KR20220163516A - 인간화된, 마우스 또는 키메라 항-cd47 단클론 항체 - Google Patents

인간화된, 마우스 또는 키메라 항-cd47 단클론 항체 Download PDF

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메흐디 라마
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스테파니 팔로
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Abstract

인간화된 마우스 또는 키메라 항-CD47 단클론 항체가 제공된다. 항체는 최적화된 Koff 값을 갖는 인간의 글리코실화된 및 탈글리코실화된 CD47에 결합하여, 인간 CD47-SIRPα 상호작용을 파괴하고, 다양한 치료, 예방 또는 진단 방법에 사용한다. 본 발명은 분리된 항체 및 이의 유도체 및 이의 단편, 하나 이상의 인간화된 또는 키메라 항-CD47 단클론 항체를 포함하는 약학적 제형; 및 상기 단클론 항체를 생산하는 세포주를 포함한다. 항체의 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열도 제공된다.

Description

인간화된, 마우스 또는 키메라 항-CD47 단클론 항체{HUMANIZED, MOUSE OR CHIMERIC ANTI-CD47 MONOCLONAL ANTIBODIES}
인간화된, 마우스 또는 키메라 항-CD47 단클론 항체가 제공된다. 항체는 최적화된 Koff 값을 갖는 인간의 글리코실화된 및 탈글리코실화된 CD47에 결합하여, 인간 CD47-SIRPα 상호작용을 파괴하고, 다양한 치료, 예방 또는 진단 방법에 사용한다. 본 발명은 분리된 항체 및 이의 유도체 및 이의 단편, 하나 이상의 인간화된 또는 키메라 항-CD47 단클론 항체를 포함하는 약학적 제형; 및 상기 단클론 항체를 생산하는 세포주를 포함한다. 또한, 항체의 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열도 제공된다.
대식세포는 병원균을 파괴하고, 식균작용을 통해 혈류의 세포를 손상시키거나 노화시킨다. 세포-표면 CD47은 정상의, 건강한 세포의 식균작용을 억제하기 위해 대식세포인 SIRPα 상에서 그의 수용체와 상호작용한다. CD47은 SIRPα의 NH2-말단 V-유사 도메인을 통해 매개되는 결합을 갖는 SIRPα의 세포 리간드로서 작용하는, 단일 Ig-유사 도메인 및 5개의 막 스패닝 영역을 갖는 광범위하게 발현된 막횡단 당단백질이다. SIRPα는 주로 대식세포, 과립세포, 골수계 수지상 세포(DCs), 비만세포, 및 조혈 줄기세포(HSCs)를 포함한 그들의 전구체를 포함한 골수 세포에서 발현된다.
SIRPα는 대식세포에 의한 숙주 세포의 식균작용을 억제하며, 숙주 표적 세포 상에서 발현되는 CD47에 의한 대식세포 상의 SIRPα의 결찰은 SHP-1에 의해 매개되는 억제 신호를 생성하여 식균작용을 음성적으로 조절한다. SIRPα는 "스스로" 제공하는 신호를 감지하여 상기 세포에 대한 타고난 면역 이펙터 기능을 음성적으로 제어하는 작용을 한다.
정상 세포의 식균작용을 억제하는 CD47의 역할을 유지하면서, 많은 암에서 상향조절된다는 증거가 있다. 암 세포 주에 대한 CD47의 과발현, 예컨대 예를 들면, 골수성 백혈병은 식균작용을 회피시킴으로써 그의 병원성을 증가시킨다. 따라서, CD47 상향-조절은 염증-매개된 동원동안 정상 HSC에 대한 보호를 제공하고 암 세포가 대식세포사멸을 회피하기 위해 선택하는 중요한 메커니즘이다.
본 발명은 개체, 예를 들어 인간에서 암과 같은 질병의 치료를 위한 다양한 바람직한 특성을 나타내는 항-CD47 항체를 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 글리코실화된 및 글리코실화되지않은 CD47에 결합하는 항체에 관한 것으로, CD47에 대한 상기 항체의 결합은 CD47의 글리코실화에 좌우되지 않는다. 일 구현 예에서, 항체는 인간 CD47의 글리코실화된 및 탈글리코실화된 형태에 결합한다. 또 다른 구현 예에서, 인간 CD47의 글리코실화된 형태는 인간 CD47의 아미노산 서열에서 위치 N23, N34, N50, N73, N111 및/또는 N206에 하나 이상의 N-글리코실화 잔기를 포함한다. 인간 CD47의 탈글리코실화된 형태는 N-글리코실화의 제거를 위해 펩타이드 N-글리코시다제(PNGase)로 처리된 글리코실화된 인간 CD47을 포함할 수 있다.
일 구현 예에서, CD47의 글리코실화되지않은 형태 대 글리코실화된 형태에 대한 항체의 결합의 EC50의 비는 4:1, 3:1 또는 2:1 미만, 바람직하게는 4:1 내지 1:4의 범위, 보다 바람직하게는 3:1 내지 1:3, 가장 바람직하게는 2:1 내지 1:2이고; 또는 CD47의 글리코실화되지않은 형태 대 글리코실화된 형태에 대한 항체의 결합의 EC95의 비는 25:1, 20:1 또는 10:1 미만, 바람직하게는 10:1 내지 1:10의 범위, 보다 바람직하게는 9:1 내지 1:9, 가장 바람직하게는 10:1 내지 1:10이다.
또 다른 구현 예에서, 항체는 80 pM 이하, 바람직하게는 70 pM 이하, 보다 바람직하게는 60 pM 이하의 평형 결합 상수로 글리코실화된 및 글리코실화되지않은 CD47 각각에 결합한다.
또 다른 구현 예에서, 글리코실화되지않은 CD47에 대한 항체의 최대 결합능(Bmax2)은 글리코실화된 CD47에 대한 항체의 최대 결합능(Bmax1)의 적어도 60%이다.
바람직하게는, 항체는 약 1.0×10-4 s-1(1/s) 이상의 글리코실화된 및/또는 글리코실화되지않은 CD47에 결합하기 위한 Koff 값을 갖는다. 보다 바람직하게, 항체는 1.0×10-4 s-1 내지 1.0×10-3 s-1의 글리코실화된 및/또는 글리코실화되지않은 CD47에 결합하기 위한 Koff 값을 갖는다. 가장 바람직하게는, 항체는 2.5×10-4 s-1 내지 5.0×10-4 s-1의 글리코실화된 및/또는 글리코실화되지않은 CD47에 결합하기 위한 Koff 값을 갖는다.
다른 양태에서, 본 발명은 CD47에 결합하는 항체를 제공하며, 상기 항체는 1.0×10-4 s-1 내지 1.0×10-3 s-1의 CD47에 결합하기 위한 Koff 값을 갖는다.
인간화된 또는 키메라 항-CD47 단클론 항체에 관한 조성물 및 방법이 제공된다. 본 발명의 항체는 CD47에 결합하고, 독특한 기능적 프로파일을 갖는다. 특히, 상기 항체는 다음의 특징 중 적어도 하나를 갖는다: 인간 CD47-SIRPα 상호작용을 파괴하고, CD47-SIRPα 신호 변환을 억제하고, 특정 CD47 발현 세포의 식균작용을 증가시키고, 세포의 상당한 수준의 응집을 일으키지 않으며, 다양한 치료 방법에 사용되는 기능. 인간 CD47에 결합하고, IgG4 포맷으로 있는 항체가 바람직하다. 인간 CD47에 결합하는 이중특이적 포맷의 항체가 또한 IgG1 포맷일 수도 있는 것이 바람직하다. 높은 Koff 값(빠른 해리 동역학을 시사함), 약한 또는 결핍된 세포사멸 프로파일 및 적혈구 응집 활성(낮은 독성을 시사함)을 갖는 비-활성화 항체가 바람직하다. 또한, 상이한 글리코실화 패턴의 인간 CD47 및/또는 인간 CD47의 탈글리코실화된 형태에 결합하는 항체가 바람직하다. 본 발명의 구현 예는 분리된 항체 및 이의 유도체 및 단편, 하나 이상의 인간화된 또는 키메라 항-CD47 단클론 항체를 포함하는 약학적 제형; 및 상기 단클론 항체를 생산하는 세포주를 포함한다. 항체의 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열도 제공된다.
관심의 항체는 제공된 인간화된, 조작된 또는 키메라 항체 및 이의 변이체를 포함한다. 본 발명의 단클론 항체는 특히 혈액학적 및 고형 종양과 같은 암 치료법에서 인간의 CD47과 관련된 질병의 진단 및 면역요법을 위한 제제로서 특히 유용하다. 본 발명의 단클론 항체의 이점은 인간화 과정에서 유래한다. 따라서, 면역요법을 위한 본 발명의 단클론 항체의 생체 내 사용은 항체에 대한 중요한 숙주 면역 반응의 문제점을 크게 감소시킨다.
다양한 형태의 항체가 본 명세서에서 고려된다. 예를 들어, 항-CD47 항체는 전장 키메라 또는 인간화된 항체, 예를 들어 임의의 이소타입의 인간 면역글로불린 불변 영역, 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA 등 또는 항체 단편, 예를 들어, 단일 사슬 항체, F(ab')2 단편, F(ab) 단편 등일 수 있다. 비록 IgG4 포맷이 분명히 바람직한 형태이지만, 예를 들어, 이미징 목적을 위한 CDR 영역을 포함하는 단편도 관심 대상이다. 이중특이적인 접근법의 경우, IgG1 포맷도 적합할 수 있다. 또한, 항체는 검출가능한 표지로 표지되고, 고체상에 고정화되거나 및/또는 이종 화합물과 접합될 수 있다. 항체는 또한 특히 암 항원을 포함하는 제2 항원과 반응성인 이중특이적 또는 다중특이적 항체로서 제공될 수 있다. 바람직한 이중특이적 항체는 Her-2 항원과 기능적으로 반응성인 항체이다. 바람직한 용도의 이중특이적 항체는 인간 CD47에 결합하는 배지를 갖는 것, 예컨대 예를 들어, 후보물질 20 및 22 및 그의 변이체(예를 들어, 그의 인간화된 버전)이다.
특히 CD47을 발현하는 바람직하지 않은 세포의 검출 및 제거와 관련하여 항체에 대한 진단 및 치료 용도가 고려된다. 하나의 진단 용도에서, 본 발명은 CD47-발현 암 세포를 함유하는 것으로 의심되는 환자 샘플을 항-CD47 항체에 노출시키는 단계 및 샘플에 대한 항체의 결합을 측정하는 단계를 포함하는, CD47-발현 암 세포의 존재를 측정하는 방법을 제공한다. 상기 용도로, 본 발명은 항체 및 항체를 사용하기 위한 설명서를 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명의 항체는 특히 질병의 치료, 예를 들어 CD47-발현 세포의 식균작용을 증가시키는데 효과적이다. 치료는 종양 내 주사 등에 의한 전달과 같이, 전신적이거나 국부적일 수 있다.
본 발명의 구현 예는 통상적으로 인간 가변 영역으로부터의 프레임워크 서열과 조합하여, 본원에서 제공되는 바와 같은 적어도 3개의 CDR 서열을 포함하는 분리된 항체 및 그의 유도체 및 단편을 포함한다. 일부 구현 예에서, 항체는 제한없이, 인간 또는 마우스 가변 영역 프레임워크일 수 있는 가변 영역 프레임워크에 위치한 본원에서 제공되는 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함하는 1개 이상의 경쇄 및 제한없이, 인간 또는 마우스 가변 영역 프레임워크일 수 있는 가변 영역 프레임워크에 위치한 본원에서 제공되는 3개의 중쇄 CDR 서열을 포함하는 1개 이상의 중쇄를 포함한다.
다른 구현 예에서, 항체는 제공된 항체의 CDR의 아미노산 서열 변이체를 포함하며, 이 변이체는 CDR 잔기내에 또는 인접한 하나 이상의 아미노산 삽입(들) 및/또는 CDR 잔기내에 또는 인접한 결실(들) 및/또는 CDR 잔기(들)의 치환(들)을 포함한다(상기 치환(들)은 상기 변이체를 생성하기 위한 아미노산 변형의 바람직한 유형임). 상기 변이체는 일반적으로 인간 CD47-SIRPα 상호작용을 파괴하는, 인간 CD47에 대해 적어도 약 10-8M의 결합 친화도, 예컨대 예를 들어 인간 CD47에 대해 2 nM 내지 15 nM의 결합 친화도를 가질 것이며, 본원에 기술된 것의 아미노산 서열을 갖는 항체와 동일한 에피토프에 결합할 것이다. 다양한 형태의 항체가 본 명세서에서 고려된다. 예를 들어, 항체는 임의의 이소타입의 인간 면역글로불린 불변 영역을 갖는 전장 항체, 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, 보다 바람직하게는 돌연변이(들)을 갖는 IgG4 또는 항체 단편, 예를 들어, F(ab')2 단편, F(ab) 단편 등일 수 있다. 더욱이, 항체는 검출가능한 표지로 표지되거나, 고체상에 고정화되거나 및/또는 이종 화합물과 접합될 수 있다.
본 발명의 구현 예는 (i) 항체 이소타입(및 이펙터 기능)에 관계없이 인간 CD47-SIRPα 상호작용의 강력한 파괴를 갖고, (ii) 인간 단핵구-유래된 대식세포에 의한 CD47-발현 종양 세포의 효율적인 식균작용을 가능하게 하고, (iii) (낮은 싱크 효과 및 고밀도 CD47-보유 암 세포에 대한 항체의 보다 높은 가용성을 가능하게 하는) 1.0×10-4 s-1 내지 1.0×10-3 s-1의 최적화된 Koff 값을 갖고, 및/또는 (iv) 표적 CD47을 과발현하는 이종이식 마우스 모델에서 종양 성장의 억제를 나타내는 항-CD47 항체를 포함한다. 본 발명의 바람직한 구현 예는 부가적으로 낮은 독성을 시사하는 약한 적혈구 응집 활성을 추가로 나타내거나(후보물질 19, 33, 20) 및/또는 Jurkat 세포의 세포사멸을 유도하지 않는(또는 약간만 유도하는)(후보물질 7, 19, 20, 22, 33) 항-CD47 항체 그룹이다. 또한, 본 발명의 더욱 바람직한 양태는 세포외로 글리코실화된 및 글리코실화되지않은 CD47에 추가로 결합하거나 또는 그의 면역학적으로 활성이고 글리코실화된 및 글리코실화되지않은 그의 단편에 결합하는 항-CD47 항체 그룹이다. 또한, 본 발명의 보다 바람직한 구현 예는 CD47의 단량체 및 이량체를 결합하는 항-CD47 항체 그룹이다. 또한, 본 발명의 보다 바람직한 구현 예는 SEQ ID NO: 151에 따라 넘버링된 경우, CD47 상의 특정 에피토프, 즉 특히 인간 CD47의 K59, R63, Y66, T67, H108, T109, T117 및 T120을 포함하는 불연속적 에피토프에 결합하는 항-CD47 항체 그룹이다(예를 들어, 후보물질 20 및 그의 인간화된 및 조작된 버전). 본 발명의 구현 예의 또 다른 예는 SEQ ID NO: 151에 따라 넘버링된 경우, CD47 상의 특정 에피토프, 즉 특히 인간 CD47의 K59, K61, S107, H108, T117, T120 및 R121을 포함하는 불연속적 에피토프에 결합하는 항-CD47 항체 그룹이다(예를 들어, 후보물질 22 및 그의 인간화된 및 조작된 버전).
본 발명의 구현 예는 (i) 항체 이소타입(및 이펙터 기능)에 관계없이 인간 CD47-SIRPα 상호작용의 강력한 파괴를 갖고, (ii) 인간 단핵구-유래된 대식세포에 의한 CD47-발현 종양 세포의 효율적인 식균작용을 가능하게 하고, (iii) (낮은 싱크 효과 및 고밀도 CD47-보유 암 세포에 대한 항체의 보다 높은 가용성을 가능하게 하는) 1.0×10-4 s-1 내지 1.0×10-3 s-1의 최적화된 Koff 값을 갖고, (iv) 표적 CD47을 과발현하는 이종이식 마우스 모델에서 종양 성장의 억제를 나타내고, 및/또는 (v) 하기 표 2 및 표 3에 기술된 바와 같은 CDR 조합을 나타내는 항-CD47 항체를 포함하며, 1개 이상의 CDR내 5 이하, 보다 바람직하게는 4, 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산이 다른 아미노산, 예를 들면, 보존적 치환과 같이 다른 아미노산에 의해 치환되고, 그러나 상기 요소 (i) 내지 (iv)와 같은 항체의 전체 프로파일은 즉, 표준 생물학적 변이의 10% 범위 내에서 변경되지 않거나 유사하다.
본 발명은 추가로: 항체 및 그의 변이체를 코딩하는 분리된 핵산; 벡터로 형질전환된 숙주 세포에 의해 인식되는 조절 서열에 선택적으로 작동가능하게 연결된 핵산을 포함하는 벡터; 그 벡터를 포함하는 숙주 세포; 핵산이 발현되도록 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 임의로 숙주 세포 배양물로부터(예를 들어, 숙주 세포 배양 배지로부터) 항체를 회수하는 단계를 포함하는 항체의 생산 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 항-인간 CD47 항체 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제 중 하나 이상을 포함하는 조성물을 제공한다. 상기 치료용 조성물은 무균이며, 동결건조될 수 있으며, 희석제 및 전달 장치, 예를 들어, 흡입기, 주사기 등과 함께 단위 투여량으로 예비-팩(pre-pack)으로 제공된다.
본 발명의 항-CD47 항체는 인간에서 암과 같은 질병의 치료를 위한 다양한 바람직한 특성을 나타낸다.
첨부한 도면은 일정한 비율로 도시되는 것은 아니다. 도면은 단지 예시적인 것이고, 공개를 가능하게 하기 위해 요구되지는 않는다. 명확하게 하기 위해 모든 구성요소가 모든 도면에 표시되는 것은 아니다. 도면에서:
도 1 항-CD47 항체에 의한 CHO 세포 상에 발현된 hCD47에 대한 hSIRPα 결합의 억제.
도 2 Raji 세포 상에 발현된 hCD47에 대한 항-CD47 항체의 결합 프로파일.
도 3 항-CD47 항체에 의한 Raji 세포 상에 발현된 hCD47에 대한 hSIRPα 결합의 억제.
도 4 항-CD47 항체를 갖는 인간 대식세포에 의한 Raji 세포 식균작용의 증진.
도 5 항-CD47 항체에 의한 정제된 인간 RBC의 응집.
도 6 SPR에 의해 측정한 hCD47과 항-CD47 항체의 결합 및 해리의 프로파일.
도 7 후보물질 20의 마우스 VH 서열(VH0)의 서열과 정렬된 5개의 인간화된 VH 변이체(VH1 내지 VH5)의 아미노산 서열. CDR은 밑줄이 그어져 있다(KABAT와 IMGT의 결합된 정의를 사용).
도 8 후보물질 20의 마우스 VL 서열(VL0)의 서열과 정렬된 5개의 인간화된 VL 변이체(VL1 내지 VL5)의 아미노산 서열. CDR은 밑줄이 그어져 있다(KABAT와 IMGT의 결합된 정의를 사용).
도 9 A) NOG 마우스에서 인간 Raji 림프종 세포의 성장 및 B) Raji 종양 세포 이식 후 NOG 마우스의 생존에 대한 항-CD47 항체의 효과(*p<0.05; **p<0.005; Mantel-Cox 시험).
도 10 NOG 마우스에서 A2780/Luc 인간 난소 종양의 성장에 대한 항-CD47 후보물질 20 단독 또는 Herceptin® 또는 Erbitux®와의 조합의 효과. NOG 마우스에 A2780/Luc 세포를 복강내(IP)로 이식하고(n=4/그룹), 10 mg/kg에서 최대 5주(3회/주, IP) 이식 후 1일에 항체 처리를 시작하였다. (A) 28일에 각 마우스에서 관찰되는 복부 및 등부분 발광. (B) 종양 이식 후 시간에 대해 플롯팅된 생체발광 강도(등부분 + 복부)의 정량화. 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 소프트웨어의 독립표본 t-검정(unpaired t-test)(**p<0.005; ***p<0.001)을 사용하여 치료 그룹을 28일째에 비히클 그룹과 비교하였다.
도 11 NOG 마우스에서 A549 인간 폐 종양 세포의 성장에 대한 항-CD47 후보물질 20 단독 또는 Herceptin® 또는 Erbitux®와의 조합의 효과. A549 세포를 NOG 마우스에 피하 이식하고(n=4/그룹), 종양이 만져졌을 때(10일) 최대 10주(3회 주사/주, IP)동안 10 mg/kg으로 항체 처리를 시작하였다. (A) 종양 이식후 시간에 대해 플롯팅된 각 그룹의 평균 종양 체적 +/- SD(cm3)에 의해 측정된 종양 세포 성장. 처리 그룹을 Hather et al.(Hather G., Liu R., Bandi S., Mettetal J., et al. "Growth Rate Analysis and Efficient Experimental Design for Tumor Xenograft Studies." Cancer Informatics 13(S4):65-72 (2014))에 의해 기술된 속도-기반 T/C 방법을 사용하여 비히클 그룹과 비교하였다(*p<0.05; **p<0.005). (B) 마우스의 생존 곡선. 그래프패드 프리즘 소프트웨어의 로그-순위(Log-rank)(맨텔-콕스(Mantel-Cox)) 시험을 사용하여 처리 그룹을 비히클 그룹과 비교하였다(*p<0.05; **p<0.01).
도 12 유동 세포계측법에 의한 Raji 세포에 대한 항-CD47 후보물질 20의 인간화된 변이체의 결합. VL-CDR2-F56Y 돌연변이(SEQ ID Nos: 152(Kabat) 및 153(IMGT)를 갖는 CDR2, 즉 후보물질 20.26(h20-H2-L5Y), 20.27(h20-H3-L2Y), 20.28(h20-H3-L3Y), 20.29(h20-H4-L4Y), 20.30(h20-H4-L5Y))를 갖는 인간화된 변이체를 F56Y 돌연변이 후보물질 20.10(h20-H2-L5), 20.12(h20-H3-L2), 20.13(h20-H3-L3), 20.19(h20-H4-L4), 20.20(h20-H4-L5)) 없고, 키메라 후보물질 20(인간 IgG4 포맷의 모든 항체)을 갖는 대응 변이체와 비교하였다.
도 13 항-CD47 후보물질 20의 인간화된 변이체에 의해 Raji 세포 상의 hCD47에 대한 hSIRPα 결합의 억제. VL-CDR2-F56Y 돌연변이(SEQ ID Nos: 152(Kabat) 및 153(IMGT)를 갖는 CDR2, 즉 후보물질 20.26(h20-H2-L5Y), 20.27(h20-H3-L2Y), 20.28(h20-H3-L3Y), 20.29(h20-H4-L4Y), 20.30(h20-H4-L5Y))를 갖는 인간화된 변이체를 F56Y 돌연변이 후보물질 20.10(h20-H2-L5), 20.12(h20-H3-L2), 20.13(h20-H3-L3), 20.19(h20-H4-L4), 20.20(h20-H4-L5)) 없는 대응 변이체와 비교하였다.
도 14 CD47 결합 분석 및 Raji 세포에 대한 CD47/SIRPα 상호작용 분석에서, 후보물질 20(즉 후보물질 20.26(h20-H2-L5Y), 20.27(h20-H3-L2Y), 20.28(h20-H3-L3Y), 20.29(h20-H4-L4Y), 20.30(h20-H4-L5Y))의 VL-CDR2-F56Y 인간화된 변이체의 항체 AB06.12 및 Hu5F9와의 비교.
도 15 후보물질 20과 hCD47 사이의 상호작용의 에피토프 매핑.
도 16 후보물질 22와 hCD47 사이의 상호작용의 에피토프 매핑.
도 17 SEC-HPLC에 의한 가용성 hCD47의 분석은 CD47의 단량체 및 이량체의 존재하에 단백질 제조과정에서 이종성을 보였다.
도 18 ~30kDa 및 >50kDa에서 각각, 정제된 hCD47 단량체 및 이량체 분획의 SDS-PAGE 분석.
도 19 ELISA 결합에 의한 후보물질 20 및 22에 의한 hCD47 단량체 및 이량체의 인식.
도 20 RBC 결합 후 항-CD47 항체 방출. 인간 RBC는 +4℃에서 1 μg/mL의 마우스 항-CD47 후보물질 14, 19, 20, 22에 의해 또는 마우스 2A1 또는 B6H12 항체에 의해 먼저 염색되었다. 세척 후, RBC는 무-항체 배지에서 +37℃에서 6시간(T+6h) 또는 24시간(T+24h) 동안 배양하고, RBC 상에 고정된 잔류수준 마우스 항-CD47 항체는 PE-접합된 항-마우스 IgG 항체 및 유동 세포계측법을 사용하여 나타냈다. 상기 결과는 6시간 및 24시간 배양 전에(T0), 동일한 항체를 갖는 RBC의 염색에 대해 수득된 MFI와 비교된, 항-CD47 항체로 염색된 RBC 상에서 T+6h 또는 T+24h에 측정된 평균 형광 강도(MFI)의 감소%로 표현되었다.
도 21 Raji 세포에 결합한 후의 항-CD47 항체의 방출 및 항-CD47 항체에 의한 염색 후의 Raji 종양 세포의 식균작용의 감소. (A) Raji 림프종 세포는 1 μg/mL의 마우스 항-CD47 후보물질 14, 19, 20, 22 또는 마우스 2A1 또는 B6H12 항체로 먼저 염색되었다. 세척 후, Raji 세포는 무-항체 배지에서 +37℃에서 24시간(T+24h) 동안 배양하고, 그다음 세척하고 PFA 4%로 고정시켰다. Raji 세포 상에 고정된 마우스 항-CD47 항체의 잔류 수준은 PE-접합된 항-마우스 IgG 항체 및 유동 세포계측법을 사용하여 나타냈다. 상기 결과는 24시간 배양 전에(T0), 동일한 항체를 갖는 PFA-고정된 Raji 세포의 염색에 대해 수득된 MFI와 비교된, 항-CD47 항체로 염색된 세포 상에서 T+24h에 측정된 평균 형광 강도(MFI)의 감소%로 표현되었다. (B) CFSE-표지된 Raji 림프종 세포는 0.1 또는 1 μg/mL 마우스 항-CD47 후보물질 14, 19, 20, 22 또는 마우스 2A1 또는 B6H12 항체로 먼저 염색되었다. 세척 후, Raji 세포를 무-항체 배지에서 +37℃에서 24시간(T+24h) 동안 배양한 후, 세척하고 Far-Red-표지된 인간 대식세포(hMDM)를 이용한 유동 세포계측법으로 식균작용 분석법에서 검사하였다. 결과는 24시간 배양 기간 전에(T0) 동일한 항체로 염색한 Raji 세포의 식균작용과 비교되는, 항-CD47 항체로 염색한 Raji 세포에 대해 T+24h에서 측정한 식균작용의 감소%로 나타내었다.
도 22 글리코실화된 또는 N-탈글리코실화된 hCD47로 코팅된 플레이트상에서 ELISA로 측정한 키메라 후보물질 20 및 22, 인간화된 h20-H2L5Y 항체 및 인간화된 Hu5F9 및 AB06.12 항체에 의한 인간 글리코실화된(A) 및 N-탈글리코실화된(B) CD47의 인식. 모든 항체를 hu-IgG4 포맷으로 검사하였다.
도 23 NOG 마우스의 A549 NSCLC 이종이식 모델에서, 인간화된 h20-H2L5Y 항체 단독 또는 Herceptin®과의 조합의 효능. A549 세포를 NOG 마우스(그룹당 n=8)에 피하 이식하고, 최대 10주 동안 종양이 약 100 mm3(14일)인 경우 항체 치료를 시작했다. 항체는 IP(3회 주사/주)로 주사입하고, 10 mg/kg/투여량의 hu-IgG4 포맷(h20-H2L5Y-G4)으로 h20-H2L5Y를 주사하고, 2.5 mg/kg/투여량으로 Herceptin®(hu-IgG1)를 주사입하였다. 마우스의 생존을 모니터링하고, 생존 곡선을 제공한다. 그래프패드 프리즘 소프트웨어의 로그-순위(맨텔-콕스) 시험을 사용하여 처리 그룹을 비히클 그룹과 비교하였다(*p<0.05; ***p<0.005). Herceptin® 단독 투여한 그룹(p<0.01)과 비교했을 때 h20-H2L5Y-G4와 Herceptin®을 조합하여 치료받은 마우스의 생존율이 유의하게 향상되었다.
도 24 NOG 마우스의 NCI-N87 위의 이종이식 모델에서 인간화된 항체 h20-H2L5Y 단독 또는 Herceptin®과의 조합의 효능. NOG 마우스(그룹당 n=8)에 NCI-N87 세포(10×106)를 피하 이식하고, 최대 5주 동안 종양이 약 100 mm3(7일)인 경우 항체 치료를 시작했다. 항체는 IP(3회 주사/주)로 주사하고, 10 mg/kg/투여량의 hu-IgG4-S228P-L235E 포맷(h20-H2L5Y-G4PE)으로 h20-H2L5Y를 주사하고, 2.5 mg/kg/투여량으로 Herceptin®(hu-IgG1)을 주사하였다. 종양 체적을 측정하여 종양 세포 성장을 모니터링하였다. 첫 번째 마우스가 죽거나 각 그룹으로 희생될 때까지 각 그룹의 평균 종양 체적(cm3)+/-SD를 다른시간 동안 나타내었다. 처리 그룹을 Hather et al. (Hather G., Liu R., Bandi S., Mettetal J., et al. "Growth Rate Analysis and Efficient Experimental Design for Tumor Xenograft Studies." Cancer Informatics 13(S4):65-72 (2014))에 의해 기술된 속도-기반 T/C 방법을 사용하여 비히클 그룹과 비교하였다(*p<0.05; ***p<0.0005). 또한 NCI-N87 종양 세포의 성장은 Herceptin® 단독으로 치료한(p<0.05) 동물과 비교했을 때 h20-H2L5Y-G4PE + Herceptin®의 조합으로 치료받은 동물 그룹에서 유의하게 감소했다.
