KR102217476B1 - 식 ｘ₁－ｇｑｒｅｔｐｅｇａｅａｋｐｗｙ－ｘ₂의 고리 펩티드를 함유하는 동결건조물 - Google Patents

식 ｘ₁－ｇｑｒｅｔｐｅｇａｅａｋｐｗｙ－ｘ₂의 고리 펩티드를 함유하는 동결건조물 Download PDF

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Abstract

첨가제 및/또는 안정제 없는 동결건조물의 형태인 식 I의 고리 펩티드 및 그것의 사용.
X1-GQRETPEGAEAKPWY-X2 (I)
여기서
X1은 천연 및 비천연 아미노산을 포함하는 1 내지 4 멤버를 가진 아미노산(서열)을 포함하고, X2는 천연 아미노산을 포함하고, X1은 위치 1에 있는 왼쪽 N-말단 아미노산을 포함하고, X2는 마지막 오른쪽 위치에 있는 C-말단 아미노산을 포함한다.

Description

식 Ｘ₁－ＧＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹ－Ｘ₂의 고리 펩티드를 함유하는 동결건조물{LYOPHILISATE CONTAINING A CYCLIC PEPTIDE OF FORMULA X₁-GQRETPEGAEAKPWY-X₂}
본 발명은 포유류, 예를 들어 사람의 폐에 투여하도록 된 제약학적으로 적용가능한 동결건조물에 관한 것이다.
제약 활성 성분들의 활성은 이들 활성 성분이 신체에서 또는 장기에서 각각 처리되는 방식에 다소 본질적으로 의존한다.
의약을 투여하는 가장 흔한 방식은 비경구 투여이다. 피부를 통해서, 예를 들어 혈류에 직접, 근육에, 또는 피부 밑에 직접 의약이 주사된다.
의약 흡수의 다른 통상적인 형태는 위와 장관에 경구 투여하는 것이다. 의약에 함유된 활성 성분들은 위와 장관에서 유리되고, 신체, 혈액 및 장기에 재흡수를 통해서 도달된다.
의약은 또한 피부나 점막을 통해서 투여될 수 있다.
주사에 대한 대안으로서 경구 흡입 방법이 제안되었다. 이 경우 의약은 분말 형태로 또는 소적 형태로 구강과 인두에 송달되고, 아마도 호흡한 공기와 함께 폐에 도달할 것이다. 이로부터 이들 의약은 폐 조직을 통해서 혈액으로 송달되고, 따라서 신체 전신에 공급된다.
그러나, 의약의 경구 흡입은 현재 아직도 실질적인 기술상의 문제를 지닌다. 특히 예를 들어 단백질과 같은 고 분자량 활성 성분은 매우 제한적으로만 경구 흡입을 통해서 적용될 수 있다. 무화 또는 분무 과정 동안 열과 압력에 의해서 활성 성분인 단백질이 물리적으로 손상되거나 비활성화된다. 활성 단백질 성분은 경구 흡입 전에 저장하는 동안과 흡입 도중에 다소 불안정하다. 게다가, 이러한 펩티드 활성 성분은 폐의 기공에서 이미 변성될 수 있다.
이것을 상쇄하기 위하여, 단백질의 흡입을 위한 이러한 제제에서 매우 다양한 제약 제형이 개발되었다. 따라서, 단백질의 흡입을 위한 이러한 제제는 칼슘이나 나트륨 염과 같은 염, 안정제 및 텐사이드, 특정 버퍼 혼합물, 지질 혼합물 등을 원하는 용해 특징의 획득, 안정성의 보장, 단백질 활성의 보호를 위해서 함유할 수 있다. 단백질 의약의 제조 동안 다른 혼합물, 예를 들어 알부민, 삼투제, 항산화제, 응집 및 침전을 피하기 위한 화학 물질, 리포솜, 젤라틴, 알기네이트, 당 등을 포함할 수 있다.
따라서, 흡입을 위한 제조되어 제약학적으로 가공된 펩티드제 및 단백질제는 이어서 폐 조직을 통해 의도적으로 또는 우연히 혈액에 도달하게 되어, 거기서 검출될 수 있다.
요약하면, 현재 단지 두 가지의 국제 등록된 단백질/펩티드 기반 흡입용 의약으로서 Pulmozyme®(데옥시리보뉴클레아제)과 Exubera®(인슐린)이 있다. 활성 및 안정성의 보장을 위해 이들 제제는 예를 들어 염을 함유한다(각각 염화나트륨, 염화칼슘, 또는 나트륨 시트레이트, 만니톨, 글리세롤, 수산화나트륨).
사람의 의약 사용을 위한 단백질/펩티드 제형을 제조하기 위한 일반적인 기술적 방식은 물의 제거를 위한 동결건조이다(예를 들어, J Pharm Sci. 2009 Sep;98 (9):2886-908). 그러나, 이들 최신 과정 동안에는 예를 들어 이당류와 같은 보조제가 펩티드의 안정성 및 활성을 보장하기 위해 첨가된다(Allison SD et al, Arch Biochem Biophys. 1999 May 15;365(2):289-98). 동결건조 동안 물의 제거 후 활성 및 안정성을 보장하고(Roberts et al, Adv Drug Deliv Rev. 2002 Jun, 17;54(4): 459-76, 2002, Morris et al, Antimicrob Agents Chemother. 2012 Jun;56(6):3298-308. doi:10.1128/AAC.06335-11), 단백질 가수분해 과정에 의한 변성을 피하고(Lee et al, Regul Pept. 2009 Jan 8;152(1-3):101-7; Baginski et al, Pharm Res. 2012 Jun;29(6):1425-34) 또는 분자 질량에 유리한 영향을 미치는 것(Veronese & Pasut, Drug Discov Today. 2005 Nov 1;10(21):1451-8; Patton & Byron, Nat Rev Drug Discov. 2007 Jan;6(1):67-74)을 위해서, 각각 펩티드와 단백질 위에서 폴리에틸렌글리콜(PEG)과 결합시키는 것이 성공적인 것으로 입증되었다.
이제 놀랍게도 첨가제 없는 적용 형태가 특정 펩티드에 대해 발견되었으며, 이것은 폐기능에 긍정적인 영향을 미치고, 이 적용 형태는 극히 적합한 것으로 드러나게 되었다.
한 양태에서, 본 발명은 첨가제 및/또는 안정제 없는 동결건조물 형태의 식 I의 고리 펩티드를 제공한다:
X1-GQRETPEGAEAKPWY-X2 (I)
여기서
X1은 천연 또는 비천연 아미노산을 포함하여 1 내지 4, 특히 1 내지 3 멤버의 아미노산(서열)을 포함하며, 특히 아미노산(서열) C(Cys), KSP(Lys-Ser-Pro), K(Lys), 오르니틴, 4-아미노부티르산, β-알라닌으로부터 선택되고,
X2는 천연 아미노산, 특히 C(Cys), D(Asp), G(Gly) 및 E(Glu) 그룹으로부터 선택된 것을 포함하고,
여기서 X1은 위치 1에 있는 왼쪽 N-말단 아미노산을 포함하고, X2는 마지막 오른쪽 위치에 있는 C-말단 아미노산을 포함한다.
본 발명에 의해서 제공되는 동결건조물은 여기서 "본 발명의 (본 발명 하의, 본 발명에 따른) 동결건조물"이라고 지칭된다. 또한, 본 발명에 따른 동결건조물 중의 펩티드는 여기서 "본 발명의 (본 발명 하의, 본 발명에 따른) 펩티드"라고 지칭된다.
본 발명의 동결건조물에는 하나의 또는 몇 개의 식 I의 고리 펩티드가 존재할 수 있으며, 이 경우 바람직하게 단지 하나의 식 I의 펩티드가 존재한다.
식 I의 고리 화합물은 다음의 아미노산 서열을 가진 고리 화합물이다:
X1-Gly-Gln-Arg-Glu-Thr-Pro-Glu-Gly-Ala-Glu-Ala-Lys-Pro-Trp-Tyr-X2
여기서 X1 및 X2는 상기 정의된 대로이다.
또한, 식 I의 신규 화합물이 본 발명의 주제이다.
