TW202100563A - 融合多肽及其用途與製備方法、核酸分子、重組載體、重組細胞以及用於增強生長/分化因子15或其功能變體的活體內穩定性的方法 - Google Patents

融合多肽及其用途與製備方法、核酸分子、重組載體、重組細胞以及用於增強生長/分化因子15或其功能變體的活體內穩定性的方法 Download PDF

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Abstract

本發明提供一種包括生長/分化因子15（Growth/differentiation factor 15；GDF15）以及免疫球蛋白可結晶區域片段（Fc region of immunoglobulin）的融合多肽、一種包括融合多肽的醫藥組成物，以及一種增加生長/分化因子15的活體內持續時間的方法，所述方法包括與免疫球蛋白可結晶區域片段融合。

Description

包括免疫球蛋白可結晶區域片段以及生長/分化因子15之融合胜肽
提供一種包括生長/分化因子15（Growth/differentiation factor 15；GDF15）以及免疫球蛋白Fc區域的融合多肽、一種包括融合多肽的醫藥組成物，以及一種增加GDF15的活體內持續時間的方法，所述方法包括與免疫球蛋白Fc區域融合。
大多數蛋白質或肽藥物在體內具有較短活性期，且在藉由除靜脈內投與以外的方法投與時具有較低吸收速率，且因此在需要使用長期藥物治療進行治療時，所述藥物具有以較短投與時間間隔連續重複注射此等藥物的不便性。為解決此不便性，需要研發一種用於以單次劑量連續釋放藥物的技術。回應於此類需求，將研發用於持續釋放的持續釋放調配物。
舉例而言，已積極地進行對持續釋放調配物的研究，其中製備呈由可生物降解聚合物基體包圍蛋白質或肽藥物的形式的微粒，且在其投與期間，基體材料經緩慢分解且在體內移除並緩慢釋放藥物。
在另一方面，生長/分化因子15（GDF15）為TGF-β家族中的一者，且為25kDa均二聚體，且為在血漿中循環的分泌性蛋白質。GDF15的血漿含量與身體質量指數（body mass index；BMI）有關，且GDF15發揮能量穩態的長期調節因子的作用。GDF15亦防止病理病況，諸如心血管疾病、心肌肥大、局部缺血損壞以及類似病況。另外，在1型糖尿病模型及2型糖尿病模型中，GDF15防止腎小管及腎間質損傷。此外，GDF15對年齡相關的感官及運動神經損耗具有保護作用，且可促使外周神經損傷的恢復。此外，GDF15具有體重減輕及體脂減少以及葡萄糖耐受性作用，且具有增加全身性能量消耗及氧化代謝的作用。GDF15經由體重依賴型及非依賴型機制呈現血糖控制作用。
需要研發一種用於提高在體內具有各種藥理學作用的GDF15蛋白質的持久性的技術。
[技術難題]
在本發明中，提供一種藉由將生長/分化因子15（GDF15）或其功能變體與免疫球蛋白Fc區域連接來建構融合多肽的技術；藉此相較於不含Fc區域的情況，藉由增加GDF15的活體內半衰期來提昇活體內持續時間，以增強GDF15的藥理學作用及/或增加投與時間間隔。
一實施例提供一種融合多肽，包括GDF15或其功能變體以及免疫球蛋白Fc區域。
在融合多肽中，免疫球蛋白Fc區域可包括（連接）於GDF15或其功能變體的N末端中。舉例而言，融合多肽自N末端至C末端可包括（1）免疫球蛋白Fc區域以及（2）GDF15或其功能變體。
包括於融合多肽中的免疫球蛋白Fc區域發揮增強GDF15或其變體的穩定性的作用，且例如，所述免疫球蛋白Fc區域可具有延長半衰期（例如活體內半衰期）的作用。在一個實施例中，免疫球蛋白Fc區域可由下述者組成的族群中選出：IgG1 Fc區域及IgG4 Fc區域。IgG1 Fc區域可包括IgG1的CH2域、CH3域或CH2+CH3域，且包括或不含IgG1在N末端處的鉸鏈區域。IgG4 Fc區域可包括IgG4的CH2域、CH3域或CH2+CH3域，且包括或不含IgG4在N末端處的鉸鏈區域。
融合多肽可更包括在免疫球蛋白Fc區域與GDF15或其功能變體之間的肽連接子。在一個實施例中，肽連接子可為可撓性連接子，以使得融合至連接子的兩個末端的Fc區域及GDF15可獨立地呈現其功能。在一特定實施例中，肽連接子可不為剛性連接子。舉例而言，肽連接子可為重複包括至少一個Gly（G）及至少一個Ser（S）的GS連接子，且例如可由(GGGGS)n（n為GGGGS（SEQ ID NO: 13）的重複次數，且為1至10的整數或1至5（1、2、3、4或5）的整數）表示，但不限於此。
在融合多肽中，相較於不與免疫球蛋白Fc區域融合的GDF15或其功能變體，與免疫球蛋白Fc區域融合的GDF15或其功能變體的特徵在於活體內（或血液中）穩定性（持續時間）增加（例如活體內或血液中半衰期增加）。另外，相較於不與免疫球蛋白Fc區域融合的GDF15或其功能變體，與免疫球蛋白Fc區域融合的GDF15或其功能變體的特徵在於藥理學作用（例如體重減輕作用）提高。
其他實施例提供一種包括融合多肽中的兩種的融合多肽二聚體。融合多肽二聚體可連接（合併）至融合多肽中的兩種的GDF15或其功能變體。
其他實施例提供一種編碼融合多肽的核酸分子。
其他實施例提供一種包括核酸分子的重組載體。
其他實施例提供一種包括重組載體的重組細胞。
其他實施例提供一種用於體重減輕、飲食控制（減少餐食量）或預防、改善、緩解及/或治療代謝疾病的組成物（醫藥組成物或保健功能食品組成物），所述組成物包括由下述者組成的族群中選出的至少一者：融合多肽、融合多肽二聚體、編碼融合多肽的核酸分子、包括核酸分子的重組載體以及包括重組載體的重組細胞。其他實施例提供一種體重減輕的方法、用於飲食控制（減少餐食量）的方法或一種預防、改善、緩解及/或治療代謝疾病的方法，包括由下述者組成的族群中選出的至少一者：融合多肽、融合多肽二聚體、編碼融合多肽的核酸分子、包括核酸分子的重組載體以及包括重組載體的重組細胞。代謝疾病意謂由代謝病症引起的所有疾病，且所述代謝疾病可由下述者組成的族群中選出：肥胖症、糖尿病（例如2型糖尿病）、非酒精性脂肪肝病（例如非酒精性脂肪變性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis；NASH）等）以及類似疾病。
其他實施例提供一種製備具有增加的活體內（或血液中）半衰期的GDF15或其功能變體的方法，所述方法包括使細胞中的重組載體表現；或一種用於製備包括具有增加的活體內（或血液中）半衰期的GDF15或其功能變體的融合多肽或包括所述融合多肽的均二聚體的方法。
其他實施例提供一種增加GDF15或其功能變體的活體內持續時間的方法，所述方法包括將GDF15或其功能變體與免疫球蛋白Fc區域融合（或連接或合併）。在一個特定實施例中，融合可包括用或不用連接子將免疫球蛋白Fc區域融合（或連接或合併）至GDF15或其功能變體的N末端。另一實施例提供一種降低GDF15、免疫球蛋白Fc區域或包括其兩者的融合多肽的免疫原性的方法，所述方法包括用可撓性連接子（例如GS連接子）將免疫球蛋白Fc區域融合（或連接或合併）至GDF15或其功能變體。融合（或連接或合併）的步驟可在活體外進行。
[技術解決方案]
下文中，將更詳細地描述本發明： GDF15
除總共308個胺基酸中的信號肽及原肽以外，GDF15由自第197個（A）至第308個（I）的胺基酸（UniProt Q99988）（SEQ ID NO: 1；圖2；成熟形式）組成：
本文中，除非以其他方式提及，否則GDF15意謂基本上包括以下的多肽：自全長蛋白質的第197個（A）至第308個（I）的胺基酸序列（UniProt Q99988）（SEQ ID NO: 1，見圖2；ARNG DHCPLGPGRC CRLHTVRASL EDLGWADWVL SPREVQVTMC IGACPSQFRA ANMHAQIKTS LHRLKPDTVP APCCVPASYN PMVLIQKTDT GVSLQTYDDL LAKDCHCI），或與在維持GDF15的特有活性及結構的範圍內的胺基酸序列具有80%或更高、85%或更高、90%或更高、95%或更高、96%或更高、97%或更高、98%或更高或99%或更高的序列同源性的胺基酸序列。
本文中，GDF15的功能變體可為經修飾以使得GDF15維持特有活性及結構且亦有利於二聚體結構形成的變體。在一個實施例中，GDF15的功能變體可為N末端缺失變體，其中具有SEQ ID NO: 1的GDF15的胺基酸序列的N末端的14個胺基酸殘基中的至少一個（1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個或14個）（亦即，自SEQ ID NO: 1中的第1個至第14個的總共14個胺基酸殘基）（例如依次來自N末端的至少一個），例如全部14個胺基酸殘基缺失（下文中可由『ΔN14GDF15』或『GDF(CRL)』表示）。在一個特定實施例中，GDF15的功能變體可為基本上包括以下的多肽：胺基酸序列SEQ ID NO: 2（CRLHTVRASL EDLGWADWVL SPREVQVTMC IGACPSQFRA ANMHAQIKTS LHRLKPDTVP APCCVPASYN PMVLIQKTDT GVSLQTYDDL LAKDCHCI），或與在維持GDF15的特有活性及結構的範圍內的胺基酸序列具有80%或更高、85%或更高、90%或更高、95%或更高、96%或更高、97%或更高、98%或更高或99%或更高的序列同源性的胺基酸序列。 免疫球蛋白Fc
待與GDF15或其功能變體融合的免疫球蛋白Fc發揮增強GDF15或其功能變體的穩定性的作用，且例如所述Fc可具有延長半衰期（例如活體內半衰期）及/或減少腎臟過濾等的作用。在一個實施例中，免疫球蛋白Fc區域可由IgG1的Fc及IgG4的Fc中選出。IgG1 Fc區域可包括IgG1的CH2域、CH3域或CH2+CH3域，且包括或不包括IgG1在N末端處的鉸鏈區域。IgG4 Fc區域可包括IgG4的CH2域、CH3域或CH2+CH3域，且包括或不包括IgG4在N末端處的鉸鏈區域。
