品上。该过程还使分布的CD47抗原在活检肿瘤组织中被检测。对本领域技术人员显而易见的是，广泛的各种组织学方法都可用于原位检测。

更具体而言，利用标准检测分析，本发明的SIRPαFc融合蛋白可用于监测在生物样品(如组织活检样品、细胞或体液)中融合蛋白的反应性存在与否。免疫学检验可包括直接检测，并且特别适合筛选大量的样品以检测CD47+癌细胞的存在。例如，所述融合蛋白可在任意标准免疫检验形式(如ELISA、蛋白质印迹、免疫沉淀、流式细胞检验或RIA检验)中用作任何抗体，从而检测复合物的形成。可用于这些检验分析中的直接或间接可视的任何合适的标记物包括但不限于：任何放射性标记、荧光标记、发色标记(如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶)、或化学发光标记、或可利用标记的半抗原特异性抗体可视化的半抗原(例如毛地黄毒苷或生物素)或其他结合伴侣(如亲和素)。示例性免疫检验在如文献“Ausubel etal.，supra,Harlow and Lane,Antibodies:A Laboratory Approach,Cold Spring HarborLaboratory,New York(1988)”以及“Moynagh and Schimmel,Nature 400:105,1999”中有描述。例如，利用本文所述的融合蛋白，利用标准流式细胞法可在细胞表面容易地检测到高密度的CD47。将发现含有标记的复合物的样品与合适的对照样品比较以指示高密度CD47的存在，由此指示可用本发明的融合蛋白治疗的癌症或其他疾病。

应当理解，本发明的融合蛋白包括两个分子，均包含融合有SIRPα蛋白成分和Fc成分的单链多肽。当单链多肽从产生它们的宿主细胞中分泌出来时，Fc成分之间形成二硫键，从而使单链多肽融合以形成二聚体。因此，形成融合蛋白的产物是通过两分子的融合有Fc成分和SIRPα成分的单链多肽之间的二硫键而形成的二聚体蛋白。

因此，本发明不仅提供了其中SIRPα蛋白成分与Fc区(即CH成分)融合的单链多肽，还提供了其中两个拷贝的所述单链多肽通过它们各自的Fc成分而融合的二聚体融合蛋白。其中多于两个拷贝的多肽发生融合的多聚体形式也包括在本发明的范围内。

为了制备本发明的SIRPαFc融合蛋白，获得编码可分泌形式的所述单链多肽的DNA，插入合适的表达/分泌载体，然后转染入合适的生产宿主。培养所得转染子，产生二聚体融合蛋白作为分泌产物，然后可以收集并纯化，所有方法均总体上根据已有的实践以及本文所示例的那些方法进行。类似地，可以获得单链形式的多肽，但是需要在诸如原核生物的宿主中在没有分泌信号的帮助下产生，这样不会发生二聚化，并且该多肽可回收作为细胞内蛋白质。

因此，本发明还提供了表达产生可分泌形式的构成本发明融合蛋白的单链多肽的多核苷酸(包括DNA和RNA)。编码优选且可分泌的单链多肽的多核苷酸包含具有SEQ IDNo.8的DNA序列，其中前90个残基编码天然人SIRPα的30-mer分泌信号，其余核酸残基(SEQID No.7)编码单链FSIRPαFc多肽。一些实施方案包括其中一个或多个密码子被同义密码子置换的多核苷酸，以及所示出的那些。

在相关的实施方案中，提供了编码可分泌形式的基于IgG1的融合蛋白(具有SEQID No.25)的多核苷酸，该多核苷酸包含SEQ ID No.27。本发明还提供了编码可分泌形式的基于IgG4的融合蛋白(具有SEQ ID No.26)的多核苷酸，该多核苷酸包含SEQ ID No.28。

应当理解，可以利用标准基因合成和克隆以及扩增技术从头合成所述多核苷酸，从而装配完整的多核苷酸。或者，例如，可由可用公共来源的下述这些基因，通过PCR扩增来获得编码SIRPα蛋白成分的多核苷酸(例如SEQ ID No.5)以及编码选定Fc成分的多核苷酸(例如SEQ ID No.6)，并且所扩增的多核苷酸可采用连接技术而直接连接，或者通过编码一个或多个不损害生物学活性的氨基酸残基的连接物而连接，均根据已有技术以及本文所示例的那些方法进行。

为了表达，将编码分泌形式的单链多肽的多核苷酸并入载体，如适合在所选的产生融合蛋白的宿主中表达该多核苷酸的质粒。这样的载体可市购获得，并且通常被构建为允许引入编码可分泌的融合蛋白的多核苷酸，该多核苷酸直接受到在该所选宿主中有效启动表达的启动子的控制。宿主细胞的转染方法是本领域已有的，包括载体和用于该载体的表达宿主的表达系统是市售可得的。其包括适合共转染入宿主293、CHO或NSO以在CMV启动子的控制下表达编码融合蛋白的多核苷酸的pcDNA载体(可得自Invitrogen公司)；以及在CMV启动子的控制下用于表达融合蛋白链的、来自宿主293、CHO或NSO的双顺反子RNA的pTandem-1载体系统(也可得自Invitrogen公司)。在本文实施例中所描述的另一个有用的表达系统采用了CMV启动子，并且可购自加拿大蒙特利尔市的生物技术研究所(Biotechnology Research Institute)。

用于本发明的融合蛋白的合适的生产宿主是通过瞬时转染或稳定转染而引入了编码分泌形式的融合蛋白形成用单链多肽的多核苷酸的细胞。融合蛋白的表达形式引入了能使各融合蛋白链从宿主中分泌出来的信号序列，由此使得可以在所产生的融合蛋白链内和之间形成期望的二硫键，从而提供功能性融合蛋白。分泌信号可由在选定宿主中发挥作用的任何这样的信号编码。在一个实施方案中，分泌信号是通常与SIRPα蛋白成分相关的分泌信号。

