WO2023191117A1 - 친화도가 성숙된 cd47에 특이적인 인간화 항체 - Google Patents

친화도가 성숙된 cd47에 특이적인 인간화 항체 Download PDF

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WO2023191117A1
WO2023191117A1 PCT/KR2022/004325 KR2022004325W WO2023191117A1 WO 2023191117 A1 WO2023191117 A1 WO 2023191117A1 KR 2022004325 W KR2022004325 W KR 2022004325W WO 2023191117 A1 WO2023191117 A1 WO 2023191117A1
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WO
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antibody
seq
chain variable
amino acid
variable region
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PCT/KR2022/004325
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English (en)
French (fr)
Inventor
김승구
김기태
Original Assignee
(주)이노베이션바이오
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants

Definitions

  • the present invention relates to a humanized antibody specific for affinity matured CD47, and more specifically, to a humanized antibody specific for affinity matured CD47, and to cells overexpressing CD47 comprising the affinity matured humanized antibody. It relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating diseases mediated by.
  • CD47 also called integrin-binding protein (IAP)
  • IAP integrin-binding protein
  • SIRP ⁇ signal regulatory protein ⁇
  • SIRP ⁇ signal regulatory protein ⁇
  • thrombospondin a transmembrane glycoprotein widely expressed on the cell surface and belongs to the immunoglobulin superfamily, including integrins, SIRP ⁇ (signal regulatory protein ⁇ ), SIRP ⁇ , and thrombospondin. It interacts with various ligands such as thrombospondin.
  • CD47 and CD47-SIRP ⁇ signaling systems have received the most attention as potential drug targets in tumor therapy.
  • Antibodies specific to CD47 are being developed for the treatment or diagnosis of tumor cells overexpressing CD47 or diseases related to CD47 overexpression, and are being developed in International Patent Publication No. WO2018-075857, International Publication Patent WO2017-121771, and International Publication No. WO2018-075857.
  • Patent WO2013-119714 discloses various anti-CD47 antibodies.
  • mice As mentioned above, for the production of antibodies for treatment, monoclonal antibodies are mainly produced using mice. However, non-human antibodies, such as mouse-derived monoclonal antibodies, are considered foreign antigens in the human body, so they trigger an immune response and have a short half-life, which limits their therapeutic effect.
  • a humanized antibody was developed in which all parts of the antibody except the CDR region that binds to the antigen were replaced with a human antibody.
  • the currently used method of replacing a mouse antibody with a humanized antibody is to select the most similar human antibody gene to the antibody to be replaced and replace only the CDR region of the mouse antibody with the CDR site of the human antibody using a method called CDR transplantation.
  • Such humanized antibodies have the advantage of reducing immune responses in the human body because most of the genes are humanized.
  • the affinity of the humanized antibody often decreases, so the FR (framework region) amino acid residues that interact importantly with the amino acid residues of the CDR are grafted onto the humanized antibody FR to change the variable of the humanized antibody. Parts can be manufactured.
  • the produced humanized antibody can be produced through an optimization process through antibody mutation to obtain the desired level of affinity and physical properties, thereby producing an affinity-matured humanized antibody.
  • an antibody (3A5) that binds to CD47 was selected, and a humanized anti-CD47 antibody (Hu3A5V10) was prepared using this antibody.
  • a humanized anti-CD47 antibody (Hu3A5V10) was prepared using this antibody.
  • three humanized anti-CD47 antibodies with mature affinity of the Hu3A5V10 antibody were prepared, and it was confirmed that these antibodies had increased binding ability and affinity to the antigen, completing the present invention.
  • the purpose of the present invention is to provide an affinity matured humanized antibody that specifically binds to CD47, a polynucleotide encoding the antibody, a vector expressing the antibody, and a recombinant cell transformed with the vector.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating diseases mediated by cells overexpressing CD47, comprising an affinity matured humanized antibody that specifically binds to CD47.
  • the present invention provides (1) a heavy chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 and a light chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16;
  • the antibody may be a monoclonal antibody, preferably a single-chain variable fragment (scFv) or full-length antibody.
  • scFv single-chain variable fragment
  • the antibody can prevent CD47 from interacting with signal-regulatory protein (SIRP ⁇ ) or promote macrophage-mediated phagocytosis of CD47-expressing cells.
  • SIRP ⁇ signal-regulatory protein
  • the present invention provides a polynucleotide encoding an affinity matured humanized antibody or fragment thereof that specifically binds to CD47.
  • the present invention provides a vector containing a polynucleotide encoding an affinity matured humanized antibody or fragment thereof that specifically binds to CD47.
  • the present invention provides recombinant cells that produce an affinity matured humanized antibody or fragment thereof that specifically binds to CD47 transformed with the above vector.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of diseases mediated by cells overexpressing CD47, comprising an affinity matured humanized antibody or fragment thereof that specifically binds to CD47.
  • the disease mediated by cells overexpressing CD47 may be cancer or tumor overexpressing CD47.
  • the cancer or tumor is hematological cancer, ovarian cancer, colon cancer, breast cancer, lung cancer, myeloma, neuroblast-induced CNS tumor, monocytic leukemia, B-cell induced leukemia, T- Cell induced leukemia, B-cell induced lymphoma, T-cell induced lymphoma, and mast cell induced tumor.
  • a humanized antibody (Hu3A5V10 antibody) was prepared using an antibody (3A5 antibody) that binds to CD47, and the humanized anti-CD47 antibody was confirmed to specifically bind to the CD47 antigen.
  • humanized anti-CD47 antibodies were prepared, in which the affinity of the humanized anti-CD47 antibody was matured, and it was confirmed that these antibodies had increased binding ability and affinity to the antigen, and therefore, it was confirmed that these antibodies were specific for CD47 of the present invention.
  • Affinity-matured humanized antibodies that bind to target antibodies can be effectively applied to the prevention or treatment of diseases or tumors in which the immune response is suppressed by overexpression of CD47.
  • Figure 1 shows data confirming the binding ability of the 3A5 (mouse) antibody selected in the present invention to CD47 overexpressing tumor cells (MCF-7) using a flow cytometer.
  • Figure 2 shows data confirming the binding ability of the humanized 3A5 antibody (Hu3A5V10 antibody) of the present invention to tumor cells overexpressing CD47 (MCF-7) using a flow cytometer.
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing a method (surface plasmon resonance (SPR)) for measuring the affinity of the affinity matured humanized 3A5 antibody of the present invention.
  • SPR surface plasmon resonance
  • FIG 4 is data showing the results of affinity analysis of the humanized 3A5 antibody (Hu3A5V10 antibody) of the present invention and the affinity matured humanized 3A5 antibody (AHF16309 antibody, AHF16310 antibody, AHF16312 antibody).
  • the present invention provides (1) a heavy chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 and a light chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16;
  • humanized antibody refers to an amino acid sequence that corresponds to an antibody produced by humans except for the CDR region, which is a key part of antigen binding, so that it is more similar to a human antibody. This means increased antibodies.
  • the most common method of humanizing an antibody is CDR-grafting, which involves grafting the CDR region of an animal antibody to a human antibody, but is not limited to this and includes methods known in the art. Humanized antibodies can be produced using this method.
  • the term “affinity matured humanized antibody” refers to an antibody that has a higher affinity for an antigen compared to the affinity of a reference antibody (antigen-binding molecule).
  • affinity of the humanized antibody is low, so amino acid residues in the FR (framework region) region that interacts importantly with amino acid residues of the CDR are added to the humanized antibody FR.
  • Humanized antibodies with mature affinity can be produced by transplanting them into .
  • binding affinity can be expressed as the equilibrium dissociation constant (KD). The lower the KD value, the higher the affinity of the antibody for the antigen, and the higher the KD value, the lower the affinity.
  • the antibody may be a monoclonal antibody.
  • the term "monoclonal antibody” is also called a monoclonal antibody or monoclonal antibody, and is an antibody produced by a single antibody-forming cell, and is characterized by a uniform primary structure (amino acid sequence). It recognizes only one antigenic determinant and is generally produced by culturing hybridoma cells, which are a fusion of cancer cells and antibody-producing cells.
  • CDR complementarity determining region
  • antibody in the present invention may be used not only in the complete form (full-length antibody) having two full-length light chains and two full-length heavy chains, but also in fragments of the antibody molecule.
  • a fragment of an antibody molecule refers to a fragment that possesses at least a peptide tag (epitope) binding function and includes scFv, Fab, F(ab'), F(ab') 2 , single domain, etc.
  • a full length antibody refers to an antibody composed of two heavy chains and two light chains.
  • the heavy chain consists of a heavy chain variable region (V H ) and a heavy chain constant region (C H1 , C H2 , C H3 ), and the light chain consists of a light chain. It consists of a variable region (V L ) and a light chain constant region (C L1 ).
  • the antibody of the present invention can preferably be produced as a single-chain variable fragment (scFv) or full-length antibody.
  • the monoclonal antibody that specifically binds to CD47 of the present invention can be prepared using the entire CD47 protein or a partial peptide as an immunogen (or antigen). More specifically, first, as an immunogen, CD47, a fusion protein containing the CD47 protein, or a carrier containing the CD47 protein is used as an immunogen, along with an adjuvant (e.g., Freund adjuvant) as needed. Immunization is achieved by injecting once or more subcutaneously, into the muscle, vein, foot, or intraperitoneal cavity of animals other than mammals.
  • an adjuvant e.g., Freund adjuvant
  • the non-human mammal is preferably a mouse, rat, hamster, mammal, chicken, rabbit, cat, dog, pig, goat, sheep, donkey, horse or cow (transgenic mouse producing human antibodies). (including transgenic animals engineered to produce antibodies derived from other animals, such as), and more preferably, mice, rats, hamsters, mammals, chickens, or rabbits.
  • transgenic mouse producing human antibodies including transgenic animals engineered to produce antibodies derived from other animals, such as
  • mice, rats, hamsters, mammals, chickens, or rabbits By performing 1 to 4 immunizations approximately every 1 to 21 days from the first immunization, antibody-producing cells can be obtained from the immunosensitized mammal approximately 1 to 10 days after the final immunization.
  • the number of immunizations and time intervals can be appropriately changed depending on the characteristics of the immunogen used.
  • hybridomas secreting monoclonal antibodies can be carried out according to the method of Keira and Mirstein et al. (Nature, 1975, Vol. 256, p. 495-497) or similar methods. Any one selected from the group consisting of spleen, lymph node, bone marrow, or tonsil collected from an animal other than a human immune-sensitized as described above, preferably from a mammal incapable of producing antibody-producing cells contained in the spleen and autoantibodies.
  • Hybridomas can be produced by cell fusion of myeloma cells.
  • the mammal may be a mouse, rat, mammal, hamster, chicken, rabbit or human, and preferably may be a mouse, rat, chicken or human.
  • a fusion promoter such as polyethylene glycol or Sendai virus or a method using electric pulses is used.
  • antibody-producing cells and mammalian-derived cells capable of infinite growth are added to a fusion medium containing a fusion promoter. is suspended at a ratio of about 1:1 to 1:10, and cultured in this state at about 30 to 40°C for about 1 to 5 minutes.
  • common media such as MEM medium, RPMI1640 medium, and Iscove's Modified Dulbecco's Medium can be used, and it is desirable to exclude sera such as bovine serum.
  • the method of screening hybridoma clones producing the monoclonal antibody is first, by transferring the fused cells obtained as described above to a selective medium such as HAT medium and culturing them at about 30 to 40°C for about 3 days to 3 weeks. Kills cells other than hybridomas. Subsequently, after culturing the hybridomas on a microtiter plate, etc., the portion with increased reactivity between the immunogen used in the immune response of animals other than humans described above and the culture supernatant was subjected to RIA (radioactive substance-marked immunohistochemistry). antibody) or ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). And the clone producing the monoclonal antibody found above shows specific binding ability to the immunogen.
  • the monoclonal antibody of the present invention can be obtained by culturing such hybridomas in vitro or in vivo.
