JP5878922B2

JP5878922B2 - 糖尿病血管合併症の治療

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Publication number: JP5878922B2
Application number: JP2013515709A
Authority: JP
Inventors: ベルンハルト・フィッシャー; ルドルフ・ルカス
Original assignee: Apeptico Forschung und Entwicklung GmbH
Current assignee: Apeptico Forschung und Entwicklung GmbH
Priority date: 2010-06-21
Filing date: 2010-10-20
Publication date: 2016-03-08
Anticipated expiration: 2030-10-20
Also published as: ES2933405T3; EP2397151A1; KR101752260B1; CN102946897A; JP2013530970A; US20130116200A1; EP2582385B1; CA2800261A1; DK2397151T3; EP2582385A1; PL2397151T3; AU2010355825B2; EP2397151B1; CA2800261C; KR20130127359A; CN102946897B; ES2542227T3; RU2545718C2; WO2011160664A1; AU2010355825A1

Description

本発明は、糖尿病の血管合併症の予防および治療方法に関する。

糖尿病は、2000年には、世界で、およそ1.5億人が侵されており、2010年には2.2億人に達すると予測される、一般的な代謝性疾患である。糖尿病およびその関連合併症は、かなり大きな公衆衛生問題となっている。心臓血管疾患は、過剰な罹患率と死亡率のほとんどの原因となっている。糖尿病の成人は、糖尿病でない成人と比べて、心臓血管イベントのリスクが2〜4倍に増加する。心臓血管疾患は、糖尿病患者における時期尚早な過剰な死亡率の80%までを占める。この疾患に関連する時期尚早な罹患率と死亡率のために、その合併症の予防が重要な課題である。

糖尿病において、血管内皮の機能不全は、糖尿病性微小血管障害および大血管障害の病因における重要なファクターとみなされている。糖尿病における内皮機能不全に寄与する３つの主な源がある：i)高血糖および即時の生化学的後遺症は、内皮機能を直接変更する；ii)高血糖は、他の細胞における成長因子および血管作用剤の合成によって内皮細胞の機能に間接的に影響を及ぼし、内皮単層透過性を変更する；iii)内皮に影響を及ぼしうるメタボリックシンドロームの要素(Schalkwijkら、Clin. Sci. 109(2005)、143−159)。

本発明の目的は、糖尿病患者における血管合併症の病理学的影響を軽減する手段を提供することである。

したがって、本発明は、糖尿病患者における血管合併症の治療および予防のための、7−17個のアミノ酸からなり、隣接する六量体TX₁EX₂X₃Eを含むペプチド（ここで、X₁、X₂およびX₃は、任意の天然または非天然アミノ酸である）であって、TNF特異的炎症活性を示さず(Hribarら、Eur. J. Immunol. 1999；Eliaら、AJRCCM 2003；実施例セクションも参照)、環式であるペプチドを提供する。

X₁、X₂およびX₃は、天然タンパク質合成のための塩基性アミノ酸のセットである20個の天然の標準アミノ酸から選ばれるのが好ましい；X₁、X₂およびX₃が、疎水性側鎖を有する天然アミノ酸(Ala、Ile、Leu、Met、Val、ProおよびGly)から選ばれるのがより好ましい。(互いに独立して)X₁＝Pro；X₂およびX₃＝Gly、Ala、Val、LeuまたはIleであるのが特に好ましく；X₂X₃が、Gly−Ala、Gly−Val、Ala−GlyまたはAla−Valから選ばれるジペプチドであるのが好ましい。

本発明のペプチドが、7−17個のアミノ酸からなり、六量体TPEGAE(配列番号：4)を含むのが好ましく、ここで、ペプチドは、環式であり、TNF受容体結合活性を示さない。

本発明の特に好ましい実施態様は、糖尿病患者における血管合併症の治療および予防のための、六量体TPEGAEを含む、
− QRETPEGAEAKPWY(配列番号：5)
− PKDTPEGAELKPWY(配列番号：6)
− CGQRETPEGAEAKPWYC(配列番号：1)および
− CGPKDTPEGAELKPWYC(配列番号：7)
ならびに少なくとも7個のアミノ酸からなるそのフラグメントから選ばれる連続したアミノ酸の配列からなる環式ペプチドに関する。

本発明ペプチドは、たとえば、欧州特許EP 1 264 599 B1などから、肺水腫の治療における使用が知られている。

驚いたことに、これらのペプチドは、糖尿病患者における血管合併症の治療および予防にとって、特に有益であることがわかった。したがって、本発明は、糖尿病患者における血管合併症の治療および予防のための医薬の製造における、これらのペプチドの使用に関する。