用于表达本发明的重组融合蛋白的合适的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞，包括dhfr-CHO细胞和CHOcTA细胞)、NSO骨髓瘤细胞、SOS细胞和SP2细胞。在一个具体的实施方案中，宿主为CHO细胞系，如CHO-S细胞系。对于使用NSO骨髓瘤细胞，另一个优选的表达系统为WO 87/04462、WO 89/01036和EP 338,841中公开的GS基因表达系统。通过培养经转染的宿主细胞一段时间，以足以使融合蛋白分泌到宿主细胞生长的培养介质中，从而制备融合蛋白。可利用标准蛋白纯化方法从培养介质中回收融合蛋白，所有操作如本文所示例。

实施例

在如下的描述中，参照融合蛋白的编号。为了方便起见，所述及的融合蛋白的功能性成分总结如下：

表1：

所有人IgG4 Fc区具有使铰链稳定的S²²⁸P突变，除了标记星号(*)的以外。标记为“mut”的IgG4 Fc在233-236位(EU编号系统)含有突变，其进一步降低FcγR的结合(Armouret al，1999Eur.J.Immunol.29:2613)。文献“Weiskopf et al.2013Science 341:88”中记载了^FD6突变(L4V、V6I、A27I、I31F、E47V、K53R、E54Q、H56P、V63I、L66T、K68R、V92I)和CV1突变(V6I、A27I、I31F、E47V、K53R、E54Q、H56P、L66T、V92I)。**市售可得的蛋白质，R&DSystems公司销售(Cat#4546-SA-050)。

1、SIRPα-Fc融合蛋白的制备

利用如下所示的引物，由三段克隆(three-stage cloning)法制备SIRPαFc构建体：

P#5863：GGCGCTAGCCACCATGGAGC SEQ ID No.9

P#5929：GGTGAAGCTCACTGTGTGCTG SEQ ID No.10

P#5930：CAGCACACAGTGAGCTTCACC SEQ ID No.11

P#1035：CCGGATCCTCATTTACCCAG SEQ ID No.12

P#0874：GGACTCAGAGGGTTTGGCACGCACAGA SEQ ID No.13

P#0875：CCCTCTGAGTCCAAATATGGTCCCCCA SEQ ID No.14

P#4197：AGTTTTGTCAGAGGGTTTGGCACGCACAGA SEQ ID No.15

P#4198：AAACCCTCTGACAAAACTCACACATGCCCA SEQ ID No.16

P#1737：CACGGATCCTCATTTACCCGG SEQ ID No.17

P#4195：AGGTGCTGGGCATGGTGGGCATGGGGG SEQ ID No.18

P#4196：CCCCCATGCCCACCATGCCCAGCACCT SEQ ID No.19

P#2058：CACGGATCCTCATTTACCCAGAGACAGGG SEQ ID No.20

在第一组PCR反应中，根据如下反应条件，利用platinum Pfx DNA聚合酶(Invitrogen公司)、1mM MgSO₄、每种dNTP 0.4mM和各引物20pmol，扩增100ng模板DNA(合成的人SIRPα GenBank#AAH26692，得自Blue Heron Biotechnology公司)：

TTI-602：引物P#5863和P#5929；首先在94℃解链5分钟，然后进行30个循环，每个循环为94℃持续1分钟、56℃持续2分钟以及68℃持续2分钟。

TTI-616：引物P#5863和P#0874；首先在94℃解链5分钟，然后进行30个循环，每个循环为94℃持续1分钟、50℃持续1.5分钟以及63℃持续3分钟。

TTI-621：引物P#5863和P#4197；首先在94℃解链5分钟，然后进行30个循环，每个循环为94℃持续0.5分钟、50℃持续1.5分钟以及63℃持续3分钟。

TTI-622：引物P#5863和P#4195；首先在94℃解链5分钟，然后进行30个循环，每个循环为94℃持续0.5分钟、50℃持续1.5分钟以及63℃持续3分钟。

然后将反应在72℃保持10分钟，冷却至4℃。将反应产物电泳通过1-1.4％琼脂糖凝胶，并用溴化乙锭使其可视。

接下来，在如下反应条件下，利用Pfx DNA聚合酶(Invitrogen公司)、1mM MgSO₄、每种dNTP 0.4mM、各引物20pmol和100ng模板DNA(人IgG1和人IgG4，之前克隆获得)，在反应PCR2中扩增IgG Fc片段：

TTI-602：引物P#5930和P#1035；首先在94℃解链5分钟，然后进行30个循环，每个循环为94℃持续1分钟、56℃持续2分钟以及72℃持续2分钟。

TTI-616：引物P#0875和P#1035；首先在94℃解链5分钟，然后进行30个循环，每个循环为94℃持续1分钟、50℃持续1.5分钟以及63℃持续3分钟。

TTI-621：引物P#4198和P#1737；首先在94℃解链5分钟，然后进行30个循环，每个循环为94℃持续0.5分钟、60℃持续0.5分钟以及68℃持续0.5分钟。

TTI-622：引物P#4196和P#2058；首先在94℃解链5分钟，然后进行30个循环，每个循环为94℃持续0.5分钟、50℃持续1.5分钟以及63℃持续3分钟。

