KR20160010618A - 감소된 면역원성을 갖는 개질된 박테리오파아지 g3p 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 - Google Patents

감소된 면역원성을 갖는 개질된 박테리오파아지 g3p 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 Download PDF

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리차드 에이. 피셔
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뉴로페이지 파마슈티컬즈, 인크.
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Abstract

본 발명은 아밀로이드에 결합되고/되거나 이를 분해시키기에 충분한 섬사상 박테리오파아지 유전자 3 단백질(filamentous bacteriophage gene 3 protein)(g3p)의 부분, 예를 들면, g3p의 N1-N2 부분 및 이의 돌연변이체와 단편을 포함하는 폴리펩티드에 관한 것으로, 여기서 그 g3p 아미노산 서열은 생체 내에서 사용된 경우에 상응하는 야생형 g3p 아미노산 서열보다 면역성이 실질적으로 더 적도록 아미노산 치환을 통해 개질시켰다. 본 발명의 폴리펩티드는 아밀로이드를 결합하고/하거나 분해하는 그들의 능력을 유지한다. 더욱이, 본 발명은 아밀로이드의 미스폴딩(misfolding) 또는 응집과 관련된 질병의 치료 및/또는 예방에 있어서의 이들 변이체 g3p-폴리펩티드의 용도에 관한 것이다.

Description

감소된 면역원성을 갖는 개질된 박테리오파아지 G3P 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드{POLYPEPTIDES COMPRISING A MODIFIED BACTERIOPHAGE G3P AMINO ACID SEQUENCE WITH REDUCED IMMUNOGENICITY}
본 발명은 아밀로이드에 결합되고/되거나 이를 분해시키기에 충분한 섬사상 박테리오파아지 유전자 3 단백질(filamentous bacteriophage gene 3 protein)(g3p)의 부분, 예를 들면, g3p의 N1-N2 부분 및 이의 돌연변이체와 단편을 포함하는 폴리펩티드에 관한 것으로, 여기서 그 g3p 아미노산 서열은 생체 내에서 사용된 경우에 상응하는 야생형 g3p 아미노산 서열보다 면역성이 실질적으로 적도록 아미노산 치환을 통해 개질시켰다. 본 발명의 폴리펩티드는 아밀로이드를 결합하고/하거나 분해하는 그들의 능력을 유지한다. 본 발명은 또한 아밀로이드의 미스폴딩(misfolding) 또는 응집과 관련된 질병의 치료 및/또는 예방에 있어서의 이들 g3p-개질된 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다.
섬사상 박테리오파아지 g3p 단백질, 및 특히 g3p의 N1-N2 영역을 포함하는 이의 폴리펩티드 부분은 다양한 아밀로이드, 예를 들면, β-아밀로이드, 타우 단백질(tau protein), 및 프리온 단백질을 결합하고 분해시킨다고 입증되어 왔다. [참조: 공-계류중인 PCT 출원 PCT/US2012/066793, 및 US 가출원 US 61/801,349, 및 US 61/801,849, 이들 각각의 기술은 본원에 참조로 포함됨]. 또한 참조 [R. Krishnan et al., J. Mol . Biol . (2014)]. 그 효능에도 불구하고, 인간에 g3p 또는 그의 N1-N2 영역을 포함하는 폴리펩티드의 전신 투여는 유해한 면역 반응을 유발할 수 있음이 예상된다. 그러나, 이들 교시중 어떠한 것도 g3p의 면역 특성을 유발하거나, 이들 면역 특성을 감소 또는 제거하기 위하여 여기에 제공된 특정 개질을 제안하는 특정 T 세포 에피토프를 동정하지 못했다.
많은 재조합 또는 달리 비-천연 치료 단백질 또는 폴리펩티드의 효능은 환자의 원치않는 면역 반응에 의해 그 치료 단백질 또는 폴리펩티드로 제한될 수 있다. 단백질에 의한 면역 반응의 유도시 주요 요인은 단백질 내에 T-세포 에피토프, 즉 주요 조직적합 복합체(major histocompatibility complex)(MHC) class II 분자 상에 제시를 통해 T-세포의 활성을 자극할 수 있는 아미노산 서열의 존재이다. T-세포 에피토프는 통상 MHC class II 분자에 결합되는 능력을 갖는 임의의 아미노산 잔기로서 정의된다. MHC 분자에 결합된 경우에, T-세포 에피토프는 T-세포 수용체(TCR)에 의해 인지될 수 있고, T-세포 반응을 촉진하도록 T-세포 수용체를 결합시킴으로써 T-세포의 활성화를 유발할 수 있다. 그러나, 일반적으로 MHC class II 분자에 결합된 특정 T-세포 에피토프는 이들 펩티드가 단백질이 투여된 유기체 내에서 "자체(self)"로서 인식되기 때문에 T-세포 반응을 자극하지 못하는 것으로 이해된다.
일부 T-세포 에피토프는 세포 내에서 치료 단백질 또는 폴리펩티드의 분해 도중 펩티드로서 방출된 다음, T-세포의 활성화를 촉발하는 MHC 분자에 의해 제시될 수 있다. MHC class II 분자에 의해 제시된 펩티드의 경우, T-세포의 상기 활성화는, 이어서 예를 들면, 그러한 항체를 생성하기 위하여 B-세포의 직접 자극에 의해 항체 반응을 일으킬 수 있다.
MHC class II 분자는 헬퍼 T-세포 선택 및 활성화에서 중심 역할을 하는 상당히 다형성(polymorphic)인 단백질 그룹이다. 인간 백혈구 항원 그룹(human leukocyte antigen group) DR (HLA-DR)은 이러한 단백질 그룹의 압도적인 이소타입이다. 그러나, 이소타입 HLA-DQ 및 HLA-DP는 유사한 기능을 수행한다. 인간에서, DR 이소타입의 대략 70 상이한 알로타입(allotype)이 알려져 있으며, DQ의 경우 30 상이한 알로타입이 존재하고, DP의 경우 47 상이한 알로타입이 알려져 있다. 각각의 개체는 2 내지 4개의 DR 대립유전자, 2개의 DQ 및 2개의 DP 대립유전자를 갖는다.
개체에서 단백질 또는 폴리펩티드에 대한 면역 반응은 그 개체의 HLA-DR 알로타입의 펩티드 결합 특이성의 기능인 T-세포 에피토프 인식에 의해 상당히 영향을 받는다. 전반적인 개체와 관련하여 단백질 또는 폴리펩티드 내에서 T-세포 에피토프를 동정하기 위하여, 가능한 한 다양한 일련의 HLA-DR 알로타입의 결합 특성을 고려하고, 이에 따라 가능한 높은 퍼센트의 세계 인구를 포함하도록 고려하는 것이 바람직하다.
T-세포 에피토프 동정(identification)은 에피토프 제거에 대한 제1 단계이다. T-세포 에피토프를 검출할 수 있는 방법이 당해 분야에 공지되어 있고, WO 98/52976, WO 00/34317, US2007/0269435; US 7,208,147, Kern et al., Nature Medicine 4:975-978 (1998); 및 Kwok et al., Trends in Immunology 22:583-588 (2001)에 기재되어 있다. 이들 접근에서, 예상되거나 동정된 T-세포 에피토프는 치료 단백질 또는 폴리펩티드의 1차 서열 내에 적절한 아미노산 치환을 사용함으로써 제거된다. 이들 참조가 T-세포 에피토프의 추정상 동정을 가능하게 함에도 불구하고, 생물학적 활성에 대한 음성 영향을 피하는 아미노산 치환의 선택은 합당하게 예상할 수 없다. 그것은 단지 상기 활성에 대해 각각의 개질된 폴리펩티드를 시험함으로써 결정할 수 있다.
따라서, 그 N1-N2 부분을 포함하는 폴리펩티드가 치료학적 및/또는 진단학적 목적을 위해 만성적으로 전신 투여될 수 있도록 그의 아밀로이드-결합/분해 특성을 파괴하지 않으면서 g3p의 N1-N2 부분의 면역원성을 검사 및 감소시키는 것이 바람직하다. 본 발명은 N1-N2 서열 내에서 잠재적인 T-세포 에피토프를 동정함으로써 이러한 요구에 부합하고 있다. 본 발명은 아밀로이드에 결합되는 변이체 N1-N2의 능력을 파괴하지 않으면서 그 T-세포 에피토프의 면역원성을 감소 또는 제거하고, 아밀로이드 응집을 방지하고/하거나, 아밀로이드 플라크의 분해를 수행할 변이체 N1-N2 서열을 생성하기 위하여 이들 잠재적인 T-세포 에피토프 내에서 특정 아미노산 치환을 추가로 동정한다.
한 구현예로, 본 발명은 또한 하나 이상의 동정된 T-세포 에피토프 내에 하나 이상의 아미노산 치환으로 인하여 면역원성이 감소된, N1-N2 아미노산 서열의 변이체, 또는 이의 돌연변이체 또는 단편을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 한 측면에 있어서, 본 발명은 인간 면역글로불린 Fc 영역에 융합된 변이체 N1-N2 서열을 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
다른 구현예로, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 약제학적 조성물 및 미스폴딩 및/또는 응집된 아밀로이드 단백질과 관련된 질병으로 고생하거나 이에 걸리기 쉬운 대상체에 상기 약제학적 조성물을 투여함으로써 상기 질병을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
추가의 구현예로, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자, 및 이들 핵산 분자를 포함하는 벡터 및 상기 벡터가 하버링(harboring)된 세포를 제공한다.
다른 구현예로, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드의 제조 방법을 제공한다. 특히, 상기 방법은 핵산 분자 및/또는 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터가 하버링된 세포를 이용한다.
도 1은 굵고 밑줄이 있는 것으로 동정되는 5개의 T-세포 에피토프를 갖는 N1-N2-hlgG1-Fc 융합 단백질 (서열 번호: 1)의 아미노산 서열을 나타낸다. 아미노산 1-217은 야생형 g3p 서열의 N1-N2 부분을 구성한다. 아미노산 218-256은 M13 박테리오파아지에 존재하는 야생형 g3p 글리신-풍부 N2-C-말단 링커로 이루어진 링커 영역을 나타낸다. 이 영역은 음영(shading)으로 동정된다. 아미노산 257-261은 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 작제하는데 사용되는 다중 클로닝 부위에 의해 암호화된 아미노산을 나타낸다. 단백질의 IgG-Fc 부분은 아미노산 262에서 시작한다.
도 2는 밑줄로 동정되는 4개의 T-세포 에피토프를 갖는 g3p-hIgG1-Fc 융합 단백질 (서열 번호: 2)의 대안적 구현예의 아미노산 서열을 나타낸다. 다섯 번째 T-세포 에피토프는 서열 번호: 1의 아미노산 258 및 259에 상응하는 아미노산의 결실에 의해 제거되었다.
도 3은 굵고 밑줄이 있는 것으로 동정되는 3개의 T-세포 에피토프를 갖는 g3p-hIgG1-Fc 융합 단백질 (서열 번호: 3)의 다른 대안적 구현예의 아미노산 서열을 나타낸다. 네 번째 T-세포 에피토프는 서열 번호: 1과 비교하여 V215A 및 G220E의 치환에 의해 제거되었고, 다섯 번째 T-세포 에피토프는 서열 번호: 1의 아미노산 258 및 259에 상응하는 아미노산의 결실에 의해 제거되었다.
도 4a는 N-말단 포유동물 시그널 서열을 갖는 서열 번호: 1의 g3p-hIgG1-Fc 융합 단백질을 암호화하는 DNA 서열 (서열 번호: 4)을 나타낸다. 도 4b는 N-말단 포유동물 시그널 서열을 갖는 서열 번호: 2의 g3p-hIgG1-Fc 융합 단백질을 암호화하는 DNA 서열 (서열 번호: 5)을 나타낸다.
도 5는 N-말단 포유동물 시그널 서열을 갖는 서열 번호: 3의 g3p-hIgG1-Fc 융합 단백질을 암호화하는 DNA 서열 (서열 번호: 6)을 나타낸다.
도 6은 실시예 1에 기술된 연구에서 발현된 공혈자(donor) 알로타입의 빈도 비교를 제공한다.
도 7은 굵고 밑줄이 있는 것으로 동정되는 3개의 T-세포 에피토프를 갖는 g3p-hIgG1-Fc 융합 단백질 (서열 번호: 7)의 다른 대안적 구현예의 아미노산 서열을 나타낸다. 네 번째 T-세포 에피토프는 서열 번호: 1과 비교하여 V215G 치환에 의해 제거되었다.
도 8은 N-말단 포유동물 시그널 서열을 갖는 서열 번호: 7의 g3p-hIgG1-Fc 융합 단백질을 암호화하는 DNA 서열 (서열 번호: 8)을 나타낸다.
발명의 상세한 설명
본 발명에서, 참조 (비개질된) 아미노산 또는 핵산 서열과 관련하여 용어 "개질된(modified)" (및 그의 유사어)는 하나 이상의 아미노산 치환 또는 코돈의 상응하는 치환을 함유하는 서열을 지칭한다. 개질(modification)은 반드시 참조 서열의 물리적 조작을 요하지 않는다. 서열이 참조 서열과 비교하여 상기 치환을 함유하는 한, 그것이 합성된 방법과는 무관하게 "개질된" 것으로 여겨질 것이다. 용어 "변이체(variant)"는 참조 서열에 비하여 면역원성이 감소되도록 개질시킨 아미노산 또는 핵산 서열을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, "변이체 g3p" 또는 "변이체 N1-N2"는 (a) 섬사상 박테리오파아지 g3p 단백질의 N1-N2 부분 (예: 서열 번호: 1의 아미노산 1-217), 또는 (b) 아밀로이드에 결합되고/되거나 이를 분해하는 그 아미노산 서열의 돌연변이체 또는 단편 (예: 서열 번호: 3의 아미노산 1-217)을 포함하는 아미노산 서열 (또는 그것을 암호화하는 핵산 서열)을 지칭하며, 여기서 아미노산 서열 (또는 그것을 암호화하는 핵산 서열)은 참조 (비개질) 아미노산 서열에 비하여 면역원성이 감소되도록 개질시켰고; 여기서 개질은 표 1, 표 2, 표 6 또는 표 7중 어느 하나에 제시된 아미노산 치환 그룹으로부터 선택된 1 내지 9개의 아미노산 치환 또는 상응하는 치환으로 이루어진다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "상응하는 치환(corresponding substitution)"은 상기 돌연변이체 또는 단편이 서열 번호: 1의 아미노산 1-217과 정렬되는 경우에 표 1, 표 2, 표 6 또는 표 7의 동등한 아미노산 치환에 상응하는 서열 번호: 1의 아미노산 1-217의 돌연변이체 또는 단편의 치환을 의미한다.
아밀로이드에 결합되고/되거나 이를 분해하는 서열 번호: 1의 아미노산 1-217의 단편의 한 예는 서열 번호: 1의 아미노산 1-67을 포함하는 임의의 단편을 포함하지만, 이것으로 제한되지 않는다. 아밀로이드에 결합되고/되거나 이를 분해하는 서열 번호: 1의 아미노산 1-217의 돌연변이체의 예는: (1) 서열 번호: 3의 아미노산 1-217; (2) 아미노산 43-45에서 AAA에 의한 VVV의 치환을 갖는, 서열 번호: 1의 아미노산 1-217, 서열 번호: 3의 아미노산 1-217, 또는 서열 번호: 7의 아미노산 1-217; (3) 치환 C53W를 갖는, 서열 번호: 1의 아미노산 1-217, 서열 번호: 3의 아미노산 1-217, 또는 서열 번호: 7의 아미노산 1-217; (4) 아미노산 96-103의 결실을 갖는, 서열 번호: 1의 아미노산 1-217, 서열 번호: 3의 아미노산 1-217, 또는 서열 번호: 7의 아미노산 1-217; (5) 아미노산 212-214에서 AGA에 의한 QPP의 치환을 갖는, 서열 번호: 1의 아미노산 1-217, 서열 번호: 3의 아미노산 1-217, 또는 서열 번호: 7의 아미노산 1-217; (6) 치환 W181A, F190A 및 F194A를 갖는, 서열 번호: 1의 아미노산 1-217, 서열 번호: 3의 아미노산 1-217, 또는 서열 번호: 7의 아미노산 1-217; (7) PCT/US2012/066793에 기재된 다른 활성 돌연변이체 및 단편들; (8) 서열 번호: 7의 아미노산 1-217; (9) 서열 번호: 1의 아미노산 2-217, 서열 번호: 3의 아미노산 2-217, 또는 서열 번호: 7의 아미노산 2-217; (10) 서열 번호: 1의 아미노산 3-217, 서열 번호: 3의 아미노산 3-217, 또는 서열 번호: 7의 아미노산 3-217을 포함하지만, 이것으로 제한되지 않는다.
섬사상 박테리오파아지 g3p 단백질의 N1-N2 부분은 이미 아밀로이드 결합 및 분해 특성을 갖는 것으로 밝혀졌다 (참조: PCT US2012/066793). 천연 M13 파아지의 N1-N2 부분은 서열 번호: 1의 아미노산 1-217로 표시된다. 동일한 N1-N2 아미노산 서열은 또한 fd 및 fl 섬사상 박테리오파아지에 존재한다. 서열 번호: 1의 아미노산 218-256은 또한 천연 g3p 서열의 부분이고, 통상적으로 N3 도메인으로서 또한 공지된, g3p의 C-말단 도메인(CT)에 g3p의 N2 영역을 결합시키는 글리신-풍부 링커로서 지칭됨을 이해해야 한다. 서열 번호: 1의 아미노산 257-261은 서열 번호: 1의 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 작제하는데 사용되는 다중 클로닝 부위에 의해 암호화된 아미노산을 나타낸다.
폴리펩티드
따라서, 한 구현예로, 본 발명은 변이체 g3p 또는 변이체 N1-N2를 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명의 보다 특정한 구현예는 서열 번호: 1의 아미노산 1-217, 서열 번호: 3의 아미노산 1-217, 및 서열 번호: 7의 아미노산 1-217로부터 선택된 개시 아미노산 서열의 변이체를 포함하는 폴리펩티드를 제공하며, 여기서 (a) 폴리펩티드는 아밀로이드에 결합되고/되거나 이를 분해하고; (b) 폴리펩티드는 개시 아미노산 서열을 포함하는 상응하는 폴리펩티드에 비하여 면역원성이 감소되었고; (c) 변이체는 개시 아미노산 서열에 비하여 1 내지 9개의 아미노산 치환을 가지며, 이때 각각의 아미노산 치환은 표 1 및 표 2에 제시된, 아미노산 치환 그룹으로부터 선택된다. 본원에 사용된 바와 같이 용어 "개시 아미노산 서열을 포함하는 상응하는 폴리펩티드"는 치환(들)을 제외하고는, 개시 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 의미한다.
표 1. 서열 번호: 1, 서열 번호: 2, 서열 번호: 3 또는 서열 번호: 7의 아미노산 1-217에 대한 탈면역화(Deimmunizing) 아미노산 치환
Figure pct00001