본 발명은 CD47에 특이적인 단클론 항체에 관한 것이다. 또한, 상기 항체의 핵산 및 아미노산 서열이 개시된다. 항체는 CD47과 관련된 치료 및 진단 방법에 사용된다.
"치료"는 치료적 조치 및 예방적 또는 방지적 조치를 모두 의미한다. 치료가 필요한 개체들은 이미 장애가 있는 개체와 장애가 예방되는 개체들을 포함한다.
치료를 위한 "포유동물"은 인간, 가축 및 농장 동물, 및 동물원 동물, 스포츠 동물, 또는 애완동물, 예컨대 개, 말, 고양이, 소 등을 포함하여 포유동물로 분류된 임의의 동물을 의미한다. 바람직하게는, 포유동물은 인간이다.
용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 구체적으로는 단클론 항체(전장 단클론 항체 포함), 다중클론 항체, 다중특이적 항체(예를 들어, 이중특이적 항체), 및 항원 단편이 원하는 생물학적 활성을 갖는 경우의 항원 단편을 포함한다. "항체"(Abs)와 "면역글로불린"(Igs)은 동일한 구조적 특징을 가진 당단백질이다. 항체가 특정 항원에 대한 결합 특이성을 나타내는 반면, 면역글로불린은 항체 및 항원 특이성이 결여된 다른 항체-유사 분자를 포함한다. 후자의 종류의 폴리펩타이드는 예를 들어 림프계에 의해 낮은 수준으로 생성되고, 골수종에 의해 증가된 수준으로 생성된다.
본 발명에서 사용되는 용어 "에피토프"는 항체의 파라토프가 결합하는 항원상의 임의의 항원 결정기를 의미한다. 에피토프성 결정기는 일반적으로 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적 활성 표면 기들로 이루어지며, 일반적으로 특정 전하 특성뿐만 아니라 특정 3차원 구조적 특성을 갖는다.
"원체(native) 항체와 면역글로불린"은 일반적으로 2개의 동일한 경(L)쇄와 2개의 동일한 중(H)쇄로 구성된 약 150,000 달톤의 헤테로테트라머 당단백질이다. 각 경쇄는 하나의 공유결합된 디설파이드 결합에 의해 중쇄에 연결되고, 디설파이드 결합의 수는 상이한 면역글로불린 이소타입의 중쇄 사이에서 다양하다. 각 중쇄 및 경쇄는 또한 규칙적으로 이격된 사슬내 디설파이드 브릿지를 갖는다. 각 중쇄는 한쪽 말단에 가변 도메인(VH)과 그 뒤에 다수의 불변 도메인을 갖는다. 각 경쇄는 한쪽 말단에 가변 도메인(VL)을, 다른 쪽 끝에 불변 도메인을 가지고 있으며; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 정렬되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 사이의 계면을 형성한다고 여겨진다(Clothia C, Novotn
Figure pat00001
J, Bruccoleri R, Karplus M. "Domain association in immunoglobulin molecules. The packing of variable domains." J. Mol. Biol. 186:651-63 (1985); Novotny J. and Haber E. "Structural invariants of antigen binding: comparison of immunoglobulin VL-VH and VL-VL domain dimers." Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:4592-96 (1985)).
용어 "가변적"은 가변 도메인의 특정 부분이 항체 사이에서 서열이 광범위하게 상이하고, 그의 특정 항원에 대한 각 특정 항체의 결합 및 특이성에서 사용된다는 사실을 지칭한다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인 전체에 고르게 분포되어 있지 않다. 경쇄 가변 도메인과 중쇄 가변 도메인 모두에서 상보성-결정 영역(CDR) 또는 과가변 영역으로 불리는 3개의 세그먼트에 집중되어있다. 가변 도메인의 보다 고도로 보존된 부분을 프레임워크(FR)라고 한다. 본래의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 β-시트 구조를 채택하고, β-시트 구조를 연결하고 일부 경우에는 β-시트 구조를 형성하는 루프를 형성하는 3개의 CDR로 연결된 4개의 FR 영역을 포함한다. 각 사슬 내의 CDR은 FR 영역에 의해 근접하여 함께 유지되고, 다른 사슬로부터의 CDR과 함께 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다(KABAT 주석의 경우, Kabat E.A.Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) 참조하거나, IMGT 주석의 경우, http://www.imgt.org 참조). 불변 도메인은 항체와 항원의 결합에 직접적으로 관여하지 않지만, 항체가 항체-의존성 세포 독성(ADCC)에 참여하는 것과 같은 다양한 이펙터 기능을 나타낸다.
예시적인 항-CD47 중쇄 및 경쇄 조합의 CDR 서열은 SEQ ID NO: 1-120, 152, 153(상기 표 2 및 3 참조)을 포함하는 서열 목록에 개시되어있다.
항체의 파파인 소화는 각각 하나의 항원-결합 부위를 갖는 "Fab" 단편이라고 불리는 2개의 동일한 항원-결합 단편, 및 잔류 "Fc" 단편을 생성하며, 그의 이름은 쉽게 결정화하는 능력을 반영한다. 펩신 처리는 2개의 항원-결합 부위를 가지며, 여전히 항원을 가교 결합시킬 수 있는 F(ab')2 단편을 생성한다.
"Fv"는 완전한 항원 인식 및 결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 2-쇄 Fv 종에서, 이 영역은 타이트하고 비공유결합된 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 구성된다. 단일-사슬 Fv 종(scFv)에서, 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인은 가요성 펩타이드 링커에 의해 공유결합될 수 있어서, 경쇄 및 중쇄가 2개의 사슬 Fv 종의 구조와 유사한 "이량체" 구조에 연합할 수 있다. VH-VL 이량체의 표면 상에 항원-결합 부위를 정의하기 위해 각 가변 도메인의 3개의 CDR이 상호작용하는 것이 이 구성에 있다. 총체적으로, 6개의 CDR은 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인(또는 항원에 특이적인 3개의 CDR만 포함하는 Fv의 절반)조차도 전체 결합 부위보다 낮은 친화도를 나타낼지라도 항원을 인식하고 결합할 수 있다. scFv에 대한 리뷰는 Pl
Figure pat00002
ckthun A. Antibodies from Escherichia coli, in "The Pharmacology of Monoclonal Antibodies", by Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, vol. 113, pp. 269-315 (1994)를 참조한다.
Fab 단편은 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인을 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 부위로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 약간의 잔기를 부가함으로써 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올 기를 갖는 Fab'에 대한 지정이다. F(ab')2 항체 단편은 원래 그들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링 또한 공지되어있다.
5가지 주요 부류의 면역글로불린: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 있으며, 이들 중 몇 개는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2와 같은 하위부류(이소타입)로 더 분류될 수 있다. 면역글로불린의 다른 부류에 해당하는 중쇄 불변 도메인을 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 불리운다. 면역글로불린의 상이한 부류의 서브유닛 구조 및 3차원 구성은 잘 알려져 있다.
본원에서 사용된 "항체 단편" 및 이의 모든 문법적 변이체는 항체 결합 부위 또는 온전한 항체의 가변 영역을 포함하는 온전한 항체의 일부로서 정의되며, 이 부분은 온전한 항체의 Fc 영역의 불변 중쇄 도메인(즉, CH2, CH3 및 CH4, 항체 이소타입에 따라 다름)이 유리되어 있다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디; 제한없이, (1) 단일-사슬 Fv(scFv) 분자 (2) 관련 중쇄 모이어티 없이, 단지 1개의 경쇄 가변 도메인을 함유하는 단일 사슬 폴리펩타이드, 또는 경쇄 가변 도메인의 3개의 CDR을 함유하는 이의 단편, 및 (3) 관련 경쇄 모이어티 없이, 단지 1개의 중쇄 가변 영역을 함유하는 단일 사슬 폴리펩타이드, 또는 중쇄 가변 영역의 3개의 CDR을 함유하는 이의 단편을 포함하는, 연속적인 아미노산 잔기(본원에서 "단일-사슬 항체 단편" 또는 "단일 사슬 폴리펩타이드"로 언급됨)의 하나의 중단되지 않은 서열로 이루어진 일차 구조를 갖는 폴리펩타이드인 임의의 항체 단편; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이성 또는 다가 구조를 포함한다. 하나 이상의 중쇄를 포함하는 항체 단편에서, 중쇄(들)은 온전한 항체의 비-Fc 영역에서 발견되는 임의의 불변 도메인 서열(예를 들어, IgG 이소타입에서의 CH1)을 함유할 수 있고, 및/또는 온전한 항체에서 발견된 임의의 힌지 영역 서열을 함유할 수 있으며, 및/또는 중쇄(들)의 힌지 영역 서열 또는 불변 도메인 서열에 융합되거나 위치하는 류신 지퍼 서열을 함유할 수 있다.
반대로 특별히 지시되지 않는 한, 본원에서 기술되고 청구되는 바와 같은 용어 "접합체"는 하나 이상의 중합체 분자(들)에 대한 하나 이상의 항체 단편(들)의 공유결합에 의해 형성된 이종 분자로 정의되며, 상기 이종 분자는 수용성이며, 즉 혈액과 같은 생리적 유체에 가용성이며, 상기 이종 분자는 임의의 구조화된 집합체가 없다. 관심 있는 접합체는 PEG이다. 전술한 정의와 관련하여, 용어 "구조화된 응집체"는 (1) 회전타원체(spheroid) 또는 회전타원체 쉘 구조를 갖는 수용액 중의 분자들의 임의의 집합체로서, 이종 분자가 미셀 또는 다른 유제 구조에 존재하지 않고, 및 지질 이중층, 소포 또는 리포좀에 고정되어 있지 않는 응집체, 및 (2) 고체 또는 불용화 형태의 임의의 분자 집합체, 예컨대 크로마토그래피 비드 매트릭스로서, 수성 상과의 접촉시 이종 분자를 용액으로 방출하지 않는 집합체를 지칭한다. 따라서, 본원에서 정의된 용어 "접합체"는 침전물, 침강물, 생분해성(bioerodible) 매트릭스 또는 고체의 수화시에 이종 분자를 수용액으로 방출할 수 있는 다른 고체 내의 상기 이종 분자를 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "단클론 항체"(mAb)는 실질적으로 균질한 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하며, 즉, 모집단을 구성하는 개개의 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연발생 돌연변이를 제외하고 동일하다. 단클론 항체는 매우 특이적이며, 단일 항원 부위에 대향한다. 각 mAb는 항원 상의 단일 결정기에 대향한다. 그들의 특이성 외에도, 단클론 항체는 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않은 하이브리도마 배양물 또는 포유류 세포주에 의해 합성될 수 있다는 점에서 유리하다. 수식어 "단클론"은 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득된 것으로서의 항체의 특성을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체 생산을 요구하는 것으로 간주되어서는 안된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 단클론 항체는 불멸화된 B 세포 또는 이의 하이브리도마에서 제조될 수 있거나, 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 단클론 항체는 항-CD47 항체의 가변(초 가변성 포함) 도메인을 불변 도메인(예를 들어, "인간화된" 항체)으로, 또는 경쇄를 중쇄로, 또는 한 종으로부터의 사슬을 다른 종의 사슬로 스플라이싱하여 생성된 혼성 및 재조합 항체, 또는 원래의 종 또는 면역글로불린 종류 또는 하위분류 지정에 관계없이, 이종 단백질과의 융합체, 뿐만 아니라 이들은 원하는 생물학적 활성을 나타내는한, 항체 단편(예를 들어, Fab, F(ab')2 및 Fv)을 포함한다.
본원에서 단클론 항체는 특히 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체에서 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 반면, 나머지 사슬(들)이 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 다른 종으로부터 유래되거나 다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체, 뿐만 아니라 상기 항체의 단편에서 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라" 항체(면역글로불린)를 포함한다.
"분리된" 항체는 자연환경의 성분으로부터 동정되고 분리 및/또는 회수된 항체이다. 자연환경의 오염 성분은 항체의 진단적 또는 치료적 용도를 방해하는 물질이며, 효소, 호르몬 및 기타 단백질성 또는 비 단백질성 용질을 포함할 수 있다. 일부 구현 예에서, 항체는 (1) 로리(Lowry) 방법에 의해 측정된, 항체의 75중량% 초과, 가장 바람직하게는 80중량%, 90중량% 또는 99중량% 이상으로, 또는 (2) 쿠마시 블루(Coomassie blue) 또는 바람직하게는 은 염색(silver stain)을 사용하여 환원 또는 비 환원 조건에서 SDS-PAGE에 의해 동종성으로 정제될 것이다. 분리된 항체는 항체의 자연환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문에 재조합 세포 내에서 원위치로 항체를 포함한다. 그러나 통상적으로, 분리된 항체는 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
본원에서 사용된 용어 "에피토프 태그된(epitope tagged)"은 "에피토프 태그"에 융합된 항-CD47 항체를 지칭한다. 에피토프 태그 폴리펩타이드는 항체가 제조될 수 있는 에피토프를 제공하기에 충분한 잔기를 가지지만, CD47 항체의 활성을 방해하지 않을 정도로 충분히 짧다. 에피토프 태그는 바람직하게는 에피토프에 특이적인 항체가 다른 에피토프와 실질적으로 가교 반응을 일으키지 않도록 충분히 독특하다. 적합한 태그 폴리펩타이드는 일반적으로 6개 이상의 아미노산 잔기 및 통상적으로 약 8 내지 50개의 아미노산 잔기(바람직하게는 약 9 내지 30개 잔기)를 갖는다. 그 예로는 c-myc 태그 및 그에 대한 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 및 9E10 항체(Evan G.I., Lewis G.K., Ramsay G., et al. "Isolation of monoclonal antibodies specific for human c-myc proto-oncogene product", Mol. Cell. Biol. 5(12):3610-3616 (1985)); 및 헤르페스 심플렉스 바이러스 당 단백질 D(gD) 태그 및 그의 항체를 포함한다(Paborsky L.R., Fendly B.M., Fisher K.L., et al. "Mammalian cell transient expression of tissue factor for the production of antigen", Protein Engineering 3(6):547-553 (1990)).
본원에서 사용된 "표지"라는 용어는 항체에 직접 또는 간접적으로 접합된 검출가능한 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 표지 그 자체는 그 자체로 검출될 수 있거나(예를 들어, 방사성 동위원소 표지 또는 형광 표지), 효소 표지의 경우, 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변형을 촉매할 수 있다.
"고체상"은 본 발명의 항체가 부착할 수 있는 비-수성 매트릭스를 의미한다. 본원에 포함되는 고체상의 예는 부분적으로 또는 전체적으로 유리(예를 들어, 조절된 구멍 유리), 다당류(예를 들어, 아가로스), 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌, 폴리비닐알콜 및 실리콘으로 형성된 것들을 포함한다. 특정 구현 예에서, 문맥에 따라, 고체상은 분석 플레이트의 웰; 다른 것들에서는 정제 컬럼(예를 들어, 친화도 크로마토그래피 컬럼)을 포함할 수 있다. 이 용어는 또한 이산 입자의 불연속 고체상, 예컨대 미국특허 제4,275,149호에 기술된 것들을 포함한다.
CD47의 글리코실화
CD47은 번역 후 변형, 특히 글리코실화에 적용될 수 있다. CD47은 세포 표면 디스플레이에 직접 영향을 미치고, 세포외 리간드와의 상호작용을 조절하는 다수의 N-말단 글리코실화 부위를 갖는다. 예를 들어, 탈글리코실화된 CD47은 SIRPα에 대한 결합력이 글리코실화된 CD47보다 높으며, 그 반대의 경우, 탈글리코실화된 SIRPα는 CD47에 대한 결합력보다 높은 결합력을 갖는다(Subramanian S., Boder E.T., and Discher D. E. "Phylogenetic divergence of CD47 interactions with human signal regulatory protein α reveals locus of species specificity." J. Biolog. Chem. 282(3):1805-18 (2007); Subramanian S., Parthasarathy R., Sen S., Boder E.T., and Discher D.E. "Species and cell type-specific interactions between CD47 and human SIRP ." Blood 107(6):2548-56 (2006)). 반대로, 과글리코실화된 SIRPα는 CD47/SIRPα 상호작용을 파괴시킬 수 있다(Ogura T., Noguchi T., Murai-takebe R., Hosooka T., Honma N., and Kasuga M. "Resistance of B16 melanoma cells to CD47-induced negative regulation of motility as a result of aberrant N-glycosylation of SHPS-1." J Biol Chem 279(14): 13711-20 (2004)). 주목할 점은 N-연결된 글리코실화 부위의 부위-지향성 돌연변이 유발은 효모 모델에서 CD47의 세포 표면 국소화를 저해하지만(Parthasarathy R., Subramanian S., Boder E.T., and Discher D.E. "Post-Translational Regulation of Expression and Conformation of an Immunoglobulin Domain in Yeast Surface Display." Biothech Bioin 93(1):159-68 (2006)), 유사한 돌연변이 유발은 CHO 세포에서 인간 CD47의 막 국소화에 영향을 미치지는 않았다(Subramanian et al., 2006, supra). CD47 또는 SIRPα의 비정상적인 글리코실화는 CD47-유도성 운동 억제에 대해 차별적으로 글리코실화된 SIRPα 렌더링 B16 흑색종 세포에 의해 하류 반응을 변형시킬 수 있다(Ogura et al., 2004, supra). 또한, 1차 및 형질전환된 T-세포, 내피 세포 및 혈관 평활근 세포에서 CD47의 과도하게 글리코실화된(> 250 kD) 형태가 검출되었다(Kaur S., Kuznetsova S.A., Pendrak M.L., Romeo M. J., Li Z., Zhang L., and Roberts D.D. "Heparan Sulfate Modification of the Transmembrane Receptor CD47 Is Necessary for Inhibition of T Cell Receptor Signaling by Thrombospondin-1", J Biol Chem 286(17):14991-15002 (2011)). 이 변형은 SIRPα 결합 부위로부터 멀리 떨어져 있었지만, T-세포에서 TSP-1 매개되는 억제 신호에 필요했다.
종양 세포가 비정상적인 글리코실화 패턴을 나타낼 수 있기 때문에, 글리코실화와 독립적으로 CD47에 결합하는 항-CD47 항체를 제공하는 것이 바람직할 것이다. 그러나 공지된 치료학적으로 적절한 항-CD47 항체는 전형적으로 글리코실화된 CD47에 효과적으로 결합하는 반면, 글리코실화되지않은 또는 탈글리코실화된 CD47에 대해서는 (예를 들어, 낮은 결합 친화도/보다 높은 평형 결합 상수 또는 감소된 최대 결합 용량(Bmax)으로) 약하게 결합한다.
일 양태에서, 본 발명의 항체는 글리코실화된 및 글리코실화되지않은 CD47에 결합한다. 예를 들어, 일 구현 예에서, CD47에 대한 항체의 결합은 CD47의 글리코실화에 의존하지 않는다. 이것은 CD47의 글리코실화가 CD47에 대한 항체의 적절한 결합에 필요하지 않다는 것을 의미하며, 예를 들어 항체는 CD47의 글리코실화 수준에 관계없이 CD47에 대한 유의한 특이적 결합을 나타낸다. 다시 말해서, CD47에 대한 항체의 결합은 적어도 부분적으로, 상당히 또는 실질적으로 글리코실화와 무관하다.
본원에 사용된 "글리코실화된" CD47은 전형적으로 하나 이상의 잔기에서 N-글리코실화된 (예를 들어, 인간) CD47을 지칭한다. 인간 CD47은 인간 CD47의 아미노산 서열(SEQ ID NO: 151)에서 위치 N23, N34, N50, N73, N111 및 N206의 하나 이상의 (예를 들어, 아스파라긴) 잔기에서 N-글리코실화될 수 있다. 바람직하게는, 글리코실화된 CD47은 상기 위치 중 적어도 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개가 글리코실화된다.
"탈글리코실화된" CD47은 하나 이상의 글리칸 사슬(예를 들어, N-글리칸)이 제거된 CD47의 형태를 지칭한다. CD47의 탈글리코실화는 펩타이드 N-글리코시다제(PNGase)와 같은 효소, 예를 들어, N-글리칸을 제거하는 PNGase F에 의한 처리로 이행될 수 있다. 용어 "글리코실화되지않은" 및 "탈글리코실화"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. 따라서, 글리코실화되지않은 또는 탈글리코실화된 형태는 전형적으로 인간 CD47의 아미노산 서열(SEQ ID NO: 151)에서 위치 N23, N34, N50, N73, N111 및/또는 N206에서 글리칸 잔기가 누락된다.
일 구현 예에서, CD47의 탈글리코실화는 (인간) CD47에 대한 항체의 결합력/친화도 및/또는 최대 결합능에 유의한 영향을 미치지 않는다. 글리코실화된 및 탈글리코실화된 형태의 CD47에 대한 항체의 결합력/친화도 및 최대 결합능(Bmax)은 예를 들어, 이하의 실시예에 제시된 바와 같이, 표준 분석법을 사용하여 측정될 수 있다. 항체의 표적 에피토프에 대한 항체의 친화도는 그의 해리 상수와 반비례 관계에 있다. 해리 상수는 또한 CD47에 대한 항체의 결합을 위한 EC50 값과 직접 관련될 수 있다. EC50은 반 최대 결합을 제공하는, 즉 CD47 상의 결합 부위의 50%가 결합되는 항체의 농도이다. 또한, 95% 최대 결합을 제공하는 항체의 농도인 EC95 값은 CD47 상의 결합 부위의 95%가 결합된 항체의 농도를 나타낸다. 어느 측정이 사용되든, 본 발명의 구현 예에 따라, 중요한 것은 글리코실화된 및 글리코실화되지않은 형태에 대해 수득된 상대 값, 즉 글리코실화된 형태 및 글리코실화되지않은 형태가 합리적으로 유사한 결과를 나타내는 경우 절대값이 반드시 결정될 필요는 없다는 것이다.
따라서, 일부 구현 예에서, 글리코실화되지않은 및 글리코실화된 형태의 CD47에 대한 항체의 친화도는 각 형태에 대한 항체의 결합을 위한 EC50 값 또는 EC95 값의 비를 측정함으로써 비교될 수 있다. 바람직하게는, 이 비율은 5:1, 4:1, 3:1 또는 2:1 미만이지만, EC95에 대해서는 훨씬 더 높을 수 있는데, 즉 25:1, 20:1, 10:1, 바람직하게는 범위 10:1 내지 1:10, 보다 바람직하게는 9:1 내지 1:9, 가장 바람직하게는 10:1 내지 1:10이다. 즉, 글리코실화되지않은 CD47에 대한 항체의 결합을 위한 EC50은 글리코실화된 CD47에 대한 항체의 결합을 위한 EC50 값보다 3배 또는 2배 이상 높지 않을 수 있다. 글리코실화되지않은 CD47에 대한 항체의 결합을 위한 EC95는 글리코실화된 CD47에 대한 항체의 결합을 위한 EC95 값보다 9배 또는 10배 이상 높지 않을 수 있다. 추가의 구현 예에서, EC50의 비는 바람직하게는 3:1 내지 1:3 또는 2:1 내지 1:2, 가장 바람직하게는 3:1 내지 1:3의 범위이고; 또는 EC95의 비는 바람직하게는 10:1 내지 1:10, 더욱 바람직하게는 9:1 내지 1:9, 가장 바람직하게는 10:1 내지 1:10의 범위이다. 상기 구현 예에서, 탈글리코실화가 결합 친화도에 유의한 영향을 미치지 않으며, 즉 CD47에 대한 항체의 결합이 글리코실화에 좌우되지 않는다고 생각된다. 일부 구현 예에서, 항체는 평형 결합 상수가 80 pM 이하, 바람직하게는 70 pM 이하, 더 바람직하게는 60 pM 이하인 CD47의 글리코실화되지않은 형태(및 바람직하게는 CD47의 글리코실화되지않은 및 글리코실화된 형태 모두)에 결합한다.
다른 구현 예에서, CD47의 탈글리코실화는 CD47에 대한 항체의 최대 결합능을 현저하게 감소시키지 않는다. 예를 들어, 최대 결합능(즉, Bmax1)은 글리코실화된 CD47에 대한 항체의 결합에 대해 결정될 수 있다. Bmax1은 과잉 항체 농도, 즉 항체와 CD47 사이의 특이적 결합의 최대 수준에서 항체가 CD47에 결합하는 수준에 관한 것이다. 따라서 Bmax1은 글리코실화된 CD47에 대한 항체의 이용가능한 결합 부위의 농도의 척도이다. 이어서, CD47을 탈글리코실화(예를 들어, PNGase를 사용)하고, 과량의 항체 농도에서 CD47에 대한 결합 수준을 다시 결정하였다(샘플에서 동일한 CD47 농도로). 따라서, 탈글리코실화된 CD47에 대한 항체의 최대 결합능(즉, Bmax2)은 탈글리코실화된 CD47 상의 항체에 대한 이용가능한 결합 부위의 농도의 척도이다.
바람직한 구현 예에서, 글리코실화되지않은 CD47에 대한 항체의 최대 결합능(즉, Bmax2)은 글리코실화된 CD47에 대한 항체의 최대 결합능(즉, Bmax1)의 적어도 60%, 또는 적어도 70%이다. 상기 구현 예에서, 탈글리코실화는 최대 결합능에 현저한 영향을 미치지 않는다고 생각되며, 즉, CD47에 대한 항체의 결합은 글리코실화에 의존하지 않는다.
추가의 구현 예에서, 글리코실화된 및 탈글리코실화된 형태의 CD47에 대한 항체의 결합 특성은 EC95 값의 비에 기초하여 비교될 수 있다. EC95는 CD47상의 결합 부위의 95%가 결합된 항체의 농도이다. 따라서, 일부 구현 예에서, 글리코실화되지않은 및 글리코실화된 형태의 CD47에 대한 항체의 친화도는 각 형태에 대한 항체의 결합을 위한 EC95 값의 비를 측정함으로써 비교될 수 있다. 바람직하게는 이 비율은 10:1 또는 9:1 미만이다. 달리 말하면, 글리코실화되지않은 CD47에 대한 항체의 결합을 위한 EC95는 글리코실화된 CD47에 대한 항체의 결합을 위한 EC95보다 10배 또는 9배 이상 높지 않을 수 있다.
항체 해리 동역학
본 발명의 또 다른 양태에서, 정의된 범위 내에서 CD47로부터 해리 속도(Koff)를 갖는 항-CD47 항체가 제공된다. 특히, 1×10-3 s-1보다 우수한 Koff 값을 특징으로 하는 높은 해리 속도를 갖는 항-CD47 항체가 RBC로부터 강력하고 신속하게 분리되지만, 종양 세포에 대한 그의 기능적 활성의 대부분, 예를 들어 종양 세포 식균작용의 증진을 급속하게 상실한다는 것이 입증되었다. 대조적으로, 1×10-4 s-1보다 열등한 Koff 값을 특징으로 하는 매우 느린 해리 속도를 갖는 항-CD47 항체는 종양 세포로부터 더 천천히 분리되지만, RBC에 달라 붙을 것이며, 중요한 싱크 효과 및 가능하게는 더 많은 부작용을 가질 수 있다.
따라서, 1×10-4와 1×10-3 s-1 사이에 포함되는 Koff 값을 특징으로 하는 중간 해리 동역학을 갖는 항-CD47 항체는 최적의 CD47 결합/방출 평형을 가지며, 즉 항-종양 효능을 유지하면서, 약한 싱크 효과 및 부작용을 제공한다. 따라서, 일 양태에서, 본 발명은 CD47에 결합하는 항체 및 1.0×10-4 s-1 내지 1.0×10-3 s-1에 포함되는 CD47에 결합하기 위한 Koff 값을 제공한다. 특정 구현 예에서, 항체는 글리코실화된 및/또는 글리코실화되지않은 CD47에 이 범위의 Koff 값으로 결합할 수 있다. 바람직하게는, 항체는 1.0×10-4 s-1 내지 1.0×10-3 s-1, 2.0×10-4 s-1 내지 1.0×10-3 s-1, 2.5×10-4 s-1 내지 8.0×10-4 s-1, 2.5×10-4 s-1 내지 5.0×10-4 s-1 또는 3.0×10-4 s-1 내지 4.5×10-4 s-1에 포함되는 (예를 들어, 글리코실화된 및/또는 글리코실화되지않은) CD47에 결합하기 위한 Koff 값을 갖는다.