  • conventional methods for cultivating cells derived from mammals are used, and for collecting monoclonal antibodies from cultures, etc., conventional methods in this field for purifying antibodies in general are used.
  • Each method includes, for example, salting out, dialysis, filtration, concentration, centrifugation, fractional precipitation, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, high-performance liquid chromatography, and gel electrophoresis. and isoelectric electrophoresis, etc., and these are applied in combination as needed.
  • the purified monoclonal antibody is then concentrated and dried to form a liquid or solid state depending on the intended use.
  • hybridomas producing anti-CD47 antibodies are prepared and screened to produce an antibody (scFv) that specifically binds to CD47. It was selected and named 3A5.
  • the 3A5 antibody is a heavy chain variable comprising a CDR1 region represented by the amino acid of SEQ ID NO: 1 (GYTFTSYW), a CDR2 region represented by the amino acid of SEQ ID NO: 2 (IDPSDSYT), and a CDR3 region represented by the amino acid of SEQ ID NO: 3 (ARGGKRAMDY)
  • a light chain variable region comprising the CDR1 region (QSLVHSNGNTY) represented by the amino acid of SEQ ID NO: 4, the CDR2 region (KVS) represented by the amino acid of SEQ ID NO: 5, and the CDR3 region (SQSTHVPFT) represented by the amino acid of SEQ ID NO: 6. It was confirmed that it was composed.
  • the 3A5 antibody is composed of a heavy chain variable region represented by the amino acid of SEQ ID NO: 7 and a light chain variable region represented by the amino acid of SEQ ID NO: 8, wherein the heavy chain variable region has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9, and the light chain variable region is It was confirmed that it was encoded by the base sequence of SEQ ID NO: 10.
  • the Hu3A5V10 antibody a humanized antibody
  • the heavy chain variable region CDR and light chain variable region CDR of the Hu3A5V10 antibody were identical to those of the 3A5 antibody, and the remaining portions except the CDR portion were humanized.
  • the Hu3A5V10 antibody consists of a heavy chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 and a light chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, wherein the heavy chain variable region has the base sequence of SEQ ID NO: 13, and the light chain variable region Can be encoded with the base sequence of SEQ ID NO: 14.
  • three affinity-matured humanized antibodies (AHF16309 antibody, AHF16310 antibody, and AHF16312 antibody) were prepared using the Hu3A5V10 antibody.
  • the AHF16309 antibody consists of a heavy chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 and a light chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, wherein the heavy chain variable region has the base sequence of SEQ ID NO: 17, and the light chain variable region Can be encoded with the base sequence of SEQ ID NO: 18.
  • the AHF16310 antibody consists of a heavy chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 and a light chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20, the heavy chain variable region having the base sequence of SEQ ID NO: 21, and the light chain variable region having the sequence It can be coded with the base sequence number 22.
  • the AHF16312 antibody consists of a heavy chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23 and a light chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24, the heavy chain variable region having the base sequence of SEQ ID NO: 25, and the light chain variable region having the sequence It can be coded with the base sequence number 26.
  • the scFv can be produced through genetic recombination technology so that the heavy chain variable region and the light chain variable region can be connected with a linker.
  • the linker may preferably be represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27, and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27 may be encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 28, but is not limited thereto.
  • the 3A5 antibody When linked by light chain variable region-linker-heavy chain variable region, the 3A5 antibody can be represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29 or the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 30, and the Hu3A5V10 antibody can be represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 31 or the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 32.
  • the AHF16309 antibody which is a humanized antibody with mature affinity, has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33 or the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 34
  • the AHF16310 antibody has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35 or the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 36
  • the AHF16312 antibody has SEQ ID NO: 37. It can be expressed as the amino acid sequence or the base sequence of SEQ ID NO: 38.
  • the heavy chain variable region C-terminal portion of each antibody contains a heavy chain constant region (C H1 , C H2 ) represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 39. , C H3 ) may be added, and a light chain constant region (C L1 ) represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40 may be added to the C-terminal portion of the light chain variable region of each antibody.
  • the heavy chain constant region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 39 may be encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 41 or 42
  • the light chain constant region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40 may be encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 43. It can be coded as
  • the full-length Hu3A5V10 antibody consists of a heavy chain represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44 and a light chain represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 45, wherein the heavy chain region has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 46 and the light chain region has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 47. It can be coded as a base sequence.
  • the AHF16309 full-length antibody consists of a heavy chain represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 48 and a light chain represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 49, the heavy chain region having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 50, and the light chain region having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 51. It can be coded as
  • the AHF16310 full-length antibody consists of a heavy chain represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 52 and a light chain represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 53, the heavy chain region having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 54, and the light chain region having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 55. It can be coded as
  • the AHF16312 full-length antibody consists of a heavy chain represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 56 and a light chain represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 57, the heavy chain region having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 58, and the light chain region having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 59. It can be coded as
  • the affinity of the CD47-specific humanized antibody (Hu3A5V10 antibody) and the three affinity matured humanized antibodies (AHF16309 antibody, AHF16310 antibody, and AHF16312 antibody) prepared in the present invention was measured.
  • Each antibody was prepared as a full-length antibody, and then the affinity of each antibody was measured by the method shown in Figure 3.
  • the affinity of the three affinity matured humanized antibodies of the present invention was determined. It was confirmed that the degree was higher than that of the Hu3A5V10 antibody.
  • the antibody can prevent CD47 from interacting with signal-regulatory protein (SIRP ⁇ ) or promote macrophage-mediated phagocytosis of CD47-expressing cells.
  • SIRP ⁇ signal-regulatory protein
  • the affinity-matured humanized antibody of the present invention Since the affinity-matured humanized antibody of the present invention has increased affinity to the antigen, it can more effectively recognize CD47 overexpressed in tumor cells. Therefore, the affinity-matured humanized antibody of the present invention can not only inhibit immune evasion of cancer or tumor cells by blocking CD47-SIRP ⁇ binding, but also effectively promote phagocytosis of cancer cells overexpressing CD47 by macrophages. Therefore, it can be used as an antibody treatment for the prevention or treatment of cancer or tumors that overexpress CD47.
  • the present invention relates to a polynucleotide encoding an affinity matured humanized antibody or fragment thereof that specifically binds to CD47.
  • polynucleotide generally refers to nucleic acid molecules, deoxyribonucleotides or ribonucleotides, or analogs thereof, separated of any length.
  • the polynucleotides of the invention may undergo (1) in-vitro amplification, such as polymerase chain reaction (PCR) amplification; (2) cloning and recombination; (3) purification such as digestion and gel electrophoresis; (4) It can be manufactured through synthesis such as chemical synthesis, and preferably the isolated polynucleotide is manufactured by recombinant DNA technology.
  • PCR polymerase chain reaction
  • nucleic acids for encoding antibodies or antigen-binding fragments thereof can be prepared by various methods known in the art, including but not limited to restriction fragment operation of synthetic oligonucleotides or application of SOE PCR. can be manufactured.
  • the present invention relates to a vector containing a polynucleotide encoding an affinity matured humanized antibody or fragment thereof that specifically binds to CD47, and a recombinant cell transformed with the vector.
  • the term “expression vector” is a gene product containing essential regulatory elements such as a promoter to enable expression of a target gene in an appropriate host cell.
  • the vector may be selected from one or more of plasmids, retroviral vectors, and lentiviral vectors. Once transformed into a suitable host, the vector can replicate and function independently of the host genome, or in some cases can be integrated into the genome itself.
  • vectors may contain expression control elements that allow the coding region to be expressed correctly in a suitable host.
  • These regulatory elements are well known to those skilled in the art and include, for example, promoters, ribosome-binding sites, enhancers and other regulatory elements for regulating gene transcription or mRNA translation. can do.
  • the specific structure of the expression control sequence may vary depending on the function of the species or cell type, but generally it is a 5' non-specific sequence that participates in transcription initiation and translation initiation, respectively, such as the TATA box, capped sequence, CAAT sequence, etc. -contains a transcribed sequence and a 5' or 3' non-translated sequence.
  • the 5' non-transcriptional expression control sequence may include a promoter region, which may include a promoter sequence for transcribing and regulating a functionally linked nucleic acid.
  • promoter refers to the minimal sequence sufficient to direct transcription. Additionally, promoter constructs sufficient to cause regulatable promoter-dependent expression of the gene induced by cell type-specific or external signals or agents may be included, and these constructs may be located in the 5' or 3' portion of the gene. . Both conservative and inducible promoters are included. Promoter sequences may be from prokaryotes, eukaryotes, or viruses.
  • the term "transformant” refers to a cell transformed by introducing a vector containing a polynucleotide encoding one or more target proteins into a host cell, and the expression vector is introduced into the host cell to produce a transformant.
  • Methods for this include the calcium phosphate method or the calcium chloride/rubidium chloride method described in the literature (Sambrook, J., et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd edition), Cold Spring Harbor Laboratory, 1. 74, 1989). , electroporation, electroinjection, chemical treatment methods such as PEG, and methods using gene guns.
  • antibody proteins By culturing the transformant expressing the vector in a nutrient medium, antibody proteins can be produced and isolated in large quantities.
  • the medium and culture conditions can be appropriately selected and used depending on the host cell tolerance. During culture, conditions such as temperature, pH of the medium, and culture time must be appropriately adjusted to suit cell growth and mass production of proteins.
  • the vector according to the present invention can be transformed into host cells, preferably mammalian cells, for the production of antibodies.
  • Suitable host cells capable of expressing fully glycosylated proteins include COS-1 (e.g., ATCC CRL 1650), COS-7 (e.g., ATCC CRL-1651), HEK293, BHK21 (e.g., ATCC CRL-10), CHO (e.g. ATCC CRL 1610) and BSC-1 (e.g.
  • ATCC CRL-26 ATCC CRL-26 cell lines, Cos-7 cells, CHO cells, hep G2 cells, P3X63Ag8.653, SP2/0 -Agl4, 293 cells, HeLa cells, etc., and these cells are readily available, for example, from ATCC (American Type Culture Collection, USA).
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating diseases mediated by CD47 overexpression, comprising an affinity matured humanized antibody or fragment thereof that specifically binds to CD47.
  • the disease mediated by CD47 overexpression may be a cancer or tumor overexpressing CD47.
  • the cancer or tumor overexpressing CD47 is blood cancer, ovarian cancer, colon cancer, breast cancer, lung cancer, myeloma, selected from the group consisting of neuroblast-derived CNS tumor, monocytic leukemia, B-cell derived leukemia, T-cell derived leukemia, B-cell derived lymphoma, T-cell derived lymphoma, and mast cell derived tumor. It can be.
  • the composition may further include a therapeutic agent for diseases mediated by cells overexpressing CD47, and the therapeutic agent is covalently bound to the heavy chain and/or light chain of an antibody that specifically binds to CD47. or can be administered in combination with a humanized antibody specific for CD47 of the present invention.
  • the therapeutic agents include small molecule drugs, peptide drugs, toxins (eg, cytotoxins), and the like. Additionally, the therapeutic agent may be an anticancer agent.
  • Anticancer agents include non-peptide (i.e., non-proteinaceous) compounds that reduce the proliferation of cancer cells and encompass cytotoxic agents and cytostatic agents. Non-limiting examples of anticancer agents include alkylating agents, nitrosoureas, antimetabolites, antitumor antibiotics, plant (vinca) alkaloids, and steroid hormones. Peptidic compounds may also be used.
  • the pharmaceutical composition preferably contains a therapeutically effective amount of the antibody of the present invention.
  • therapeutically effective amount means the amount of therapeutic agent necessary to treat, improve, or prevent a target disease or condition, or the amount of therapeutic agent necessary to produce a detectable therapeutic or preventive effect. It means.
  • the therapeutically effective dose can be initially determined by cell culture assays or animal models, usually rodents, rabbits, dogs, pigs, or primates. Animal models can also be used to determine appropriate concentration ranges and routes of administration. This information can be used to determine useful dosages and routes for human dosing.