最后，在反应PCR3中通过重叠PCR装配SIRPα和Fc的cDNA。在94℃下将PCR1和PCR2的产物(100ng)与platinum Pfx DNA聚合酶(Invitrogen公司)、1mM MgSO₄、每种dNTP 0.4–0.8mM共孵育5分钟，然后进行10个循环，每个循环为94℃持续30秒至1分钟，然后52-60℃持续80秒-3分钟，冷却至4℃。然后向第一反应加入引物(各引物20-40pmol)，并且在如下条件进行第二阶段的反应：在94℃解链5分钟，然后进行30个循环，每个循环为94℃持续30秒-1分钟、50-56℃持续30秒-3分钟、以及30秒。以下详细描述各条件：

TTI-602：利用引物P#5863和P#1035，进行10个循环，每个循环为94℃持续1分钟并且56℃持续3分钟，然后进行30个循环，每个循环为94℃持续1分钟、55℃持续2.5分钟以及72℃持续3分钟。

TTI-616：不进行第一PCR循环；利用引物P#5863和P#1035进行30个循环，每个循环为94℃持续1分钟、50℃持续2分钟以及63℃持续3.5分钟。

TTI-621：利用引物P#5863和P#1737进行10个循环，每个循环为94℃持续1分钟并且52℃持续3分钟，然后进行30个循环，每个循环为94℃持续1分钟、52℃持续2分钟以及63℃持续4分钟。

TTI-622：利用引物P#5863和P#2058进行10个循环，每个循环为94℃持续1分钟并且60℃持续3分钟，然后进行30个循环，每个循环为94℃持续1分钟、52℃持续2分钟以及63℃持续4分钟。

然后将反应在68-72℃保持7-8分钟，冷却至4℃。通过1-1.4％琼脂糖凝胶将反应产物分离，并用溴化乙锭使其可视，并根据如下方式连接入pMPG表达载体(加拿大蒙特利尔市的生物技术研究所)：利用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen公司)，从琼脂糖凝胶中切割并纯化经PCR扩增的目的DNA条带。用NheI和BamHI限制性内切酶(New England BioLabs公司)对经纯化的PCR产物进行酶切，并利用Qiaquick凝胶纯化试剂盒(Qiagen公司)从凝胶中进行纯化。然后用T4 DNA连接酶(Invitrogen公司)将该片段连接入已经相似地经NheI和BamHI酶酶切的pMPG表达质粒。该pMPG质粒使用CMV启动子和TK Poly A终止子，并且含有潮霉素抗性选择标记。然后根据制造商的说明书，用2μl的连接产物转化25μl的感受态E.coliDH5α细胞(Invitrogen公司)。将转化细胞散布在含有100μg/ml氨苄青霉素(Sigma公司)的LB琼脂平板上，然后在37℃下孵育20小时。利用QIAprep Spin mini-prep试剂盒(Qiagen公司)从小规模的E.coli培养物中提取并纯化质粒DNA，并利用荧光染料缀合的ddNTPs(CoreMolecular Biology Facility,York大学)通过自动测序来鉴定DNA序列。为了转染，利用EndoFree Plasmid Maxi试剂盒(Qiagen公司)制备大量的质粒DNA，然后利用荧光染料缀合的ddNTPs(Core Molecular Biology Facility,York大学)通过自动测序再次鉴定序列。

细胞系的制备

利用CHO-S细胞系(Invitrogen公司)产生稳定转染株。简言之，用XbaI(NewEngland BioLabs公司)将分离的质粒DNA线性化，并用QIAGEN柱(Qiagen公司)纯化。CHO-S细胞在补充有8mML-谷氨酰胺和1xHT-补充物的不含血清的化学成分确定的培养基(CD-CHO，Invitrogen公司)中生长，利用Lipofectamine 2000试剂(Invitrogen公司)用线性化的质粒转染该细胞。48小时后，将细胞转移到96孔板中，以在含有600μg/mL潮霉素B(Invitrogen公司)的培养基中的不同浓度(10000、5000或2000个细胞/孔)接种。空白转染对照在相同的方式下进行，但是未向混合物中加入DNA。转染2-3周后，挑取一组抗药性寡克隆，根据如下方法利用ELISA对经48h表达研究的上清进行筛选：用0.1μg/孔的捕获Ab(羊抗人IgGFc)包被96孔板，并在4℃下孵育过夜。洗涤所述孔，并用200μl的含有2％BSA的PBST在室温下封闭所述孔1小时。洗涤后，100μl样品用含有1％BSA的PBST稀释，加入孔中，孵育1小时，洗涤，然后在室温下用HRP偶联的检测Ab(HRP偶联的羊抗人IgGFc)孵育1小时。然后洗涤所述孔，并加入TMB底物(Moss公司)，在室温下孵育3至5分钟。利用iMark微板阅读器(Biorad)在450nm/655nm波长下测量吸光度，并利用已知量的纯化融合蛋白构建标准曲线。在含有600μg/mL潮霉素B的完全CD-CHO培养基中，以更低的细胞浓度(0.1、0.25和0.5个细胞/孔)对3个表达最高的寡克隆进行第二次有限稀释。2-3周后，如上所述通过ELISA对抗药克隆再次进行产生重组蛋白的评价。生产率以pg/细胞/天表示，对于人SIRPα融合蛋白，生产率在1.4至23.9pg/细胞/天的范围内。用表达最高的单细胞克隆在WAVE生物反应器系统中进行上清液批量生产。在一些情况中，在达到单克隆阶段之前，利用最佳的寡克隆进行生产。