표 2. 서열 번호: 1, 서열 번호: 2, 서열 번호: 3 또는 서열 번호: 7의 아미노산 1-217에 대한 대안적 또는 부가적인 탈면역화 아미노산 치환
Figure pct00002

* 표 1 및 2에서, 제시된 아미노산 각각은 서열 번호: 1, 3 및 7에서와 동일하다.
표 1 및 2에 제시된 아미노산 치환은 N1-N2 아미노산 서열 내에 완전히 존재하는 T-세포 에피토프를 동정함으로써 유래되었다. 이는 잠재적인 T-세포 에피토프를 동정하기 위하여 HLA-DR 알로타입의 세계 인구를 나타내는 공혈자 집단으로부터의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC: peripheral blood mononuclear cell)에 대해 N1-N2 서열의 상이한 중복 펩티드 부분을 배양시킴으로써 수행했다. 이 정보는 이어서 그들 잠재적인 에피토프 내에 최적의 아미노산 치환을 동정하기 위하여 공지된 T-세포 에피토프의 데이타베이스에 대한 소프트웨어 분석을 수행했다. 이들 절차는 실시예에 상세히 기술되어 있다.
이들 구현예의 한 측면에 있어서, 1-9개 아미노산 치환은 표 1에 제시된 것들로부터 선택된다. 상기 제시된 구현예의 보다 특정한 측면에 있어서, 폴리펩티드는 단지 특정한 단일 아미노산 치환을 갖는, 서열 번호: 1의 아미노산 1-217의 변이체 또는 서열 번호: 3의 아미노산 1-217의 변이체 또는 서열 번호: 7의 아미노산 1-217의 변이체를 포함하며, 여기서 상기 치환은 표 3에 제시된 치환중 하나로부터 선택된다:
표 3. 서열 번호: 1의 아미노산 1-217, 서열 번호: 3의 아미노산 1-217, 또는 서열 번호: 7의 아미노산 1-217중 특정한 탈-면역화 단일 아미노산 치환
Figure pct00003

일부 구현예에서, 폴리펩티드는 2 내지 9개의 아미노산 치환을 갖는 서열 번호: 1의 아미노산 1-217의 변이체 또는 서열 번호: 3의 아미노산 1-217의 변이체, 또는 서열 번호: 7의 아미노산 1-217의 변이체를 포함하며, 여기서 상기 치환은 에피토프 1, 2 및 3 중 적어도 2개에 존재하고, 상기 치환은 표 1 및 2에 제시된 것들로부터 선택된다. 보다 특정 측면에 있어서, 서열 번호: 1의 아미노산 1-217의 변이체 또는 서열 번호: 3의 아미노산 1-217의 변이체 또는 서열 번호: 7의 아미노산 1-217의 변이체중 적어도 2개의 치환은 표 1에 제시된 것들로부터 선택된다. 보다 더 특정한 측면에 있어서, 폴리펩티드는 단 2개의 아미노산 치환을 갖는 서열 번호: 1 또는 서열 번호: 3 또는 서열 번호: 7의 변이체를 포함하며, 여기서 치환은 표 4에 제시된 특정한 2개의 아미노산 치환중 어느 하나로부터 선택된다.
표 4. 서열 번호: 1의 아미노산 1-217, 서열 번호: 3의 아미노산 1-217, 또는 서열 번호: 7의 아미노산 1-217중 특정한 탈-면역화된 2개의 아미노산 치환:
Figure pct00004

다른 구현예로, 폴리펩티드는 3 내지 9개의 아미노산 치환을 갖는 서열 번호: 1의 아미노산 1-217의 변이체 또는 서열 번호: 3의 아미노산 1-217의 변이체, 또는 서열 번호: 7의 아미노산 1-217의 변이체를 포함하며, 여기서 적어도 1개의 아미노산 치환은 에피토프 1, 2 및 3 각각에 존재하고, 상기 치환은 표 1 및 2에 제시된 것들로부터 선택된다. 보다 특정 측면에 있어서, 서열 번호: 1의 아미노산 1-217의 변이체 또는 서열 번호: 3의 아미노산 1-217의 변이체 또는 서열 번호: 7의 아미노산 1-217의 변이체중 적어도 3개의 치환은 표 2에 제시된 치환들로부터 선택된다. 보다 더 특정한 측면에 있어서, 서열 번호: 1의 아미노산 1-217의 변이체 또는 서열 번호: 3의 아미노산 1-217의 변이체 또는 서열 번호: 7의 아미노산 1-217의 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 단 3개의 아미노산 치환을 가지며, 여기서 치환은 표 5에 제시된 특정한 3개의 아미노산 치환중 어느 하나로부터 선택된다.
표 5. 서열 번호: 1의 아미노산 1-215, 서열 번호: 3의 아미노산 1-217, 또는 서열 번호: 7의 아미노산 1-217중 특정한 탈-면역화된 3개의 아미노산 치환:
Figure pct00005

다른 구현예로, 본 발명은 1 내지 9개의 치환중 하나가 V215A, V215S, V215G 또는 V215T, V215C, V215D, V215E, V215F, V215H, V215K, V215N, V215P, V215Q, 또는 V215R로부터 선택되는 에피토프 4의 치환인, g3p 변이체를 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 또 다른 구현예로, 본 발명은 서열 번호: 1의 아미노산 1-217의 변이체를 포함하는 폴리펩티드를 제공하며, 여기서 1 내지 9개의 치환중 하나는 V215A, V215S, V215G, V215T, V215C, V215D, V215E, V215F, V215H, V215K, V215N, V215P, V215Q, 또는 V215R로부터 선택되는 에피토프 4의 치환이다. N1-N2 서열의 중복되는 잠재적인 T-세포 에피토프 펩티드 부분의 시험을 통해, 출원인은 서열 번호: 1의 V215가 서열 번호의 아미노산 215-223에 걸친 (글리신-풍부 링커의 부분을 통해 N2의 말단) 잠재적인 T-세포 에피토프 (도 1의 에피토프 4)의 일부라고 결정했다. 에피토프 4에서 V215A 및 G220E 치환 (참조: 서열 번호: 3)은 아밀로이드에 결합되는 폴리펩티드의 능력에 영향을 주지 않지만, 후속 분석은 이들 치환중 하나 또는 모두가 각각의 에피토프 1, 2 및 3에서 표 1 및 2에 제시된 특정 변화와 조합되는 경우에, 아밀로이드를 분해하는 생성된 폴리펩티드의 능력을 감소시킨다고 제시하였다. 서열 번호: 1과 비교하여 에피토프 4에서 단일 V215G 치환 (참조: 서열 번호: 7)은 아밀로이드에 결합되거나 이를 분해하는 폴리펩티드의 능력에 영향을 주지 못했다. 이들 에피토프 4 치환은 각각 T-세포 에피토프를 제거하는 것으로 소프트웨어 및 데이타베이스에 의해 예상되었다. 상기 제시된 V215에 대한 다른 치환들은 각각 유사하게 T-세포 에피토프를 제거하는 것으로 예상되는 반면에, 아밀로이드 결합에는 거의 영향이 없다.
보다 특정 측면에 있어서, 서열 번호: 1의 아미노산 1-217의 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 표 1 또는 표 2에 제시된 아미노산 치환중 1 내지 8개뿐만 아니라, 상기 제시된 V215 치환중 어느 하나를 갖는다. 보다 더 특정한 구현예로, 1 내지 8개의 아미노산 치환은 표 1에 제시된 것들로부터 선택된다. 보다 더 특정한 측면에 있어서, 폴리펩티드는 상기 제시된 V215 치환중 어느 하나, 및 표 3에 제시된 것들로부터 선택된 1개의 부가 단일 아미노산 치환을 갖는다. 보다 특정한 측면에 있어서, 서열 번호: 1의 아미노산 1-217의 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 상기 제시된 V215 치환중 어느 하나 및 2 내지 8개의 부가 아미노산 치환을 가지며, 여기서 부가의 치환은 에피토프 1, 2 및 3 중 적어도 2개에 존재하고, 치환은 표 1 또는 표 2에 제시된 것들로부터 선택된다. 보다 더 특정한 구현예로, 에피토프 1, 2 및 3 중 적어도 2개의 적어도 1개의 치환은 표 1에 제시된 치환으로부터 선택된다. 보다 더 특정한 구현예로, 폴리펩티드는 상기 제시된 V215 치환중 하나, 및 표 4에 제시된 특정한 2개의 아미노산 치환을 갖는다.
보다 특정 측면에 있어서, 서열 번호: 1의 아미노산 1-217의 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 상기 제시된 V215 치환중 어느 하나, 및 표 1 또는 표 2에 제시된 것들로부터 선택된 3 내지 8개의 부가 아미노산 치환을 가지며, 여기서 각각의 에피토프 1, 2 및 3은 부가의 치환들중 하나를 포함한다. 보다 더 특정한 구현예로, 각각의 에피토프 1, 2 및 3에서의 치환은 표 1에 제시된 것들로부터 선택된다. 보다 더 특정한 구현예로, 폴리펩티드는 상기 제시된 V215 치환중 하나, 및 표 5에 제시된 특정한 3개의 아미노산 치환을 갖는다. 보다 더 특정한 구현예로, 폴리펩티드는 V215G 치환 및 T56H, M135K 및 D178N: T56K, M135K 및 D178N; T56K, M135T 및 D178N; T56H, M135K 및 W181R; T56H, M135T 및 W181R; Y54K, M135T 및 K174R; Y54R, M135K 및 K174R; Y54R, M135T 및 K174R; T56H, M135K 및 K174R; 및 T56H, M135T 및 K174R로부터 선택되는 3개의 아미노산 치환을 갖는다.
다른 구현예로, 본 발명의 폴리펩티드는 필수적으로 변이체 g3p 아미노산 서열의 C-말단에 펩티드 링커를 통해 또는 직접 융합된 인간 또는 인간화 면역글로불린 Fc 폴리펩티드 서열로 이루어진 융합 단백질이다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "펩티드 링커(peptide linker)"는 폴리펩티드의 기능을 방해하지 않을 일련의 연속 아미노산을 지칭한다. 상기 제시된 바와 같이, 서열 번호: 1 내지 3 및 7에서, 아미노산 218-256은 보통 M13 g3p 단백질에 존재하는 글리신-풍부 링커를 나타낸다. 그 링커가 사용될 수 있거나, 다른 링커가 본 발명의 폴리펩티드에 그 대신 치환될 수 있다. 대안적으로, Fc 폴리펩티드 서열은 N2를 암호화하는 마지막 아미노산 (예: 서열 번호: 1 내지 3의 아미노산 217)에 직접 결합될 수 있다. 링커 서열의 선택 및/또는 그의 부재는 본 발명의 폴리펩티드의 재조합 발현에 유용한 벡터를 고려하여 당 분야의 숙련가들에 의해 제조될 수 있고, 상기 링커의 임의의 2차 또는 3차 구조가 폴리펩티드에 부여될 수 있다. 본 구현예의 한 측면에 있어서, Fc 폴리펩티드는 인간 IgG의 Fc 부분이다. 보다 특정 측면에 있어서, 폴리펩티드는 표 1, 표 2, 또는 하기 표 6이나 표 7에 제시된 아미노산 치환 그룹으로부터 선택되는 1 내지 9개의 아미노산 잔기 치환을 그 안에 갖는, 서열 번호: 1, 서열 번호: 2 서열 번호: 3 또는 서열 번호: 7의 변이체이다:
표 6. 서열 번호: 1의 아미노산 215-223에 대한 탈면역화된 아미노산 치환
Figure pct00006

표 7. 서열 번호: 1 또는 서열 번호: 2의 아미노산 215-223에 대한 대안적 및 부가적인 탈면역화된 아미노산 치환
Figure pct00007