  • the precise effective dose for human patients will vary depending on the severity of the disease condition, the patient's general health, the patient's age, weight and gender, diet, time of administration, frequency of administration, drug composition, sensitivity, and tolerance/response to treatment. You can. The amount can be determined by routine experimentation and is within the judgment of the clinician. Generally, the effective dosage is 0.01 to 50 mg/kg, preferably 0.1 to 20 mg/kg, and more preferably about 15 mg/kg.
  • composition may be administered to the patient individually or in combination with other agents, drugs, or hormones.
  • dosage at which an antibody of the invention is administered will depend on the nature of the condition being treated, the grade of malignant lymphoma or leukemia, and whether the antibody is used prophylactically or to treat an existing condition.
  • the frequency of administration varies depending on the half-life of the antibody molecule and the persistence of the drug effect. If the antibody molecule has a short half-life (e.g., 2 to 10 hours), it may be necessary to give one or more doses per day. Alternatively, if the antibody molecule has a long half-life (e.g., 2 to 15 days), it may be necessary to give doses once a day, once a week, or once every month or two.
  • the pharmaceutical composition may contain a pharmaceutically acceptable carrier for administration of the antibody.
  • the carrier itself must not induce the production of antibodies harmful to the subject receiving the composition and must be non-toxic.
  • Suitable carriers may be slowly metabolizing macromolecules, such as proteins, polypeptides, liposomes, polysaccharides, polylactic acid, polyglycolic acid, amino acid polymers, amino acid copolymers, and inactive viral particles.
  • Pharmaceutically acceptable salts include, for example, mineral salts such as hydrochloride, hydrobromide, phosphate and sulfate, or acetic acid and propionic acid. Salts of organic acids such as malonic acid and benzoic acid can be used.
  • Pharmaceutically acceptable carriers in therapeutic compositions may additionally include liquids such as water, saline, glycerol, and ethanol. Additionally, auxiliary substances such as wetting agents, emulsifying agents or pH buffering substances may be present in such compositions.
  • the carrier may be formulated as tablets, pills, dragees, capsules, liquids, gels, syrups, slurries and suspensions for ingestion of the pharmaceutical composition by a patient.
  • Preferred forms for administration include forms suitable for parenteral administration, for example by injection or infusion.
  • the product When the product is intended for infusion or injection, it may take the form of a suspension, solution or emulsion in an oil or water-soluble excipient, which may contain preservatives such as suspending agents, preservatives, stabilizers and/or dispersing agents.
  • the antibody molecule may be in anhydrous form and reconstituted in an appropriate sterilizing solution prior to use.
  • compositions of the invention can be administered directly to a patient.
  • Patients to be treated may be animals. However, it is desirable to tailor the composition for administration to human patients.
  • compositions of the present invention can be administered, without limitation, oral, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intrathecal, intraventricular, transdermal, transcutaneous, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, enteral, topical. , can be administered by routes including sublingual, intravaginal, or rectal routes.
  • therapeutic compositions may be prepared as injectable substances, either as liquid solutions or suspensions. Additionally, solid forms suitable for liquid excipient solutions or suspensions can be prepared prior to injection.
  • Direct delivery of the composition may generally be by injection, subcutaneous injection, intraperitoneal injection, intravenous injection, intramuscular injection, or may be delivered into the interstitial space of the tissue. Additionally, the composition can be administered to the wound site. Dosage treatment may be a single dose schedule or a multiple dose schedule.
  • the present invention relates to a composition for diagnosing or monitoring diseases mediated by cells expressing CD47, comprising an affinity matured antibody or fragment thereof that specifically binds to CD47.
  • the affinity matured antibody or fragment thereof that specifically binds to CD47 may be labeled directly or indirectly.
  • Indirect labels include secondary antibodies containing a detectable label, where the secondary antibody binds to an antibody that specifically binds to CD47.
  • Other indirect labels include biotin, where antibodies that specifically bind to biotinylated CD47 can be detected using avidin or streptavidin containing a detectable label.
  • Suitable detectable labels include any composition detectable by spectroscopic, photochemical, biochemical, immunochemical, electrical, optical or chemical means. Suitable labels include, but are not limited to, magnetic beads, fluorescent dyes (e.g., fluorescein isothiocyanate, Texas Red, rhodamine, green fluorescent protein, red fluorescent protein, yellow fluorescent protein, etc.), radioactive labels (e.g. For example, 3 H, 125 I, 35 S, 14 C or 32 P), enzymes (e.g.
  • horseradish peroxidase alkaline phosphatase, luciferase and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)) those commonly used
  • colorimetric labels such as colloidal gold or colored glass or plastic (e.g., polystyrene, polypropylene, latex, etc.) beads.
  • the antibody may be labeled with a fluorescent protein and may contain a contrast agent or radioisotope.
  • the affinity-matured humanized antibody or fragment thereof that specifically binds to CD47 of the present invention is used in a diagnostic kit
  • the antibody is immobilized on a support
  • the support is a microplate, microarray, chip, glass, bead, or It may be a particle or a membrane.
  • hybridomas producing antibodies that bind to CD47 were prepared and antibodies were selected.
  • spleen cells were removed by immunization with CD47 protein (Acrobiosystems, cat# CD7-HA2E9), and hybridoma cells were created through cell fusion with mouse myeloma cells.
  • HAT medium Hypoxanthine Guanidine-Phosphoribosyl-Transferase
  • HGPRT Hypoxanthine Guanidine-Phosphoribosyl-Transferase
  • hybridomas that produce antibodies that bind to CD47.
  • the number of cells per 96 well was reduced to less than 1, and then it was confirmed by ELISA whether the antibody obtained from the clone propagated from one cell binds to CD47, and the clones that bind to CD47 were selected.
  • the above process was repeated three times to select hybridomas producing antibodies that bind to CD47. In this way, an antibody binding to CD47 was obtained.
  • the antibody was named 3A5, and its base and amino acid sequences were analyzed. Sequence information for the heavy chain variable region and light chain variable region of each antibody according to the results of sequence analysis is shown in Table 1 below, and the underlined portion in Table 1 refers to the complementarity determining region (CDR).
  • CDR complementarity determining region
  • Example 2 Confirmation of specificity of selected antibodies for CD47 - ELISA and flow cytometer
  • CD47 protein (Acrobiosystems, cat#CD7-HA2E9) was dispensed at 100 ng/well into a 96-well plate and then reacted at 4°C overnight. Next, it was treated with 1
  • the breast cancer cell line overexpressing CD47, MCF- 7 (1 .
  • a CD47 antibody Biolegend PE anti-human CD47, cat# 323108, 5 ⁇ l
  • a PE-conjugated anti-mouse IgG antibody PE-conjugated goat anti-mouse IgG
  • Biolegend Inc. cat# 405307, USA, 5 ⁇ l
  • a humanized antibody was prepared by modifying the 3A5 antibody selected in Example 1 to have a structure corresponding to that of a human.
  • the mouse 3A5 antibody was created by CDR-grafting, which replaces the CDR of the human antibody with the CDR of the mouse antibody that binds to CD47 using the germline sequence of the human antibody as a frame.
  • a humanized antibody was prepared. This was named Hu3A5V10 antibody, and its amino acid sequence was analyzed.
  • Example 4 Confirmation of specificity of humanized 3A5 antibody for CD47 - ELISA and flow cytometer
  • an affinity matured humanized antibody was prepared.
  • Affinity-matured humanized antibodies were produced by GenScript. DNA sequences encoding the heavy and light chains of the antibody were synthesized, cloned into a FESEB vector (Gencript), and transformed into bacteria (TG1 competent E. coli). After doing so, a system (Fab FASEBA sample) was constructed to produce Fab by induction with IPTG. In addition, a PML (precise mutagenesis library) library was created and affinity matured antibodies were finally selected.
  • DNA oligonucleotide library synthesis was performed on a programmable microarray, and library quality was ensured with a minimum coverage of 90% through NGS.
  • 48 clones were randomly selected from each PML library, and then the 48 PML library clones were inoculated and expression was induced in a 96-deep well plate. Next, the expression of antibodies secreted in the medium and their binding affinity to human CD47 protein were evaluated using ELISA.
  • affinity-matured humanized antibodies were selected, named AHF16309 antibody, AHF16310 antibody, and AHF16312 antibody, respectively, and their amino acid sequences were analyzed.
  • Sequence information of AHF16309 antibody AHF16309 Sequence information sequence number Heavy chain variable region amino acid sequence EVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKAS GYTFTSYW MHWMRQAPGQGLEWIGV IDPNDSYT SYNQGFTGRFVLSVDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYC ARGGKRMMDY WGQGTTVTVSS SEQ ID NO: 15 Light chain variable region amino acid sequence DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSS QSLVHSNGNTY LNWFQQRPGQSPRLLIY KVS NRFPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC SQSTHVPFT FGGGTKLEIK SEQ ID NO: 16 Heavy chain variable region base sequence GAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCAGCGAGCTGAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTTAAGGTGTCTTGTAAAGCTTCTGGCTACACCTTCACATCTTATTGGATGCACTGGATGAGACAGGCC
  • Sequence information of AHF16310 antibody AHF16310 Sequence information sequence number Heavy chain variable region amino acid sequence EVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKAS GYTFTSYW MHWMRQAPGQGLEWIGV IDPNDSYT SYNQGFTGRFVLSVDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYC ARGGKRMMDY WGQGTTVTVSS SEQ ID NO: 19 Light chain variable region amino acid sequence DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSS QSLVHSNGNTY LHWFQQRPGQSPRLLIY KVS NRFTGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC SQSTHVPFT FGGGTKLEIK SEQ ID NO: 20 Heavy chain variable region base sequence GAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCAGCGAGCTGAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTTAAGGTGTCTTGTAAAGCTTCTGGCTACACCTTCACATCTTATTGGATGCACTGGATGAGACAGGCCCCT
  • Sequence information of AHF16312 antibody AHF16312 Sequence information sequence number Heavy chain variable region amino acid sequence EVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKAS GYTFTSYW MHWMRQAPGQGLEWIGV IDPNDSYT SYNQGFTGRFVLSVDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYC ARGGKRIMDY WGQGTTVTVSS SEQ ID NO: 23 Light chain variable region amino acid sequence DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSS QSLVHSNGNTY LNWFQQRPGQSPRLLIY KVS NRFTGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC SQSTHVPFT FGGGTKLEIK SEQ ID NO: 24 Heavy chain base sequence GAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCAGCGAGCTGAAGAAGCCTGGAGCTTCTGTGAAGGTGTCTTGTAAAGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGATGAGACAGGCCCCTG
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 39 The heavy chain constant region and the light chain constant region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40 were added to the amino acid sequence of each antibody and linked to IgG4 Fc to prepare a full-length antibody. Next, the affinity was measured using the prepared full-length antibody using surface plasmon resonance (SPR) method ( Figure 3).
  • SPR surface plasmon resonance
  • the binding affinity of the antibody to human CD47 was measured using Biacore 8K, and the measurement conditions are shown in Table 10 below.
  • the dissociation constant (KD) of the three affinity matured humanized antibodies of the present invention was found to be lower than that of the Hu3A5V10 antibody. That is, it was confirmed that the binding force and affinity for the antigen (CD47) of the affinity-matured humanized antibody of the present invention increased compared to the Hu3A5V10 antibody.
  • the affinity-matured humanized antibody that specifically binds to CD47 of the present invention was confirmed to have increased binding force and affinity to the antigen, it can be effectively applied to the prevention or treatment of diseases or tumors in which the immune response is suppressed by overexpression of CD47. can do.