IgG1可衍生自諸如人類的靈長類動物，或諸如小鼠、大鼠以及類似動物的嚙齒動物，且例如所述IgG1可為人類IgG1（UniProtKB P01857）。IgG4可衍生自諸如人類的靈長類動物，或諸如小鼠、大鼠以及類似動物的嚙齒動物，且例如所述IgG4可為人類IgG4（UniProtKB P01861）。
IgG1 Fc區域可包括IgG1的CH2域、CH3域或CH2+CH3域，且包括或不包括IgG1在N末端處的鉸鏈區域。IgG4 Fc區域可包括IgG4的CH2域、CH3域或CH2+CH3域，且包括或不包括IgG4在N末端處的鉸鏈區域。
在一個特定實施例中，IgG1的Fc可為包括人類IgG1（SEQ ID NO: 3）的CH2域及CH3域的多肽，或更包括人類IgG1（SEQ ID NO: 4）在胺基酸序列SEQ ID NO: 3的N末端處的鉸鏈區域的多肽。如本文中所描述，可將IgG1 Fc區域解譯為包括與胺基酸序列SEQ ID NO: 3具有80%或更高、85%或更高、90%或更高、95%或更高、96%或更高、97%或更高、98%或更高或99%或更高的序列同源性的胺基酸序列，或在維持IgG1的特有活性及結構的範圍內的『N末端-(SEQ ID NO: 4)-(SEQ ID NO: 3)-C末端』。
IgG4的Fc可為包括人類IgG4（SEQ ID NO: 5）的CH2域及CH3域的多肽，或更包括人類IgG1（SEQ ID NO: 10）在胺基酸序列SEQ ID NO: 5的N末端處的鉸鏈區域的多肽。如本文中所描述，可將IgG4 Fc區域解譯為包括與胺基酸序列SEQ ID NO: 5具有80%或更高、85%或更高、90%或更高、95%或更高、96%或更高、97%或更高、98%或更高或99%或更高的序列同源性的胺基酸序列，或在維持IgG4的特有活性及結構的範圍內的『N末端-(SEQ ID NO: 10)-(SEQ ID NO: 5)-C末端』（或下文描述的IgG4的變體Fc的胺基酸序列）。
當免疫球蛋白Fc區域用以延長連接至其N末端或C末端的蛋白質的（活體內）半衰期時，至關重要的是使Fc的任何效應功能降至最低以便減小免疫球蛋白Fc區域的副作用。在此態樣中，相較於其他IgG亞型，人類IgG4 Fc區域因與FcγR及互補因子的低結合能力而為有利的。另外，人類IgG4 Fc區域可藉由包括胺基酸取代而具有降低的效應功能。用以降低效應功能的人類IgG4 Fc區域的胺基酸取代可包括以下中的至少一者：IgG4（UniprotKB P01861）人類的第234個殘基苯丙胺酸取代成丙胺酸取代及第235個殘基白胺酸取代成丙胺酸（包括於IgG4 Fc的CH2-CH3域位點中；胺基酸殘基數目是根據EU編號[Kabat, E.A.等人（1991）《免疫學關注蛋白質之序列（Sequences of Proteins of Immunological Interest）》，第5版，美國衛生與公共服務部（U.S. Dept. of Health and Human Services），馬里蘭州貝什斯達，NIH公開案第91-3242號]）。另外，IgG4 Fc區域可包括使重鏈二聚體形成穩定且防止半IGG4 Fc鏈形成的胺基酸取代。此胺基酸取代可包括人類IgG4 Fc區域（UniprotKB P01861）的第228個胺基酸殘基絲胺酸（根據EU編號；包括於鉸鏈區域中）取代成脯胺酸。
在一個特定實施例中，為降低免疫原性，Fc區域可不包括除上文所描述的突變以外的突變，但不限於此。
在一個特定實施例中，免疫球蛋白Fc區域可包括人類IgG4 Fc（SEQ ID NO: 5（一般型）；SEQ ID NO: 6（野生型），或SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8或SEQ ID NO: 9（變體））的CH2-CH3域，或更包括人類IgG4在CH2-CH3域（SEQ ID NO: 10（一般型）；SEQ ID NO: 11（野生型），或SEQ ID NO: 12（變體））的N末端處的鉸鏈區域。
本文中可使用的免疫球蛋白Fc區域概述於下表1中： [表1]
  區域 胺基酸序列 SEQ ID NO:
人類IgG1-Fc (UniProtKB P01857) 核心鉸鏈 DKTHT CPPCP 4
CH2-CH3 APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSRDELTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGX （X不存在或為K） 3
人類IgG4-Fc (UniProtKB P01861) 鉸鏈（一般型） ESKYGPPCPX CP（X為S或P） 10
鉸鏈（野生型） ESKYGPPCPS CP（在SEQ ID NO: 10中，X為S） 11
鉸鏈（變體） ESKYGPPCP P CP（在SEQ ID NO: 10中，X為P） 12
CH2-CH3（一般型） APE X1X2 GGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLG X3 （X1為F或A，X2為L或A，X3不存在或為K） 5
CH2-CH3（野生型） APEFL GGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGK （在SEQ ID NO: 5中，X1為F，X2為L，X3為K） 6
CH2-CH3（變體） APE AA GGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLG（在SEQ ID NO: 5中，X1為A，X2為A，X3不存在） 7
CH2-CH3 （變體） APE A LGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLG （在SEQ ID NO: 5中，X1為A，X2為L，X3不存在） 8
CH2-CH3 （變體） APEF A GGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLG （在SEQ ID NO: 5中，X1為F，X2為A，X3不存在） 9
融合多肽
本文中提供的融合多肽包括免疫球蛋白Fc區域及連接至免疫球蛋白Fc區域的C末端的GDF15或其功能變體。免疫球蛋白Fc區域及GDF15或其功能變體如上文所描述。
在融合多肽中，免疫球蛋白Fc區域及GDF15或其功能變體可共價或非共價連接，或藉由適當連接子（例如肽連接子）連接或不藉由連接子直接連接。在一個實施例中，肽連接子可為由以下組成的多肽：1至20、1至15、1至10、2至20、2至15或2至10的任何胺基酸，且包括於其中的胺基酸的種類不受限制。在本發明中，肽連接子可為可撓性連接子，以使得融合至連接子的兩個末端的Fc區域及GDF15可獨立地呈現其功能（例如對於Fc區域，呈現穩定的活性，諸如半衰期增加、腎臟過濾減少以及類似功能）。在一特定實施例中，肽連接子可不為剛性連接子。舉例而言，肽連接子可包括由下述者組成的族群中選出的至少一個胺基酸殘基：Gly、Asn、Ser、Glu以及Lys，且亦可包括中性胺基酸，諸如Thr及/或Ala，但不限於此，且適合於肽連接子的胺基酸序列為此項技術中已知的。
在一個實施例中，肽連接子可為重複包括一或多個Gly（G）及一或多個Ser（S）的GS連接子，且例如可為(GGGGS)n（n為GGGGS（SEQ ID NO: 13）的重複計數，且為1至10的整數或1至5（1、2、3、4或5）的整數），但不限於此。在GS連接子中，甘胺酸（Glycine；Gly）（其為具有氫（-H）作為R基團的胺基酸）為非極性的，且具有高自由度（φ、ψ角度）及優良行動性；且絲胺酸（Serine；Ser）（其為具有-CH2-OH作為R基團的胺基酸）具有較小的大小及極性以與水形成氫鍵，其有利於維持穩定性，藉此使GS連接子與GDF15或Fc區域之間的非特異性相互作用減小。另外，GS連接子具有可撓性結構，藉此有利於降低免疫原性。另外，GS連接子可在使Fc區域與GDF15在空間上分離以使得其功能不受彼此干擾中起作用。GS連接子可具有15個至25個胺基酸（n=3至5）、15個至20個胺基酸（n=3或4）、15個至25個胺基酸（n=4或5）或20個胺基酸（n=4）的胺基酸長度。在一特定實施例中，包括於本說明書中所提供的融合多肽中的肽連接子可不包括除如上文所描述的GS連接子[(GGGGS)n（n為1至10的整數或1至5的整數）]以外的胺基酸。
在一實施例中，融合肽可更包括在免疫球蛋白Fc區域與GDF15或其功能變體之間的肽連接子。在一個實施例中，肽連接子可為重複包括一或多個Gly（G）及一或多個Ser（S）的GS連接子，且例如可為(GGGGS)n（n為GGGGS（SEQ ID NO: 13）的重複計數，且為1至10的整數或1至5（1、2、3、4或5）的整數），但不限於此。
可以重組方式產生或以化學方式合成融合多肽。當以重組方式產生時，融合多肽可由一個閱讀框編碼，所述閱讀框的表現由一個轉錄起始調節因子（例如啟動子等）控制（由「單股」表示）。
在融合多肽中，相較於其中GDF15或其功能變體不與免疫球蛋白Fc區域融合的情況，與免疫球蛋白Fc區域融合的GDF15或其功能變體的特徵在於活體內（或血液中）穩定性（持續時間）增加（例如活體內或血液中半衰期增加）及/或免疫原性降低，且/或免疫球蛋白Fc區域與GDF15或其功能變體經由除如上文所描述的GS連接子以外的連接子融合。另外，相較於其中GDF15或其功能變體不與免疫球蛋白Fc區域融合的情況，與免疫球蛋白Fc區域融合的GDF15或其功能變體的特徵在於藥理學作用（例如體重減輕作用）提高。 融合多肽二聚體