* V215A 및 G220E는 서열 번호: 3에서 이미 치환됨으로써, 서열 번호: 3의 변이체는 이들 아미노산 잔기에 추가의 치환을 함유하지 않도록 한다.
** V215G 치환이 이미 서열 번호: 7에 존재함으로써, 서열 번호: 7의 변이체는 이들 아미노산 잔기에 추가의 치환을 함유하지 않도록 한다.
보다 더 특정한 측면에 있어서, 폴리펩티드는 2 내지 9개의 아미노산 치환을 갖는, 서열 번호: 1 또는 서열 번호: 2의 변이체로, 여기서 치환중 하나는 표 6 및 표 7에 제시된 치환이고, 치환중 적어도 하나는 표 1 및 표 2에 제시된 치환이다. 보다 더 특정한 측면에 있어서, 폴리펩티드는 서열 번호: 1 또는 서열 번호: 2의 변이체이고, 2 내지 9개의 아미노산 치환; 표 6에 제시된 치환중 적어도 하나; 및 표 1에 제시된 치환중 적어도 하나를 갖는다. 다른 보다 특정한 측면에 있어서, 폴리펩티드는 서열 번호: 1 또는 서열 번호: 2의 변이체이고, 3 내지 9개의 아미노산 치환을 가지며, 여기서 치환중 적어도 하나는 표 6 및 표 7에 제시된 치환으로부터 선택되고, 에피토프 1, 2 및 3 중 적어도 2개는 표 1 및 표2에 제시된 치환으로부터 선택되는 적어도 1개의 치환을 함유한다. 보다 특정한 측면에 있어서, 폴리펩티드는 서열 번호: 1 또는 서열 번호: 2의 변이체이고, 표 6에 제시된 치환중 적어도 하나 및 표 1에 제시된 치환으로부터 선택되는 에피토프 1, 2 및 3의 적어도 2개중 적어도 1개의 치환을 갖는다. 다른 보다 특정한 측면에 있어서, 폴리펩티드는 서열 번호: 1 또는 서열 번호: 2의 변이체이고, 4 내지 9개의 아미노산 치환; 표 6 및 표 7에 제시된 치환중 적어도 하나; 및 표 1 및 표 2에 제시된 치환으로부터 선택되는 각각의 에피토프 1, 2 및 3 중 적어도 하나의 치환을 갖는다. 보다 특정한 측면에 있어서, 폴리펩티드는 서열 번호: 1 또는 서열 번호: 2의 변이체이고, 표 6에 제시된 치환중 적어도 하나 및 표 1에 제시된 것들로부터 선택되는 각각의 에피토프 1, 2 및 3 중 적어도 하나의 치환을 갖는다. 다른 보다 특정한 측면에 있어서, 폴리펩티드는 서열 번호: 1 또는 서열 번호: 2의 변이체이고, 표 6에 제시된 치환중 적어도 하나; 및 표 3, 표 4 또는 표 5에 각각 제시된 특정한 치환 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환중 적어도 하나를 갖는다. 본 구현예의 또 다른 보다 특정한 측면에 있어서, 폴리펩티드는 서열 번호: 1 또는 서열 번호: 2의 변이체이고, 표 6에 제시된 아미노산 치환중 단지 하나, 및 표 3, 표 4 또는 표 5에 각각 제시된 특정한 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환으로부터 선택된 단지 1, 2 또는 3개의 부가적인 아미노산 치환을 갖는다.
대안적 구현예로, 폴리펩티드는 서열 번호: 3 또는 서열 번호: 7의 변이체이고, 표 1 및 표 2에 제시된 아미노산 치환 그룹으로부터 선택되는 1 내지 9개의 아미노산 잔기 치환을 갖는다. 보다 특정한 측면에 있어서, 적어도 하나의 치환은 표 1에 제시되어 있다. 다른 보다 특정한 측면에 있어서, 폴리펩티드는 서열 번호: 3 또는 서열 번호: 7의 변이체이고, 2 내지 9개의 아미노산 치환 및 표 1 및 표 2에 제시된 치환중 어느 하나로부터 선택되는 에피토프 1, 2 및 3의 적어도 2개중 적어도 하나의 치환을 갖는다. 보다 특정한 측면에 있어서, 에피토프 1, 2 및 3의 적어도 2개중 적어도 하나의 치환은 표 1에 제시된 것들로부터 선택된다. 다른 보다 특정한 측면에 있어서, 폴리펩티드는 서열 번호: 3 또는 서열 번호: 7의 변이체이고, 3 내지 9개의 아미노산 치환을 가지며, 여기서 적어도 하나의 치환은 각각의 에피토프 1, 2 및 3에 존재하고, 표 1 및 표 2에 제시된 치환중 어느 하나로부터 선택된다. 보다 특정한 측면에 있어서, 각각의 에피토프 1, 2 및 3 중 적어도 하나의 치환은 표 1에 제시된 것들로부터 선택된다. 보다 더 특정한 구현예로, 폴리펩티드는 서열 번호: 3 또는 서열 번호: 7의 변이체이고, 표 3, 표 4 또는 표 5에 각각 제시된 특정한 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환중 하나로부터 선택되는 단지 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환을 갖는다.
다른 구현예로, 본 발명의 폴리펩티드는 표 4에 제시된 특정한 2개의 아미노산 치환중 어느 하나로부터 선택되는 단 2개의 아미노산 치환을 갖는, 서열 번호: 3 또는 서열 번호: 7의 변이체이다. 다른 구현예로, 본 발명의 폴리펩티드는 표 5에 제시된 특정한 3개의 아미노산 치환중 어느 하나로부터 선택되는 단 3개의 아미노산 치환을 갖는, 서열 번호: 3 또는 서열 번호: 7의 변이체이다. 보다 특정한 구현예로, 본 발명의 폴리펩티드는 표 5에 제시된 특정한 3개의 아미노산 치환중 어느 하나로부터 선택되는 단 3개의 아미노산 치환을 갖는, 서열 번호: 7의 변이체이다. 다른 보다 특정한 구현예로, 본 발명의 폴리펩티드는 하기 특정한 3개 아미노산 치환 세트중 어느 하나로부터 선택되는 단 3개의 아미노산 치환을 갖는, 서열 번호: 7의 변이체이다: T56H, M135K 및 D178N: T56K, M135K 및 D178N; T56K, M135T 및 D178N; T56H, M135K 및 W181R; T56H, M135T 및 W181R; Y54K, M135T 및 K174R; Y54R, M135K 및 K174R; Y54R, M135T 및 K174R; T56H, M135K 및 K174R; 및 T56H, M135T 및 K174R.
핵산 분자, 서열, 벡터 및 숙주 세포
다른 구현예로, 본 발명은 상기 기술한 3gp 변이체를 포함하는 폴리펩티드 또는 융합 단백질중 임의의 것을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 단리된(isolated) 핵산 분자를 제공한다. 본 구현예의 한 측면에 있어서, 단리된 핵산 분자는 1 내지 9개의 코돈 치환에 의해 개질된, 서열 번호: 4의 뉴클레오티드 64-714의 변이체를 포함하며, 여기서 각각의 코돈 치환은 표 1 및 표 2에 제시된 치환으로부터 선택되는 아미노산 치환, 및 하기의 V215 아미노산 치환중 어느 하나에 상응한다: V215A, V215S, V215G 또는 V215T, V215C, V215D, V215E, V215F, V215H, V215K, V215N, V215P, V215Q, 및 V215R. 이들 구현예의 보다 더 특정한 측면에 있어서, 변이체 핵산 서열은 상기 제시된 V215 아미노산 치환중 어느 하나를 암호화하도록, 그리고 1 내지 8개의 부가 코돈 치환으로부터 선택된 1개의 코돈 치환에 의해 개질되며, 여기서 각각의 부가 코돈 치환은 표 1에 제시된 아미노산 치환을 암호화하도록 선택된다. 이들 구현예의 보다 더 특정한 측면에 있어서, 변이체 핵산 서열은 상기 제시된 V215 아미노산 치환중 어느 하나를 암호화하도록, 그리고 2 내지 8개의 부가 코돈 치환으로부터 선택되는 1개의 코돈 치환에 의해 개질되며, 여기서 각각의 부가 코돈 치환은 표 1에 제시된 아미노산 치환을 암호화하고, 코돈 치환은 각각의 에피토프 1, 2 및 3 중 적어도 2개 각각에 존재한다. 보다 더 특정한 구현예로, 변이체 핵산 서열은 상기 제시된 V215 아미노산 치환중 어느 하나를 암호화하도록, 그리고 3 내지 8개의 부가 코돈 치환으로부터 선택되는 1개의 코돈 치환에 의해 개질되며, 여기서 각각의 부가 코돈 치환은 표 1에 제시된 아미노산 치환을 암호화하고, 코돈 치환은 각각의 에피토프 1, 2 및 3에 존재한다. 보다 더 특정한 구현예로, 변이체 핵산 서열은 V215A 아미노산 치환을 암호화하도록 선택된 1개의 코돈 치환; 및 표 3에 제시된 단일 아미노산 치환중 하나를 암호화하도록 선택된 1개의 부가 코돈 치환에 의해 개질된다. 보다 더 특정한 구현예로, 변이체 핵산 서열은 V215G 아미노산 치환을 암호화하도록 선택된 1개의 코돈 치환; 및 표 3에 제시된 단일 아미노산 치환중 하나를 암호화하도록 선택된 1개의 부가 코돈 치환에 의해 개질된다. 다른 특정한 구현예로, 변이체 핵산 서열은 상기 제시된 V215A 아미노산 치환을 암호화하도록 선택된 1개의 코돈 치환; 및 표 4에 제시된 특정한 2개의 아미노산 치환중 하나를 암호화하도록 선택된 2개의 부가 코돈 치환에 의해 개질된다. 다른 특정한 구현예로, 변이체 핵산 서열은 상기 제시된 V215G 아미노산 치환을 암호화하도록 선택된 1개의 코돈 치환; 및 표 4에 제시된 특정한 2개의 아미노산 치환중 하나를 암호화하도록 선택된 2개의 부가 코돈 치환에 의해 개질된다. 보다 더 특정한 구현예로, 변이체 핵산 서열은 상기 제시된 V215 아미노산 치환을 암호화하도록 선택된 1개의 코돈 치환; 및 표 5에 제시된 특정한 3개의 아미노산 치환중 하나를 암호화하도록 선택된 3개의 부가 코돈 치환에 의해 개질된다. 보다 더 특정한 구현예로, 변이체 핵산 서열은 상기 제시된 V215G 아미노산 치환을 암호화하도록 선택된 1개의 코돈 치환; 및 표 5에 제시된 특정한 3개의 아미노산 치환중 하나를 암호화하도록 선택된 3개의 부가 코돈 치환에 의해 개질된다.
또 다른 구현예로, 단리된 핵산 분자는 서열 번호: 4의 뉴클레오티드 64-1530 또는 서열 번호: 5의 뉴클레오티드 64-1524의 변이체를 포함하며, 여기서 서열은 1 내지 9개의 코돈 치환에 의해 개질되고, 여기서 각각의 코돈 치환은 표 1, 표 2에 제시된 치환, 및 다음의 V215 아미노산 치환: V215S, V215G 또는 V215T, V215C, V215D, V215E, V215F, V215H, V215K, V215N, V215P, V215Q, 및 V215R 중 어느 하나로부터 선택되는 아미노산 치환에 상응한다. 보다 특정한 구현예로, 각각의 코돈 치환은 표 1에 제시된 치환들, 및 상기 제시된 V215 치환중 어느 하나로부터 선택되는 아미노산 치환에 상응한다. 보다 더 특정한 구현예로, 변이체 핵산 서열은 상기 제시된 V215 아미노산 치환중 어느 하나를 암호화하도록, 그리고 1 내지 8개의 부가 코돈 치환으로부터 선택되는 1개의 코돈 치환에 의해 개질되며, 여기서 각각의 부가 코돈 치환은 표 1에 제시된 치환으로부터 선택된 아미노산 치환에 상응한다. 보다 특정한 측면에 있어서, 변이체는 표 3에 제시된 특정한 1개 아미노산 치환중 하나에 상응한다. 보다 더 특정한 구현예로, 서열 번호: 4의 뉴클레오티드 64-1530 또는 서열 번호: 5의 뉴클레오티드 64-1524의 변이체는 상기 제시된 V215 아미노산 치환중 어느 하나를 암호화하도록, 그리고 2 내지 8개의 부가 코돈 치환으로부터 선택되는 1개의 코돈 치환으로 이루어진 개질을 가지며, 여기서 각각의 부가 코돈 치환은 표 1에 제시된 아미노산 치환에 상응하고, 코돈 치환은 에피토프 1, 2 및 3 중 적어도 2개 각각에 존재한다. 보다 특정한 측면에 있어서, 변이체는 표 4에 제시된 특정한 2개 아미노산 치환중 하나에 상응하는 2개의 부가 코돈 치환을 갖는다. 보다 더 특정한 구현예로, 서열 번호: 4의 뉴클레오티드 64-1530 또는 서열 번호: 5의 뉴클레오티드 64-1524중 어느 하나의 변이체는 상기 제시된 V215 아미노산 치환중 어느 하나를 암호화하도록, 그리고 3 내지 8개의 부가 코돈 치환으로부터 선택되는 1개의 코돈 치환으로 이루어진 개질을 가지며, 여기서 각각의 부가 코돈 치환은 표 1에 제시된 아미노산 치환에 상응하고, 코돈 치환은 각각의 에피토프 1, 2 및 3에 존재한다. 보다 특정한 측면에 있어서, 변이체는 표 5에 제시된 특정한 3개 아미노산 치환중 하나에 상응하는 3개의 부가 코돈 치환을 갖는다.
또 다른 구현예로, 단리된 핵산 분자는 서열 번호: 6의 뉴클레오티드 64-1524 또는 서열 번호: 8의 뉴클레오티드 64-1524의 변이체를 포함하며, 여기서 변이체 핵산 서열은 1 내지 9개의 코돈 치환에 의해 개질되고, 여기서 각각의 코돈 치환은 표 1 또는 표 2에 제시된 치환으로부터 선택되는 아미노산 치환에 상응한다. 보다 특정한 구현예로, 각각의 코돈 치환은 표 1에 제시된 치환으로부터 선택되는 아미노산 치환에 상응한다. 보다 더 특정한 구현예로, 변이체는 표 3에 제시된 특정한 1개 아미노산 치환에 상응한다. 보다 더 특정한 구현예로, 서열 번호: 6의 뉴클레오티드 64-1524 또는 서열 번호: 8의 뉴클레오티드 64-1524의 변이체는 2 내지 8개의 코돈 치환에 의해 개질되며, 여기서 각각의 코돈 치환은 표 1에 제시된 아미노산 치환에 상응하며, 코돈 치환은 에피토프 1, 2 및 3 중 적어도 2개 각각에 존재한다. 보다 특정한 측면에 있어서, 변이체는 표 4에 제시된 특정한 2개의 아미노산 치환중 하나에 상응하는 2개의 부가 코돈 치환을 갖는다. 보다 더 특정한 구현예로, 서열 번호: 6의 뉴클레오티드 64-1524 또는 서열 번호: 8의 뉴클레오티드 64-1524의 변이체는 3 내지 8개의 코돈 치환에 의해 개질되며, 여기서 각각의 코돈 치환은 표 1에 제시된 아미노산 치환에 상응하며, 코돈 치환은 각각의 에피토프 1, 2 및 3에 존재한다. 보다 특정한 측면에 있어서, 변이체는 표 5에 제시된 특정한 3개의 아미노산 치환중 하나에 상응하는 3개의 부가 코돈 치환을 갖는다. 보다 더 특정한 측면에 있어서, 변이체는 3개 아미노산 치환의 하기 특정 세트중 하나에 상응하는 3개의 부가 코돈 치환을 갖는다: T56H, M135K 및 D178N; T56K, M135K 및 D178N; T56K, M135T 및 D178N; T56H, M135K 및 W181R: T56H, M135T 및 W181R; Y54K, M135T 및 K174R; Y54R, M135K 및 K174R; Y54R, M135T 및 K174R; T56H, M135K 및 K174R과; T56H, M135T 및 K174R.
본 발명의 핵산 분자의 또 다른 구현예로, 핵산 분자는 변이체 g3p를 암호화하는 핵산 서열의 5' 말단에 직접 및 단계적으로 융합된 시그널 서열을 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 이들 구현예의 한 측면에 있어서, 시그널 서열을 암호화하는 핵산 서열은 서열 번호: 4의 뉴클레오티드 1-63이다.
본 발명의 핵산 분자는 상기 기술한 핵산 분자중 어느 하나에 의해 암호화된 것과 동일한 아미노산 서열에 대해 변성되지만, 이를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다.
재조합체 생산의 경우, 본 발명의 핵산 분자중 어느 하나는 삽입된 암호화 서열의 전사 및 번역을 위해 필수적인 성분들을 함유하거나, RNA 바이러스 벡터의 경우에, 복제 및 번역을 위한 필수적인 성분들을 함유하는 적절한 발현 벡터내로 삽입시킬 수 있다. 암호화 핵산은 적절한 해독 프레임(reading frame)으로 벡터내에 삽입된다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 핵산 분자 및 서열을 포함하는 벡터를 제공한다. 이러한 벡터들은 DNA 벡터, 파아지 벡터, 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 핵산 분자 및 서열이 클로닝되는 적절한 벡터의 선택은 발현을 수행하는 선택된 숙주 세포와 벡터의 혼용성의 잘 공지된 지식을 사용하여 당해 분야의 숙련가가 수행할 수 있다. 이는 포유동물 세포, 식물 세포, 곤충 세포, 박테리아 세포, 효모 세포 등중 어느 하나에서 수행할 수 있다. 각각의 이들 세포 형태에 대한 적절한 백터는 당해 분야에 잘 공지되어 있고, 일반적으로 시판되고 있다.
다른 구현예로, 본 발명은 본 발명의 핵산 분자 또는 핵산 서열을 함유하는 벡터를 하버링하는 숙주 세포를 제공한다. 본 발명의 벡터를 숙주 세포로 형질감염 또는 형질변형 또는 달리 수득하는 방법이 당해 분야에 공지되어 있다. 벡터를 하버링한 세포는 적절한 조건하에 배양한 경우에, 본 발명의 폴리펩티드를 생성할 것이다. 본 발명의 폴리펩티드의 재조합 생산에 사용된 벡터 및 세포의 특정 예가 하기 실시예 섹션에 제시되어 있다.
약제학적 조성물
일부 구현예로, 본 발명은 임의로 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 함께, 변이체 g3p를 포함하는 임의의 폴리펩티드 또는 융합 단백질을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. "약제학적 조성물"은 생리학적으로 적절한 담체 및/또는 부형제를 갖는 본원에 기술된 바와 같은 치료학적 유효량의 조성물을 지칭한다. 약제학적 조성물은 유기체에 유의적인 자극을 유발하지 않는다. 상호교환적으로 사용될 수 있는 구문 "생리학적으로 적절한 담체(physiologically suitable carrier)" 및 "약제학적으로 허용가능한 담체(pharmaceutically acceptable carrier)"는 유기체에 대해 유의적인 자극을 유발하지 않으며 투여된 조성물의 생물학적 활성 및 특성을 제거하지 않는 담체 또는 희석제를 지칭한다. 용어 "부형제"는 약제학적 조성물에 가해져서 활성 성분의 투여를 추가로 용이하게 하는 불활성 물질을 지칭한다. 예들은, 예를 들면, 염수, 탄산칼슘, 인산칼슘, 각종 당들 및 전분 유형들, 셀룰로즈 유도체, 젤라틴, 식물성 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 및 예를 들면, 폴리소르베이트 20을 포함하는 표면활성제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 약제학적 조성물은 활성 성분을 약제학적으로 사용될 수 있는 조성물로 가공하는 것을 용이하게 하는, 부형제 및 보조제를 포함하는 하나 이상의 생리학적으로 허용되는 담체를 사용하여 통상의 방식으로 제형화할 수 있다. 적절한 제형은 선택된 투여 경로 및 전달된 조성물의 특성(예를 들면, 폴리펩티드의 크기 및 용해도)에 의존한다. 이들 구현예의 한 측면에 있어서, 약제학적 조성물은 환자의 혈류내로 주사 또는 주입을 위해 제형화된다. 이들 구현예의 다른 측면에 있어서, 약제학적 조성물은, 예를 들면, 골수내, 척추강내 또는 심실내 주사에 의해 환자의 뇌 또는 중추신경계로 직접 투여하도록 제형화된다.
본원에 기술된 조성물은 비경구 투여를 위해, 예를 들면, 볼루스 주사(bolus injection) 또는 연속 주입에 의해 제형화할 수 있다. 비경구 투여를 위한 약제학적 조성물은 수용성 형태인 조성물의 수용액을 포함한다. 부가적으로, 활성 성분의 현탁액은 오일 또는 수계 주사 현탁액들로서 제조할 수 있다. 적합한 친지성 용매들 또는 비히클은 참기름과 같은 지방 오일들, 또는 에틸 올레이트, 트리글리세라이드 또는 리포좀과 같은 합성 지방산 에스테르들을 포함한다. 수성 주사 현탁액은 나트륨 카복시메틸 셀룰로즈, 소르비톨 또는 덱스트란과 같은, 현탁액의 점도를 증가시키는, 물질들을 함유할 수 있다. 임의로, 현탁액은 또한 활성 성분들의 용해도를 증가시켜서 고도로 농축된 용액의 제조를 허용하는 적합한 안정화제 또는 제제들(예를 들면, 폴리소르베이트(트윈 20)와 같은 표면활성제)을 함유할 수 있다. 예를 들면, 알부민과 같은 단백질계 제제를 사용하여 전달 표면(즉, IV 백, 카테터, 니들 등)에 본 발명의 폴리펩티드가 흡수되는 것을 방지할 수 있다.
경구 투여를 위해, 조성물은 활성 화합물을 당해 분야에 잘 공지된 약제학적으로 허용가능한 담체와 조합하여 용이하게 제형화될 수 있다.
제형은 단위 용량형(unit dosage form)으로, 예를 들면, 바이알(vial), 앰플 또는 다중투여량 용기 속에 임의로, 첨가된 보존제와 함께 제공할 수 있다. 조성물은 유성 또는 수성 비히클 속의 현탁액, 용액 또는 유액일 수 있으며, 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제형화제를 함유할 수 있다. 단일 용량형은 액체 또는 고체형일 수 있다. 단일 용량형은 변형없이 환자에게 직접 투여될 수 있거나 투여 전 희석되거나 재구성될 수 있다. 특정 구현예에서, 단일 용량형은 거환 형태(bolus form), 예를 들면, 단일 주사제, 다수의 정제, 캅셀제, 환제 등을 포함하는 경구 투여량을 포함하는, 단일 경구 투여량으로 투여될 수 있다. 대안적인 구현예에서, 단일 용량형은 기간에 걸쳐, 주입에 의해, 또는 ICV 펌프와 같은 이식된 펌프를 통해 투여될 수 있다. 후자의 구현예에서, 단일 용량형은 변이체 g3p를 포함하는 적절한 양의 폴리펩티드 또는 융합 단백질로 예비-충전된 주입 백 또는 펌프 저장기(pump reservoir)일 수 있다. 대안으로는, 주입 백 또는 펌프 저장기는 환자에게 투여 직전에 변이체 g3p의 적절한 양을 주입 백 또는 펌프 저장기 용액과 혼합하여 제조할 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 본 발명의 약제학적 조성물의 제조 방법을 포함한다. 약물들의 제형을 위한 기술은 예를 들면, 이의 전문이 참조로 본원에 포함된 문헌(참조: "Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, Pa., 최신판)에서 찾을 수 있다.
본 발명의 내용에서 사용하기에 적합한 약제학적 조성물은, 활성 성분들이 의도된 목적을 달성하기에 효과적인 양으로 함유된 조성물들을 포함한다.
치료학적 또는 진단학적 유효량의 결정은 특히 본원에 제공된 상세한 기재내용의 측면에서, 당해 분야의 숙련가들의 능력내에 잘 속한다.
용량 및 간격은 개별적으로 조절하여 특정한 뇌 질병, 장애, 또는 상태를 치료하거나 진단하기에 충분한 파아지 디스플레이 비히클의 뇌 수준(최소 유효 농도, MEC)을 제공할 수 있다. MEC는 각각의 제제에 대해 변할 것이나, 시험관내 데이터로부터 추정될 수 있다. MEC를 달성하는데 필수적인 용량들은 개개의 특성들에 좌우될 것이다.
용량 간격은 또한 MEC 값을 사용하여 측정할 수 있다. 제제들은 시간의 10-90%, 바람직하게는 30-90% 및 가장 바람직하게는 50-90%에 대해 MEC를 초과하는 뇌 수준들을 유지하는, 치료요법(regimen)을 사용하여 투여할 수 있다.
치료될 상태의 중증도 및 반응성에 따라서, 투여량은 수 일 내지 수 주간 지속되는 치료의 과정으로 또는 치유가 달성되거나 질병 상태의 축소가 달성될 때까지 단일 또는 다수의 투여일 수 있다.
투여될 조성물의 양은 물론 치료되거나 진단되는 피검자, 고통의 중증도, 주치의의 판단 등에 따를 것이다.
본 발명의 조성물은 경우에 따라, 활성 성분을 함유하는 하나 이상의 단위 용량 형들을 함유할 수 있는 FDA 승인된 키트와 같은 팩 또는 디스펜서 장치로 제공될 수 있다. 팩은 예를 들면, 블리스터 팩과 같은 금속 또는 플라스틱 호일을 포함할 수 있다. 팩 또는 디스펜서 장치는 투여 지시들이 동반될 수 있다. 팩 또는 디스펜서는 또한 조성물의 형태 또는 인간 또는 가축 투여의 기관에 의한 승인을 반영하는, 약제들의 제조, 사용 또는 판매를 조절하는 정부 단체가 처방한 형태의 용기와 관련된 통지를 동반할 수 있다. 이러한 통지는, 예를 들면, 처방 약물들을 위해 미국 식품 및 의약품 안정청이 승인한 표지 또는 승인된 제품 삽입물일 수 있다. 혼용성의 약제학적 담체 속에 제형화된 본 발명의 제제를 포함하는 조성물은 또한 제조되고, 적절한 용기 속에 두어, 위에서 추가로 상세히 설명한 바와 같이, 나타낸 상태의 치료를 위해 표지할 수 있다.
앞서의 그리고 다음의 설명 둘 다는 단지 예시하고 설명하기 위한 것으로서, 특허청구된 바와 같이, 본 발명을 한정하는 것이 아닌 것으로 이해된다.
치료학적 용도
본 발명의 다른 측면은 fAβ42, fαsyn, fNM, 또는 ftau 중 임의의 것을 포함하는 질병들을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 단백질 미스폴딩(misfolding) 질병들의 치료 시, 본 발명의 폴리펩티드, 핵산 분자, 또는 조성물 중 임의의 것의 용도에 관한 것이다.
치료들과 관련하여, 용어 "환자(patient)", "대상체(subject)" 및 "수용체(recipient)"는 상호교환적으로 사용되며, 인간뿐만 아니라 다른 포유동물들을 포함한다. 일부 구현예에서, 환자는 단백질 미스폴딩 질병과 관련된 바이오마커에 대해 양성인 인간이다. 하나의 구현예에서, 환자는 플로르베타피르를 사용한 PET 영상화에 의해 검출한 것으로서 β-아밀로이드 침착을 나타낸다.
용어 "치료하는(treating)"은 질병의 하나 이상의 임상 증상들을 나타내는 환자에서 질병의 진행을 감소시키거나, 지연시키거나 회복시킴을 의미하는 것으로 의도된다. "치료하는"은 또한 질병의 하나 이상의 임상 증상들을 나타내는 환자에서 질병의 증상들을 감소시키거나, 지연시키거나, 회복시킴을 의미하는 것으로 의도된다. 하나의 구현예에서, 환자는 플로르베타피르를 사용한 PET 영상화에 의해 검출된 것으로서 β-아밀로이드 침착물을 나타내며, 다수의 β-아밀로이드 침착물은 당해 처리로 감소된다. 하나의 구현예에서, 환자는 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 조성물에 의해 검출된 것으로서 β-아밀로이드 침착물을 나타내며, 다수의 β-아밀로이드 침착물은 치료에 의하여 감소되거나 유지된다. 다른 구현예에서, 환자는 PET 영상화에 의해 검출된 것으로서 아밀로이드 침착물들의 임의의 유형도 나타내며, 환자의 인지 기능은 당해 치료에 의해 개선된다. 인지 기능에 있어서의 개선은 문헌(참조: McKhann et al., Alzheimer's & Dementia 7(3):263-9 (2011))의 방법 및 시험들에 의해 검정될 수 있다.
"예방(prophylaxis)"은 치료와는 구별되며 임의의 임상 증상들의 발병 전에 개인에게 조성물을 투여함을 말한다. 본 발명의 폴리펩티드 또는 이의 조성물 중의 어느 하나를 사용한 예방이 포함된다. 예방은 질병에 대한 위험이 증가되는 것으로 공지된 개인들, 또는 하나 이상의 유전 마커들을 근거로 단독으로 질병으로 진행되는 것이 확실한 개인들에서 연루될 수 있다. 많은 유전 마커들이 다양한 단백질 미스폴딩 질병들에 대해 동정되어 왔다. 예를 들면, 인간 아밀로이드 전구체 단백질(hAPP)에서 하나 이상의 스웨덴 돌연변이(Swedish mutation), 인디안 돌연변이(Indiana mutation), 또는 런던 돌연변이(London mutation)를 지닌 개인들은 조발성 알츠하이머병으로 진행될 위험이 증가되어 있으므로 예방에 대한 후보들이다. 마찬가지로, 헌팅틴 유전자(huntingtin gene)내에 트리뉴클레오티드 CAG 반복물, 특히 36개 이상의 반복물을 갖는 개인들은 궁극적으로 헌팅톤병으로 진행될 것이므로 예방에 대한 후보들이다.