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Abstract

본 발명은 친화도가 성숙된 CD47에 특이적인 인간화 항체에 관한 것으로, 보다 상세하게는 친화도가 성숙된 CD47에 특이적인 인간화 항체, 상기 친화도가 성숙된 인간화 항체를 포함하는 CD47을 과발현하는 세포에 의해 매개되는 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에서는 CD47에 결합하는 항체(3A5 항체)를 이용하여 인간화된 항체(Hu3A5V10 항체)를 제조하였으며, 상기 인간화된 항-CD47 항체는 CD47 항원과 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다. 또한, 상기 인간화된 항-CD47 항체의 친화도가 성숙된 3종의 인간화된 항-CD47 항체를 제조하였으며, 이들 항체가 항원과의 결합력 및 친화도가 증가한 것을 확인하였으므로, 본 발명의 CD47에 특이적으로 결합하는 친화도 성숙된 인간화 항체는 CD47의 과발현에 의한 면역 반응이 억제되는 질환 또는 종양의 예방 또는 치료에 효과적으로 적용할 수 있다.

Description

친화도가 성숙된 CD47에 특이적인 인간화 항체
본 발명은 친화도가 성숙된 CD47에 특이적인 인간화 항체에 관한 것으로, 보다 상세하게는 친화도가 성숙된 CD47에 특이적인 인간화 항체, 상기 친화도가 성숙된 인간화 항체를 포함하는 CD47을 과발현하는 세포에 의해 매개되는 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
CD47은 인테그린 결합 단백질(IAP)이라고도 하며, 세포 표면에서 광범위하게 발현되는 막관통 당단백질로서, 면역글로불린 상과(immunoglobulin superfamily)에 속하며, 인테그린, SIRPα(신호조절 단백질α), SIRPγ와 트롬보스폰딘(thrombospondin)과 같은 다양한 리간드와 상호 작용을 한다.
종양세포는 CD47의 과발현에 의한 면역 감시를 효과적으로 회피할 수 있으므로, CD47 및 CD47-SIRPα 신호 시스템은 종양 치료에서의 잠재적인 약물 표적으로서 가장 주목을 받고 있다. 이러한 CD47을 과발현하는 종양세포 또는 CD47 과발현과 관련된 질환 등의 치료 또는 진단을 위해 CD47에 특이적인 항체의 개발이 이루어지고 있으며, 국제공개특허 WO2018-075857호, 국제공개특허 WO2017-121771호 및 국제공개특허 WO2013-119714호에는 다양한 항-CD47 항체에 대해 개시되어 있다.
상기와 같이 치료를 위한 항체의 생산을 위해 주로 마우스를 이용하여 단일클론 항체(monoclonal antibody)를 생산하고 있다. 하지만 마우스 유래 단일클론 항체와 같은 비인간 항체들은 인체 내에서 외래 항원으로 간주되기 때문에 면역반응을 유발하고 반감기가 짧기 때문에 치료효과가 제한적인 문제점이 있다.
상기 문제를 해결하기 위해 항체의 항원과 결합하는 CDR 부위만을 제외한 나머지 부분을 인간 항체로 치환한 인간화 항체가 개발되었다. 현재 사용되고 있는 마우스 항체의 인간화 항체로의 치환방법으로는 치환할 항체에 대한 가장 유사한 인간 항체 유전자를 선정하고, CDR 이식이라 불리는 방법으로 마우스 항체의 CDR 부위만을 인간 항체 CDR 위치로 치환하는 것이다. 이와 같은 인간화 항체는 유전자의 대부분을 인간화 하였으므로 인체 내에서의 면역반응을 줄일 수 있는 장점이 있다.
그러나 단순히 CDR 부위만을 이식할 경우 인간화 항체의 친화도가 떨어지는 경우가 많으므로, CDR의 아미노산 잔기들과 중요하게 상호작용하는 FR(framework region) 아미노산 잔기들을 함께 인간화 항체 FR에 이식시켜 인간화 항체의 가변부위를 제작할 수 있다. 제작된 인간화 항체는 원하는 수준의 친화도와 물성을 얻기 위해 항체의 변이를 통한 최적화 과정을 거쳐 친화도 성숙된 인간화된 항체를 제조할 수 있다.
이에, 본 발명에서는 인체 내에서 면역반응을 줄이기 위해 CD47에 결합하는 항체(3A5)를 선별하고, 이를 이용하여 인간화된 항-CD47 항체(Hu3A5V10)를 제조하였다. 또한, Hu3A5V10 항체의 친화도가 성숙된 3종의 인간화된 항-CD47 항체를 제조하였으며, 이들 항체가 항원과의 결합력 및 친화도가 증가한 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 CD47에 특이적으로 결합하는 친화도 성숙된 인간화 항체, 상기 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 항체를 발현하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 재조합 세포를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 CD47에 특이적으로 결합하는 친화도 성숙된 인간화 항체를 포함하는 CD47을 과발현하는 세포에 의해 매개되는 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 데 있다.
상술한 목적을 달성하기 위해,
본 발명은 (1) 서열번호 15의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 16의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위;
(2) 서열번호 19의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 20의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위; 또는
(3) 서열번호 23의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 24의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위로 구성된, CD47에 특이적으로 결합하는 친화도 성숙된 인간화 항체 또는 이의 단편을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 항체는 단클론 항체, 바람직하게는 scFv(Single-chain variable fragment) 또는 전장항체(full length antibody)일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 있어서, 상기 항체는 CD47이 신호-조절-단백질(SIRPα)과 상호 작용하는 것을 방지하거나, CD47-발현 세포에 대한 대식세포 매개 식균 작용을 촉진할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 CD47에 특이적으로 결합하는 친화도 성숙된 인간화 항체 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 CD47에 특이적으로 결합하는 친화도 성숙된 인간화 항체 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 벡터로 형질전환된 CD47에 특이적으로 결합하는 친화도 성숙된 인간화 항체 또는 이의 단편을 생산하는 재조합 세포를 제공한다.
다른 목적을 달성하기 위해,
본 발명은 상기 CD47에 특이적으로 결합하는 친화도 성숙된 인간화 항체 또는 이의 단편을 포함하는 CD47을 과발현하는 세포에 의해 매개되는 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 다른 실시예에 있어서, 상기 CD47을 과발현하는 세포에 의해 매개되는 질환은 CD47을 과발현하는 암 또는 종양일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 실시예에 있어서, 상기 암 또는 종양은 혈액암, 난소암, 결장암, 유방암, 폐암, 골수종, 신경모세포-유도된 CNS 종양, 단핵구 백혈병, B-세포 유도된 백혈병, T-세포 유도된 백혈병, B-세포 유도된 림프종, T-세포 유도된 림프종, 및 비만 세포 유도된 종양으로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
본 발명에서는 CD47에 결합하는 항체(3A5 항체)를 이용하여 인간화된 항체(Hu3A5V10 항체)를 제조하였으며, 상기 인간화된 항-CD47 항체는 CD47 항원과 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다.
또한, 상기 인간화된 항-CD47 항체의 친화도가 성숙된 3종의 인간화된 항-CD47 항체를 제조하였으며, 이들 항체가 항원과의 결합력 및 친화도가 증가한 것을 확인하였으므로, 본 발명의 CD47에 특이적으로 결합하는 친화도 성숙된 인간화 항체는 CD47의 과발현에 의한 면역 반응이 억제되는 질환 또는 종양의 예방 또는 치료에 효과적으로 적용할 수 있다.
도 1은 본 발명에서 선별한 3A5(mouse) 항체의 CD47 과발현 종양세포(MCF-7)에 대한 결합력을 유세포분석기(flow cytometer)로 확인한 데이터이다.
도 2는 본 발명의 인간화된 3A5 항체(Hu3A5V10 항체)의 CD47 과발현 종양세포(MCF-7)에 대한 결합력을 유세포분석기(flow cytometer)로 확인한 데이터이다.
도 3은 본 발명의 친화도 성숙된 인간화 3A5 항체의 친화도를 측정하는 방법(SPR, surface plasmon resonance)을 나타낸 모식도이다.
도 4는 본 발명의 인간화된 3A5 항체(Hu3A5V10 항체)와 친화도 성숙된 인간화 3A5 항체(AHF16309 항체, AHF16310 항체, AHF16312 항체)의 친화도 분석결과를 나타낸 데이터이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
CD47에 특이적으로 결합하는 친화도 성숙된 인간화된 항체
본 발명은 일관점에서, (1) 서열번호 15의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 16의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위;
(2) 서열번호 19의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 20의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위; 또는
(3) 서열번호 23의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 24의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위로 구성된 CD47에 특이적으로 결합하는 친화도 성숙된 인간화 항체 또는 이의 단편에 관한 것이다.
본 발명에서, 용어 "인간화 항체" 또는 "인간화된 항체"는 항원 결합에 핵심적인 부분인 CDR 부위를 제외한 나머지 부분을 인간에 의해 생산된 항체와 상응하는 아미노산 서열이 되도록 하여 보다 인간 항체와의 유사성이 증가된 항체를 의미한다. 항체(non-human antibody)를 인간화하는 가장 일반적인 방법으로는 동물항체의 CDR 부위를 인간 항체에 이식하는 CDR-그라프팅(CDR-grafting) 방법이 있으며, 이에 한정되지 않고 당업계에 공지된 방법을 이용하여 인간화 항체를 제조할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "친화도 성숙된(affinity matured) 인간화 항체"는 기준 항체(항원 결합 분자)의 친화도에 비해 더 높은 항원에 대한 친화도를 가지는 항체를 의미한다. 일반적으로, CDR-그라프팅 방법을 이용하여 인간화 항체를 제조한 경우, 인간화 항체의 친화도가 떨어지므로 CDR의 아미노산 잔기들과 중요하게 상호작용하는 FR(framework region) 영역의 아미노산 잔기를 인간화 항체 FR에 이식시켜 친화도가 성숙된 인간화 항체를 제조할 수 있다.
친화도는 항원과의 결합 친화도로 확인할 수 있으며, "결합 친화도"는 평형 해리 상수(KD, dissociation constant)로 표현될 수 있다. KD 값이 낮을수록 항체의 항원에 대한 친화도가 높으며, KD 값이 높을수록 친화도가 낮아지게 된다.
본 발명에서, 상기 항체는 단클론 항체(monoclonal antibody)일 수 있다. 본 발명에서, 용어 "단클론 항체(monoclonal antibody)"는 모노클로날 항체 또는 단일클론항체라고도 불리며, 단일 항체 형성세포가 생성하는 항체로, 1차 구조(아미노산 배열)가 균일한 특징이 있다. 오직 하나의 항원 결정기만을 인식하며, 일반적으로 암세포와 항체생산세포를 융합한 하이브리도마(hybridoma cell)을 배양하여 생산된다.
본 발명에서, 용어 "CDR", 즉 "상보성 결정 영역"은 중쇄 및 경쇄 부위 모두의 가변 영역 내에서 발견되는 비근접(non-contiguous) 항원 결합 부위를 의미하는 것이다.
본 발명의 용어 "항체"는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태(전장항체)뿐만 아니라 항체 분자의 단편도 사용될 수 있다. 항체 분자의 단편이란 적어도 펩타이드 태그(에피토프) 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 scFv, Fab, F(ab'), F(ab')2, 단일 도메인(single domain) 등을 포함한다. 전장항체(full length antibody)는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄로 이루어지는 항체를 의미하며, 중쇄는 중쇄 가변부위(VH) 및 중쇄 불변부위(CH1, CH2, CH3)로, 경쇄는 경쇄 가변부위(VL) 및 경쇄 불변부위(CL1)로 구성된다. 본 발명의 항체는 바람직하게, scFv(Single-chain variable fragment) 또는 전장항체(full length antibody) 제조될 수 있다.