식 I의 화합물에서 고리는 식 I의 화합물의 아미노산 잔기 중 둘의 두 적합한 치환체 사이의 결합을 통해서, 예를 들어 아민 결합, 또는 이황화 브릿지를 통해서 형성될 수 있으며, 여기서 고리는 바람직하게 적어도 15, 더 바람직하게 적어도 17, 최대 19 또는 20, 예를 들어 17 내지 19 아미노산 잔기를 포함하고, 이들은 고리 멤버로서 식 I의 화합물에 존재한다.
바람직하게 고리의 형성은 X1의 아미노산의, 바람직하게 X1의 위치 1의 아미노산의 적합한 치환체와 X2의 적합한 치환체 사이의 결합에 의해서 형성된다.
본 발명의 식 I의 아미노산 서열에 사용될 수 있는 천연 아미노산은 공지되어 있으며, 예를 들어 G(Gly), A(Ala), V(Val), L(Leu), I(Ile), M(Met), P(Pro), F(Phe), W(Trp), S(Ser), T(Thr), N(Asn), Q(Gln), C(Cys), U(Sec), Y(Tyr), D(Asp), E(Glu), H(His), K(Lys), R(Arg)을 포함한다.
본 발명의 식 I의 아미노산 서열에 사용될 수 있는 비천연 아미노산 서열은 다음을 포함한다:
(i) 원칙적으로 천연 아미노산의 화학 구조를 갖지만 알파 아미노산이 상이한 아미노산,
(ii) D-형태, 즉 천연 L-형태 이외의 다른 천연 아미노산, 이것은 위치 2에서 C-원자의 알킬기가 L-형태로 존재하지 않고 D-형태로 존재하는 천연 아미노산을 의미한다,
(iii) 예를 들어 피롤일, 인돌일, 이미다졸일을 포함하는 페닐과 같은 추가의 고리와 선택적으로 융합된, 선택적으로 천연 아미노산에도 존재하는 치환체, 예를 들어 OH, -CONH2,-NH-C(=NH2)NH2, SH, (C1- 4)알킬-S-, 페닐, N, O, S로부터 선택된, 바람직하게 N인, 적어도 하나의, 예를 들어 하나 또는 2개의 헤테로원자를 포함하며, 예를 들어 5 또는 6 고리 멤버를 포함하는 헤테로시클릴에 더하여, 2 내지 12, 예컨대 2 내지 6 탄소 원자, 적어도 하나, 예를 들어 하나 또는 2개의 아민기, 및 적어도 하나, 예를 들어 하나 또는 2개의 카복시기를 포함하는, 예를 들어 상기 (i) 및 (ii)에서 정의된 것 이외의 다른 비천연 아미노산.
본 발명의 식 I의 비천연 아미노산은 오르니틴, 4-아미노부티르산, β-알라닌을 포함한다.
추가의 양태에서, 본 발명의 식 I의 고리 화합물은 다음을 포함한다:
- 아미노산 서열 SEQ ID NO:1을 갖는 화합물
시클로(CGQRETPEGAEAKPWYC)
여기서 이황화 브릿지가 양 말단 시스테인 잔기 사이에 형성된다;
- 아미노산 서열 SEQ ID NO:2를 갖는 화합물
시클로(KSPGQRETPEGAEAKPWYE)
여기서 아미드 결합이 N-말단 리신 잔기의 ε-탄소 원자에 부착된 아민기와 C-말단 글루타민산 잔기의 γ-탄소 원자에 부착된 측쇄 카복시기 사이에 형성된다;
- 아미노산 서열 SEQ ID NO:3을 갖는 화합물
시클로(KGQRETPEGAEAKPWYG)
여기서 아미드 결합이 N-말단 리신 잔기의 측쇄의 ε-탄소 원자에 부착된 아민기와 C-말단 글리신 잔기의 카복시기 사이에 형성된다;
- 아미노산 서열 SEQ ID NO:4를 갖는 화합물
시클로(오르니틴-GQRETPEGAEAKPWYG)
여기서 아미드 결합이 N-말단 오르니틴 잔기의 측쇄의 δ-탄소 원자에 부착된 아민기와 C-말단 글리신 잔기의 카복시기 사이에 형성된다;
- 아미노산 서열 SEQ ID NO:5를 갖는 화합물
시클로(4-아미노부탄산-GQRETPEGAEAKPWYD)
여기서 아미드 결합이 N-말단 4-아미노부티르산 잔기의 아민기와 C-말단 아스파라긴산 잔기의 β-탄소 원자에 부착된 측쇄 카복시기 사이에 형성된다; 및
- 아미노산 서열 SEQ ID NO:6을 갖는 화합물
시클로(β-알라닌-GQRETPEGAEAKPWYE)
여기서 아미드 결합이 N-말단 β-알라닌 잔기(3-아미노프로판산 잔기)의 아민기와 C-말단 글루타민산 잔기의 γ-탄소 원자에 부착된 측쇄 카복시기 사이에 형성된다.
식 I의 화합물뿐만 아니라 아미노산 서열 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 또는 SEQ ID NO:6의 화합물에서, 아미노산은 고리 형성을 가져오는 결합을 제외하며 일반적인 펩티드 방식으로 결합된다.
식 I의 고리 화합물은 본원에서 "본 발명의 (본 발명 하의, 본 발명에 따른) 고리 화합물(들)"이라고 지칭되며, 예를 들어 자유 형태 및 염 형태 등, 어떤 형태의 식 I의 고리 화합물을 포함한다. 생물학적 환경에서 일반적으로 식 I의 화합물은 통상 염의 형태로 존재한다.
추가의 양태에서, 본 발명의 동결건조물 중에서 식 I의 화합물은 염의 형태이다.
이러한 염은 바람직하게 제약학적으로 허용되는 염을 포함하지만, 예를 들어 제조/분리/정제 목적을 위한 제약학적으로 허용되지 않는 염들도 포함된다.
생물학적 환경에서 식 I의 화합물의 염은 통상 염산염이다.
본 발명의 식 I의 고리 화합물은 자유 형태에서 염 형태의 식 I의 고리 화합물로 전환될 수 있으며, 그 반대도 가능하다.
본 발명의 식 I의 고리 화합물은 이성질체 및 이성질체들의 혼합물, 예를 들어 광학 이성질체의 형태로 존재할 수 있다. 식 I의 고리 화합물은, 예를 들어 비대칭 탄소 원자를 포함할 수 있고, 따라서 거울상이성질체 또는 부분입체이성질체 및 이들의 혼합물, 예를 들어 라세메이트의 형태일 수 있다. 식 I의 고리 화합물은 비대칭 탄소 원자에서의 개별 치환체에 관하여 (R)-, (S)- 또는 (R,S)-형태, 바람직하게 (R)- 또는 (S)-형태로 존재할 수 있다. 이성질체 혼합물은 적절하게, 예를 들어 종래의 방법에 따라서, 예컨대 유사한 방법으로 분리될 수 있으며, 이로써 순수한 이성질체가 얻어진다. 본 발명은 어떤 이성질체 형태 및 이성질체 혼합물의 어떤 형태로 식 I의 고리 화합물을 포함한다. 천연 아미노산의 경우 치환체의 형태는 통상 천연 아미노산에서와 같다.
본 발명의 고리 화합물은 적절하게, 예를 들어 종래의 방법에 따라서, 예를 들어 유사한 방법으로, 또는 본원에 명시된 대로, 예를 들어 고체상 펩티드 합성에 의해서, 선택적으로 적절한 커플링제, 예컨대 디이소프로필 카보디이미드 및/또는 N-하이드록시벤조트리아졸 및 적절한 용매, 예를 들어 N,N-디메틸포름아미드를 사용하여 2-클로로트리틸클로라이드 수지 상에서 플루오렌일메톡시카보닐/t-부틸 보호 전략에 따라서 제조될 수 있다. 보호된 아미노산은 C-말단 아미노산에서 시작하여 펩티드 사슬에 연속 커플링될 수 있다. 플루오렌일메톡시카보닐-보호된 기의 탈보호는 적절한 용매 중에서 피페리딘과 같은 염기를 사용하여, 예컨대 N,N-디메틸포름아미드 중의 20% 피페리딘을 사용하여 수행될 수 있다. 수지로부터 완료된, 선택적으로(부분적으로) 보호된 펩티드의 절단은 적절하게, 예를 들어 할로겐화 탄화수소, 예컨대 CH2Cl2와 같은 적절한 용매 중에서 아세트산과 같은 산의 도움을 받아, 예를 들어 아세트산과 CH2Cl2의 1:1 혼합물에서 수행될 수 있다.