本発明にしたがって治療および予防される糖尿病のタイプは、一般的糖尿病、好ましくは1型糖尿病、2型糖尿病、妊娠性糖尿病、先天性糖尿病、嚢胞性線維症関連糖尿病、ステロイド糖尿病(高用量の糖質コルチコイドによって誘発される)およびいくつかの形態の単一遺伝子糖尿病のいずれであってもよい；しかしながら、本発明にとって、I型およびII型糖尿病が好ましい標的疾患であり、II型糖尿病が特に好ましい。本発明は、本明細書に記載の血管合併症の発症のリスクを有するかまたはリスクにある糖尿病患者に有効量の本発明ペプチド(またはペプチドの混合物)を投与する、糖尿病患者における血管合併症の治療および予防方法を提供する。

糖尿病は、再発性または持続性の高血糖を特徴とし、以下のいずれかひとつを実証することによって診断される：
−空腹時血糖値7.0 mmol/L(126 mg/dL以上(現在の(WHO)定義による；2つの空腹時血糖測定値126 mg/dL(7.0 mmol/L)が、糖尿病のための診断とみなされる；
−グルコース負荷試験において経口グルコース摂取した2時間後の血糖値が11.1 mmol/L(200 mg/dL)以上；
−高血糖の症状および随時血糖値11.1 mmol/L(200 mg/dL)以上；
−糖化ヘモグロビン(ヘモグロビンA1C)6.5以上(この基準は、2010年、米国糖尿病教会によって推奨された；WHOにはまだ採用されていない)；

空腹時血糖値が100〜125 mg/dL(5.6〜6.9 mmol/L)である患者は、空腹時血糖異常を有するとみなされる。75 gグルコース経口摂取の2時間後に、140 mg/dL(7.8 mmol/L)以上であるが、200 mg/dL(11.1 mmol/L)を越えない血糖値の患者は、空腹時血糖異常を有するとみなされる。これらの2つの前糖尿病状態のうち、特に後者は、本格的な糖尿病ならびに心臓血管疾患(糖尿病患者における主要な血管合併症としての)への進行の主要なリスク因子である。

糖尿病患者における血管合併症は、微小血管障害および大血管障害を引き起こしうる。網膜および腎微小血管障害は、それぞれ網膜症および腎症を引き起こし、神経の脈管の微小血管障害は、神経障害の発症機序において重要である。糖尿病における大血管障害は、主として、促進されたアテローム性動脈硬化症からなり、冠動脈、頸動脈および末梢動脈に影響を及ぼすことによって、心筋梗塞、脳卒中および糖尿病による足の病気のリスクを増加させる。I型およびII型糖尿病の両方において、大規模臨床試験が、高血糖が、心臓微小血管透過性亢進などの微小血管合併症の発症機序において重要な役割を演じることを実証している。高血圧、喫煙、高コレステロール血症、脂質異常症、肥満および高ホモシステイン血症は、微小血管障害のさらなる主な原因である。

大血管障害のリスクは、高血糖と関連性が高いようには見えないが、年齢、喫煙、高血圧、高コレステロール血症、脂質異常症、肥満および高ホモシステイン血症などのアテローム血栓症に対する一般的リスク因子に関連している。すべての上述の因子は、低悪性度の炎症過程および内皮機能不全によって明らかにされる、持続性および進行性の損傷状態を血管壁に生み出す。上述したように(Schalkwijkら、2005)、血管内皮の機能不全は、微小および大血管障害の発症機序において重要な因子とみなされる。糖尿病中の血管合併症に関与するパラメーターは、機能不全性血管弛緩容量と心臓透過性亢進である

したがって、本発明は、糖尿病患者における、微小血管障害および大血管障害、心筋梗塞、心臓微小血管透過性亢進、脳卒中、網膜症、腎症または糖尿病による足の病気に特に適している。

本発明によって、糖尿病の血管合併症患者を治療および予防することができる。糖尿病は、現在、完治できない病気であるから、本発明における「治療」は、これらの合併症の通常の進行と比較しての糖尿病患者の血管合併症の改善の提供を含むと理解されるべきである。同様に、本発明における「予防」もまた、糖尿病患者の血管合併症が、糖尿病患者におけるこれらの合併症の通常の出現と比べて、本発明の提供による疾患状態においては、遅く起こることを含む。