본 발명의 CD47에 특이적으로 결합하는 단클론 항체는 CD47 단백질 전체 또는 일부 펩타이드를 면역원(또는 항원)으로 이용하여 제조할 수 있다. 보다 상세하게는, 우선 면역원으로서 CD47, CD47 단백질을 포함하는 융합 단백질, 또는 CD47 단백질을 포함하는 캐리어(carrier)를 필요에 따라서 면역증강제인 아주반트(adjuvant)(예, Freund adjuvant)와 함께 인간을 제외한 포유동물의 피하, 근육, 정맥, 발볼록살 또는 복강 내에 1회 내지 그 이상 주사하는 것으로써 면역감작(immunization)을 시킨다. 상기 인간을 제외한 포유동물은 바람직하게는, 마우스, 래트, 햄스터, 몰모트, 닭, 토끼, 고양이, 개, 돼지, 염소, 양, 당나귀, 말 또는 소(인간 항체를 생산하는 형질 전환(transgenic) 마우스와 같은 다른 동물 유래의 항체를 생산하도록 조작된 형질 전환(transgenic) 동물을 포함한다.)이며, 보다 바람직하게는, 마우스, 래트, 햄스터, 몰모트, 닭 또는 토끼이다. 첫 번째 면역으로부터 약 1 ~ 21일 마다 1 ~ 4회 면역을 실시하여, 최종 면역으로부터 약 1~10일 후에 면역 감작된 포유동물로부터 항체 생산하는 세포를 수득할 수 있다. 면역을 시키는 회수 및 시간적 간격은 사용하는 면역원의 특징 등에 의하여 적당히 변경할 수 있다.
단클론 항체를 분비하는 하이브리도마(hybridoma)의 제조는 케이라 및 미르슈타인 등의 방법(Nature, 1975, Vol. 256, p. 495-497) 및 이에 준하는 방법에 따라 실시할 수 있다. 상기와 같이 면역 감작된 인간을 제외한 동물로부터 채취한 비장, 림프절, 골수 또는 편도로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나, 바람직하게는 비장에 포함되는 항체 생산하는 세포와 자가 항체 생산 능력이 없는 포유동물 유래의 골수종 세포(myeloma cells)를 세포 융합시키는 것에 의해 하이브리도마(hybridoma)를 제조할 수 있다. 상기 포유동물은 마우스, 래트, 몰모트, 햄스터, 닭, 토끼 또는 인간일 수 있고, 바람직하게는 마우스, 래트, 닭 또는 인간일 수 있다.
세포 융합은, 예를 들면, 폴리에틸렌글리콜이나 센다이 바이러스를 비롯한 융합 촉진제나 전기 펄스에 의한 방법이 이용되고, 일례를 들면, 융합 촉진제를 함유하는 융합 배지에 항체 생산 세포와 무한 증식 가능한 포유류 유래의 세포를 약 1:1 내지 1:10의 비율로 부유시켜, 이 상태로, 약 30 내지 40℃로 약 1 내지 5분간 배양한다. 융합 배지에는, 예를 들면, MEM 배지, RPMI1640 배지 및 이스코브 변형 둘베코 배지(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)를 비롯한 통상의 일반적인 것을 이용하면 좋고, 소 혈청 등의 혈청류는 제외해 두는 것이 바람직하다.
상기 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마 클론을 스크리닝하는 방법은 우선, 상기한 바와 같이 획득한 융합 세포를 HAT 배지 등의 선택용 배지에 옮기고, 약 30 내지 40℃로 약 3일 내지 3주일 배양해서 하이브리도마 이외의 세포를 사멸시킨다. 이어서, 마이크로타이터 플레이트(microtiter plate) 등에서 하이브리도마를 배양한 후, 위에서 기술한 인간을 제외한 동물의 면역반응에 사용한 면역원과 배양 상청액과의 반응성이 증가된 부분을 RIA(radioactive substance-marked immuno antibody) 또는 ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)같은 면역분석방법을 통하여 찾는 방법을 통해 수행할 수 있다. 그리고 상기에서 찾은 단클론 항체를 생산하는 클론은 상기 면역원에 대하여 특이적인 결합력을 보여준다.
본 발명의 단클론 항체는, 이와 같은 하이브리도마를 생체 내외에서 배양함으로써 얻을 수 있다. 배양에는, 포유동물 유래의 세포를 배양하기 위한 통상의 방법이 이용되며, 배양물 등으로부터 단클론 항체를 채취하기 위해서는, 항체 일반을 정제하기 위한 이 분야에서의 통상의 방법이 이용된다. 각각의 방법으로서는, 예를들면, 염석(鹽析), 투석, 여과, 농축, 원심분리, 분별 침전, 겔 여과 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피, 고속액체 크로마토그래피, 겔 전기영동 및 등전점 전기영동 등을 들 수 있고, 이들은 필요에 따라서 조합해서 적용된다. 정제한 단클론 항체는, 그 후, 농축, 건조하여, 용도에 따라서 액상 또는 고상으로 한다.
본 발명의 구체적인 일실시예에서는, CD47에 특이적으로 결합하는 항체를 제조하기 위해, 항-CD47 항체를 생산하는 하이브리도마를 제조 및 스크리닝 하여, CD47에 특이적으로 결합하는 항체(scFv)를 선별하였으며, 이를 3A5로 명명하였다.
상기 3A5 항체는 서열번호 1의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역(GYTFTSYW), 서열번호 2의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역(IDPSDSYT) 및 서열번호 3의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역(ARGGKRAMDY)을 포함하는 중쇄 가변부위 및 서열번호 4의 아미노산으로 표시되는 CDR1 영역(QSLVHSNGNTY), 서열번호 5의 아미노산으로 표시되는 CDR2 영역(KVS) 및 서열번호 6의 아미노산으로 표시되는 CDR3 영역(SQSTHVPFT)을 포함하는 경쇄 가변 부위로 구성되는 것을 확인하였다.
구체적으로, 3A5 항체는 서열번호 7의 아미노산으로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 8의 아미노산으로 표시되는 경쇄 가변부위로 구성되며, 상기 중쇄 가변 부위는 서열번호 9의 염기서열로, 경쇄 가변 부위는 서열번호 10의 염기서열로 코딩되는 것을 확인하였다.
본 발명의 구체적인 다른 일실시예에서, 항-CD47 항체인 3A5를 인간에 대응하는 구조로 변경한 인간화된 항체(humanized antibody)인 Hu3A5V10 항체를 제조하였다. 상기 Hu3A5V10 항체의 중쇄 가변부위 CDR과 경쇄 가변부위 CDR은 3A5 항체와 동일한 것으로 CDR 부분을 제외한 나머지 부분을 인간화하였다.
바람직하게 Hu3A5V10 항체는 서열번호 11의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 12의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위로 구성되며, 상기 중쇄 가변 부위는 서열번호 13의 염기서열로, 경쇄 가변 부위는 서열번호 14의 염기서열로 코딩될 수 있다.
본 발명의 구체적인 또 다른 일실시예에서, 상기 Hu3A5V10 항체를 이용하여 친화도가 성숙된 인간화 항체 3종(AHF16309 항체, AHF16310 항체, AHF16312 항체)을 제조하였다.
바람직하게 AHF16309 항체는 서열번호 15의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 16의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위로 구성되며, 상기 중쇄 가변 부위는 서열번호 17의 염기서열로, 경쇄 가변 부위는 서열번호 18의 염기서열로 코딩될 수 있다.
AHF16310 항체는 서열번호 19의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 20의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위로 구성되며, 상기 중쇄 가변 부위는 서열번호 21의 염기서열로, 경쇄 가변 부위는 서열번호 22의 염기서열로 코딩될 수 있다.
AHF16312 항체는 서열번호 23의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 24의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위로 구성되며, 상기 중쇄 가변 부위는 서열번호 25의 염기서열로, 경쇄 가변 부위는 서열번호 26의 염기서열로 코딩될 수 있다.
본 발명의 CD47에 특이적인 항체가 scFv(single chain variable fragment)로 제조될 경우, scFv는 중쇄 가변 부위 및 경쇄 가변 부위가 링커로 연결될 수 있도록 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다. 상기 링커는 바람직하게 서열번호 27의 아미노산 서열로 표시될 수 있으며, 상기 서열번호 27의 아미노산 서열은 서열번호 28의 염기서열로 코딩될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
경쇄 가변부위-링커-중쇄 가변부위로 연결된 경우 3A5 항체는 서열번호 29의 아미노산 서열 또는 서열번호 30의 염기서열로, Hu3A5V10 항체는 서열번호 31의 아미노산 서열 또는 서열번호 32의 염기서열로 표시될 수 있다. 친화도가 성숙된 인간화 항체인 AHF16309 항체는 서열번호 33의 아미노산 서열 또는 서열번호 34의 염기서열로, AHF16310 항체는 서열번호 35의 아미노산 서열 또는 서열번호 36의 염기서열로, AHF16312 항체는 서열번호 37의 아미노산 서열 또는 서열번호 38의 염기서열로 표시될 수 있다.
본 발명의 CD47에 특이적인 항체가 전장항체(full length antibody)로 제조될 경우, 각 항체의 중쇄 가변부위C-말단 부분에 서열번호 39의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 불변부위(CH1, CH2, CH3)가 추가될 수 있으며, 각 항체의 경쇄 가변부위 C-말단 부분에는 서열번호 40의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 불변부위(CL1)가 추가될 수 있다. 상기 서열번호 39의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 불변부위는 서열번호 41 또는 서열번호 42의 염기서열로 코딩될 수 있으며, 상기 서열번호 40의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 불변부위는 서열번호 43의 염기서열로 코딩될 수 있다.
바람직하게, Hu3A5V10 전장 항체는 서열번호 44의 아미노산서열로 표시되는 중쇄 및 서열번호 45의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄로 구성되며, 상기 중쇄부위는 서열번호 46의 염기서열로, 경쇄부위는 서열번호 47의 염기서열로 코딩될 수 있다.
AHF16309 전장 항체는 서열번호 48의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 및 서열번호 49의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄로 구성되며, 상기 중쇄부위는 서열번호 50의 염기서열로, 경쇄부위는 서열번호 51의 염기서열로 코딩될 수 있다.
AHF16310 전장 항체는 서열번호 52의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 및 서열번호 53의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄로 구성되며, 상기 중쇄부위는 서열번호 54의 염기서열로, 경쇄부위는 서열번호 55의 염기서열로 코딩될 수 있다.
AHF16312 전장 항체는 서열번호 56의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 및 서열번호 57의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄로 구성되며, 상기 중쇄부위는 서열번호 58의 염기서열로, 경쇄부위는 서열번호 59의 염기서열로 코딩될 수 있다.
본 발명의 구체적인 또 다른 일실시예에 있어서, 본 발명에서 제조한 CD47에 특이적인 인간화 항체(Hu3A5V10 항체) 및 3종의 친화도 성숙된 인간화 항체(AHF16309 항체, AHF16310 항체, AHF16312 항체)의 친화도, 즉, 항원과의 결합 친화도를 측정하였다. 각 항체를 전장 항체로 제조한 다음, 도 3에 나타난 방법으로 각 항체의 친화도를 측정한 결과, 도 4 및 표 11에 나타난 바와 같이, 본 발명의 3종의 친화도 성숙된 인간화 항체의 친화도가 Hu3A5V10 항체에 비해 높은 것을 확인하였다.
본 발명에 있어서, 상기 항체는 CD47이 신호-조절-단백질(SIRPα)과 상호 작용하는 것을 방지하거나, CD47-발현 세포에 대한 대식세포 매개 식균 작용을 촉진할 수 있다.
본 발명의 친화도 성숙된 인간화 항체는 항원과의 친화도가 상승하였으므로, 종양세포에서 과발현된 CD47을 보다 효과적으로 인식할 수 있다. 따라서, 본 발명의 친화도 성숙된 인간화 항체는 CD47-SIRPα 결합을 차단하여 암 또는 종양 세포의 면역회피를 억제할 수 있을 뿐만 아니라, 대식세포에 의한 CD47을 과발현하는 암 세포의 대식작용을 효과적으로 촉진할 수 있으므로, CD47을 과발현하는 암 또는 종양의 예방 또는 치료를 위한 항체 치료제로 활용할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 CD47에 특이적으로 결합하는 친화도 성숙된 인간화 항체 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다.