蛋白质纯化

为了快速生产小批量蛋白质，在瞬时转染的293F细胞中制备一些SIRPα-Fc批次。简言之，在293F培养基(Invitrogen公司)中培养FreeStyle 293F细胞(Invitrogen公司)，该细胞用非线性的质粒DNA和293Fectin试剂(Invitrogen公司)转染，并以80-100mL/瓶的体积在37℃、5％CO₂下在摇瓶中使其生长3至6天。每天监测细胞密度和生活力直到细胞生活力降至90％。成批收获时细胞生活力在85-90％的范围内。

对于从CHO-S细胞中的纯化，在WAVE一次性袋式生物反应器系统Base20/50EHT(GEHealthcare公司)中由稳定转染的高表达寡细胞克隆或单细胞克隆产生5或10L培养上清。简言之，CHO-S转染株在37℃下在完全生长培养基(补充了8mM L-谷氨酰胺、1xHT-补充物和600μg/mL潮霉素B的CD-CHO)中在静态T150瓶中生长，从而制备足够的细胞数以开始以0.5x10⁶个细胞/mL进行的1L或2L的培养，从而分别进行5L或10L的试验。将细胞接种于生物反应器袋，然后在37℃、10％CO₂下，以摇速15-20rpm、角度7°、气流0.2-0.4Lpm孵育。当培养物达到2至2.5x10⁶个细胞/mL的密度(通常在接种2-3天之内)时，进一步扩大生物反应器至5L或10L，并继续在37℃、10％CO₂下，以摇速15-20rpm、角度7°、气流0.2-0.4Lpm下孵育。当细胞达到1至1.5x10⁶个细胞/mL的密度时，将温度降至30℃，并且培养物进一步在上述条件下继续孵育7至10天。从第0天开始，在30℃下，每两天对培养物供应1％CHO生物反应器供给补充物(feed bioreactor supplement)(Sigma公司)，并且在细胞生活力降至约90％时收获培养物。收集上清液，在4℃下以3000x g离心40分钟，并在-20℃下冷冻直至纯化。

所有蛋白质用两步法纯化，首先采用蛋白A层析。缓冲液置换的上清液用结合缓冲液(20mM Na-P&3M NaCl,pH 7.8)稀释9倍，并在4℃下以2-3mL/分钟的流速(根据上样体积和上样时间确定)装载入rProtein A柱(GE Healthcare公司)过夜。然后所述柱用结合缓冲液洗涤(3mL/分钟，20倍体积)，并用0.1M柠檬酸pH 4.0和pH 2.2以3mL/分钟洗脱蛋白质。洗脱物质以1M调节pH至中性，然后用HiTrap Phenyl HP色谱纯化。简言之，将蛋白质稀释至少4倍至0.2M硫酸铵pH 7.5，并以2-3mL/分钟的流速(根据上样体积和上样时间确定)装载入HiTrap Phenyl HP柱(GE Healthcare公司)。收集流过组分中的未聚集的SIRPαFc蛋白。采用利用BioMax 10膜(Millipore公司)的切向流过滤将蛋白质浓缩并缓冲液置换至PBS pH7.4中。用SDS-PAGE、利用羊抗IgGFc抗体和兔抗羊IgG HRP缀合物的蛋白质印迹以及HPLC分析来确定各蛋白质的品质。利用N端测序和质谱法鉴定所有蛋白质。

1.比较单结构域SIRPαFc融合蛋白和3结构域SIRPαFc融合蛋白

SIRPα由3个细胞外免疫球蛋白(Ig)样结构域构成，然而与CD47的结合定位于N端结构域。为了确定SIRPαFc融合蛋白的最佳SIRPα区，我们制备了引入所有3个细胞外SIRPα结构域(TTI-602)或仅引入单一的N端结构域(TTI-616)的蛋白质。

两种蛋白都是在缺乏效应子功能的突变的人IgG4 Fc骨架上构建的。我们使用直接结合检验(图1A)和间接竞争检验(图1B)比较了TTI-602和TTI-616与人CD47的结合。对于直接结合检验，CD47+人Jurkat细胞分别与不同浓度(如所示出的)的hSIRPαFc蛋白在冰上孵育1小时。然后洗涤细胞以去除任何未结合的蛋白，然后将细胞与抗hIgG Fcg特异性(Fab’)₂FITC抗体在冰上孵育1小时。然后洗涤细胞，并通过与2％多聚甲醛溶液过夜孵育来固定细胞。然后洗掉固定液，并且用流式细胞仪(BD FACScan)分析细胞。采用非线性回归将数据拟合为单一位点结合模型。对于间接检验，将固定化的饱和量的生物素化的人SIRPαFc(TTI-601)单独孵育，或与滴定量的TTI-602或TTI-616在冰上孵育15分钟。然后将该混合物加入人CD47+Jurkat细胞，在冰上孵育1小时，洗涤以除去未结合的蛋白，然后与饱和量的链霉亲和素PE在冰上在黑暗中孵育1h。然后洗涤细胞，如上所述固定并用流式细胞仪分析。对几何平均数进行归一化，其中100％抑制是单独链霉亲和素-PE的几何平均数，0％抑制是单独生物素化的TTI601的几何平均数。通过非线性回归分析，采用S形剂量-反应曲线拟合获得最佳拟合线(Prism,Graphpad)。

图1A和1B中的数据清楚地示出TTI-602和TTI-616之间的结合差异，在两个试验中TTI-616具有更高的结合亲和性。在直接结合检验中，TTI-616的结合亲和性比TTI-602高10倍(EC₅₀值：13.4nm对139nm)。在间接结合检验中，TTI-616的结合亲和性是TTI-602的7倍(EC₅₀值：4.5nM对32.1nM)。这些结果是出乎意料的，因为之前公布的数据显示，SIRPα的N端结构域与包含所有三个胞外结构域的SIRPα具有相当的CD47结合亲和性(Hatherley etal，2007J.Biol.Chem.282:14567)。

