KR101868139B1

KR101868139B1 - 새로운 융합 프로모터 및 이를 포함하는 재조합 벡터

Info

Publication number: KR101868139B1
Application number: KR1020100120885A
Authority: KR
Inventors: 김연철; 정샘; 정준
Original assignee: 주식회사 엘지화학
Priority date: 2010-11-30
Filing date: 2010-11-30
Publication date: 2018-06-15
Also published as: KR20120059222A

Abstract

본 발명은 CMV 프로모터의 일부 또는 전부 및 β-액틴 인트론의 일부 또는 전부가 작동가능하게 연결된 융합 프로모터, 이를 포함하는 재조합 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 숙주 세포, 및 상기 벡터 또는 숙주 세포를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

Description

새로운 융합 프로모터 및 이를 포함하는 재조합 벡터 {Novel hybrid promoter and recombinant vector which includes the promoter}

숙주 세포 내에서 원하는 유전자를 발현시키기 위해서는 세포 내로 구조 유전자를 수송하여 이를 발현시키는 발현벡터 및 유전자 전달기술이 필요하다. 이때, 발현벡터는 벡터에 삽입된 DNA 단편을 발현시킬 수 있는 벡터로서, 일반적으로 숙주 내에서 유전자를 발현시킬 수 있는 프로모터 서열 등의 발현조절서열을 포함한다. 숙주 세포의 종류, 발현 시기, 발현량 등은 발현벡터를 선택함에 있어서 주요한 근거가 되며, 목적에 따라 이러한 점들을 충족시키기 위해 다양한 발현벡터가 개발되어 왔으나, 보다 효율적인 발현벡터의 개발이 지속적으로 요구되고 있는 실정이다.

이러한 배경하에, 본 발명자들은 목적 단백질의 발현 수준을 증가시키기에 적합한 벡터들을 개발하고자 노력한 결과, CMV 프로모터의 일부 또는 전부 및 β-액틴 인트론의 일부 또는 전부가 작동가능하게 연결된 융합 프로모터가 목적 단백질의 발현양을 증가시킬 수 있음을 확인하고 이에 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 CMV 프로모터의 일부 또는 전부 및 β-액틴 인트론의 일부 또는 전부가 작동가능하게 연결된 융합 프로모터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 융합 프로모터를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 벡터 또는 숙주 세포를 포함하는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 배양된 숙주 세포 또는 숙주 세포 배양 배지로부터 발현된 목적 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 목적 단백질 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 벡터를 숙주 세포에 형질전환하여, 숙주 세포에서 목적 단백질을 발현시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 벡터를 숙주 세포에 형질전환하여, 숙주 세포에서 목적 단백질의 발현량을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 CMV 프로모터의 일부 또는 전부 및 β-액틴 인트론의 일부 또는 전부가 작동가능하게 연결된 융합 프로모터에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, "β-액틴"은 세포의 골격을 이루는 세포골격의 주된 구성요소로서 대부분의 세포에서 고르게 발현되는 단백질이다. β-액틴을 코딩하는 유전자는 하우스 키핑 유전자(house keeping gene) 성격을 가지고 있어 외부 조건에 잘 변하지 않고 일정 정도의 발현양을 나타내는 특징이 있다.

본 발명에서 용어, "CMV(cytomegalovirus)"는 헤르페스 바이러스 그룹의 헤르페스 바이러스 유전자에 속하는 것으로, 일반적으로 HCMV 또는 인간 헤르페스 바이러스 5로 알려진 바이러스를 말한다. 알파-헤르페스 바이러스 또는 감마-헤르페스 바이러스로 구분되고, 인체 감염시 오랜 기간의 잠복기를 갖는 특징이 있다.

본 발명에서 용어, "프로모터"는 이에 작동 가능하게 연결된 유전자의 전사를 허용하고 조절하는 폴리뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 프로모터는 RNA 폴리머라제를 결합시키기 위한 인식 서열 및 전사용 개시 부위(전사 개시 부위)를 함유한다. 특정 세포 유형 또는 숙주 세포내에서 목적한 단백질을 발현시키기 위해서는 적합한 기능성 프로모터를 선택해야 한다. 이들은 예를 들면, GenBank와 같은 데이터뱅크에 기탁되어 있으며, 시판되거나 개개의 공급원으로부터 폴리뉴클레오티드 서열내에 클로닝된 별개의 요소 또는 요소들로서 입수할 수 있다.

본 발명에서 용어. "β-액틴 인트론"이란 전사를 조절하는 β-액틴 유전자 또는 그의 전사체 내에 존재하고 유전자의 최종 RNA 산물에는 포함되지 않는 서열을 가리킨다.

인트론의 뉴클레오타이드 서열은 아미노산 서열에 관한 정보를 갖지 않는다.

본 발명의 목적상 β-액틴 인트론은 하기 ⅰ- ⅲ으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 DNA 단편으로 이루어진 것을 특징으로 하는 프로모터인 바: ⅰ. 서열번호 7로 표시되는 DNA 단편, 또는 ⅱ. ⅰ을 구성하는 뉴클레오티드 서열 중 하나 이상의 뉴클레오티드가 결실, 치환, 또는 삽입된 것으로 프로모터의 활성 및 프로모터의 다운스트림에 작동 가능하게 연결되는 목적 유전자의 발현 조절 활성을 가지는 DNA 단편일 수 있다. 이러한 DNA 단편은 DNA 서열이 여기 보고된 DNA 단편의 서열에 적어도 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상동성을 가지는 DNA 단편을 포함한다.

상기 β-액틴 인트론 영역은 바람직하게는 하기의 프라이머를 이용하여 β-액틴 인트론의 DNA 일부 또는 전부를 주형으로 증폭된 약 1kb 크기의 DNA 단편일 수 있다. 본 발명의 β-액틴 인트론은 서열번호 1 및 서열번호 2로 개시된 센스 및 안티센스 프라이머를 사용하여 베타-액틴 프로모터의 유전자 중 인트론의 DNA 일부 또는 전부를 주형으로 PCR로 증폭하였다.