GDF15的功能活性形式為均二聚體形式。
因此，本發明的其他實施例提供一種融合多肽二聚體，其中兩種融合多肽（第一融合多肽及第二融合多肽）經合併。第一融合多肽包括第一免疫球蛋白Fc區域及第一GDF15或其功能變體，且第二融合多肽包括第二免疫球蛋白Fc區域及第二GDF15或其功能變體。在二聚體中，在第一融合多肽及第二融合多肽中，第一GDF15或其功能變體與第二GDF15或其功能變體可藉由共價鍵（例如雙硫鍵等）連接。另外，在二聚體中，視情況，第一免疫球蛋白Fc區域與第二免疫球蛋白Fc區域可藉由共價鍵（例如雙硫鍵等）或非共價鍵（例如杵與臼、靜電相互作用、疏水相互作用等）連接（見圖1）。免疫球蛋白Fc區域及GDF15或其功能變體如上文所描述，且第一免疫球蛋白Fc區域與第二免疫球蛋白Fc區域以及第一GDF15或其功能變體與第二GDF15或其功能變體可彼此相同或不同。
在一個實施例中，包括於融合多肽二聚體中的第一免疫球蛋白Fc區域及第二免疫球蛋白Fc區域以及第一GDF15或其功能變體及第二GDF15或其功能變體以及藉由其連接所形成的第一融合多肽及第二融合多肽分別為單股（鏈；例如由一個閱讀框編碼的多肽）形式，且排除其中第一免疫球蛋白Fc區域及第二免疫球蛋白Fc區域以及第一GDF15或其功能變體及第二GDF15或其功能變體以及藉由其連接所形成的第一融合多肽及第二融合多肽中的至少一者為二聚體形式（例如包括於第一融合多肽或第二融合多肽中的第一或第二免疫球蛋白Fc區域藉由2條股（2個分子）的雙硫鍵連接）及類似形式的結構。
GDF15的二聚體結構中的單體的N末端經暴露以與其他蛋白質融合，且C末端定位於其不能與其他蛋白質融合之處。因此，為形成融合多肽同時維持GDF15二聚體形式，融合夥伴（亦即免疫球蛋白Fc區域）較佳連接至GDF15的N末端。
GDF15藉由與其受體GFRAL（GDNF家族α樣受體；例如GenBank寄存編號NP_997293.2）合併而形成GDF15-GFRAL複合結構。在所述複合結構中，分別合併GDF15單體及GFRAL單體，且GDF15的N末端定位於GDF15二聚體的中間部分中。在X射線結構中未觀測到在N末端處可融合至GDF15的4個胺基酸殘基，且因此預測所述胺基酸殘基不具有特定結構。在GDF15的N末端處的14個胺基酸殘基藉由Cys7-Cys14雙硫鍵固定，且所述胺基酸殘基不參與GDF15二聚體中的單體之間的相互作用。另外，在GDF15的N末端處的14個胺基酸殘基在結構上定位於不能與GFRAL受體相互作用（結合）的距離處，且因此預期雖然在GDF15的N末端處的14個胺基酸殘基缺失，但對GDF15與GFRAL受體的結合不存在影響。
GDF15單體在分子中具有4個雙硫鍵，且在二聚體分子之間具有一個雙硫鍵。假定分子中的雙硫鍵使結構穩定，且合併Cys7-Cys14的雙硫鍵定位於單體結構的邊緣處且用以固定N末端的環形結構。因為在N末端處的14個胺基酸殘基在GFRAL受體結合中不發揮直接作用，所以若移除所述胺基酸殘基中的一或多者，則其將並不影響GDF15的功能及結構，但Cys15與Cys88形成雙硫鍵，且因此，若移除Cys15，則其可能影響GDF15的三維結構。因此，在維持GDF15的功能及結構時的可移除區域可為在N末端處的14個胺基酸（亦即在SEQ ID NO: 1中，自Ala1至Cys14的14個胺基酸中的至少一者，例如依次來自N末端的至少一者（1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14））。在一個實施例中，GDF15單體可為野生型（SEQ ID NO: 1）或其中在N末端處的14個胺基酸在野生型中缺失的形式（∆N14GDF15；SEQ ID NO: 2）。
在其中wtGDF15（SEQ ID NO: 1）或∆N14GDF15（其中在N末端處的14個胺基酸在SEQ ID NO: 1中缺失的形式）與其受體GFRAL合併的複合結構中，wt（野生型）GDF15 N末端（1個至14個胺基酸殘基）部分藉由Cys7-Cys14雙硫鍵固定，且N末端分別在左下方及右下方的方向上暴露。當在wtGDF15中移除N末端處的14個胺基酸時，N末端分別在左上方及右上方的方向上暴露。
歸因於此結構，當藉由將免疫球蛋白的Fc蛋白質與GDF15融合而形成融合蛋白質時，其中移除N末端處的14個胺基酸殘基的∆N14GDF15與Fc蛋白質的C末端可在形態上自然地連接（見圖3a）。在另一方面，在wtGDF15的情況下，N末端可定位於略微難以與Fc蛋白質合併的方向上（見圖3b）。
在其中Fc-∆N14GDF15或Fc-wtGDF15合併至GFRAL的複合結構中，GDF15及Fc為功能二聚體形式，且Fc-∆N14GDF15具有易於分別形成Fc二聚體及∆N14GDF15二聚體的結構配置。因此，在不中斷與GFRAL形成複合物的情況下進行二聚體形成的態樣中，Fc-∆N14GDF15可比Fc-wtGDF15有利。
相較於不與免疫球蛋白Fc區域融合的GDF15或其功能變體，包括於本文所提供的融合多肽或融合多肽二聚體中的GDF15或其功能變體在哺乳動物中的活體內（血液中）半衰期可增加約1.5倍或更大、約2倍或更大、約2.5倍或更大、約3倍或更大、約3.5倍或更大、約4倍或更大、約4.5倍或更大、約5倍或更大、約5.5倍或更大、約6倍或更大、約7倍或更大、約8倍或更大、約9倍或更大或約10倍。
如上文所描述，相較於不與免疫球蛋白Fc區域融合的GDF15或其功能變體，在融合多肽形式中與免疫球蛋白Fc區域融合的GDF15或其功能變體因GDF15或其功能變體的半衰期增加而具有較長投與時間間隔的優勢。 產生融合多肽
包括GDF15或其功能變體以及免疫球蛋白Fc區域的融合多肽可藉由常用化學合成方法或重組方法產生，且可能並不天然地存在。
本文中，術語「載體」意謂用以在宿主細胞中表現目標基因的表現構件，且例如可由下述者組成的族群中選出：質體載體、黏質體載體以及病毒載體，諸如噬菌體載體、腺病毒載體、反轉錄病毒載體以及腺相關病毒載體以及類似物。在一個實施例中，可用於重組載體中的載體可基於以下來製備：質體（例如pcDNA系列、pSC101、pGV1106、pACYC177、ColE1、pKT230、pME290、pBR322、pUC8/9、pUC6、pBD9、pHC79、pIJ61、pLAFR1、pHV14、pGEX系列、pET系列、pUC19等）、噬菌體（例如λgt4λB、λ-Charon、λΔz1、M13等）或病毒（例如SV40等），但不限於此。
在重組載體中，編碼融合多肽的核酸分子可以操作方式連接至啟動子。術語「以操作方式連接」意謂核酸表現調節序列（例如啟動子序列）與其他核酸序列的功能結合。調節序列可調節藉由「以操作方式連接」的其他核酸序列的轉錄及/或轉譯。
重組載體可典型地經建構為用於選殖的載體或用於表現的表現載體。作為表現載體，可使用在所屬領域中用於在植物、動物或微生物中表現外來蛋白質的常見表現載體。重組載體可藉由所屬領域中已知的各種方法來建構。
可使用真核生物作為宿主來表現重組載體。當使用真核生物作為宿主表現時，重組載體可包括待表現的核酸分子及前述啟動子、核糖體結合位點、分泌信號序列（參見韓國專利公開案第2015-0125402號），及/或除轉錄/轉譯終止子序列以外，於真核生物中操作的複製起點，諸如f1複製起點、SV40複製起點、pMB1複製起點、腺複製起點、AAV複製起點及/或BBV複製起點以及類似的複製起點，但不限於此。另外，可使用衍生自哺乳動物細胞的基因組的啟動子（例如金屬硫蛋白啟動子）或衍生自哺乳動物病毒的啟動子（例如腺病毒晚期啟動子、痘瘡病毒7.5K啟動子、SV40啟動子、巨細胞病毒啟動子、融合啟動子（KR 10-1038126或KR 10-1868139）、HSV的tk 啟動子），且可使用通常可用作分泌信號序列的所有分泌信號序列，且可使用例如揭露於韓國專利公開案第2015-0125402號中的分泌信號序列，但不限於此，且所述啟動子可包括聚腺苷酸化序列作為轉錄終止子序列。
重組細胞可藉由將重組載體引入（轉化或轉染）至適當宿主細胞中而獲得。宿主細胞可由可穩定且連續地選殖或表現重組載體的所有真核生物選出。可用作宿主的真核生物包含酵母菌（釀酒酵母菌（ Saccharomyces cerevisiae ） ）、昆蟲細胞、植物細胞以及動物細胞以及類似細胞，且例如包含小鼠（例如COP、L、C127、Sp2/0、NS-0、NS-1、At20或NIH3T3）、大鼠（例如PC12、PC12h、GH3或MtT）、倉鼠（例如BHK、CHO、GS基因缺陷CHO或DHFR基因缺陷CHO）、猴（例如COS（COS1、COS3、COS7等）、CV1或Vero）、人類（例如HeLa、HEK-293、視網膜衍生之PER-C6、衍生自二倍體纖維母細胞、骨髓瘤細胞或HepG2的細胞）、其他動物細胞（例如MDCK等）、昆蟲細胞（例如Sf9細胞、Sf21細胞、Tn-368細胞、BTI-TN-5B1-4細胞等）、融合瘤以及類似物，但不限於此。
藉由在前述適當宿主細胞中表現編碼本文中所提供的融合多肽的核酸分子，相較於未融合形式，可製備具有增強的活體內穩定性的GDF15或其功能變體，或包括其的融合多肽或融合多肽二聚體。用於製備融合多肽或融合多肽二聚體的方法可包括培養包括核酸分子的重組細胞。所述培養可在常用培養條件下執行。另外，用於製備的方法可更包括在培養之後，自培養物分離及/或純化融合多肽或融合多肽二聚體。
將核酸分子或包括核酸分子的重組載體遞送（引入）至宿主細胞中可使用所屬領域中廣泛已知的遞送方法。當宿主細胞為真核生物時，遞送方法可使用例如顯微注射、磷酸鈣沈澱、電穿孔、脂質體介導的轉染以及基因撞擊以及類似方法，但不限於此。
用於選擇經轉化（引入有重組載體）宿主細胞的方法可易於根據所屬領域中廣泛已知的方法使用由選擇標記物表現的表現型來進行。舉例而言，當選擇標記物為特異性耐抗生素基因時，可易於藉由在含有抗生素的培養基中培養來選擇引入重組載體的重組細胞。 醫療用途