용어 "단백질 미스폴딩(protein misfolding)"은 β-아밀로이드, 혈청 아밀로이드 A, 시스타틴 C, IgG 카파 경쇄, 또는 프리온 단백질과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 응집 단백질(아밀로이드 형성 펩티드)에 의한 아밀로이드 단백질의 형성으로 특징화된 질병들을 지칭한다. 미스폴딩되고/되거나 응집된 아밀로이드 단백질과 관련된 것으로 알려진 질병들은 조발성 알츠하이머병, 만발성 알츠하이머병, 및 전조증상적 알츠하이머병을 포함하는, 알츠하이머병, 파킨슨병, SAA 아밀로이드증, 시스타틴 C, 유전성 아이슬란드 증후군(hereditary Icelandic syndrome), 노망, 다발성 골수종, 쿠루병, 크로이츠펠트-야곱병(CJD), 게르스트만 슈트라우슬러 샤인커병(Gerstmann-Straussler-Scheinker disease: GSS), 치명적 가족성 불면증(FFI), 스크래피, 및 소 해면상 뇌증(BSE)과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 프리온 질병들; 근육위축가쪽경화증(ALS), 척수소뇌성실조증(SCA1), (SCA3), (SCA6), (SCA7), 헌팅톤병, 엔타토루브랄-팔리돌류시안 위축증(entatorubral-pallidoluysian atrophy), 척추 및 연수 근육 위축증, 유전성 대뇌 아밀로이드 혈관병, 가족성 아밀로이드증, 전두측두엽 치매, 영국인/덴마크인 치매, 진행성 핵상마비(progressive supranuclear palsy; PSP) 및 가족성 뇌병증을 포함한다. 본 발명의 폴리펩티드 및 조성물은 "단백질 미스폴딩" 질병들을 치료하는데 사용될 수 있다.
많은 이들 미스폴딩되고/되거나 응집된 아밀로이드 단백질 질병들은 중추 신경계(CNS)에서 발생한다. CNS에서 발생하는 질병들의 일부 예들은 파킨슨병; 알츠하이머병; 행동 변이(behavioral variant) FTD(bvFTD), 진행성의 유창하지 않은 실어증(progressive non-fluent aphasia: PNFA) 및 의미적 치매(semantic dementia: SD)의 임상 증상들을 갖는 환자들을 포함하는 전측두엽 치매(FTD); 전측두엽변성(frontotemporal lobar degenerations: FTLDs); 및 헌팅톤병이다. 본 발명의 폴리펩티드 및 조성물은 중추신경계(CNS)내에서 발생하는 미스폴딩되고/되거나 응집된 아밀로이드 단백질에 의해 특성화된 질병들을 치료하는데 사용될 수 있다.
단백질의 미스폴딩 및/또는 응집은 또한 CNS의 외부에서 일어날 수 있다. 아밀로이드증 A(AA)(이의 경우 전구체 단백질은 혈청 급성 아포리포단백질(SAA)이다) 및 다발성 골수종(전구체 단백질들 면역글로불린 경쇄 및/또는 중쇄)은 CNS의 외부에서 발생하는 2개의 광범위하게 공지된 단백질 미스폴딩 및/또는 응집된 단백질 질병들이다. 다른 예들은 α2-마이크로글로불린에 의해 형성된 아밀로이드, 트랜스티레틴(가족성 아밀로이드성 다발성신경병증(FAP), 가족성 아밀로이드성 심근증(FAC), 및 노인 전신성 아밀로이드증(SSA)), (아포)혈청 AA, 아포리포단백질 AI, AII, 및 AIV, 겔솔린(가족성 아밀로이드증 다발성신경병증의 핀란드인 형태), 라이소자임, 피브리노겐, 시스타틴 C(중추 아밀로이드 혈관병증, 아밀로이드증을 지닌 유전성 뇌일혈, 아이슬란드 유형), (프로)칼시토닌, 섬세포 아밀로이드 폴리펩티드(IAPP 아밀로이드증), 심방 나트륨 이뇨인자, 프로락틴, 인슐린, 락타헤드린, 케라토-에피텔린, 락토페린, 치아 에나멜아세포-관련 단백질, 및 세메노겔린 I과 관련된 질병을 포함한다. 본 발명의 폴리펩티드 및 조성물은 CNS의 외부에서 발생하는 단백질들의 미스폴딩 및/또는 응집을 포함하는 질병들을 치료하는데 사용될 수 있다.
신경변성 질병들은 또한 tau 병변들을 포함할 수 있다(참조: Lee et al.,. Annu. Rev. Neuroses. 24:1121-159 (2001)에서 검토됨). Tau 단백질은 중추 및 말초 신경계 뉴우런 둘 다의 액손에서 발현된 미세소관-관련된 단백질이다. 신경변성 타우병증(때때로 타우병증으로 언급됨)이 포함된다. 타우병증의 예들은 알츠하이머병, 근위축성 측색경화증/파킨슨증-치매 합병증, 은 친화성 그레인 치매(Argyrophilic grain dementia), 피질기저퇴행, 크로이펠츠-야곱병, 권투선수 치매(Dementia pugilistica), 석회화를 지닌 분산된 신경원섬유엉킴들(diffuse neurofibrillary tangles), 다운 증후군(Down's syndrome), 17번 염색체에 연결된 파킨슨증을 지닌 전측두엽 치매를 포함하는 전측두엽 치매, 게르스트만-슈트로이슬러 샤인커병, 할러포르텐-스파츠병(Hallervorden-Spatz disease), 근육긴장 디스트로피, 니이만-픽병(Niemann-Pick disease) C형, 신경원섬유엉킴을 지닌 비-괌의 운동신경원병(Non-Guamanian motor neuron disease), 픽병, 뇌염후 파킨슨증, 프리온 단백질 중추 아밀로이드 혈관병증, 진행성 피질하부 신경아교증(Progressive subcortical gliosis), 진행성 핵상마비, 아급성경화범뇌염(Subacute sclerosing panencephalitis), 및 탱글 온리 치매(Tangle only dementia)를 포함한다. 이들 질병 중 일부는 원섬유 아밀로이드 β 펩티드의 침착물을 포함할 수 있다. 예를 들면, 알츠하이머병은 아밀로이드 β 침착물 및 tau 병변들 둘 다를 나타낸다. 유사하게, 크로이펠츠-야곱병, 프리온 단백질 중추 아밀로이드 혈관형성, 및 게르스트만 슈트로이슬러 샤인커 증후군과 같은 프리온-매개된 질병들 또한 tau 병변을 가질 수 있다. 따라서, 질병이 "타우병증"이라는 말은 단지 편의를 위해 제공된 것으로, 다른 신경변성 질병 분류 또는 그룹들로부터의 질병을 배제하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 본 발명의 폴리펩티드 및 조성물들은 tau 병변들을 포함하는 질병들뿐만 아니라 신경변성 질병을 치료하는데 사용될 수 있다.
하나의 구현예에서, 약제학적 조성물 또는 제형은 본원에 기술된 바와 같은 약제학적 조성물 또는 제형의 유효량을 환자에게 투여함을 포함하여, 아밀로이드의 존재와 관련되거나 플로르베타피르(AV-45, 제조원: Eli Lilly)와 같은 단백질 미스폴딩 질병과 관련된 바이오마커에 대해 양성인 증상들을 나타내는 환자에서 아밀로이드를 감소시키는 방법에 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 투여 경로는 척추강내 주사 또는 주입, 직접적인 심실내 주사 또는 주입, 실질내(intraparenchymal) 주사 또는 주입, 또는 비강내 주사 또는 주입 중에서 선택된다.
하나의 구현예에서, 약제학적 조성물 또는 제형은 본원에 기술된 바와 같은 약제학적 조성물 또는 제형의 유효량을 환자에게 투여함을 포함하여, 아밀로이드의 존재와 관련되거나 플로르베타피르(AV-45, 제조원: Eli Lilly)와 같은 단백질 미스폴딩 질병과 관련된 바이오마커에 대해 양성인 증상들을 나타내는 환자에서 아밀로이드의 수준을 유지시키는 방법에 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 투여 경로는 척추강내 주사 또는 주입, 직접적인 심실내 주사 또는 주입, 실질내 주사 또는 주입, 또는 비강내 주사 또는 주입 중에서 선택된다.
하나의 구현예에서, 약제학적 조성물 또는 제형은 아밀로이드를 가진 환자에게 본원에 기술된 바와 같은 약제학적 조성물 또는 제형의 유효량을 투여함을 포함하여, 환자에서 아밀로이드를 분해하는 방법에서 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 투여 경로는 척추강내 주사 또는 주입, 직접적인 심실내 주사 또는 주입, 실질내 주사 또는 주입, 또는 비강내 주사 또는 주입 중에서 선택된다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 약제학적 조성물 또는 제형은 β-아밀로이드 침착물의 분해가 요구되는 환자의 뇌내로 유효량의 본원에 기술된 약제학적 조성물을 직접 주사함으로써 뇌 속에서 β-아밀로이드 침착물의 감소를 유발함을 포함하여, 뇌 속에서 β-아밀로이드 침착물의 분해를 유발시키는 방법에서 사용하기 위한 것이다. 대안적 구현예로, 본 발명의 약제학적 조성물 또는 제형은 β-아밀로이드 침착물의 분해가 요구되는 환자에 유효량의 본원에 기술된 약제학적 조성물을 비강내 전달함으로써 뇌 속에서 β-아밀로이드 침착물의 감소를 유발함을 포함하여, 뇌 속에서 β-아밀로이드 침착물의 분해를 유발시키는 방법에서 사용하기 위한 것이다.
하나의 구현예에서, 약제학적 조성물 또는 제형은 뇌 속에서 아밀로이드 형성을 감소시키는 방법에서 사용하기 위한 것이다. 뇌 속에서 아밀로이드 형성을 감소시키는 것은 단백질-미스폴딩 또는 신경변성 질병의 증상 또는 중증도를 예방하거나, 치료하거나 감소시킬 수 있다. 하나의 구현예에서, 투여 경로는 척추강내 주사 또는 주입, 직접적인 심실내 주사 또는 주입, 실질내 주사 또는 주입, 또는 비강내 주사 또는 주입 중에서 선택된다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 약제학적 조성물 또는 제형은 뇌 속에서 아밀로이드 청소(clearance)를 촉진시키기 위한 방법에서 사용하기 위한 것이다. 아밀로이드 청소를 촉진하는 것은 단백질-미스폴딩 또는 신경변성 질병의 증상 또는 중증도를 예방하거나, 치료하거나 감소시킬 수 있다. 하나의 구현예에서, 투여 경로는 척추강내 주사 또는 주입, 직접적인 심실내 주사 또는 주입, 실질내 주사 또는 주입 또는 비강내 주사 또는 주입 중에서 선택된다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 약제학적 조성물 또는 제형은 뇌 속에서 아밀로이드 응집을 억제하는 방법에서 사용하기 위한 것이다. 뇌 속에서 아밀로이드 응집을 억제하는 것은 단백질-미스폴딩 또는 신경변성 질병의 증상 또는 중증도를 예방하거나, 치료하거나 감소시킬 수 있다. 하나의 구현예에서, 투여 경로는 척추강내 주사 또는 주입, 직접적인 심실내 주사 또는 주입, 실질내 주사 또는 주입, 또는 비강내 주사 또는 주입 중에서 선택된다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 약제학적 조성물 또는 제형은 뇌 속에서 독성 아밀로이드 올리고머를 청소하는 방법에서 사용하기 위한 것이다. 뇌 속에서 독성 아밀로이드 올리고머를 청소하는 것은 단백질-미스폴딩 또는 신경변성 질병의 증상 또는 중증도를 예방하거나, 치료하거나 감소시킬 수 있다. 하나의 구현예에서, 투여 경로는 척추강내 주사 또는 주입, 직접적인 심실내 주사 또는 주입, 실질내 주사 또는 주입, 또는 비강내 주사 또는 주입 중에서 선택된다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 약제학적 조성물 또는 제형은 뇌 속에서 독성 아밀로이드 올리고머의 형성을 방지하는 방법에서 사용하기 위한 것이다. 뇌 속에서 독성 올리고머의 형성을 방지하는 것은 단백질-미스폴딩 또는 신경변성 질병의 증상 또는 중증도를 예방하거나, 치료하거나 감소시킬 수 있다. 하나의 구현예에서, 투여 경로는 척추강내 주사 또는 주입, 직접적인 심실내 주사 또는 주입, 실질내 주사 또는 주입, 또는 비강내 주사 또는 주입 중에서 선택된다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 약제학적 조성물 또는 제형은 아밀로이드 손상으로부터 뉴우런을 보호하기 위한 방법에서 사용하기 위한 것이다. 아밀로이드 손상으로부터 뉴우런을 보호하는 것은 단백질-미스폴딩 또는 신경변성 질병의 증상 또는 중증도를 예방하거나, 치료하거나 감소시킬 수 있다. 하나의 구현예에서, 투여 경로는 척추강내 주사 또는 주입, 직접적인 심실내 주사 또는 주입, 실질내 주사 또는 주입, 또는 비강내 주사 또는 주입 중에서 선택된다. 하나의 구현예에서, 아밀로이드 손상으로부터 뉴우런을 보호하기 위해 사용하기 위한 본 발명의 약제학적 조성물 또는 제형은 예방학적으로 제공된다.
일부 구현예에서, 환자는 단백질 미스폴딩 및/또는 응집 병과 관련된 바이오마커에 대해 양성이다. 하나의 구현예에서, 바이오마커는 플로르베타피르(AV45, 제조원: Eli Lilly)이다.
일부 구현예에서, 환자는 아밀로이드의 존재와 관련된 신경변성 잘병의 증상을 나타낸다. 각종 구현예에서, 아밀로이드는 fAβ42, fαsyn, fNM, 또는 ftau 중의 임의의 것이다.
특정 구현예에서, 신경변성 질병은 파킨슨병, 알츠하이머병, 또는 헌팅톤병이다. 하나의 구현예에서, 신경변성 질병은 알츠하이머병이다. 하나의 구현예에서, 신경변성 질병은 알츠하이머병이고, 환자는 영상화제 플로르베타피르(AV-45, 제조원: Eli Lilly)에 의해 검출된 β-아밀로이드를 나타낸다.
일부 구현예에서, 환자는 프리온-매개된 질병의 증상들을 나타낸다.
특정 구현예들에서, 프리온-매개된 질병은 크로이펠츠-야곱병, 쿠루, 치명적 가족 불면증, 또는 게르스트만-슈트로이슬러-샤인커 증후군 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, 환자는 알츠하이머병 이외의 신경병성 타우병증의 증상들을 나타낸다. 특정 구현예에서, 치료될 질병은 은 친화성 그레인 치매, 피질기저퇴행, 권투선수 치매, 석회화를 지닌 분산된 신경원섬유엉킴, 다운 증후군, 17번 염색체에 연결된 파킨슨증을 지닌 전측두엽 치매를 포함하는 전측두엽 치매, 할러포르텐-스파츠병, 근육긴장디스트로피, 니이만-픽병 C형, 신경원섬유엉킴을 지닌 비-괌의 운동신경원병, 픽병, 뇌염후 파킨슨증, 진행성 피질하부 신경아교증, 진행성 핵상마비, 아급성경화범뇌염, 및 탱글 온리 치매를 포함한다.
다른 구현예에서, 상기 기술한 질병 상태 중 임의의 것은 본 발명의 핵산 분자 (즉, 감소된 면역원성을 나타내고, 아밀로이드에 결합, 아밀로이드 플라크를 분해 및/또는 아밀로이드의 응집을 방지하는 능력을 갖는 변이체 g3p를 암호화하는 것)를, 예를 들면, 흡입 및 비강내 주입과 같은 임의의 적절한 경로에 의해 환자에 단독으로 또는 적절한 담체 (예: 지질 나노입자. 중합체성 담체) 또는 벡터 (예: 바이러스성 벡터)와 함께 투여함으로써 치료할 수 있다. 이 치료에 적합한 본 발명의 변이체 g3p를 암호화하는 핵산 분자는 DNA 또는 RNA일 수 있다.
진단제
본 발명의 다른 측면에서, 본원에 기술된 폴리펩티드 및 조성물은 본원에 기술된 각종 질병과 관련된 진단 적용들에서 사용된다. 예를 들면, 본 발명의 조성물의 결합은, 생체내 또는 시험관내에서 영상화제로서 사용되는 경우, 기술된 단백질 미스폴딩 질병중 하나의 진단의 부분일 수 있다. 진단제로서 사용되는 경우에, 본 발명의 폴리펩티드는 검출가능한 표지를 추가로 포함할 수 있거나, 생체내에서 달리 검출할 수 있다. 다양한 표지들이 단백질을 표지화하기 위한 표준 기술을 사용하여 진단 조성물의 아밀로이드 결합 성분에 부착될 수 있다. 표지의 예는 형광 표지 및 방사능 표지를 포함한다. 사용될 수 있는 광범위하게 다양한 방사능 표지가 존재하지만, 일반적으로 표지는 종종 18F, 11C 및 123I를 포함하지만, 이것으로 한정되지는 않는 방사능 표지로부터 선택된다. 이들 및 다른 방사성동위원소는 잘 알려진 화학을 사용하여 단백질에 부착시킬 수 있다. 하나의 구현예에서, 표지는 양전자 방출 단층촬영법(PET)을 사용하여 검출한다. 그러나, 방사성동위원소를 검출하기 위한 임의의 다른 적합한 기술도 또한 사용하여 방사성 추적자(radiotracer)를 검출할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드 및 조성물은 예를 들면, F18-AV-45(제조원: Eli Lilly)와 같은 β-아밀로이드에 대해 특이적인 영상화제와 함께 영상화제로서 사용될 수 있다. 비 β-아밀로이드 응집물에 대해 공지된 영상화제는 현재 알려져 있지 않으므로, β-아밀로이드-특이적인 영상화제와 함께 본 발명의 진단 조성물의 사용은 차등적 검출을 기본으로 한 비-β-아밀로이드 응집물의 검출을 초래할 것이다. 따라서, 하나의 구현예에서, 본 발명의 진단 조성물은 β-아밀로이드 영상화제와 함께 영상화제로서 사용되어 비-β-아밀로이드 응집물을 검출한다.
다른 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드 또는 조성물은 뇌를 포함하는, CNS에서 β-아밀로이드를 검출하기 위한 진단 영상화제로서 사용된다.
본 발명의 진단 조성물은 치료학적 조성물에 대해 기술된 동일한 경로를 사용하여 투여할 수 있다. 하나의 구현예에서, 투여 경로는 척추강내 주사 또는주입, 직접적인 심실내 주사 또는 주입, 실질내 주사 또는 주입, 또는 비강내 주사 또는 주입 중에서 선택된다.
실시예
실시예 1: g3p에서 CD4+ T세포 에피토프의 맵핑(mapping)
서열 번호: 1의 아미노산 1-240의 서열에 걸치는 87개 중복 펩티드 (12개 아미노산이 중복된 15개 아미노산 길이)를 합성했고, 인간 CD4+ T 세포로부터의 반응에 대한 T 세포 에피토프 맵핑 검정으로 시험했다. 개별 펩티드는 여섯개 한조(sextuplicate) PBMC 배양으로 시험했고, T 세포 반응을 평가하여 그들의 상대적 효능뿐만 아니라, 에피토프의 위치를 동정했다.
PBMC(말초 혈액 단핵 세포)는 Lymphoprep (Axis-shield, Dundee, UK) 밀도 원심단리법에 의해 영국 국립 수혈 서비스(UK National Blood Transfusion Service) (Addenbrooke's Hospital, Cambridge, UK)로부터 입수하고, 에덴브룩 병원 지역연구 윤리위원회(Addenbrooke's Hospital Local Research Ethics Committee)에서 인정한 승인에 따르는 건강한 공혈자 버피 코트(buffy coat) (24시간 이내에 뺀 혈액으로부터)로부터 단리시켰다. CD8+ T 세포는 CD8+ RosetteSep™ (StemCell Technologies lnc, London, UK)을 사용하여 고갈시켰다. 공혈자는 HLA SSP-PCR 기반 조직-타이핑 키트(tissue-typing kit) (Biotest. Solihull, UK)를 사용하여 HLA-DR 단상형을 동정함으로써 특성화되었다. 대조군 신생항원 단백질(KLH 단백질 (Pierce (Perbio), Cramlington, UK) 및 IFV와 EBV로부터 유래된 펩티드)에 대한 T 세포 반응을 또한 측정했다. 이어서, PBMC를 동결시키고, 필요할 때까지 액체 질소에 저장했다.
55명의 공혈자 집단은 검정에서 세계 인구로 표현되는 HLA-DR 알로타입의 수 및 빈도를 가장 잘 나타내기 위해 선택했다. 세계 인구로 표현되는 것들에 대한 집단으로 표현되는 알로타입의 분석은 >80%의 범위가 달성되었고, 모든 주요 HLA-DR 대립유전자 (세계 인구로 표현되는 빈도 > 5%를 갖는 개별 알로타입)가 잘 나타났다고 밝혔다. 개별 공혈자 단상형의 상세한 설명 및 세계 인구와 샘플 인구로 표현되는 MHC class II 단상형의 빈도 비교가 각각 표 8 및 도 3에 제시되어 있다.
표 8. 공혈자 상세설명 및 단상형
Figure pct00008
Figure pct00009
각각의 공혈자로부터의 PBMC를 해동시켜, 카운팅하고, 생존도를 평가했다. 세포는 세포 밀도를 2-3x106 PBMC/ml (증식 세포 스톡)로 조절하기 전에 실온에서 AIM-V® 배양 배지(제조원: Invitrogen, Paisley, UK)를 수정했다. 15개 아미노산 길이 펩티드는 유리 N-말단 아민 및 C-말단 카복실산을 사용하여 1-3 mg 스케일로 합성했다. 펩티드는 10 mM의 농도로 DMSO에 용해시켰고, 펩티드 배양 스톡은 웰에서 5 μΜ의 최종 농도까지 AIM-V® 배양 배지로 희석시켜 제조했다. 각각의 펩티드 및 각각의 공혈자의 경우, 여섯개 한조 배양이 평평한 바닥의 96개 웰 플레이트에 정립되었다. 양성 및 음성 대조군 배양 모두를 또한 여섯개 한조로 시험했다. 각 공혈자의 경우, 3개의 대조군(IFV 및 EBV로부터 유래된 KLH 단백질 및 펩티드)이 또한 포함되었다. 양성 대조군의 경우, PHA(제조원: Sigma, Dorset, UK)가 2.5 ㎍/ml의 최종 농도로 사용되었다.
배양물은 각각의 웰에 0.75 μCi 3[H]-티미딘(Perkin Elmer®, Beaconsfieid, UK)을 가하기 전에 총 6일 동안 배양시켰다. 배양물은 TomTec Mach III 세포 채취기를 사용하여 필터 매트 위로 수확하기 전에 다시 18시간 동안 배양시켰다. 각각의 웰에 대한 Cpm은 파라룩스(paralux), 저백그라운드 계수 형태(low background counting mode)로 마이크로플레이트 베타 카운터(Microplate Beta Counter) (Perkin Elmer®, Beaconsfieid, UK) 상에서 Meltilex™ (Perkin Elmer®, Beaconsfieid. UK) 섬광 계수에 의해 측정했다.
데이타 분석을 위해, SI ≥ 2.00이거나 이보다 큰 자극 지수(SI: stimulation index)의 임계치가 사용되었다 (경계선 SI ≥ 1.90-1.99 반응의 고려와 함께). 양성 반응은 하기의 통계학적 및 실증적 한계점으로 정의되었다:
1. 쌍을 이루지 않은 2개 샘플 스튜던트 t-시험(Student's t-test)을 사용하여 배지 대조군 웰에 대한 시험 웰의 cpm의 비교에 의한 반응의 유의성 (p < 0.05).
2. 2.00보다 큰 자극 지수 (SI ≥ 2.00), 여기서 SI = 시험 웰의 평균 cpm/배지 대조군 웰의 평균 cpm. 이 방법으로 나타낸 데이타는 SI ≥ 2.00, p < 0.05로서 제시된다.
또한, 검정-내(intra-assay) 변환은 복제 배양물로부터 원 자료(raw data)의 CV 및 SD를 계산하여 평가했다. 증식 검정은 여섯개 한조 배양으로 조정했다 ("비-조절 데이타"). 검정-내 변동성이 낮음을 보장하기 위하여, 데이타는 또한 최대 및 최소 cpm 값의 제거 후 분석했고 ("조절 데이타"), 공혈자 반응의 SI는 두 데이타 세트를 사용하여 비교하였다. T 세포 에피토프는 백그라운드 반응 속도를 제공하는 연구에서의 모든 펩티드에 대한 양성 반응 (상기 정의한)의 평균 빈도 + SD를 계산함으로써 동정하였다. 조절 및 비-조절 데이타 모두에서 백그라운드 반응 속도를 초과하는 증식성 반응을 유도한 임의의 펩티드가 T 세포 에피토프를 함유하는 것으로 고려되었다. 2개의 중복 펩티드가 증식성 반응을 유도한 경우에, T-세포 에피토프는 중복 영역에 존재하는 것으로 여겨졌다. 이것을 근거로 하여, 하기의 T-세포 에피토프가 시험된 폴리펩티드에서 동정되었다:
에피토프 1: C T G D E T Q C Y G T W (서열 번호: 1의 아미노산 46-57)
에피토프 2: T F M F Q N N R F R N R. (서열 번호: 1의 아미노산 133-144)
에피토프 3: S S K A M Y D A Y W N G (서열 번호: 1의 아미노산 194-205)
에피토프 4: P V N A G G G S G G G S (서열 번호: 1의 아미노산 214-225)
에피토프 5: S G S G A M V R S D K T H T C (서열 번호: 1의 아미노산 253-267)
실시예 2: 인실리코 ( In Silico ) 분석에 의한 T 세포 에피토프 4 및 5에서의 돌연변이 디자인
T 세포 검정에서 양성이었던 펩티드의 서열은 iTope™ 및 TCED™ 인실리코(in silico) 기술을 사용하여 에피토프 영역으로부터 중복된 9-mers를 사용하여 분석하였다 [Perry et al., Drugs R D 9(6):385-96 (2008)]. 각각의 9-mer은 MHC class II 대립유전자(총 34개)의 데이타베이스에 대해 시험했고, MHC class II 분자와의 피트(fit) 및 상호작용을 근거로 하여 등급을 매겼다. 또한, 각각의 9-mer은 공지된 CD4+ T 세포 에피토프의 데이타베이스에 대해 BLAST 서치하여 앞의 T 세포 검정에서 T 세포 반응을 자극했던 미관련 단백질로부터의 펩티드의 데이타베이스와 9-mer의 것 사이에 어떤 높은 서열 상동성을 동정하였다. 인실리코 분석으로부터의 정보를 기반으로 하여, 돌연변이는 동정된 에피토프로부터 CD4+ T 세포 에피토프의 잠재적 제거에 대해 동정되었다.
에피토프 5는 서열 번호: 1의 N1-N2-인간 Ig Fc 융합 단백질을 생성하는데 사용되는 pFUSE 벡터의 다중 클로닝 부위("MCS": multiple cloning site)에 의해 암호화된 아미노산인, 본래 N2-CT Gly-풍부 링커의 C-말단, 및 인간 Ig Fc 영역의 N-말단에 걸쳐진다. 인실리코 분석은 P1이 책임있는 T-세포 활성을 앵커링(anchoring)하는 경우 서열 번호: 1의 M258 및 V259를 포함했다. N1-N2 코딩 영역으로부터 외부로 그들의 위치를 근거로 하여, 이들 두 아미노산의 제거는 기능의 손실을 유발하리라 예상하지 못했다. 이들 두 아미노산은 MCS에 의해 암호화되었다. 따라서, MCS를 개질시키고 서열 번호: 1의 M258 및 V259를 암호화하는 뉴클레오티드를 제거한 이중-가닥 DNA 분자는 적절한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 부위-지정 돌연변이(site-directed mutagenesis)로 생성하였다. 이것에 이어 MCS에 EcoRI 및 BgIII 제한 부위를 사용하여 생성된 돌연변이된 DNA 서열을 pFUSE 벡터로 다시 재클로닝시켰다. 생성된 성숙 (시그널 서열이 결여된) 융합 단백질은 M258 및 V259가 빠졌다. 그의 아미노산 서열은 서열 번호: 2로 제시되고, 서열 번호: 5에 의해 암호화된다. 그 융합 단백질은 서열 번호: 1 융합 단백질로서 하기 기술되는 검정에서 Abeta를 결합하는 동일한 능력을 유지했다.