5'-CBint _F(NheI): 5'-CAA GCT AGC GAG CAC AGG CCT TTC-3'(서열번호 1, 센스)

3'-BA 4_R(HindIII): 5'-GTA AGC TTC GGC GAA CTA TAT CAG GGC A-3'(서열번호 2, 안티센스)

본 발명에서 용어, "CMV 프로모터(이하, pCMV)"란 사이토메갈로 바이러스(Cytomegalovirus; CMV) 초기(early) 프로모터를 말한다. pCMV는 강력한 조절 요소로 알려져 왔고, 다양한 세포에서 활성을 지닌다.

또한, 본 발명의 목적상 CMV 프로모터는 하기 ⅰ또는 ⅱ의 DNA 단편으로 이루어진 것을 특징으로 하는 프로모터인 바: ⅰ. 서열번호 8로 표시되는 DNA 단편, 또는 ⅱ. ⅰ을 구성하는 뉴클레오티드 서열 중 하나 이상의 뉴클레오티드가 결실, 치환, 또는 삽입된 것으로 프로모터의 활성 및 프로모터의 다운스트림에 작동 가능하게 연결되는 목적 유전자의 발현 조절 활성을 가지는 DNA 단편일 수 있다. 이러한 DNA 단편은 DNA 서열이 여기 보고된 DNA 단편의 서열에 적어도 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상동성을 가지는 DNA 단편을 포함한다.

본 발명의 CMV 프로모터는 벡터 pcDNA3.1의 CMV promoter를 MluI 및 NheI으로 자른 후 얻어진 DNA 단편 (0.67kb)을 사용하였다(실시예 2-2).

용어 "다운스트림(downstream)"은 참고 뉴클레오티드 서열의 3' 쪽에 위치한 뉴클레오티드 서열을 말한다. 구체적으로, 다운스트림 뉴클레오티드 서열은 전사의 개시 포인트 뒤에 오는 서열과 일반적으로 관련된다. 예를 들면, 유전자의 번역 개시 코돈은 전사의 개시 부위의 다운스트림에 위치한다.

본 발명에서 용어, "작동 가능하게 연결된(operably linked)"이란 일반적으로 기능을 수행하도록 염기 발현 조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 염기 서열이 작동 가능하게 연결되어 코딩하는 염기 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 벡터와의 작동가능한 연결은 당업계의 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당업계의 절단 및 연결 효소 등을 사용하여 제작할 수 있다.

본 발명에서는 상기 CMV 프로모터의 일부 또는 전부 및 β-액틴 인트론의 일부 또는 전부를 작동 가능하게 연결하여 목적 유전자의 전사 및 목적 단백질의 발현을 증가시킬 수 있는 융합 프로모터를 제작하였다. 본 발명에 따른 융합 프로모터는 기존의 β-액틴 프로모터(도 7의 3번 레인) 및 β-액틴 프로모터와 CMV 프로모터의 융합 프로모터(도 7의 4번 레인) 비해 목적 유전자의 전사 및 목적 단백질의 발현 효율이 증가된 것을 확인하였다.

보다 구체적인 태양에서, 본 발명에 따른 융합 프로모터는 서열번호 7로 표시되는 DNA 단편 및 서열번호 8로 표시되는 DNA 단편이 포함된 프로모터일 수 있다. 상기 프로모터를 구성하는 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환, 삽입 및 결실 변이체 및 이들의 조합을 포함한다. 뉴클레오티드의 치환 변이체는 뉴클레오티드 서열에서 적어도 하나의 염기가 제거되고 다른 염기가 그 자리에 삽입된 변이체이다. 뉴클레오티드의 삽입 변이체는 하나 이상의 뉴클레오티드가 서열 내 미리 결정된 부위에 도입된 변이체이다. 뉴클레오티드의 결실 변이체는 하나 이상의 뉴클레오티드가 염기으로부터 제거된 것에 특징이 있다. 치환, 결실 또는 삽입의 임의의 조합은 구성요소의 기능이 온전히 동일하게 남아있도록 유도하도록 한다. 본 발명에 따른 융합 프로모터의 DNA 단편은 그 DNA 서열이 상기 서열번호 7로 표시되는 DNA 단편 및 서열번호 8로 표시되는 DNA 단편으로 이루어진 DNA 단편에 적어도 70% 상동성을 가지는 DNA 단편이다. 본 발명의 DNA 단편은 DNA 서열이 여기 보고된 DNA 단편의 서열에 적어도 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상동성을 가지는 DNA 단편을 포함한다.

본 발명에서 용어, "상동성"은 두개의 폴리뉴클레오티드나 두개의 폴리펩티드 모이티 사이의 동일성의 퍼센트를 말한다. 하나의 모이티로부터 다른 하나의 모이티까지의 서열 간 상응성은 알려진 당해 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 상동성은 서열 정보를 정렬하고 용이하게 입수가능한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 두 개의 폴리펩티드 분자 간의 서열 정보를 직접 정렬하여 결정될 수 있다. 또한, 상동성은 상동 영역간의 안정된 이중가닥을 이루는 조건하에서 폴리뉴클레오티드의 혼성화한 후, 단일-가닥-특이적 뉴클레아제로 분해 (digestion)시켜 분해된 단편의 크기를 결정함으로써 결정할 수 있다.

본 발명에서 용어, "상동"의 모든 문법적 형태나 스펠링 변이 형태는 슈퍼패밀리 유래 단백질 (예, 면역글로불린 슈퍼패밀리) 및 다른 종 유래의 상동 단백질 (예, 미오신 경쇄, 등)을 포함하여, "공통 진화 기원"을 갖는 단백질 간의 관계를 말한다 (Reeck et al., Cell 50:667 (1987)). 그러한 단백질 (및 그들의 코딩 유전자)은 높은 정도의 서열 유사성에 의해 반영되는 서열 상동성을 갖는다. 그러나, 일반적 사용과 본 발명에서 "상동"은 "매우 높은"과 같은 형용사에 의해 수식될 경우에는 서열 유사성을 말하는 것이고 공통 진화 기원을 의미하는 것은 아니다.