시스테인-함유 펩티드의 경우, 수지로부터의 절단 후, 필요하다면 측쇄 탈보호가, 예를 들어 트리플루오로아세트산(TFA)과 같은 강산을 사용하여, 예를 들어 95% TFA/5% H2O에서 수행될 수 있다. 이황화 결합을 얻기 위한 고리화는 말단 시스테인 잔기의 산화에 의해서 수행될 수 있으며, 예를 들어 90시간 동안 pH 8.5에서 조 선형 펩티드의 공기처리에 의해 달성될 수 있다. 얻어진 조 펩티드 생성물은, 예를 들어 크로마토그래피에 의해서, 예를 들어 RP-C18-실리카겔 칼럼과 같은 적절한 칼럼에서 역상 중간 압력 액체 크로마토그래피(RP-MPLC)에 의해서, 5% 내지 40% 아세토니트릴-물 구배와 같은 용출 구배를 편리하게 사용하여 정제될 수 있다. 트리플루오로아세테이트 카운터 이온은, 예를 들어 Lewatit MP64 칼럼(아세테이트 형태)과 같은 칼럼에서 아세테이트로 치환될 수 있다. 물로 최종 세척 후, 아세테이트 염으로서 정제된 펩티드가 동결건조될 수 있고, 흰색과 같은 연한 색의 분말 형태로 얻어질 수 있다.
시스테인-무함유 펩티드의 경우, 고리화 단계가 적절하게, 예를 들어 수지로부터 절단 후 부분적으로-보호된 선형 펩티드 상에서 수행될 수 있다. 시스테인-무함유 펩티드의 선택적 고리화 후, 필요하다면 TFA에서 측쇄 탈보호가 수행될 수 있다. 정제 단계는, 예를 들어 크로마토그래피를 통해서, 예를 들어 예비 RP-MPLC에 의해서 수행될 수 있다. 이렇게 얻어진 펩티드에서 아세테이트에 의한 트리플루오로아세테이트 이온의 치환이, 예를 들어 상기 설명된 대로 수행될 수 있다. 또한, 펩티드의 아세테이트 형태의 동결건조가, 예를 들어 시스테인-함유 펩티드에 대한 것처럼 수행될 수 있다.
얻어진 펩티드의 분자 질량은 전자분무 이온화 질량분광기 또는 MALDI-TOF-MS에 의해서 확인될 수 있다. 예를 들어 분석 고성능 액체 크로마토그래피에 의해서 순도가 결정될 수 있다.
식 I의 고리 화합물은 아미노산 서열 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 또는 SEQ ID NO:6을 가진 화합물을 포함한다. 이러한 화합물들은, 예를 들어 Hazemi P., Tzotzos, S., Fischer B., Andavan, G.S.B., Fischer H., Pietschmann H, Lucas, R. and Lemmens-Gruber, R. in J. Med. Chem. 2010 November 25, 53(22): 8021-8029, "Essential structural features of TNF-α lectin-like domain derived peptides for activation of amiloride-sensitive sodium current in A549 cells"로부터 알려졌으며, "아밀로라이드-감응 상피 나트륨 채널(ENaC)"을 활성화하기 때문에 폐에서 질환의 치료에 유용하다. 아밀로라이드-감응 나트륨 이온 채널(ENaC)의 활성화에 의해서 나트륨 이온이 폐 조직을 통해 수송된다. 삼투 구배가 형성되어 수동적 물 수송이 이루어진다. 이 모델이 폐 위에 전달된다면 아밀로라이드-감응 나트륨 이온 채널의 활성화는, 예를 들어 폐 부종의 경우, 예를 들어 폐에서 물 축적의 감소를 위해서 사용될 수 있다.
본 발명의 개발 과정에서 X1 및 X2가 상기 정의된 대로인, 예를 들어 아미노산 서열 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:6을 가진 본 발명의 식 I의 고리 펩티드의 폐 조직을 통한 혈액으로의 능동적 또는 수동적 수송은 바람직하지 않고 일어나지 않아야 하는 것으로 판명되었는데, 이들이 경구 흡입을 통해 폐 기공에 도달해서 폐 조직의 표면에 침착되어 정점-배향된 아밀로라이드-감응 나트륨 이온 채널을 활성화할 수 있다면, 그것은 아미노산 서열 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:6을 가진 고리 화합물의 생리학적 효능에 실질적으로 기여하기 때문이다.
놀랍게도 물의 첨가에 의해서 본 발명에 따른 동결건조물로부터 제조된 에어로졸의 흡입 후 본 발명의 펩티드는 혈액에서 검출되지 않았던 것으로 나타났다(실시예 10).
흡입 후 폐 조직을 통해 혈류로 보내지며, 따라서 아마도 비경구 주사는 회피되는 흡입 제제가 일반적으로 개발되었으며, 일반적으로 개발되고 있다. 즉, 이전의 흡입 의약의 목표는 전신적 활성이다. 혈액으로 제제의 분포를 통해서 분자는 각 조직과 장기에 이른다. 그러나, 전신 적용의 실질적인 단점은 치료될 질환과 관련없는 신체 장기 및 조직에서 독성 및 부작용과 관련한 넓은 범위이다.
공기와 폐 상피 사이의 장벽에 이르는 펩티드와는 달리, 본 발명의 동결건조물로부터 제조된 수성 에어로졸을 투여했을 때 이들은 나트륨 채널을 활성화한다. 따라서, 본 발명의 펩티드는 전신적으로 작동하는 것이 아니라 폐 상피 조직 위에 "국소적으로" 작동한다. 폐 조직을 통한 펩티드의 단계는 바람직하지 않으며 일어나지 않는다.
문헌에 알려진 펩티드 제형과는 달리, 첨가제를 함유하지 않는 본 발명의 동결건조물로부터 제조된 수성 에어로졸을 통해서 흡입된 펩티드의 폐를 통한 혈액으로의 전파를 피하는데 성공할 수 있었다. 이로써 펩티드의 가능한 전신-독성 특성과 또한 폐 이외의 다른 장기에 대한 독성이 방지될 수 있다는 극히 긍정적인 효과가 얻어진다. 따라서, 일반적인 부작용도 배제될 수 있어 상당한 의약상의 이점을 제공한다. 내부 폐 표면 위에 국소 투여되며 혈액으로의 확산이 없기 때문에 전신 용도와 비교하여 훨씬 적은 활성제가 필요하다.
더욱이, 놀랍게도 식 I의 고리 펩티드, 특히 아미노산 서열 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:6의 고리 펩티드를 포함하는 첨가제가 없는 본 발명에 따른 동결건조물에서 화학적 및 생물학적 불안정성은 실질적으로 수 개월 및 수 년 동안 배제될 수 있는 것으로 드러났다. 즉, 아미노산 서열 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:6의 것들과 마찬가지로 본 발명의 식 I의 고리 펩티드의 화학적 구조 및 생물학적 활성은 놀랍게도 통상 사용되는 첨가제 및/또는 안정제 없이도 손상되지 않는다는 것이 명백했다.
본 발명의 식 I의, 특히 아미노산 서열 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:6의 고리 펩티드의 흡입을 위한 투여시 고리 펩티드는 이들이 용해된 형태로, 즉 수성 용액으로, 또한 첨가제 없이도, 예를 들어 분무를 위한 장치(분무기)의 저장 용기에서 더 오랜 시간 동안 안정한 것으로 드러났다. 게다가, 본 발명의 식 I의, 특히 본 발명의 아미노산 서열 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:6의 고리 펩티드는 흡입 형태로 전환시 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:6의 고리 펩티드가 놀랍게도 통상 사용되는 첨가제 및/또는 안정제 없이 손상되지 않고, 따라서 완전한 활성을 유지하는 방식으로 제조될 수 있는 것으로 판명되었다.