본 발명에서, 용어 "폴리뉴클레오타이드"는 일반적으로 임의의 길이로 분리된 핵산 분자(nucleic acid molecule), 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드, 또는 그의 유사체를 지칭한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 (1) 중합효소 연쇄반응(PCR) 증폭과 같은 in-vitro 증폭; (2) 클로닝 및 재조합; (3) 절단(digestion) 및 겔 전기영동분리와 같은 정제; (4) 화학 합성과 같은 합성을 통해 제조될 수 있으며, 바람직하게 분리된 폴리뉴클레오타이드는 재조합 DNA 기술에 의해 제조된다. 본 발명에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하기 위한 핵산은 합성 올리고뉴클레오티드의 제한 단편 조작(restriction fragment operation) 또는 SOE PCR의 적용을 포함하지만 이에 제한하지 않고, 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 CD47에 특이적으로 결합하는 친화도 성숙된 인간화 항체 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 포함하는 벡터, 및 상기 벡터로 형질전환된 재조합 세포에 관한 것이다.
본 발명에서, 용어 "벡터(expression vector)"는 적당한 숙주세포 내에서 목적 유전자가 발현할 수 있도록 프로모터 등의 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제조물이다. 벡터는 플라스미드, 레트로바이러스(retroviral) 벡터 및 렌티바이러스(lentiviral) 벡터 중 하나 이상으로부터 선택될 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
또한, 벡터는 코딩 영역이 적합한 숙주에서 정확하게 발현될 수 있게 하는 발현 제어 요소를 포함할 수 있다. 이러한 조절 요소는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어 프로모터, 리보솜 결합 부위(ribosome-binding site), 인핸서(enhancer) 및 유전자 전사(transcription) 또는 mRNA 번역(translation)을 조절하기 위한 다른 조절 요소를 포함할 수 있다. 발현 조절 서열의 특정 구조는 종 또는 세포 유형의 기능에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 TATA 박스(box), 캡핑된(capped) 서열, CAAT 서열 등과 같은 전사 개시 및 번역 개시에 각각 참여하는 5' 비-전사 서열, 및5' 또는 3' 비-번역 서열을 함유한다. 예를 들어, 5' 비-전사 발현 조절 서열은 기능적으로 연결된 핵산을 전사 및 조절하기위한 프로모터 서열을 포함할 수 있는 프로모터영역을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "프로모터"는 전사를 지시하기에 충분한 최소 서열을 의미한다. 또한, 세포 유형 특이적 또는 외부의 신호 또는 제제에 의해 유도되는 조절 가능한 프로모터 의존적 유전자를 발현하도록 하는 데 충분한 프로모터 구성이 포함될 수 있으며, 이러한 구성들은 유전자의 5' 또는 3' 부분에 위치할 수 있다. 보존적 프로모터 및 유도적 프로모터 둘 다 포함된다. 프로모터 서열은 원핵생물, 진핵생물 또는 바이러스로부터 유래될 수 있다.
본 발명에서, 용어 "형질전환체"는 하나 이상의 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 갖는 벡터가 숙주세포에 도입되어 형질전환된 세포를 의미하고, 발현 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하기 위한 방법으로는 문헌(Sambrook, J., et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual(2판), Cold Spring Harbor Laboratory, 1. 74, 1989)에 기재된 인산칼슘법 또는 염화캄슘/염화루비듐법, 일렉트로포레이션법(electroporation), 전기주입법(electroinjection), PEG 등의 화학적 처리방법, 유전자 총(gene gun) 등을 이용하는 방법 등이 있다.
상기 벡터가 발현되는 형질전환체를 영양배지에서 배양하면 항체 단백질을 대량으로 제조, 분리 가능하다. 배지와 배양조건은 숙주 세포에 따라 관용되는 것을 적절히 선택하여 이용할 수 있다. 배양시 세포의 생육과 단백질의 대량 생산에 적합하도록 온도, 배지의 pH 및 배양시간 등의 조건들을 적절하게 조절하여야 한다.
본 발명에 따른 벡터는 항체의 생산을 위해 숙주세포, 바람직하게는 포유동물 세포에 형질전환 시킬 수 있다. 완벽한 글리코실화된 단백질을 발현할 수 있는 적합한 숙주 세포는 COS-1(예를 들면, ATCC CRL 1650), COS-7(예를 들면, ATCC CRL-1651), HEK293, BHK21(예를 들면, ATCC CRL-10), CHO(예를 들면, ATCC CRL 1610) 및 BSC-1(예를 들면, ATCC CRL-26) 세포주, Cos-7 세포, CHO 세포, hep G2 세포, P3X63Ag8.653, SP2/0-Agl4, 293 세포, HeLa 세포 등을 포함하며, 이들 세포는 예를 들면, ATCC(American Type Culture Collection, 미국)으로부터 용이하게 이용 가능하다.
CD47 과발현에 의해 매개되는 질환 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 또 다른 관점에서, CD47에 특이적으로 결합하는 친화도 성숙된 인간화 항체 또는 이의 단편을 포함하는, CD47 과발현에 의해 매개되는 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 CD47 과발현에 의해 매개되는 질환은 CD47을 과발현하는 암 또는 종양일 수 있으며, 바람직하게, CD47을 과발현하는 암 또는 종양은 혈액암, 난소암, 결장암, 유방암, 폐암, 골수종, 신경모세포-유도된 CNS 종양, 단핵구 백혈병, B-세포 유도된 백혈병, T-세포 유도된 백혈병, B-세포 유도된 림프종, T-세포 유도된 림프종, 및 비만 세포 유도된 종양으로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 CD47을 과발현하는 세포에 의해 매개되는 질환의 치료제를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 치료제는 CD47에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄 및/또는 경쇄에 공유결합된 상태로 존재하거나, 본 발명의 CD47에 특이적인 인간화 항체와 병용투여할 수 있다.
상기 치료제는 저분자 약물, 펩타이드성 약물, 독소(예를 들어, 세포독소) 등을 포함한다. 또한, 상기 치료제는 항암제일 수 있다. 항암제는 암 세포의 증식을 감소시키고, 세포독성 약제 및 세포 증식 억제제를 아우르는 비-펩타이드성(즉, 비-단백질계) 화합물을 포함한다. 항암제의 비제한적인 예는 알킬화제, 니트로소요소, 항대사물질, 항종양 항생물질, 식물(빈카) 알칼로이드 및 스테로이드 호르몬을 포함한다. 펩타이드성 화합물 또한 사용될 수 있다.
상기 약제 조성물은 치료적 유효량의 본 발명의 항체를 포함하는 것이 바람직하다. 여기에서 사용된 용어 "치료적 유효량"은 목표 질환 또는 상태를 치료, 개선 또는 예방하는 데 필요한 치료제의 양을 의미하고, 또는 감지할 수 있는 정도의 치료 또는 예방효과를 나타내는 데 필요한 치료제의 양을 뜻한다. 어떤 항체에 대하여, 치료적 유효 투여량은 세포배양 분석법 또는 보통 설치류, 토끼, 개, 돼지 또는 영장류와 같은 동물 모델로 최초로 결정될 수 있다. 동물 모델은 또한 적절한 농도범위와 투여루트를 결정하는 데 사용될 수 있다. 이러한 정보는 인간의 투약을 위해 유용한 투여량 및 루트를 결정하는 데 사용될 수 있다.
인간환자를 위한 정밀한 유효량은 질환상태의 심각도, 환자의 일반적 건강 상태, 환자의 나이, 체중 및 성별, 식이요법, 투여시간, 투여빈도, 약제조성, 반응감도 및 치료에 대한 내성/반응에 따라 달라질 수 있다. 상기 양은 통상적인 실험에 의해 결정될 수 있고, 임상의사의 판단의 범위 내에 있다. 일반적으로, 유효 투여량은 0.01 ~ 50mg/kg, 바람직하게는 0.1 ~ 20mg/kg, 더욱 바람직하게는 약 15mg/kg이다.
조성물은 환자에게 개별적으로 투여되거나, 또는 다른 제제, 약제 또는 호르몬과 조합하여 투여될 수 있다. 본 발명의 항체가 투여되는 투여량은 치료될 상태의 성질, 악성 림프종 또는 백혈병의 등급, 및 항체가 질환 예방 차원에서 사용되는지 또는 현존하는 상태를 치료하기 위해 사용되는지에 따라 달라진다.
투여빈도는 항체분자의 반감기, 약 효과의 지속성에 따라 달라진다. 만약 항체분자가 짧은 반감기(예, 2 ~ 10시간)를 가지면, 하루당 1회 또는 그 이상의 투여량을 제공할 필요가 있다. 또는, 항체분자가 긴 반감기(예, 2 ~ 15일)를 가지면, 하루에 한번, 일주일에 한차례, 또는 매 1개월 또는 2개월당 한차례의 투여량을 제공할 필요가 있다.
또한, 약제 조성물은 항체의 투여를 위하여 약제학적으로 허용가능한 담체를 함유할 수 있다. 담체는 그 자신이 조성물을 투여받는 개체에 유해한 항체의 생성을 유발해서는 안되고, 독성이 없어야만 한다. 적당한 담체로는 단백질, 폴리펩타이드, 리포오좀, 다당류, 폴리락틱산, 폴리글리콜산, 아미노산 중합체, 아미노산 공중합체 및 비활성 바이러스 입자들과 같은, 서서히 물질대사되는 거대분자일 수 있다.
약제학적으로 허용가능한 염들은, 예를 들면, 염화수소산염, 브롬화수소산염, 인산염 및 황산염과 같은 미네랄산염들, 또는 아세트산, 프로피온산. 말론산 및 벤조산 같은 유기산의 염들이 사용될 수 있다.
치료 조성물내의 약제학적으로 허용가능한 담체는 부가적으로, 물, 식염수, 글리세롤 및 에탄올과 같은 액체들을 포함할 수 있다. 부가적으로, 습윤제, 유화제 또는 pH 완충물질과 같은 보조 물질들이 이런한 조성물 내에 존재할 수 있다. 상기 담체는 환자에 의한 약제 조성물 섭취를 위해, 정제, 환약, 당의정, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리 및 현탁제로서 제제화될 수 있다.
투여를 위한 바람직한 형태는, 예로써 주사(injection) 또는 주입(infusion)에 의한 비경구적 투약에 적합한 형태를 포함한다. 생성물이 주입 또는 주사용일 경우에는, 오일 또는 수용성 부형제내의 현탁제, 용액 또는 에멀젼의 형태를 취할 수 있고, 이는 현탁제, 방부제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 처방제들을 포함할 수 있다. 또는, 항체분자는 무수형태일 수 있고, 사용전에 적절한 멸균액으로 재구성될 수 있다.
일단 제제화된 경우, 본 발명의 조성물은 환자에게 직접 투여될 수 있다. 치료받을 환자들은 동물일 수 있다. 그러나, 조성물은 인간 환자 투여를 위해 맞추는 것이 바람직하다.
본 발명의 약제 조성물은 제한은 없지만, 경구, 정맥, 근육내, 동맥내, 골수내, 척추강내, 심실내, 경피(transdermal), 경피(transcutaneous), 피하, 복강내, 비강내, 장내, 국소, 혀밑, 질내 또는 직장 경로를 포함하는 경로에 의해 투여될 수 있다. 전형적으로, 치료 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로서 주사가능한 물질로서 제조될 수 있다. 또한, 주입전에 액체 부형제내용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태가 제조될 수 있다.
조성물의 직접적인 전달은 일반적으로 주사, 피하주사, 복강내주사, 정맥내주사, 근육내주사에 의해 이루어질 수 있거나, 또는 조직의 간질(interstitial) 공간으로 전달될 수도 있다. 또한, 조성물은 상처부위로 투여될 수 있다. 투여량 처리는 단일 복용 스케쥴 또는 다중 복용 스케쥴일 수 있다.
CD47를 발현하는 세포에 의해 매개되는 질환의 진단 또는 모니터링
본 발명은 또 다른 관점에서, CD47에 특이적으로 결합하는 친화도 성숙된 항체 또는 이의 단편을 포함하는 CD47를 발현하는 세포에 의해 매개되는 질환의 진단 또는 모니터링용 조성물에 관한 것이다.