2.设计具有不同Fc区的人SIRPαFc融合蛋白

已经确定了引入单个SIRPα结构域的融合蛋白是优选的，本发明进一步进行研究以确定最佳Fc区。制备了三种不同的人SIRPαFc融合蛋白，其含有相同的SIRPα区(31-148)，但是是在具有不同效应子活性的不同Fc成分的基础上构建的。设计细节总结在下表2中。标注的DNA和蛋白质序列在附录1中示出。

表2：人SIRPαFc融合蛋白的设计。

*对应于EU编号系统的228位，旨在稳定IgG4铰链区域并防止导致形成单体的链内二硫键的形成(Angal et al，1993Mol.Immunol.30:105)；

**对应于EU编号系统的233-236位，旨在进一步降低Fcγ受体结合(Armour etal，1999Eur.J.Immunol.29:2613)。

3.SIRPαFc融合蛋白与CD47的结合

比较三种SIRPαFc融合蛋白与细胞表面人CD47的结合。简言之，CD47+人Jurkat细胞分别与不同浓度(如所示出)的hSIRPαFc蛋白在冰上孵育1小时。然后洗涤细胞去除任何未结合的蛋白，然后将细胞与抗hIgG Fcg特异性(Fab’)₂FITC抗体在冰上孵育1小时。然后洗涤细胞，并通过与2％多聚甲醛溶液过夜孵育来固定细胞。然后洗掉固定液，并且用流式细胞仪(BD FACScan)分析细胞。对几何平均数进行归一化，并利用Prism(Graphpad)通过非线性回归将数据拟合为单一位点结合模型生成结合曲线和Kd值。

如图2所示，3种融合蛋白示出非常类似的结合曲线，产生几乎相同的亲和结合(Kd)值(2.3-2.4nM)。这是可以预期的，因为所有三种蛋白均含有相同的SIRPα区，并且预计Fc区不会影响配体结合。

4.SIRPαFc融合蛋白的体外促吞噬作用

用SIRPαFc阻断CD47增强了活化的人巨噬细胞对人急性髓细胞白血病(AML)肿瘤细胞的吞噬作用。在体外比较3种融合蛋白的促吞噬活性从而确定Fc区是否影响AML吞噬作用。首先利用磁性选择(magnetic selection)，从Ficoll纯化的人外周血单核的细胞中分离CD14+单核细胞，由此得到人巨噬细胞。在含20ng/ml人单核细胞集落刺激因子的X-vivo培养基中培养单核细胞至少1周以促进其发育成巨噬细胞。然后将巨噬细胞接种到24孔培养板中的玻片上，并与人干扰素γ过夜孵育。第二天，洗涤所述孔，并加入LPS至少1小时。对人AML细胞计数，并用CFSE标记。标记后，AML细胞在室温下(RT)与PBS、SIRPαFc蛋白或同种型对照孵育15分钟。然后将AML细胞添加到各孔中，混合，并在37℃、5％CO₂加湿细胞孵育器中孵育2小时。孵育后，洗涤所述孔，并在RT下用麦胚凝集素Alexa555缀合物(Invitrogen公司，cat#w32464)标记巨噬细胞15分钟，同时摇动。然后洗涤所述孔，并用2％多聚甲醛在RT下固定30分钟。然后洗涤所述孔，并保留在黑暗、4℃下过夜。用扫描共聚焦显微镜(Quorum Wave FX-X1Spinning Disc共聚焦系统，Quorum Technologies公司，Guelph,ON,加拿大)分析玻片。使用吞噬指数对对AML细胞的吞噬作用进行定量，如下：(巨噬细胞中的AML细胞的数目/巨噬细胞的数目)×100；每个样品计数至少200个巨噬细胞。如图3所示，TTI-621和TTI-622示出相似的促吞噬活性，而TTI-616明显较弱(在10nm的剂量下特别明显)。这表明野生型IgG4或IgG1的Fc区是使SIRPαFc引发的巨噬细胞对肿瘤细胞的杀伤最大化所需的。

利用AML细胞系OCI/AML-2作为靶标评价扩大样本的SIRPαFc融合蛋白的吞噬活性。如图6所示，数据清楚地表明AML-2吞噬的最高水平是由含有单一SIRPα结构域和野生型IgG4或IgG1的Fc区的融合蛋白诱导的(即，TTI-622、-620或TTI-621)。缺乏任何Fc效应子功能的融合蛋白(例如，TTI-616)可以触发吞噬，但效果显著较弱。这与图3报告的数据是一致的。具有三个胞外结构域的SIRPαFc(TTI-601、TTI-602和R&D)也表现出只有低水平的促吞噬活性，并且在R&D融合蛋白的情况中，该差的活性不能通过IgG1 Fc区克服。此外，与具有相同Fc区的野生型SIRPαFc(TTI-616)相比，含有提供显著较高的CD47结合活性的突变SIRPα序列的融合蛋白(TTI-623和TTI-624)不导致更高的吞噬活性。这些结果表明，超过野生型单一SIRPα结构域所能实现的水平的增加的CD47结合亲和性在体外不能导致任何进一步的效果。这一结论是出乎意料的，因为据报道，与IgG4 Fc连接的、FD6和CV1突变的SIRPα比野生型SIRPα-IgG4具有更高的促吞噬活性(Weiskopf et al，2013Science 341:88)。