本発明による特に好ましいペプチドは、アミノ酸配列CGQRETPEGAEAKPWYCからなり、C残基(1および17位にて)を介して環化される。

本発明の環化は、アミノ酸残基の官能基の直接分子内環化を介して、好ましくはC−C結合(2つのC残基間のジスルフィド結合)を介して得られる。ペプチドは、たとえば、2つのシステインを介して、担体物質にカップリングしてもよい。したがって、本発明ペプチドが、分子の始めと終わりにシステイン残基を提示するのが好ましい。アミノ酸残基のアミンまたはアルコール基などのペプチドの環化能力がある他の官能基を用いて、アミドまたはエステル閉環をもたらすことができる(これには、アミノ酸であるアスパラギン酸およびグルタミン酸、およびセリン、トレオニン、チロシン、アスパラギン、グルタミンまたはリシンなどが挙げられてもよく、分子内的に環化されるのが好ましい)。したがって、他の好ましい本発明ペプチドは、たとえば、CGQKETPEGAEAKPWYC(配列番号：8)、CGQRETPEGAEARPWYC(配列番号：9)、CGQRETPEGAEAKPC(配列番号：10)、CQRETPEGAEAKPWYC(配列番号：11)またはCGQRETPEGAEAKFWYC(配列番号：12)などである。

適当な担体は、本発明ペプチドに適当な結合基を提示する一般的な医薬担体物質に使用されているすべてであり、たとえば、システインのSH基と反応して共有結合を形成する担体である。他の適当な担体は、二官能性基(たとえば、アミンまたはアルコール基の近くにある酸基など)を含む。これに関連して、本発明の「環化」が、分子内環化および担体(結合したペプチドがそこから突き出る(ここで、ペプチドのN−およびC−末端は、担体に結合して担体上にループを形成する))の関与の両方を含むことに留意することが重要である。両方の実施態様において、環式ペプチドは、環状の空間構造を示し、したがって、安定化される。いくつかの実施態様において、分子内環化が好ましく、溶解度の理由または分子量もしくは分子サイズの理由から、担体分子の欠如が有利であるならば、特に好ましい。

もう１つの態様において、本発明は、本発明ペプチド(または本発明ペプチドの混合物)および医薬的担体を含む医薬組成物に関する。この医薬組成物は、糖尿病患者における血管合併症の治療および予防に用いられる。

用語「医薬組成物」は、上述したように、本明細書に記載する状態を改善、治療および予防するペプチドを含むいずれかの組成物または製剤を意味する。特に、表現「医薬組成物」は、本発明ペプチドおよび医薬的に許容しうる担体または賦形剤(両方の用語は、同じ意味で用いられる)を含む組成物を意味する。適当な担体または賦形剤は、当業者に知られており、たとえば、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、緩衝液、ハンクス液、ベシクル形成化合物(たとえば、脂質)、不揮発性油、オレイン酸エチル、生理食塩水中の5%デキストロース、等張性および化学的安定性を増強させる物質、緩衝液および保存剤などが挙げられる。他の適当な担体として、患者にとって有害である抗体の産生を患者において誘発しないいずれかの担体が挙げられる。例は、耐容性の高いタンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、高分子アミノ酸およびアミノ酸共重合体である。すでに上述したように、本発明ペプチドは、直接共有結合によって、このような担体に環化することができる。この医薬組成物は、当業者に知られている適当な手順を介して薬物として投与することができる。好ましい投与経路は、非経口投与であり、吸入(エアロゾル)または静脈内投与が特に好ましい。非経口投与のために、本発明医薬組成物は、上述の医薬的に許容しうる賦形剤と併せて、溶液、懸濁液または乳液などとして、注射用用量単位で提供される。しかしながら、投与用量および方法は、治療される個々の患者に応じて変わる。一般に、本発明ペプチドは、1 μg/kg〜10 mg/kg、より好ましくは10 μg/kg〜5 mg/kg、最も好ましくは0.1〜2 mg/kgの用量で投与される。組成物が腹腔内ボーラス用量で投与されるのが好ましい。持続注入を適用することもできる。この場合、ペプチドは、5〜20μg/kg/分、より好ましくは7〜15μg/kg/分の注入用量でデリバリーされる。

本発明によれば、特に好ましい本発明ペプチド(「AP 301」とも呼ばれる)は、以下のアミノ酸配列を有する：
配列番号：1
(NH2)Cys−Gly−Gln−Arg−Glu−Thr−Pro−Glu−Gly−Ala−Glu−Ala−Lys−Pro−Trp−Tyr−Cys(COOH)。