본 발명에서 용어, "서열 유사성"은 공통 진화 기원을 공유하거나 하지 않을 수 있는 단백질의 염기 서열이나 아미노산 서열 간의 동일성이나 상응성 정도를 말한다. 하나의 구체예에서, 두 개의 DNA 서열이 DNA 서열의 소정의 길이에 대해 뉴클레오티드 매치가 적어도 21% (바람직하게 적어도 약 50%, 가장 바람직하게 약 75%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%)일 때, "실질적으로 상동" 또는 "실질적으로 유사"하다. 실질적으로 상동인 서열은 서열 데이터 은행에서 사용되는 표준 소프트웨어를 사용하거나, 예를 들면, 특정한 시스템을 위해 정의된 엄격한 조건 하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로서 확인할 수 있다. 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이다 (예, Sambrook et al., 1989, infra 참고).

다른 하나의 양태로, 본 발명은 상기 제조된 융합 프로모터를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, "벡터"는 숙주 세포로 염기의 클로닝 및/또는 전이를 위한 임의의 매개물을 말한다. 벡터는 다른 DNA 단편이 결합하여 결합된 단편의 복제를 가져올 수 있는 복제단위 (replicon)일 수 있다. "복제단위"란 생체 내에서 DNA 복제의 자가 유닛으로서 기능하는, 즉, 스스로의 조절에 의해 복제가능한, 임의의 유전적 단위 (예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스)를 말한다. 용어 "벡터"는 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내에서 숙주 세포로 염기를 도입하기 위한 바이러스 및 비 바이러스 매개물을 포함한다. 용어 "벡터"는 또한 미니구형 DNA를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 벡터는 박테리아 DNA 서열을 갖지 않는 플라스미드일 수 있다. CpG 영역에서 풍부한 박테리아 DNA 서열의 제거는 전이유전자 발현 사일런싱을 감소시키고 플라스미드 DNA 벡터로부터 보다 지속적인 발현을 가져오기 위해 행해지고 있다 (예를 들면, Ehrhardt, A. et al. (2003) Hum Gene Ther 10: 215-25; Yet, N. S. (2002) MoI Ther 5: 731-38; Chen, Z. Y. et al. (2004) Gene Ther 11 : 856-64) 참조. 용어 "벡터"는 또한 슬리핑 뷰티(Sleeping Beauty)같은 트랜스포존(Izsvak et al. J. MoI. Biol. 302:93-102 (2000)), 또는 인공 염색체를 포함할 수 있다.

본 발명의 구체적 태양에서, 본 발명의 벡터는 상기 융합 프로모터를 포함한다. 보다 구체적으로, CMV 프로모터의 일부 또는 전부 및 β-액틴 인트론의 일부 또는 전부가 작동가능하게 연결된 융합 프로모터를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

보다 바람직하게, 본 발명의 재조합 벡터는 CMV 프로모터(서열번호 8) 및 β-액틴 인트론 (서열번호 7)이 융합된 프로모터를 포함한다.

가장 바람직하게, 상기 재조합 벡터는 개열지도 도 4에 개시된 pGL3-CMV/BA_in인 벡터일 수 있다.

이 경우, 목적 유전자 전사 및 목적 단백질의 발현을 유도하는 경우 최대의 효율로 전사 및 발현되는 것을 확인할 수 있었다(도 7).

또한, 상기 재조합 벡터는 암피실린(ampicillin) 저항성 유전자, 가나마이신(kanamycin) 저항성 유전자 및 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라아제(chloramphenicol acetyl transferase) 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 항생제 저항성 유전자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터일 수 있다.

본 발명에서 용어, "항생제 저항성 유전자" 항생제에 대하여 저항성을 가지는 유전자로서, 이것을 가지는 세포는 해당 항생제를 처리한 환경에서도 생존하므로, 대장균에서 대량으로 플라스미드를 얻는 과정에 선별 마커로서 유용하게 사용된다. 본 발명에서 항생제 저항성 유전자는 본 발명의 핵심적 기술인 벡터의 최적의 조합에 따른 발현 효율에 크게 영향을 미치는 요소가 아니므로, 선별 마커로서 일반적으로 사용되는 항생제 저항성 유전자를 제한 없이 사용할 수 있다. 구체적인 예로는, 암피실린(ampicilin), 테트라사이클린(tetracyclin), 카나마이신(kanamycin), 클로람페니콜(chloroamphenicol), 스트렙토마이신 (streptomycin), 또는 네오마이신(neomycin)에 대한 저항 유전자 등을 사용할 수 있고, 바람직하게는 암피실린 저항 유전자일 수 있다.

본 발명에서 용어, "검출용 유전자(또는 리포터 유전자)"는 상기 유전자의 효과에 기초하여 동정될 수 있는 동정하는 인자를 코딩하는 염기를 말하며, 여기서 상기 효과는 관심 염기의 유전을 추적하거나 관심 염기를 물려받은 세포나 유기체를 동정하기 위해, 및/또는 유전자 발현 유도 또는 전사를 측정하기 위해 사용된다. 공지되고 당해 기술에서 사용되는 리포터 유전자의 예는 하기를 포함한다: 루시퍼라제 (Luc), 녹색 형광 단백질(GFP)와 같은 형광 단백질, 클로르암페니콜 아세틸전이효소 (CAT), 베타-갈락토시다아제 (LacZ), 베타-글루쿠로니다아제 (Gus) 등. 선택적 마커 유전자는 또한 검출용 유전자로 간주될 수 있다.

본 발명에서 용어, "루시퍼라아제"는 발광 단백질의 발광반응을 촉매하여, 루시퍼린이라는 발광체를 생성하므로 이를 이용하여 효소 반응 및 단백질의 다양한 반응을 분석하는 데 리포터로 사용하는 단백질이다. 본 발명에서는 상기 발현 벡터에 루시퍼라아제를 코딩하는 유전자를 삽입하여 상기 재조합 벡터의 목적 단백질의 발현 기능을 확인하는 검출자로 사용되었다.

상기에서 제조된 벡터의 목적 단백질 발현능을 확인하기 위하여, 본 발명자들은 검출용 유전자로 삽입된 루시퍼라아제 유전자의 발현 수준을 비교하였다. 대조군으로는 본 발명에서 사용된 벡터의 기본 구조를 가지며, 본 발명에 따른 프로모터와 인핸서 서열이 제거된 pGL3-Basic 벡터를 사용하였다(도 1). 검출용 유전자인 루시퍼라아제 유전자의 발현능을 확인한 결과, CMV 프로모터의 일부 또는 전부 및 β-액틴 인트론의 일부 또는 전부가 작동가능하게 연결된 융합 프로모터를 포함하는 재조합 벡터의 경우 β-액틴 프로모터만을 포함하는 벡터(도 3의 pGL3-BA, 도 7의 3번 레인) 및 β-액틴 프로모터와 CMV 프로모터의 융합 프로모터를 포함하는 벡터(도 6의 pGL3-B/C_TA, 도 7의 4번 레인) 와 비교하여 루시퍼라아제의 발현 수준이 높아지는 것을 확인할 수 있었다(표 1 또는 2 및 도 7).