提供一種用於體重減輕、飲食控制（減少餐食量）或防止、改善、緩解及/或治療代謝疾病的組成物（醫藥組成物或保健功能食品組成物），所述組成物包括由下述者組成的族群中選出的至少一者：融合多肽、融合多肽二聚體、編碼融合多肽的核酸分子、包括核酸分子的重組載體以及包括重組載體的重組細胞；及/或 提供一種體重減輕方法、一種飲食控制（減少餐食量）方法或一種用於防止、改善、緩解及/或治療代謝疾病的方法，所述方法包括向需要防止、改善、緩解及/或治療代謝疾病的個體投與醫藥學上有效劑量的由下述者組成的族群中選出的至少一者：融合多肽、融合多肽二聚體、編碼融合多肽的核酸分子、包括核酸分子的重組載體以及包括重組載體的重組細胞。
代謝疾病意謂由代謝病症引起所有疾病，且可由下述者組成的族群中選出：肥胖症、糖尿病（例如II型糖尿病）、非酒精性脂肪肝病（例如非酒精性脂肪變性肝炎（NASH）等）以及類似疾病。
如本文中所使用，醫藥學上地有效劑量意謂能夠獲得所要作用的活性成分的含量或劑量。可根據諸如調配方法、投與方法、患者的年齡、體重、性別、發病率、進食、投與時間、投與時間間隔、投與途徑、排泄速率以及反應敏感度的因素不同地規定醫藥組成物中的活性成分（由下述者組成的族群中選出的至少一者：包括GDF15或其功能變體以及免疫球蛋白Fc區域的融合多肽、融合多肽二聚體、編碼融合多肽的核酸分子、包括核酸分子的重組載體以及包括重組載體的重組細胞）的含量或劑量。舉例而言，活性成分的單次劑量可在以下範圍內：0.001毫克/公斤至1000毫克/公斤、0.01毫克/公斤至100毫克/公斤、0.01毫克/公斤至50毫克/公斤、0.01毫克/公斤至20毫克/公斤、0.01毫克/公斤至10毫克/公斤、0.01毫克/公斤至5毫克/公斤、0.1毫克/公斤至100毫克/公斤、0.1毫克/公斤至50毫克/公斤、0.1毫克/公斤至20毫克/公斤、0.1毫克/公斤至10毫克/公斤、0.1毫克/公斤至5毫克/公斤、1毫克/公斤至100毫克/公斤、1毫克/公斤至50毫克/公斤、1毫克/公斤至20毫克/公斤、1毫克/公斤至10毫克/公斤或1毫克/公斤至5毫克/公斤，但不限於此。在其他實施例中，按總醫藥組成物重量計，醫藥組成物中的活性成分的含量可為0.01重量%至99.9重量%、0.01重量%至90重量%、0.01重量%至80重量%、0.01重量%至70重量%、0.01重量%至60重量%、0.01重量%至50重量%、0.01重量%至40重量%、0.01重量%至30重量%、1重量%至99.9重量%、1重量%至90重量%、1重量%至80重量%、1重量%至70重量%、1重量%至60重量%、1重量%至50重量%、1重量%至40重量%、1重量%至30重量%、5重量%至99.9重量%、5重量%至90重量%、5重量%至80重量%、5重量%至70重量%、5重量%至60重量%、5重量%至50重量%、5重量%至40重量%、5重量%至30重量%、10重量%至99.9重量%、10重量%至90重量%、10重量%至80重量%、10重量%至70重量%、10重量%至60重量%、10重量%至50重量%、10重量%至40重量%或10重量%至30重量%。
本文中提供的活性成分或包括所述活性成分的醫藥組成物的投與時間間隔（2個相鄰劑量之間的時間間隔）可根據活性成分的濃度或狀態（變化等）或患者的病況或症狀以及類似者來調整，且例如所述投與時間間隔可為2天或大於2天、3天或大於3天、4天或大於4天、5天或大於5天、6天或大於6天、7天或大於7天、8天或大於8天、9天或大於9天、10天或大於10天、2週或大於2週、3週或大於3週、4週或大於4週、6週或大於6週、8週或大於8週、10週或大於10週或12週或大於12週。最大投與時間間隔可為約2週、約3週、約4週、約1個月、約2個月或約3個月，但不限於此，且可根據活性成分的濃度或狀態（變化等）或患者的病況或症狀以及類似者來增大或減小所述最大投與時間間隔。在一個特定實施例中，可將投與時間間隔適當地規定於約1週至約3個月內。
另外，除所述活性成分以外，醫藥組成物可更包括醫藥學上可接受的載劑。載劑常用於調配包括蛋白質、核酸或細胞的藥物，且所述載劑可為由下述者組成的族群中選出的至少一者：乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、澱粉、阿拉伯樹膠、磷酸鈣、褐藻酸鹽、明膠、矽酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯啶酮、纖維素、水、糖漿、甲基纖維素、甲基羥基苯甲酸鹽、丙基羥基苯甲酸鹽、滑石、硬脂酸鎂、礦物油以及類似物，但不限於此。醫藥組成物可更包括由下述者組成的族群中選出的至少一者：常用於製備醫藥組成物的稀釋劑、賦形劑、潤滑劑、潤濕劑、甜味劑、調味劑、乳化劑、懸浮劑、防腐劑以及類似物。
醫藥組成物的投與個體可為哺乳動物，包含諸如人類、猴等靈長類動物，諸如小鼠、大鼠等嚙齒動物以及類似哺乳動物，或由其衍生的細胞、組織、細胞培養物或組織培養物。
醫藥組成物可藉由經口投與或非經腸投與來投與，或藉由與細胞、組織或體液接觸來投與。特定言之，在非經腸投與的情況下，可藉由皮下注射、肌肉內注射、靜脈內注射、腹膜內注射、內皮投與、局部投與、鼻內投與、肺內投與以及直腸投與以及類似方式來投與醫藥組成物。在經口投與的情況下，由於蛋白質或肽經消化，因而經口組成物應經調配以包覆活性劑或防止其在胃中分解。
另外，醫藥組成物可以溶液、懸浮液、糖漿或乳液形式在油或含水介質中調配，或以提取物、粉末、顆粒、錠劑或膠囊或類似物的形式調配，且可更包括用於調配的分散劑或穩定劑。
另一實施例提供一種增加GDF15或其功能變體的活體內持續時間的方法，所述方法包括將GDF15或其功能變體與免疫球蛋白Fc區域融合（或連接或合併）。在一個特定實施例中，融合可包括用或不用連接子將免疫球蛋白Fc區域融合（或連接或合併）至GDF15或其功能變體的N末端。另一實施例提供一種降低GDF15、免疫球蛋白Fc區域或包括其兩者的融合多肽的免疫原性的方法，所述方法包括用可撓性連接子將GDF15或其功能變體與免疫球蛋白Fc區域融合（或連接或合併）。融合（或連接或合併）的步驟可在活體外進行。 [有利效果]
相較於GDF15或其功能變體不與免疫球蛋白Fc區域融合的情況，本發明中提供的與免疫球蛋白Fc區域融合的GDF15或其功能變體在投與體內時具有更長持續時間，且因此可增加投與時間間隔，且藉此可減小劑量，且因此就投與便利性及/或經濟態樣而言，其具有有利效果，且其亦具有極佳藥理學作用，且因此其可有效地應用於需要GDF15或其功能變體的治療的領域。
下文中，將藉由以下實例更詳細地描述本發明。然而，此等實例僅意欲示出本發明，但本發明的範圍不受此等實例限制。實例 1 ：製備融合多肽 1.1. 選殖 且培養編碼融合多肽的基因
製備IgG1-GDF(CRL)、HIgG1-GDF(CRL)、IgG4-GDF、HIgG4-GDF、IgG4-GDF(CRL)以及HIgG4-GDF(CRL)（參見圖1），以上各者為與下述者融合的融合多肽：成熟GDF15（由GDF或GDF15表示；SEQ ID NO: 1）或具有包括或不包括鉸鏈的免疫球蛋白Fc（IgG1-Fc（不包括鉸鏈：SEQ ID NO: 3）；HIgG1-Fc（包括鉸鏈；[SEQ ID NO: 4]至[SEQ ID NO: 3]），突變IgG4-Fc（不包括鉸鏈；SEQ ID NO:7）或突變HIgG4-Fc（包括鉸鏈：[SEQ ID NO: 12]至[SEQ ID NO:7]））的目標多肽的GDF15變體（由GDF(CRL)表示；在N末端處的14個胺基酸缺失：SEQ ID NO: 2）。包括於融合多肽中的各部分的胺基酸序列概述於下表2、表3以及表4中。 [表2] IgG1-GDF(CRL)（不包括鉸鏈）與HIgG1-GDF(CRL)（包括鉸鏈）（自N末端至C末端的方向）
  胺基酸序列 SEQ ID NO:
信號肽 MHRPEAMLLL LTLALLGGPT WA 17
IgG1 Fc 鉸鏈 DKTHTCPPCP 4
CH2-CH3 APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSRDELTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPG 3
連接子 GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS 18
GDF(CRL) CRLHTVRASL EDLGWADWVL SPREVQVTMC IGACPSQFRA ANMHAQIKTS LHRLKPDTVP APCCVPASYN PMVLIQKTDT GVSLQTYDDL LAKDCHCI 2
[表3] IgG4-GDF15（不包括鉸鏈）與HIgG4-GDF15（包括鉸鏈）（自N末端至C末端的方向）
  胺基酸序列 SEQ ID NO:
信號肽 MHRPEAMLLL LTLALLGGPT WA 17
突變IgG4 Fc 鉸鏈 ESKYGPPCPP CP 12
CH2-CH3 APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLG 7
連接子 GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS 18
GDF15 ARNGDHCPLG PGRCCRLHTV RASLEDLGWA DWVLSPREVQ VTMCIGACPS QFRAANMHAQ IKTSLHRLKP DTVPAPCCVP ASYNPMVLIQ KTDTGVSLQT YDDLLAKDCH CI 1
[表4] IgG4-GDF(CRL)（不包括鉸鏈）與HIgG4-GDF(CRL)（包括鉸鏈）（自N末端至C末端的方向）
  胺基酸序列 SEQ ID NO:
信號肽 MHRPEAMLLL LTLALLGGPT WA 17
突變IgG4 Fc 鉸鏈 ESKYGPPCPP CP 12
CH2-CH3 APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLG 7
連接子 GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS 18
GDF15(CRL) CRLHTVRASL EDLGWADWVL SPREVQVTMC IGACPSQFRA ANMHAQIKTS LHRLKPDTVP APCCVPASYN PMVLIQKTDT GVSLQTYDDL LAKDCHCI 2
1.1.1 製備重組表現載體 1.1.1.1. 成熟 GDF15
為獲得編碼成熟GDF15的基因（參考UniprotKB Q99968的胺基酸），在Bioneer中合成編碼成熟GDF15（SEQ ID NO: 14）的基因。
Figure 02_image001
（帶下劃線部分為GDF(CRL)）1.1.1.2. IgG1-Fc
使用藉由包括編碼人類IgG1及IgG1 Fc的核心鉸鏈的基因的質體藉由PCR來獲得編碼包括鉸鏈的人類IgG1 Fc的基因或編碼不包括鉸鏈的人類IgG1 Fc的基因。
Figure 02_image003
（帶下劃線部分為編碼IgG1核心鉸鏈的基因）1.1.1.3. IgG4-Fc
使用藉由包括編碼人類IgG4及IgG4 Fc的鉸鏈的基因的質體藉由PCR來獲得編碼包括鉸鏈的人類IgG4 Fc的基因或編碼不包括鉸鏈的人類IgG4 Fc的基因。
Figure 02_image005
（帶下劃線部分為編碼IgG4鉸鏈的基因）1.1.1.4. 製備表現載體
藉由BamHI及NotI切割作為pcDNA3.1(+)（英傑（Invitrogen），目錄號V790-20）的變體的pDHDD-D1G1（包括KR10-1868139B1的啟動子），且將基因（成熟GDF15、IgG1-Fc、IgG4-Fc）與其合併以插入具有以下結構（見圖4）的基因，藉此製備各重組載體。 pHIgG1-GDF(CRL) 『(N末端)-[BamHI限制位點-信號肽(SEQ ID NO: 17)-IgG1核心鉸鏈(SEQ ID NO: 4)-IgG1 CH2-CH3 (SEQ ID NO: 3)-GS連接子(SEQ ID NO: 18)-GDF(CRL)(SEQ ID NO: 2)-NotI限制位點]-(C末端)』 pIgG1-GDF(CRL) 『(N末端)-[BamHI限制位點-信號肽(SEQ ID NO: 17)-IgG1 CH2-CH3 (SEQ ID NO: 3)-GS連接子(SEQ ID NO: 18)-GDF(CRL)(SEQ ID NO: 2)-NotI限制位點]-(C末端)』 pHIgG4-GDF15 『(N末端)-[BamHI限制位點-信號肽(SEQ ID NO: 17)-IgG4鉸鏈(SEQ ID NO: 12)-IgG4 CH2-CH3 (SEQ ID NO: 7)-GS連接子(SEQ ID NO: 18)-GDF15(SEQ ID NO: 1)-NotI限制位點]-(C末端)』 pIgG4-GDF15 『(N末端)-[BamHI限制位點-信號肽(SEQ ID NO: 17)-IgG4 CH2-CH3 (SEQ ID NO: 7)-GS連接子(SEQ ID NO: 18)-GDF15(SEQ ID NO: 1)-NotI限制位點]-(C末端)』 pHIgG4-GDF(CRL) 『(N末端)-[BamHI限制位點-信號肽(SEQ ID NO: 17)-IgG4鉸鏈(SEQ ID NO: 12)-IgG4 CH2-CH3 (SEQ ID NO: 7)-GS連接子(SEQ ID NO: 18)-GDF(CRL)(SEQ ID NO: 2)-NotI限制位點]-(C末端)』 pIgG4-GDF(CRL) 『(N末端)-[BamHI限制位點-信號肽(SEQ ID NO: 17)-IgG4 CH2-CH3 (SEQ ID NO: 7)-GS連接子(SEQ ID NO: 18)-GDF(CRL)(SEQ ID NO: 2)-NotI限制位點]-(C末端)』1.1.2. 培養編碼融合多肽的基因
將所製備重組表現載體pHIgG1-GDF(CRL)、pIgG1-GDF(CRL)、pHIgG4-GDF(CRL)、pIgG4-GDF(CRL)、pHIgG4-GDF以及pIgG4-GDF引入至ExpiCHO-STM 細胞（賽默飛世爾科技（Thermo Fisher Scientific））中，且在ExpiCHO表現培養基（賽默飛世爾科技；400 mL）中培養12天（分批飼喂培養；第1天與第5天飼喂），以表現融合多肽HIgG1-GDF(CRL)、IgG1-GDF(CRL)、HIgG4-GDF(CRL)、IgG4-GDF(CRL)、HIgG4-GDF以及IgG4-GDF。1.2. 純化融合多肽
使用蛋白質A親和性層析自實施例1.1中製備的細胞培養物中純化融合多肽。
首先，用0.22微米過濾器過濾細胞移除融合多肽的培養液。其中封裝MabSelect SuReTM pcc（GE醫療生命科學（GE Healthcare Life Sciences））樹脂的管柱經配備至AKTATM Pure（GE醫療生命科學），且使磷酸鹽緩衝鹽水（PBS，10 mM磷酸鈉，150 mM NaCl，pH 7.4）流動以平衡管柱。在注射經0.22微米過濾器過濾的培養液以平衡管柱之後，再次使PBS流動以洗滌管柱。在完成管柱的洗滌之後，使溶離緩衝液（0.1 M檸檬酸鈉pH 3.5）流動至管柱以溶離目標融合多肽。將1M Tris pH 8.5立即添加至溶離溶液中以便使其為中性pH。在溶離級分當中，將具有高濃度融合多肽及高純度的級分收集且冷凍儲存。
對於動物實驗，使用Amicon超濾器裝置（MWCO 10K，默克公司（Merck））及離心機，用PBS或20 mM Tris pH 8.0、150 mM NaCl濃縮包括融合多肽的溶離級分樣本，且進行緩衝液交換。
藉由在UV光譜光度計（G113A，安捷倫科技（Agilent Technologies））中量測在280奈米及340奈米下的吸光度，且藉由以下等式計算蛋白質濃度來執行融合多肽的定量分析。使用用胺基酸序列在理論上計算的值（表5）作為各材料的消光係數。
Figure 02_image007
*消光係數（0.1%）：在280奈米下的理論吸光度，假定蛋白質濃度為0.1%（1公克/升），且一級序列上的所有半胱胺酸經氧化以形成雙硫鍵，其藉由ProtParam工具（https://web.expasy.org/protparam/）來計算。 [表5] 融合多肽的消光係數
樣本名稱 消光係數(0.1%，1毫克/毫升)
IgG1-GDF (CRL) 1.317
HIgG1-GDF (CRL) 1.22
IgG4-GDF (CRL) 1.334
IgG4-GDF 1.287
實例 2. 融合多肽的藥理學作用 （ 活體內 ） 2.1. 測試方法
在小鼠（C57BL/6J，6週，雄性，100隻小鼠；RaonBio）中測試在實例1中產生及純化的融合多肽的藥理學作用。
在此實例中，使用DI0小鼠模型（小鼠，C57BL/6J-DIO，雄性，100隻小鼠，14週（飼喂肥胖性飼料8週）），其中向C57BL/6J小鼠饋送高脂膳食8週以誘導肥胖症。DI0小鼠模型呈現諸如高脂質血症、抗胰島素症、高血糖症以及類似病症的2型糖尿病的臨床特性，且因此所述小鼠模型為廣泛用於評估糖尿病及抗胰島素症的改善的動物模型，且對諸如肥胖症、糖尿病以及高脂質血症以及類似疾病的代謝疾病的研究相當的基線資料積累較多，且因此其適用於此實例的藥理學作用測試，且因此選擇此模型。
對飼喂肥胖性飼料8週的小鼠模型進行2週檢測及純化時段，且在此時段期間，一天觀測一次一般症狀以檢查健康狀況及其是否適用於進行所述實驗，從而選擇健康的動物。在純化時段期間，在採集時用紅色油性筆在動物尾部上標記個體（尾部標記），且在育種箱中，在檢測及純化時段期間附著暫時的個體識別卡（測試名稱、個體數目及到達時間）。在將組分離時，用黑色油性筆在動物尾部上標記個體，且將個體識別卡（測試名稱、組資訊、個體數目、性別、到達時間、投與時段）附著至各籠。
為藉由皮下投與測試材料（融合多肽）使實驗動物的應激性降至最低，在投與測試材料之前3天使用1毫升注射器以200微升/頭部向所有動物皮下投與無菌蒸餾生理鹽水，以執行用於皮下投與的預適應訓練。
對於在檢測及純化時段期間未發現異常的健康動物，在完成純化時段之後，對所有個體量測體重及攝食量。
量測體重及攝食量，且執行組分離以使得各組之間基於體重的兩個量測值的平均值相似。在組分離之後當天開始投與測試材料。在組分離結束之後自測試系統排除未選擇的剩餘動物。
向C57BL/6J-DIO飼喂高脂肪飲食（肥胖性飼料；高脂肪飲食（High fat diet；HFD））的資訊如下： 5.24千卡/公克、脂肪60重量%、蛋白質20重量%以及來源於碳水化合物的卡路里20重量%；美國飲食研究公司（Research Diet Inc., U.S.A.）；產品編號高脂肪飲食（脂肪60千卡%，D12492）。
以自由飼喂（在純化及測試時段期間飼喂）方式飼喂飼料。
作為飲用方式，將自來水用濾水流動滅菌器過濾，且隨後用紫外光輻照，且使用聚碳酸酯飲用水瓶（250毫升）將其自由消耗。2.1.1.HIgG1-GDF (CRL) 及IgG1-GDF (CRL)
在組分離之後當天進行測試材料（HIgG1-GDF(CRL)及IgG1-GDF(CRL)）以及對照材料GDF15（R&D系統）的投與，且投與時間為每天上午9點。所有對照材料及測試材料均皮下投與。根據臨床既定投與途徑，將對照材料及測試材料的投與途徑選擇為皮下途徑。