에피토프 4는 N2 도메인 및 본래 Gly-풍부 링커와 중복된다. g3p 단백질의 결정 구조(제시되지 않음)는 에피토프 4가 아밀로이드 결합 영역으로부터 멀리 위치함으로써, 활성에 영향없이 아미노산 치환을 견딘다고 제시하였다. P1 앵커로서 동정된 V215(서열 번호: 2)는 단백질 코어쪽으로 측쇄의 약간의 배위를 가지면서 표면 노출된다. 구조 분석으로부터, 표 6 및 7에 제시된 V215에 대한 치환중 어떤 것은 에피토프를 제거해야 한다. 또한, 표 6 및 7에 제시된 이러한 에피토프 내에 다른 아미노산의 치환중 어떤 것이 또한 수용되어야 한다. V215A 치환을 포함하는 N1-N2-Ig Fc를 암호화는 핵산 서열(서열 번호: 6)은 적절한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 부위-지정 돌연변이에 의해 서열 번호: 5로부터 유래되었다. 생성된 성숙 융합 단백질(서열 번호: 3)은 서열 번호: 1 또는 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질에 비하여 결합 검정에서 Abeta에 대한 결합이 증가된 것으로 입증되었다. 서열 번호: 6의 핵산 서열은 에피토프 1, 2 및 3에 모든 개질을 포함하는 유전자를 생성하기 위한 모(parent) 서열로서 사용되었다.
실시예 3: 인실리코 분석에 의한 T 세포 에피토프 1, 2 및 3에서의 돌연변이 디자인
에피토프 1은 N1-N2의 추정되는 Abeta 결합 부분에 대해 단지 C-말단에 놓인다. 에피토프 1의 인실리코 분석은 T-세포 에피토프의 아미노산 치환 및 제거에 대한 영역으로 서열 번호: 1의 아미노산 48-56을 강조했다. 이러한 9-mer 내의 아미노산은 g3p의 X-선 결정구조로부터 해석된 바와 같이, 존재하는 아미노산의 특성, 표면 노출, 및 g3p의 아밀로이드 결합 영역과의 상호작용을 근거로 하여 치환에 대해 표적이 되었다. 특히, G48, T51, Y54 및 T56은 표 1에 제시된 변화에 의한 치환에 대해 표적이 되었다. 이 영역에서 다른 잠재적인 아미노산 치환이 표 2에 제시되어 있다.
에피토프 2의 iTope™ 분석은 에피토프를 감소시키거나 제거하기 위한 표적으로서 서열 번호: 1의 아미노산 135-143을 지목했다. X-선 결정구조를 근거로 하여, 서열 번호: 1의 아미노산 136-139는 N1-N2의 힌지 영역과의 결합을 형성하는 루프(loop) 영역을 형성하고, 이에 따라 아밀로이드 결합 활성에 대해 중요할 수 있다. 이들 아미노산에 대한 변화는 덜 바람직하고, 단지 표 2에 제시되어 있다. 보다 바람직한 변화는 M135, R140, F141 및 N143에 대한 것으로, 표 1에 제시되어 있다. 이 9개 아미노산 영역에 대한 다른 잠재적인 변화는 표 2에 제시되어 있다.
서열 번호: 1의 아미노산 173-182는 인실리코 분석에 의해 치환에 대한 표적으로서 에피토프 3 내에서 동정되었다. 에피토프 3은 N2 도메인의 알파 나선 부분에 위치함에 따라, 방법은 소수성 잔기 및 작은 극성의 비하전 잔기의 도입을 피하는 것이었다. 또한, 본 발명자는 이 에피토프의 C-말단쪽으로 극성 잔기 산성 잔기의 도입을 피하고자 했다. X-선 결정구조시각화 데이타(crysiallographic data)를 근거로 하여, 본 발명자는 표 1에 제시된 변화에 의한 치환에 대해 S173, D174, M176, D178 및 W182를 표적으로 삼았다. 이 영역에서의 다른 잠재적인 아미노산 치환이 표 2에 제시되어 있다.
실시예 4: T-세포 에피토프가 감소된 N1-N2-인간 IgG Fc 폴리펩티드의 생성
각각 표 3에 제시된 상이한 단일 아미노산 치환을 함유하는 N1-N2-인간 IgG Fc 융합 단백질을 암호화하는, 58개의 상이한 핵산 분자를 제조했다. 이는 원하는 치환을 도입시키는 적절한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 서열 번호: 6의 부위-지정 돌연변이시킨 다음, PCR-증폭된 돌연변이된 서열을 pFUSE-hlgG1-Fc2 벡터 (Invivogen®, Toulouse, France, Catalogue No. pfuse-hg1fc2)로 재클로닝시켜 달성했다.
이들 "탈면역화된" Fc 융합 폴리펩티드를 암호화하는 유전자는 일시적으로 FreeStyle 293-F 세포 (Invitrogen, Paisley, Scotland, Catalogue # R790-07)에 개별적인 pFUSE-hlgG1-Fc2 벡터로 발현되었다. 형질감염시키는 날에, 세포는 FreeStyle 293 배지 (Invitrogen. Catalogue # 12338)에서 1 x 106/mL로 희석시켜 >90%의 생존도를 보장한다. 플라스미드 DNA 및 폴리에틸렌이민(PEI)은 Optimem (Invitrogen, Catalogue # 31985)에서 별도로 희석시켜 5분 동안 배양시킨 다음, PEI를 DNA에 서서히 가했고, DNA/PEI 혼합물은 실온에서 5분 동안 배양시켰다. 배양 후, DNA/PEI 혼합물은 플라스크를 스월링(swirling)시키면서 293-F 세포로 적가했다. 형질감염된 배양물은 6 내지 7일 동안 135 rpm으로 회전하는 오비탈 진탕기 플랫폼(orbital shaker platform)에서 37℃, 8% CO2에서 배양시킨 다음, 그들을 수확했다.
폴리펩티드를 함유하는 배양 배지는 원심단리에 의해 수확하고, 10x PBS를 사용하여 pH 조절했다. 단백질은 4℃에서 밤새 회전시켜 단백질 A 세파로즈 비이드 (Sigma, Dorset, UK)에 결합시켰다. 비이드는 1x PBS로 2회 세척하고, SigmaPrep 스핀 칼럼(Sigma)으로 옮겼다. 샘플은 0.1M 글리신 pH 3.0을 사용하여 원심단리로 용출시키고, 1/10th 용적 1M 트리스-HCl pH 8.0을 사용하여 수집 튜브에서 중화시켰다. 용출물은 2 ml ZebaSpin 칼럼 (Pierce, Cramlington, UK, Catalogue #89890)을 사용하여 1x PBS로 완충액 교환시켰다. 샘플은 필터-멸균시키고, 280nm에서의 흡광도를 각 샘플에 대해 측정했다.
실시예 5: 탈면역화된 폴리펩티드의 ABeta 결합 분석
A. ABeta (Aβ) 섬유 제조. Αβ42 (1 mg, rPeptide A-1002-2)를 헥사플루오로이소프로판올(HFIP, 1 mL)에 용해시키고, 철저히 소용돌이시킨 다음, 맑은 용액이 나타날 때까지 2 내지 18시간 동안 실온에서 배양시켰다. 모액(100 ㎕, 100 ㎍)을 1.5 mL Eppendorf 튜브에 넣고, 2 내지 3시간 동안 진공(speed Vac. Eppendorf, Concentrator 5301)하에 건조시켰다. 생성된 단량체를 20 μL DMSO에 재현탁시키고, 피펫팅한 다음, 완전히 용해될 때까지 철저히 소용돌이시켰다. 용액을 10 mM HCl 용액 260 μL로 희석시키고(최종 Aβ42 농도는 80 μM임), 20초 동안 소용돌이시켰다. 맑은 용액은 37℃에서 3일 동안 배양(진탕없이)시켜 응집되도록 한다. 검정에서 사용하기 위해, 생성된 스톡 용액으로부터의 Aβ42 섬유는 PBS중 1.6 μM 최종 농도까지 50배 희석시켰다.
B. ELISA 플레이트 제조. 96개 웰 플레이트(F96 MAXISORP NUNC-IMMUNO PLATE: Catalog number: 442404, Lot 125436 및 128158; Denmark)의 각각의 웰에 1% BSA 용액 200 ㎕를 가했다. 플레이트를 밀봉시키고, 3시간 동안 7℃에서 배양시켰다. 그 다음에, 플레이트는 PBS(250 ㎕/웰) x 3으로 세척했다. 각각의 웰에 희석시킨 Aβ42 섬유 용액(1.6 μM) 50 μL를 가하고, 완전 건조까지 37℃에서 밤새 덮지않고 배양시켰다. PBS(50 ㎕/웰)을 대조 웰에 가했다(Aβ42 섬유 없이). 이어서, 플레이트는 물로 2X 및 PBS로 1X (각각의 세척을 위해 250 μL/웰) 세척했다.
C. ELISA 검정. 50 μL중 다양한 농도의 각각의 폴리펩티드 (및 서열 번호: 3의 폴리펩티드)를 비-Aβ42 섬유 코팅된 웰뿐만 아니라, 각각의 웰에 가하고, 37℃에서 1시간 동안 배양시켰다. 그 다음에, 플레이트는 PBS-T(PBS중 0.05% 트윈 20)로 3X 및 PBS(각각의 세척을 위해 250 μL/웰)로 3X 세척했다. 이어서, 각각의 웰에 PBS-T + 1% 우유 (Difco™ Skim Milk, Becton, Dickinson and Company. USA, Catalog number: 232100, Lot number: 7320448)중 1:2500 (최종 0.32 ㎍/mL)으로 희석시킨 HRP-접합된 염소 항-인간 항 Fcγ (Jackson Labs, Catalog number. 109-035-008, Lot number: 106617) 50 ㎕를 가하고, 37℃에서 40분 동안 배양시켰다. 그 다음에, 플레이트는 PBS-T로 6X 및 PBS(각각의 세척을 위해 250 μL/웰)로 2X 세척했다. 그 다음에, 50 ㎕/웰의 OPD 용액 (15 mg/7.5 ml 0.05M 시트레이트 완충액 pH-5.5/3 ㎕ H2O2)을 가하고, 3 내지 6분 동안 색상이 전개되도록 두었다. 이어서, 반응을 정지시키기 위하여 25 ㎕/웰의 4N HCl 용액을 가했다. 플레이트는 492 nm 및 405 nm에서 흡광도를 판독했다. 405 nm 흡광도를 492 nm 흡광도에서 뺐고, 결과는 폴리펩티드 농도의 함수로서 플로팅했다. 그 다음에, 각각의 탈면역화된 폴리펩티드에 대해 결합에 대한 IC50을 계산했고, 서열 번호: 3의 폴리펩티드에 대해 계산된 IC50과 비교했다. 결과는 하기 표 9에 제시되어 있다.
표 9. 서열 번호: 3의 폴리펩티드와 견주어진 에피토프 1, 2 또는 3의 단일 부가 아미노산 치환을 갖는 폴리펩티드에 대한 ABeta 결합 IC50에 있어서의 상대적 변화
Figure pct00010
* 숫자는 IC50 (치환된 폴리펩티드)/IC50 (서열 번호: 3의 폴리펩티드)을 나타낸다. 여러 개의 값은 결합 검정에서 시험된 중복을 나타낸다.
실시예 6: 전단백질 (whole protein) CD4+ T 세포 반응의 분석
서열 번호: 1과 비교할 때 본 발명의 폴리펩티드 중 임의의 것으로부터의 CD4+ T 세포 반응을 분석하기 위하여, 전단백질 T 세포 검정을 수행했다. PBMC는 실시예 1에서와 같이 제조된 20명의 건강한 인간 공혈자 버피코트로부터 단리시켰다. PBMC는 AIM-V® 배양 배지에서의 동결로부터 수정했고, CD14+ 세포는 Miltenyi CD14 마이크로비이드 및 LS 칼럼 (Miltenyi Biotech, Oxford, UK)을 사용하여 단리시켰다. 단핵세포는 4-6x106 PBMC/ml로 1000U/ml IL-4 및 1000U/ml GM-CSF에 의해 보충된 AIM-V®("DC 배양 배지")에 재현탁시킨 다음, 24개 웰 플레이트에 분배했다(2 ml 최종 배양물 용적). 세포는 2일째에 1/2 용적의 DC 배양 배지를 대체하여 공급하였다. 3일째까지, 단핵세포는 반-성숙 수지상 세포(DC)로 미분화시켰고, 이는 40ug/ml의 시험 폴리펩티드 또는 40ug/ml의 서열 번호: 1의 폴리펩티드 및 100 ㎍/ml의 KLH 또는 단독 배지만을 포함하는 항원과 함께 예비-배양시켰다. 반-성숙 DC를 24시간 동안 항원과 함께 배양시킨 후, 과량의 항원은 세포를 2회 세척하고, 50ng/ml TNFα (Peprotech, London, UK)로 보충한 DC 배양 배지에 재현탁시켜 제거했다. DC는 7일째에 50 ng/ml TNFα로 보충한 1/2 용적의 DC 배양 배지를 대체하여 공급하였고 8일째에 성숙 DC가 수확되었다. 수확된 성숙 DC를 카운팅하고, 생존도는 트립판 블루 색소 배제(trypan blue dye exclusion)를 사용하여 평가했다. 그 다음에, DC는 γ-조사하고(4000 rads), 하기와 같이 T 세포 증식 및 ELISpot 검정에서 사용 분석 전에 AIM-V 배지에 2x105 세포/ml로 재현탁시켰다. 또한, 8일째에, 신선한 CD4+ T 세포를 또한 제조했다. CD4+ T 세포를 정제하기 위하여, FBMC는 AIM-V® 배양 배지에서 수정했고, CD4+ 세포는 Miltenyi CD4 마이크로비이드 및 LS 칼럼 (Miltenyi Biotech, Oxford, UK)을 사용하여 단리시켜, AIM-V® 배지에 2x106 세포/ml로 재현탁시켰다.
8일째에, T 세포 증식 검정을 정립함으로써, 1x105 자가유래 CD4+ T 세포를 96개 웰 U-형 플레이트의 1x104 항원-부하된 DC (10:1의 비)에 가하고, AIM-V® 배지를 최종 용적 200ul/웰까지 가했다. 14일째에, 검정용 플레이트는 TomTec Mach III (Hamden CT, USA) 세포 채취기를 사용하여 필터 매트 (Perkin Elmer) 위로 수확하기 전에 6시간 동안 25ul AIM-V®에서 웰당 1 uCi [3H] (Perkin Elrner, Beaconsfield, UK)로 펄싱(pulsed)시켰다. 모든 폴리펩티드는 여섯개 한조(sextuplet)로 시험했다. 각각의 웰에 대해 분당 계수(cpm: counts per minute)는 파라룩스, 저백그라운드 카운팅으로 1450 Microbeta Wallac Trilux 액체 섬광 계수기 (Perkin Elrner) 상에서 Meltilex™ (Perkin Elmer) 섬광 계수에 의해 측정했다. 각각의 항원에 대한 분당 계수는 AIM-V® 배지 만의 대조군으로 정규화하였다.
ELISpot 검정의 경우, ELISpot 플레이트 (Millipore, Watford, UK)는 PBS중 100 ul/웰 IL-2 포획 항체 (R&D Systems, Abingdon, UK)로 코팅시켰다. 플레이트는 이어서 PBS로 2회 세척하고, 차단 완충액 (PBS중 1% BSA (Sigma))에서 밤새 배양시킨 다음, AIM-V® 배지로 세척했다. 8일째에, 1x105 자가유래 CD4+ T 세포를 96개 웰 ELISpot 플레이트의 1x104 항원-부하된 DC (10:1의 비)에 가했다. 모든 폴리펩티드 제제는 여섯개 한조 배양물로 시험했다. 각각의 공혈자 PBMC 경우, 음성 대조군 (AIM-V® 배지 단독), 무세포 대조군 및 PHA(10ug/ml) 양성 대조군을 또한 포함했다.
다시 7일의 배양 기간 후, ELISpot 플레이트는 PBS/1% BSA중 100ul 여과된 비오티닐화 검출 항체 (R&D Systems, Abingdon, UK)의 부가 전에 dH2O 및 PBS로 3회 연속 세척하여 전개시켰다. 1.5시간 동안 37℃에서 배양한 다음, 플레이트는 PBS로 3회 다시 세척하고, PBS/1% BSA중 100ul 여과된 스트렙타비딘-AP (R&D Systems)를 1시간 동안 가했다(실온에서 배양). 스트렙타비딘-AP를 폐기시키고, 플레이트는 PBS로 4회 세척했다. BCIP/NBT (R&D Systems)를 각각의 웰에 가하고, 실온에서 30분 동안 배양시켰다. 스폿(spot) 전개는 dH2O로 3회 웰 및 웰의 뒤를 세척함으로써 정지시켰다. 건조된 플레이트는 Immunoscan™ 분석기에서 스캔했고, 웰당 스폿(spw: spots per well)은 imrrtunoscan™ 버젼 4 소프트웨어를 사용하여 측정했다.
증식 및 IL-2 ELISpot 검정 모두의 경우, 결과는 cpm의 비로서 정의되는 자극 지수(SI) (증식 검정) 또는 양성 T 세포 반응에 대해 2 이상의 SI 임계치 (SI≥2.0)를 사용하는 배지-단독 대조군에 대한 시험 폴리펩티드의 경우 스폿 (ELISpot 검정)으로서 나타냈다.
실시예 7: T 세포 에피토프 1, 2 및 3 중 2개 이상에서 이중 및 삼중 돌연변이의 디자인
결합 검정의 결과를 근거로 하여, 하기의 치환이 서열 번호: 3과 비교하여 2개의 아미노산 치환을 함유하는 폴리펩티드에 존재하도록 에피토프 1, 2 및 3에서 선택되었고, 각각의 치환은 상이한 에피토프에서 일어난다.
표 10. 2개의 에피토프 및 3개의 에피토프 개질을 포함하는 변이체에 대한 아미노산 치환
Figure pct00011
각각 상이한 에피토프에, 표 10에 제시된 아미노산 치환중 2개를 갖는 N1-N2-인간 IG Fc 융합 단백질을 암호화는 DNA는 적절한 개시 DNA (통상 실시예 3에 제시된 바와 같이 제조된 2개의 돌연변이중 1개를 암호화하는 DNA)의 부위-지정 돌연변이에 의해 제조했다. 이들 융합 단백질을 암호화하는 생성된 DNA는 세포를 형질전환시키는데 사용되었고, 실시예 4에 제시된 바와 같이 발현시키고 정제하여, 실시예 5에 제시된 바와 같이 결합에 대해 시험했다. 그 다음에, 각각의 에피토프 1, 2 및 3에 1개의 치환을 갖는 폴리펩티드는 2개의 아미노산 치환된 폴리펩티드에 대한 결합 검정의 결과를 근거로 하여 디자인하였다. 각각의 에피토프 1, 2 및 3에 1개의 치환을 갖는 폴리펩티드는 실시예 6에 제시된 바와 같이 T-세포 반응뿐만 아니라, ABeta 결합 모두에 대해 검정한다. 특히, 하기의 이중 및 삼중 에피토프 변이체는 하기 표 11에 제시된 바와 같이, 서열 번호: 3 또는 서열 번호: 7의 특정 아미노산을 치환시켜 제조했다.
표 11. 본 발명의 이중 및 삼중 에피토프 변이체 폴리펩티드
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
상기-제시된 폴리펩티드는 실시예 5에 제시된 ELISA 검정을 사용하여 베타-아밀로이드에 대한 결합에 대해 검정했다. 결과는 표 12 및 13에 제시되어 있다. 상대적인 결합값은 IC50 (서열 번호:3의 폴리펩티드)/IC50 (시험된 폴리펩티드)를 나타낸다 (예를 들면, 서열 번호: 3의 폴리펩티드와 비교하여, 그 값이 적으면 적을수록, 폴리펩티드의 결합은 더 크다). 여러 개의 값은 결합 검정에서 중복 시험을 나타낸다.
표 12. 본 발명의 예시적 폴리펩티드에 대한 서열 번호: 3의 폴리펩티드의 상대적 결합값
Figure pct00015
Figure pct00016
표 13. 본 발명의 예시적 폴리펩티드에 대한 서열 번호: 7의 폴리펩티드의 상대적 결합값
Figure pct00017
실시예 8: 셀룰로즈 아세테이트 필터 지연 검정(filter retardation assay)
이 검정은 비-아밀로이드 생성(non-amyloidogenic) 또는 가용성 응집체로 아밀로이드 섬유의 탈안정화(분해) 또는 리모델링을 모니터하기 위해 사용되었다. 검정은 주로 문헌[참조: Chang, E. and Kuret. J., Anal Bioehem 373, 330-6, (2008) 및 Wanker, E, E. et al., Methods Enzymoi 309, 375-86, (1999)]으로부터 채택되었다. 특히, Aβ 아밀로이드 섬유의 2.5 μM 제제는 3일 동안 37℃에서 상이한 농도의 본 발명의 변이체 융합 폴리펩티드 (1 nM 내지 2 μΜ)를 사용하여 예비-배양시켰다. 배양 후, 융합 폴리펩티드의 존재 및 부재하에 섬유를 희석시키고, 진공 블롯(vacuum blot)으로 셀룰로즈 아세테이트 막 위에 스폿팅했다. 막은 PBS로 광범위하게 세척하고, 1시간 동안 Aβ의 N-말단에 대해 특이적인 항체로 탐침했다. HRP-접합된 2차 Ab는 막 위에 유지된 섬유상 응집체를 정량화하는데 사용되었다. 스폿 색상을 분석하고, 덴시토메트릭 스캐너(densitometric scanner)를 사용하여 디지틀화했다. EC50(1/2 최대 유효 농도)은 각 스폿에 첨가된 융합 폴리펩티드의 농도에 대한 각 스폿의 시그널의 세기를 근거로 계산했다.
서열 번호: 3의 폴리펩티드를 이 검정에서 시험한 경우에, EC50은 2 μΜ보다 큰 것으로 측정되었고, 이 폴리펩티드가 낮은 분해 활성을 가짐을 나타내는 것이다. 서열 번호: 1 및 서열 번호: 7의 폴리펩티드를 또한 이 검정에서 시험하였고, 각각 100 nM의 EC50을 나타냈으며, 이는 유의적인 분해 활성을 나타내는 것이다. 이러한 결과를 근거로 하여, 각각의 에피토프 1, 2 및 3에 탈면역화 치환을 함유하는 모든 변이체 폴리펩티드를 포함한, 폴리펩티드 102 이후 모든 후속되는 번호의 폴리펩티드는 개질되는 개시 아미노산 서열로서 서열 번호: 7의 폴리펩티드를 사용하여 제조하였다. 시험된 폴리펩티드에 대한 EC50 값은 하기 표 14에 제시되어 있다.
표 14. 본 발명의 예시적 변이체 폴리펩티드의 fAβ 아밀로이드 섬유 분해 활성
Figure pct00018
*nd = 폴리펩티드의 농도 범위는 EC50을 측정하기 위해 시험되지 않았다. 시험된 최고 농도에서 이들 폴리펩티드는 유의적인 EC50을 입증하지 못했다.
상기 실시예로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 변이체 폴리펩티드는 모두 ELISA 검정으로 측정된 바와 같이 Aβ에 대한 결합을 나타내었다. 시험된 대부분의 변이체 폴리펩티드는 또한 도트 블롯 검정(dot blot assay)으로 측정된 바와 같이, Aβ의 분해를 나타내었다.
<110> NEUROPHAGE PHARMACEUTICALS, INC. <120> POLYPEPTIDES COMPRISING A MODIFIED BACTERIOPHAGE G3P AMINO ACID SEQUENCE WITH REDUCED IMMUNOGENICITY <130> 12236.0006-00304 <150> PCT/US 2014/039760 <151> 2014-05-28 <150> US 61/828,497 <151> 2013-05-29 <150> US 61/828,004 <151> 2013-05-28 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 488 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1 Ala Glu Thr Val Glu Ser Cys Leu Ala Lys Pro His Thr Glu Asn Ser 1 5 10 15 Phe Thr Asn Val Trp Lys Asp Asp Lys Thr Leu Asp Arg Tyr Ala Asn 20 25 30 Tyr Glu Gly Cys Leu Trp Asn Ala Thr Gly Val Val Val Cys Thr Gly 35 40 45 Asp Glu Thr Gln Cys Tyr Gly Thr Trp Val Pro Ile Gly Leu Ala Ile 50 55 60 Pro Glu Asn Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly 65 70 75 80 Gly Ser Glu Gly Gly Gly Thr Lys Pro Pro Glu Tyr Gly Asp Thr Pro 85 90 95 Ile Pro Gly Tyr Thr Tyr Ile Asn Pro Leu Asp Gly Thr Tyr Pro Pro 100 105 110 Gly Thr Glu Gln Asn Pro Ala Asn Pro Asn Pro Ser Leu Glu Glu Ser 115 120 125 Gln Pro Leu Asn Thr Phe Met Phe Gln Asn Asn Arg Phe Arg Asn Arg 130 135 140 Gln Gly Ala Leu Thr Val Tyr Thr Gly Thr Phe Thr Gln Gly Thr Asp 145 150 155 160 Pro Val Lys Thr Tyr Tyr Gln Tyr Thr Pro Val Ser Ser Lys Ala Met 165 170 175 Tyr Asp Ala Tyr Trp Asn Gly Lys Phe Arg Asp Cys Ala Phe His Ser 180 185 190 Gly Phe Asn Glu Asp Pro Phe Val Cys Glu Tyr Gln Gly Gln Ser Ser 195 200 205 Asp Leu Pro Gln Pro Pro Val Asn Ala Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 210 215 220 Ser Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu 225 230 235 240 Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly 245 250 255 Ala Met Val Arg Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 260 265 270 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 275 280 285 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 290 295 300 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 305 310 315 320 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 325 330 335 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 340 345 350 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 355 360 365 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 370 375 380 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr 385 390 395 400 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 405 410 415 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 420 425 430 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 435 440 445 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 450 455 460 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 465 470 475 480 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 485 <210> 2 <211> 486 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 2 Ala Glu Thr Val Glu Ser Cys Leu Ala Lys Pro His Thr Glu Asn Ser 1 5 10 15 Phe Thr Asn Val Trp Lys Asp Asp Lys Thr Leu Asp Arg Tyr Ala Asn 20 25 30 Tyr Glu Gly Cys Leu Trp Asn Ala Thr Gly Val Val Val Cys Thr Gly 35 40 45 Asp Glu Thr Gln Cys Tyr Gly Thr Trp Val Pro Ile Gly Leu Ala Ile 50 55 60 Pro Glu Asn Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly 65 70 75 80 Gly Ser Glu Gly Gly Gly Thr Lys Pro Pro Glu Tyr Gly Asp Thr Pro 85 90 95 Ile Pro Gly Tyr Thr Tyr Ile Asn Pro Leu Asp Gly Thr Tyr Pro Pro 100 105 110 Gly Thr Glu Gln Asn Pro Ala Asn Pro Asn