상기 재조합 벡터의 구성 요소들은 하기와 같다.

-pGL3-Basic: f1 ori, 합성 폴리 A/전사 휴지 사이트, MCS, luc+, SV40 후기 폴리아데닐 신호, Amp(도 1)

-pGL3-Promoter(SV40): f1 ori, 합성 폴리 A/전사 휴지 사이트, MCS, SV40 프로모터, luc+, SV40 후기 폴리아데닐 신호, Amp(도 2)

-pGL3-BA: f1 ori, 합성 폴리 A/전사 휴지 사이트, MCS, β-액틴 프로모터, luc+, SV40 후기 폴리아데닐 신호, Amp(도 3)

-pGL3-CMV/BA_in: f1 ori, 합성 폴리 A/전사 휴지 사이트, MCS, CMV 프로모터, β-액틴 인트론, luc+, SV40 후기 폴리아데닐 신호, Amp(도 4)

-pGL3-B/C_TA: f1 ori, 합성 폴리 A/전사 휴지 사이트, MCS, β-액틴 프로모터(1.9 kb)-CMV 프로모터의 TATA box부분(130 bp)을 융합한 프로모터, luc+, SV40 후기 폴리아데닐 신호, Amp(도 6)

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기에서 개시된 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, "형질전환" 은 핵산 단편이 숙주 유기체의 게놈 안으로 이동하여 유전적으로 안정한 유전을 일으키는 것을 말한다.

상기 세포 내로 본 발명의 벡터를 형질전환시키는 방법은 염기를 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 일렉트로포레이션 (electroporation), 칼슘 포스페이트 공동-침전 (calcium phosphate co-precipitation), 레트로바이러스 감염 (retroviral infection), 미세주입법 (microinjection), DEAE-덱스트란 (DEAE-dextran), 양이온 리포좀 (cationic liposome) 법 등이 있고, 이로 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어, "재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포"는 하나 이상의 목적 단백질을 암호화하는 유전자를 갖는 벡터로 형질감염된 세포를 말하며, 재조합 포유동물 세포, 설치류 세포, 바람직하게는 동물세포 또는 동물세포 유래의 세포일 수 있으며, 가장 바람직하게는 CHO 세포일 수 있다. 숙주 세포가 CHO 세포인 경우, 유전자를 안정적으로 발현시키고, 또한, 세포내에서의 유전자의 카피 수(copy number)의 증폭을 목적으로 하기 때문에, 염기 합성 경로를 결손한 CHO 세포에 그것을 상보하는 DHFR 유전자를 갖는 벡터(예를 들면, pCHOI 등)를 도입하고, 메토트렉세이트(methotrexate, MTX)에 의해 증폭시킬 수 있다.

본 발명에서 용어, "숙주"는 동물을 포함한다. 동물을 사용하는 경우, 포유류동물, 곤충을 사용하는 생산계가 있다. 포유류동물로서는, 염소, 돼지, 양, 마우스, 소를 사용할 수 있다(Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993). 또한, 포유류동물을 사용하는 경우, 트랜스제닉 동물을 사용할 수 있다. 예를 들면, 목적으로 하는 단백질을 코드하는 DNA를, 염소 β 카세인(goat β casein)과 같은 유즙(乳汁) 중에 고유하게 생산되는 폴리 펩티드를 코드하는 유전자와의 융합 유전자로서 조제한다. 이어서, 이 융합 유전자를 포함하는 DNA 단편을 염소의 배(embryo)로 주입하고, 이 배를 암컷의 염소로 이식한다. 배를 수용한 염소로부터 태어나는 트랜스제닉 염소 또는 그의 자손이 생산하는 유즙으로부터, 목적으로 하는 항체를 얻을 수 있다. 트랜스제닉 염소로부터 생산되는 폴리펩티드를 포함하는 유즙량을 증가시키기 위해, 적절히 호르몬을 트랜스제닉 염소에 사용해도 된다(Bio/Technology, Vol.12, p.699-702, 1994). 또한, 곤충으로서는, 예를 들면 누에를 사용할 수 있다. 누에를 사용하는 경우, 목적으로 하는 단백질을 코드하는 DNA를 삽입한 바큘로바이러스(Baculovirus)를 누에에 감염시킴으로써, 이 누에의 체액으로부터 목적으로 하는 단백질을 얻을 수 있다(Nature, Vol.315, p.592-594, 1985). 바람직하게 본 발명에서는 CHO 세포를 숙주로 사용하였다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 재조합 벡터 또는 숙주 세포를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 벡터를 상기의 개시된 용도로 사용하는 경우, 치료학적 유효량의 목적 유전자를 포함하는 본 발명의 벡터 성분과 함께, 약제학적으로 허용되는 담체, 예를 들면, 인산염 완충용액(PBS), 염수, 포도당, 물, 글리세롤, 에탄올 또는 이들의 혼합물이 포함될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 조성물은 당업계의 공지된 보조제 성분들을 추가로 포함할 수 있다.

의료용 단백질, 진단 및 치료용 항체 또는 유전자 치료용 조성물은 다양한 방식 예를 들어, 경우, 비내, 폐, 근육내, 피하내 또는 피내 경로를 포함하지만 이에 제한되지 않는 경로로 투여될 수 있다. 이들은 주입가능한 조성물로서, 예를 들어, 멸균 수성 현탁액, 바람직하게는 등장액으로서 개체에 투여될 수 있다.