図１は、STZ注射から４週間後のコントロールラット、ストレプトゾシン(STZ)処置ラットまたはTIPペプチド＋STZ処置ラット(n＝3)からのU46619により収縮している中隔の冠状動脈(Septal coronary arteries)におけるアセチルコリン誘発性血管弛緩を示す。図２は、TIPペプチド処置が、STZ処置ラット(n＝3)において血糖値に影響を及ぼさないことを示す。図３は、TIPペプチド処置が、わずかに、そして用量依存的に、STZ処置ラット(n＝3)において尿量を減少させることを示す。図４は、FITC−BSAによるラット心臓(ランゲンドルフ)の蛍光顕微鏡画像を示す。図５は、心臓透過性におけるTIPペプチド(125 μg/ラット、4週間以上、腹腔内)の効果を示す(ランゲンドルフ法を用いるアルブミン−FITC取り込みによって評価)。

以下の実施例および図面によって、本発明をさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

１．ラットのストレプトゾシン誘発糖尿病中の内皮弛緩におけるTNF誘導性TIPペプチドの効果
ストレプトゾシン(STZ)は、膵β細胞破壊を引き起こす抗生物質であり、インスリン依存性糖尿病(IDDM)を誘発しうる作用剤として実験的に広く用いられている。

この実験において、雄性スプラーグ・ドーリーラット(240〜265 g、n＝3)を３つのグループに分けた：１）ビヒクルのみの注射を受けたコントロールラット；２）STZ(50 mg/kg、腹腔内)により糖尿病にされたラット；および３）STZ注射の2日前から開始して、4週間にわたって、TIPペプチド(125 μg、腹腔内)で3日ごとに併用処置されたSTZ処置ラット。血中濃度＞350 mg/dLのラットを、糖尿病とみなした。ラットの中隔の冠状動脈を、先に述べられている(Romeroら、2008)ように調製した。簡単に述べると、血管の冠動脈セグメントを小さい血管ミオグラフ(Danish Myo Technology)に載せ、トロンボキサンA2類縁体U46619 9,11−ジデオキシ−9a,11a−メタノエポキシプロスタグランジンF2a；化学名：(5Z)−7−[(1R,4S,5S,6R)−6−[(1E,3S)−3−ヒドロキシ−1−オクテニル]−2−オキサビシクロ[2.2.1]ヘプト−5−イル]−5−ヘプテン酸で収縮させ、アセチルコリンの漸進的な濃度に応答する、それらの弛緩能力を試験した。血管弛緩応答は、最大コントロール弛緩のパーセントで表される。図１に示すように、STZ誘発糖尿病ラットから単離された中隔の冠状動脈は、コントロールラットと比べて、有意に低下した血管弛緩キャパシティを示した。TNF誘導性TIPペプチドとの糖尿病ラットの併用処置は、中隔の冠状動脈における血管弛緩応答を改善した。この一般に認められた糖尿病動物モデルは、TNF誘導性TIPペプチドAP301が糖尿病中の内皮血管弛緩を改善することができることを示す。

血糖値、血圧、尿量および体重におけるこれらのラットでの本発明のTIPペプチド処置の効果もまた、検討した(図２および３)。TIPペプチド処置動物は、STZグループと同程度の血糖値であったが、STZグループと比べて、尿量は少なく、血圧は高かった。TIPペプチド処置動物は、体重の減少も示した。本発明のTIPペプチドはまた、STZ関連心臓透過性をインビボで阻害する。

上記と同じプロトコルにしたがって、コントロール、STZ処置およびTIP/STZ処置ラットから4週間後に心臓を摘出した。ランゲンドルフ法を用い、BSA−FITCで心臓を潅流した(Di Napoliら、Nitric Oxide 16(2007)、228−236)。次いで、液体窒素で心臓を凍結し、ミクロトームで切片を切り出した。次いで、各心臓の4切片において蛍光を評価し、累積蛍光応答を記録した。図４および５に示すように、TIPペプチドAP301は、心臓透過性亢進を有意に阻害した：FITC−アルブミン−潅流ラット心臓からの心室の蛍光顕微鏡は、TIPペプチド不在実験(図４)と比較して、TIPペプチドの存在下（図５）、有意に少ない蛍光着色を検出した。

本発明動物モデルにおいて、ラットにおけるSTZ誘発I型糖尿病が、障害内皮依存性血管弛緩および心臓透過性亢進を特徴とする血管機能不全を引き起こすことを明らかにすることができた。

本動物モデルによって提供されたデータは、本発明の代表的なペプチド(「TIPペプチド」；「AP301」；配列番号：1)での処置は、これらの動物において、糖尿病血管合併症を効果的に治療および予防することを明らかにする。これらのデータは、本発明のペプチドによる治療が、ヒト患者においても糖尿病血管合併症の治療のための新たな療法のための有望なアプローチであることをサポートする。