항체
일 양태에서, 본 발명은 인간 CD47에 특이적으로 결합하는 마우스, 인간화된 또는 키메라 단클론 항체 및 상기 항체를 생산하는 세포주에 관한 것이다. 본 발명의 상기 항-CD47 항체는 항체 이소타입(및 이펙터 기능)에 관계없이 CD47-SIRPα 상호작용의 강력한 파괴, 1.0×10-4 s-1 내지 1.0×10-3 s-1, 2.0×10-4 s-1 내지 1.0×10-3 s-1, 2.5×10-4 s-1 내지 8.0×10-4 s-1, 2.5×10-4 s-1 내지 5.0×10-4 s-1, 또는 3.0×10-4 s-1 내지 4.5×10-4 s-1(여기서, 기준 항체는 5.0 내지 8.9×10-5 s-1의 낮은 Koff 값을 나타냄)의 범위의 Koff 값에 의한 빠른 해리 동역학과 같은 암 치료를 위한 다양한 원하는 특성들(여기에 제한되지 않음)을 나타낸다. 또한, 본 발명의 항체는 적혈구상의 CD47에 결합한 후 신속하게 방출된다(여기서, 더 낮은 Koff 값을 갖는 기준 항체는 보다 천천히 방출됨). 또한, 본 발명의 항-CD47 항체는 인간 단핵구-유래 대식세포에 의한 CD47-발현 종양 세포의 효율적인 식균작용을 가능하게 한다. 또한, 본 발명의 항-CD47 항체는 표적 CD47을 과발현하는 이종이식 마우스 모델에서 종양 성장의 억제를 나타낸다. 또한, 상기 항체는 다음의 특징 중 적어도 하나를 갖는다: CD47-SIRPα 상호작용을 파괴하고, 3.0보다 크지 않은 탈글리코실화된 CD47 대 글리코실화된 CD47에 대한 EC50의 비 및 10.0보다 크지 않은 탈글리코실화된 CD47 대 글리코실화된 CD47에 대한 EC95의 비를 갖는 글리코실화된 및 글리코실화되지 않은 CD47에 결합하고, CD47-SIRPα 신호 전달을 억제하고, 특정 CD47 발현 세포의 식균작용을 증가시키며, 세포 응집의 유의한 수준을 유발하지 않으며, 다양한 치료 및 진단 방법에서 용도를 찾는다. 인간 CD47에 결합하고 선택적 돌연변이(들)(예를 들어, CDR2와 같은 CDR 영역에서도 T 세포 에피토프(들)을 제거하기 위한 아미노산의 치환)을 갖는 IgG4 포맷인 항체가 바람직하다. 본 발명의 바람직한 구현 예는 부가적으로 낮은 독성을 제시하는 약한 적혈구 응집 활성을 추가로 나타내고(후보물질 19, 33, 20(후보물질 번호 20의 인간화된 및 추가 조작된 항체를 포함)), 및/또는 Jurkat 세포(후보물질 번호 7, 19, 20(후보물질 20의 인간화된 및 추가 조작된 항체를 포함), 22(후보물질 22의 인간화된 및 추가 조작된 항체를 포함), 33)의 세포자멸사를 유도하지 않거나(약간만 유도하는) 항-CD47 항체의 그룹이다. 또한, 본 발명의 더욱 바람직한 구현 예는 세포외로 글리코실화된 및 글리코실화되지않은 CD47에 추가로 결합하거나, 또는 그의 면역학적으로 활성이고 글리코실화된 및 글리코실화되지 않은 그의 단편에 결합하는 항-CD47 항체의 그룹이다. 또한, 본 발명의 더 바람직한 구현 예는 인간 CD47과 같은 CD47의 단량체 및 이량체에 결합하는 항-CD47 항체의 그룹이다. 또한, 본 발명의 보다 바람직한 구현 예는 CD47 상의 특정 에피토프, 즉 특히 SEQ ID NO: 151에 따라 넘버링된 경우 인간 CD47의 K59, R63, Y66, T67, H108, T109, T117 및 T120을 포함하는 불연속적 에피토프에 결합하는 항-CD47 항체의 그룹이다(예를 들어, 후보물질 20 및 그의 인간화된 및 조작된 버전). 본 발명의 구현 예의 또 다른 예는 CD47상의 특정 에피토프, 즉 특히 SEQ ID NO: 151에 따라 넘버링된 경우 인간 CD47의 K59, K61, S107, H108, T117, T120 및 R121을 포함하는 불연속적 에피토프에 결합하는 항-CD47 항체의 그룹이다(예를 들어, 후보물질 22 및 그의 인간화된 및 조작된 버전).
바람직한 후보물질은 후보물질 7, 14, 15, 19, 20, 22, 26 및 33이다. 더욱 바람직한 후보물질은 7, 19, 20, 22 및 33이다. 더욱더 바람직한 후보물질은 20 및 22이다. 가장 바람직한 후보물질은 20(후보물질 20의 인간화되고 추가 조작된 항체, 즉 후보물질 20.1 내지 20.30을 포함)이다. 예시적인 항체(본원에서 일반적으로 후보물질 번호 또는 항체 이름으로 언급됨)의 CDR(KABAT-(표 2) 및 IMGT-(표 3) 주석) 및 가변 영역(표 1)이 제공된다(IMGT 주석이 바람직함). 관심의 항체는 상기 제공된 조합뿐만 아니라, 예를 들어 F(ab)' 항체를 생성하기 위한 적절한 불변 영역 또는 불변 영역의 단편과의 가변 영역의 융합을 포함한다. 관심 있는 가변 영역은 제공된 항-CD47 항체의 하나 이상의 CDR 서열을 포함하며, 상기 CDR은 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 그 이상의 아미노산일 수 있다. 대안적으로, 관심 있는 항체는 제공된 항체에 개시된 바와 같은 가변 영역, 또는 본원에 개시된 바와 같은 가변 영역 서열의 쌍을 포함한다. 상기 항체는 전장 항체, 예를 들어 임의의 이소타입의 인간 면역글로불린 불변 영역, 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, 보다 바람직하게는 돌연변이(들)을 갖는 IgG4를 갖는 항체일 수 있으며, 예를 들면, 여기서 CDR 영역에 있어서도 T 세포 에피토프(들)의 일부 또는 전부가 침묵 보존 아미노산(들)(실시예에 대한 실험 부분 참조), 예를 들어 S228P 및 L235E 돌연변이에 의해 치환되며, 즉 잠재적인 사슬 교환을 회피하고 Fcγ 수용체에 대한 hIgG4의 친화도를 감소시키기 위해 상기 S228P 및 L235E 돌연변이가 도입된다.
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Fab에 더하여, CD47의 적어도 하나의 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 보다 작은 항체 단편 및 에피토프-결합 펩타이드도 본 발명에 의해 고려되며, 또한 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 예를 들어, 단일 사슬 항체는 미국특허 제4,946,778호의 방법에 따라 구성될 수 있으며, 이는 이후에 참고로 포함된다. 단일 사슬 항체는 가요성 링커 모이어티에 의해 연결된 경쇄 및 중쇄의 가변 영역을 포함한다. 분리 VH 단일 도메인을 포함하는 단일 도메인 항체로 알려진 항체 단편은 더 작다. 이들이 유래된 온전한 항체의 결합 특이성의 적어도 일부를 갖는 단일 도메인 항체를 수득하기 위한 기술은 당 분야에 공지되어있다. 예를 들어, Ward et al. (Ward S., G
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ssow D., Griffiths A.D., Jones P.T., and Winter G. "Binding Activities of a Repertoire of Single Immunoglobulin Variable Domains Secreted from Escherichia coli," Nature 341:544-46 (1989))은 표적 에피토프가 분리된 형태로 결합하기에 충분한 친화도를 갖는 항체 중쇄 가변 영역(H 단일 도메인 항체)을 수득하기 위해 스크리닝하는 방법을 개시하고 있다.
본 발명은 또한 인간화된 또는 키메라 항-CD47 항체를 코딩하는 분리된 핵산, 핵산을 포함하는 벡터 및 숙주 세포, 및 항체 생산을 위한 재조합 기술을 제공한다. 관심의 핵산은 제공된 핵산 서열과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99% 동일하거나, 또는 동일할 수 있다. 상기 인접 서열은 CDR 서열을 코딩할 수 있거나, 완전한 가변 영역을 코딩할 수 있다. 당 분야에 알려져 있는 바와 같이, 가변 영역 서열은 임의의 적절한 불변 영역 서열에 융합될 수 있다.
항체의 재조합 생산을 위해, 이를 코딩하는 핵산은 추가의 클로닝(DNA의 증폭) 또는 발현을 위해 복제가능한 벡터에 삽입된다. 단클론 항체를 코딩하는 DNA는 (예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용함으로써) 통상적인 과정을 사용하여, 용이하게 분리 및 시퀀싱된다. 많은 벡터를 사용할 수 있다. 벡터 성분은 일반적으로 신호 서열, 복제 기원, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열 중 하나 이상을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 항-CD47 항체는 직접적으로 뿐만 아니라, 성숙한 단백질 또는 폴리펩타이드, 면역글로불린 불변 영역 서열 등의 N-말단에 특이적인 절단 부위를 갖는 신호 서열 또는 다른 폴리펩타이드를 포함하는 이종 또는 동종 폴리펩타이드와의 융합 폴리펩타이드로서 재조합적으로 생산될 수 있다. 선택된 이종 신호 서열은 바람직하게는 숙주 세포에 의해 인식 및 처리(즉, 신호 펩티다아제에 의해 절단)될 수 있다. 원체 항체 신호 서열을 인식 및 처리하지 않는 원핵 숙주 세포의 경우, 신호 서열은 선택된 원핵 신호 서열로 치환된다.
"분리된" 핵산 분자는 항체 핵산의 천연 공급원에서 통상적으로 관련되는 적어도 하나의 오염 핵산 분자로부터 동정되고 분리된 핵산 분자이다. 분리된 핵산 분자는 자연에서 발견되는 형태 또는 환경과는 상이하다. 따라서, 분리된 핵산 분자는 천연 세포에 존재하는 핵산 분자와 구별된다. 그러나 예를 들어, 핵산 분자가 천연 세포와 다른 염색체 위치에 있는 경우, 분리된 핵산 분자는 항체를 통상적으로 발현하는 세포에 포함된 핵산 분자를 포함한다.
DNA의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 원핵생물, 효모 또는 그 이상의 고등 진핵 세포이다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 계통(COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포(293 또는 293 세포는 현탁 배양에서 성장을 위해 서브클로닝됨, Graham F.L. and Smiley J. "Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5," J. Gen. Virol. 36:59-72 (1977)); 아기 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL 10); 중국 햄스터 난소 세포; 중국 햄스터 난소 세포/dhFr-(CHO/dhFr-, Urlaub G. and Chasin L.A. "Isolation of Chinese hamster cell mutants deficient in dihydrofolate reductase activity," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77(7):4216-20 (1980)); 마우스의 세르톨리(Sertoli) 세포(TM4, Mather J.P. "Establishment and characterization of two distinct mouse testicular epithelial cell lines", Biol. Reprod. 23(1):243-251 (1980)); 원숭이 신장 세포(CV1, ATCC CCL 70); 아프리카 녹색원숭이 신장세포(VELO-76, ATCC CRL-1587), 인간 자궁 경부암 세포(HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포(MDCK, ATCC CCL 34), 버팔로 래트 간세포(BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐세포(W138, ATCC CCL 75); 인간 간세포(Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 세포(MMT 060562, ATCC CCL51); TR1 세포(Mather J.P., Zhuang L.Z., Perez-Infante V., and Phillips D.M. "Culture of testicular cells in hormone-supplemented serum-free medium", Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); MRC 5 세포; EB66 세포(예를 들어, EP 2150275B1 참조); FS4 세포; 및 인간 간암 세포주(Hep G2)이다. 숙주 세포는 항-CD47 항체 생산을 위한 상기 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환되고, 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선택하거나, 또는 원하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시키기 위해 적당하게 변형되는 통상적인 영양 배지에서 배양된다.
세포로부터 제조된 항체 조성물은 예를 들어 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 및 친화도 크로마토그래피를 사용하여 정제될 수 있으며, 친화도 크로마토그래피가 바람직한 정제 기술이다. 친화도 리간드로서의 단백질 A의 적합성은 항체내에 존재하는 임의의 면역글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소타입에 의존한다. 단백질 A는 인간 γ1, γ2 또는 γ4 중쇄를 기본으로 하는 항체를 정제하는데 사용할 수 있다(Lindmark R., Thoren-Tolling K., Sjφquist J. "Binding of immunoglobulins to protein A and immunoglobulin levels in mammalian sera", J. Immunol. Meth. 62(1):1-13 (1983)). 단백질 G는 인간 γ3에 권장된다(Guss M., Eliasson M., Olsson A., Uhl
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n M., Frej A.K., Jφrnvall H., Flock J.I., and Lindberg M. "Structure of the IgG-binding regions of streptococcal protein G", EMBO J. 5(1):1567-1575 (1986)). 친화도 리간드가 부착된 매트릭스는 가장 흔히 아가로스이지만, 다른 매트릭스도 이용가능하다. 제어된 공극 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠과 같은 기계적으로 안정한 매트릭스는 아가로스로 달성될 수 있는 것보다 빠른 유속 및 짧은 처리 시간을 가능하게 한다. 항체가 CH3 도메인을 포함하는 경우, Bakerbond ABX™ 수지(J.T. Baker, Phillipsburg, NJ)는 정제에 유용하다. 이온 교환 컬럼 상의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상의 크로마토그래피, 헤파린 상의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지(예컨대, 폴리아스파르트산 칼럼) 상의 SEPHAROSE™ 크로마토그래피, 크로마토포커싱(chromatofocusing), SDS-PAGE 및 황산암모늄 침전과 같은 단백질 정제를 위한 다른 기술들은 또한 회수될 항체에 따라 이용가능하다.
임의의 예비 정제 단계(들) 후에, 관심 있는 항체 및 오염물을 포함하는 혼합물은 약 2.5-4.5의 pH에서 용출 완충액을 사용하는 저 pH 소수성 상호작용 크로마토그래피에 적용될 수 있으며, 바람직하게는 저염 농도(예를 들어, 약 0 내지 0.25M 염)에서 수행될 수 있다.
사용 방법
본 발명의 인간화된 또는 키메라 단클론 항체는 국제 출원 US2009/000319에 개시된 방법을 포함하는 식균작용의 조절에 사용될 수 있으며, 본원에서 참고문헌으로 통합된다. 예를 들어, 항체 조성물은 CD47을 발현하는 암 세포의 식균작용을 증가시키기 위해 투여될 수 있으며, 따라서 본 발명의 인간화된 또는 키메라 단클론 항체의 유효량을 투여함으로써 개체의 암 치료에 적당하다.
본 발명의 인간화된 또는 키메라 단클론 항체 및 선택적으로 약학적으로 적합한 부형제 또는 담체를 포함하는 암 치료에 사용하기 위한 약학적 조성물이 또한 제공된다.
본 발명의 인간화된 또는 키메라 단클론 항체는 시험관 내 및 생체 내에서 CD47 질병 치료의 진행과정을 모니터링하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 예를 들어, CD47을 발현하는 세포, 특히 CD47을 발현하는 암 세포의 수의 증가 또는 감소를 측정함으로써, 질병 개선을 목적으로 하는 특정 치료 요법이 효과적인지 여부를 결정할 수 있다.
바람직한 구현 예에서, 본 발명의 인간화된 또는 키메라 단클론 항체는 단독 요법으로, 또는 다른 항암제(들)과 조합하여(병용 요법), 암 또는 다른 신생물 질환을 치료하거나, 진행을 지연시키거나, 재발을 예방하거나 증상을 완화시키는데 사용될 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "암" "신생물" 및 "종양"이란 용어는 상호교환 가능하다. 암의 예로는 제한없이, 위암, 유방암, 폐암, 난소암, 자궁경부암, 전립선암, 방광암, 결장직장암, 췌장암, 간암, 신장암, 갑상선암, 뇌암, 두경부암, 혈액암, 암종, 흑색종, 평활근종, 평활근육종, 신경아교종, 교모세포종 등이 있다. "혈액암"은 혈액의 암을 지칭하며, 백혈병, 림프종 및 골수종을 포함한다. 고형 종양은 예를 들어 위 종양, 유방 종양, 폐 종양, 난소 종양, 전립선 종양, 방광 종양, 결장직장 종양, 췌장 종양, 간 종양, 신장 종양, 갑상선 종양, 뇌종양, 두경부 종양, 식도 종양 및 흑색종 종양 등을 포함한다. 암 및 기타 종양 장애와 관련된 증상으로는 염증, 발열, 전반적인 불쾌감, 통증, 식욕 상실, 체중 감소, 부종, 두통, 피로, 발진, 빈혈, 근력 약화, 및 근육 피로를 포함하며, 이에 제한되지는 않는다.
병용 요법은 하나 이상의 추가의 치료제, 예를 들어, 화학요법제 또는 항신생물제, 예컨대 사이토카인 및 성장 인자 억제제, 면역억제제, 항염증제, 대사 억제제, 효소 억제제 및/또는 세포 독성 또는 세포 증식 억제제와 함께 제형화된, 및/또는 함께-투여된 본 발명의 하나 이상의 항체를 포함할 수 있다. 이 문맥에서 "조합"이라는 용어는 제제가 실질적으로 동시발생적으로, 동시에 또는 순차적으로 제공된다는 것을 의미한다. 화학요법제의 예는 알데스류킨(aldesleukin), 알트레타민(altretamine), 아미포스틴(amifostine), 아스파라기나제(asparaginase), 블레오마이신(bleomycin), 카페시타빈(capecitabine), 카르보플라틴(carboplatin), 카르뮤스틴(carmustine), 클라드리빈(cladribine), 시사프라이드(cisapride), 시스플라틴(cisplatin), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 시타라빈(cytarabine), 다카르바진(dacarbazine)(DTIC), 닥티노마이신(dactinomycin), 도세탁셀(docetaxel), 독소루비신(doxorubicin), 드로나비놀(dronabinol), 듀오카르마이신(duocarmycin), 에토포시드(etoposide), 필그라스팀(filgrastim), 플루다라빈(fludarabine), 플루오로우라실(fluorouracil), 겜시타빈(gemcitabine), 그라니세트론(granisetron), 히드록시우레아(hydroxyurea), 이다루비신(idarubicin), 이포스파미드(ifosfamide), 인터페론 알파(interferon alpha), 이리노테칸(irinotecan), 란소프라졸(lansoprazole), 레바미솔(levamisole), 류코보린(leucovorin), 메게스트롤(megestrol), 메스나(mesna), 메토트렉세이트(methotrexate), 메토클로프라미드(metoclopramide), 미토마이신(mitomycin), 미토탄(mitotane), 미톡산트론(mitoxantrone), 오메프라졸(omeprazole), 온단세트론(ondansetron), 파클리탁셀(paclitaxel)(TaxolTM), 필로카르핀(pilocarpine), 프로클로로페라진(prochloroperazine), 사프로인(saproin), 타목시펜(tamoxifen), 탁솔(taxol), 토포테칸 히드로클로라이드(topotecan hydrochloride), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine) 및 비노렐빈 타르트레이트(vinorelbine tartrate)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 항체는 환자의 적혈구 용적(hematocrit)을 증가시키는 유효량의 약제, 예를 들어 에리트로포이에틴 자극제(erythropoietin stimulating agents, ESA)와 조합될 수 있다. 상기 제제는 당 분야에 알려져 있고, 사용되며, 예를 들어, Aranesp®, Epogen®NF/Procrit®NF, Omontys®, Procrit® 등을 포함한다.
다른 구현 예에서, 본 발명의 항체는 이하의 FDA 승인 단클론 항체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 암의 치료에 사용된 다른 항체의 유효량과 조합될 수 있다: 리툭시맵(rituximab)(Rituxan®, CD20: 키메라 IgG1), 트라스투주맙(trastuzumab)(Herceptin®, HER2: 키메라 IgG1), 알렘투주맙(alemtuzumab)(Campath®, CD52: 인간화된 IgG1), 이브리투모맙 티욱세탄(ibritumomab tiuxetan)(Zevalin®, CD20: 뮤린, IgG1, 방사성표지된(이트륨(Yttrium) 90), 토시투모맙(tositumomab)-I-131(Bexxar®:CD20, 뮤린, IgG2a, 방사성표지된(요오드(Iodine) 131)), 세툭시맙(cetuximab)(Erbitux®, EGFR: cjimeric, IgG1), 베바시주맙(bevacizumab)(VEGF: 인간화된, IgG4), 파니투무맙(panitumumab)(Vectibix®, EGFR: 인간 IgG2), 오파투무맙(Arzerra®, CD20: 인간 IgG1), 이필리무맙(ipilimumab)(Ypervoy®, CTLA-4: 인간 IgG1), 브렌티욱시맙 베도틴(brentiuximab vedotin)(Adectris®, CD30: 키메라, IgG1, 약물-접합체), 퍼투주맙(pertuzumab)(Perjecta®, HER2: 인간화된 IgG1, 약물 접합체), 아도트라스투주맙 에마탄신(adotrastuzumab ematansine)(Kadcyla®, HER2: 인간화된, IgG1, 약물-접합체), 오비누투주맙(obinutuzumab)(Gazyva®, CD20: 인간화된 및 글리콜-조작된), 니볼루맙(nivolumab) 및 펨브롤리주맙(pembrolizumab)(항-PD-1s) 등. 트라스투주맙은 HER-2 항원을 표적으로 삼는다. 이 항원은 유방암과 전이성 위암의 25% 내지 35%에서 나타난다. 트라스투주맙은 HER2-과발현 유방암의 치료 및 HER2-과발현 전이성 위암 및 위식도 접합부 선암종에 대하여 승인을 받았다. 세툭시맙은 전이성 직장결장암, 전이성 비-소세포 폐암 및 두경부암의 치료에 사용된다. 니볼루맙 및 펨브롤리주맙은 최근 전이성 흑색종 및 비-소세포 폐암을 치료하는데 승인되었다. 그들은 폐암, 신-세포 암, 림프종 및 중피종에 대한 임상시험에서 검사를 받는다. 현재 임상 시험에서 시험되거나 연구중인 다른 암 약물도 함께 조합될 수 있다.
바람직한 조합은 본 발명의 CD47 항체와 i) 면역 체크-포인트 억제제 또는 ii) 대식세포 및 수지상 세포의 항-종양 활성을 재프로그래밍하는 면역 조절제 또는 iii) 종양 관련 항원에 대한 항체의 조합이다. 예시적인 조합으로는 Herceptin® 및 Erbitux®가 기술되어 있으며, 본원에서 Herceptin®과의 조합은 그것의 첨가제, 협동 또는 가능한 시너지 효과로 인해 바람직하다. 다른 제제들도 조합하는데 유용할 수 있다.
본 발명의 단클론 항체는 액상에서 이용될 수 있거나 고체상 담체에 결합될 수 있는 면역분석법에서 시험관 내에서 사용될 수 있다. 또한, 상기 면역분석법에서 단클론 항체는 다양한 방법으로 검출가능하게 표지될 수 있다. 본 발명의 단클론 항체를 이용할 수 있는 면역분석법의 유형의 예로는 유동 세포계측법, 예를 들어 FACS, MACS, 면역조직화학법, 직접 및 간접적인 포맷의 경쟁적 및 비경쟁적 면역분석법; 등이 있다. 본 발명의 단클론 항체를 사용하여 항원을 검출하는 것은 생리적 샘플에 대한 면역조직화학적 분석을 포함하여, 순방향, 역방향 또는 동시 모드로 수행되는 면역분석법을 이용하여 수행될 수 있다. 당업자는 과도한 실험없이 다른 면역분석법 포맷을 알고 있거나 쉽게 구별할 수 있다.
본 발명의 단클론 항체는 많은 상이한 담체에 결합될 수 있고, CD47-발현 세포의 존재를 검출하는데 사용될 수 있다. 잘 알려진 담체의 예는 유리, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 덱스트란, 나일론, 아밀라아제, 천연 및 변성 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 아가로스 및 마그네타이트를 포함한다. 담체의 성질은 본 발명의 목적상 가용성 또는 불용성일 수 있다. 당업자는 통상적인 실험을 사용하여 단클론 항체에 결합하기 위한 다른 적합한 담체를 알 수 있거나 또는 이를 확인할 수 있을 것이다.
치료 방법에서 추적자로서 사용하고, 진단 방법에서 사용하기 위한, 당 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 공지된 많은 다른 표지 및 표지 방법이 있다. 진단 목적을 위해, 표지는 본 발명의 항체, 또는 CDR 서열로 구성되는 또는 포함하는 단편을 포함하는, 그의 단편에 공유결합 또는 비공유결합될 수 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 표지 유형의 예는 효소, 방사성 동위원소, 형광 화합물, 콜로이드 금속, 화학발광 화합물 및 생체-발광 화합물을 포함한다. 당업자는 본 발명의 단클론 항체에 결합하기 위한 다른 적합한 표지를 알 수 있거나, 또는 통상적인 실험을 사용하여 이를 확인할 수 있을 것이다. 또한, 본 발명의 단클론 항체에 대한 상기 표지의 결합은 당업자에게 일반적인 표준 기술을 사용하여 수행될 수 있다.
일부 구현 예에서, 항체 또는 이의 단편은 예를 들어 이미징에 사용하기 위해, 나노입자에 부착된다. 유용한 나노입자는 예를 들어, 제한없이 라만-실리카-금-나노입자(R-Si-Au-NP)를 포함하는 당 분야에 공지된 것들이다. R-Si-Au-NP는 좁은 밴드의 스펙트럼 시그니처가 있는, 라만 유기 분자로 이루어져 있으며, 금 코어 상에 흡착된다. 라만 유기 분자가 변할 수 있기 때문에, 각 나노입자는 자체 서명을 지님으로써 멀티플렉싱을 통해 다중 나노입자가 동시에 독립적으로 검출될 수 있다. 전체 나노입자는 실리카 껍질에 캡슐화되어, 라만 유기 분자를 금 나노코어에 고정시킨다. R-Si-Au-NP의 선택적인 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-일화(ylation)는 그들의 생체이용률을 증가시키고, 표적 부분을 부착시키는 기능성 "손잡이(handles)"를 제공한다(Thakor A.S., Luong R., Paulmurugan R., et al. et al. "The fate and toxicity of raman-active silica-gold nanoparticles in mice", Sci. Transl. Med. 3(79):79ra33 (2011); Jokerst J.V., Miao Z., zavaleta C., Cheng Z., and Gambhir S.S. "Affibody-functionalized gold-silica nanoparticles for Raman molecular imaging of the epidermal growth factor receptor", Small. 7(5):625-33 (2011); Gao J., Chen K., Miao Z., Ren G., Chen X., Gambhir S.S., Cheng Z. "Affibody-based nanoprobes for HER2-expressing cell and tumor imaging", Biomaterials 32(8):2141-8 (2011) 참조; 각 문헌들은 이후에 참고로 포함됨).
본 발명의 목적을 위해, CD47은 생물학적 유체 및 조직상에, 생체 내 또는 시험관 내에 존재할 때 본 발명의 단클론 항체에 의해 검출될 수 있다. 검출가능한 양의 CD47을 함유하는 임의의 샘플이 사용될 수 있다. 샘플은 소변, 타액, 뇌척수액, 혈액, 혈청 등과 같은 액체이거나, 또는 조직, 대변 등과 같은 고체 또는 반고체일 수 있거나, 대안으로는 조직학적 진단에 통상적으로 사용되는 것과 같은 고체 조직일 수 있다.
감도를 증가시킬 수 있는 다른 표지 기술은 항체를 저 분자량의 합텐에 커플링시키는 것으로 구성된다. 그후 상기 합텐은 두 번째 반응에 의해 특이적으로 검출될 수 있다. 예를 들어, 특정 항-합텐 항체와 반응할 수 있는, 아비딘 또는 디니트로페놀, 피리독살 또는 플루오레신과 반응하는 비오틴과 같은 합텐을 사용하는 것이 일반적이다.
편리성의 문제로서, 본 발명의 항체는 키트, 즉 소정량의 제제와 진단 분석을 수행하기 위한 설명서의 포장된 조합으로 제공될 수 있다. 항체가 효소로 표지되는 경우, 키트는 효소에 의해 요구되는 기질 및 보조 인자(예를 들어, 검출가능한 발색단 또는 형광발색을 제공하는 기질 전구체)를 포함할 것이다. 또한, 안정화제, 완충액(예를 들어, 블록 완충액 또는 용해 완충액) 등과 같은 다른 첨가제가 포함될 수 있다. 다양한 제제의 상대적인 양은 분석의 민감도를 실질적으로 최적화하는 제제의 용액 중 농도를 제공하기 위해 광범위하게 다양할 수 있다. 특히, 제제는 용해시 적당한 농도를 갖는 제제 용액을 제공할 부형제를 포함하는 보통, 동결 건조 분말로서 제공될 수 있다.
본 발명의 하나 이상의 항체를 포함하는 치료용 제형은 동결건조된 제제 또는 수용액의 형태로 임의의 생리학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제(Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))와 원하는 정도의 순도를 갖는 항체를 혼합함으로써 저장을 위해 제조된다. 항체 조성물은 훌륭한 의학적 처치와 일치하는 방식으로 제형화되고, 복용되고, 투여될 것이다. 이 문맥에서 고려해야할 요인은 치료되는 특정 질환, 치료되는 특정 포유동물, 개별 환자의 임상 상태, 장애의 원인, 약제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄링, 및 의료 종사자들에게 알려진 다른 요소들을 포함한다. 투여될 항체의 "치료적 유효량"은 상기 고려사항에 따라 결정될 것이며, CD47-관련 질병을 예방하는데 필요한 최소량이다.
치료 용량은 체중 kg 당 적어도 약 0.01mg, 체중 kg 당 적어도 약 0.05mg; 체중 kg 당 적어도 약 0.1mg, 체중 kg 당 적어도 약 0.5mg, 체중 kg 당 적어도 약 1mg, 체중 kg 당 적어도 약 2.5mg, 체중 kg 당 적어도 약 5mg, 체중 kg 당 적어도 약 10mg, 및 체중 kg 당 약 100mg 이하, 바람직하게는 체중 kg 당 0.1 내지 20mg일 수 있다. 당업자는 상기 가이드라인이 활성제의 분자량, 예를 들어 항체 단편의 사용 또는 항체 콘쥬 게이트의 사용에 대해 조정될 것이라는 것을 이해할 것이다. 투여량은 또한 국소 투여, 예를 들어 비강내 흡입 등, 또는 전신 투여, 예를 들어 i.m., i.p., i.v. 등을 위해 다양할 수 있다.
항체는 반드시 그럴 필요는 없지만, 선택적으로 활성을 강화시키거나 다른 방법으로 치료 효과를 증가시키는 하나 이상의 약제로 제형화된다. 이들은 일반적으로 상기에서 사용된 것과 동일한 투여량 및 투여 경로 또는 약 1 내지 99%의 종래 사용된 투여량으로 사용된다.