所有對照材料及測試材料的劑量為5毫升/公斤，且基於最近所量測體重來計算個體劑量，且在測試開始日使用可拋棄式注射器（1毫升）皮下投與一次所述材料。在測試開始日僅投與一次測試材料。為比較準備有對照材料GDF15的對照組及投與GDF15的比較組，所述組經一天投與一次持續5天（總共5次），且所有投與自上午9點進行。
測試組組成物及投與劑量以及類似資料概述於下表6中： [表6] IgG1-GDF(CRL)融合多肽投與組組成物
高脂肪飲食 測試材料 投與途徑 投與劑量(奈莫耳/公斤) 投與體積(毫升/公斤) 動物數目
X 媒劑 皮下 - 5 5
O 媒劑，每天一次 皮下 - 5 5
O 媒劑，每週一次 皮下 - 5 5
O GDF15 皮下 2.86 5 3
O IgG1-GDF (CRL) 皮下 1 5 5
O IgG1-GDF (CRL) 皮下 10 5 5
O HIgG1-GDF (CRL) 皮下 1 5 5
O HIgG1-GDF (CRL) 皮下 10 5 5
將測試組的觀測、量測以及檢查時間表設定為第0天開始投與，且將自投與開始7天設定為1週投與。
檢查時間表概述於表7中： [表7] 檢查時間表
觀測項目 純化時段（週） 時段(天)
1 2 0 1 2 3 4 5 6 7
飼喂高脂肪飼料 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●
經口及皮下投與適應   ●                
投與     ●              
體重量測   ● ● ● ● ● ● ● ● ●
攝食量量測     ● ● ● ● ● ● ● ●
對於所有動物，觀測一般臨床症狀一天一次，且確證臨死及已死動物的存在一天兩次，且此觀測自投與1天開始進行至投與結束。在觀測期間，僅將存在異常症狀的情況下，將所述異常症狀記錄於記錄表上。
在開始投與測試材料當天（在投與之前）量測各小鼠的體重，且隨後每天量測體重（在最大時量測9天）。基於最近所量測體重來確定測試材料的劑量。
另外，在向小鼠投與測試材料之後，每天量測攝食量，且使用電子秤量測各育種箱的飼喂量，且隨後量測剩餘量以計算一天的攝食量。自量測中排除重度進食的個體。
在此實例中獲得的所有實驗結果由平均值±標準差表示且使用Prism5（版本5.01）來檢查。對於所有資料，執行單因素方差分析（one-way analysis of variance；ANOVA），且當觀測到顯著性時，進行鄧尼特（Dunnett's）測試以尋找與對照組具有顯著差異的測試組（顯著水準：5%及1%兩側，0.1%）。2.1.2. IgG4-GDF 及 IgG4-GDF (CRL)
皮下投與測試材料（IgG4-GDF IgG4-GDF(CRL)）及對照材料索馬魯肽（Semaglutide）（Bachem）。所有對照材料及測試材料的劑量為5毫升/公斤，且基於最近所量測體重來計算個體劑量，且在測試開始日使用可拋棄式注射器（1毫升）皮下投與一次所述材料。在測試開始日僅投與一次測試材料，且為了比較，準備投與對照材料索馬魯肽的對照組。對於投與索馬魯肽的比較組，每天投與索馬魯肽一天一次。所有投與自上午9點進行。
測試組組成物及投與劑量以及類似資料概述於下表8中： [表8] IgG4-GDF15融合多肽投與組組成物
高脂肪飲食 測試材料 投與途徑 投與劑量(奈莫耳/公斤) 投與體積(毫升/公斤) 動物數目
O 媒劑，每週一次 皮下 - 5 5
O 索馬魯肽，每天一次 皮下 3 5 5
O IgG4-GDF 皮下 1 5 5
O IgG4-GDF 皮下 10 5 5
O IgG4-GDF (CRL) 皮下 1 5 5
O IgG4-GDF (CRL) 皮下 10 5 5
將測試組的觀測、量測以及檢查時間表設定為第0天開始投與，且其與2.1.1相同地進行。
在開始投與測試材料當天（在投與之前）量測各小鼠的體重，且隨後每天量測體重（在最大時量測19天）。基於最近所量測體重來確定測試材料的劑量。
另外，在向小鼠投與測試材料之後，每天量測攝食量，且使用電子秤量測各育種箱的飼喂量，且隨後量測剩餘量以計算一天的攝食量。自量測中排除重度進食的個體。2.2. 體重減輕測試結果 2.2.1. HIgG1-GDF (CRL) 及 IgG1-GDF(CRL)
實例2.1.1中量測的體重變化展示於圖5及圖6以及表9中（體重（組，初始%））。 [表9]
組 天數 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
精簡媒劑對照 平均值 100 102 101 101 101 101 101 101 101 102
(每日注射) S.E. 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1
DIO媒劑對照 平均值 100 100 100 100 100 100 101 101 101 101
(每日注射) S.E. 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0
DIO媒劑對照 平均值 100 100 99 100 100 100 101 101 102 102
(單次注射) S.E. 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1
GDF15，2.86奈莫耳/公斤 平均值 100 99 98 97 96 95 95 95 96 97
(每日注射) S.E. 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2
IgG1-GDF(CRL)，1奈莫耳/公斤 平均值 100 99 98 96 96 96 95 95 95 95
(單次注射) S.E. 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1
IgG1-GDF(CRL)，10奈莫耳/公斤 平均值 100 98 97 95 94 93 91 90 90 90
(單次注射) S.E. 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1
HIgG1-GDF(CRL)，1奈莫耳/公斤 平均值 100 100 98 98 97 96 97 96 96 97
(單次注射) S.E. 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1
HIgG1-GDF(CRL)，10奈莫耳/公斤 平均值 100 99 98 97 95 95 94 93 93 93
(單次注射) S.E. 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1
（在表9中，第0天：第一次投與對照材料GDF15，單次投與IgG1-GDF(CRL)融合多肽；精簡組：無高脂肪飲食的組）
圖5及表9藉由與陰性對照組（媒劑投與組）及陽性對照組（GDF15每日投與組）進行比較來展示展示在單次投與融合蛋白質IgG1-GDF之後的體重變化。另外，圖6為提取及展示展示圖5的結果當中的7天時的結果的圖式。
如結果中所示，可確證在陰性對照組（媒劑投與組）的情況下，存在少量體重變化，而在GDF15每日投與組（自第5天停止投與）的情況下，體重減輕作用自第6天（停止投與之後第一天）消失。另一方面，可確證在其中GDF15(CRL)與包括鉸鏈的IgG1或Fc融合的融合多肽的情況下，體重減輕作用在第0天單次投與之後立即顯現，且體重減輕作用未減小，且在整個測試時段（9天）期間始終顯現，且隨時間流逝，濃度體重減輕作用增加，且體重減輕作用為濃度依賴型的。融合多肽的體重減輕作用可謂與在整個測試時段期間投與GDF15一天一次時相當。2.2.2. IgG4-GDF 及 IgG4-GDF(CRL)
在實例2.1.2中量測的體重變化展示於圖7及表10中（體重（組，初始%））。 [表10]
組 天數 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
DIO媒劑對照 (單次注射) 平均值 100 100 100 99 100 100 100 100 101 101
S.E. 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1
索馬魯肽，3奈莫耳/公斤 (每日注射) 平均值 100 94 91 90 87 87 85 86 83 85
S.E. 0 0 1 2 2 3 3 3 3 3
IgG4-GDF15，1奈莫耳/公斤 (單次注射) 平均值 100 99 97 96 95 93 93 92 92 91
S.E. 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1
IgG4-GDF15，10奈莫耳/公斤 (單次注射) 平均值 100 98 97 96 94 93 93 92 91 90
S.E. 0 0 1 1 1 1 1 1 2 2
IgG4-GDF(CRL)，1奈莫耳/公斤 (單次注射) 平均值 100 99 98 97 96 95 94 93 92 92
S.E. 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1
IgG4-GDF(CRL)，10奈莫耳/公斤 (單次注射) 平均值 100 98 97 95 94 92 91 90 88 87
S.E. 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1
組 日 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
DIO媒劑對照 (單次注射) 平均值 102 102 103 104 104 104 105 105 105 105
S.E. 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1