분무에 적합한 형태로 본 발명의, 특히 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:6의 펩티드 중, 예를 들어 적어도 하나의 용액의 제조를 위하여, 이들 펩티드는 물에 용해될 수 있고, 얻어진 용액은, 예를 들어 통상 사용되는 첨가제 및/또는 안정제와 같은 추가의 첨가제 없이 동결건조될 수 있으며, 이로써 분말이 얻어진다. 동결건조 전에 용액은 선택적으로 침전물을 제거하기 위해 여과될 수 있다.
추가의 양태에서, 본 발명은 분무에 적합한 에어로졸, 특히 첨가제 및/또는 안정제 없는 에어로졸의 제조를 위한 본 발명에 따른 동결건조물의 사용을 제공한다.
본 발명에 따른 동결건조물의 사용은 본원에서 또한 "본 발명에 따른(의) 사용"이라고 지칭된다.
식 I의 펩티드, 특히 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:6의 것들은 이러한 동결건조된 형태에서 일반적인 첨가제 및/또는 안정제의 첨가 없이도 저온 환경에서 적어도 24시간 동안 그리고 실온에서 적어도 6개월 동안 안정했다는 것이 판명되었다.
본 발명에 따른 동결건조물은, 예를 들어 첨가제와 함께 또는 없이, 예를 들어 첨가제 없이, 예를 들어 에어로졸의 직접 제조를 위해, 또는 예를 들어 저장 용기에 용액으로서 저장을 위해, 에어로졸을 얻기 위한 투여를 위해 물에 용해될 수 있다.
추가의 양태에서, 본 발명은 X1 및 X2가 상기 정의된 대로인 식 I의 펩티드가 특히 첨가제 및/또는 안정제 없이 수성 용액 중에 존재하는 동결건조물의 사용을 제공한다.
놀랍게도 유익하게 이렇게 용해된 X1 및 X2가 상기 정의된 대로인 식 I의 고리 펩티드, 특히 아미노산 서열 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:6의 고리 펩티드는 적어도 7일 동안 용액에서 안정한 것으로 드러났으며, 이것은 고리 단백질의 생물학적 활성이 다른 일반적인 첨가제 및/또는 안정체의 첨가 없이도 흡입가능한 모양으로 전환했을 때 감쇠되지 않았음을 의미한다.
본 발명의, 특히 아미노산 서열 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:6의 고리 펩티드의 적용시 펩티드의 용액은 그것이 예를 들어 분무기에 의해서 에어로졸로 전환될 수 있도록 구성되며, 이로써 고리 펩티드는 분무된다는 것이 판명되었다. 여기서 5μm 이하의 직경을 가진 에어로졸 입자가 얻어진 것이 판명되었다.
더욱이, ≤5μm의 직경을 갖는 소적을 우세하게 포함하는 에어로졸이 투여에 특히 적합한 것으로 드러났는데, 결과적으로 에어로졸이 폐의 기공에 도달하기 때문이다. 소적 크기의 하한은 단순히 소적 크기의 실현가능성에만 의존한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 입자 크기가 ≤5μm의 직경을 갖는 에어로졸의 제조를 위한 동결건조물의 사용을 제공한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 동결건조물로부터 제조된 에어로졸이 흡입의 형태로 폐기능의 개선/조정을 위해 사용되는 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 동결건조물의 사용을 제공한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 폐기능의 개선을 위한, 예를 들어 폐 부종의 치료를 위한 본 발명에 따른 동결건조물로부터 제조된 에어로졸, 특히 첨가제가 없는 에어로졸의 사용을 제공하고, 추가의 양태에서 첨가제 없는 본 발명에 따른 에어로졸이 흡입의 형태로 환자에 투여되는 것을 특징으로 하는 폐기능을 개선하기 위한, 예를 들어 폐 부종의 치료를 위한 과정이 제공되고, 추가의 양태에서 폐기능의 개선/조정을 위한 사용을 위한, 또는 폐기능의 개선/조정을 위한 흡입을 위한 본 발명에 따른 동결건조물이 제공된다.
적합한 용량은 상이한 요인들에 의존하며, 예를 들어 식 I의 고리 화합물의 화학적 성질 및 약동학적 특성, 개별 숙주, 예를 들어 숙주의 체중, 나이 및 환자의 개별적 상태 및 질환의 성질 및 중증도에 따른다. 그러나, 일반적으로 큰 포유류에서, 예를 들어 사람에서 만족스러운 결과를 위해서는 (약) 0.1mg/kg 체중 내지 대략 (약) 200mg/kg의 (일일) 용량, 예를 들어 1mg/kg 체중에서 100mg/kg 체중까지가, 예를 들어 몇 번에, 예를 들어 최대 4 (부분) 용량으로 투여되며, 이것은 성공적인 결과에 이를 것이라고 할 수 있다. 어린이는 일반적으로 성인 용량의 절반이다.
X1 및 X2가 상기 정의된 대로인, 특히 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 갖는 식 I의 고리 화합물에 의한 기증자 폐의 생체외 치료에 의해서, 즉 환자에 이식하기 전 치료에 의해서 놀랍게도 폐기능이 개선/조정된다는 것이 연구조사에서 더 밝혀졌다. 여기서 특히 첨가제가 없는 본 발명의 동결건조물로부터의 에어로졸로 이식될 폐가 이식 전에 치료된 경우 월등한 개선이 달성될 수 있음이 밝혀졌다.
추가의 양태에서, 본 발명은 폐기능을 조정/개선하는 체외 방법을 제공하며, 이것은 특히 첨가제 및/또는 안정제 없이 본 발명에 따른 동결건조물로부터 제조된 수성 에어로졸이 기증자 폐에 생체외 분무되는 것을 특징으로 한다.
폐의 치료는 또한 수혜자에게 이어서 이식 후에도 (여전히) 일어날 수 있다.
여기서 도 1에 도시된 결과가 얻어졌다. 에어로졸 중의 본 발명에 따른 식 I의 고리 화합물의 농도는 여기서 5nM 내지 대략 150nM였다.
도 1은 농도에 의존하는 형태로 아미노산 서열 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO: 6을 가진 고리 펩티드의 활성을 나타낸다. SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:6의 고리 단백질의 nM(로그 규모) 농도가 x-축에 표시되고, y-축은 나트륨 이온 흐름 %이다.
도 2는 폐 이식을 모사한, 신체 밖 폐 관류(체외, 생체외) 동안 SEQ ID NO:1의 고리 펩티드의 흡입 적용의 결과를 나타낸다. 도 2a에서 x-축에는 시간 포인트 T1 내지 T4가 표시되며, 여기서 측정은 SEQ ID NO:1의 펩티드의 흡입 적용 후 (한 시간에 한번) 이루어졌고, y-축에는 순응성이 표시된다. 도 2b에서 x-축에는 다시 시간 포인트 T1 내지 T4가 표시되고, y-축에는 동맥-정맥 pO2 차이 ΔpO2가 표시된다. 주사용수(WFI)가 대조군으로 사용되었다. 그룹당 8회 실험의 평균을 나타낸다.
도 3은 시간(분, x-축)에 대한 패널(실선) 및 생성물(점선) 온도(℃)로서 그래프가 작성된 아미노산 서열 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:7을 가진 펩티드의 동결건조 사이클을 나타낸다.
도 4는 냉각 트랩에서 에어로졸을 응축시키기 위한 실험 어셈블리를 도식적으로 나타내며, 여기서
1은 얼음과 염으로 채워진 폴리스티렌 용기,
2는 용해된 펩티드(대조군 물질)가 담긴 작은 튜브,
3은 분무기,
4는 저장실,
5는 대조군 모듈이다.
도 5는 두 상이한 분무기(타입(TYP) A 및 타입(TYP) B)에서 생성된, 아미노산 서열 SEQ ID NO:1을 가진 고리 펩티드의 에어로졸의 평균 입자 크기 분포를 나타낸다. 이것은 레이저 회절에 의해서 결정되었다(유속: 15 L/min). 오차 표지 = SD. 라인은 에어로졸에서 ≤5μm의 직경을 가진 입자의 각 부분을 나타낸다. x-축은 μm 단위의 소적 크기이고, y-축은 누적량이 % 단위로 표시된다.