허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용된 투여량 및 농도에서 수혜자에게 무독성이며, 인산염, 시트르산염 및 기타 유기산과 같은 완충액; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 방부제(예컨대, 옥타데시이디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 잔기 미만) 폴리펩타이드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글라이신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신과 같은 아미노산; 단당류, 이당류 및, 글루코스, 만노오스 또는 덱스트린을 포함한 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨과 같은 당; 나트륨과 같은 염-형성 카운터-이온; 금속 착물(예를 들어, Zn-단백질 복합체); 및/또는 TWEEN™, PLURONICSTM 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 비-이온성 계면활성제를 포함한다. 생체 내 투여에 사용되는 제형은 무균이어야 한다. 이것은 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성된다.
활성 성분은 또한 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포솜, 알부민, 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 또는 매크로에멀젼에서 각각 코아세르베이션 기술에 의해 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어, 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에 포획될 수 있다. 상기 기술은 Remington 's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)에 개시되어 있다.
항-CD47 항체는 비경구, 피하, 복강내, 폐내 및 비강내를 포함하는 임의의 적합한 수단에 의해 투여된다. 비경구 주입에는 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여가 포함된다. 또한, 항-CD47 항체는 펄스 주입에 의해, 특히 항체의 감소된 투여량으로 적당하게 투여된다.
질병의 예방 또는 치료를 위해, 항체의 적당한 투여량은 상기 정의된 바와 같이 치료될 질환의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 항체가 예방 목적으로 투여되었는지 여부, 이전의 치료법, 환자의 임상 내력 및 항체에 대한 반응, 주치의의 재량에 따라 다를 것이다. 항체는 한 번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적합하게 투여된다.
본 발명의 또 다른 구현 예에서, 상기 질환의 치료에 유용한 물질을 함유하는 물품이 제공된다. 제조 물품은 용기 및 라벨을 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어, 병, 바이알, 주사기 및 시험관을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로 형성될 수 있다. 상기 용기는 상기 상태를 치료하는데 효과적인 조성물을 보유하고, 멸균 접근 포트(예를 들어, 상기 용기는 피하 주사 바늘에 의해 관통가능한 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있음)를 가질 수 있다. 조성물 중의 활성제는 항-CD47 항체이다. 용기 위의 라벨 또는 용기와 관련된 라벨은 조성물이 해당 질환을 치료하는데 사용됨을 나타낸다. 제조 물품은 인산염 완충 식염수, 링거액 및/또는 덱스트로스 용액과 같은 약학적으로-허용가능한 완충액을 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 그것은 다른 완충액, 희석제, 필터, 바늘, 주사기 및 사용 설명서가 있는 패키지 삽입물을 포함하여, 상업적 및 사용자 입장에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 이제 충분히 기술되었지만, 본 발명의 사상 및 범주를 벗어나지 않으면서 다양한 변경 및 수정이 이루어질 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다.
서열
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ARPYYGSRWDYTMDY
SEQ ID NO: 115
VL008-AL17-8K7; 경쇄; CDR1-Kabat
KSSQNLLNSNNQKNHLA
SEQ ID NO: 116
VL008-AL17-8K7; 경쇄; CDR2-Kabat
FASTRES
SEQ ID NO: 117
VL008-AL17-8K7; 경쇄; CDR3-Kabat
QQHYTTPYT
SEQ ID NO: 118
VL008-AL17-8K7; 경쇄; CDR1-IMGT
QNLLNSNNQKNH
SEQ ID NO: 119
VL008-AL17-8K7; 경쇄; CDR2-IMGT
FAST
SEQ ID NO: 120
VL008-AL17-8K7; 경쇄; CDR3-IMGT
QQHYTTPYT
SEQ ID NO: 121
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VTVSA
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SEQ ID NO: 123
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VT008-AL6-39K2; 가변 영역 경쇄
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EIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSIDQKNYLAWYQQKAGQSPKLLIYFASTK
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SEQ ID NO: 150
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Figure pat00010
Figure pat00011
Figure pat00012
Figure pat00013
Figure pat00014
Figure pat00015
Figure pat00016
실시예
I. 마우스 항-CD47 항체의 생성
1. 마우스의 예방접종
인간 CD47(hCD47)에 대한 마우스 항체를 생성시키고, 마우스 CD47(mCD47)과 잠재적으로 교차-반응시키기 위해, NMRI 야생형 또는 CD47-KO(C57BL6) 마우스를 2주 간격의 4회의 DNA 주사 후, CD47 DNA 또는 CD47 발현 벡터로 형질감염된 CHO 세포로 1주 간격으로 2개의 최종 부스트를 수행하는 것을 포함하는 프로토콜로 하기와 같이 예방접종하였다 :
- (5) WT 마우스:프라임 인간 CD47 DNA + 부스트 인간 CD47 DNA
- (3) CD47-/-마우스:프라임 인간 CD47 DNA + 부스트 뮤린CD47 CHO
- (3) CD47-/-마우스:프라임 뮤린CD47 CHO + 부스트 뮤린CD47 CHO
혈청 스크리닝 결과에 따라 동물 희생을 실시하였다. ELISA(hCD47-인간IgG1 융합 단백질, hCD47-Fc 또는 mCD47-인간IgG1 융합 단백질, mCD47-Fc의 코팅)를 사용하여, 및 hCD47 또는 mCD47을 발현하는 안정한 CHO 세포(hCD47 또는 mCD47를 코딩하는 벡터로 형질감염시킨 후, 안정한 CD47-발현 클론을 선별한 후 수득됨, 도시되지 않음) 상에서의 유동 세포계측법에 의해, 예방접종된 동물의 혈청에서 인간 또는 마우스 CD47에 결합하는 IgG의 존재 및 역가를 모니터링하였다. 강한 항-CD47 IgG 역가를 나타내는 동물을 희생시켰다. 이들의 비장과 림프절을 추출하고, 단핵 세포(MNCs)를 정제하고, 동결시켰다.
2. ISAAC 기술을 이용한 단일 B 세포 스크리닝 및 재조합 항-CD47 항체 생성
WO2009/017226에 기술된 ISAAC 기술은 마이크로어레이 칩을 사용하여 개별적인 항체-분비 세포를 검출하는 독창적인 방법으로서, 단일-세포 기준으로 살아있는 세포의 분석을 가능하게 하고, 관련 세포를 동정 및 회수하기 위한, 신속하고 효율적이며, 높은 처리량(234,000개 이하의 개별 세포) 시스템을 제공한다.
예방접종된 마우스의 비장 및 림프절로부터 미리 정제된 마우스 MNC를 마이크로 어레이 칩에 적용하여 단일 생세포 어레이를 제조하였다. 칩 표면은 이전에 표적 항원(hCD47-인간IgG1 융합 단백질, hCD47-Fc)으로 코팅되었고, 항체 분비 세포에 의해 분비된 항-CD47 마우스 항체는 웰 주위의 표면 상에 코팅된 CD47에 의해 포집되었다. 세척 후, 고정화된 CD47에 결합된 마우스 IgG의 존재는 Cy3 및 형광 현미경에 결합된 항-마우스 IgG 항체에 의해 검출되었다. 특정 항체에 대한 항원의 결합은 뚜렷한 원형 반점을 형성하였으며, 이는 비특이적 신호와 쉽게 구별할 수 있었다. 그다음, CD47-특이적 항체-분비 단일 세포를 미세조작에 의해 회수하고, 단일 세포로부터 mRNA를 회수하고, IgG의 중쇄(VH) 및 경쇄(VL)의 가변 영역을 코딩하는 cDNA 서열을 RT-PCR에 의해 증폭시켰다. 이어서, VH 및 VL 서열을 마우스 γ-2a 불변 영역(Fcγ2a) 및 카파 또는 람다 불변 영역을 각각 함유하는 발현 벡터에 클로닝하였다. CHO 세포에서 H 및 L 사슬 발현 벡터의 동시-형질감염 후, 재조합 항체를 세포 상등액으로부터 단백질 A 칼럼상에서 정제하고, hCD47-Fc 또는 mCD47-Fc로 코팅된 플레이트상에서 ELISA에 의해, hCD47 또는 mCD47로 형질감염된 또는 되지않은 CHO 세포에서의 유동 세포계측법에 의해, CD47 인식 및 특이성에 대해 시험하였다.
총 55개의 항체가 동정되었으며, 그 중 34개(18개의 다른 생식계열에 속함)가 생산되고 정제되었다. 34개의 항체 중 19개는 인간 CD47만을 인식하고, 1개의 항체는 마우스 CD47만을 인식했으며, 14개의 항체는 인간 및 마우스 CD47을 모두 인식하였다.
II. 항-CD47 후보물질의 서열
표 1 내지 3(supra)은 선택된 10개의 후보물질의 아미노산 서열을 나타낸다. 나열된 서열에서, CDR은 Kabat 및 IMGT 주석에 따라 동정된다.
III. 재조합 마우스 항-CD47 항체의 시험관 내 특성분석
1. ELISA에 의한 CD47 결합 분석
모든 항체를 ELISA 플레이트 상에 코팅된 재조합 hCD47-Fc 및 mCD47-Fc에 결합시키는 능력을 시험하였다. 시험된 34개의 정제된 항체 중에서 19개는 hCD47만 인식하였으며, 1개의 항체는 mCD47만 인식하였고, 및 14개의 항체는 인간 및 마우스 CD47 모두를 인식하였다(데이터는 나타내지 않음).
2. CD47-형질감염된 CHO 세포 상에서의 유동 세포계측법 및 마우스 및 사이노몰구스 CD47과의 교차-반응성에 의한 CD47 결합 분석.
동정된 마우스 항-CD47 항체가 세포막 발현된 인간 CD47뿐만 아니라 다른 종으로부터의 CD47 단백질을 인식하는 능력을 인간, 마우스 또는 비-인간 영장류(사이노몰구스 원숭이) 기원의 CD47 항원을 안정하게 발현하는 CHO 세포를 사용하여 유동 세포계측법에 의해 추가로 분석하였다. CHO 세포 표면 상에서의 종-특이적 CD47의 발현은 적당한 항-CD47 항체에 의한 염색 및 비-고정 세포에서의 유동 세포계측법을 사용하여 입증되었다. 인간 및 사이노몰구스 CD47의 발현을 확인하기 위해 항체 B6H12(마우스 IgG1, Abcam)를 사용하고, 마우스 CD47의 발현을 체크하기 위해 MIAP301(래트 IgG2a, BD Biosciences)를 사용하고, 원숭이 CD47의 발현을 확인하기 위해 MEM122(마우스 IgM, abcam)를 사용하였다.
항-CD47 항체 및 이소타입 대조군 항체를 +4℃에서 30분 동안 상이한 CD47 종을 발현하는 CHO 세포로 7.3μg/mL 내지 3.3ng/mL의 다양한 농도로 배양하였다. 2회 세척한 후, 세포막 CD47에 결합된 항체의 존재는 일차 항체의 이소타입에 의존하는 PE 결합된 항-마우스 또는 항-인간 IgG 항체와 함께 배양함으로써, 및 Accuri-C6 유동 세포계측기(BD Biosciences) 상에서 분석함으로써 밝혀냈다. 각 항체 농도에 대해 얻은 평균 형광 강도(MFI)와 일차 항체가 없는 상태에서 얻은 강도(δ-MFI) 사이의 차이를 계산하여, 항체 농도에 대해 플로팅하였다. CD47을 인식하지 못하는 적당한 이소타입(mIgG1, mIgG2a, hIgG1, hIgG4)의 음성 대조군 항체를 배경 항체 염색(비특이적 염색)을 측정하기 위한 동일한 조건하에서 시험하였다.
다른 항-hCD47 기준 항체도 본 발명의 후보물질과 병행하여 시험했다. 스탠포드 대학(WO2011/143624)으로부터의 마우스 B6H12, 키메라 5F9(c5F9) 및 인간화된 5F9(hu5F9; vh2-vl2) 항체; Inhibrx(US2013/0224188; WO2014/123580)로부터의 마우스 2A1 항체 및 그의 인간화된 변이체 AB06.12; Novimmune(WO2014/087248)로부터의 마우스 5A3M3 항체; 및 Frazier 등(WO2014/093678)으로부터의 마우스 VxP037-01LC1 항체를 포함하였다.
10개의 마우스 항-CD47 항체에 대해 얻어진 결과를 하기 표 4에 요약하고, 기준 항체로 수득한 결과와 비교하였다. 10개의 마우스 항-CD47 후보물질 모두는 인간 및 사이노몰구스 CD47을 발현하는 CHO 세포에 강하게 결합하지만, 형질감염되지 않은 CHO 세포에는 그렇지 않았다. 또한, 5개의 후보물질(후보물질 14, 15, 26, 29 및 30)도 마우스 CD47을 발현하는 CHO 세포에 강하게 결합한 반면, 다른 5개의 항체는 그렇지 않았다. 이 결과는 5개의 항체가 인간 및 사이노몰구스 기원의 CD47(후보물질 7, 19, 20, 22 및 33)을 특이적으로 인식하고, 5개의 다른 항체도 마우스 기원의 CD47(후보물질 14, 15, 26, 29, 30)에 대해 교차-반응을 일으킨다는 것을 보여 주었으며, 이는 상기 항체들에 의한 다른 에피토프(들)의 인식을 제시한다.
보고된 바에 따르면, 2A1 및 B6H12 기준은 hCD47을 인식하고 cynoCD47과 교차 반응하지만 mCD47과 교차 반응하지 않는 반면, VxP037-01LC1 항체는 사이노몰구스 및 마우스 CD47에 대해 교차 반응하였을 뿐만 아니라 야생형 CHO 세포 상에 발현된 햄스터 CD47 세포에 대해 가능하게 교차-반응하였다.
Figure pat00017
3. ELISA에 의한 CD47/SIRPα 상호작용의 억제
항체를 ELISA에 의해 CD47-SIRPα 상호작용을 파괴시키는 능력에 대해 시험하였다. 실험 전날, hCD47-hIgG1 융합 단백질을 96 웰 플레이트의 바닥에 코팅하고, 4℃에서 밤새 배양했다. 이어서 웰을 세척하고, 실온에서 2시간 동안 포화시켰다. 세척 단계 후에, 시험할 항체뿐만 아니라 항원(hSIRPα-6HIS 융합 단백질, Gentaur)을 각 웰에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 세척 후, 상호작용하는 SIRPα의 존재 유무는 HRP-접합된 항-6His 이차 항체(Bethyl) 및 퍼옥시다제 기질에 의해 검출되었다. 선택된 10개의 항체 모두 hSIRPα와 hCD47의 결합을 억제하는 것으로 나타났다(데이터는 나타내지 않음).
4. CHO 세포 상에서의 유동 세포계측법에 의한 CD47/SIRPα 상호작용의 억제
이어서, 8개의 최상의 후보물질을 ELISA 및 CD47-형질감염된 CHO 세포(후보물질 7, 14, 15, 19, 20, 22, 26, 33)에 의한 이들의 결합 프로파일에 따라 추가로 선택하고, CHO 세포 상에서 발현된 hCD47에 대한 인간 SIRPα(hSIRPα)의 결합을 억제하는 능력에 대하여 시험하였다. 인간 CD47-형질감염된 세포(3×105 세포/96-웰 플레이트의 웰) 먼저 항-CD47 항체 또는 이소타입 대조군 항체(mIgG2a 또는 mIgG1 포맷)의 연속 희석과 함께 +4℃에서 30분 배양하였다. 그런 다음 세포를 세척하고. +4℃에서 30분 동안 His-태그된 hSIRPα(His-hSIRPα, Gentaur) 10μg/mL와 함께 배양했다. 세척 후, His-hSIRPα의 CHO 세포와의 결합은 토끼 항-His 항체(Bethyl)와 함께 배양한 후, FITC-접합된 염소 항-토끼 IgG(BD Biosciences)에 의해, 및 Accuri-C6 유동 세포계측기(BD Biosciences) 상에서 유동 세포계측 분석함으로써 나타났다.
hCD47에 대한 hSIRPα 결합의 억제율은 하기와 같이 계산하였다:
% 억제율 = (1-(MFI_wAb - MFI_wohSIRPα)/(MFI_whSIRPα - MFI_wohSIRPα))×100,
상기 식에서, MFI_wAb는 시험된 항체 및 hSIRPα와 함께 배양된 hCD47-CHO 세포를 사용하여 얻은 평균 강도 형광(MFI)이고; MFI_wohSIRPα는 hSIRPα의 부재(100% hSIPRα 결합 억제)하에 얻어진 MFI이고; 및 MFI_whSIRPα는 항체와 사전 배양하지 않지만(0% SIRPα 결합 억제), hSIRPα를 갖는 형광 물질이다. 항체 농도에 대해 % 억제율을 플롯팅하고, 그래프패드 프리즘 소프트웨어의 비선형 회귀 분석 모델을 사용하여 IC50 값을 계산하였다. 하기의 도 1 및 표 5에 제시된 결과는 8개의 선택된 후보물질(번호 7, 14, 15, 19, 20, 22, 26 및 33)이 CHO 세포 상에서 발현된 hCD47에 대한 hSIRPα의 결합을 강력하게 억제함을 보여주며, IC50 값은 0.36 내지 1.10 μg/mL(2.4 내지 7.3 nM) 범위임을 보여주었다. 8개의 항-CD47 후보물질은 B6H12 및 5A3M3 항체보다 우수하였으며, 2A1 및 VxP037-01LC1 항체와 유사했다.
Figure pat00018
5. Raji 세포에 의해 발현된 hCD47에 대한 항-CD47 항체의 결합
8개의 추가 선택된 후보물질(번호 7, 14, 15, 19, 20, 22, 26, 33)을 Raji 인간 B 림프종 세포주 상에서 발현된 hCD47에 결합하는 능력에 대해 시험하였다. Raji 세포(ATCC-CLL-86; 2×105 세포/96-웰 플레이트의 웰)를 먼저 항-CD47 항체 또는 대조군 이소타입 항체(mIgG2a 또는 mIgG1 포맷으로)의 일련의 희석과 함께 +4℃에서 30분 동안 배양하였다. 그 다음 세포를 세척하고, PE-접합된 F(ab)'2 염소 항-마우스 IgG 항체(1/100 희석, Beckman Coulter)와 함께 +4℃에서 30분 동안 배양했다. 세척 후, 세포의 형광을 Accuri-C6 유동 세포계측기(BD Biosciences)상에서 유동 세포계측법으로 분석하였다.
시험된 항체로 측정된 강도와 항체가 없는 경우의 강도 간의 차이를 나타내는 MFI의 델타를 각 항체 농도에 대해 계산하고, 그 값을 항체 농도에 대해 플롯팅하였다. EC50 값은 그래프패드 프리즘 소프트웨어의 비선형 회귀 분석 모델을 사용하여 계산하였다.
이하의 도 2와 표 6에 제시된 결과는 Raji 세포에서 발현된 hCD47에 8개의 후보물질(번호 7, 14, 15, 19, 20, 22, 26 및 33)가 강하게 결합하고, EC50 값의 범위가 0.03 내지 0.17 μg/mL(0.2 내지 1.1 nM)임을 보여준다. 8개의 항-CD47 후보물질은 B6H12 및 5A3M3 항체보다 우수하였으며, 경쟁 물질인 2A1 및 VxP037-01LC1 항체와 유사했다.
Figure pat00019
6. Raji 세포 상에서 유동 세포계측법에 의한 CD47/SIRPα 상호작용의 억제
8개의 추가 후보물질 중 6개(번호 14, 15, 19, 20, 22, 33)를 인간 B 림프종 Raji 세포 상에 발현된 hCD47에 대한 hSIRPα의 결합을 억제하는 능력에 대하여 시험하였다. 이 목적을 위해, Raji 세포(ATCC-CCL-86; 2×105 세포/96-웰 플레이트의 웰)를 먼저 항-CD47 항체 또는 이소타입 대조군 항체(키메라 항-CD47 후보물질은 hIgG1 또는 hIgG4 포맷으로 생산됨)의 연속 희석액과 함께 +4℃에서 30분 동안 배양하였다. 그런 다음, 세포를 세척하고 2.5 μg/mL의 His-태그된 hSIRPα(His-hSIRPα, Gentaur)와 함께 +4℃에서 30분 동안 배양했다. 세척 후, Raji 세포에 대한 His-hSIRPα의 결합은 마우스 항-His 항체(1/1000 희석물; Qiagen)와 함께 배양하고, 이어서 PE-접합된 염소 항-마우스 IgG(1/100 희석물; Beckman Coulter) 및 Accuri-C6 유동 세포계측기(BD biosciences)에서의 유동 세포계측법 분석에 의해 나타났다.
hCD47에 대한 hSIRPα 결합의 억제율은 하기와 같이 계산하였다:
% 억제율 = (1-(MFI_wAb - MFI_wohSIRPα)/(MFI_whSIRPα - MFI_wohSIRPα))×100,
상기 식에서, MFI_wAb는 시험된 항체 및 hSIRPα와 함께 배양된 Raji 세포로 얻은 평균 강도 형광(MFI)이고; MFI_wohSIRPα는 hSIRPα의 부재(100% hSIPRα 결합 억제)하에 얻어진 MFI이고; 및 MFI_whSIRPα는 항체와 사전 배양하지 않지만(0% SIRPα 결합 억제), hSIRPα를 갖는 형광 물질이다. 항체 농도에 대해 % 억제율을 플롯팅하고, 그래프패드 프리즘 소프트웨어의 비선형 회귀 분석 모델을 사용하여 IC50 값을 계산하였다.
하기의 도 3 및 표 7에 제시된 결과는 6개의 선택된 후보물질(번호 14, 15, 19, 20, 22 및 33)이 Raji 세포 상에서 발현된 hCD47에 대한 hSIRPα의 결합을 강력하게 억제함을 보여주며, IC50 값은 0.021 내지 0.369 μg/mL(0.14 내지 2.46 nM) 범위임을 보여주었다. 6개의 항-CD47 후보물질은 키메라 B6H12 및 키메라 5F9 항체뿐만 아니라 인간화된 5F9 및 AB06.12 항체와 유사하거나 더 우수했다.
Figure pat00020
7. 인간 대식세포에 의한 Raji 세포의 식균작용
CD47은 대식세포와 같은 식균작용 활성을 갖는 세포 상에서 발현된 SIRPα와 상호작용하여 CD47-발현 세포의 식균작용을 막는 "나를 먹지 마시오" 신호로 간주된다. 대식세포에 의한 종양 세포의 식균작용을 증가시키는 최선의 후보물질의 능력을 평가하기 위하여, 인간 B 림프종 Raji 세포에 5(6)-카르복시플루오레세인 N-히드록시숙신이미딜 에스터(CFSE, 2.5 μM, Abcam)를 먼저 로딩한 후, 항-CD47 항체 또는 대조군 항체(mIgG1 포맷)의 상이한 희석액과 함께 배양하였다. 이어서, 세포를 세척하고, 9일 동안 10 ㎍/mL M-CSF(Peprotech)의 존재하에 24-웰 플레이트에서 인간 말초 혈액 단핵 세포로부터 사전 분화된 부착성 대식세포의 존재하에 두었다. +37℃에서 4시간 배양한 후, 세포 혼합물을 차가운 PBS로 확실하게 세척하고, 접착성 대식세포를 PFA로 고정시켰다. 고정된 세포를 HB050 램프가 장착된 Axiovert 40FL 형광 현미경(Zeiss) 하에서 검사하였다. 녹색 형광 사진(Raji 세포)과 명시야(대식세포)의 사진을 디지털 AxioCam 카메라로 모니터링하고, Raji 세포(녹색 형광) 및 대식세포의 수를 ZEN 라이트 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 필드 당 카운팅하였다. 그후, 식균작용 지수를 100개의 대식세포 당 섭취한 Raji 세포의 수로 계산하였다.
이하의 도 4와 표 8에 제시된 결과는 8개의 선택된 후보물질(번호 7, 14, 15, 19, 20, 22, 26 및 33)가 인간 대식세포에 의한 Raji 세포의 식균작용을 개선시켰음을 보여준다. 최적-이하 농도(0.125 μg/mL)에서, 후보물질은 B6H12 및 5A3M3 항체보다 우수했으며, 2A1 및 VxP037-01LC1 항체와 유사했다.
Figure pat00021
8. 적혈구 응집 분석
사전 선택된 8개의 후보물질을 인간 적혈구(RBC)의 응집을 유도하는 능력에 대하여 테스트한 후, 기준 항체와 비교했다.
첫 번째 일련의 실험에서, 인간 말초 혈액에서 정제된 적혈구를 항-CD47 항체 또는 대조군 항체의 연속 희석액과 함께 37℃에서 1시간 동안 U-바닥 96 플레이트에서 배양하였다. 배양 후, RBC 응집의 증거는 응집되지않은 RBC의 점상 적색 펠릿과 대조적으로 헤이즈(haze)의 출현에 의해 입증되었다. RBC 펠릿의 면적을 측정하고, 본질적으로 WO2014/123580에 기술된 바와 같이, 상이한 항체 농도에서의 RBC의 면적 대 항체가 없는 RBC의 면적의 비로 혈구응집 지수를 계산하였다. 혈구응집 지수는 도 5에 도시된 바와 같이 항체 농도에 대해 플롯팅되었다. 후보물질 14 및 15, 및 보다 적게는 후보물질 26은 정제된 RBC의 강한 응집을 유도하는 것으로 밝혀졌다. 참고로 이 3개의 항체는 동일한 클론 계열에 속하며, mCD47과 교차-반응한다. 대조적으로, 후보물질 19, 20 및 33은 2A1 항체에서도 관찰되는 바와 같이, 0.01 nM 내지 240 nM(~ 1.5 ng/mL 내지 36 μg/mL) 범위의 농도로 시험했을 때 정제된 RBC의 응집을 유도하지 않았다. 후보물질 7 및 22는 VxP037-01LC1과 B6H12 항체에서도 관찰되는 좁은 농도 창에서 약한 응집을 유도하는 것으로 밝혀졌다. 항체 5A3M3은 고농도에서만 정제된 RBC의 응집을 유도하였다.
제2 세트의 실험에서, 본질적으로 WO2014/087248에 기술된 바와 같이, 8개의 선택된 후보물질을 전체 말초 혈액으로부터의 정제되지 않은 RBC를 사용함으로써 인간 RBC의 응집을 유도하는 능력에 대해 시험하였다. 이를 위해, 인간 말초 혈액(1/5 최종 희석액)을 평평한-바닥 96-웰 플레이트에서 항-CD47 항체 또는 대조군 항체를 연속 희석하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 배양 후, 플레이트를 부드럽게 교반하고, 약 30°기울였으며, 10분 동안 방치하였다. RBC 응집의 증거는 웰의 하류 경계 부근의 바닥에 초승달 모양의 응집 침착물의 출현에 의해 증명되었다. 항-CD47 후보물질의 상이한 포맷을 시험하고, 기준 항체와 비교하였다. mIgG1 또는 hIgG1 키메라 포맷의 후보물질 20은 2A1 및 AB06.12(인간화된 2A1) 항체에서도 관찰된 바와 같이, 0.023 내지 50 ㎍/mL(~0.15 내지 330nM)의 농도 범위에서 적혈구 응집을 유도하지 않았다. hIgG4 포맷의 후보물질 20 및 AB06.12 항체 모두 16 μg/mL 이상의 농도에서 약한 RBC 응집이 관찰되었다. 대조적으로, 키메라 5F9(c5F9) 및 인간화된 5F9(hu5F9, vh2/vl2 변이체)는 hIgG1 및 hIgG4 포맷 모두에서 시험했을 때 더 강한 응집을 유도하였다. 키메라 B6H12는 hIgG1 포맷에서 RBC 응집을 유도하였지만, hIgG4 이소타입에서는 보다 약하게 유도하였다.
전혈을 사용한 이 분석에서, 후보물질 19, 22 및 33은 5㎍/mL보다 높은 농도에서 RBC 응집을 유도하는 것으로 밝혀졌다. 이 관찰은 테스트된 형식(mIgG 또는 키메라 hIgG)과는 무관하다. 마지막으로, 후보물질 14 및 15, 및 보다 적게 후보물질 7 및 26은 정제되지 않은 RBC의 강한 응집을 유도하였다.
적혈구 응집 분석 데이터는 하기 표 9에 요약되어있다.
Figure pat00022
9. 최상의 마우스 항-CD47 후보물질의 친화도
마우스 항-CD47 후보물질의 동역학 상수(Kon & Koff)와 해리 상수(KD)는 6His-태그(SEQ ID NO: 160)(hCD47-his 단백질)에 의해 태그된 인간 CD47 세포외 도메인의 가용성 제제를 사용하여 Biacore T200(GE Healthcare)의 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 추가로 측정하고, 기준과 비교하였다. 간단히 말해서, 항체와 hCD47-his 사이의 결합 친화도는 +20℃에서 Biacore T200 기기의 단일-사이클 동역학 프로토콜을 사용하여 측정되었다. 항-인간 또는 항-마우스 IgG(Fc)를 제조사의 설명서(GE Healthcare)에 따라 인간 또는 마우스 항체 캡처 및 아민 커플링 키트를 사용하여 Serie S 센서 칩 CM5 표면에 먼저 고정시켰다. 그 결과 표면 상에 약 10,000개의 응답 단위(RU)가 고정되었다. 그 후, ~300 RU가 표면 상에 캡쳐되도록 조정된 농도 및 접촉 시간에 대조군으로서 사용된 유동 세포 1을 제외한 모든 유동 세포에서 적당한 항-마우스 또는 항-인간 IgG 표면으로 시험될 마우스 키메라화 또는 인간화된 항체를 포획하였다. 결합 동역학은 30 μL/min의 속도로 모든 유동 세포를 통해 일련의 5회 10분 주사에서 hCD47-his의 농도를 증가시킴으로써 연구되었다. 3배 희석법을 최대 농도 270nM까지 사용하였다. 최종 주사 후, 결합된 항원의 해리를 모니터링하기 위해 완충액을 각 유동 세포에 60분(마우스) 또는 30분(인간) 동안 통과시켰다. 결합 표면의 재생은 3 μM MgCl2를 20 μL/분으로 60초간 유동시키고, 이어서 10 mM 글리신-HCl, pH 1.7을 10 μl/분(인간의 경우)으로 180초간 유동시키거나, 또는 10 mM 글리신-HCl, pH 1.7을 10 μl/분(마우스의 경우)로 360초간 유동시킴으로써 수행하였다. 동일한 항체를 가지고 있지만 항원이 없는 두 번째주기가 대조군으로 수행되었다. 동역학 결합 상수는 Biacore T200 평가 소프트웨어가 제공하는 1:1 결합 모델에 대한 센소그램 데이터의 비선형 맞춤에 의해 추정되었다. 결과를 하기 표 10에 나타내었다. 모든 후보물질은 약 15.7 nM의 KD로 약한 친화도를 나타내는 후보물질 22를 제외하고, 0.9 내지 4.2 nM의 KD로 nM 범위에서 친화도를 나타내었다. 도 6에서 도시된 바와 같이, 후보물질 33을 제외한 모든 미리-선택된 후보물질은 B6H12, 2A1 및 VxP037-01LC1에 대해 5.0 내지 8.9×10-5 s-1과 비교하여, Koff 값이 3.4×10-3에서 1.8×10-4 s-1 범위인 해리의 보다 빠른 동역학을 보여줌으로써, B6H12, 2A1 및 VxP037-01LC1 항체와 달랐다.