5.SIRPαFc融合蛋白的体内抗白血病活性

在标准异种移植模型中，检测三种SIRPαFc融合蛋白控制人AML肿瘤细胞生长的能力。用137Csγ-辐照器以275cGy以亚致死剂量辐射NOD/ShiLtJ-Prkdcscid(NOD.SCID)小鼠(8-12周龄)24h，然后股骨内(intrafemoral)注射从人白血病患者收集的AML细胞。从移植后3周开始，用SIRPαFc融合蛋白(8mg/kg，IP，每周三次)或等摩尔剂量的对照Fc蛋白TTI-401(突变的人IgG4)或TTI-402(人IgG1)处理小鼠。处理4周后，处死小鼠，通过流式细胞仪分析，检测被注射的股骨、未注射的骨髓、和脾脏中的人白血病细胞，染色以检测人CD45和人CD33标记物的表达。AML的植入以各腔室的人CD45+CD33+细胞的百分比表示。

如图4所示，具有IgG1 Fc区的TTI-621融合蛋白是唯一能够在移植部位(注射的股骨)介导抗白血病效应的蛋白。在未注射的骨髓中，存在明显的Fc依赖效应，其中TTI-621(全Fc活性)>TTI-622(低Fc活性)>TTI-616(无Fc活性)。所有三种融合蛋白在脾脏中表现出抗白血病活性，虽然该位点的活性测试不太严格(因为其整体植入水平(如对照小鼠中那样)远低于在注射的或未注射的骨髓)。总的来说，这些结果表明，具有人IgG1 Fc区的SIRPαFc蛋白在人AML异种移植模型中具有最大活性。不能基于体外吞噬数据来预料基于IgG1的融合蛋白的较优的体内活性(图2)，在体外吞噬数据中，TTI-621和TTI-622显示出相似的活性。

6.SIRPαFc融合蛋白的血细胞凝集活性

利用来自健康供体的肝素化的全血来制备人红细胞。将4ml全血吸入15ml锥形管中，用磷酸盐缓冲液(PBS)加满，室温下以200x g离心10分钟，以去除血小板。吸去血小板部分后，用PBS加满所述管至15ml，上下颠倒所述管以混合内容物，在1500rpm下离心5分钟使RBC成团。再重复3次洗涤。最后一次洗涤后吸去上清，向成团的红细胞中加入足量的PBS以制备10％RBC溶液(例如，如果得到1ml成团的红细胞，进一步用9mL PBS稀释以制备10％RBC溶液)。存储在4℃的10％RBC溶液在一个星期内是可用的。在进行血细胞凝集检验之前即刻制备新鲜的1％RBC溶液。

对在CHO或293细胞中表达的SIRPαFc蛋白进行分析以检验其使人RBC凝集的能力，这由RBC聚集和抑制形成RBC团来证实。该检验在96孔非组织培养物处理的、低蛋白结合的圆底平板中进行。在进行血细胞凝集检验之前，即刻制备新鲜的1％RBC溶液。将50μL的1％RBC溶液转移到各孔中。向合适的孔中加入50μL每孔的3倍系列稀释(以3μM终浓度开始稀释)的人SIRPa-Fc融合蛋白或载体对照。轻柔地混合所述孔，并在37℃、5％CO₂下孵育过夜。孵育过夜后，对所述平板拍照。在没有交联的情况下，红细胞滚动到孔底部并呈现为紧密的小团。血细胞凝集由存在非固定的RBC来证实，其与界限清楚的RBC团相比外观模糊。引发血细胞凝集的SIRPa融合蛋白会抑制RBC团的形成，由此产生弥漫或模糊的结构。结果表明，与单结构域融合蛋白相比，三结构域的SIRPαFc融合蛋白TTI-601和TTI-602显示出增加的诱导血细胞凝集的倾向。这表明单结构域SIRPαFc在体内导致RBC毒性的可能性低。

7.SIRPαFc融合蛋白的CD47激动活性

人Jurkat T细胞Clone E6-1购自ATCC(CAT#TIB-152)，并在补充有10％FBS、2mML-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、10mM HEPES和1.5g/L碳酸氢钠的RPMI 1640中生长。通过流式细胞仪证明细胞表面结合有抗CD47 mAb clone B6H12、2D3、BRIC126和CC2C6，从而分析CD47的表达。在激动性检验之前，以3x10⁵个细胞/mL的浓度将Jurkat细胞接种在T75/T150组织培养瓶中的完全生长培养基中。

收获高生活力(>95％)的Jurkat T细胞，并以每孔2x10⁵个细胞/200μL铺板于圆底96孔组织培养板的完全生长培养基中。在37℃、5％CO₂下，用单独的培养基或每孔12.5μg/20μL的CD47阻断抗体cloneB6H12预处理细胞1小时。加入3μM终浓度、20μL/孔的SIRPαFc融合蛋白或对照Fc，并且加入1μM 20μL/孔的促凋亡剂十字孢碱作为阳性对照。未处理的细胞(UT)仅加入20μL/孔的培养基。在37℃、5％CO₂下孵育细胞过夜。孵育过夜后，用购自eBiosciences公司的Annexin-V:FITC/7-AAD凋亡检测试剂盒(Cat#88-8005-75)根据制造商的说明对细胞染色，并在染色4小时之内用流式细胞仪分析以检测对凋亡进程的抑制。

如图5所示，与单一结构域融合蛋白TTI-616和TTI-620相比，三结构域融合蛋白TTI-602诱导了明显更高水平的Jurkat凋亡。由于细胞用CD47阻断抗体B6H12进行了预处理以进行中和，因此TTI-602的效果明显是CD47特异的。这些结果表明，在使CD47激动活性最小化方面，单一结构域SIRPαFc融合蛋白优于三结构域SIRPαFc。