索馬魯肽，3奈莫耳/公斤 (每日注射) 平均值 84 82 81 82 81 79 79 78 77 77
S.E. 3 3 3 3 3 2 2 2 2 1
IgG4-GDF15，1奈莫耳/公斤 (單次注射) 平均值 91 91 93 94 94 94 95 96 96 96
S.E. 1 1 1 1 1 1 1 2 1 2
IgG4-GDF15，10奈莫耳/公斤 (單次注射) 平均值 90 90 91 92 92 92 92 93 94 94
S.E. 2 1 2 2 2 2 2 2 2 2
IgG4-GDF(CRL)，1奈莫耳/公斤 (單次注射) 平均值 91 91 91 91 91 91 91 92 92 92
S.E. 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2
IgG4-GDF(CRL)，10奈莫耳/公斤 (單次注射) 平均值 85 85 84 83 83 82 83 84 84 85
S.E. 1 1 1 1 2 2 2 2 3 2
（在表10中，第0天：第一次投與對照材料（索馬魯肽）及測試材料；每天投與對照材料；投與一次測試材料）
圖7及圖8以及表10藉由與陰性對照組（媒劑投與組）及陽性對照組（索馬魯肽每日投與組）進行比較來展示在單次投與融合蛋白質IgG4-GDF IgG4-GDF(CRL)之後的體重變化。另外，圖8為提取及展示圖7的結果當中的7天及14天時的結果的圖式。
如結果中所示，可確證在陰性對照組（媒劑投與組）的情況下，體重略微增加，而在陽性對照組（索馬魯肽每日投與組）的情況下，體重減輕為恆定的。當投與一次IgG4-GDF15時，無論劑量如何，體重減輕作用均持續至9天。另一方面，可確證當投與一次1奈莫耳/公斤的IgG4-GDF(CRL)時，體重減輕作用恆定地顯現至10天，且當投與一次10奈莫耳/公斤時，體重減輕作用恆定地顯現至15天，且隨時間流逝，濃度體重減輕作用增加，且體重減輕作用為濃度依賴型的。另外，經確證相較於具有包括鉸鏈的IgG4的Fc（突變）的GDF(CRL)融合多肽，具有不帶有鉸鏈的IgG4的Fc（突變）的GDF(CRL)融合多肽在相同劑量下具有極佳的體重減輕作用。此IgG4 Fc融合多肽的體重減輕作用可謂與在整個測試時段期間投與索馬魯肽一天一次時相當。2.3. 飲食攝入測試結果 2.3.1 .HIgG1-GDF(CRL) 及 IgG1-GDF(CRL)
在實例2.1.1中量測的攝食量變化分別展示於表11及圖9中（6天的累計攝入）。 [表11]
組 日 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
精簡媒劑對照 平均值 4.5 4.6 4.6 4.3 4.4 4.6 4.2 4.5 3.9 4.7
(每日注射) S.E. 0.2 0.2 0.1 0.2 0.1 0.3 0.2 0.2 0.1 0.3
DIO媒劑對照 平均值 2.8 2.8 3.1 3.0 3.1 2.9 3.0 2.9 2.9 3.3
(每日注射) S.E. 0.3 0.2 0.2 0.3 0.3 0.2 0.3 0.2 0.1 0.2
DIO媒劑對照 平均值 3.1 2.9 3.1 3.2 3.3 3.2 3.3 3.2 3.0 3.5
(單次注射) S.E. 0.1 0.2 0.2 0.2 0.2 0.1 0.1 0.1 0.1 0.2
GDF15，2.86奈莫耳/公斤 平均值 2.8 2.4 2.7 2.4 2.5 2.6 2.7 3.0 3.3 3.5
(每日注射) S.E. 0.4 0.3 0.2 0.4 0.2 0.3 0.2 0.3 0.2 0.3
IgG1-GDF(CRL)，1奈莫耳/公斤 平均值 3.0 2.1 2.2 2.2 2.6 2.6 2.6 2.8 2.7 3.0
(單次注射) S.E. 0.2 0.2 0.1 0.1 0.2 0.1 0.0 0.1 0.1 0.3
IgG1-GDF(CRL)，10奈莫耳/公斤 平均值 2.7 2.0 2.5 2.0 1.9 1.9 2.1 2.1 2.3 2.8
(單次注射) S.E. 0.3 0.1 0.1 0.3 0.2 0.2 0.2 0.1 0.1 0.3
HIgG1-GDF(CRL)，1奈莫耳/公斤 平均值 3.0 2.4 2.4 2.5 2.7 2.6 2.9 2.7 2.9 3.0
(單次注射) S.E. 0.2 0.1 0.1 0.0 0.1 0.0 0.1 0.1 0.1 0.1
HIgG1-GDF(CRL)，10奈莫耳/公斤 平均值 3.8 2.2 2.2 2.3 2.4 2.4 2.3 2.4 2.9 3.3
(單次注射) S.E. 0.5 0.1 0.1 0.1 0.2 0.1 0.1 0.1 0.3 0.3
如結果中所示，可確證相較於陰性對照（媒劑投與組）投與組，其中GDF(CRL)與包括鉸鏈的IgG1 Fc或不包括鉸鏈的IgG1 Fc融合的融合多肽投與組在測試時段（9天）期間顯現攝食量減少作用，且攝食量減少作用為濃度依賴型的。融合多肽的此攝食量減少作用可謂與整個測試時段期間投與GDF15一天一次時相當。2.3.2. IgG4-GDF 及 IgG4-GDF(CRL)
在實例2.1.2中量測的攝食量變化展示於表12及圖10中（7天、14天以及19天的累計攝入）。 [表12]
組 天數 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
DIO媒劑對照 (單次注射) 平均值 3.3 2.7 3.0 3.0 3.1 3.5 3.0 3.5 3.3 3.4
S.E. 0.1 0.1 0.2 0.1 0.1 0.2 0.2 0.1 0.1 0.2
索馬魯肽，3奈莫耳/公斤 (每日注射) 平均值 3.7 2.1 3.3 2.8 2.3 2.9 2.7 3.2 2.4 3.7
S.E. 0.3 0.7 1.4 0.6 0.4 0.9 0.6 0.3 0.4 0.1
IgG4-GDF15，1奈莫耳/公斤 (單次注射) 平均值 3.0 1.9 1.9 2.1 2.0 2.0 2.1 2.4 2.4 2.5
S.E. 0.1 0.1 0.1 0.2 0.2 0.1 0.1 0.2 0.2 0.2
IgG4-GDF15，10奈莫耳/公斤 (單次注射) 平均值 3.0 1.7 2.0 2.0 2.1 2.2 2.4 2.4 2.2 2.7
S.E. 0.1 0.1 0.3 0.2 0.2 0.3 0.2 0.2 0.2 0.2
IgG4-GDF(CRL)，1奈莫耳/公斤 (單次注射) 平均值 3.3 2.0 2.6 2.7 2.4 2.7 2.3 2.5 2.5 2.8
S.E. 0.2 0.1 0.2 0.2 0.1 0.1 0.2 0.1 0.2 0.1
IgG4-GDF(CRL)，10奈莫耳/公斤 (單次注射) 平均值 3.1 1.5 2.3 2.4 2.4 2.3 2.3 2.0 2.3 2.4
S.E. 0.2 0.3 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.1 0.2 0.3
組 天數 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
DIO媒劑對照 (單次注射) 平均值 3.0 3.4 3.2 3.5 3.1 3.3 3.1 3.2 3.3 3.3
S.E. 0.2 0.1 0.2 0.1 0.1 0.2 0.1 0.1 0.1 0.1
索馬魯肽，3奈莫耳/公斤 (單次注射) 平均值 2.7 2.5 2.4 3.0 2.5 2.1 2.5 2.0 2.2 3.7
S.E. 0.4 0.4 0.3 0.4 0.3 0.3 0.2 0.2 0.2 0.3
IgG4-GDF15，1奈莫耳/公斤 (單次注射) 平均值 2.7 3.1 3.2 3.7 3.0 3.1 3.1 3.1 3.1 3.0
S.E. 0.1 0.0 0.0 0.1 0.1 0.3 0.2 0.3 0.1 0.1
IgG4-GDF15，10奈莫耳/公斤 (單次注射) 平均值 3.1 3.8 3.3 3.7 3.4 3.6 3.1 3.5 3.3 3.0
S.E. 0.3 0.7 0.5 0.5 0.4 0.6 0.2 0.1 0.1 0.1
IgG4-GDF(CRL)，1奈莫耳/公斤 (單次注射) 平均值 2.4 2.8 2.6 3.0 2.8 2.9 3.1 3.3 3.0 3.3
S.E. 0.1 0.1 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
IgG4-GDF(CRL)，10奈莫耳/公斤 (單次注射) 平均值 2.1 2.5 2.3 2.5 2.6 2.6 3.0 3.4 3.3 3.1
S.E. 0.1 0.2 0.3 0.2 0.4 0.2 0.3 0.3 0.3 0.2
如結果中所示，可確證相較於陰性對照（媒劑投與組）投與組，其中GDF15或GDF(CRL)與不包括鉸鏈的IgG4（突變）融合的融合多肽投與組在測試時段（19天）期間顯現攝食量減少作用。融合多肽的此攝食量減少作用可謂與整個測試時段期間投與索馬魯肽一天一次時相當。在比較10奈莫耳/公斤的其中GDF15或GDF(CRL)與不包括鉸鏈IgG4 Fc（突變）融合的融合多肽的投與組時，在全長GDF15-融合的融合多肽投與組的情況下，飲食抑制能力維持約10天，且在GDF(CRL)-融合的融合多肽投與組的情況下，飲食抑制能力維持約2週。換言之，經確證相較於全長GDF15融合多肽，GDF(CRL)融合多肽在10奈莫耳/公斤劑量下具有少量極佳的體重減輕作用。實例 3. 融合多肽 （ IgG4-GDF 或 IgG4-GDF(CRL) ） 的藥力學測試 3.1. 製備測試組及對照組血清