Figure pat00023
10. 인간 RBC 또는 종양 세포에 결합한 후 항-CD47 항체의 방출, 및 그들의 Koff 값에 따라 항-CD47 항체에 의한 종양 세포의 식균작용
CD47은 순환 혈액 세포, 특히 RBC에서 발현되며, 종양 세포와 같은 표적 세포에서 이용가능한 유리 항체의 양을 낮춤으로써 치료용 항-CD47 항체의 약물 동역학 및 효능에 상당한 영향을 미칠 수 있는 싱크 효과의 중요한 원인을 나타낸다. 더욱이, RBCs에 대한 항-CD47 항체의 중요하고 연장된 결합은 또한 빈혈증과 같은 독성의 위험을 증가시킬 수 있다. 항원으로부터 항체의 결합 대 방출의 동역학은 예를 들어, 대부분 본 발명의 항-CD47 항체에 대해 수행된 SPR에 의한 Kon 및 Koff 값을 각각 측정함으로써 정량화될 수 있는 결합 및 해리의 동역학에 의존한다. 시험관 내에서 항-CD47 항체의 해리 동역학이 RBC에 결합한 후의 방출에 미치는 영향을 평가하기 위해, 정제된 인간 RBC를 1㎍/mL의 마우스 항-CD47 후보물질 14, 19, 20 또는 22와 함께, 또는 1 μg/mL 마우스 항-CD47 항체 2A1 또는 B6H12와 함께 배양하였다. 상기 항-CD47 후보물질은 Koff 값이 후보물질 14의 경우인 1×10-4 s-1보다 우수하거나, 1×10-3 s-1보다 우수하기 때문에 선택되었다(표 10 참조). 반대로, 항-CD47 2A1 및 B6H12 기준의 Koff 값은 1×10-4 s-1보다 열등했다(표 10). +4℃에서 항체와 30분 배양 후, RBCs를 세척하고, 무-항체 PBS/BSA/EDTA 완충액에 재현탁하고, 및 +37℃에서 6시간 또는 24시간 동안 배양하였다. 상이한 배양 시간에, RBC를 PBS/BSA/EDTA 완충액에서 세척하고, +4℃에서 PE-접합된 염소 항-마우스 IgG와 함께 배양하였다. RBCs에 대한 마우스 항-CD47 항체의 결합을 유동 세포계측법에 의해 추가로 분석하였다. 각 항체에 대해, 6시간(T + 6h) 또는 24시간(T + 24h) 후에 생존가능한 RBCs를 게이팅함으로써 얻어진 평균 형광 강도(MFI)를 기록하고, +37℃(T0) 배양기간 직전에 분석된 RBCs에서 수득된 MFI와 비교하였다. 결과는 배양 단계 전에 T0에 기록된 MFI와 비교하여, +37℃에서 T + 6h 또는 T + 24h 배양 후에 기록된 MFI의 감소의 백분율로 나타내었다.
도 20에 도시된 바와 같이, 후보물질 14, 19, 20 및 22로 염색된 RBCs의 MFI는 6시간 후에 이미 현저히 감소되었고, +37℃에서 24시간 배양한 후에 더욱 강하게 감소하였다. 상기 결과는 막-발현된 CD47 항원을 결합시킨 후, 후보물질 14, 19, 20 및 22가 RBCs로부터 점진적으로 분리됨을 나타냈다. 대조적으로, +37℃에서 6시간 또는 24시간 배양한 후, 항체 2A1 또는 B6H12로 염색된 RBCs의 MFI는 변형되지 않았거나 약하게만 변형된 것으로 나타났으며, 이는 항체 2A1 및 B6H12가 RBC 상에 강하게 부착되었고, 천천히 세포외 배지에서 방출되지 않거나, 느리게만 방출되었음을 가리킨다.
참고로, 특정 항체(후보물질 14 및 22, 항체 B6H12)에서 응집이 관찰되었지만, 이는 유동 세포계측법에 의한 단일 RBCs의 분석에 크게 영향을 미치지 않았다.
상기 결과는 1×10-4 s-1보다 우수한 높은 Koff 값을 갖는 해리 동역학을 공유하는 후보물질 14, 19, 20 및 22와 같은 항-CD47 항체가 RBCs로부터 보다 신속하게 방출되어 표적 세포에 도달함을 시사한다. 따라서, 후보물질 14, 19, 20 및 22와 같은 항-CD47 항체는 1×10-4 s-1보다 열등한 Koff 값을 갖는 2A1 또는 B6H12와 같은 느린 해리 동역학을 갖는 항체와 비교하여 표적 종양 세포 상에서 발현되는 CD47에 도달하기에 더 유용할 것이다.
반대로, 세포-발현된 CD47로부터의 높은 해리 속도를 갖는 항체는 더 느린 해리 속도를 갖는 항체보다 종양 세포 식균작용을 향상시키는데 덜 효율적일 수 있다. 이 점을 해결하기 위해, 종양 세포에 의한 항-CD47 항체의 시험관 내 방출 및 종양 세포 식균작용에 대한 영향을 측정하기 위해, 상기에서 수행된 RBC에 대한 결합/방출 실험과 유사한 실험을 수행하였다. 이를 위해, 인간 Raji 림프종 세포를 마우스 항-CD47 후보물질 14, 19, 20 또는 22, 또는 1 μg/mL의 마우스 항-CD47 항체 B6H12 또는 2A1과 함께 +4℃에서 30분 동안 배양한 후, 세척 후 +37℃에서 24 시간동안 무-항체 배지에서 다시 배양하였다. 24시간 배양 시간(T + 24시간) 후 세포를 수집하고, PBS로 세척하고, 4% PFA로 고정시켰다. 염색의 양성 대조군으로서, 세포를 또한 24시간 동안 배양되기 직전에(시간 T0) 4% PFA로 고정시켰다. 최종 배양 시간 후, 고정된 세포를 PE-접합된 염소 항-마우스 IgG 항체로 염색하고, 유동 세포계측법으로 분석하였다. 각 항체에 대해, 24시간(T + 24 시간) 배양한 후 얻은 평균 형광 강도(MFI)를 기록하고, +37℃(T0)에서 배양하기 직전에 분석한 Raji 세포에서 얻은 MFI와 비교했다. 결과는 배양 단계 전에 T0에 기록된 MFI와 비교하여 +37℃에서 T + 24 시간 배양한 후 기록한 세포의 MFI 감소의 백분율로 나타냈다.
도 21a에 도시된 바와 같이, 후보물질 14의 MFI의 중요한 감소가 37℃에서 Raji 세포의 24시간 배양 후 이미 관찰되었으며, 반면 후보물질 19, 20 및 22에 대해서 뿐만 아니라 항체 2A1에 대하여 더 약한 감소가 관찰되었지만, B6H12는 그렇지 않았다. 상기 결과는 1×10-3 s-1보다 우수한 Koff 값을 갖는 후보물질 14와 같은 매우 빠른 해리 동역학을 갖는 항-CD47 항체가 Raji 종양 세포로부터 보다 신속하고 더 강력하게 분리될 것이므로, 1×10-3 s-1보다 열등한 Koff 값을 갖는 후보물질 19, 20 및 22와 같은 더 느린 해리 속도를 갖는 항-CD47 항체보다 종양 세포 식균작용을 증가시키는데 덜 효율적일 수 있다.
이 지점을 해결하기 위해, Raji 세포를 먼저 CFSE 염료로 표지한 다음, +4℃에서 30분 동안 0.1 또는 1 μg/mL의 항-CD47 항체로 염색했다. 그런 다음, Raji 세포를 세척하고, 상기 기술된 바와 같이 무-항체 배지에서 +37℃에서 24시간 동안 배양했다. 24시간 배양 기간(T + 24h) 후, 본질적으로 Tseng 등(Tseng D., Volkmer J-P., Willingham S.B., Contreras-Trujillo H., et al. "Anti-CD47 antibody-mediated phagocytosis of cancer by macrophages primes an effective antitumor T-cell response", PNAS 110(27):11103-08 (2013))에 기술된 바와 같이 유동 세포계측법 식균작용 분석을 사용하여 hMDM으로 식균작용 분석법으로 Raji 세포를 시험하였다. 항-CD47 항체에 의해 염색되기 전에 미리 CFSE 염료로 염색된 표적 Raji 종양 세포를 이전에 Far-Red 염료로 표지한 hMDM과 함께 배양하였다. 37℃에서 60분간 배양한 후, 세포를 수집하고, 유동 세포계측법으로 분석하고, CFSE 및 Far-Red 형광을 모니터링하였다. CFSE와 Far-Red에 의해 이중-염색된 것으로 나타난 세포 집단은 대식세포에 의해 탐식된 표적 종양 세포에 대응했다. 식균작용(시간 T0)의 양성 대조군으로서, 동일 실험을 Far-Red로 표지된 hDMDM의 동일한 제조로 수행하고, 0.1 또는 1㎍/mL에서 상이한 항-CD47 항체로 염색한 CFSE-표지된 Raji 세포와 함께 배양하였지만, Raji 세포는 +37℃에서 24시간 동안 배양하지 않았다. 이것은 무-항체 배지에서 배양하기 전의 참조 시간 T0에 해당한다. 탐식된 세포의 백분율은 각 조건에서 CFSE와 Far-Red에 의해 이중-염색된 세포의 백분율로부터 계산하였다. 각 항체에 특이적인 식균작용의 백분율은, 무관한 항체로 동일한 조건에서 처리된 Raji 세포에 의해 수득한 식균작용의 백분율을 빼서 계산하였다. 그 결과는 마지막으로, 시험된 항체 각각에 대해 T0에 측정한 특정 식균작용과 비교하여 T + 24h에서 수득한 특정 식균작용의 감소 백분율로서, 하기 식을 적용하여 표현하였다: 식균작용 감소율% = (1-(항체 A에 의한 T+24h에 특정 식균작용의 %/항체 A에 의한 T0에 특정 식균작용의 %))×100.
도 21b에 도시된 바와 같이, 항-CD47 후보물질 14로 염색된 Raji 세포에 대해 매우 강한 식균작용의 감소가 관찰되었는데, 식균작용의 약 60% 감소가 1㎍/mL의 후보물질 14에 의해 염색한 후 관찰되었으며, 심지어 100% 이하 감소는 0.1㎍/mL로 염색된 Raji 세포에서 관찰되었다. 대조적으로, 기준 2A1 및 B6H12와 같이 후보물질 19, 20 및 22로 염색된 Raji 세포에 대해서 식균작용의 약한 감소만 관찰되었다.
전반적으로, 상기 결과는 (후보물질 14와 같은) 1×10-3 s-1보다 우수한 Koff 값을 특징으로 하는 높은 해리 속도를 갖는 항-CD47 항체가 RBC로부터 강력하고 신속하게 분리될 것이지만, 종양 세포에 대한 그들의 기능적 활성의 대부분, 즉 종양 세포 식균작용의 증진을 신속하게 상실할 것이다. 따라서, 상기 항체는 싱크/부작용이 낮을 수 있지만, 항-종양 효능이 더 약해질 수 있다. 반대로, 1×10-4 s-1보다 낮은 Koff 값을 특징으로 하는 매우 느린 해리 속도를 갖는 항-CD47 항체(예컨대, 2A1 및 B6H12)는 종양 세포로부터 더 천천히 분리될 것이지만, RBC 상에 달라붙을 것이며, 따라서 중요한 싱크 효과와 더 많은 부작용을 가질 수 있다. 따라서, Koff 값이 1×10-4 내지 1×10-3 s-1인 중간 해리 동역학을 갖는 항-CD47 항체(예컨대, 후보물질 19, 20 또는 22)는 항-종양 효능을 유지하면서 약한 싱크대 효과를 수용하기 위해, 최적의 CD47 결합/방출 평형을 가질 것이다.
11. Jurkat 세포를 이용한 세포사멸 분석
시험한 8개의 후보물질 중 후보물질 14 및 15는 인간 Jurkat 세포(T 세포 백혈병 세포)의 중요한 세포사멸을 유도하는 것으로 밝혀졌고, 후보물질 26은 또한 약한 세포사멸을 유도한(데이터는 나타내지 않음) 반면, 후보물질 20 및 22는 세포사멸을 유도하지 않았다. 상기 데이터는 이 항체 계열이 hCD47 상의 에피토프를 인식하여, CD47 참여 후 CD47-발현 세포에 신호전달 활성을 전달한다는 것을 시사한다. 상기 유형의 작용성(agonistic) 항체는 생체 내에서 오프-타겟 효과를 유도할 수 있다.
12. 시험관 내 특성분석의 요약
요약하면, 34개의 항-CD47 항체가 생성되고, 정제되고, 특이성 및 기능성에 대해 시험관 내에서 평가하였다. 결합 및 기능 분석(hCD47/hSIRPα 상호작용의 억제, 식균작용의 유도)에서의 효능에 기초하여 8개의 후보물질(번호 7, 14, 15, 19, 20, 22, 26, 33)을 사전 선택하고, 그들의 친화도 및 RBC 응집 활성을 측정하는 분석에서 완전히 특징분석하였다.
8개의 후보물질 모두는 hCD47 및 cynoCD47 모두를 강력하게 인식하고, 0.9 내지 15.7nM 범위의 친화도를 갖는 hCD47를 결합시켰다. 8개의 후보물질 모두는 hCD47/hSIRPα 상호작용을 강력히 억제하고, 인간 대식세포에 의한 Raji 림프종 세포의 식균작용을 유도할 수 있었다.
같은 클론 계열에 속하는 3개의 항체(후보물질 14, 15, 26)도 mCD47과 교차반응하였으며, Jurkat 종양 세포의 중요한 아폽토시스를 유도하고 강한 RBC 응집을 유도하는 것으로 밝혀졌다. 상기 후보물질은 생체 내 주입시 잠재적인 독성을 유발할 수 있다.
후보물질 20(클론 계열에서 유일함)은 강한 기능적 활성과 매우 약하지만 검출가능한 RBC 응집을 갖는 최상의 프로파일을 가졌으며, 잠재적인 독성이 있을지라도 약하게 나타냈다.
후보물질 19 및 33(동일한 클론 계열)뿐만 아니라 후보물질 7 및 22(그들의 각 클론 패밀리에서 고유함)는 테스트된 IgG 포맷에 따라 일부는 수용가능한 RBC 응집과 함께 강력한 기능적 활성을 나타내었다.
1×10-4 내지 1×10-3 s-1의 Koff 값을 갖는 후보물질 19, 20 및 22는 인간 RBC에 일단 결합한 신속한 방출을 나타냈지만, 인간 대식세포에 의한 종양 세포의 식균작용에 의해 측정된 바와 같이 효율적인 기능 활성을 유지하였다.
IV. 선택된 마우스 항-CD47 후보물질의 생체 내 특성분석
hCD47에 특이적인 선택된 후보물질 19, 20 및 22를 마우스 종양 이종이식 모델에서 생체 내에서 시험하였다. 후보물질 14 및 15는 또한 mCD47 교차-반응 항-CD47 항체로서의 제1 연구에서 생체 내에서 시험하였다.
1. 인간 림프종 Raji 모델
Raji 세포(우측 측면에 피하 주사된 150만개의 세포)로 이식된 NOG 마우스(그룹당 n=8)를 갖는 인간 비-호지킨 림프종 이종이식 모델에서 항-CD47 후보물질 14, 19, 20 및 22를 생체 내 평가하였다. 세포 이식 10일 후에, 종양이 만져졌으며, 4개의 항-CD47 후보물질에 대한 항체 요법(10 mg/kg/dose, 복강내 주사, 주 3회, 8주까지)을 음성 대조군 항체 및 항-CD47 기준 항체 2A1, B6H12 및 VpX037-01LC1와 병행하여 시작하였다. 모든 항체는 mIgG1 이소타입 포맷이었다. 종양 성장은 2일마다 모니터링되었고, 마우스 생존율을 기록하였다. 4개의 후보물질 14, 19, 20 및 22는 Raji 세포의 성장을 지연시켰는데, 기준 B6H12 및 2A1과 같았지만 마우스 CD47과 강력하게 교차 반응하는 VxP037-01LC1 항체는 없었다(도 9a). 도 9b에 도시된 바와 같이, 후보물질 20 및 22는 기준 B6H12 및 2A1과 같이 대조군과 비교할때 마우스의 유의한 보호를 유도하지만, VxP037-01LC1은 유도하지 않은 것으로 밝혀졌다.
상기 결과는 B6H12와 같은 기준 항-CD47 항체에 대해 이전에 보고된 바와 같이, 4개의 후보물질(후보물질 14, 19, 20 및 22)이 면역손상 마우스내 인간 NHL Raji 종양 세포의 성장을 제어할 수 있었음을 나타냈다. 후보물질 20 및 22는 마우스 생존을 연장하기 위해 후보물질 14 및 19보다 더 강력한 것으로 나타났다.
2. 인간 A2780 난소 이종이식 모델
인간 A2780 난소 이종이식 모델에서 단독으로 또는, 항-EGFL 항체 세툭시맙(Erbitux®) 또는 항-Her2 항체 트라스투주맙(Herceptin®)과 조합하여, 생체 내에서 항-CD47 후보물질 20을 추가로 평가하였다. A2780 세포는 Herceptin®의 결합에 의해 검출된 Her2 뿐만 아니라 후보물질 20의 결합에 의해 검출된 CD47을 강하게 발현하였다(도시되지 않음). 대조적으로, A2780 세포는 Erbitux®에 의한 염색으로 측정되는, 시험관 내 낮은 수준의 EGFR만 발현하였다(도시되지 않음). NOG 마우스(그룹당 n=4)에 루시퍼라제-형질감염된 A2780(A2780/Luc) 세포(1천만개의 세포를 복강내 주사)로 이식하였다. 세포 이식한 다음날, 항체 요법(10 mg/kg/dose, 복강내 주사, 주 3회, 5주까지)은 항-CD47 후보물질 20 단독으로 또는, Herceptin® 또는 Erbitux®와 조합하여 시작하였다.
복부 및 등 위치에서 5일마다 생체발광 강도(BLI)를 모니터링했다. 도 10에 제시된 결과는 항-CD47 후보물질 20 단독에 의한 처리로 A2780 종양 세포의 성장이 지연됨을 보여주었다. Herceptin® 단독으로도 종양 성장의 지연이 관찰되었지만, Erbitux® 단독으로는 관찰되지 않았다. 또한, Herceptin® 또는 Erbitux®와 조합하여 항-CD47 후보물질 20의 조합은 또한 A2780 세포의 성장을 지연시켰다.
상기 결과는 후보물질 20이 단일 작용제로 사용될 때 NOG 면역손상 마우스에서 생체 내 A2780 난소 종양 세포의 성장을 조절할 수 있고, 항-Her-2 항체(Herceptin®) 또는 항-EGFR 항체(Erbitux®)와 조합하여 협동적 활성을 나타낼 수 있다.
3. 인간 A549 폐 이종이식 모델
항-CD47 후보물질 20은 또한 인간 A549 폐 선암종 이종이식 모델(Steiner P., Joynes C., Bassi R., Wang S., Tonra J.R., et al. "Tumor Growth Inhibition with Cetuximab and Chemotherapy in Non-Small Cell Lung Cancer Xenografts Expressing Wild-type and Mutated Epidermal Growth Factor Receptor", Clin Cancer Res 13(5):1542-51(2007); Kellar A., Egan C., and Morris D. "Preclinical Murine Models for Lung Cancer: Clinical Trial Applications", BioMed Res Int 2015, ID 621324 (2015)) 단독 또는 항-EGFR 항체 세툭시맙(Erbitux®) 또는 항-Her2 항체 트라스투주맙(Herceptin®)과 조합하여 생체 내에서 평가하였다. 시험관 내에서, A549 세포(ATCC-CCL-185)는 Erbitux®로 염색하여 측정한 EGFR뿐만 아니라 후보물질 20의 결합에 의해 검출되는 CD47을 강하게 발현하였고, 유동 세포계측법에 의해 Herceptin®으로 검출된 Her2를 약한 강도로 발현하였다(데이터는 나타내지 않음). NOG 마우스(그룹당 n=4)에 A549 세포(피하주사한 1000만 세포)를 이식하였다. 세포 이식 10일 후에, 종양이 만져질 수 있어서(용적>30mm3), 항체요법(10 mg/kg/dose, 복강내 주사, 주 3회, 10주까지)을 항-CD47 후보물질 20 단독 또는 Herceptin® 또는 Erbitux®와 조합하여 시작하였다.
도 11에 도시된 바와 같이, Erbitux® 및 Herceptin®뿐만 아니라 항-CD47 후보물질 20 단독으로도 종양 체적의 측정에 의해 정량화된 A549 종양 세포의 성장을 지연시킬 수 있었고(도 11a), 비히클 그룹과 비교하여 마우스를 유의하게 보호할 수 있었다(도 11b). Herceptin®과 항-CD47 후보물질 20의 조합은 A549 종양 세포 성장(도 11a)의 더 중요한 지연 및 생존 분석에서 마우스의 더 강력한 보호(도 11b)를 초래했다.
상기 결과는 항-CD47 후보물질 20이 단일 약제 또는 Herceptin®과 조합하여 사용될 때 NOG 마우스에서 생체 내 A549 폐 선암의 성장을 지연시킬 수 있음을 시사한다.
V. 항-CD47 후보물질 20의 인간화
1. 인간화된 항-CD47 후보물질 20
마우스 후보물질 20이 인간화의 첫 번째 단서로 선택되었다. 5개의 VH 및 5개의 VL 변이체가 인간 수용체 프레임워크 내로의 CDR 생장에 의해 생성되었다. 인실리코(in silico) 알고리즘을 사용하여 MHC 클래스 II 고친화도를 갖는 잠재 T 세포 에피토프의 제거 뿐만 아니라 Fv 글리코실화 및 탈아미드화와 같은 번역-후 변형의 존재에 대해 서열을 분석하였다. 후보물질 20(VH0)의 마우스 VH 서열의 서열과 정렬된 5개의 VH 변이체(VH1 내지 VH5)의 아미노산 서열이 도 7에 제시되어 있다. 후보물질 20(VL0)의 마우스 VL 서열의 서열과 정렬된 5개의 VL 변이체(VL1 내지 VL5)의 아미노산 서열은 도 8에 제시되어 있다.
hIgG4/카파 인간화된 변이체를 생성하기 위해, 5개의 인간화된 VH 변이체를 인간 Fcγ4-S228P 백본(SEQ ID NO: 162)을 함유하는 발현 벡터에서 클로닝하고, 5개의 인간화된 VL 변이체를 인간 카파 백본(SEQ ID NO: 176)을 함유하는 발현 벡터로 클로닝하였다. 돌연변이 S228P는 모든 hIgG4 항체의 Fc 단편에 도입되어, hIgG4에서 관찰된 잠재적 사슬 교환을 피하였다(Angal S., King D.J., Bodmer M.W., Turner A., Lawson A.D., Roberts G., Pedley D., and Adair J.R. "A single amino acid substitution abolishes the heterogeneity of chimeric mouse/human (IgG4) antibody", Mol Immunol 30(1):105-8 (1993)). 25개의 hIgG4/카파 변이체를 5개의 VH 중 하나 및 5개의 VL 벡터 중 하나로 공동-형질감염시킨 CHO 세포로부터 생산 및 정제하였다. 생성된 항체를 h20-VHx-VLx로 명명하였으며, 여기서 h20은 인간화된 후보물질 20으로 명명하고, VHx는 인간화된 VH 변이체 x(VH1 내지 VH5)를 갖는 중쇄 가변 도메인으로 명명하고, Lx는 인간화된 VL 변이체 x(VL1 내지 VL5)를 갖는 경쇄 가변 도메인으로 명명하였다. 25개의 정제된 항체를 인간 Raji 림프종 세포 및, hCD47 또는 mCD47로 형질감염한 또는 이를 갖지 않은 CHO 세포에 대한 결합 활성 및 특이성에 대하여, Raji 세포에 대한 hSIRPα의 결합을 억제하는 그들의 기능성 활성에 대하여, 및 전혈 응집 분석에서 인간 RBC 응집을 유도할 수 있는 능력에 대해, 시험하였다. 동역학(Kon 및 Koff) 및 친화도(KD) 상수는 또한 Biacore의 SPR에 의해 측정하였다. 모든 분석에서, 25개의 인간화된 변이체를 마우스 VH0 및 VL0 서열을 인간 Fcγ4-S228P 및 인간 카파 백본을 함유하는 적당한 벡터로 클로닝함으로써 생성된 hIgG4 키메라 후보물질 20과 비교하였다.
상이한 분석에서 얻어진 모든 결과는 하기 표 12 및 표 13에 요약되어있다.
Figure pat00024
RBC 응집의 경우: +/-, 50 μg/mL 항체에서만 관찰된 약한 응집; +, 50 μg/mL 항체에서 응집; ++, 농도 ≥16.7 μg/mL인 경우 응집; +++, 농도 ≥5.6 μg/mL인 경우 응집
Figure pat00025
VH1 및 VH5 서열을 갖는 모든 인간화된 변이체는 다른 변이체보다 낮은 친화도(높은 KD)을 가졌으며, 키메라 후보물질 20의 친화도보다 낮았다. 다른 변이체는 키메라 후보물질 20의 것과 유사한 Kon, Koff 및 KD 상수를 나타내었다. 어떤 변이체도 키메라 후보물질 20과 비교하여 hCD47에 대한 유의적 증가된 친화도를 나타내지 않았다. 모든 인간화된 변이체의 Koff 값은 5.3×10-4 내지 11.7×10-4 s-1의 범위로 관찰되었다.
모든 25개의 변이체는 키메라 후보물질 20의 EC50과 유사한 EC50을 갖는 Raji 세포 상에서 발현되는 CD47에 강하게 결합하였다. 그들은 또한 키메라 후보물질 20(도시되지 않음)과 같이, CHO 세포 상에서 발현되는 hCD47을 특이적으로 인식하엿지만, mCD47은 인식하지 못했다.
모든 25개의 변이체는 Raji 세포 상에 발현된 CD47에 대한 hSIRPα의 결합을 강하게 억제하였으며, 키메라 후보물질 20의 IC50과 동일한 범위의 IC50을 가졌다. VH2 서열을 갖는 변이체는 키메라 후보물질 20 뿐만 아니라 다른 변이체보다 낮은 IC50을 가졌다.
모든 시험된 hIgG4 변이체는 인간의 대식세포에 의한 Raji 세포의 식균작용을 키메라 hIgG4 후보물질 20과 유사한 방식으로 향상시킬 수 있었다.
VH1 계열의 일부 변이체들(h20-VH1-VL1, h20-VH1-VL2, h20-VH1-VL3, h20-VH1-VL5), 변이체 h20-VH2-VL1 및 변이체 h20-VH5-VL2 및 h20-VH5-VL4는 다른 변이체뿐만 아니라 키메라 후보물질 20보다 많은 RBC 응집을 유도하는 경향을 나타내었다.
2. 인간화된 항체 및 단서 선택의 최적화
인간화된 변이체의 VH 및 VL 서열 내의 잠재적인 T 세포 에피토프의 분석은 5개의 VL 변이체(VL1 내지 VL5)의 CDR2 도메인 내의 고친화도 CD4 + T 세포 에피토프(LIYFASTKESGV)의 존재를 밝혀냈다. 마우스 VL0 서열의 CDR2 내에 존재하는 이 잠재적인 T 세포 에피토프는 제1 인간화된 후보물질의 친화도 및/또는 활성의 임의의 손실을 피하기 위해 5개의 제1 인간화된 VL 변이체에서 제거되지 않았다. 그러나, VL 서열의 위치 56(F56Y)(신호 펩타이드가 없는 아미노산 넘버링)에서 단일 지점 돌연변이 F에서 Y까지는 이 잠재적 T 세포 에피토프(LIYFASTKESGV에서 LIYYASTKESGV로)의 면역 원성을 제거하기에 충분했다. 따라서, F56Y 돌연변이는 인간화된 VL1 내지 VL5 서열에 도입되었다. 상기 새로운 서열을 VL1-F56Y 내지 VL5-F56Y로 명명하고, VH1 내지 VH5 변이체 중 하나를 VL1-F56Y 내지 VL5-F56Y 변이체 중 하나와 조합하여 생성된 상응하는 인간화된 항체를 h20-Hx-LxY로 명명하였다. 5개의 인간화된 변이체(후보물질 20.26(h20-H2-L5Y), 20.27(h20-H3-L2Y), 20.28(h20-H3-L3Y), 20.29(h20-H4-L4Y), 20.30(h20-H4-L5Y))를 hIgG4 단백질을 안정화시키는 것으로 알려진 S228P 돌연변이(SEQ ID NO: 162)를 함유하는 인간 IgG4 포맷으로 선택 및 생산하였다(Angal S et al. Mol Immunol, 1993). 정제된 항체를 Raji 세포에서의 hCD47에 대한 결합 활성에 대하여, Raji 세포에서의 hCD47/hSIRPα 상호작용을 억제하는 효능에 대하여, 및 전혈을 이용한 인간 RBC 응집 활성에 대하여, 시험관 내에서 추가로 특성 분석하였다. 5개의 인간화된 Hx-LxY 변이체 또한 hIgG4-S228P 포맷으로 제조된 키메라 후보물질 20뿐만 아니라 hIgG4-S228P에 클로닝된 AB06.12 및 Hu5F9 인간화된 항체와 비교하였다.