8.红细胞结合

对基于CD47的治疗的关注点之一在于靶标在红细胞表面(RBC)的表达，其有潜力作为大的抗原沉积并引起血液学毒性。的确，已经报道，用高亲和性SIRPαFcs变体和CD47特异性抗体处理的动物发生了贫血。因此，用流式细胞仪评价了SIRPαFc融合蛋白与人红细胞的结合。利用肝素化的全血制备人RBC。全血在室温下以200x g离心10分钟以除去血小板。吸去血小板部分后，用PBS加满所述管至原体积，上下颠倒所述管以充分混合内容物，在1500rpm下离心5分钟以使RBC成团。洗涤再重复3至5次。最后一次洗涤后吸去上清，用PBS加满所述管至原血液体积。采用血细胞计数器对RBC计数，并在RBC结合检验之前，以5x10⁸个细胞/mL将RBC重悬。利用流式细胞仪，利用抗人CD235a(eBiosciences公司Cat#12-9978)评价红细胞的纯度。

据观察，含野生型SIRPα序列的融合蛋白与人红细胞的结合非常差，即使在高浓度下，所产生的信号也高于背景不到2倍。相比之下，CD47单克隆抗体的结合通常高于背景超过100倍。SIRPαFc和CD47抗体之间的与RBC结合的显著差异如图7A所示，其中比较了在一系列浓度范围内，TTI-616与CD47抗体B6H12的结合。为了证明这种现象并不是B6H12独有的，对另外三种CD47抗体(2D3、BRIC126和CC2C6)进行了评价。如图7B显示，所有四种抗体以比SIRPαFc显著更高的水平与人RBC结合。注意到无论Fc同种型或单一或三个结构域结构的情况如何，SIRPαFc融合蛋白均较差地与人RBC结合(数据未示出)。此外，由于SIRPαFc和CD47抗体这两种蛋白与AML肿瘤细胞系相似地结合(见图7C)，因此SIRPαFc和CD47抗体对红细胞结合的差异并不是简单地反映出对CD47亲和性的差异。

由这些研究获得了一些出乎意料的结果。首先，与三结构域SIRPαFc相比，单结构域SIRPαFc具有更优的结合亲和性与已公开的文献是不一致的。第二，Fc区在体内消除白血病细胞方面的强的作用与其他人发表的数据不一致，他们提出CD47抗体的有效性归因于阻断了CD47-SIRPα相互作用。同样，不能基于体外吞噬数据来预料TTI-621(IgG1)的更优的体内有效性。此外，单结构域SIRPαFc对红细胞非常低的结合性、以及低的CD47激动活性均支持本文教导的与其他CD47抑制剂相比，SIRPaFc具有更有的医疗用途。

总之，这些数据表明，最佳的人SIRPαFc融合蛋白应当包含与具有效应子功能的Fc区(例如优选地，人IgG1的Fc区，或者合适地，人IgG4的Fc区)连接的单一(N端)SIRPα结构域。

序列表

<110> 特里姆治疗公司（Trillium Therapeutics Inc.）

<120> 蛋白、缀合物、药物组合物、DNA构建体、宿主细胞及制备人SIRPα融合蛋白的方法

<130> FI-191659-59:53

<160> 28

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 106

<212> PRT

<213> 人()

<400> 1

Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala Ala

1 5 10 15

Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Val Thr Ser Leu Ile Pro Val

20 25 30

Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Glu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser Glu

50 55 60

Ser Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Asn Ile

65 70 75 80

Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys Gly

85 90 95

Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala

100 105

<210> 2

<211> 227

<212> PRT

<213> 人()

<400> 2

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Lys

225

<210> 3

<211> 333

<212> PRT

<213> 人()

<400> 3

Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala Ala

1 5 10 15

Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Val Thr Ser Leu Ile Pro Val

20 25 30

Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Glu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser Glu

50 55 60

Ser Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Asn Ile

65 70 75 80

Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys Gly

85 90 95

Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Asp Lys Thr His Thr Cys

100 105 110

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

115 120 125

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

130 135 140

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys

145 150 155 160

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

165 170 175

Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

180 185 190

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

195 200 205

Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

210 215 220

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

225 230 235 240

Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

245 250 255

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

260 265 270

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

275 280 285

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

290 295 300

Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

305 310 315 320

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 4

<211> 375

<212> PRT

<213> 人()

<400> 4

Met Glu Pro Ala Gly Pro Ala Pro Gly Arg Leu Gly Pro Leu Leu Cys

1 5 10 15

Leu Leu Leu Ala Ala Ser Cys Ala Trp Ser Gly Val Ala Gly Glu Glu

20 25 30

Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala Ala Gly

35 40 45

Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Val Thr Ser Leu Ile Pro Val Gly

50 55 60

Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Glu Leu Ile Tyr

65 70 75 80

Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser Glu Ser

85 90 95

Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Asn Ile Thr

100 105 110

Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys Gly Ser

115 120 125

Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val Arg

130 135 140

Ala Lys Pro Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

145 150 155 160

Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

165 170 175

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

180 185 190

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp

195 200 205

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr

210 215 220

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

225 230 235 240

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

245 250 255

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

260 265 270

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys

275 280 285

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

290 295 300

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

305 310 315 320

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

325 330 335

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser

340 345 350

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

355 360 365

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

370 375

<210> 5

<211> 318

<212> DNA

<213> 人()

<400> 5

gaggagctgc aggtgattca gcctgacaag tccgtatcag ttgcagctgg agagtcggcc 60

attctgcact gcactgtgac ctccctgatc cctgtggggc ccatccagtg gttcagagga 120

gctggaccag cccgggaatt aatctacaat caaaaagaag gccacttccc ccgggtaaca 180

actgtttcag agtccacaaa gagagaaaac atggactttt ccatcagcat cagtaacatc 240

accccagcag atgccggcac ctactactgt gtgaagttcc ggaaagggag ccctgacacg 300

gagtttaagt ctggagca 318

<210> 6

<211> 684

<212> DNA

<213> 人()