도 6은 각 장소에서 호흡 시뮬레이터에서 아미노산 서열 SEQ ID NO:1을 가진 고리 펩티드의 에어로졸의 분포를 나타내며, 여기서
1 = 흡입 필터
2 = 날숨 필터
3 = 필터 연결 부품
4 = 분무기 Y-피스(원-웨이 밸브 포함)
5 = 분무기 나머지 부분이며,
여기서 2개의 분무기는 타입(TYP) A의 것과 타입(TYP) B의 것이 사용되었다.
실시예 1
펩티드 합성
펩티드를 다음 단계에 따라서 제조했다:
아미노산의 연속 커플링; 고체상으로부터 선택적 절단; 정제 및 동결건조, 선택적 고리화; 보호기의 절단; 정제 및 동결건조; 분석 조사.
본 발명의 모든 고리 펩티드, 아미노산 서열 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:6의 고리 펩티드뿐만 아니라 아미노산 서열 SEQ ID NO:7을 가진 펩티드를 캐리어(2-클로로트리틸클로라이드 수지) 상에서 고체상 합성의 형태로 플루오렌일메톡시카보닐/t-부틸 보호 전략에 따라서 완전 자동 합성했다. 디이소프로필 카보디이미드와 N-하이드록시벤조트리아졸을 커플링 시약으로 사용했다. 모든 커플링 단계는 용매로서 N,N-디메틸포름아미드에서 수행되었다. 여기서 보호된 아미노산은 출발 물질로서 사용된 각 C-말단 아미노산 위에서 연속 커플링되었다. 플루오렌일메톡시카보닐의 탈보호를 N,N-디메틸포름아미드 중의 20% 피페리딘에서 수행했다. 수지로부터 완료된, 부분적으로-보호된 펩티드의 절단을 아세트산과 디클로로메탄의 1:1 혼합물에서 수행했다.
시스테인-함유 펩티드의 경우, 캐리어(수지)로부터의 절단 후 측쇄 탈보호를 95% 트리플루오로아세트산에서 수행하며, 이어서 말단 시스테인 잔기의 산화에 의한 고리화를 90시간 동안 염기성 pH(8.5)에서 조 선형 펩티드의 공기처리에 의해서 달성했다. 조 고리 펩티드를 5%-40% 아세토니트릴/물의 구배로 RP-C18-실리카 겔 칼럼에서 역상 중간 압력 액체 크로마토그래피(RP-MPLC)에 의해서 정제했다. 마지막으로, 트리플루오로아세테이트 이온을 Lewatit MP64 칼럼(아세테이트 형태)에서 아세테이트로 치환했다. 물에서 세척 후 정제된 펩티드를 아세테이트 염으로서 동결건조해서 흰색 내지 회백색 분말을 얻었다.
시스테인-무함유 펩티드의 경우, 캐리어(수지)로부터 절단 후 부분적으로-보호된 선형 펩티드에서 고리화 단계를 수행했다. 시스테인-무함유 펩티드의 선택적 고리화 후, 트리플루오로아세트산에서 측쇄 탈보호를 수행하고, 이어서 예비 RP-MPLC 크로마토그래피, 아세테이트로 트리플루오로아세테이트 이온의 치환 및 펩티드의 아세테이트 형태의 동결건조를 시스테인-함유 펩티드와 마찬가지로 수행했다.
이후, SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:6의 고리 단백질을 순도 및 질량에 관해 역상 HPLC로 분석했다.
SEQ ID NO:1의 고리 단백질의 순도는 96.3%였다. m/z (ESI) 1924.2 (M++1). SEQ ID NO:2의 고리 단백질의 순도는 96.3%였다. m/z (ESI) 1924.2 (M++1). SEQ ID NO:3의 고리 단백질의 순도는 98.8%였다. m/z (ESI) 1888.2 (M++1). SEQ ID NO:4의 고리 단백질의 순도는 97.4%였다. m/z (ESI) 1873.4 (M++1). SEQ ID NO:5의 고리 단백질의 순도는 99%였다. m/z (MALDI-TOF) 1901.6 (M++1). SEQ ID NO:6의 고리 단백질의 순도는 99%였다. m/z (MALDI-TOF) 1902.7 (M++1). SEQ ID NO:7의 고리 단백질의 순도는 95%였다. m/z (MALDI-TOF) 1778.02 (M++1).
아미노산 서열 SEQ ID NO:7을 갖는 화합물:
시클로(CGQREAPAGAAAKPWYC)
여기서 이황화 브릿지가 양 말단 시스테인 잔기 사이에 형성되며, 이것은 생리학적으로 비활성인 것으로 드러났고, 비교 목적을 위해 사용되었다.
실시예 2
아밀로라이드 -감응 나트륨 이온 채널( ENaC )의 전기생리학적 조사
"패치-클램프" 기술에 의해서 "전 세포" 형태로 사람 폐 상피 세포 A549로부터 육안으로 나트륨 이온 전류를 유도했다(Hamill et al, Pflugers Arch. 1981, 391(2):85-100., 1981). "전 세포" 형태의 전류를 위해 다음의 욕 용액 및 전극 용액이 사용되었다. 배치 용액: 135mM 나트륨 메탄설포네이트, 10mM NaCl, 2.7mM KCl, 1.8mM CaCl2, 2mM MgCl2, 5.5mM 글루코오스, 및 10mM HEPES, pH 7.4. 전극 용액: 120mM 칼륨메탄설포네이트, 15mM KCl, 6mM NaCl, 1mM Mg2ATP, 2mM Na3ATP, 10mM HEPES, 및 0.5mM EGTA(pH 7.2). 세포가 배양된 커버 글래스를 1mL 함유 시험 욕으로 옮겨서 현미경 테이블(Axiovert 100, 400-배 확대) 위에 고정하고, 세포를 상기 설명된 욕 용액으로 과잉성장시켰다. 이어서 적합한 세포(커버 글래스에 붙은)로부터 전류를 유도했다. 이를 위해, 전해질 용액으로 충전된 미세전극(대략 1-3μm의 한정된 열-연마 상부 개구를 가진 유리 모세관 - 3-5MΩ의 전극 상부 전기 저항에 상응한다)을 부착하고, 막을 흡인하여 막과 전극 사이에 "기가옴-시일"을 형성해서 누출 전류를 최소화했다. "전 세포" 형태에서 전극 상부 아래 막이 파괴되었고, 이로써 세포의 전체 이온 채널을 통해서 흐르는 전류의 측정이 가능하게 된다. "기가옴-시일"의 접수시 한정된 막 보유 전위가 사전증폭기(CV-4 Headstag, Axon Instruments) 및 증폭기(Axopatch 1D, Axon Instr.)를 통해서 생성되었고, 이로써 이온 채널을 통해서 흐르는 전류가 측정된다.
펄스 프로토콜은 5초 동안 -100mV까지 세포막의 초분극화와 이어서 +100mV까지 20mV씩 단계적 탈분극화로 구성된다.
이 프로토콜은 고리 단백질의 첨가 전(대조군)과 후에 행해졌다. 이렇게 얻어진 전류를 기록하고 프로그램 PCLAMP 6.0에 의해서 분석했다. 이를 위해, 아밀로라이드의 존재하에 얻어진 전류를 앞서 기록된 전류로부터 차감하며, 그 결과 상피 나트륨 채널에 의한 아밀로라이드-감응 나트륨 전류가 결정될 수 있었다.
측정 결과가 표 1에 개략되며, 세포 아밀로라이드-감응 나트륨 이온 전류에 대한 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:7의 고리 단백질의 활성이 표시된다. 개별 펩티드의 활성은 EC50(nM)으로 표시된다. EC50은 최대 활성의 50%가 측정되는 유효 농도이다(이것은 전류 강도 I의 최대 증가를 의미한다).
고리 단백질 EC 50 (nM)
SEQ ID NO:1 54
SEQ ID NO:2 56
SEQ ID NO:3 38
SEQ ID NO:4 45
SEQ ID NO:5 24
SEQ ID NO:6 19
SEQ ID NO:7 활성 없음
도 1에서, 농도 의존적 방식으로 고리 단백질 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:7의 활성이 그래프로 작성된다. 최대 활성은 100%로 표시되었다.
표 1 및 도 1에 나타낸 조사연구는 아미노산 서열 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:6을 가진 고리 펩티드는 생물학적으로 활성이지만, 구조적으로 어떤 유사성을 나타내는 아미노산 서열 SEQ ID NO:7을 가진 고리 펩티드는 활성이 아님을 보여준다.