도 12와 13에 도시된 바와 같이, 5개의 F56Y 돌연변이 변이체는 돌연변이되지않은 대응물에 대한 유사한 효능 및 키메라 후보물질 20과 유사하게, Raji 세포에 결합하고(도 12), 및 hSIRPα와 Raji 세포의 결합을 억제했다(도 13). 5개의 F56Y-돌연변이된 인간화된 변이체는 전혈 분석법에서 키메라 후보물질 20보다 약간 더 높은 RBC 응집 활성을 나타내지만, Hu5F9 기준(표 14)보다는 여전히 낮았다.
마지막으로, 후보물질 20의 5개의 F56Y-돌연변이된 인간화된 변이체는 Raji 세포 상에서 hCD47의 강한 인식과 AB06.12 및 Hu5F9 항체와 유사한, Raji 세포에서 hCD47에 대한 hSIRPα 결합의 강한 억제를 나타냄이 밝혀졌다(도 14). 하기 표 14는 상이한 분석법에서 얻어진 결과를 요약한다.
Figure pat00026
5개의 새로운 인간화된 h20-Hx-LxY 변이체의 동역학(Kon 및 Koff) 및 친화도(KD) 상수를 Biacore의 SPR에 의해 결정하였다. 표 15의 결과는 VL CDR2-F56Y 돌연변이를 갖는 5개의 인간화된 변이체는 후보물질 20과 유사하고 VL CDR2-F56Y 돌연변이가 없는 상응하는 인간화된 변이체와 유사하게, 2.0 내지 2.8 nM의 친화도를 보존한다는 것을 보여준다(표 15).
Figure pat00027
VL CDR2-F56Y 돌연변이를 갖는 5개의 인간화된 변이체는 또한 마우스 및 후보물질 20에 대해 관찰된 바와 같이 5.73×10-4 내지 7.61×10-4 s-1 범위의 Koff 값을 갖는 신속한 해리 동역학을 보존하였다(표 13 및 15).
3. 항-CD47 후보물질 22의 인간화
마우스 후보물질 22도 인간화를 위해 선택되었다. 본질적으로 마우스 후보물질 20에 대해 기술된 바와 같이, 인간 수용체 프레임워크 내로의 CDR 이식에 의해 4개의 VH 및 4개의 VL 변이체가 생성되었다. Fv 글리코실화 및 탈 아미노화와 같은 번역 후 변형의 존재에 대한 것 뿐만 아니라 인실리코(in silico) 알고리즘을 사용하여 MHC 클래스 II 고친화도를 갖는 잠재적 T-세포 에피토프의 제거를 위해 서열을 분석하였다.
hIgG4/카파 인간화된 변이체를 생성하기 위해, 인간 Fcγ4-S228P 백본(SEQ ID NO: 162)을 함유하는 발현 벡터에 2개의 인간화된 VH 변이체 h22-VH3 및 h22-VH4를 클로닝하고, 인간 카파 백본(SEQ ID NO: 176)을 함유하는 발현 벡터에 4개의 인간화된 h22-VL 변이체를 클로닝하였다. 8개의 hIgG4/카파 변이체를 h22-VH3 또는 h22-VH4 중 하나 및 4개의 h22-VL 벡터 중 하나에 의해 형질감염된 CHO 세포로부터 생산 및 정제하였다. 얻어진 항체를 h22-VHx-VLx로 칭하며, 상기 h22는 인간화된 후보물질 22를 명명하며, VHx는 인간화된 VH 변이체 x(VH3 내지 VH4)를 갖는 중쇄 가변 도메인을 명명하며, 및 Lx는 인간화된 VL 변이체 x(VL1 내지 VL4)를 갖는 경쇄 가변 도메인을 명명하였다. 8개의 정제된 항체의 동역학(Kon 및 Koff) 및 친화도(KD) 상수는 Biacore의 SPR에 의해 측정하였다. 8개의 정제된 항체는 또한 Raji 세포에 대한 결합 활성 및 특이성에 대하여, Raji 세포에 대한 hSIRPα의 결합을 억제하는 기능적 활성에 대하여, 및 전혈에서 인간 RBC 응집을 유도할 수 있는 능력에 대해 시험하였다. 모든 분석에서, 8개의 인간화된 변이체는 후보물질 22의 마우스 VH 및 VL 서열을 인간 Fcγ4-S228P 인간 카파 백본을 함유하는 적당한 벡터내로 클로닝함으로써 생성된 hIgG4 키메라 후보물질 22와 비교하였다. RBC 응집에 있어서, 8개의 인간화된 변이체 또한 Hu5F9 항체와 비교하였다.
상이한 분석에서 얻어진 모든 결과는 하기 표 16 및 표 17에 요약되어있다.
Figure pat00028
h22-VL1 내지 h22-VL4 서열과 조합된 h22-VH3 또는 h22-VH4 서열을 갖는 8개의 인간화된 변이체 모두는 키메라 후보물질 22와 유사한 Kon, Koff 및 KD 상수를 나타냈다. 변이체의 어느 것도 키메라 후보물질 22와 비교하여 hCD47에 대한 유의적으로 증가한 친화도를 나타내지 않았다. 후보물질 22로부터의 모든 인간화된 변이체의 Koff 값은 2.5×10-4 내지 3.8×10-4 s-1의 범위에 있는 것으로 관찰되었다.
8개의 변이체 모두 키메라 후보물질 22의 EC50과 유사한 EC50을 갖는 Raji 세포 상에서 발현된 CD47에 강하게 결합하였다.
8개의 변이체 모두 키메라 후보물질 22의 IC50과 동일한 범위의 IC50을 갖는 Raji 세포 상에서 발현된 CD47에 대한 hSIRPα의 결합을 강력하게 억제하였다.
8개의 변이체 모두 키메라 후보물질 22보다 약간 더 많은 RBC 응집을 유도하는 경향을 보였다. 그 중 5개는 Hu5F9 기준과 유사한 RBC 응집 성향을 보였다.
VI. 에피토프 매핑, 이량체화 및 글리코실화
1. 에피토프 매핑
마우스 항-CD47 후보물질 20 및 22에 의해 hCD47 항원에서 인식된 에피토프는 CovalX에 의해 개발된 고해상도 방법을 사용하여 결정하였다(Bich C., Scott M., Panagiotidis A., Wenzel R. J., Nazabal A., Zenobi R. "Characterization of antibody-antigen interactions: Comparison between surface plasmon resonance measurements and hih-mass matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectromrtry", Analytical Biochem 375:35-45, (2008)). 항-CD47 항체는 6His-태그로 표지된 인간 CD47 세포외 도메인의 가용성 제제와 복합체를 형성하였다(SEQ ID NO: 160).
이어서, 항-CD47 항체/hCD47 복합체를 중수소화된 가교 결합제와 함께 배양하고, 다중-효소 절단을 수행하였다. 가교-결합 펩타이드가 농축된 후, 샘플을 고해상도 질량 분광계(nLC-Orbitrap MS)로 분석하고, 생성된 데이터를 XQuest 및 Stavrox 소프트웨어를 사용하여 분석했다. MALDI ToF MS 분석은 표준 질소 레이저를 사용하는 CovalX의 HM4 상호작용 모듈을 사용하고 0 내지 1500 kDa의 서로 다른 질량 범위에 초점을 맞추어 수행되었다.
도 15에 도시된 바와 같이, 화학적 교차 결합 분석은 키메라 후보물질 20에 의해 인식되는 hCD47상의 에피토프가 불연속적이었으며, 아미노산 잔기 K59, R63, Y66, T67, H108, T109, T117 및 T120(SEQ ID NO: 151) 또는 hCD47의 아미노산 잔기 xxK59xxxR63xxY66T67xx--------xxH108T109xxxxxxxT117xxT120xx(SEQ ID NO: 151)(여기서 "x"는 임의의 아미노산 잔기(SEQ ID NO: 151에 따른 넘버링)임)를 포함했다.
유사한 분석은 키메라 후보물질 22(도 16)에 의해 인식된 hCD47의 에피토프가 불연속적이었으며, hCD47의 K59, K61, S107, H108, T117, T120 및 R121(SEQ ID NO: 151) 또는 hCD47의 아미노산 잔기 xxK59xK61xxxxxx---------xxxxxxxxS107H108xxxxxxxxT117xxT120R121xx(SEQ ID NO: 151)(여기서 "x"는 임의의 아미노산 잔기(SEQ ID NO: 151에 따른 넘버링)임)를 포함했다.
동일한 방법을 사용하여, AB06.12에 의해 인식되는 hCD47 상의 에피토프도 또한 결정되었고, 후보물질 20 또는 22(데이터는 나타내지 않음)와 상이한 것으로 밝혀졌다.
2. CD47의 이량체화
가용성 hCD47(세포외 IgV 도메인) 제형의 고 질량 MALDI ToF 분석 및 SEC-HPLC 분석은 시험관 내에서 자연적으로 형성된 hCD47의 단량체, 이량체 및 다량체 존재를 보여주었다. 후보물질 20 및 22가 hCD47의 이량체를 인식하는 능력을 추가로 조사하기 위해 항-CD47 항체/가용성 hCD47의 혼합물을 과량의 항원과 함께 CovalX 's K200 MALDI MS 분석 키트를 사용하여 가교-결합시켰다. 데이터는 후보물질 20이 hCD47의 이량체(60.8%)와 단량체(39,2%) 모두와 결합할 수 있지만, 하나의 항체와 2개의 단량체의 복합체가 검출된다는 것을 배제할 수 없다는 것을 제안한다(표 18). 유사하게, 후보물질 22는 hCD47 이량체(3,8%) 및 단량체(5%)와 가교-결합을 형성할 수 있다(표 18). 추가 실험에 의해 후보물질 20 및 22 둘 다 SEC-HPLC로 정제된 인간 CD47 단량체 및 인간 CD47 이량체와 결합한다는 것을 확인하였다(도 18 및 도 19 참조). SE-HPLC에 의한 가용성 hCD47의 분석은 단백질 준비 과정에서 이형성을 보였으며, CD47 단량체와 이량체의 존재를 추정했다(도 17). 단량체 및 이량체 분획물을 GE healthcare의 Superdex 200 Increase 10/300 GL을 사용하는 반제조식 SE-HPLC로 추가로 정제하였다. 비-환원 조건에서의 SDS-PAGE 분석은 글리코실화된 hCD47의 예상 크기에 상응하는 CD47 단량체 분획에서 ~ 30kDa에서의 큰 밴드가 관찰되었고, 및 CD47 이량체 분획에서 50kDa보다 약간 큰 주요 밴드가 관찰되었음을 추가로 입증했다(도 18). 그후, 정제된 CD47 단량체 및 이량체 분획을 ELISA 플레이트 상에 코팅하고, 항-CD47 항체를 2개의 분획을 인식하는 그들의 능력에 대해 시험하였다. 도 19에 도시된 바와 같이, 후보물질 20 및 22는 유사한 효능을 갖는 hCD47 단량체 및 이량체 모두에 결합할 수 있었다.
Figure pat00029
3. 탈글리코실화된 hCD47의 인식
40년 이상 이래로 (Meezan E., Wu H. C., Black P. H., Robbins P. W. "Comparative studies on the carbohydrate-containing membrane components of normal and virus-transformed mouse fibroblasts. II Separation of glycoproteins and glycopeptides by Saphadex chromatography", Biochemistry 8 (6):2518-24 (1969) 참조), 글리코실화의 메카니즘이 종양 세포에서 변형되어, 변형된 글리코실화 패턴을 갖는 단백질의 발현으로 이어진다는 것이 밝혀졌다(보다 최근의 검토를 위해, Pinho S.S. and Reis C.A. "Glycosylation in cancer: mechanisms and clinical implications", Nat Rev Cancer 15: 540-55 (2015) 참조). CD47은 위치 N23, N34, N50, N73, N111, N206에 6개의 N-글리코실화 부위를 갖는 고도의 글리코실화된 막관통 단백질이다(Lindberg F.P., Gresham H.D., Schwarz E., and Brown E.J. "Molecular cloning of integrin-associated protein: An immunoglobulin family member with multiple membrane-spanning domains implicated in ανβ3-dependent ligand binding", J Cell Biol 123: 485-96 (1993)).
CD47 글리코실화 패턴이 종양 세포에서 변형되기 때문에, 평가할 중요한 측면은 치료 항체가 표적에 대한 그들의 결합에 대한 CD47 글리코실화 수준에 의존하는지 여부이다. 이 점을 해결하기 위해 가용성 hCD47을 PNGase로 처리하여 N-글리코실화를 제거한 후(Maley F., Trimble R. B., Tarentino A. L., and Plummer T. H. "Characterization of glycoproteins and their associated oligosaccharides through the use of endoglycosidases", Anal. Biochem 180:195-204 (1989)), 후보물질 20 또는 22를 실온에서 180분 동안 DSS 및 K200을 사용하여 가교-결합시켜 항-CD47 항체/탈글리코실화-hCD47 가교-결합 복합체를 생성시켰다. 상기 복합체를 사용하여 CovalX (Bich C., Scott M., Panagiotidis A., Wenzel R. J., Nazabal A., Zenobi R. "Characterization of antibody-antigen interactions: Comparison between surface plasmon resonance measurements and hih-mass matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectromrtry", Analytical Biochem 375:35-45 (2008))의 기술에 따라 상기 비공유 상호작용의 성격을 모니터링했다. MALDI-ToF에 의해 복합체화 되지않은 및 복합체화된 분자를 모니터링한 결과, 본 발명자들은 항체-CD47 복합체(각각 174.407 kDa 및 163.440kDa))와 과량으로 첨가된 가용성 항체(후보물질 20에 대해서는 148.944kDa, 및 후보물질 22에 대해서는 149.173kDa)에 상응하는 피크를 성공적으로 확인하였지만, 복합체화되지 않은 탈글리코실화된 CD47(15.901kDa; 표 19 참조)에 상응하는 피크를 확인하는데 실패하였다. 상기 데이터는 사용가능한 모든 탈글리코실화 hCD47이 후보물질 20 또는 후보물질 22와 복합체화되어, 항체 20 및 22가 글리코실화된 및 N-탈글리코실화된 hCD47 둘 모두를 인식할 수 있다는 개념을 지지한다고 제안한다.
Figure pat00030
CovalX 접근법으로 관찰된 바와 같이 후보물질 20 및 22에 의한 탈글리코실화된 hCD47의 인식을 확인 및 정량화하기 위해, 항체를 코팅된 hCD47 및 탈글리코실화된-hCD47 제제에 대한 ELISA로 시험하였다. hCD47로부터 N-글리칸의 성공적인 제거는 크기 배제 크로마토그래피 분석에 의해 확인되었다(미도시). 항-CD47 후보물질 20 및 22는 hu-IgG4 이소타입에서도 인간화된 변이체 h20-H2L5Y와 유사하게 키메라 hu-IgG4 포맷으로 시험하였다. 상기 항체를 hu-IgG4 포맷으로 생성된 AB06.12 및 Hu5F9 인간화된 항체와 함께 시험하여 ELISA에 의한 동일한 인식 효율을 허용하였다. 도 22a 및 표 20, 21 및 22에 나타낸 바와 같이, Hu5F9 및 AB06.12가 약간 낮은 최대 결합을 나타냈지만, 모든 항체는 글리코실화된 CD47(Bmax1)과 유사한 프로파일 및 EC50, EC95, 평형 결합 상수 및 최대 특이적 결합(Bmax) 값을 나타내었다. 반대로, N-탈글리코실화된 CD47에 대한 Hu5F9 및 AB06.12의 결합은 키메라 후보물질 20, 22 및 인간화된 변이체 h20-H2L5Y에 대해 관찰된 결합과 비교할 때 강하게 감소되었다(도 22b, 표 20, 21 및 22). 실제로, 키메라 후보물질 20, 22 및 인간화된 항체 h20-H2L5Y는 글리코실화된 CD47 상에서 측정된 EC50 값의 3.0배 미만인 EC50 값을 갖는 및/또는 글리코실화된 CD47 상에서 측정된 10.0배 미만의 EC95 값을 갖는 EC95 값을 갖는 탈글리코실화된 CD47 상에 결합하였다. 대조적으로, AB06.12 및 Hu5F9의 EC50 및 EC95 값은 각각 글리코실화된 CD47 상에서 측정된 EC50 및 EC95 값보다 3.0 및 10.0배 이상 우수했다(표 20). 또한, 키메라 후보물질 20, 22 및 인간화된 항체 h20-H2L5Y의 평형 결합 상수 값은 글리코실화된 CD47 및 N-탈글리코실화된 CD47 모두에서 60 pM 이하인 반면, AB06.12 및 Hu5F9의 평형 결합 상수 값은 N-탈글리코실화된 CD47에서 90 내지 130 pM의 범위에 있었다(표 21). 마지막으로, 키메라 후보물질 20, 22 및 인간화된 항체 h20-H2L5Y는 글리코실화된(Bmax1) 및 탈글리코실화된(Bmax2) CD47에서 최대 특이적 결합(Bmax) 값이 1.9 OD 이상인 글리코실화 및 N-탈글리코실화된 CD47 모두를 결합시킨 반면, AB06.12 및 Hu5F9의 Bmax2 값은 N-탈글리코실화된 CD47에서 <1.5 OD이었다(표 22).
상기 결과는 후보물질 20, 22 및 인간화된 h20-H2L5Y 항체에 의한 hCD47의 인식이 CD47의 N-글리코실화 수준에 의존하지 않음을 추가로 입증한다. 반대로, Hu5F9 및 AB06.12 항체는 N-탈글리코실화된 CD47에 대한 결합 능력을 크게 상실한다. 세포 표면 단백질의 글리코실화 수준 및 성질이 종양 세포에서 변형될 수 있기 때문에, CD47 항원의 글리코실화는 종양 세포에 의해 발현되거나 과발현될 때 또한 변형될 수 있는 것이 가능하다. 주목할 점은 CD47의 글리코실화 패턴이 SIRPα와의 상호작용에 필요하지 않은 것으로 보이며(Subramanian S., Boder E.T., and Discher D.E. "Phylogenetic divergence of CD47 interactions with human signal regulatory protein α reveals locus of species specificity." J. Biolog. Chem. 282(3):1805-18 (2007)), 이상(aberrant) 글리코실화가 CD47/SIRPα 상호작용을 변화시키지 않을 것이라고 제시하였다. 따라서, CD47을 과발현하는 암 세포는 글리코실화 패턴에 독립적으로 식균작용으로부터 그들 자신을 방어할 것이다. 반대로, hCD47의 N-글리코실화 패턴은 항체 결합에 영향을 미치고, 치료 효능을 현저하게 저하시킬 수 있다. 결과적으로, 본 발명자들은 hCD47에 대한 결합이 그의 글리코실화 수준에 의존하지 않는, 20, 22 및 바람직하게는 h20-H2L5Y와 같은 항-CD47 치료 항체를 사용함으로써 보다 광범위한 항-종양 효과를 기대한다.
Figure pat00031
Figure pat00032
VII. 인간화된 항-CD47 항체 h20-H2L5Y의 생체 내 효능
인간화된 변이체 h20-H2L5Y를 이전에 기술된 바와 같이 A549 폐 선암종 이종이식 모델에서 hu-IgG4 포맷(h20-H2L5Y-G4)에서 단일 제제로, 및 항-Her2 트라스투주맙(Herceptin®)과 조합하여, 평가하였다. NOG 마우스(그룹당 n=8)를 A549 세포(피하주사한 1천만개의 세포)로 이식하였다. 항체 요법은 세포 이식 후 14일에 시작되었으며, 한번 종양 체적는 약 100 mm3이었다. 항-CD47 항체 h20-H2L5Y 및 Herceptin®을 복강내 주사에 의해 10 mg/kg/투여량의 투여량으로 단독 또는 조합하여 10주까지 주 3회 주사하였다. 도 23에 도시된 바와 같이, 항-CD47 항체 h20-H2L5Y-G4와 Herceptin®의 조합은 비히클을 투여한 동물 대조군(p <0.005)과 대조군, 및 Herceptin® 단독 처리한 동물 그룹(p <0.05)과 비교할때, 처리된-마우스의 생존율을 크게 연장시킨다. 따라서, 상기 결과는 NOG 마우스에서 A549 폐 선암종의 생체 내 성장을 조절하기 위한 인간화된 항-CD47 h20-H2L5Y 항체와 Herceptin®의 조합의 증가된 효능을 보여주며, 마우스 항-CD47 후보물질 20에 의해 이전에 얻은 결과들을 확인시킨다.
상기 인간화된 h20-H2L5Y 항체를 또한, Her2 양성 위암의 마우스 이종이식 모델에서 단일 약제로서, 및 Her2 과발현 전이성 위암 치료제로 승인된 항-Her2 트라스투주맙(Herceptin®)과 조합하여, 평가하였다. 이 연구를 위해 이종이식을 위해 Herceptin® 치료에 반응하는 Her-2 양성 위 종양으로서 인간 NCI-N87 세포주(ATCC®-CRL-5822)를 선택했다(Matsui Y., Inomata M., Tojigamori M., Sonoda K., Shiraishi N., Kitano S. "Suppression of tumor growth in human gastric cancer with HER2 overexpression by an anti-HER2 antibody in a murine model", Int. J. Oncol. 27(3):681-5 (2005)). 시험관 내에서, 상기 세포는 h20-H2L5Y 항체에 의한 염색 및 유동 세포계측 분석(데이터는 나타내지 않음)에 의해 측정된 바와 같이, Herceptin®의 결합에 의해 검출된 Her-2를 매우 강하게 발현하고, CD47을 강력하게 발현하였다. 연구는 NOG 마우스에서 수행되었으며, 상기 인간화된 h20-H2L5Y 항체는 hu-IgG4-S228P-L235E 포맷(h20-H2L5Y-G4PE)에서 테스트되었다. 상기 목적으로, 인간화된 항체 h20-H2L5Y는 인간 Fcγ4-S228P-L235E 백본(SEQ ID NO: 164)을 함유하는 발현 벡터에서 h20-VH2 변이체의 클로닝 후 S228P 및 L235E 돌연변이를 갖는 hu-IgG4 포맷으로 추가로 생산되었다. L235E 돌연변이는 Fcγ 수용체(FcγRs)에 대한 hu-IgG4의 친화도를 강하게 감소시키므로 ADCC 또는 ADCP와 같은 Fc 이펙터 기능을 없애는 것으로 나타났다(Alegre ML, Collins AM, Pulito VL, Brosius RA, Olson WC, et al. "Effect of a single amino acid mutation on the activating and immunosuppressive properties of a "humanized" OKT3 monoclonal antibody", J. Immunol. 148(11): 3461-68 (1992); Reddy MP, Kinney CAS., Chaikin MA, Fishman-Lobell J, Tsui P, et al. "Elimination of Fc Receptor-Dependent Effector Functions of a Modified IgG4 Monoclonal Antibody to Human CD4", J. Immunol. 164:1925-33 (2000)). 따라서, L235E 돌연변이는 옵소닌작용된(opsonized) 정상 세포(예컨대, RBC, 혈소판 등)의 식균작용 또는 용해와 같은 부작용 위험을 감소시킬 것이다. NOG 마우스(그룹당 n=8)에 NCI-N87 세포(피하주사된 1천만개의 세포)를 이식하였고, 세포 이식 7일 후에 항체 요법을 시작하고, 종양 체적이 약 100mm3이었다. 항-CD47 항체 h20-H2L5Y-G4PE를 단독 또는 조합하여 10mg/kg/용량으로 주입하는 반면, Herceptin®은 2.5mg/kg/용량의 투여량으로 단독으로 또는 조합하여 투여하였다. 항체는 복강내 주사에 의해 5주까지 주 3회 투여하였다. 도 24에 도시된 바와 같이, 항-CD47 항체 h20-H2L5Y-G4PE 단독으로 처리한 마우스 그룹에서 NCI-N87 성장의 지연이 관찰되었으며, Herceptin®과 항-CD47 h20-H2L5Y-G4PE 항체의 조합에 의해 처리된 마우스에서 NCI-N87 성장의 더 강한 지연이 관찰되었다(도 24). 연구가 NOD/SCID 마우스에서 수행되었을 때도 비슷한 결과가 얻어졌다(데이터는 도시되지 않음). Herceptin®과 항-CD47 h20-H2L5Y-G4PE의 조합에 의해 처리된 마우스 그룹에서 NCI-N87 종양 성장의 감소는 Herceptin® 단독으로 처리한 마우스 그룹과 비교하여 통계적으로 더 높았으며(p <0.05, 스튜던트 t-검정(Student's t-test)), 이는 생체 내 NCI-N87 종양 세포 증식 및 다른 Her-2 양성 위 종양의 증식을 제어하기 위한, 항-CD47 h20-H2L5Y 항체와 Herceptin® 간의 협동 효과를 입증했다.
추가 양태:
1. 하기로 구성된 항체 그룹으로부터 선택되는 항체로서:
(a) SEQ ID NO: 1-3(Kabat 주석) 또는 SEQ ID NO: 4-6(IMGT 주석)에 개시된 각 CDR 서열을 갖는 중쇄 및 SEQ ID NO:7-9(Kabat 주석) 또는 SEQ ID NO: 10-12(IMGT 주석)에 개시된 각 CDR 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항체 그룹 1; 또는
(b) SEQ ID NO: 13-15(Kabat 주석) 또는 SEQ ID NO: 16-18(IMGT 주석)에 개시된 각 CDR 서열을 갖는 중쇄 및 SEQ ID NO: 19-21(Kabat 주석) 또는 SEQ ID NO:22-24(IMGT 주석)에 개시된 각 CDR 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항체 그룹 2; 또는
(c) SEQ ID NO: 25-27(Kabat 주석) 또는 SEQ ID NO: 28-30(IMGT 주석)에 개시된 각 CDR 서열을 갖는 중쇄 및 SEQ ID NO: 31-33(Kabat 주석) 또는 SEQ ID NO: 34-36(IMGT 주석)에 개시된 각 CDR 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항체 그룹 3; 또는
(d) SEQ ID NO: 37-39(Kabat 주석) 또는 SEQ ID NO: 40-42(IMGT 주석)에 개시된 각 CDR 서열을 갖는 중쇄 및 SEQ ID NO: 43-45(Kabat 주석) 또는 SEQ ID NO: 46-48(IMGT 주석)에 개시된 각 CDR 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항체 그룹 4; 또는
(e) SEQ ID NO: 49-51(Kabat 주석) 또는 SEQ ID NO: 52-54(IMGT 주석)에 개시된 각 CDR 서열을 갖는 중쇄 및 SEQ ID NO: 55-57(Kabat 주석) 또는 SEQ ID NO: 58-60(IMGT 주석)에 개시된 각 CDR 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항체 그룹 5; 또는
(f) SEQ ID NO: 61-63(Kabat 주석) 또는 SEQ ID NO: 64-66(IMGT 주석)에 개시된 각 CDR 서열을 갖는 중쇄 및 SEQ ID NO: 67-69(Kabat 주석) 또는 SEQ ID NO: 70-72(IMGT 주석)에 개시된 각 CDR 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항체 그룹 6; 또는
(g) SEQ ID NO: 73-75(Kabat 주석) 또는 SEQ ID NO: 76-78(IMGT 주석)에 개시된 각 CDR 서열을 갖는 중쇄 및 SEQ ID NO: 79-81(Kabat 주석) 또는 SEQ ID NO: 82-84(IMGT 주석)에 개시된 각 CDR 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항체 그룹 7; 또는
(h) SEQ ID NO: 85-87(Kabat 주석) 또는 SEQ ID NO: 88-90(IMGT 주석)에 개시된 각 CDR 서열을 갖는 중쇄 및 SEQ ID NO: 91-93(Kabat 주석) 또는 SEQ ID NO: 94-96(IMGT 주석)에 개시된 각 CDR 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항체 그룹 8; 또는
(i) SEQ ID NO: 97-99(Kabat 주석) 또는 SEQ ID NO: 100-102(IMGT 주석)에 개시된 각 CDR 서열을 갖는 중쇄 및 SEQ ID NO: 103-105(Kabat 주석) 또는 SEQ ID NO: 106-108(IMGT 주석)에 개시된 각 CDR 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항체 그룹 9; 또는
(j) SEQ ID NO: 109-111(Kabat 주석) 또는 SEQ ID NO: 112-114(IMGT 주석)에 개시된 각 CDR 서열을 갖는 중쇄 및 SEQ ID NO: 115-117(Kabat 주석) 또는 SEQ ID NO: 118-120(IMGT 주석)에 개시된 각 CDR 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항체 그룹 10;
(k) SEQ ID NO: 49-51(Kabat 주석) 또는 SEQ ID NO: 52-54(IMGT 주석)에 개시된 각 CDR 서열을 갖는 중쇄 및 SEQ ID NO: 55, 152, 57(Kabat 주석) 또는 SEQ ID NO: 58, 153, 60(IMGT 주석)에 개시된 각 CDR 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항체 그룹 11;
(l) 및, 바람직한 항체 그룹은 SEQ ID NO: 49-51(Kabat 주석) 또는 SEQ ID NO: 52-54(IMGT 주석)에 개시된 각 CDR 서열을 갖는 중쇄 및 SEQ ID NO: 55-57(Kabat 주석) 또는 SEQ ID NO: 58-60(IMGT 주석)에 개시된 각 CDR 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항체 그룹 5, SEQ ID NO: 61-63(Kabat 주석) 또는 SEQ ID NO: 64-66(IMGT 주석)에 개시된 각 CDR 서열을 갖는 중쇄 및 SEQ ID NO: 67-69(Kabat 주석) 또는 SEQ ID NO: 70-72(IMGT 주석)에 개시된 각 CDR 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항체 그룹 6; 및 SEQ ID NO: 49-51(Kabat 주석) 또는 SEQ ID NO: 52-54(IMGT 주석)에 개시된 각 CDR 서열을 갖는 중쇄 및 SEQ ID NO: 55, 152, 57(Kabat 주석) 또는 SEQ ID NO: 58, 153, 60(IMGT 주석)에 개시된 각 CDR 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항체 그룹 11로 구성된 항체 그룹으로부터 선택되는, 항체.