본 발명의 벡터를 함유하는 조성물의 적용 방식은 처리되는 동물의 크기 및 종, 투여되는 약제학적 조성물의 구성 또는 조성물의 양, 투여 경로, 사용된 보조제 화합물의 효능과 용량, 및 당해 분야의 숙련자에게 자명한 기타 요인에 따라 변화될 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 배양된 숙주 세포 또는 숙주 세포 배양 배지로부터 발현된 목적 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 목적 단백질 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, "목적 단백질"은 예를 들면, 항체, 효소, 사이토카인, 림포카인, 부착 분자, 수용체 및 이의 유도체 또는 단편을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일반적으로, 효능제 또는 길항제로서 작용하고/하거나 치료학적 또는 진단학적 적용성을 갖는 모든 폴리펩타이드가 사용될 수 있다. 다른 목적 단백질은, 예를 들면, 소위 "tph 조작"의 범위내에서 숙주 세포의 특성을 변화시키는데 사용되는, 항-아폽토시스 단백질, 샤페론, 대사효소, 글리코실화 효소 및 이의 유도체 또는 단편과 같은 단백질/폴리펩타이드이지만, 이에 한정되지는 않는다.

용어 "폴리펩타이드"는 아미노산 서열 또는 단백질에 대해 사용되며 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 말한다. 당해 용어는 또한 글리코실화, 인산화, 아세틸화 또는 단백질 프로세싱과 같은 반응에 의해 해독 후에 변형된 단백질을 포함한다. 폴리펩타이드의 구조는, 자체의 생물학적 활성을 유지하면서, 예를 들면, 아미노산의 치환, 결실 또는 삽입 및 다른 단백질과의 융합에 의해 변형될 수 있다. 또한, 폴리펩타이드는 다량체화되어 호모머(homomer) 또는 헤테로머(heteromer)를 형성할 수 있다.

치료용 단백질의 예는 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자, 사람 성장 호르몬(hGH) 및 기타 성장 인자, 수용체, 조직 플라스미노겐 활성인자(tPA), 에리트로포이에틴(EPO), 사이토카인, 예를 들면, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18과 같은 인터루킨(IL), 인터페론(IFN)-알파, -베타, -감마, -오메가 또는 -타우, TNF-알파, 베타 또는 감마와 같은 종양 괴사 인자(TNF), TRAIL, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, MCP-1 및 VEGF를 포함한다. 다른 예는 예를 들면, Fab, Fab', F(ab')₂, Fc 및 Fc' 단편, 면역글로불린 경쇄(L) 및 중쇄(H) 및 이의 불변, 가변 또는 초가변 영역, 및 Fv 및 Fd 단편(참조: Chamov et al., 1999)과 같은, 모노클로날, 폴리클로날 다특이적인 및 단일쇄 항체 및 이의 단편이다. 항체는 사람 또는 비-사람 기원일 수 있다. 사람화된 키메라 항체가 또한 가능하다.

상기의 목적 단백질의 제조를 위한 생산계는 생산계는, in vitro 및 in vivo의 생산계가 있다. in vitro의 생산계로서는, 진핵세포를 사용하는 생산계나 원핵세포를 사용하는 생산계를 들 수 있다. 예를 들면, 전술한 숙주 세포를 in vitro에서 배양함으로써 목적으로 하는 단백질을 얻을 수 있다. 배양은 공지의 방법에 따라 행할 수 있다. 예를 들면, 동물세포의 배양액으로서, 예를 들면, DMEM, MEM, RPMI1640, IMDM, F10 배지, F12 배지 등을 사용할 수 있다. 그 때, 소태아혈청(FCS) 등의 헐청 보액(serum supplement)을 병용하는 것도 가능하고, 무혈청 배양해도 된다. 더욱이, 트랜스액티베이터를 배지에 첨가해도 된다. 배양시의 pH는 약 6~8인 것이 바람직하다. 배양은 통상 약 30~40℃에서 약 15~200시간 행하고, 필요에 따라 배지의 교환, 통기(通氣), 교반을 추가한다. 배양조건은 사용하는 세포의 종류에 따라 상이하기 때문에, 당업자는 적절히 적합한 조건을 결정할 수 있다. 예를 들면 CHO 세포라면 통상 기상(氣相)의 CO₂ 농도가 0-40%, 바람직하게는 2-10%의 분위기하, 30-39℃, 바람직하게는 37℃ 정도에서, 1-14일간 배양하면 된다. 또한, 동물세포 배양용의 각종 배양장치로서는, 예를 들면 발효조형 탱크 배양장치(fermentation tank-type tank culture apparatuses), 에어리프트형 배양장치(airlift-type culture apparatuses), 컬쳐 플라스크형 배양장치(culture flask-type culture apparatuses), 스피너 플라스크형 배양장치(spinner flask-type culture apparatuses), 마이크로캐리어형 배양장치(microcarrier-type culture apparatuses), 유동층형 배양장치, 홀로 파이버형 배양장치(hollow fiber-type culture apparatuses), 롤러 보틀형 배양장치(roller bottle-type culture apparatuses), 충전조형 배양장치(packed bed-type culture apparatuse) 등을 사용해서 배양할 수 있다.

한편, in vivo에서 단백질을 생산시키는 계(系)로서는, 예를 들면, 동물을 사용하는 생산계나 식물을 사용하는 생산계를 들 수 있다. 이들 동물 또는 식물에 목적으로 하는 DNA를 도입하고, 동물 또는 식물의 체내에서 폴리펩티드를 생산시키고, 회수한다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 숙주 세포에 형질전환하여, 숙주 세포에서 목적 단백질을 발현시키는 방법에 관한 것이다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 숙주 세포에 형질 전환하여, 숙주 세포에서 목적 단백질의 발현량을 증가시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, "동물목(animal order)이란, 생물분류의 린네식 계층분류에 있어서, 강(class)의 차하위, 과계급군(family)의 상위에 놓여지는 기본적 계급 또는, 그 계급에 있는 택손(taxon)을 말한다. 구체적인 동물목으로서는, 예를 들면, 쥐목(Rodentia), 토끼목(Lagomorpha), 도약땃쥐목(Macroscelidea), 투파이목(Scandentia) 등을 들 수 있지만, 쥐목이 바람직하다. 쥐목에는 햄스터, 랫트, 마우스, 모르모트, 다람쥐, 비버 등이 포함된다. 또한, 본 발명에 있어서는 목적으로 하는 단백질의 발현량을 증가시킬 목적으로, 트랜스액티베이터를 사용해도 된다. 트랜스액티베이터는 트랜스액티베이터를 코딩하는 DNA를 도입하고, 상기 DNA를 포함하는 벡터를 숙주 세포에 도입한 후, 배양시에 트랜스액티베이터가 발현되도록 하는 방법이 있을 수 있고, 트랜스액티베이터를 배지에 직접 첨가하는 방법도 있다. 트랜스액티베이터를 코딩하는 DNA는, 목적으로 하는 단백질을 코딩하는 DNA와 동일한 벡터 상에 삽입해도 되고, 상이한 벡터에 삽입하여 양쪽 벡터를 세포에 도입할 수 있다.