<400> 6

gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 60

ttcctcttcc caccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 120

tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 180

ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 240

cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 300

tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 360

gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 420

aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 480

tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 540

gacggctcct tcttcctcta tagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 600

aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 660

ctctccctgt ctccgggtaa atga 684

<210> 7

<211> 1035

<212> DNA

<213> 人()

<400> 7

gaggagctgc aggtgattca gcctgacaag tccgtatcag ttgcagctgg agagtcggcc 60

attctgcact gcactgtgac ctccctgatc cctgtggggc ccatccagtg gttcagagga 120

gctggaccag cccgggaatt aatctacaat caaaaagaag gccacttccc ccgggtaaca 180

actgtttcag agtccacaaa gagagaaaac atggactttt ccatcagcat cagtaacatc 240

accccagcag atgccggcac ctactactgt gtgaagttcc ggaaagggag ccctgacacg 300

gagtttaagt ctggagcagg cactgagctg tctgtgcgtg ccaaaccctc tgacaaaact 360

cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc 420

ccaccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg 480

gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 540

gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc 600

agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc 660

tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 720

cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc 780

agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 840

aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 900

ttcttcctct atagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 960

tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg 1020

tctccgggta aatga 1035

<210> 8

<211> 1128

<212> DNA

<213> 人()

<400> 8

atggagcccg ccggcccggc ccccggccgc ctcgggccgc tgctctgcct gctgctcgcc 60

gcgtcctgcg cctggtcagg agtggcgggt gaggaggagc tgcaggtgat tcagcctgac 120

aagtccgtat cagttgcagc tggagagtcg gccattctgc actgcactgt gacctccctg 180

atccctgtgg ggcccatcca gtggttcaga ggagctggac cagcccggga attaatctac 240

aatcaaaaag aaggccactt cccccgggta acaactgttt cagagtccac aaagagagaa 300

aacatggact tttccatcag catcagtaac atcaccccag cagatgccgg cacctactac 360

tgtgtgaagt tccggaaagg gagccctgac acggagttta agtctggagc aggcactgag 420

ctgtctgtgc gtgccaaacc ctctgacaaa actcacacat gcccaccgtg cccagcacct 480

gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc ttcccaccaa aacccaagga caccctcatg 540

atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccctgag 600

gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg 660

gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac 720

tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aagccctccc agcccccatc 780

gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc 840

ccatcccggg atgagctgac caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc 900

tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag 960

accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctatagcaa gctcaccgtg 1020

gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg 1080

cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc ctgtctccgg gtaaatga 1128

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<220>

Claims

1.一种用于抑制CD47+疾病细胞的生长和/或增殖的蛋白，其中所述蛋白是由SEQ IDNO.26构成的人SIRPα融合蛋白。

2.一种用于抑制CD47+疾病细胞的生长和/或增殖的蛋白，其中所述蛋白是包含经由各自的Fc组分融合的两种人SIRPαFc融合蛋白的二聚体，所述两种人SIRPαFc融合蛋白均由SEQ ID No.26组成。

3.一种缀合物，其包含根据权利要求1或2所述的蛋白，以及能被检测的标签或细胞毒素。

4.一种药物组合物，包含可药用的载体和能够有效地抑制CD47+疾病细胞的生长或增殖的量的根据权利要求1至3中任一项所述的蛋白或缀合物。

5.根据权利要求1-3中任一项所述的蛋白或缀合物在制备用于抑制有需要的对象中的CD47+疾病细胞生长或增殖的药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其中所述疾病细胞为CD47+癌细胞。

7.根据权利要求6所述的应用，其中所述疾病细胞为CD47+血液癌细胞。

8.根据权利要求7所述的应用，其中所述疾病细胞为CD47+白血病细胞。

9.根据权利要求8所述的应用，其中所述CD47+白血病细胞是急性淋巴细胞白血病(ALL)细胞、急性髓细胞白血病(AML)细胞、慢性淋巴细胞白血病(CLL)细胞、慢性粒细胞白血病(CML)细胞、骨髓增殖性失调/肿瘤细胞或骨髓增生异常综合征细胞。

10.根据权利要求7所述的应用，其中所述CD47+血液癌细胞是霍奇金淋巴瘤细胞、侵袭性非霍奇金淋巴瘤细胞、惰性非霍奇金淋巴瘤细胞、伯基特淋巴瘤、小细胞滤泡性淋巴瘤细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤细胞。

11.根据权利要求7所述的应用，其中所述CD47+血液癌细胞是多发性骨髓瘤(MM)细胞、巨细胞骨髓瘤细胞、重链骨髓瘤细胞、轻链骨髓瘤细胞或本斯-琼斯氏骨髓瘤细胞。

12.根据权利要求6所述的应用，其中所述疾病细胞为含有CD47+癌细胞的实体瘤细胞。

13.一种DNA构建体，其包含编码根据权利要求1或2所述的蛋白的核苷酸序列。

14.根据权利要求13所述的DNA构建体，其中所述序列编码可分泌形式的所述蛋白。

15.一种生产蛋白质的宿主细胞，包含以可表达的方式引入其中的根据权利要求13或14所述的DNA构建体。

16.一种用于制备人SIRPα融合蛋白的方法，包括培养生产蛋白质的宿主细胞，该生产蛋白质的宿主细胞中引入有用于在其中表达编码根据权利要求1-2中任一项所述的蛋白的DNA构建体。