2. 양태 1에 있어서, 상기 항체가 하기로 구성된 항체 그룹으로부터 선택되며:
(a) SEQ ID NO: 121에 개시된 아미노산 서열을 갖는 VH 및/또는 SEQ ID NO: 122에 개시된 아미노산 서열을 갖는 VL을 포함하는 항체 그룹 1; 또는
(b) SEQ ID NO: 123에 개시된 아미노산 서열을 갖는 VH 및/또는 SEQ ID NO: 124에 개시된 아미노산 서열을 갖는 VL을 포함하는 항체 그룹 2; 또는
(c) SEQ ID NO: 125에 개시된 아미노산 서열을 갖는 VH 및/또는 SEQ ID NO: 126에 개시된 아미노산 서열을 갖는 VL을 포함하는 항체 그룹 3; 또는
(d) SEQ ID NO: 127에 개시된 아미노산 서열을 갖는 VH 및/또는 SEQ ID NO: 128에 개시된 아미노산 서열을 갖는 VL을 포함하는 항체 그룹 4; 또는
(e) SEQ ID NO: 129에 개시된 아미노산 서열을 갖는 VH 및/또는 SEQ ID NO: 130에 개시된 아미노산 서열을 갖는 VL을 포함하는 항체 그룹 5; 또는
(f) SEQ ID NO: 131에 개시된 아미노산 서열을 갖는 VH 및/또는 SEQ ID NO: 132에 개시된 아미노산 서열을 갖는 VL을 포함하는 항체 그룹 6; 또는
(g) SEQ ID NO: 133에 개시된 아미노산 서열을 갖는 VH 및/또는 SEQ ID NO: 134에 개시된 아미노산 서열을 갖는 VL을 포함하는 항체 그룹 7; 또는
(h) SEQ ID NO: 135에 개시된 아미노산 서열을 갖는 VH 및/또는 SEQ ID NO: 136에 개시된 아미노산 서열을 갖는 VL을 포함하는 항체 그룹 8; 또는
(i) SEQ ID NO: 137에 개시된 아미노산 서열을 갖는 VH 및/또는 SEQ ID NO: 138에 개시된 아미노산 서열을 갖는 VL을 포함하는 항체 그룹 9; 또는
(j) SEQ ID NO: 139에 개시된 아미노산 서열을 갖는 VH 및/또는 SEQ ID NO: 140에 개시된 아미노산 서열을 갖는 VL을 포함하는 항체 그룹 10; 또는
(k) SEQ ID NO: 129에 개시된 아미노산 서열을 갖는 VH 및/또는 SEQ ID NO: 154에 개시된 아미노산 서열을 갖는 VL을 포함하는 항체 그룹 11;
(l) 및 바람직한 항체 그룹은 SEQ ID NO: 129에 개시된 아미노산 서열을 갖는 VH 및/또는 SEQ ID NO: 130에 개시된 아미노산 서열을 갖는 VL을 포함하는 항체 그룹 5, SEQ ID NO: 131에 개시된 아미노산 서열을 갖는 VH 및/또는 SEQ ID NO: 132에 개시된 아미노산 서열을 갖는 VL을 포함하는 항체 그룹 6; 및 SEQ ID NO: 129에 개시된 아미노산 서열을 갖는 VH 및/또는 SEQ ID NO: 154에 개시된 아미노산 서열을 갖는 VL을 포함하는 항체 그룹 11로 구성된 항체 그룹으로부터 선택되는, 항체.
3. 양태 1 또는 2에 있어서, 상기 항체가 전장 키메라, 마우스 또는 인간화된 항체인, 항체.
4. 양태 3에 있어서, 상기 인간화된 항체가 SEQ ID NO: 141에 개시된 아미노산 서열을 갖는 VH 및 SEQ ID NO: 146-150 및/또는 SEQ ID NO: 155-159에 개시된 아미노산 서열로 구성된 VL의 그룹으로부터 선택된 VL을 포함하며; 또는 상기 인간화된 항체가 SEQ ID NO: 142에 개시된 아미노산 서열을 갖는 VH 및 SEQ ID NO: 146-150 및/또는 SEQ ID NO: 155-159에 개시된 아미노산 서열로 구성된 VL의 그룹으로부터 선택된 VL을 포함하며; 또는 상기 인간화된 항체가 SEQ ID NO: 143에 개시된 아미노산 서열을 갖는 VH 및 SEQ ID NO: 146-150 및/또는 SEQ ID NO: 155-159에 개시된 아미노산 서열로 구성된 VL의 그룹으로부터 선택된 VL을 포함하며; 또는 상기 인간화된 항체가 SEQ ID NO: 144에 개시된 아미노산 서열을 갖는 VH 및 SEQ ID NO: 146-150 및/또는 SEQ ID NO: 155-159에 개시된 아미노산 서열로 구성된 VL의 그룹으로부터 선택된 VL을 포함하며; 또는 상기 인간화된 항체가 SEQ ID NO: 145에 개시된 아미노산 서열을 갖는 VH 및 SEQ ID NO: 146-150 및/또는 SEQ ID NO: 155-159에 개시된 아미노산 서열로 구성된 VL의 그룹으로부터 선택된 VL을 포함하며; 또는 상기 인간화된 항체가 SEQ ID NO: 168에 개시된 아미노산 서열을 갖는 VH 및 SEQ ID NO: 172-175에 개시된 아미노산 서열로 구성된 VL의 그룹으로부터 선택된 VL을 포함하며; 또는 상기 인간화된 항체가 SEQ ID NO: 169에 개시된 아미노산 서열을 갖는 VH 및 SEQ ID NO: 172-175에 개시된 아미노산 서열로 구성된 VL의 그룹으로부터 선택된 VL을 포함하며; 또는 상기 인간화된 항체가 SEQ ID NO: 170에 개시된 아미노산 서열을 갖는 VH 및 SEQ ID NO: 172-175에 개시된 아미노산 서열로 구성된 VL의 그룹으로부터 선택된 VL을 포함하며; 또는 상기 인간화된 항체가 SEQ ID NO: 171에 개시된 아미노산 서열을 갖는 VH 및 SEQ ID NO: 172-175에 개시된 아미노산 서열로 구성된 VL의 그룹으로부터 선택된 VL을 포함하는, 항체.
5. 양태 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 약 1.0×10-4 s-1(1/s) 이상의 Koff 값을 갖는, 항체.
6. 양태 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 IgA 불변 영역, 바람직하게는 선택적으로 돌연변이 S228P(SEQ ID NO: 162) 및/또는 선택적으로 돌연변이 S228P-L235E(SEQ ID NO: 164)를 갖는 인간 IgG4를 갖는, 항체.
7. 양태 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 항체 단편이고, 상기 항체 단편이 선택적으로 F(ab')2 또는 Fab 단편인, 항체.
8. 양태 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 이중특이적 항체인, 항체.
9. 양태 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 인간 CD47에 특이적으로 결합하고, 결합시에 CD47을 활성화시키지 않는, 항체.
10. 양태 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 CD47, 바람직하게는 인간 CD47 상의 불연속적 에피토프에 결합하는, 항체.
11. 양태 10에 있어서, 상기 불연속적 에피토프가 아미노산 잔기 K59, R63, Y66, T67, H108, T109, T117 및 T120(SEQ ID NO: 151)을 포함하고; 또는 상기 불연속적 에피토프는 hCD47(SEQ ID NO: 151)의 아미노산 잔기 K59, K61, S107, H108, T117, T120 및 R121을 포함하는, 항체.
12. 양태 1 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 CD47 단량체 및 CD47 이량체, 바람직하게는 인간 CD47 단량체 및 이량체에 각각 결합하는, 항체.
13. 양태 1 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 CD47의 글리코실화된 및 탈글리코실화된 형태, 바람직하게는 인간 CD47 글리코실화된 및 탈글리코실화된 형태에 각각 결합하는, 항체.
14. 양태 1 내지 13 중 어느 한 항에 개시된 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
15. 양태 1 내지 13 중 어느 한 항에 개시된 항체를 생산하는 세포.
16. 약학적으로 허용가능한 부형제를 임의적으로 추가로 포함하는, 양태 1 내지 13 중 어느 한 항에 개시된 항체를 포함하는 약학적 조성물.
17. 개체의 질병의 치료에 사용하기 위한, 양태 1 내지 13 중 어느 한 항의 항체 또는 양태 16의 약학적 조성물.
18. 양태 17에 있어서, 암의 치료에 사용하기 위한, 항체 또는 조성물.
19. 양태 17 또는 18에 있어서, 단일 요법으로 사용하기 위한, 항체 또는 조성물.
20. 양태 17 또는 18에 있어서, 병용 요법, 바람직하게는 Her-2 억제제 또는 항-Her-2 항체 또는 EGFR 억제제 또는 항-EGFR 항체와 조합하여 사용하기 위한, 항체 또는 조성물.
21. 양태 17 내지 20 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체가 인간 및/또는 비-인간 동물인, 항체 또는 조성물.
22. 생물학적 샘플 또는 조직에서 CD47의 존재를 검출하는 방법으로서, (i) 상기 샘플 또는 조직을 양태 1 내지 13 중 어느 한 항에 개시된 항체와 접촉시키는 단계, 및 (ii) 상기 조직 또는 샘플에 결합된 항체의 존재를 측정하는 단계를 포함하는, 방법.
23. 양태 1 내지 13 중 어느 한 항의 항체를 생산하는 방법으로서, 양태 14의 핵산이 발현되도록 양태 15의 세포를 배양하는 단계, 및 선택적으로 세포 배양물로부터 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 방법.
24. 개체의 암을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 유효량의 양태 1 내지 13 중 어느 한 항의 항체를 암이 있거나 발병 위험이 있는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
추가 구현 예는 하기의 넘버링된 단락에서 정의된다:
1. 글리코실화된 및 글리코실화되지않은 CD47에 결합하는 항체로서, CD47에 대한 항체의 결합은 CD47의 글리코실화에 의존하지 않는, 항체.
2. 제1항에 있어서, 상기 항체가 치료용 항체로서 사용하기에 적합한, 항체.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체가 인간 CD47의 글리코실화된 및 탈글리코실화된 형태에 결합하는, 항체.
4. 제3항에 있어서, 인간 CD47의 상기 글리코실화된 형태가 인간 CD47의 아미노산 서열(SEQ ID NO: 151)에서 위치 N23, N34, N50, N73, N111 및/또는 N206에 하나 이상의 N-글리코실화 잔기를 포함하는, 항체.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 CD47의 상기 탈글리코실화된 형태가 N-글리코실화의 제거를 위해 펩타이드 N-글리코시다제(PNGase)로 처리된 글리코실화된 인간 CD47을 포함하는, 항체.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, (ⅰ) 글리코실화되지않은 형태 대 글리코실화된 형태의 CD47에 대한 항체의 결합의 EC50의 비율이 4, 3, 2, 1, 0.5, 0.25 미만, 바람직하게는 4 내지 1의 범위, 보다 바람직하게는 3 내지 1, 가장 바람직하게는 2 내지 1이고; 및/또는 (ii) 글리코실화되지않은 형태 대 글리코실화된 형태의 CD47에 대한 항체의 결합의 EC95의 비율이 25, 20, 10, 1, 0.5 또는 0.25 미만, 바람직하게는 10 내지 1, 보다 바람직하게는, 9 내지 1, 가장 바람직하게는 9 내지 1인, 항체.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 80 pM 이하, 바람직하게는 70 pM 이하, 보다 바람직하게는 60 pM 이하의 평형 결합 상수로 글리코실화된 및 글리코실화되지않은 CD47 각각에 결합하는, 항체.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 글리코실화되지 않은 CD47에 대한 항체의 최대 결합능(Bmax2)이 글리코실화된 CD47에 대한 항체의 최대 결합능(Bmax1)의 적어도 60%인, 항체.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 약 1.0×10-4 s-1(1/s) 이상의, 글리코실화된 및/또는 글리코실화되지않은 CD47에 대한 결합을 위한 Koff 값을 갖는, 항체.
10. 제9항에 있어서, 상기 항체가 1.0×10-4 s-1 내지 1.0×10-3 s-1의, 글리코실화된 및/또는 글리코실화되지않은 CD47에 대한 결합을 위한 Koff 값을 갖는, 항체.
11. 제10항에 있어서, 상기 항체가 2.5×10-4 s-1 내지 8.0×10-4 s-1의, 글리코실화된 및/또는 글리코실화되지않은 CD47에 대한 결합을 위한 Koff 값을 갖는, 항체.
12. CD47에 결합하는 항체로서, 상기 항체가 1.0×10-4 s-1 내지 1.0×10-3 s-1의, CD47에 결합하기 위한 Koff 값을 갖는, 항체.
13. (i) SEQ ID NO: 49-51(Kabat 주석) 또는 SEQ ID NO: 52-54(IMGT 주석)에 개시된 각 CDR 서열을 갖는 중쇄 및 SEQ ID NO: 55-57(Kabat 주석) 또는 SEQ ID NO: 58-60(IMGT 주석)에 개시된 각 CDR 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항체 그룹, (ii) SEQ ID NO: 61-63(Kabat 주석) 또는 SEQ ID NO: 64-66(IMGT 주석)에 개시된 각 CDR 서열을 갖는 중쇄 및 SEQ ID NO: 67-69(Kabat 주석) 또는 SEQ ID NO: 70-72(IMGT 주석)에 개시된 각 CDR 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항체 그룹; 및 (iii) SEQ ID NO: 49-51(Kabat 주석) 또는 SEQ ID NO: 52-54(IMGT 주석)에 개시된 각 CDR 서열을 갖는 중쇄 및 SEQ ID NO: 55, 152, 57(Kabat 주석) 또는 SEQ ID NO: 58, 153, 60(IMGT 주석)에 개시된 각 CDR 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항체 그룹으로 구성된 항체 그룹으로부터 선택되는, 항체.
14. 제13항에 있어서, 상기 항체가
(a) SEQ ID NO: 129에 개시된 아미노산 서열을 갖는 VH 및 SEQ ID NO: 130에 개시된 아미노산 서열을 갖는 VL을 포함하는 항체 그룹; 또는
(b) SEQ ID NO: 131에 개시된 아미노산 서열을 갖는 VH 및 SEQ ID NO: 132에 개시된 아미노산 서열을 갖는 VL을 포함하는 항체 그룹; 또는
(c) SEQ ID NO: 129에 개시된 아미노산 서열을 갖는 VH 및 SEQ ID NO: 154에 개시된 아미노산 서열을 갖는 VL을 포함하는 항체 그룹
으로 구성된 항체 그룹으로부터 선택되는, 항체.
15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 항체가 전장 키메라, 마우스 또는 인간화된 항체인, 항체.
16. 제15항에 있어서, 상기 인간화된 항체가 SEQ ID NO: 141에 개시된 아미노산 서열을 갖는 VH 및 SEQ ID NO: 146-150 및/또는 SEQ ID NO: 155-159에 개시된 아미노산 서열로 구성된 VL의 그룹으로부터 선택된 VL을 포함하며; 또는 상기 인간화된 항체가 SEQ ID NO: 142에 개시된 아미노산 서열을 갖는 VH 및 SEQ ID NO: 146-150 및/또는 SEQ ID NO: 155-159에 개시된 아미노산 서열로 구성된 VL의 그룹으로부터 선택된 VL을 포함하며; 또는 상기 인간화된 항체가 SEQ ID NO: 143에 개시된 아미노산 서열을 갖는 VH 및 SEQ ID NO: 146-150 및/또는 SEQ ID NO: 155-159에 개시된 아미노산 서열로 구성된 VL의 그룹으로부터 선택된 VL을 포함하며; 또는 상기 인간화된 항체가 SEQ ID NO: 144에 개시된 아미노산 서열을 갖는 VH 및 SEQ ID NO: 146-150 및/또는 SEQ ID NO: 155-159에 개시된 아미노산 서열로 구성된 VL의 그룹으로부터 선택된 VL을 포함하며; 또는 상기 인간화된 항체가 SEQ ID NO: 145에 개시된 아미노산 서열을 갖는 VH 및 SEQ ID NO: 146-150 및/또는 SEQ ID NO: 155-159에 개시된 아미노산 서열로 구성된 VL의 그룹으로부터 선택된 VL을 포함하며; 또는 상기 인간화된 항체가 SEQ ID NO: 168에 개시된 아미노산 서열을 갖는 VH 및 SEQ ID NO: 172-175에 개시된 아미노산 서열로 구성된 VL의 그룹으로부터 선택된 VL을 포함하며; 또는 상기 인간화된 항체가 SEQ ID NO: 169에 개시된 아미노산 서열을 갖는 VH 및 SEQ ID NO: 172-175에 개시된 아미노산 서열로 구성된 VL의 그룹으로부터 선택된 VL을 포함하며; 또는 상기 인간화된 항체가 SEQ ID NO: 170에 개시된 아미노산 서열을 갖는 VH 및 SEQ ID NO: 172-175에 개시된 아미노산 서열로 구성된 VL의 그룹으로부터 선택된 VL을 포함하며; 또는 상기 인간화된 항체가 SEQ ID NO: 171에 개시된 아미노산 서열을 갖는 VH 및 SEQ ID NO: 172-175에 개시된 아미노산 서열로 구성된 VL의 그룹으로부터 선택된 VL을 포함하는, 항체.
17. 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 1.0×10-4 s-1 내지 1.0×10-3 s-1의 Koff 값을 갖는, 항체.
18. 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 선택적으로 돌연변이 S228P(SEQ ID NO: 162) 또는 선택적으로 돌연변이 S228P-L235E(SEQ ID NO: 164)를 갖는 인간 IgG4 불변 영역을 갖는, 항체.
19. 제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 항체 단편이고, 상기 항체 단편이 선택적으로 F(ab')2 또는 Fab 단편인, 항체.
20. 제13항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 이중특이적 항체인, 항체.
21. 제13항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 CD47에 특이적으로 결합하고, CD47-SIRPα 상호작용을 파괴하며, 바람직하게는 상기 항체가 각각 인간 CD47에 특이적으로 결합하고, 인간 CD47-SIRPα 상호작용을 파괴하는, 항체.
22. 제13항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 CD47, 바람직하게는 인간 CD47 상의 불연속적 에피토프에 결합하는, 항체.
23. 제22항에 있어서, 상기 불연속적 에피토프가 인간 CD47(SEQ ID NO: 151)의 아미노산 잔기 K59, R63, Y66, T67, H108, T109, T117 및 T120을 포함하고; 또는 상기 불연속적 에피토프는 인간 CD47(SEQ ID NO: 151)의 아미노산 잔기 K59, K61, S107, H108, T117, T120 및 R121을 포함하는, 항체.
24. 제13항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 CD47 단량체 및 CD47 이량체, 바람직하게는 인간 CD47 단량체 및 이량체에 각각 결합하는, 항체.
25. 제13항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 CD47의 글리코실화된 및 탈글리코실화된 형태, 바람직하게는 인간 CD47 글리코실화된 및 탈글리코실화된 형태에 각각 결합하는, 항체.
26. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 개시된 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
27. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 개시된 항체를 생산하는 세포.
28. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 개시된 항체를 포함하고, 약학적으로 허용가능한 부형제를 선택적으로 추가로 포함하는, 약학적 조성물.
29. 개체의 질환의 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 항체 또는 제28항의 약학적 조성물.
30. 제29항에 있어서, 암 치료에 사용하기 위한, 항체 또는 조성물.
31. 제30항에 있어서, 단일 요법으로 사용하기 위한, 항체 또는 조성물.
32. 제30항에 있어서, 병용 요법, 바람직하게는 Her-2 억제제 또는 항-Her-2 항체 또는 EGFR 억제제 또는 항-EGFR 항체와 조합하여 사용하기 위한, 항체 또는 조성물.
33. 제29항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체가 인간 또는 비-인간 동물인, 항체 또는 조성물.
34. 생물학적 샘플 또는 조직에서 CD47의 존재를 검출하는 방법으로서, 상기 방법이 (i) 상기 샘플 또는 조직을 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 개시된 항체와 접촉시키는 단계, 및 (ii) 상기 조직 또는 샘플에 결합된 항체의 존재를 측정하는 단계를 포함하는, 방법.
35. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 항체를 생산하는 방법으로서, 제26항의 핵산이 발현되도록 제27항의 세포를 배양하는 단계, 및 선택적으로 세포 배양물로부터 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 방법.
36. 개체의 암을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 유효량의 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 항체를 암이 있거나 발병 위험이 있는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
<110> Blink Biomedical <120> HUMANIZED, MOUSE OR CHIMERIC ANTI-CD47 MONOCLONAL ANTIBODIES <130> PAT017/PCT <160> 176 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Human <400> 1 Lys Tyr Trp Met His 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VT008-AL5-10G7 antibody; heavy chain; CDR2-Kabat <400> 2 Glu Ile Asn Pro Ser Asp Thr Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VT008-AL5-10G7 antibody; heavy chain; CDR3-Kabat <400> 3 Val Ala Thr Met Val Ala Arg Gly Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VT008-AL5-10G7 antibody; heavy chain; CDR1-IMGT <400> 4 Gly Tyr Thr Phe Thr Lys Tyr Trp 1 5 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VT008-AL5-10G7 antibody; heavy chain; CDR2-IMGT <400> 5 Ile Asn Pro Ser Asp Thr Tyr Thr 1 5 <210> 6 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VT008-AL5-10G7 antibody; heavy chain; CDR3-IMGT <400> 6 Ala Arg Val Ala Thr Met Val Ala Arg Gly Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VT008-AL5-10K7 antibody; 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nucleotide sequence of human IgG4 S228P double mutant <400> 163 gctagcacca agggcccctc tgtgtttcct ctggcccctt gctcccggtc cacctccgaa 60 tctacagccg ctctgggctg cctcgtgaaa gactacttcc ccgagcctgt gacagtgtcc 120 tggaactctg gcgccctgac cagcggagtg cataccttcc ctgctgtgct gcagtcctcc 180 ggcctgtact ccctgtcctc cgtcgtgaca gtgccctcca gctctctggg caccaagacc 240 tatacctgca acgtggacca caagccctcc aacaccaagg tggacaagag agtggaatct 300 aagtacggcc ctccctgccc cccttgtcct gcccctgaat ttgaaggcgg accctccgtg 360 ttcctgttcc ccccaaagcc taaggacacc ctgatgatct cccggacccc cgaagtgacc 420 tgcgtggtgg tggatgtgtc tcaggaagat cccgaggtgc agttcaattg gtacgtggac 480 ggcgtggaag tgcataatgc caagaccaag cctcgggaag aacagttcaa ctccacctac 540 cgggtggtgt ccgtgctgac cgtgctgcac caggattggc tgaacggcaa agagtacaag 600 tgcaaggtgt ccaacaaggg cctgcccagc tccatcgaaa agaccatctc caaggccaag 660 ggccagcccc gggaacccca ggtgtacaca ctgcctccat cccaggaaga gatgaccaag 720 aaccaggtgt ccctgacctg tctcgtgaag ggattctacc cctccgatat cgccgtggaa 780 tgggagtcca acggccagcc tgagaacaac tacaagacca ccccccctgt gctggactcc 840 gacggctcct tcttcctgta ctctcgcctg accgtggaca agtcccggtg gcaggaaggc 900 aacgtgttct cctgctccgt gatgcacgag gccctgcaca accactacac ccagaagtcc 960 ctgtctctgt ccctgggcaa g 981 <210> 164 <211> 327 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> huIgG4_S228P_L235E; amino acid sequence of human IgG4 S228P_L235E double mutant <400> 164 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 165 <211> 444 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> h20-H2-L5Y; heavy chain in huIgG4_S228P format <400> 165 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Ile Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Lys Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly His Tyr Gly Arg Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys 210 215 220 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 225 230 235 240 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 245 250 255 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln 260 265 270 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 275 280 285 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 290 295 300 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 305 310 315 320 Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 325 330 335 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 340 345 350 Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 355 360 365 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 370 375 380 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 385 390 395 400 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 405 410 415 Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 420 425 430 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly 435 440 <210> 166 <211> 444 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> h20-H2 ; heavy chain in hu-IgG4_S228P_L325E format <400> 166 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Ile Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Lys Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly His Tyr Gly Arg Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys 210 215 220 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 225 230 235 240 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 245 250 255 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln 260 265 270 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 275 280 285 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 290 295 300 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 305 310 315 320 Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 325 330 335 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 340 345 350 Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 355 360 365 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 370 375 380 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 385 390 395 400 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 405 410 415 Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 420 425 430 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly 435 440 <210> 167 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> h20-L5Y antibody; light chain <400> 167 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Ile Asp Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Thr Lys Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln 85 90 95 His Tyr Ser Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Arg Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 115 120 125 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 130 135 140 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 145 150 155 160 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 165 170 175 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 180 185 190 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 195 200 205 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 220 <210> 168 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL008-AL13-8G5 antibody; humanized variable region heavy chain; VH1m <400> 168 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val His Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Met Ile His Pro Asn Ser Gly Thr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Ser His Tyr Tyr Asp Gly His Phe Ser Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 169 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL008-AL13-8G5 antibody; humanized variable region heavy chain; VH2m <400> 169 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Met Ile His Pro Asn Ser Gly Thr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Ser His Tyr Tyr Asp Gly His Phe Ser Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 170 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL008-AL13-8G5 antibody; humanized variable region heavy chain; VH3 <400> 170 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Met Ile His Pro Asn Ser Gly Thr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Ser His Tyr Tyr Asp Gly His Phe Ser Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 171 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL008-AL13-8G5 antibody; humanized variable region heavy chain; VH4 <400> 171 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Met Ile His Pro Asn Ser Gly Thr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Ser Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Ser His Tyr Tyr Asp Gly His Phe Ser Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 172 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL008-AL13-8K3 antibody; humanized variable region light chain; VL1 <400> 172 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Gly Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Phe Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln 85 90 95 Ser Tyr Asn Leu Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Val Lys 100 105 110 <210> 173 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL008-AL13-8K3 antibody; humanized variable region light chain; VL2 <400> 173 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln 85 90 95 Ser Tyr Asn Leu Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 174 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL008-AL13-8K3 antibody; humanized variable region light chain; VL3 <400> 174 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Ala Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Asp Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln 85 90 95 Ser Tyr Asn Leu Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 175 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL008-AL13-8K3 antibody; humanized variable region light chain; VL4 <400> 175 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ala Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln 85 90 95 Ser Tyr Asn Leu Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 176 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Constant region of human kappa light chain <400> 176 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105

Claims (31)

  1. 항-CD47 항체 및 항체를 사용하는 것에 관한 지침을 포함하는 키트로서,
    상기 항체는
    a. SEQ ID: 49-51(Kabat 주석) 또는 SEQ ID: 52-54(IMGT 주석)에 개시된 CDR 서열들 각각을 갖는 중쇄, 및 SEQ ID: 55, 152 및 57(Kabat 주석) 또는 SEQ ID: 58, 153 및 60(IMGT 주석)에 개시된 CDR 서열들 각각을 갖는 경쇄; 또는
    b. SEQ ID: 49-51(Kabat 주석) 또는 SEQ ID: 52-54(IMGT 주석)에 개시된 CDR 서열들 각각을 갖는 중쇄, 및 SEQ ID: 55-57(Kabat 주석) 또는 SEQ ID: 58-60(IMGT 주석)에 개시된 CDR 서열들 각각을 갖는 경쇄
    를 포함하는, 키트.