본 발명은 항체 개발 또는 DNA 백신에 있어서 최적의 조건을 가지는 융합 프로모터를 포함하는 벡터에 다양한 진핵 세포 목적 유전자를 삽입하는 경우, 유전자의 발현을 높게 유지할 수 있다. 또한, 본 발명의 최적의 융합 프로모터를 포함하는 재조합 벡터는 목적 유전자를 삽입하여 항체 개발 또는 DNA 백신에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명에서 사용된 벡터의 기본 구조인 pGL3-Basic 벡터를 나타내는 도이다.
도 2는 SV40 프로모터가 도입된 pGL3-Promoter(SV40) 벡터를 나타낸 것이다.
도 3은 β-액틴 프로모터가 도입된 벡터를 나타낸 것이다.
도 4는 CMV 프로모터 및 β-액틴 인트론이 도입된 벡터를 나타낸 것이다.
도 5는 pcDNA3.1의 CMV TATA box 부분을 나타낸 것이다.
도 6은 1.9 kb의 β-액틴 프로모터 및 CMV 프로모터의 TATA box 영역이 융합된 프로모터가 도입된 벡터를 나타낸 것이다.
도 7은 각 벡터들로 형질전환된 형질전환체들의 루시퍼라아제 발현 수준을 비교한 것을 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 일반 분자생물학적 기술

제한 효소의 처리, 아가로즈 겔 전기영동, 겔 적출 키트(QIAGEN사의 Gel Extraction Kit), 플라스미드 DNA 순수 정제, 중합연쇄반응, DNA 절편의 접합 및 대장균의 형질 전환 등과 같은 분자생물학에서 일반적으로 사용한 방법들은 Sambrook 등의 Molecular Cloning(2판)에 소개된 방법들에 최소한의 변형을 가하여 실시하였다. Luciferase를 포함하고 있는 pGL3-Basic 벡터에 CHO β-액틴 프로모터 또는 이를 응용한 조합의 서열을 첨가하기 위하여 중합연쇄반응(PCR)을 이용하여 필요한 부분을 증폭시키고 적당한 제한효소를 사용하여 개환한 다음 아가로스 젤 전기영동을 통하여 벡터 및 증폭조각을 분리, 정제하였다. 이를 DNA Ligase를 이용하여 연결한 후 대장균(E. coli)에 형질전환하여 올바른 크기의 벡터가 들어간 콜로니를 얻어내었다.

실시예 2: 다양한 플라스미드 벡터의 제조

2-1. pGL3 - BA 의 제조

CHO 세포로부터 얻은 전체 DNA를 주형으로 하여 프라이머로 β-액틴 프로모터 유전자를 PCR하고, 그 증폭된 산물을 NheI 및 HindIII로 자른 후 얻어진 DNA 단편(3.0kb, 서열번호 5)을 벡터 pGL3-Basic(Promega사)를 같은 제한효소로 절단한 부위에 삽입함으로써 제조하였다(도 3). PCR은 94 ℃에서 5분 후, 94 ℃ 1분, 55 ℃에서 1분 및 72 ℃에서 3분 30초의 세 과정을 25 회 반복 후, 72 ℃에서 7 분 incubation의 순서로 수행되었다.

5'-BA 1_F (NheI): 5'-CAG CTA GCG GGA CCA AGA CAG AAC CAT AA-3' (서열번호 1, 센스)

2-2. pGL3 - CMV / B _in 의 제조

베타-액틴 프로모터의 유전자 중 인트론 부분을 PCR하고, 그 증폭된 산물을 제한효소 NheI 및 HindIII로 자른 후(서열번호 7), 벡터 pGL3-CMV를 같은 제한효소로 절단한 부위에 삽입함으로써 제조하였다(도 4).

2-3. pGL3 -B/ C _TA

pcDNA3.1의 CMV 프로모터의 TATA box 부분(130 bp)을 PCR하고(도 5), 증폭된 산물을 SalI 및 HindIII으로 자른 후(서열번호 6) pGL3-BA를 XhoI 및 HindIII로 절단한 부위에 삽입함으로써 제조하였다(SalI 및 XhoI 제한효소 부위 없어짐, 도 6).

5-CMV TA_F(SalI): 5'-CAG TCG ACT AGG CGT GTA CGG TGG GAG-3'(서열번호 3, 센스)

3'-BGH reverse priming site: 5'-TAG AAG GCA CAG TCG AGG-3'(서열번호 4, 안티센스)

실시예 3: 플라스미드 벡터의 시험관 내( in vitro ) 효능 분석

제작된 벡터들에는 루시퍼라아제(Luciferase) 유전자가 삽입되어 이 유전자의 발현수준을 in vitro cell culture system에서 조사하기 위하여 CHO 세포에 형질 전환한 뒤 ELISA를 통해 루시퍼라아제(Luciferase)의 발현 수준을 조사하였다.