실시예 3
동결건조물의 제조
식 I의 고리 펩티드의 안정한 저장 형태의 개발을 기술적 규모로 수행했다. 이를 위해, SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:6의 고리 펩티드와 SEQ ID NO:7의 고리 펩티드를 0.1mg/mL 내지 100mg/mL의 양으로 순수한 물에 용해하고, 침전물, 오염물 및 가능한 세균의 제거를 위하여 0.2μm의 기공 크기를 가진 필터를 통해서 여과했다.
순수한 물에 용해된 고리 펩티드의 여과 후, 유리 또는 플라스틱 앰풀에 나누어 넣고, 냉동-건조(동결건조)에 의해서 안정한 분말로 전환시켰다. 여기서 표 2에 설명된 동결건조 변수 및 도 3에 설명된 동결건조 사이클이 얻어졌다.
단계 과정 저장 온도
(℃) 		유지 시간
(분) 		유지 시간 동 안 온도 이동 (℃) 압력 ( mTorr )
1 로드 5 60 5.0 n/a
2 냉동 -45 150 0.5 n/a
3 1차 건조 -15 940 0.3 250
4 2차 건조 20 630 0.5 75
5 종료 바이알을 95% 순도 질소 분위기에서 닫았다
동결건조 결과, 아미노산 서열 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:6을 가진 고리 화합물에 대해 흰색 분말이 각각 얻어졌다.
실시예 4
실온 및 냉장고에서 저장 후 실시예 2로부터의 동결건조물의 안정성 조사
아미노산 서열 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:6의 고리 펩티드의 동결건조물의 안정성 조사를 기술적 규모로 행했다. 이를 위해, 동결건조물을 60% 상대습도에서 2 내지 8℃에서 최대 24개월 그리고 25℃에서 최대 6개월 저장했다. 이 기간 동안 상이한 시간 포인트에서 안정성을 조사했다. 특히, 고리 펩티드의 외형, 내용물 및 순도를 조사했다. 이를 위해, 예를 들어 육안검사 및 역상 HPLC와 같은 실험실-공통 분석 과정을 사용했다.
게다가, 2-8℃에서 24개월 저장 후 생물학적 활성을 패치 클램프 실험에 의해서 결정했다. 여기서 A549 세포의 육안 전류를 "아밀로라이드-감응 나트륨 이온 채널(ENaC)의 전기생리학적 조사"에 설명된 대로 "패치-클램프" 기술의 "전 세포" 형태에서 유도했다.
표 3에 시간 포인트 T=0 및 6개월 후(T=6M), 또는 24개월 후(T=24M) 아미노산 서열 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:6을 가진 고리 펩티드의 각 동결건조물의 안정성 조사에 대한 결과가 각각 개략된다. 외형은 전 시간 기간 동안 변화가 없었다. 고리 펩티드의 내용물 및 순도는 아주 약간 변동이 있다.
저장 온도
2-8℃ 		저장 온도
25℃/ 60% rH
분석 변수
T=0 T=24M T=0 T=6M
외형
SEQ ID 1
SEQ ID 2
SEQ ID 3
SEQ ID 4
SEQ ID 5
SEQ ID 6		 흰색 분말
흰색 분말
흰색 분말
흰색 분말
흰색 분말
흰색 분말
 흰색 분말
흰색 분말
흰색 분말
흰색 분말
흰색 분말
흰색 분말
양/내용물
SEQ ID 1
SEQ ID 2
SEQ ID 3
SEQ ID 4
SEQ ID 5
SEQ ID 6		 100%
100%
100%
100%
100%
100%		 99%
99%
99%
99%
99%
99%		 100%
100%
100%
100%
100%
100%		 99%
99%
99%
99%
99%
99%
순도
SEQ ID 1
SEQ ID 2
SEQ ID 3
SEQ ID 4
SEQ ID 5
SEQ ID 6		 96%
96%
98%
97%
99%
99%		 96%
96%
98%
97%
99%
99%		 96%
96%
98%
97%
99%
99%		 95%
95%
97%
96%
98%
98%
따라서, 아미노산 서열 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:6의 고리 펩티드의 동결건조물은 각각 60% 상대습도에서 2 내지 8℃에서 최대 24개월 그리고 25℃에서 최대 6개월 동안 안정하다.
패치 클램프 실험에 의한 생물학적 활성 측정은 아미노산 서열 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:6의 고리 펩티드는 각각 2 내지 8℃에서 24개월 저장 후에도 여전히 충분히 활성이었음을 드러냈다.
실시예 5
흡입 전 아미노산 서열 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:6의 고리 펩티드의 수성 용액 제조
아미노산 서열 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:6의 고리 단백질의 투여를 위한 사전 제조를 위해, 실시예 2에 따라서 동결건조 동안 얻어진 안정한 흰색 분말을 각각 순수한 물의 규정된 부피에 용해하여 0.1 mg/mL 내지 100mg/mL의 농도를 얻었다. 다음에, SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:6의 고리 단백질의 결과의 용액을 분무기의 저장 용기로 옮겼다. SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:6의 고리 펩티드를 물에 용해함으로써 투명한 용액이 얻어졌다.
실시예 6
흡입 전 용해된 제제에서 아미노산 서열 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:6의 고리 펩티드의 안정성에 관한 조사
실제적인 이유로 아미노산 서열 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:6의 고리 펩티드의 수성 용액이 항상 흡입을 위한 제조 직후에 사용될 수 있는 것은 아니다. 이런 이유 때문에 수성 용액의 안정성이 예시적으로 조사되었다. 따라서, 사용이 준비된 용액을 7일 동안 2 내지 8℃에서 실험실에서 통상 사용되는 주사기 안에, 또는 24시간 동안 25℃에서 분무기의 용기 안에 저장했다. 특히, 외형, SEQ ID NO:1의 고리 펩티드의 내용물 및 그것의 순도를 조사했다. 따라서, 사용된 방법은, 예를 들어 육안검사 및 역상 HPLC에 의한 분석과 같은 실험실에서 통상 사용되는 분석 방법이었다.
SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 가진 고리 펩티드의 수성 용액의 안정성 조사 결과가 표 4에 제시된다. 외형은 전 시간 기간 동안 변화가 없었다. 고리 펩티드의 내용물 및 순도는 아주 약간 변동이 있었다.
변수 실험실 주사기
온도 2 내지 8℃ 		분무기의 저장 용기, 온도 25℃
T=0 T=7개월 T=0 T=24개월
외형 투명 용액 투명 용액
양/내용물 25 mg/ml 25 mg/ml
순도 96.3% 96.2% 96.6% 96.5%
따라서, 아미노산 서열 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:6의 고리 펩티드의 흡입을 위한 수성 용액은 7일 동안 2 내지 8℃에서 실험실에서 통상 사용되는 주사기 안에서, 또는 적어도 24시간 동안 25℃에서 분무기의 용기 안에서 안정하다.
실시예 7
에어로졸로 전환하는 동안 용해된 제제에서 아미노산 서열 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:6의 고리 펩티드의 안정성에 관한 조사
단백질 및 펩티드는 때로 다소 불안정할 수 있기 때문에 에어로졸로 전환하는 동안 용해된 제제에서 아미노산 서열 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:6의 고리 펩티드가 계속 안정한지의 여부를 조사했다. 이를 위해, 고리 펩티드를 실시예 4에 설명된 대로 물에 용해했다. 분무기의 저장 용기를 충전한 후, 고리 펩티드의 수성 용액을 에어로졸로 전환시켰다. 이를 위해, "메시-타입" 분무기가 사용되었다. 분무기로부터 통과해 나온 에어로졸을 도 4에 도시된 대로 냉각 트랩에 수집했다. 수집된 에어로졸의 생물학적 활성을 패치 클램프 방법에 의해서 결정했다. 여기서 A549 세포의 육안 전류를 "아밀로라이드-감응 나트륨 이온 채널(ENaC)의 전기생리학적 조사"에 설명된 대로 "패치-클램프" 기술의 "전 세포" 형태에서 유도했다.
응축된 에어로졸의 화학적 안정성을 역상 HPLC/MS에 의해서 결정했다.