상기 CD47에 특이적으로 결합하는 친화도 성숙된 항체 또는 이의 단편은 직접적으로 또는 간접적으로 표지될 수 있다. 간접적 표지는 검출가능 표지를 포함하는 2차 항체를 포함하는데, 여기서 2차 항체가 CD47에 특이적으로 결합하는 항체에 결합한다. 다른 간접적 표지는 바이오틴을 포함하는데, 여기서 바이오티닐화된 CD47에 특이적으로 결합하는 항체는 검출가능 표지를 포함하는 아비딘 또는 스트렙트아비딘을 사용하여 검출될 수 있다.
적절한 검출가능 표지는 분광분석적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적, 전기적, 광학적 또는 화학적 수단에 의해 검출가능한 모든 조성물을 포함한다. 적절한 표지는, 비제한적으로, 자석 비드, 형광염료(예를 들어, 플루오레세인이소티오시안산염, 텍사스 레드, 로다민, 초록 형광 단백질, 적색 형광 단백질, 황색 형광 단백질 등), 방사성 표지(예를 들어, 3H, 125I, 35S, 14C 또는 32P), 효소(예를 들어, 겨자무과산화효소, 알칼린 포스파타아제, 루시퍼라아제 및 효소-연결 면역흡착검사(ELISA)에 일반적으로 사용되는 것들) 및 콜로이드성 골드 또는 착색 유리 또는 플라스틱(예를 들어, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 라텍스 등) 비드와 같은 표색계 표지를 포함한다.
또한, 진단 또는 모니터링을 위해 상기 항체는 형광 단백질로 표지될 수 있으며, 조영제 또는 방사선 동위원소를 포함할 수 있다.
본 발명의 CD47에 특이적으로 결합하는 친화도 성숙된 인간화 항체 또는 이의 단편을 진단 키트에 이용하는 경우, 상기 항체는 지지체에 고정되어 있으며, 상기 지지체는 마이크로플레이트, 마이크로어레이, 칩, 유리, 비드 또는 입자, 또는 멤브레인 일 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : CD47에 특이적으로 결합하는 항체 제조 및 선별
CD47 펩타이드 특이적인 항체를 선별하기위해, CD47과 결합하는 항체를 생산하는 하이브리도마를 제조하여 항체를 선별하였다.
먼저, CD47 단백질(Acrobiosystems, cat# CD7-HA2E9)을 면역하여 비장세포를 적출하고 마우스 골수증세포와 세포 융합을 통하여 하이브리도마 세포를 제작하였다.
세포 융합에 이용하는 마우스 골수종 세포는 HGPRT(Hypoxanthine Guanidine-Phosphoribosyl-Transferase)를 가지고 있지 않기 때문에 HAT 배지에서는 생존할 수 없으나, 하이브리도마는 비장세포와 융합함으로써 HAT 배지에서 생존할 수 있다. 이를 이용하면 하이브리도마만을 증식시킬 수 있으므로, 통상 하이브리도마를 확립시킬때까지 HAT 배지에서 증식시켰다.
증식된 하이브리도마 중에서 CD47과 결합하는 항체를 생산하는 하이브리도마를 선별하기 위해 한계희석법을 사용하였다. 우선 96웰당 1개 세포 이하가 되도록 한 다음, 1개의 세포로부터 증식된 클론에서 얻어진 항체가 CD47과 결합하는지를 ELISA로 확인하고 CD47과 결합하는 클론을 선별하였다. 상기 과정을 3회 반복하여 CD47과 결합하는 항체를 생산하는 하이브리도마를 선별하였다. 이와 같은 방법으로 CD47에 결합하는 항체를 수득하였다.
상기 항체는 3A5로 명명하였으며, 이들의 염기서열과 아미노산 서열을 분석하였다. 서열분석 결과에 따른 각 항체의 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위에 대한 서열정보는 하기 표 1에 나타내었으며, 표 1에서 밑줄 친 부분은 상보적 결정 부위(complementarity determining region; CDR)를 의미한다.
3A5 항체의 서열정보
3A5 서열정보 서열번호
중쇄가변부위 CDR1 GYTFTSYW 서열번호 1
중쇄가변부위 CDR2 IDPSDSYT 서열번호 2
중쇄가변부위 CDR3 ARGGKRAMDY 서열번호 3
경쇄가변부위 CDR1 QSLVHSNGNTY 서열번호 4
경쇄가변부위 CDR2 KVS 서열번호 5
경쇄가변부위 CDR3 SQSTHVPFT 서열번호 6
중쇄가변부위 아미노산서열 EVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKAS GYTFTSYW MHWMNQRPGQGLEWIGV IDPSDSYT SYNQKFKGKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYC ARGGKRAMDY WGQGTSVTVSS 서열번호 7
경쇄가변부위 아미노산서열 DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSS QSLVHSNGNTY LHWYLQKPGQSPKLLIY KVS NRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFC SQSTHVPFT FGSGTKLEIK 서열번호 8
중쇄가변부위 염기서열 GAGGTCCAGCTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGATGAACCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATCGGAGTGATTGATCCTTCTGATAGTTATACTAGCTACAATCAAAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTAGACACATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGAGGGGGTAAGAGAGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA 서열번호 9
경쇄가변부위 염기서열 GATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAAGTACACATGTTCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAA 서열번호 10
실시예 2 : 선별한 항체의 CD47에 대한 특이성 확인 - ELISA 및 유세포분석(flow cytometer)
2-1: ELISA 분석
본 발명에서는 상기 실시예 1에서 확립한 3A5 항체의 CD47에 대한 특이성을 확인하기 위해, ELISA 분석을 수행하였다.
먼저, CD47 펩타이드를 코딩하기 위해, CD47 단백질(Acrobiosystems, cat#CD7-HA2E9)을 100 ng/웰이 되도록 96-웰 플레이트에 분주한 다음, 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 그 다음, 3% BSA가 포함된 1 X PBST를 처리한 후, 상온에서 30분 동안 블로킹시켰다.
3A5 항체(scFv)를 생산하는 각 클론의 하이브리도마 세포 배양액 3 ㎕를 각 웰에 처리한 다음, 상온에서 2시간 동안 반응시킨 후, 1 X PBST로 3번 세척하였다. 2차 항체(anti-HRP, 1:10,000)를 처리하여 상온에서 30분 동안 반응시킨 후, 1 X PBST로 3번 세척한 다음, 발색을 위해 TMB를 처리하여 상온에서 5분 동안 반응시켰다. 마지막으로 1N H2SO4의 정지액(stop solution)을 처리하여 반응을 종료시킨 다음, 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
ELISA 실험 조건
ELISA reader Infinite F50
Measurement Filter 450 nm
Measurement Mode Single Point Photo
Antigen Coating 100 ng/well
2 nd Antibody (Anti-mIgG -HRP) 1:10,000 dilution
Substrate TMB
ELISA 실험 결과
항체 종류 OD450 측정값
3A5 2.010
그 결과, 표 3에 나타난 바와 같이, 본 발명에서 선별한 3A5 항체가 CD47에 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다.
2-2: 유세포분석(flow cytometer)기를 이용한 분석
본 발명에서는 상기 실시예 1에서 확립한 3A5 항체의 CD47에 대한 특이성을 확인하기 위해, 유세포분석(flow cytometer)을 수행하였다.
먼저, CD47을 과발현하는 유방암세포주 MCF-7(1 x 107개)과 3A5 항체(1 ㎍)를 30분간 반응시킨다음, 2차 항체로 표면(surface)을 염색한 후, 유세포분석기로 측정하였다.
양성 대조군(positive control)으로 CD47 항체(Biolegend PE anti-human CD47, cat# 323108, 5 ㎕)를, 2차 항체로는 PE-컨쥬게이션된 항-마우스 IgG 항체(PE-conjugated goat anti-mouse IgG; Biolegend Inc., cat# 405307, 미국, 5 ㎕)를 사용하였다.
유세포분석 결과
항체 종류 Count Median Mean
3A5 11285 13866 14951
positive 11535 10972 11930
2 nd Ab alone 11285 73.9 80
none 11077 24.5 25.0
그 결과, 도 1 및 표 4에 나타난 바와 같이 3A5 항체는 CD47을 과발현하는 세포와 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다.
실시예 3 : 3A5 항체 기반 인간화 항체 제조
상기 실시예 1에서 선별한 3A5 항체를 인간에 대응하는 구조로 변경한 인간화된 항체(humanized antibody)를 제조하였다.
구체적으로, 인간 항체의 생식계열 염기서열(germline sequence)를 프레임(frame)으로하여 CD47과 결합하는 마우스 항체의 CDR를 인간 항체의 CDR를 교체하는 CDR-그라프팅(CDR grafting) 방법으로 마우스 3A5 항체를 인간화한 항체를 제조하였다. 이를 Hu3A5V10 항체로 명명하였으며, 아미노산 서열을 분석하였다.
서열분석 결과에 따른 항체의 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위에 대한 서열정보는 하기 표 5에 나타내었다. 밑줄 친 부분은 상보적 결정 부위(complementarity determining region; CDR)를 의미하며, Hu3A5V10 항체의 CDR은 모두 상기 마우스 3A5 항체(표 1)의 CDR과 동일하다.
Hu3A5V10 항체의 서열정보
Hu3A5V10 서열정보 서열번호
중쇄가변부위 아미노산서열 EVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKAS GYTFTSYW MHWMRQAPGQGLEWIGV IDPSDSYT SYNQGFTGRFVLSVDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYC ARGGKRAMDY WGQGTTVTVSS 서열번호 11
경쇄가변부위 아미노산서열 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSS QSLVHSNGNTY LHWFQQRPGQSPRLLIY KVS NRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC SQSTHVPFT FGGGTKLEIK 서열번호 12
중쇄가변부위 염기서열 GAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGTTCGGAGCTGAAGAAGCCAGGTGCATCCGTGAAGGTATCATGCAAAGCTTCCGGCTACACGTTCACCAGCTATTGGATGCATTGGATGCGCCAGGCCCCTGGGCAGGGGCTTGAGTGGATCGGTGTGATTGACCCAAGTGACAGCTACACCAGCTACAACCAGGGCTTCACCGGCCGGTTCGTCCTCTCCGTTGATACCAGCGTATCCACGGCCTACCTGCAAATTTCCAGCCTGAAAGCGGAGGACACAGCTGTTTACTACTGTGCTCGTGGCGGGAAGCGCGCCATGGATTATTGGGGCCAGGGCACCACCGTCACCGTGTCCTCT 서열번호 13
경쇄가변부위 염기서열 GACGTGGTGATGACCCAGAGCCCCCTGTCGCTGCCGGTGACTCTTGGACAGCCGGCCTCCATCTCTTGCCGATCTTCCCAGTCCTTGGTCCACTCTAATGGCAACACGTACTTGCACTGGTTCCAGCAGCGTCCCGGGCAGAGCCCTCGCCTGCTGATCTACAAGGTGTCGAACCGCTTCTCGGGCGTCCCCGACAGGTTTTCAGGCTCCGGTAGTGGCACCGACTTTACTCTCAAGATCAGCCGCGTGGAGGCGGAAGATGTGGGCGTGTACTACTGTTCTCAGTCCACTCACGTCCCCTTCACCTTTGGCGGTGGGACCAAGCTAGAGATCAAG 서열번호 14
실시예 4 : 인간화된 3A5 항체의 CD47에 대한 특이성 확인 - ELISA와 유세포분석(flow cytometer)
4-1: ELISA 분석
본 발명에서는 상기 실시예 3에서 확립한 Hu3A5V10 항체의 CD47에 대한 특이성을 확인하기 위해, 상기 실시예 2-1와 동일한 방법으로 ELISA 분석을 수행하였다.
ELISA 실험 결과
항체 종류 OD450 측정값
Hu3A5V10 2.8076
음성대조군 0.0431
그 결과, 표 7에 나타난 바와 같이, Hu3A5V10 항체가 CD47에 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다.
4-2: 유세포분석(flow cytometer)를 이용한 분석
본 발명에서는 상기 실시예 3에서 확립한 Hu3A5V10 항체의 CD47에 대한 특이성을 확인하기 위해, 상기 실시예 2-2와 동일한 방법으로 유세포분석(flow cytometer)을 수행하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이 Hu3A5V10 항체는 CD47을 과발현하는 세포와 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다.