열로 비활성화된 FBS(Fetal bocine serum, GIBCO-BRL사) 10%를 함유하고 있는 DMEM 배지 (Dulbecco's modified Eagles's medium, GIBCO-BRL사)로 배양된 CHO 세포로의 형질전환은 리포펙타민(lipofectamine, Invitrogen사)를 이용해 이루어졌다. β-gal이 들어있는 pCH110 벡터와 프로모터와 루시퍼라아제가 들어있는 벡터를 동시에 형질전환 시킨다. 형질전환 하루 전 웰당 6*10⁴ 개의 CHO 세포 24-웰 플레이트(Falcon사)에 배양한 후 다음날 각 루시퍼라아제 유전자가 삽입된 다양한 플라스미드 벡터 500ng, 그리고 B-Gal 보정을 위한 pCH110 150ng, Plus Reagent 0.83uL, Opti-MEM 23.92uL을 넣은 Tube 1 (1 웰 반응량)과 리포펙타민 1.25uL, Opti-MEM 30uL를 넣은 Tube 2 (1 웰 반응량)를 각각 실온에서 15분 둔 후, 두 Tube를 혼합하여 15분간 실온에서 반응시켰다. 이 혼합액을 Opti-MEM 배지 200uL로 바꾸어 준 CHO 세포에 각 60uL씩 넣고 3시간 동안 37℃ incubator (5% CO₂)에서 배양한 후 20% FBS를 함유하고 있는 DMEM 배지를 각 웰에 260uL씩 넣어주고 2일간 배양하였다. 2일 후 각 웰의 배지를 제거하고 300uL PBS로 세척한 후, 1X Reporter Lysis Buffer(Promega) 100uL씩 넣고 얼린 후 37℃에서 녹였다. 상온에서 가볍게 흔든 후 20uL씩 분석 플레이트에 옮겨 루시퍼라아제 분석과 Beta-Gal 분석을 수행하였다. 형질전환이 균일하게 되었는지 확인하기 위해 루시퍼라아제 데이터를 Beta-Gal data로 보정하였다. 분석결과 기존의 공지된 pGL3-BA와 비교하였을 때, 하기 표 1 및 표 2와 도 7에서 보는 것과 같이 pGL3-CMV/B_in 경우 루시퍼라아제 유전자의 발현량이 많았다. 또한 pGL3-B/C_TA의 경우는 pGL3-BA보다 낮은 발현을 보였다. (β-gal이 들어있는 pCH110 벡터를 프로모터와 루시퍼라아제가 들어있는 벡터와 함께 형질전환(co-transfection) 한 다음 루시퍼라아제 분석 데이터를 보정하기 위해서 β-gal assay를 하였다.)

1회차		Luminiscent		B- Gal		B- Gal 보정		보정 LUC Average	Stdev
1회차		Sample 1	Sample 2	Sample 1	Sample 2	Sample 1	Sample 2	보정 LUC Average	Stdev
1	pGL3-Basic	1763	1550	2.890	3.214	610	482	546	90
2	pGL3-promoter(SV40)	3356	3374	2.960	3.107	1134	1086	1110	34
3	pGL3-BA	12557	12811	3.106	3.254	4043	3937	3990	75
4	pGL3-B/C_TA	3533	3902	3.151	3.312	1121	1178	1150	40
5	pGL3-CMV/B_in	13591	13556	1.078	1.066	12608	12717	12662	77

2회차		Luminiscent		B- Gal		B- Gal 보정		보정 LUC Average	Stdev
2회차		Sample 1	Sample 2	Sample 1	Sample 2	Sample 1	Sample 2	보정 LUC Average	Stdev
1	pGL3-Basic	3346	2841	3.300	3.254	1014	873	944	100
2	pGL3-promoter(SV40)	3356	3096	2.451	2.443	1369	1267	1318	72
3	pGL3-BA	12557	13567	3.336	3.235	3764	4194	3979	304
4	pGL3-B/C_TA	3533	4520	3.269	3.124	1081	1447	1264	259
5	pGL3-CMV /B_in	13575	13542	0.730	0.741	18596	18275	18436	227

상기 표에 대한 각각의 해석은 다음과 같다.

*Luminescent : 벡터 내 삽입된 루시퍼라아제 유전자에 의해 발현되는 발광 값을 나타낸다.

*β-gal : β-갈락토시다아제의 발현 수준을 나타낸다.

*β-gal 보정 : 각각의 프로모터에서 β-갈락토시다아제의 발현 수준의 차이를 비교하기 위해 보정한 값을 나타낸다.

*보정 LUC average : 루시퍼라아제의 발현 수준을 평균값으로 보정한 값을 나타낸다.

*Stdev : 루시퍼라아제의 발현 수준의 표준편차를 나타낸 값이다.

*Fold : 보정 루시퍼라아제 평균 값을 토대로 pGL3 - CMV 을 기준(100 )으로 하였을 때 다른 플라스미드의 상대적인 값

*Fold Stdev : pGL3 - CMV 을 기준 으로 하였을 때 다른 플라스미드의 상대적인 값의 표준편차를 나타낸 값이다.