為評估當向大鼠皮下投與各多肽時的藥力學特性，以2毫克/公斤的量向SD大鼠（Koatech，雄性，7週，約250公克；各組n=3；測試組）分別皮下投與多肽IgG4-GDF或多肽IgG4-GDF(CRL)，且在固定時間處，經由尾部靜脈收集約200微升血液。在投與融合多肽之前、在投與之後的1小時、2小時、4小時、8小時、24小時、48小時、72小時、96小時、168小時、240小時以及336小時內進行血液收集。作為比較藥力學特性的對照組，藉由與上文用以準備GDF15投與組相同的方法以2毫克/公斤的量皮下投與GDF15（R&D系統）。
在如上文向SD大鼠投與之後，將以時間點收集的血液離心以獲得血清，且使用人類GDF15免疫檢定（SGD150，R&D系統）執行ELISA，以對各多肽量測隨時間推移在血清中的濃度。使用此等資料，使用針對PK分析的軟體（WinNonlin（Certara L.P.）等人）獲得包含AUC（曲線下面積）的參數的值。3.2 藥力學測試結果
所獲得的融合多肽藥力學參數展示於表13中，且融合多肽隨時間推移的濃度變化展示於圖11中： [表13]
PK參數 第1組 第2組 第3組
GDF15 IgG4-GDF IgG4-GDF(CRL)
Cmax (ug/mL) 0.443 10.6 9.73
Tmax (hr) 1 96 48
AUClast (ug·hr/mL) 4.86 2144 2004
AUCinf (ug·hr/mL) 4.88 2854 2593
t1/2 (小時) 19.0 101 114
AUCextp (%) 0.463 14.6 18.2
（Cmax ：最大血液濃度，Tmax ：達至最大血液濃度的時間，AUCinf ：藉由自最後可量測血液收集時間至無限時間推斷所計算的血液濃度-時間曲線下面積，AUClast ：在最後可量測血液收集時間的血液濃度-時間曲線下面積，T1/2 ：消除半衰期，AUCExtp （%）：[(AUCinf -AUClast )/AUCinf ]*100）
如結果中所示，可確證與GDF15（半衰期：19小時）相比，在IgG4-GDF15（半衰期：101小時）及IgG4-GDF(CRL)（半衰期：114小時）融合蛋白質的情況下，血液（血清）中的穩定性顯著增加（5倍或大於5倍）。
根據以上描述，本發明所屬領域的技術人員將瞭解，可在不改變其技術精神或必要特徵的情況下以其他特定形式來實施本發明。在此方面，應在所有態樣中將上文所描述的實施例理解為說明性且非限制性的。應將本發明的範圍解釋為包含由稍後將描述的申請專利範圍的含義及範圍衍生的所有變化或修改形式以及其等效概念而非以上詳細描述。
無
圖1為根據一個實例的融合多肽的模擬圖。 圖2展示GDF15的胺基酸序列（野生型；成熟形式；SEQ ID NO: 1）（自N末端至C末端）。 圖3a及圖3b展示Fc-∆N14GDF15（3a）或Fc-wtGDF15（3b）結合至GFRAL的複合物的結構。 圖4為示意性地展示根據實例的融合多肽基因的模擬圖。 圖5為展示IgG1-GDF(CRL)投與組及HIgG1-GDF(CRL)投與組的體重變化的圖式。 圖6為展示在IgG1-GDF(CRL)投與組及HIgG1-GDF(CRL)投與組的投與之後7天時的體重變化速率的圖式。 圖7為展示IgG4-GDF15投與組及IgG4-GDF(CRL)投與組的體重變化的圖式。 圖8為展示在IgG4-GDF15投與組及IgG4-GDF(CRL)投與組的投與之後7天及14天時的體重變化速率的圖式。 圖9為展示在IgG1-GDF(CRL)投與組及HIgG1-GDF(CRL)投與組的投與之後7天的累計攝食量的圖式。 圖10為展示在IgG4-GDF15投與組及IgG4-GDF(CRL)投與組的投與之後7天、14天以及19天的累計攝食量的圖式。 圖11為展示根據在投與融合多肽之後的實測時間的血液中（血清中）融合多肽濃度的變化的圖式。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010
Figure 12_A0101_SEQ_0011
Figure 12_A0101_SEQ_0012
Figure 12_A0101_SEQ_0013

Claims (21)

  1. 一種融合多肽， 包括生長/分化因子15（Growth/differentiation factor 15；GDF15）或其功能變體；以及 免疫球蛋白可結晶區域片段（Fc region of an immunoglobulin）， 其中所述免疫球蛋白可結晶區域片段為IgG1可結晶區域片段或IgG4可結晶區域片段的單鏈，且經由可撓性肽連接子連接至所述生長/分化因子15或其功能變體的N末端， 所述生長/分化因子15的功能變體為缺失變體，其中在胺基酸序列SEQ ID NO: 1的位置1至位置14處的14個胺基酸中的至少一者缺失，且 所述可撓性肽連接子由(GGGGS)n（n為1、2、3、4或5）表示。
  2. 如請求項1所述的融合多肽，其中所述免疫球蛋白可結晶區域片段為人類IgG4可結晶區域片段。
  3. 如請求項2所述的融合多肽，其中所述人類IgG4可結晶區域片段 （1）包括胺基酸序列SEQ ID NO: 5，或 （2）更包括在胺基酸序列SEQ ID NO: 5的N末端處的胺基酸序列SEQ ID NO: 10。
  4. 如請求項3所述的融合多肽，其中所述人類IgG4可結晶區域片段 （1）包括由SEQ ID NO: 6至SEQ ID NO: 9中選出的胺基酸序列，或 （2）更包括在由SEQ ID NO: 6至SEQ ID NO: 9中選出的胺基酸序列的N末端處的胺基酸序列SEQ ID NO: 11或胺基酸序列SEQ ID NO: 12。
  5. 如請求項1所述的融合多肽，其中所述生長/分化因子15的功能變體包括胺基酸序列SEQ ID NO: 2。
  6. 如請求項1至5中任一項所述的融合多肽，其中相較於不連接至所述免疫球蛋白可結晶區域片段的所述生長/分化因子15或其功能變體，所述融合多肽中連接至所述免疫球蛋白可結晶區域片段的所述生長/分化因子15或其功能變體的活體內半衰期已增加至少1.5倍。
  7. 一種融合多肽二聚體，包括兩種如請求項1至5中任一項所述的融合多肽。
  8. 一種核酸分子，其編碼如請求項1至5中任一項所述的融合多肽。
  9. 一種重組載體，包括如請求項8所述的核酸分子。
  10. 一種重組細胞，包括如請求項9所述的重組載體。
  11. 一種製備融合多肽的方法，融合多肽為請求項1所述的融合多肽，所述融合多肽包括生長/分化因子15或其功能變體以及免疫球蛋白可結晶區域片段，所述製備融合多肽的方法包括培養如請求項10所述的重組細胞。
  12. 一種用於增強生長/分化因子15或其功能變體的活體內穩定性的方法，包括經由可撓性肽連接子將IgG1可結晶區域片段或IgG4可結晶區域片段的單鏈連接至生長/分化因子15或其功能變體的N末端， 其中所述生長/分化因子15的功能變體為缺失變體，其中來自胺基酸序列SEQ ID NO: 1的1至14的14個胺基酸中的至少一者缺失，且所述可撓性肽連接子由(GGGGS)n（(SEQ ID NO: 13)n，其中n為1、2、3、4或5）表示。
  13. 如請求項12所述的用於增強生長/分化因子15或其功能變體的活體內穩定性的方法，其中免疫球蛋白可結晶區域片段為人類IgG4可結晶區域片段。
  14. 如請求項13所述的用於增強生長/分化因子15或其功能變體的活體內穩定性的方法，其中所述人類IgG4可結晶區域片段 （1）包括胺基酸序列SEQ ID NO: 5，或 （2）更包括在胺基酸序列SEQ ID NO: 5的N末端處的胺基酸序列SEQ ID NO: 10。
  15. 如請求項14所述的用於增強生長/分化因子15或其功能變體的活體內穩定性的方法，其中所述人類IgG4可結晶區域片段 （1）包括由SEQ ID NO: 6至SEQ ID NO: 9中選出的胺基酸序列，或 （2）更包括在由SEQ ID NO: 6至SEQ ID NO: 9中選出的胺基酸序列的N末端處的胺基酸序列SEQ ID NO: 11或胺基酸序列SEQ ID NO: 12。
  16. 如請求項12所述的用於增強生長/分化因子15或其功能變體的活體內穩定性的方法，其中所述生長/分化因子15的功能變體包括胺基酸序列SEQ ID NO: 2。
  17. 如請求項12至16中任一項所述的用於增強生長/分化因子15或其功能變體的活體內穩定性的方法，其中相較於不連接至免疫球蛋白可結晶區域片段的所述生長/分化因子15或其功能變體，融合多肽中連接至所述免疫球蛋白可結晶區域片段的所述生長/分化因子15或其功能變體的活體內半衰期已增加至少1.5倍。
  18. 一種用於體重減輕的組成物，包括由以下組成的族群中選出的至少一者： 如請求項1至5中任一項所述的融合多肽； 融合多肽二聚體，包括所述融合多肽中的兩種； 核酸分子，編碼所述融合多肽； 重組載體，包括所述核酸分子；以及 重組細胞，包括所述重組載體。
  19. 一種用於飲食控制的組成物，包括由以下組成的族群中選出的至少一者： 如請求項1至5中任一項所述的融合多肽； 融合多肽二聚體，包括所述融合多肽中的兩種； 核酸分子，編碼所述融合多肽； 重組載體，包括所述核酸分子；以及 重組細胞，包括所述重組載體。
  20. 一種用於預防或治療代謝疾病的醫藥組成物，包括由以下組成的族群中選出的至少一者： 如請求項1至5中任一項所述的融合多肽； 融合多肽二聚體，包括所述融合多肽中的兩種； 核酸分子，編碼所述融合多肽； 重組載體，包括所述核酸分子；以及 重組細胞，包括所述重組載體。
  21. 如請求項20所述的用於預防或治療代謝疾病的醫藥組成物，其中所述代謝疾病為肥胖症、糖尿病或非酒精性脂肪肝病。
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