실시예 5 : 3A5 항체 기반 친화도 성숙된 인간화 항체 제조
상기 실시예 3에서 제조한 Hu3A5V10 항체의 항원에 대한 친화도를 높이기 위해, 친화도 성숙된 인간화 항체를 제조하였다. 친화도 성숙된 인간화 항체는 진스크립트(GenScript)에 의뢰하여 제조하였으며, 항체의 중쇄와 경쇄를 코딩하는 DNA 서열을 합성하여 FESEB 벡터(Gencript)에 클로닝하고 박테리아(TG1 competent E. coli)으로 형질전환 시킨 후, IPTG로 유도하여 Fab를 생산하는 시스템(Fab FASEBA sample)을 구축하였다. 또한, PML(precise mutagenesis library) 라이브러리를 제작하여 친화도 성숙된 항체를 최종적으로 선별하였다.
보다 구체적으로, E. coli에 대한 최적 코돈을 사용하여 항체 CDR 영역의 67개 잔기를 다른 19개의 원하는 아미노산으로 돌연변이시켰다. 프로그래밍 가능한 마이크로어레이에서 DNA 올리고뉴클레오티드 라이브러리 합성을 수행하였으며, 라이브러리 품질은 NGS를 통해 90%의 최소 적용 범위를 보장하였다. E. coli에서의 발현을 위해 각 PML 라이브러리에서 48개의 클론을 무작위로 선택한 다음, 48개의 PML 라이브러리 클론을 접종하고 96-딥 웰 플레이트에서 발현을 유도하였다. 그 다음, 배지에서 분비된 항체의 발현, 및 인간 CD47 단백질에 대한 결합친화도를 ELISA를 이용하여 평가하였다.
최종적으로 친화도가 성숙된 인간화 항체 3종을 선별하였으며, 각각 AHF16309 항체, AHF16310 항체, AHF16312 항체로 명명하고, 아미노산 서열을 분석하였다.
서열분석 결과에 따른 항체의 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위에 대한 서열정보는 하기 표 7 내지 표 9에 나타내었다.
AHF16309 항체의 서열정보
AHF16309 서열정보 서열번호
중쇄 가변부위아미노산서열 EVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKAS GYTFTSYW MHWMRQAPGQGLEWIGV IDPNDSYT SYNQGFTGRFVLSVDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYC ARGGKRMMDY WGQGTTVTVSS 서열번호 15
경쇄 가변부위아미노산서열 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSS QSLVHSNGNTY LNWFQQRPGQSPRLLIY KVS NRFPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC SQSTHVPFT FGGGTKLEIK 서열번호 16
중쇄 가변부위염기서열 GAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCAGCGAGCTGAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTTAAGGTGTCTTGTAAAGCTTCTGGCTACACCTTCACATCTTATTGGATGCACTGGATGAGACAGGCCCCTGGACAAGGCCTGGAATGGATCGGCGTGATCGATCCTAACGACAGCTACACCTCCTACAACCAGGGATTTACCGGCAGATTCGTGCTGAGCGTGGACACCAGCGTCAGCACAGCCTACCTGCAGATCAGCAGCCTGAAGGCTGAAGATACAGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGGCGGAAAGCGGATGATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGTCCAGC 서열번호 17
경쇄 가변부위 염기서열 GACGTGGTGATGACCCAGAGCCCCCTGAGCCTGCCTGTGACACTGGGCCAACCTGCCAGCATCAGCTGTAGAAGCAGCCAGTCTCTGGTGCACAGCAACGGCAATACCTACCTCAACTGGTTCCAGCAGCGGCCTGGCCAGTCCCCTAGACTGCTGATCTATAAGGTGTCCAACCGGTTTCCAGGCGTGCCTGATAGATTCAGCGGCAGCGGATCTGGCACCGACTTCACACTGAAAATCTCTAGAGTTGAGGCCGAGGACGTGGGCGTCTACTACTGCAGCCAGTCCACCCACGTGCCCTTCACCTTCGGCGGCGGAACAAAGCTGGAAATCAAG 서열번호 18
AHF16310 항체의 서열정보
AHF16310 서열정보 서열번호
중쇄 가변부위 아미노산서열 EVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKAS GYTFTSYW MHWMRQAPGQGLEWIGV IDPNDSYT SYNQGFTGRFVLSVDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYC ARGGKRMMDY WGQGTTVTVSS 서열번호 19
경쇄 가변부위아미노산서열 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSS QSLVHSNGNTY LHWFQQRPGQSPRLLIY KVS NRFTGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC SQSTHVPFT FGGGTKLEIK 서열번호 20
중쇄 가변부위염기서열 GAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCAGCGAGCTGAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTTAAGGTGTCTTGTAAAGCTTCTGGCTACACCTTCACATCTTATTGGATGCACTGGATGAGACAGGCCCCTGGACAAGGCCTGGAATGGATCGGCGTGATCGATCCTAACGACAGCTACACCTCCTACAACCAGGGATTTACCGGCAGATTCGTGCTGAGCGTGGACACCAGCGTCAGCACAGCCTACCTGCAGATCAGCAGCCTGAAGGCTGAAGATACAGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGGCGGAAAGCGGATGATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGTCCAGC 서열번호 21
경쇄 가변부위 염기서열 GACGTGGTGATGACCCAGTCTCCACTGAGCCTGCCTGTGACCCTCGGCCAACCTGCCAGCATCTCTTGTAGAAGCAGCCAGTCCCTGGTGCACAGCAACGGCAATACCTACCTGCACTGGTTCCAGCAGCGGCCTGGCCAGAGCCCCAGACTGCTGATCTATAAGGTGTCCAACCGGTTTACAGGCGTGCCTGATAGATTCAGCGGATCTGGCAGCGGCACAGACTTCACCCTGAAAATCAGCAGAGTCGAGGCCGAGGACGTTGGAGTGTACTACTGCAGCCAGTCTACACACGTGCCCTTCACCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAG 서열번호 22
AHF16312 항체의 서열정보
AHF16312 서열정보 서열번호
중쇄 가변부위 아미노산서열 EVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKAS GYTFTSYW MHWMRQAPGQGLEWIGV IDPNDSYT SYNQGFTGRFVLSVDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYC ARGGKRIMDY WGQGTTVTVSS 서열번호 23
경쇄 가변부위아미노산서열 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVHSNGNTYLNWFQQRPGQSPRLLIY KVS NRFTGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC SQSTHVPFT FGGGTKLEIK 서열번호 24
중쇄염기서열 GAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCAGCGAGCTGAAGAAGCCTGGAGCTTCTGTGAAGGTGTCTTGTAAAGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGATGAGACAGGCCCCTGGCCAGGGCCTGGAATGGATCGGCGTGATCGACCCCAACGACAGCTATACATCTTACAACCAGGGATTTACCGGCAGATTCGTGCTGAGCGTCGACACCAGCGTGTCCACCGCCTACCTGCAGATCAGCAGCCTGAAGGCTGAAGATACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGGCGGCAAGCGGATCATGGATTACTGGGGACAAGGCACCACAGTTACAGTGTCCAGC 서열번호 25
경쇄 가변부위 염기서열 GACGTGGTGATGACCCAGTCTCCACTGAGCCTGCCTGTGACCCTCGGCCAACCTGCCAGCATCAGCTGTAGAAGCAGCCAGTCCCTGGTGCACAGCAACGGCAATACCTACCTGAACTGGTTCCAGCAGCGGCCTGGCCAGAGCCCCAGACTGCTGATCTATAAGGTGTCCAACCGGTTCACCGGCGTTCCTGATAGATTCAGCGGATCTGGCAGCGGCACCGACTTCACACTGAAAATCTCTAGAGTCGAGGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGCAGCCAGTCCACCCACGTGCCCTTCACATTTGGCGGAGGAACAAAGCTGGAAATCAAG 서열번호 26
실시예 6 : 친화도 측정
본 발명에서는 실시예 3의 Hu3A5V10 항체 및 실시예 5의 3종의 친화도 성숙된 인간화 항체(AHF16309 항체, AHF16310 항체, AHF16312 항체)의 친화도를 측정하기 위해, 서열번호 39의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 불변부위 및 서열번호 40의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 불변부위를 각 항체의 아미노산 서열에 추가하여 IgG4 Fc에 연결하여 전장항체(full length anti body)를 제조하였다. 그 다음, 제조된 전장 항체를 사용하여 SPR(surface plasmon resonance) 방법으로 친화도를 측정하였다 (도 3).
인간 CD47에 대한 항체의 결합 친화도는 Biacore 8K를 사용하여 인간 CD47 단백질에 대한 친화도를 측정하였으며, 측정 조건은 하기 표 10과 같다.
실험조건
Capture
Ligand antibodies
Capture time(s) 30
Flow rate(μl/min) 10
Association & Dissociation
Association contact time(s) 120
Dissociation contact time(s) 360
Flow rate(μl/min) 30
Sample concentrations(nM) 100,50,25,12.5,6.25,3.125,1.5625
Surface regeneration
Regeneration buffer 10 mM Glycine-HCl pH 1.5
Contact time(s) 30
Flow rate(μl/min) 30
항체의 항원에 대한 친화도
Ligand Analyte Chi²(RU²) ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M) Rmax(RU)
U822EGG010-Hu3A5V10 Human CD47 8.53E-01 1.00E+06 4.67E-04 4.65E-10 48
AHF16309 Human CD47 2.53E+00 2.78E+06 8.65E-04 3.12E-10 40
AHF16310 Human CD47 1.86E+00 2.21E+06 4.58E-04 2.08E-10 37.3
AHF16312 Human CD47 1.48E+00 1.85E+06 3.07E-04 1.66E-10 35.5
도 4 및 표 11에 나타난 바와 같이, 본 발명의 3종의 친화도 성숙된 인간화 항체의 해리 상수(KD, dissociation constant)가 Hu3A5V10 항체에 비해 낮은 것으로 나타났다. 즉, 본 발명의 친화도 성숙된 인간화 항체의 항원(CD47)에 대한 결합력 및 친화도가 Hu3A5V10 항체에 비해 증가한 것을 확인하였다.
본 발명의 CD47에 특이적으로 결합하는 친화도 성숙된 인간화 항체는 항원과의 결합력 및 친화도가 증가한 것을 확인하였으므로, CD47의 과발현에 의한 면역 반응이 억제되는 질환 또는 종양의 예방 또는 치료에 효과적으로 적용할 수 있다.

Claims (7)

  1. (1) 서열번호 15의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 16의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위;
    (2) 서열번호 19의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 20의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위; 또는
    (3) 서열번호 23의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위 및 서열번호 24의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위로 구성된, CD47에 특이적으로 결합하는 친화도 성숙된 인간화 항체 또는 이의 단편.
  2. 제1항의 CD47에 특이적으로 결합하는 친화도 성숙된 인간화 항체 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
  3. 제1항의 CD47에 특이적으로 결합하는 친화도 성숙된 인간화 항체 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
  4. 제3항의 벡터로 형질전환된 CD47에 특이적으로 결합하는 친화도 성숙된 인간화 항체 또는 이의 단편을 생산하는 재조합 세포.
  5. 제1항의 CD47에 특이적으로 결합하는 친화도 성숙된 인간화 항체 또는 이의 단편을 포함하는, CD47을 과발현하는 세포에 의해 매개되는 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 CD47을 과발현하는 세포에 의해 매개되는 질환은 CD47을 과발현하는 암 또는 종양인 것을 특징으로 하는, CD47을 과발현하는 세포에 의해 매개되는 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 암 또는 종양은 혈액암, 난소암, 결장암, 유방암, 폐암, 골수종, 신경모세포-유도된 CNS 종양, 단핵구 백혈병, B-세포 유도된 백혈병, T-세포 유도된 백혈병, B-세포 유도된 림프종, T-세포 유도된 림프종, 및 비만 세포 유도된 종양으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, CD47을 과발현하는 세포에 의해 매개되는 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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