  2. 이중특이적 항체 및 이 항체를 사용하는 것에 관한 지침을 포함하는 키트로서, 상기 항체는 CD47에 결합하고, 상기 항체는
    a. SEQ ID: 49-51(Kabat 주석) 또는 SEQ ID: 52-54(IMGT 주석)에 개시된 CDR 서열들 각각을 갖는 중쇄, 및 SEQ ID: 55, 152 및 57(Kabat 주석) 또는 SEQ ID: 58, 153 및 60(IMGT 주석)에 개시된 CDR 서열들 각각을 갖는 경쇄; 또는
    b. SEQ ID: 49-51(Kabat 주석) 또는 SEQ ID: 52-54(IMGT 주석)에 개시된 CDR 서열들 각각을 갖는 중쇄, 및 SEQ ID: 55-57(Kabat 주석) 또는 SEQ ID: 58-60(IMGT 주석)에 개시된 CDR 서열들 각각을 갖는 경쇄
    를 포함하는, 키트.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 항체는
    a. SEQ ID:142에 개시된 서열을 포함하는 VH 서열 및 SEQ ID:159에 개시된 서열을 포함하는 VL 서열;
    b. SEQ ID:143에 개시된 서열을 포함하는 VH 서열 및 SEQ ID:156에 개시된 서열을 포함하는 VL 서열;
    c. SEQ ID:143에 개시된 서열을 포함하는 VH 서열 및 SEQ ID:157에 개시된 서열을 포함하는 VL 서열;
    d. SEQ ID:144에 개시된 서열을 포함하는 VH 서열 및 SEQ ID:158에 개시된 서열을 포함하는 VL 서열;
    e. SEQ ID:144에 개시된 서열을 포함하는 VH 서열 및 SEQ ID:159에 개시된 서열을 포함하는 VL 서열;
    f. SEQ ID:141에 개시된 서열을 포함하는 VH 서열 및 SEQ ID:146에 개시된 서열을 포함하는 VL 서열;
    g. SEQ ID:141에 개시된 서열을 포함하는 VH 서열 및 SEQ ID:147에 개시된 서열을 포함하는 VL 서열;
    h. SEQ ID:141에 개시된 서열을 포함하는 VH 서열 및 SEQ ID:148에 개시된 서열을 포함하는 VL 서열;
    i. SEQ ID:141에 개시된 서열을 포함하는 VH 서열 및 SEQ ID:149에 개시된 서열을 포함하는 VL 서열;
    j. SEQ ID:141에 개시된 서열을 포함하는 VH 서열 및 SEQ ID:150에 개시된 서열을 포함하는 VL 서열;
    k. SEQ ID:142에 개시된 서열을 포함하는 VH 서열 및 SEQ ID:146에 개시된 서열을 포함하는 VL 서열;
    l. SEQ ID:142에 개시된 서열을 포함하는 VH 서열 및 SEQ ID:147에 개시된 서열을 포함하는 VL 서열;
    m. SEQ ID:142에 개시된 서열을 포함하는 VH 서열 및 SEQ ID:148에 개시된 서열을 포함하는 VL 서열;
    n. SEQ ID:142에 개시된 서열을 포함하는 VH 서열 및 SEQ ID:149에 개시된 서열을 포함하는 VL 서열;
    o. SEQ ID:142에 개시된 서열을 포함하는 VH 서열 및 SEQ ID:150에 개시된 서열을 포함하는 VL 서열;
    p. SEQ ID:143에 개시된 서열을 포함하는 VH 서열 및 SEQ ID:146에 개시된 서열을 포함하는 VL 서열;
    q. SEQ ID:143에 개시된 서열을 포함하는 VH 서열 및 SEQ ID:147에 개시된 서열을 포함하는 VL 서열;
    r. SEQ ID:143에 개시된 서열을 포함하는 VH 서열 및 SEQ ID:148에 개시된 서열을 포함하는 VL 서열;
    s. SEQ ID:143에 개시된 서열을 포함하는 VH 서열 및 SEQ ID:149에 개시된 서열을 포함하는 VL 서열;
    t. SEQ ID:143에 개시된 서열을 포함하는 VH 서열 및 SEQ ID:150에 개시된 서열을 포함하는 VL 서열;
    u. SEQ ID:144에 개시된 서열을 포함하는 VH 서열 및 SEQ ID:146에 개시된 서열을 포함하는 VL 서열;
    v. SEQ ID:144에 개시된 서열을 포함하는 VH 서열 및 SEQ ID:147에 개시된 서열을 포함하는 VL 서열;
    w. SEQ ID:144에 개시된 서열을 포함하는 VH 서열 및 SEQ ID:148에 개시된 서열을 포함하는 VL 서열;
    x. SEQ ID:144에 개시된 서열을 포함하는 VH 서열 및 SEQ ID:149에 개시된 서열을 포함하는 VL 서열;
    y. SEQ ID:144에 개시된 서열을 포함하는 VH 서열 및 SEQ ID:150에 개시된 서열을 포함하는 VL 서열;
    z. SEQ ID:145에 개시된 서열을 포함하는 VH 서열 및 SEQ ID:146에 개시된 서열을 포함하는 VL 서열;
    aa. SEQ ID:145에 개시된 서열을 포함하는 VH 서열 및 SEQ ID:147에 개시된 서열을 포함하는 VL 서열;
    bb. SEQ ID:145에 개시된 서열을 포함하는 VH 서열 및 SEQ ID:148에 개시된 서열을 포함하는 VL 서열;
    cc. SEQ ID:145에 개시된 서열을 포함하는 VH 서열 및 SEQ ID:149에 개시된 서열을 포함하는 VL 서열;
    dd. SEQ ID:145에 개시된 서열을 포함하는 VH 서열 및 SEQ ID:150에 개시된 서열을 포함하는 VL 서열
    을 포함하는, 키트.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 SEQ ID:142에 개시된 서열을 포함하는 VH 서열 및 SEQ ID:159에 개시된 서열을 포함하는 VL 서열을 포함하는, 키트.
  5. 청구항 1 또는 3에 있어서, 상기 항체는 SEQ ID:165에 개시된 서열을 갖는 중쇄 및 SEQ ID:167에 개시된 서열을 갖는 경쇄를 포함하는, 키트.
  6. 청구항 1 또는 3에 있어서, 상기 항체는 SEQ ID:166에 개시된 서열을 갖는 중쇄 및 SEQ ID:167에 개시된 서열을 갖는 경쇄를 포함하는, 키트.
  7. 항-CD47 항체와, 이 항체를 사용하는 것에 관한 지침을 포함하는 키트로서, 상기 항체는 SEQ ID: 61-63(Kabat 주석) 또는 SEQ ID: 64-66(IMGT 주석)에 개시된 CDR 서열들 각각을 갖는 중쇄, 및 SEQ ID: 67-69(Kabat 주석) 또는 SEQ ID: 70-72(IMGT 주석)에 개시된 CDR 서열들 각각을 갖는 경쇄를 포함하는, 키트.
  8. 이중특이적 항체 및 이 항체를 사용하는 것에 관한 지침을 포함하는 키트로서, 상기 항체는 CD47에 결합하고, 상기 항체는 SEQ ID: 61-63(Kabat 주석) 또는 SEQ ID: 64-66(IMGT 주석)에 개시된 CDR 서열들 각각을 갖는 중쇄, 및 SEQ ID: 67-69(Kabat 주석) 또는 SEQ ID: 70-72(IMGT 주석)에 개시된 CDR 서열들 각각을 갖는 경쇄를 포함하는, 키트.
  9. 청구항 7 또는 8에 있어서, 상기 항체는
    a. SEQ ID:168에 개시된 서열을 포함하는 VH 서열 및 SEQ ID:172에 개시된 서열을 포함하는 VL 서열;
    b. SEQ ID:168에 개시된 서열을 포함하는 VH 서열 및 SEQ ID:173에 개시된 서열을 포함하는 VL 서열;
    c. SEQ ID:168에 개시된 서열을 포함하는 VH 서열 및 SEQ ID:174에 개시된 서열을 포함하는 VL 서열;
    d. SEQ ID:168에 개시된 서열을 포함하는 VH 서열 및 SEQ ID:175에 개시된 서열을 포함하는 VL 서열;
    e. SEQ ID:169에 개시된 서열을 포함하는 VH 서열 및 SEQ ID:172에 개시된 서열을 포함하는 VL 서열;
    f. SEQ ID:169에 개시된 서열을 포함하는 VH 서열 및 SEQ ID:173에 개시된 서열을 포함하는 VL 서열;
    g. SEQ ID:169에 개시된 서열을 포함하는 VH 서열 및 SEQ ID:174에 개시된 서열을 포함하는 VL 서열;
    h. SEQ ID:169에 개시된 서열을 포함하는 VH 서열 및 SEQ ID:175에 개시된 서열을 포함하는 VL 서열;
    i. SEQ ID:170에 개시된 서열을 포함하는 VH 서열 및 SEQ ID:172에 개시된 서열을 포함하는 VL 서열;
    j. SEQ ID:170에 개시된 서열을 포함하는 VH 서열 및 SEQ ID:173에 개시된 서열을 포함하는 VL 서열;
    k. SEQ ID:170에 개시된 서열을 포함하는 VH 서열 및 SEQ ID:174에 개시된 서열을 포함하는 VL 서열;
    l. SEQ ID:170에 개시된 서열을 포함하는 VH 서열 및 SEQ ID:175에 개시된 서열을 포함하는 VL 서열;
    m. SEQ ID:171에 개시된 서열을 포함하는 VH 서열 및 SEQ ID:172에 개시된 서열을 포함하는 VL 서열;
    n. SEQ ID:171에 개시된 서열을 포함하는 VH 서열 및 SEQ ID:173에 개시된 서열을 포함하는 VL 서열;
    o. SEQ ID:171에 개시된 서열을 포함하는 VH 서열 및 SEQ ID:174에 개시된 서열을 포함하는 VL 서열;
    p. SEQ ID:171에 개시된 서열을 포함하는 VH 서열 및 SEQ ID:175에 개시된 서열을 포함하는 VL 서열
    을 포함하는, 키트.
  10. 청구항 1 내지 3 및 청구항 7 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 글리코실화된 CD47 및 글리코실화되지않은 CD47에 결합하고, 상기 항체와 CD47의 결합은 CD47의 글리코실화에 의존하지 않는, 키트.
  11. 청구항 10에 있어서,
    a. 인간 CD47의 상기 글리코실화된 형태는 인간 CD47(SEQ ID:151)의 아미노산 서열에서 위치 N23, N34, N50, N73, N111 및/또는 N206에 하나 이상의 N-글리코실화 잔기를 포함하고/포함하거나;
    b. 인간 CD47의 탈글리코실화된 형태는 N-글리코실화 재거를 위해 펩티드 N-글리코시다제(PNGase)로 처리된 글리코실화 인간 CD47을 포함하고/포함하거나;
    c. 상기 항체는 글리코실화된 CD47 및 글리코실화되지않은 CD47에 특이적으로 결합하고, CD47-SIRPα 상호작용을 파괴하는, 키트.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 항체는 각각 글리코실화된 인간 CD47 및 글리코실화되지않은 인간 CD47에 특이적으로 결합하고, 인간 CD47-SIRPα 상호작용을 파괴하는, 키트.
  13. 청구항 1 내지 3 및 청구항 7 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 항체 단편인, 키트.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 항체 단편은 F(ab')2, scFv 또는 Fab 단편인, 키트.
  15. 청구항 1 내지 4 및 청구항 7 내지 14 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 인간 IgG4를 갖는, 키트.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 항체는 돌연변이 S228P를 갖는 인간 IgG4(SEQ ID: 162)를 갖는, 키트.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 항체는 이중돌연변이 S228P-L235E를 갖는 인간 IgG4(SEQ ID: 164)를 갖는, 키트.
  18. 청구항 1 내지 3 및 청구항 7 내지 17 중 어느 한 항에 있어서,
    a. 상기 항체는 CD47, 바람직하게 인간 CD47 상의 불연속적 에피토프에 결합하고/결합하거나;
    b. 상기 항체는 CD47 단량체 및 CD47 이량체, 바람직하게 인간 CD47 단량체 및 이량체 각각과 결합하는, 키트.
  19. 청구항 18에 있어서, 상기 불연속적 에피토프는 인간 CD47(SEQ ID 151)의 아미노산 잔기 K59, R63, Y66, T67, H108, T109, T117 및 T120을 포함하거나; 또는 상기 불연속적 에피토프는 인간 CD47(SEQ ID 151)의 아미노산 잔기 K59, K61, S107, H108, T117, T120 및 R121을 포함하는, 키트.
  20. 청구항 1 내지 3 및 청구항 7 내지 19 중 어느 한 항에 있어서,
    a. CD47의 글리코실화되지않은 형태 대 글리코실화된 형태에 대한 상기 항체 결합의 EC50의 비는 4:1, 3:1, 2:1, 1:2, 1:3 또는 1:4 미만이고/이거나;
    b. CD47의 글리코실화되지않은 형태 대 글리코실화된 형태에 대한 상기 항체 결합의 EC50의 비는 25:1, 20:1 또는 10:1, 1:10, 1:20 또는 1:25 미만이고/미만이거나;
    c. 상기 항체는 글리코실화된 CD47 및 글리코실화되지않은 CD47 각각에 80 pM 이하의 평형 결합 상수로 결합하고/결합하거나;
    d. 상기 글리코실화되지않은 CD47에 글리코실화되지 않은 CD47에 대한 상기 항체의 최대 결합능(Bmax2)은, 상기 글리코실화된 CD47에 대한 상기 항체의 최대 결합능(Bmax1)의 적어도 60%이고/이거나;
    e. 상기 항체는 약 1.0×10-4 s-1(1/s) 이상의, 글리코실화된 CD47 및/또는 글리코실화되지않은 CD47에 대한 결합을 위한 Koff 값을 갖는데, 예컨대 상기 항체는 1.0×10-4 s-1 내지 1.0×10-3 s-1의, 글리코실화된 CD47 및/또는 글리코실화되지않은 CD47에 대한 결합을 위한 Koff 값을 갖고, 예컨대 상기 항체는 2.5×10-4 s-1 내지 8.0×10-4 s-1의, 글리코실화된 CD47 및/또는 글리코실화되지않은 CD47에 대한 결합을 위한 Koff 값을 갖고/갖거나;
    f. 상기 항체는 1.0×10-4 s-1 내지 1.0×10-3 s-1의, 글리코실화된 CD47 및/또는 글리코실화되지않은 CD47에 대한 결합을 위한 Koff 값을 갖는, 키트.
  21. 청구항 20에 있어서, 상기 CD47의 글리코실화되지않은 형태 대 글리코실화된 형태에 대한 항체 결합의 EC50의 비는 4:1 내지 1:4 범위인, 키트.
  22. 청구항 20에 있어서, 상기 CD47의 글리코실화되지않은 형태 대 글리코실화된 형태에 대한 항체 결합의 EC50의 비는 3:1 내지 1:3 범위인, 키트.
  23. 청구항 20에 있어서, 상기 CD47의 글리코실화되지않은 형태 대 글리코실화된 형태에 대한 항체 결합의 EC50의 비는 1:1 내지 1:2 범위인, 키트.
  24. 청구항 20에 있어서, 상기 CD47의 글리코실화되지않은 형태 대 글리코실화된 형태에 대한 항체 결합의 EC95의 비는 10:1 내지 1:10 범위인, 키트.
  25. 청구항 20에 있어서, 상기 CD47의 글리코실화되지않은 형태 대 글리코실화된 형태에 대한 항체 결합의 EC95의 비는 9:1 내지 1:9 범위인, 키트.
  26. 청구항 20에 있어서, 상기 항체는 상기 글리코실화된 CD47 및 글리코실화되지않은 CD47 각각에 70 pM 이하의 평형 결합 상수로 결합하는, 키트.
  27. 청구항 20에 있어서, 상기 항체는 상기 글리코실화된 CD47 및 글리코실화되지않은 CD47 각각에 60 pM 이하의 평형 결합 상수로 결합하는, 키트.
  28. 청구항 1 내지 27 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키트는 하나 이상의 바이알, 병, 주사기 또는 단위 투여량으로 예비-팩에 항체를 포함하는, 키트.
  29. 청구항 28에 있어서, 상기 키트는 희석제 및 전달 장치와 함께 단위 투여량으로 예비-팩에 항체를 포함하는, 키트.
  30. 청구항 29에 있어서, 상기 전달 장치는 흡입기 또는 주사기인, 키트.
  31. 청구항 30에 있어서, 상기 전달 장치는 주사기인, 키트.
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Families Citing this family (56)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20220163516A (ko) 2016-01-11 2022-12-09 포티 세븐, 인코포레이티드 인간화된, 마우스 또는 키메라 항-cd47 단클론 항체
WO2019023347A1 (en) 2017-07-26 2019-01-31 Forty Seven, Inc. ANTI-SIRP-ALPHA ANTIBODIES AND ASSOCIATED METHODS
WO2019020807A1 (en) 2017-07-28 2019-01-31 Gene Signal International Sa CD9P-1 TARGETING ANTIBODIES AND USES THEREOF
US11401329B2 (en) * 2017-08-02 2022-08-02 Phanes Therapeutics, Inc. Anti-CD47 antibodies and uses thereof
JP7256580B2 (ja) * 2017-08-18 2023-04-12 ウルトラヒューマン フォー リミティド 結合剤
CN117771364A (zh) 2017-10-18 2024-03-29 四十七公司 基于抗cd47剂的卵巢癌疗法
US20220298254A1 (en) 2017-11-01 2022-09-22 Hummingbird Bioscience Holdings Pte. Ltd. Cd47 antigen-binding molecules
TWI831759B (zh) * 2017-12-01 2024-02-11 美商思進公司 Cd47抗體及其用於治療癌症之用途
CN111699005A (zh) 2018-02-12 2020-09-22 四十七公司 使用抗cd47抗体和抗cd20抗体的抗癌方案
CN110144009B (zh) * 2018-02-14 2020-01-21 上海洛启生物医药技术有限公司 Cd47单域抗体及其用途
GB201804860D0 (en) * 2018-03-27 2018-05-09 Ultrahuman Two Ltd CD47 Binding agents
KR20210029158A (ko) 2018-06-03 2021-03-15 람카프 바이오 베타 엘티디. Ceacam5 및 cd47에 대한 이중특이성 항체
CN110577597B (zh) * 2018-06-11 2021-10-22 康诺亚生物医药科技（成都）有限公司 一种阻断CD47和SIRPα相互作用的抗体
CN112601544A (zh) * 2018-07-05 2021-04-02 三钰生物科技股份有限公司 人类抗cd47抗体及其用途
TWI830774B (zh) * 2018-08-31 2024-02-01 大陸商南京聖和藥業股份有限公司 抗cd47抗體及其應用
EP3826676A4 (en) * 2018-10-31 2022-05-04 I-Mab Biopharma US Limited NOVEL CD47 ANTIBODIES AND METHODS OF USE THEREOF
TW202045550A (zh) * 2019-04-05 2020-12-16 美商西建公司 腫瘤選擇性結合cd47之抗體之工程
CA3136450A1 (en) * 2019-04-18 2020-10-22 Qlsf Biotherapeutics Inc. Antibodies that target human cd47
EP3980747A1 (en) 2019-06-07 2022-04-13 ALX Oncology Inc. Methods and reagents for reducing the interference of drugs that bind cd47 in serological assays
EP3999107A1 (en) 2019-07-16 2022-05-25 Gilead Sciences, Inc. Hiv vaccines and methods of making and using
WO2021043220A1 (zh) * 2019-09-03 2021-03-11 中山康方生物医药有限公司 抗cd47的单克隆抗体及其用途
EP4349413A2 (en) 2019-10-18 2024-04-10 Forty Seven, Inc. Combination therapies for treating myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukemia
JP2022553390A (ja) * 2019-10-25 2022-12-22 ウーシー バイオロジクス アイルランド リミテッド 新規抗ｃｄ４７抗体及びその使用
CA3153636A1 (en) 2019-10-31 2021-05-06 Forty Seven, Inc. Anti-cd47 and anti-cd20 based treatment of blood cancer
CN115397853A (zh) 2019-12-17 2022-11-25 辉瑞大药厂 对cd47、pd-l1具特异性的抗体及其用途
IL294032A (en) 2019-12-24 2022-08-01 Carna Biosciences Inc Compounds that regulate diacylglycerol kinase
AU2021219668A1 (en) 2020-02-14 2022-08-25 Gilead Sciences, Inc. Antibodies and fusion proteins that bind to CCR8 and uses thereof
CN113939533B (zh) * 2020-06-18 2022-12-06 武汉全景生物技术有限公司 抗可溶性cd14亚型抗体、试剂盒及其应用
CN112010979B (zh) * 2020-08-21 2022-05-10 博奥信生物技术（南京）有限公司 一种抗人SIRPα单克隆抗体及其用途
EP4256336A1 (en) 2020-12-06 2023-10-11 ALX Oncology Inc. Multimers for reducing the interference of drugs that bind cd47 in serological assays
KR20220080375A (ko) 2020-12-07 2022-06-14 (주)이노베이션바이오 Cd47에 특이적인 항체 및 이의 용도
EP4050029A4 (en) * 2020-12-23 2023-07-12 Guangdong Feipeng Pharmaceutical Co., Ltd ANTIBODIES AGAINST CD47 AND USE THEREOF
CA3212351A1 (en) 2021-03-12 2022-09-15 Mendus B.V. Methods of vaccination and use of cd47 blockade
TW202302145A (zh) 2021-04-14 2023-01-16 美商基利科學股份有限公司 ＣＤ４７／ＳＩＲＰα結合及ＮＥＤＤ８活化酶Ｅ１調節次單元之共抑制以用於治療癌症
WO2022271650A1 (en) 2021-06-23 2022-12-29 Gilead Sciences, Inc. Diacylglyercol kinase modulating compounds
KR20240023628A (ko) 2021-06-23 2024-02-22 길리애드 사이언시즈, 인코포레이티드 디아실글리세롤 키나제 조절 화합물
KR20240025616A (ko) 2021-06-23 2024-02-27 길리애드 사이언시즈, 인코포레이티드 다이아실글리세롤 키나제 조절 화합물
CN117355531A (zh) 2021-06-23 2024-01-05 吉利德科学公司 二酰基甘油激酶调节化合物
WO2023277281A1 (ko) 2021-06-30 2023-01-05 (주)이노베이션바이오 Cd47에 특이적인 인간화 항체 및 이를 포함하는 cd47 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
TW202330504A (zh) 2021-10-28 2023-08-01 美商基利科學股份有限公司 嗒𠯤—３（２ｈ）—酮衍生物
CA3235986A1 (en) 2021-10-29 2023-05-04 Gilead Science, Inc. Cd73 compounds
US20230242508A1 (en) 2021-12-22 2023-08-03 Gilead Sciences, Inc. Ikaros zinc finger family degraders and uses thereof
US20240124412A1 (en) 2021-12-22 2024-04-18 Gilead Sciences, Inc. Ikaros zinc finger family degraders and uses thereof
IT202100033002A1 (it) * 2021-12-29 2023-06-29 Diatheva S R L Anticorpi umani e loro usi
TW202340168A (zh) 2022-01-28 2023-10-16 美商基利科學股份有限公司 Ｐａｒｐ７抑制劑
EP4245756A1 (en) 2022-03-17 2023-09-20 Gilead Sciences, Inc. Ikaros zinc finger family degraders and uses thereof
WO2023183817A1 (en) 2022-03-24 2023-09-28 Gilead Sciences, Inc. Combination therapy for treating trop-2 expressing cancers
WO2023179443A1 (en) * 2022-03-25 2023-09-28 Wuxi Biologics (Shanghai) Co., Ltd. Anti-her2/anti-cd47 molecules and uses thereof
WO2023191117A1 (ko) * 2022-03-28 2023-10-05 (주)이노베이션바이오 친화도가 성숙된 cd47에 특이적인 인간화 항체
WO2023186067A1 (en) * 2022-03-31 2023-10-05 I-Mab Biopharma Co., Ltd. Combination therapies comprising an anti-her2 antibody-drug conjugate for the treatment of cancer
TW202345901A (zh) 2022-04-05 2023-12-01 美商基利科學股份有限公司 用於治療結腸直腸癌之組合療法
TW202400138A (zh) 2022-04-21 2024-01-01 美商基利科學股份有限公司 Ｋｒａｓ ｇ１２ｄ調節化合物
WO2023246790A1 (zh) * 2022-06-21 2023-12-28 广东菲鹏制药股份有限公司 一种含抗cd47抗体或其抗原结合片段的制剂及其制备方法和应用
US20240116928A1 (en) 2022-07-01 2024-04-11 Gilead Sciences, Inc. Cd73 compounds
WO2024015741A1 (en) 2022-07-12 2024-01-18 Gilead Sciences, Inc. Hiv immunogenic polypeptides and vaccines and uses thereof
WO2024064668A1 (en) 2022-09-21 2024-03-28 Gilead Sciences, Inc. FOCAL IONIZING RADIATION AND CD47/SIRPα DISRUPTION ANTICANCER COMBINATION THERAPY

Family Cites Families (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4275149A (en) 1978-11-24 1981-06-23 Syva Company Macromolecular environment control in specific receptor assays
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
CA2226962A1 (en) 1998-02-16 1999-08-16 Marie Sarfati Use of binding agents to cd47 and its ligands in the treatment or the prophylaxis of various inflammatory, autoimmune and allergic diseases and in the treatment of graft rejection
GB9930706D0 (en) * 1999-12-24 2000-02-16 Medical Res Council Composition for inhibiting macrophage activity
US20040001828A1 (en) 2002-02-21 2004-01-01 Joseph Tuscano Treatment methods using anti-CD22 antibodies
US20050180972A1 (en) 2002-07-31 2005-08-18 Wahl Alan F. Anti-CD20 antibody-drug conjugates for the treatment of cancer and immune disorders
US8101719B2 (en) 2003-11-11 2012-01-24 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Humanized anti-CD47 antibody
US7601355B2 (en) 2005-06-01 2009-10-13 Northwestern University Compositions and methods for altering immune function
US20090191202A1 (en) 2005-09-29 2009-07-30 Jamieson Catriona Helen M Methods for manipulating phagocytosis mediated by CD47
US8377448B2 (en) * 2006-05-15 2013-02-19 The Board Of Trustees Of The Leland Standford Junior University CD47 related compositions and methods for treating immunological diseases and disorders
EP2139922A1 (en) 2007-03-28 2010-01-06 Biogen Idec, Inc. Treatment of hodgkins lymphoma
EP1985305A1 (en) 2007-04-24 2008-10-29 Vivalis Duck embryonic derived stem cell lines for the production of viral vaccines
JP4453724B2 (ja) 2007-06-29 2010-04-21 株式会社デンソー 車両用冷凍サイクル装置
JP4148367B1 (ja) 2007-08-02 2008-09-10 富山県 細胞のスクリーニング方法
CA2702217A1 (en) * 2007-10-11 2009-04-16 Jayne Danska Modulation of sirp.alpha. - cd47 interaction for increasing human hematopoietic stem cell engraftment and compounds therefor
CA3054220C (en) 2008-01-15 2022-10-11 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for manilpulating phagocytosis mediated by cd47
CA2711370C (en) 2008-01-15 2017-06-13 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Markers of acute myeloid leukemia stem cells
EP2111869A1 (en) 2008-04-23 2009-10-28 Stichting Sanquin Bloedvoorziening Compositions and methods to enhance the immune system
EP4134095A1 (en) 2009-09-15 2023-02-15 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Synergistic anti-cd47 therapy for hematologic cancers
KR101791430B1 (ko) 2009-11-30 2017-10-30 얀센 바이오테크 인코포레이티드 이펙터 기능이 제거된 항체 Ｆｃ 돌연변이체
HRP20221260T1 (hr) * 2010-05-14 2023-03-03 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Humanizirana i kimerna monoklonska protutijela za cd47
US20140242095A1 (en) 2011-10-19 2014-08-28 University Health Network Antibodies and antibody fragments targeting sirp-alpha and their use in treating hematologic cancers
EP2804617B9 (en) 2012-01-17 2021-04-07 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University High affinity sirp-alpha reagents
MX360772B (es) 2012-02-06 2018-11-15 Inhibrx Inc Anticuerpos cd47 y metodos de uso de los mismos.
US11059910B2 (en) * 2012-12-03 2021-07-13 Novimmune Sa Anti-CD47 antibodies and methods of use thereof
BR112015013431A2 (pt) 2012-12-12 2017-11-14 Vasculox Inc anticorpos monoclonais ou respectivos fragmentos ligantes de antígenos, composição farmacêutica, e usos de anticorpo monoclonal ou respectivo fragmento ligante de antígenos
AU2013362789B8 (en) 2012-12-17 2018-08-02 Pfizer Inc. Treatment of CD47+ disease cells with SIRP Alpha-Fc fusions
EP4137518A1 (en) * 2013-02-06 2023-02-22 Inhibrx, Inc. Non-platelet depleting and non-red blood cell depleting cd47 antibodies and methods of use thereof
CN103665165B (zh) 2013-08-28 2016-02-24 江苏匡亚生物医药科技有限公司 一种靶向人CD47-SIRPα信号通路的双特异性抗体及其制备方法和用途
AU2015229448B2 (en) 2014-03-11 2020-09-03 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Anti SIRP-alpha antibodies and Bi-specific Macrophage Enhancing antibodies
CN106535914B (zh) 2014-08-08 2021-08-27 Alx 肿瘤生物技术公司 SIRP-α变体构建体及其用途
CN104804093A (zh) * 2015-05-27 2015-07-29 江苏春申堂药业有限公司 一种针对cd47的单域抗体
RU2020143675A (ru) 2015-08-07 2021-05-26 ЭйЭлЭкс Онколоджи Инк. Конструкции, имеющие sirp-альфа домен или его вариант
EP3365370A1 (en) 2015-10-21 2018-08-29 OSE Immunotherapeutics Methods and compositions for modifying macrophage polarization into pro-inflammatory cells to treat cancer
AU2016365829B2 (en) 2015-12-11 2020-02-06 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Treatment of cancer with dual targeting of CD47 and EGFR
KR20220163516A (ko) 2016-01-11 2022-12-09 포티 세븐, 인코포레이티드 인간화된, 마우스 또는 키메라 항-cd47 단클론 항체
CA3011429A1 (en) 2016-01-21 2017-07-27 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Treatment of cancer with combinations of immunoregulatory agents
AU2017250029C1 (en) 2016-04-15 2022-03-24 Pfizer Inc. Macrophage stimulation in CD47 blockade therapy
WO2019023347A1 (en) 2017-07-26 2019-01-31 Forty Seven, Inc. ANTI-SIRP-ALPHA ANTIBODIES AND ASSOCIATED METHODS
CN117771364A (zh) 2017-10-18 2024-03-29 四十七公司 基于抗cd47剂的卵巢癌疗法
CN111315783A (zh) 2017-10-18 2020-06-19 四十七公司 用抗cd47和抗pd-l1治疗卵巢癌
CN111699005A (zh) 2018-02-12 2020-09-22 四十七公司 使用抗cd47抗体和抗cd20抗体的抗癌方案

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