Pro Ser Leu Glu Glu Ser 115 120 125 Gln Pro Leu Asn Thr Phe Met Phe Gln Asn Asn Arg Phe Arg Asn Arg 130 135 140 Gln Gly Ala Leu Thr Val Tyr Thr Gly Thr Phe Thr Gln Gly Thr Asp 145 150 155 160 Pro Val Lys Thr Tyr Tyr Gln Tyr Thr Pro Val Ser Ser Lys Ala Met 165 170 175 Tyr Asp Ala Tyr Trp Asn Gly Lys Phe Arg Asp Cys Ala Phe His Ser 180 185 190 Gly Phe Asn Glu Asp Pro Phe Val Cys Glu Tyr Gln Gly Gln Ser Ser 195 200 205 Asp Leu Pro Gln Pro Pro Val Asn Ala Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 210 215 220 Ser Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu 225 230 235 240 Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly 245 250 255 Ala Arg Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 260 265 270 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 275 280 285 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 290 295 300 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 305 310 315 320 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 325 330 335 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 340 345 350 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 355 360 365 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 370 375 380 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 385 390 395 400 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 405 410 415 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 420 425 430 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 435 440 445 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 450 455 460 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 465 470 475 480 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 485 <210> 3 <211> 486 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 3 Ala Glu Thr Val Glu Ser Cys Leu Ala Lys Pro His Thr Glu Asn Ser 1 5 10 15 Phe Thr Asn Val Trp Lys Asp Asp Lys Thr Leu Asp Arg Tyr Ala Asn 20 25 30 Tyr Glu Gly Cys Leu Trp Asn Ala Thr Gly Val Val Val Cys Thr Gly 35 40 45 Asp Glu Thr Gln Cys Tyr Gly Thr Trp Val Pro Ile Gly Leu Ala Ile 50 55 60 Pro Glu Asn Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly 65 70 75 80 Gly Ser Glu Gly Gly Gly Thr Lys Pro Pro Glu Tyr Gly Asp Thr Pro 85 90 95 Ile Pro Gly Tyr Thr Tyr Ile Asn Pro Leu Asp Gly Thr Tyr Pro Pro 100 105 110 Gly Thr Glu Gln Asn Pro Ala Asn Pro Asn Pro Ser Leu Glu Glu Ser 115 120 125 Gln Pro Leu Asn Thr Phe Met Phe Gln Asn Asn Arg Phe Arg Asn Arg 130 135 140 Gln Gly Ala Leu Thr Val Tyr Thr Gly Thr Phe Thr Gln Gly Thr Asp 145 150 155 160 Pro Val Lys Thr Tyr Tyr Gln Tyr Thr Pro Val Ser Ser Lys Ala Met 165 170 175 Tyr Asp Ala Tyr Trp Asn Gly Lys Phe Arg Asp Cys Ala Phe His Ser 180 185 190 Gly Phe Asn Glu Asp Pro Phe Val Cys Glu Tyr Gln Gly Gln Ser Ser 195 200 205 Asp Leu Pro Gln Pro Pro Ala Asn Ala Gly Gly Glu Ser Gly Gly Gly 210 215 220 Ser Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu 225 230 235 240 Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly 245 250 255 Ala Arg Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 260 265 270 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 275 280 285 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 290 295 300 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 305 310 315 320 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 325 330 335 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 340 345 350 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 355 360 365 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 370 375 380 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 385 390 395 400 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 405 410 415 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 420 425 430 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 435 440 445 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 450 455 460 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 465 470 475 480 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 485 <210> 4 <211> 1530 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 4 atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacgaattcg 60 atggctgaaa ctgttgaaag ttgtttagca aaaccccata cagaaaattc atttactaac 120 gtctggaaag acgacaaaac tttagatcgt tacgctaact atgagggctg tctgtggaat 180 gctacaggcg ttgtagtttg tactggtgac gaaactcagt gttacggtac atgggttcct 240 attgggcttg ctatccctga aaatgagggt ggtggctctg agggtggcgg ttctgagggt 300 ggcggttctg agggtggcgg tactaaacct cctgagtacg gtgatacacc tattccgggc 360 tatacttata tcaaccctct cgacggcact tatccgcctg gtactgagca aaaccccgct 420 aatcctaatc cttctcttga ggagtctcag cctcttaata ctttcatgtt tcagaataat 480 aggttccgaa ataggcaggg ggcattaact gtttatacgg gcacttttac tcaaggcact 540 gaccccgtta aaacttatta ccagtacact cctgtatcat caaaagccat gtatgacgct 600 tactggaacg gtaaattcag agactgcgct ttccattctg gctttaatga ggatccattc 660 gtttgtgaat atcaaggcca atcgtctgac ctgcctcaac ctcctgtcaa tgctggcggc 720 ggctctggtg gtggttctgg tggcggctct gagggtggtg gctctgaggg tggcggttct 780 gagggtggcg gctctgaggg aggcggttcc ggtggtggct ctggttccgg tgccatggtt 840 agatctgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg 900 tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 960 gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 1020 gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 1080 acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 1140 tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1200 gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggaggagatg 1260 accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1320 gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1380 gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1440 caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg cacgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1500 aagagcctct ccctgtctcc gggtaaatga 1530 <210> 5 <211> 1524 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 5 atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacgaattcg 60 atggctgaaa ctgttgaaag ttgtttagca aaaccccata cagaaaattc atttactaac 120 gtctggaaag acgacaaaac tttagatcgt tacgctaact atgagggctg tctgtggaat 180 gctacaggcg ttgtagtttg tactggtgac gaaactcagt gttacggtac atgggttcct 240 attgggcttg ctatccctga aaatgagggt ggtggctctg agggtggcgg ttctgagggt 300 ggcggttctg agggtggcgg tactaaacct cctgagtacg gtgatacacc tattccgggc 360 tatacttata tcaaccctct cgacggcact tatccgcctg gtactgagca aaaccccgct 420 aatcctaatc cttctcttga ggagtctcag cctcttaata ctttcatgtt tcagaataat 480 aggttccgaa ataggcaggg ggcattaact gtttatacgg gcacttttac tcaaggcact 540 gaccccgtta aaacttatta ccagtacact cctgtatcat caaaagccat gtatgacgct 600 tactggaacg gtaaattcag agactgcgct ttccattctg gctttaatga ggatccattc 660 gtttgtgaat atcaaggcca atcgtctgac ctgcctcaac ctcctgtcaa tgctggcggc 720 ggctctggtg gtggttctgg tggcggctct gagggtggtg gctctgaggg tggcggttct 780 gagggtggcg gctctgaggg aggcggttcc ggtggtggct ctggttccgg tgccagatct 840 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 900 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 960 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 1020 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 1080 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1140 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1200 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1260 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1320 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1380 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1440 aacgtcttct catgctccgt gatgcacgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1500 ctctccctgt ctccgggtaa atga 1524 <210> 6 <211> 1524 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 6 atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacgaattcg 60 atggctgaaa ctgttgaaag ttgtttagca aaaccccata cagaaaattc atttactaac 120 gtctggaaag acgacaaaac tttagatcgt tacgctaact atgagggctg tctgtggaat 180 gctacaggcg ttgtagtttg tactggtgac gaaactcagt gttacggtac atgggttcct 240 attgggcttg ctatccctga aaatgagggt ggtggctctg agggtggcgg ttctgagggt 300 ggcggttctg agggtggcgg tactaaacct cctgagtacg gtgatacacc tattccgggc 360 tatacttata tcaaccctct cgacggcact tatccgcctg gtactgagca aaaccccgct 420 aatcctaatc cttctcttga ggagtctcag cctcttaata ctttcatgtt tcagaataat 480 aggttccgaa ataggcaggg ggcattaact gtttatacgg gcacttttac tcaaggcact 540 gaccccgtta aaacttatta ccagtacact cctgtatcat caaaagccat gtatgacgct 600 tactggaacg gtaaattcag agactgcgct ttccattctg gctttaatga ggatccattc 660 gtttgtgaat atcaaggcca atcgtctgac ctgcctcaac ctcctgccaa tgctggcggc 720 gagtctggtg gtggttctgg tggcggctct gagggtggtg gctctgaggg tggcggttct 780 gagggtggcg gctctgaggg aggcggttcc ggtggtggct ctggttccgg tgccagatct 840 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 900 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 960 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 1020 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 1080 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1140 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1200 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1260 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1320 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1380 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1440 aacgtcttct catgctccgt gatgcacgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1500 ctctccctgt ctccgggtaa atga 1524 <210> 7 <211> 488 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 7 Ala Glu Thr Val Glu Ser Cys Leu Ala Lys Pro His Thr Glu Asn Ser 1 5 10 15 Phe Thr Asn Val Trp Lys Asp Asp Lys Thr Leu Asp Arg Tyr Ala Asn 20 25 30 Tyr Glu Gly Cys Leu Trp Asn Ala Thr Gly Val Val Val Cys Thr Gly 35 40 45 Asp Glu Thr Gln Cys Tyr Gly Thr Trp Val Pro Ile Gly Leu Ala Ile 50 55 60 Pro Glu Asn Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly 65 70 75 80 Gly Ser Glu Gly Gly Gly Thr Lys Pro Pro Glu Tyr Gly Asp Thr Pro 85 90 95 Ile Pro Gly Tyr Thr Tyr Ile Asn Pro Leu Asp Gly Thr Tyr Pro Pro 100 105 110 Gly Thr Glu Gln Asn Pro Ala Asn Pro Asn Pro Ser Leu Glu Glu Ser 115 120 125 Gln Pro Leu Asn Thr Phe Met Phe Gln Asn Asn Arg Phe Arg Asn Arg 130 135 140 Gln Gly Ala Leu Thr Val Tyr Thr Gly Thr Phe Thr Gln Gly Thr Asp 145 150 155 160 Pro Val Lys Thr Tyr Tyr Gln Tyr Thr Pro Val Ser Ser Lys Ala Met 165 170 175 Tyr Asp Ala Tyr Trp Asn Gly Lys Phe Arg Asp Cys Ala Phe His Ser 180 185 190 Gly Phe Asn Glu Asp Pro Phe Val Cys Glu Tyr Gln Gly Gln Ser Ser 195 200 205 Asp Leu Pro Gln Pro Pro Gly Asn Ala Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 210 215 220 Ser Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu 225 230 235 240 Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly 245 250 255 Ala Met Val Arg Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 260 265 270 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 275 280 285 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 290 295 300 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 305 310 315 320 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 325 330 335 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 340 345 350 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 355 360 365 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 370 375 380 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr 385 390 395 400 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 405 410 415 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 420 425 430 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 435 440 445 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 450 455 460 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 465 470 475 480 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 485 <210> 8 <211> 1530 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 8 atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacgaattcg 60 atggctgaaa ctgttgaaag ttgtttagca aaaccccata cagaaaattc atttactaac 120 gtctggaaag acgacaaaac tttagatcgt tacgctaact atgagggctg tctgtggaat 180 gctacaggcg ttgtagtttg tactggtgac gaaactcagt gttacggtac atgggttcct 240 attgggcttg ctatccctga aaatgagggt ggtggctctg agggtggcgg ttctgagggt 300 ggcggttctg agggtggcgg tactaaacct cctgagtacg gtgatacacc tattccgggc 360 tatacttata tcaaccctct cgacggcact tatccgcctg gtactgagca aaaccccgct 420 aatcctaatc cttctcttga ggagtctcag cctcttaata ctttcatgtt tcagaataat 480 aggttccgaa ataggcaggg ggcattaact gtttatacgg gcacttttac tcaaggcact 540 gaccccgtta aaacttatta ccagtacact cctgtatcat caaaagccat gtatgacgct 600 tactggaacg gtaaattcag agactgcgct ttccattctg gctttaatga ggatccattc 660 gtttgtgaat atcaaggcca atcgtctgac ctgcctcaac ctcctggcaa tgctggcggc 720 ggctctggtg gtggttctgg tggcggctct gagggtggtg gctctgaggg tggcggttct 780 gagggtggcg gctctgaggg aggcggttcc ggtggtggct ctggttccgg tgccatggtt 840 agatctgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg 900 tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 960 gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 1020 gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 1080 acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 1140 tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1200 gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggaggagatg 1260 accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1320 gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1380 gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1440 caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg cacgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1500 aagagcctct ccctgtctcc gggtaaatga 1530