예시적으로, 에어로졸로의 변환 동안 용해된 제제에서 아미노산 SEQ ID NO:1의 고리 펩티드는 그것의 생물학적 안정성뿐만 아니라 화학적 안정성을 유지하는 것으로 나타났다.
실시예 8
아미노산 서열 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:6의 고리 펩티드의 에어로졸의 물리화학적 특성화
수성 용액을 에어로졸로 전환하는 분무기에 의해서, 아미노산 서열 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:6의 고리 펩티드의 수성 용액도 에어로졸로 전환될 수 있다. 이러한 에어로졸은 평균 소적 크기뿐만 아니라 에어로졸 소적의 크기 분포에 대해서 특성화될 수 있다. 이를 위해, 종래의 방법이 사용되며, 이것은 약전에도 설명된다. 한 가지 분석 방법은 실제 구성에서 "차세대 임팩터"라고 하는 연쇄반응 임팩터를 사용한다. 여기서 에어로졸은 구멍의 직경이 각 판마다 감쇠하고 구멍의 양은 증가하는 일련의 체 판을 통과한다. 다른 분석 방법인 레이저-회절 측정에서는 소적 크기가 레이저에 의해서 결정된다. 이들 측정 동안 결정되는 두 가지 중요한 변수는, 하나는 전체 소적의 직경의 평균이고, 다른 하나는 ≤5μm의 직경을 가진 소적의 양이다. 문헌에서 이 직경은 흡입된 에어로졸 입자가 실제로 폐에 도달하는 상한으로서 설명된다.
실제로 생성된 에어로졸로부터 단지 일부만 환자에게 이용될 수 있다는 것이 잘 알려져 있다. 따라서, 사용자에게 이용가능한 에어로졸의 양을 결정하기 위해 호흡 시뮬레이터를 사용한 시험을 수행했다. 입자 크기를 조사하고 호흡 시뮬레이션을 실시하기 위하여 아미노산 서열 SEQ ID NO:1의 고리 펩티드의 수성 용액으로부터의 에어로졸을 사용했다. 에어로졸을 생성하기 위해 상이한 분무기 타입이 사용되었다. 분무기 A 및 B는 소위 말하는 "메시-타입 분무기"였다.
에어로졸에서 ≤5μm의 직경을 가진 소적의 양은 전체 분무기에서 적어도 50%였으며, 이것은 표 5 및 도 5를 참조하는데, 여기서는 세 가지 상이한 분무기로부터 생성된 아미노산 서열 SEQ ID NO:1의 고리 펩티드의 에어로졸의 특징들이 표시되고 제시된다.
분무기 평균 입자 직경 φ≤ 5μm의 입자의 양
타입 A 4.7μm 50%
타입 B 3.3μm 70%
타입 C 3.7μm 65%
더욱이, 분무기에 의해서 생성된 아미노산 서열 SEQ ID NO:1의 고리 펩티드의 수성 용액의 에어로졸의 대부분이 도 6에 나타낸 대로 흡입에 이용될 수 있다는 것이 입증될 수 있었으며, 이것은 "흡입 필터"에서 고리 단백질의 정량적 검증으로 나타난다. 이용되지 않은 에어로졸 부분은 현저히 적다(도 6).
실시예 9
비경구 투여 후 혈액에서 아미노산 서열 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:6의 고리 펩티드의 입증
비경구 투여 후 혈액에서 아미노산 서열 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:6의 고리 펩티드의 예시적인 입증을 개와 래트에서 수행했다. 이를 위해, 예시적으로 볼루스로서 아미노산 서열 SEQ ID NO:1의 고리 펩티드의 수성 용액을 실험 동물에 정맥내 투여했다(25mg/kg 체중). 정맥내 적용의 종료 직후 혈액을 채취하고, 아미노산 서열 SEQ ID NO:1의 고리 단백질의 농도를 공통 실험실 역상 HPLC/MS에 의해서 결정했다. 결과는 표 6에 제시되며, 정맥 적용 후 아미노산 서열 SEQ ID NO:1의 고리 펩티드의 혈장 농도가 표시된다.
래트 개
혈장 농도
(μg/ml)		 28 42
실시예 10
에어로졸로서 흡입 후 폐 조직에서 아미노산 서열 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:6의 고리 펩티드의 입증
래트의 폐 조직에서 아미노산 서열 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:6의 고리 펩티드의 입증을 수행할 수 있다. 이를 위해, 예시적으로 에어로졸을 아미노산 서열 SEQ ID NO:1의 고리 펩티드의 수성 용액으로부터 분무기를 사용하여 생성했다. 에어로졸은 실험 동물(72mg/kg 체중)에 의해서 흡입되었다. 에어로졸 흡입 종료 후, 실험 동물의 폐 조직과 혈액을 검사했다. 역상 HPLC/MS에 의해서 아미노산 서열 SEQ ID NO:1의 고리 펩티드의 농도를 결정했다. 예시적으로, 아미노산 서열 SEQ ID NO:1의 고리 펩티드는 총 72mg/kg 체중의 흡입 후 1.2μg/g의 농도로 폐 조직에서 검출될 수 있었다. 이와 달리, 아미노산 서열 SEQ ID NO:1의 고리 펩티드는 최대 0.1μg/mL의 검출 한계로서 혈액에서 검출될 수 없었다.
실시예 11
탈글리콜화 세포 표면 위에서 아미노산 서열 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:7의 펩티드의 효과
전 세포 실험에서 A549 세포를 패치 클림프 측정 직전에 효소 "PNGase F"(펩티드-N 4-(N-아세틸-β-D-글루코사미닐)아스파라긴 아미다아제 F) 100 유닛과 함께 1 내지 5분 동안 인큐베이션하고, 배양된 세포가 있는 커버 글래스를 외부 용액으로 헹군 후 1mL 욕의 챔버로 옮겼다. 대조군 기록 후, 240nM의 아미노산 서열 SEQ ID NO:1의 펩티드를 욕 용액에 첨가했다. 총 세포 전류를 대조군 조건에서 어떤 전처리 없이 아미노산 서열 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:7의 펩티드 첨가 후에, 또한 PNGase F로 전처리하여 Eh = -100mV에서 세포에서 기록했다. 전 세포 방식의 패치 클램프 분석을 사용한 탈글리코실화 실험의 결과가 표 7에 제시되며, 아미노산 서열 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:7의 펩티드에 의한 나트륨 전류의 활성화에 대한 A549 세포의 탈글리코실화의 효과가 표시된다. 전 세포 전류는 Eh = -100mV에서 기록되었다. 욕 용액 중 아미노산 서열 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:7의 펩티드의 농도는 240nM였다.
대조군/펩티드 PNGase F로 전처리 PNGase F로 전처리 하지 않음
대조군 25.4 pA (n = 16)
SEQ ID NO　:1 19.6 pA (n = 3) 1073.3 ± 15.1 pA
(n = 10)
SEQ ID NO　:2 21.3 pA (n = 3)
SEQ ID NO　:3 20.6 pA (n = 3)
SEQ ID NO　:4 22.5 pA (n = 3)
SEQ ID NO　:5 22.4 pA (n = 3)
SEQ ID NO　:6 19.9 pA (n = 3)
SEQ ID NO　:7 활성 없음 활성 없음
패치 클램프 분석 전 PNGase F를 사용한(처리) 세포는 나트륨 전류를 증진시키는 아미노산 서열 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:6의 펩티드의 능력을 감소시켰다. -100mV의 고정 전위에서 욕 용액에 펩티드를 첨가하지 않은 대조군 조건에서는 나트륨 이온전류가 처리되지 않은 세포와 PNGase F로 전처리된 세포에서 모두 25.4pA였다. 미처리 세포에서 -100mV의 고정 전위에서 욕 용액에 아미노산 서열 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:6의 펩티드의 첨가(최종 농도 240nM)는 1,000pA 초과의 뚜렷한 나트륨 이온 전류를 가져왔다. 반면에, 아미노산 서열 SEQ ID NO:7의 펩티드는 활성을 나타내지 않았다.