<110> LG Life Sciences Ltd. <120> Novel hybrid promoter and recombinant vector which includes the promoter <130> PA100777KR <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for beta-actin promoter <400> 1 cagctagcgg gaccaagaca gaaccataa 29 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for beta-actin promoter <400> 2 gtaagcttcg gcgaactata tcagggca 28 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for TATA box of CMV promoter <400> 3 cagtcgacta ggcgtgtacg gtgggag 27 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for TATA box of CMV promoter <400> 4 tagaaggcac agtcgagg 18 <210> 5 <211> 1930 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <220> <221> promoter <222> (1)..(1930) <223> Beta-actin promoter <400> 5 gctagcggga ccaagacaga accataagcc agtgggatag atcagaaatg ttccagaggt 60 gggatggggc cagagtgcct gccccttgaa ccgtcccagg gaccagaggt gacaaagtgg 120 caacacaggt cctgcctggg aatctggtct gctcctactt agtaaagctg cctggtgtca 180 cacaagaggc ccccacttat tcctgcaccc ctggtggtag gtggcgtctt ctcccctgca 240 gccaccaggc tcccctgaga acactgccgg cagtcctcat tgacaggcag tattcgctct 300 gccccacccc cacctgtgaa ttgcagggct ggcaggtcct caggcagctg gcaaaccgcc 360 tgaacaactg agagatacag ggccagggcc agggcagtcc cgtcccccgg aggcagggag 420 gggacgtgct gggaaagttc tctctctcag gcccaggttg gtgactgcag aaggcttctg 480 tcaaatctct tttgtgggaa ccacagagta gccctgaacg tgggggtgtg cttccagtat 540 actctggggt caccctttcc atactggagg cctctgcaac ttcaaaatgc tctgctacca 600 acctagcaca aggaagttgg tccagcctcc ccacgcaagg ccactgctgc agtccatata 660 tggactaagc cttccttggt ttcaacacct acactcactg agcccctact atgtgtatgc 720 agagccgaga caggccctga gcatctcatc tgaagcgccc ttcttgccta aattcagttt 780 tctgtcactt tctcccagga ggtgtgtgtc cctctaagct aagccagggg tccctcaccc 840 ctgccccact cccatcccta gtgtaggtat cagctgaaga gcttcctgag cagaacactc 900 ttgggtgctg acattttgat aaataggccc atgttgagga gagcaggggt ccgggggcgg 960 gagatcttct ctggtggatt gagggctcca agaactactc tttgagcacg ctgtccctcc 1020 cagagtcccc acagcctcca gatggactag aacacagttc ggctgtggct gcacataact 1080 aacagaggat agatggtggg tcccagccca acagtgcctg gcaatcaccc agagccacca 1140 gctaacggcc ttggcttagt tttttgcctg ggtgtgatca ggcagccctc caaaactgcc 1200 cggactccat gacaagtttt gcttgttcta tagagcacag ttcctttcta ggtctggggc 1260 gagggacatc gggagacatc ttcctgcaac agctccagtc actggaccac caggctcgcc 1320 ctgtctttgg tgtgtggccc tgagtctcct aagtggccca aacctgtgaa gacccctcca 1380 accacagttt tgcttctaaa ttgtacccca acacacctag caaattgaaa ccccaccaga 1440 agtcccccag atctggcttt ccggctattg ctggcaaggg ggagtgactc ccggcccatt 1500 caatccaggc cccgcgtgtt cctcaaacaa gaagccacgt aaacataaac cgagcctcca 1560 tgctgaccct tgcccatcga ggtactcaat gttcacgtga tatccacacc cagagggtcc 1620 tggggtgggt gcatgagccc cagaatgcag gcttgataac cgagaccctg aatcgggcag 1680 tgtccacaag ggcggaggcc agtcatgcat gttcgggcct atggggccag cacccaacgc 1740 caaaactctc catcctcttc ctcaatctcg ctttctctct ctctctcttt tttttttttt 1800 tttttttttt ttttgcaaaa ggaggggaga gggggtaaaa aaatgctgca ctgtgcggct 1860 aggccggtga gtgagcggcg cggagccaat cagcgctcgc cgttccgaaa gttgcctttt 1920 atggctcgac 1930 <210> 6 <211> 130 <212> DNA <213> Human herpesvirus <220> <221> promoter <222> (1)..(130) <223> CMV promoter TATA box <400> 6 taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctctc tggctaacta gagaacccac 60 tgcttactgg cttatcgaaa ttaatacgac tcactatagg gagacccaag ctggctagcg 120 tttaaactta 130 <210> 7 <211> 1019 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <220> <221> intron <222> (1)..(1019) <223> Beta-actin intron <400> 7 ctagcgagca caggcctttc gcagctcttt cttcgccgct ccacacccgc caccaggtaa 60 gcagggacaa caggcccagc cggccacagc cctcccgtgg gcagtgaccg cgctgcaggg 120 tcgcggggga cactcggcgc ggacaccggg gaaggctgga gggtggtgcc gggccgcgga 180 gcggacactt tcagatccaa ctttcagtcc agggtgtaga ccctttacag ccgcattgcc 240 acggtgtaga caccggtgga cccgctctgg ctcagagcac gcggcttggg ggaacccatt 300 agggtcgcag tgtgggcgct atgagagccg atgcagcttt cgggtgttga accgtatctg 360 cccaccttgg ggggaggaca caaggtcggg agccaaacgc cacgatcatg ccttggtggc 420 ccatgggtct ttgtctaaac cggtttgccc atttggcttg ccgggcgggc gggcgcggcg 480 ggcccggctc ggccgggtgg gggctgggtt gccactgcgc ttgcgcgctc tatggctggg 540 tattggggcg cgtgcacgct ggggagggag cccttcctct tccccctctc ccaagttaaa 600 cttgcgcgtg cgtattgaga cttggagcgc ggccaccggg gttgggcgag ggcggggccg 660 ttgtccggaa ggggcggggt cgcagcggct tcggggcgcc tgctcgcgct tcctgctggg 720 tgtggtcgcc tcccgcgcgc gcactagccg cccgccggcg gggcgaaggc ggggcttgcg 780 cccgtttggg gagggggcgg aggcctggct tcctgccgtg gggccgcctc cggaccagcg 840 tttgcctctt atggtaataa cgcggccggc ctgggcttcc tttgtcccct gagtttgggc 900 gcgcgccccc tggcggcccg aggccgcggc ttgccggaag tgggcagggc ggcagcggct 960 gcgcctagtg gcccgctagt gaccgcgacc ctcttttgtg ccctgatata gttcgccga 1019 <210> 8 <211> 673 <212> DNA <213> Human herpesvirus <220> <221> promoter <222> (1)..(673) <223> CMV promoter <400> 8 acgcgttgac attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg gtcattagtt 60 catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc gcctggctga 120 ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca 180 atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gactatttac ggtaaactgc ccacttggca 240 gtacatcaag tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg 300 cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc 360 tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacat caatgggcgt 420 ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt caatgggagt 480 ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaacaactc cgccccattg 540 acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata taagcagagc tctctggcta 600 actagagaac ccactgctta ctggcttatc gaaattaata cgactcacta tagggagacc 660 caagctggct agc 673

Claims

서열번호 8로 표시되는 CMV 프로모터 및 서열번호 7로 표시되는 β-액틴 인트론이 순차적으로 연결된 융합 프로모터.
삭제
삭제
제1항의 융합 프로모터를 포함하는 재조합 벡터.
제4항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 암피실린(ampicillin) 저항성 유전자, 가나마이신(kanamycin) 저항성 유전자 및 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라아제(chloramphenicol acetyl transferase) 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 항생제 저항성 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제4항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 도 4에 개시된 개열지도를 갖는 것을 특징으로 하는 pGL3-CMV/BA_in 재조합 벡터.
제6항의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
제7항에 있어서, 상기 세포는 동물세포 또는 동물세포 유래의 세포인 숙주 세포.
삭제
제4항의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 배양된 숙주 세포 또는 숙주 세포 배양 배지로부터 발현된 목적 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 목적 단백질 제조방법.
제4항의 재조합 벡터를 숙주 세포에 형질전환하여, 숙주 세포에서 목적 단백질을 발현시키는 방법.
제4항의 재조합 벡터를 숙주 세포에 형질전환하여, 숙주 세포에서 목적 단백질의 발현량을 증가시키는 방법.