２．ヒト全血中のAP301ペプチドの炎症促進特性のエクスビボ評価
ヒト全血中のAP301ペプチドのエクスビボ安全性の薬理学的研究を行って、AP301ペプチドが、新鮮なヒト全血からの炎症促進性マーカーであるインターロイキン−6(IL−6)の放出をもたらすかどうか(すなわち、APN301がTNF特異的炎症活性を提示するかどうか)を評価した。

この研究において、新鮮なヒト全血が、インビボにおける炎症応答の評価のための予測モデルシステムを表すので、それを用いた。

方法論の概要
AP301ペプチドの炎症促進性シグナル伝達能力を決定するのがこの実験の目的である。全血培養を用い、炎症促進性刺激に対して非常に感度の高いマーカーであるELISAによってインターロイキン−6(IL−6)の分泌を定量した。
テストシステム
テストシステムアッセイにおいて、5人の健康なボランティア(HV)からの25 mlの新たに採取したヘパリン化血を用いた。
テスト項目
同定 AP301ペプチド(用量：1ng/ml〜10 μg/ml；溶液で単回投与)
説明白色粉末、純度96 %
全血培養
を24ウエルプレートのウエルに1 mlのWBをピペッティングすることによって全血(WB)培養を行った。各実験には、非刺激およびコントロール刺激培養物が含まれた。
可能であれば、所定の実験の各ウエルに、調査される物質および刺激剤を、ウエル内に含まれる総体積の10 %以下で、常に同じ体積で加えた。非刺激コントロールはPBSを受けた。異なる処理のための体積調整および希釈もまた、PBSで行った。

各ウエルの内容物を混合し、プレートを37℃にて、5%CO₂下、24時間インキュベートした。インキュベーション後、各ウエルの内容物を新しい1.5 mlマイクロチューブに移し、8000〜9000 x gにて15分間遠心分離した。各サンプルの上清を別々に2つの1.5 mlマイクロチューブに移し、使用するまで−20℃に保つ。

インターロイキン−6の検出
捕捉抗体として抗ヒトIL−6抗体、ビオチン化抗ヒトIL−6検出抗体、酵素試薬としてアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体、および標準として組換えIL−6を用いる特定のELISA(ヒトIL−6 ELISAセット、BD Biosciences、カタログ番号555220)によって、インターロイキン−6を定量した。Packard Fusion Readerを用い、450 nmにて吸光度測定を行った。
データ分析
各プレートについての結果を保管し、Fusion Data Analysisソフトウェアを用いて評価した。

実験結果の概要
AP301ペプチドの炎症促進性シグナル伝達能力を決定するのがこの実験の目的であった。全血培養を用い、炎症促進性刺激に対して非常に感度の高いマーカーであるELISAによってIL−6の分泌を定量した。

健康なボランティアからの全血サンプルを、非刺激のまま(ネガティブコントロール)、高用量および低用量のLPSで刺激(ポジティブコントロール)、または10 μg/ml〜1 ng/mlの範囲の9つの片対数希釈においてペプチドとインキュベートのいずれかに付した。
表：ペプチドAP301およびLPSの添加時の新鮮なヒト全血からのインターロイキン−6の放出

結果は、AP301ペプチドが、試験したどの濃度においても、検出可能なレベルのIL−6分泌を誘発しないことを明らかに示した。ポジティブコントロール(LPS)は、IL−6分泌の強い誘発をもたらした。

議論
実験は、AP301ペプチドが炎症促進性応答の誘発を媒介するかどうかを評価するために行われた。読み取りパラメーターは、5人の健康なドナーからの全血培養物におけるIL−6の誘発された分泌であった。結果は、AP301ペプチドが、ドナーの培養物において、いかなるレベルのIL−6も誘発しなかったことを明らかに示した。したがって、AP301ペプチドが、選択したエクスビボモデルにおいて炎症促進性応答を誘発しないことが実証された。

Claims

糖尿病患者における血管合併症の治療および予防のための医薬の製造のための、連続したアミノ酸の配列：CGQRETPEGAEAKPWYC(配列番号：1)からなる環式ペプチドの使用。
糖尿病患者における、微小血管障害および大血管障害、心筋梗塞、心臓微小血管透過性亢進、脳卒中、網膜症、腎症または糖尿病による足の病気の治療のための医薬の製造のための請求項１に記載のペプチドの使用。
ペプチドが、C残基を介して環化されることを特徴とする、請求項１または２に記載のペプチドの使用。
ペプチドが、C残基間のジスルフィド結合によって環化されることを特徴とする、請求項２に記載のペプチドの使用。
連続したアミノ酸の配列：CGQRETPEGAEAKPWYC(配列番号：1)からなる環式ペプチドおよび医薬的担体を含む糖尿病患者における血管合併症の治療および予防のための医薬組成物。