Claims (28)

  1. 개시 아미노산 서열의 변이체를 포함하는 폴리펩티드로서, 상기 개시 아미노산 서열은 서열 번호: 1의 아미노산 1 내지 217, 서열 번호: 3의 아미노산 1 내지 217, 서열 번호: 7의 아미노산 1 내지 217, 및 다음 개질(modification) 중 하나 이상을 갖는 상기의 것들 중 임의의 것의 돌연변이체로부터 선택되며: AAA에 의한 아미노산 43 내지 45에서의 VVV의 치환; 치환 C53W; 아미노산 96 내지 103의 결실; AGA에 의한 아미노산 212 내지 214에서의 QPP의 치환; 치환 W181A, F190A 및 F194A; 아미노산 1의 결실; 및 아미노산 1과 2의 결실;
    여기서:
    (a) 상기 폴리펩티드는 아밀로이드에 결합되고/되거나 이를 분해하고;
    (b) 상기 폴리펩티드는 상기 개시 아미노산 서열을 포함하는 상응하는 폴리펩티드에 비하여 면역원성(immunogenicity)이 감소되었고;
    (c) 상기 변이체는 상기 개시 아미노산 서열에 비하여 1 내지 9개의 아미노산 치환을 가지며, 이때 각각의 아미노산 치환은 하기에 제시된 아미노산 치환 그룹으로부터 선택되며:
    Figure pct00019
    ;
    그리고
    (d) 상기 개시 아미노산 서열이 서열 번호: 1의 아미노산 1 내지 217인 경우에, 1 내지 9개의 아미노산 치환중 임의의 것은 임의로 하기 제시된 아미노산 치환 그룹으로부터 부가적으로 선택되는 것인, 폴리펩티드.
    Figure pct00020
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 개시 아미노산 서열에서 1 내지 9개의 아미노산 치환이 각각 하기 제시된 아미노산 치환 그룹으로부터 선택되는, 폴리펩티드.
    Figure pct00021
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 개시 아미노산 서열이 서열 번호: 1의 아미노산 1 내지 217, 서열 번호: 3의 아미노산 1 내지 217 및 서열 번호: 7의 아미노산 1 내지 217로부터 선택되는, 폴리펩티드.
  4. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변이체 아미노산 서열이 상기 개시 아미노산 서열에 비하여 2 내지 9개의 아미노산 치환을 가지며, 여기서 적어도 1개의 치환은 서열 번호: 1, 서열 번호: 3 또는 서열 번호: 7의 아미노산 48 내지 56을 포함하는 에피토프 1; 서열 번호: 1, 서열 번호: 3 또는 서열 번호: 7의 아미노산 135 내지 143을 포함하는 에피토프 2; 및 서열 번호: 1, 서열 번호: 3 또는 서열 번호: 7의 아미노산 173 내지 181을 포함하는 에피토프 3 중 적어도 2개에 존재하는, 폴리펩티드.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 개질된 아미노산 서열이 단지 2개의 아미노산 치환을 가지며, 여기서 상기 치환은 하기 제시된 2개 아미노산 치환 그룹으로부터 선택되는, 폴리펩티드.
    Figure pct00022
  6. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변이체 아미노산 서열이 상기 개시 아미노산 서열에 비하여 3 내지 9개의 아미노산 치환을 가지며, 여기서 적어도 1개의 치환이 서열 번호: 1, 서열 번호: 3 또는 서열 번호: 7의 아미노산 48 내지 56을 포함하는 에피토프 1; 서열 번호: 1, 서열 번호: 3 또는 서열 번호: 7의 아미노산 135 내지 143을 포함하는 에피토프 2; 및 서열 번호: 1, 서열 번호: 3 또는 서열 번호: 7의 아미노산 173 내지 181을 포함하는 에피토프 3의 각각에 존재하는, 폴리펩티드.
  7. 청구항 5에 있어서, 상기 변이체 아미노산 서열이 상기 개시 아미노산 서열에 비하여 단지 3개의 아미노산 치환을 가지며, 여기서 상기 치환은 다음 아미노산 치환 세트: T56H, M135K 및 D178N: T56K, M135K 및 D178N; T56K, M135T 및 D178N; T56H, M135K 및 W181R; T56H, M135T 및 W181R; Y54K, M135T 및 K174R; Y54R, M135K 및 K174R; Y54R, M135T 및 K174R; T56H, M135K 및 K174R; 및 T56H, M135T 및 K174R중 임의의 것으로부터 선택되는, 폴리펩티드.
  8. 청구항 1 내지 청구항 7중 어느 한 항에 있어서, 필수적으로 상기 변이체 아미노산 서열의 C-말단에 펩티드 링커(linker)를 통해 또는 직접 융합되는 인간 또는 인간화된(humanized) 면역글로블린 Fc 폴리펩티드 서열로 이루어진, 폴리펩티드.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 면역글로블린 Fc 폴리펩티드 서열이 인간 IgG의 Fc 부분인, 폴리펩티드.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 펩티드 링커 및 인간 IgG의 Fc 부분의 아미노산 서열이 서열 번호: 1의 아미노산 218 내지 488, 서열 번호: 3의 아미노산 218 내지 486, 및 서열 번호: 7의 아미노산 218 내지 488로부터 선택되는, 폴리펩티드.
  11. 개질된 개시 서열로 이루어진 폴리펩티드 변이체로, 여기서 상기 개시 서열은 서열 번호: 3 또는 서열 번호: 7로부터 선택되고, 상기 개질은 2 또는 3개 아미노산 치환이며, 상기 폴리펩티드는 하기 제시된 폴리펩티드 중 임의의 것으로부터 선택되는 것인, 폴리펩티드 변이체.
    Figure pct00023

    Figure pct00024

    Figure pct00025
  12. 청구항 11에 있어서, 폴리펩티드 번호 110, 112, 113, 116, 117, 118, 122, 127, 128 또는 129 중 임의의 것으로부터 선택되는, 폴리펩티드.
  13. 청구항 1 내지 청구항 12중 어느 한 항의 폴리펩티드 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 조성물이 환자의 혈류로 주사 또는 주입을 위해 제형화되는, 약제학적 조성물.
  15. 청구항 13에 있어서, 상기 조성물이 뇌 또는 CNS로 직접 투여를 위해 제형화되는, 약제학적 조성물.
  16. 청구항 1 내지 청구항 12 중 어느 한 항의 폴리펩티드 및 청구항 13 내지 청구항 15 중 어느 한 항의 약제학적 조성물을 유효량으로 상기 환자에 투여하는 단계를 포함하는, 아밀로이드 또는 tau 단백질 응집체(aggregate) 감소를 필요로 하는 환자에서 아밀로이드 또는 tau 단백질 응집체를 감소시키는 방법.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 환자가 아밀로이드 또는 tau 단백질 응집체의 존재와 관련된 신경변성 질병의 증상을 나타내는, 방법.
  18. 청구항 16 또는 청구항 17에 있어서, 상기 환자는, 상기 바이오마커가 양전자 방사 단층촬영(positron emission tomography)에서 영상화제(imaging agent)로서 사용되는 경우에 바이오마커 플로르베타피르(florbetapir)에 대해 양성인, 방법.
  19. 청구항 16 내지 청구항 18 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자가 조발성 알츠하이머병, 만발성 알츠하이머병, 및 전조증상적 알츠하이머병을 포함하는, 알츠하이머병, 파킨슨병, SAA 아밀로이드증, 시스타틴 C, 유전성 아이슬란드 증후군(hereditary Icelandic syndrome), 노망, 다발성 골수종, 쿠루병, 크로이츠펠트-야곱병(CJD), 게르스트만 슈트라우슬러 샤인커병(Gerstmann-Straussler-Scheinker disease: GSS), 치명적 가족성 불면증(FFI), 스크래피, 및 소 해면상 뇌증(BSE)과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 프리온 질병들; 근육위축가쪽경화증(ALS), 척수소뇌성실조증(SCA1, SCA3, SCA6 또는 SCA7), 헌팅톤병, 엔타토루브랄-팔리돌류시안 위축증(entatorubral-pallidoluysian atrophy), 척추 및 연수 근육 위축증, 유전성 대뇌 아밀로이드 혈관병, 가족성 아밀로이드증, 영국인/덴마크인 치매, 가족성 뇌병증, 근위축성 측색경화증/파킨슨증-치매 합병증, 은 친화성 그레인 치매(Argyrophilic grain dementia), 피질기저퇴행, 권투선수 치매(Dementia pugilistica), 석회화를 지닌 분산된 신경원섬유엉킴들(diffuse neurofibrillary tangles), 다운 증후군(Down's syndrome), 게르스트만-슈트로이슬러 샤인커병, 할러포르텐-스파츠병(Hallervorden-Spatz disease), 근육긴장 디스트로피, 니이만-픽병(Niemann-Pick disease) C형, 신경원섬유엉킴을 지닌 비-괌의 운동신경원병(Non-Guamanian motor neuron disease), 픽병, 뇌염후 파킨슨증, 프리온 단백질 중추 아밀로이드 혈관병증, 진행성 피질하부 신경아교증(Progressive subcortical gliosis), 아급성경화범뇌염(Subacute sclerosing panencephalitis), 탱글 온리 치매(Tangle only dementia), 전측두엽변성(frontotemporal lobar degenerations: FTLDs), 및 행동 변이(behavioral variant) FTD(bvFTD), 진행성의 유창하지 않은 실어증(progressive non-fluent aphasia: PNFA) 및 17번 염색체에 연결된 파킨슨증을 지닌 전측두엽 치매 중 하나 이상을 갖는 환자를 포함하는 전측두엽 치매(FTD), 진행성 핵상마비(progressive supranuclear palsy; PSP) 및 의미적 치매(semantic dementia: SD)로부터 선택되는 신경변성 질병을 앓는, 방법.
  20. 청구항 19에 있어서, 상기 신경변성 질병이 파킨슨병, 알츠하이머병 또는 헌팅톤병인, 방법.
  21. 청구항 20에 있어서, 상기 신경변성 질병이 알츠하이머병인, 방법.
  22. 청구항 19에 있어서, 상기 환자가 크로이펠츠-야곱병, 쿠루, 치명적 가족성 불면증, 또는 게르스트만-슈토이슬러-샤인커 증후군으로부터 선택되는 프리온-매개 질병을 앓는, 방법.
  23. 청구항 1 내지 청구항 12의 폴리펩티드 중 임의의 것을 암호화하는 핵산 서열.
  24. 청구항 23에 있어서, 상기 폴리펩티드 암호화 서열에 융합되고 이것과 프레임을 이루는 포유동물 시그널 서열을 추가로 암호화하는, 핵산 서열.
  25. 상기 핵산 서열이 상기 벡터 내 발현 조절 서열에 작동가능하게 결합되는, 청구항 23 또는 청구항 24의 핵산 서열을 포함하는 벡터.
  26. 청구항 25의 벡터를 함유하는 숙주 세포.
  27. 청구항 23 또는 청구항 24의 핵산 서열에 의해 암호화된 상기 단백질을 발현시키는 단계; 및 상기 발현된 폴리펩티드를 단리하는 단계를 포함하는, 청구항 1 내지 청구항 12 중 어느 한 항의 폴리펩티드의 제조 방법.
  28. 폴리펩티드의 발현을 허용하기에 충분한 조건 하에서 청구항 26의 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 상기 발현된 폴리펩티드를 단리하는 단계를 포함하는, 청구항 1 내지 청구항 12 중 어느 한 항의 폴리펩티드의 제조 방법.
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX362175B (es) 2011-11-29 2019-01-07 Proclara Biosciences Inc Composiciones de proteina del gen 3 de bacteriofago y sus usos como agentes de union amiloides.
LT2906235T (lt) 2012-10-02 2017-10-25 Proclara Biosciences, Inc. Bakteriofago sulietų baltymų p3, kaip amiloido rišamųjų agentų, naudojimas
TW201632542A (zh) * 2014-12-03 2016-09-16 神經噬菌體製藥股份有限公司 包含缺乏醣基化信號之修飾噬菌體ｇ３ｐ胺基酸序列的多肽
CN107384960B (zh) * 2017-07-25 2020-06-12 吉优诺（上海）基因科技有限公司 基于复制缺陷性重组腺病毒携带il-17结合分子转基因载体及其构建方法和应用
AU2019287623A1 (en) 2018-06-15 2021-01-07 Amyl Therapeutics Srl General amyloid interaction motif (GAIM)
EP3966227A1 (en) 2019-05-07 2022-03-16 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the vectored augmentation of protein destruction, expression and/or regulation
CN114057858B (zh) * 2020-08-10 2023-03-21 上海瑞吉康生物医药有限公司 对引起神经变性和神经退行性疾病的蛋白聚集具有解聚作用的多肽
WO2024119183A1 (en) 2022-12-02 2024-06-06 Alzheon, Inc. Methods for treating neurodegenerative disorders with tramiprosate

Family Cites Families (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3941763A (en) 1975-03-28 1976-03-02 American Home Products Corporation PGlu-D-Met-Trp-Ser-Tyr-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 and intermediates
US4215051A (en) 1979-08-29 1980-07-29 Standard Oil Company (Indiana) Formation, purification and recovery of phthalic anhydride
DE3572982D1 (en) 1984-03-06 1989-10-19 Takeda Chemical Industries Ltd Chemically modified lymphokine and production thereof
CA2006596C (en) 1988-12-22 2000-09-05 Rika Ishikawa Chemically-modified g-csf
EP1132471A3 (de) 1989-09-12 2001-11-28 F. Hoffmann-La Roche Ag TNF-bindende Proteine
US6552170B1 (en) 1990-04-06 2003-04-22 Amgen Inc. PEGylation reagents and compounds formed therewith
US5252714A (en) 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
CA2288429C (en) 1991-03-15 2006-04-25 Synergen, Inc. Pegylation of polypeptides
JP3068301B2 (ja) * 1992-01-08 2000-07-24 三菱電機株式会社 Ｉｃカード内のコネクタ支持固定機構
FR2686899B1 (fr) 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
ATE311895T1 (de) 1992-05-26 2005-12-15 Immunex Corp Neue zytokine die cd30 binden
EP1724282B1 (en) 1997-05-21 2013-05-15 Merck Patent GmbH Method for the production of non-immunogenic proteins
CA2342967A1 (en) 1998-12-08 2000-06-15 Biovation Limited Modifying protein immunogenicity
US20020052311A1 (en) 1999-09-03 2002-05-02 Beka Solomon Methods and compostions for the treatment and/or diagnosis of neurological diseases and disorders
US8022270B2 (en) 2000-07-31 2011-09-20 Biolex Therapeutics, Inc. Expression of biologically active polypeptides in duckweed
PL362324A1 (en) 2001-02-19 2004-10-18 Merck Patent Gmbh Artificial fusion proteins with reduced immunogenicity
BR0207945A (pt) 2001-03-08 2004-07-27 Merck Patent Ges Mit Beschroen Fator estimulante de colÈnia de macrófagos granulócitos modificados (gm-csf) com reduzida imunogenicidade
DE10238846A1 (de) 2002-08-20 2004-03-04 Nemod Immuntherapie Ag Aktive Fusionsproteine und Verfahren zu ihrer Herstellung
JP5096169B2 (ja) * 2005-02-01 2012-12-12 ラモット・アット・テルアビブ・ユニバーシティ アミロイド沈着に付随する炎症および活性化されたマイクログリアにかかわる脳の炎症の処置法
US20090317324A1 (en) 2006-02-15 2009-12-24 Ramot At Tel Aviv University Filamentous bacteriophage displaying protein as a binder of antibodies and immunocomplexes for delivery to the brain
WO2007094003A2 (en) 2006-02-15 2007-08-23 Ramot At Tel Aviv University Ltd. Viral display vehicles for treating multiple sclerosis
WO2007109733A2 (en) 2006-03-21 2007-09-27 The Johns Hopkins University Diagnostic and prognostic markers and treatment strategies for multiple sclerosis
WO2007114139A1 (ja) 2006-04-06 2007-10-11 Fumiaki Uchiyama 新規繊維状ファージによるファージディスプレイ
US20090324554A1 (en) 2006-07-21 2009-12-31 Ramot At Tel Aviv University Ltd. Method for inhibiting or treating a disease associated with intracellular formation of protein fibrillar or aggregates
CA2666320A1 (en) 2006-10-11 2008-04-17 Antitope Limited T cell epitope databases
EP2303315A1 (en) 2008-05-22 2011-04-06 Ramot at Tel Aviv University Ltd. Method for treating disease characterized by plaque
EP2478911A1 (en) 2008-11-24 2012-07-25 Ramot at Tel Aviv University Ltd. Method for treating Parkinson's disease using filamentous bacteriophage
WO2011084714A2 (en) * 2009-12-17 2011-07-14 Biogen Idec Ma Inc. STABILIZED ANTI-TNF-ALPHA scFv MOLECULES OR ANTI-TWEAK scFv MOLECULES AND USES THEREOF
KR20140051840A (ko) 2011-03-11 2014-05-02 라모트 앳 텔-아비브 유니버시티 리미티드 신경변성 타우오패씨를 치료하는 방법
MX362175B (es) * 2011-11-29 2019-01-07 Proclara Biosciences Inc Composiciones de proteina del gen 3 de bacteriofago y sus usos como agentes de union amiloides.
LT2906235T (lt) 2012-10-02 2017-10-25 Proclara Biosciences, Inc. Bakteriofago sulietų baltymų p3, kaip amiloido rišamųjų agentų, naudojimas
TW201632542A (zh) 2014-12-03 2016-09-16 神經噬菌體製藥股份有限公司 包含缺乏醣基化信號之修飾噬菌體ｇ３ｐ胺基酸序列的多肽

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