실시예 12
돼지에서 폐 이식 실험
뇌사 돼지를 양와위로 해서 종방향 흉골절개술을 수행했다. 심낭과 양쪽 흉강을 개방했다. 상대정맥과 하대정맥을 빙둘렀다. 우측 환기 배출관에서 펄스-스트링을 통해 유입 카테터를 폐동맥에 삽입했다. 하대정맥과 상대정맥을 결찰하여 유입 폐색을, 대동맥을 스테이플링해서 배출 폐색을 얻었다. 다음에, 유입 카테터를 통해서 차가운 등장 보존 용액(돼지 체중 kg당 50mL, 칼륨 이온, 나트륨 이온, 마그네슘 이온, 칼슘 이온, 염화물 이온, 덱스트란, 글루코오스, 완충 이온 포함)으로 예방적으로 헹궈서 폐를 보존했다. 좌측 심장 관을 절개하여 배출을 제공한다. 이 시간 기간 동안 50% 산소로 폐를 공기처리하고, 양쪽 흉강과 종격에 얼음 슬러시를 제공했다.
다음 단계에 따라서 심장과 식도에서 통틀어 제거하는 외식 기술을 행했다:
a) 기도 양측 흉강에서 연조직 브릿지를 절개한다.
b) 양측 폐 인대를 절개하고(아주 깊게, 심한 노출), VCI, 흉부 하행 대동맥 및 식도를 각각 절개단한다.
c) 나머지 종격 유착부로부터 무디게 분리한다.
d) 기증자 폐를 완전히 들어낸 후 클립으로 기관을 폐쇄한다.
외식 후, 폐를 거즈로 감싸서 저칼륨 덱스트란 세포외 용액으로 채운 아이스백에 넣고 18 내지 24시간 동안 4℃에 보관했다.
생체외 폐 조정을 위해서 EVLP 기술(혈관외 폐 관류)을 사용했다. EVLP 기술에서는 기증자 폐를 펌프, 에어레이터 및 필터로 이루어진 순환계에 배치한다. EVLP 기술에서는 온도가 최대 37℃까지 증가될 수 있다. EVLP에서는 에어레이터를 사용하여 산소를 폐로 송달한다. 펌프를 사용해서 사람 알부민과 영양분을 함유하는 세포외 용액을 폐에 관류시킨다. EVLP 동안 중요 지표에 관해 규칙적으로 폐기능이 평가될 수 있다.
돼지 폐 이식 실험을 위해서 EVLP 순환계를 사람 알부민 용액 2.0 리터로 초회 자극했다. 이 세포외 용액은 최적의 콜로이드 삼투 압력을 가졌다. 순환계를 환기한 후, 폐와 연결될 때까지 초회 자극 용액을 20℃에서 순환시켰다. 헤파린, 세푸록심, 메틸프레드니솔론을 관류액에 첨가했다.
깔대기 모양 실라스틱 관을 봉합하는 것으로 돼지 기증자 폐의 가공을 시작했고, 좌심방 커프(LA)에 압력 모니터 카테터를 내장하여 LA를 개방된 상태로 지탱하고 닫힌 관류 순환계를 유지했다.
신뢰할만한 유효한 배출 배액을 달성하기 위해 이어진 5-0 모노필라멘트 얀을 사용해서 이 관을 LA 커프에 단단히 문합시켰다. PA 크기에 대해 조정하기 위해, 필요에 따라 완전히 손질한 동일한 종류의 캐뉼라를 사용해서 폐동맥(PA)에 캐뉼라를 삽입했다. 완충된 세포외 용액 500mL를 사용하여 백테이플 역행 헹굼을 수행했다. EVLP 순환계에 기증자 폐의 장착 전에 기관을 개방하고, 직접 기관지 흡인을 수행하여 기도를 정화했다. 기관내 튜브(크기 8mm I.D.)를 기관에 삽입해서 탯줄 밴드로 확실히 고정했다. 이후 폐를 EVLP 순환계 유닛으로 옮겼다. 먼저, LA 캐뉼라를 순환계에 연결하고 느린 역행 흐름을 개시하여 PA 캐뉼라를 환기했다. 환기가 완료되자마자 PA 캐뉼라를 순환계에 연결하고, 실온에서 150mL/분의 관류액으로 전방 흐름을 개시했다. 관류액의 온도를 다음 30분에 걸쳐서 37℃까지 단계적으로 증가시켰다. 32-34℃의 온도에 도달하자마자 기증자 돼지 폐의 기계적 공기처리를 시작하고, 공기처리 속도와 관류액 유속을 단계적으로 증가시켰다.
EVLP 가스의 흐름은 폐에 산소를 수송하며, 가스 교환 막에 의해서 유입 관류액(86% N2, 6% O2, 8% CO2)에 이산화탄소를 제공하며, 이로써 35-45mmHg에서 유입 관류액 압력(pCO2)을 유지하는 것이 시작되었다(0.5L/분 가스 흐름에서 시작하여 유입 관류액 pCO2에 기초하여 적정한다). 폐가 완전히 팽창된 순간 AP301의 단일 용량(1mg/kg, 5mL Aqua 중에)을 간단한 액체 표준 분무 시스템을 사용하여 EVLP 시스템 전환에에 의해서 환기되고 관류된 기증자 돼지 폐에 제공했다.
EVLP 실험 동안 혈류를 일정하게 평가했다. 다음의 기능 변수를 매시간 측정하여 기록했다:
* 폐 동맥 흐름(PAF): L/min
* (평균) 폐 동맥압(PAP): mmHg
* 좌심방 압력(LAP): mmHg
* 폐 혈관 저항성(PVR = [PAP-LAP] x 80 / PAF): dynes/sec/cm-5
* 평균, 최고 및 평탄 기도 압력(mAwP, peak AwP, platAwP): cmH2O
* 역학적 순응성(mL/cmH2O)
* 관류액 가스 분석 - 유입(PA) 및 유출(PV) PO2, PCO2 및 pH.
결과
이 연구는 폐 이식을 모사한 체외 시스템에서 폐기능에 대한 아미노산 서열 SEQ ID NO:1을 가진 펩티드의 효과를 평가했다. 연구 결과는 흡입을 통한 투여시 역학적 폐 순응성과 동맥-정맥 pO2 차이 ΔpO2가 도 2a 및 2b에 도시된 대로 아미노산 서열 SEQ ID NO:1을 가진 펩티드로 치료된 폐에서 개선된 것을 나타냈다.
SEQ ID NO:7의 아미노산 서열을 가진 펩티드의 사용은 폐기능에 관한 개선 효과를 나타내지 않았다.
<110> APEPTICO Forschung und Entwicklung GmbH <120> Pharmaceutical composition <130> A 18066 <150> EP 13164829.7 <151> 2013-04-23 <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cyclic peptide with disulfide bridge <220> <221> DISULFID <222> (1)..(17) <400> 1 Cys Gly Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr 1 5 10 15 Cys <210> 2 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cyclic peptide with an amide bond between the amine group attached to the epsilon-C-atom of the lysine residue and the carboxy group bound to the gamma-C-atom of the side chain of the glutaminic acid residue <400> 2 Lys Ser Pro Gly Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro 1 5 10 15 Trp Tyr Glu <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cyclic peptide with an amide bond between the amine group attached to the epsilon-C-atom of the side chain of the lysine residue and the carboxy group of the glycine residue <400> 3 Lys Gly Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr 1 5 10 15 Gly <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cyclic peptide with an amide bond between the amine group bound to the delta-C-atom of the side chain of the ornithine residue and the carboxy group of the glycine residue <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> X = Ornithine <400> 4 Xaa Gly Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr 1 5 10 15 Gly <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cyclic peptide with an amide bond between the amine group of the 4-amino butyric acid and the carboxy group bound to beta-C-atom of of the side chain of the asparaginic acid <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> X = 4-Amino butyric acid <400> 5 Xaa Gly Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr 1 5 10 15 Asp <210> 6 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cyclic peptide with an amide bond between the amine group of the beta-alanine residue and the carbonyl group bound to the gamma-C-atom of the glutaminic acid residue <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> X = beta-alanine <400> 6 Xaa Gly Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr 1 5 10 15 Glu <210> 7 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cyclic peptide with disulfide bridge <220> <221> DISULFID <222> (1)..(17) <400> 7 Cys Gly Gln Arg Glu Ala Pro Ala Gly Ala Ala Ala Lys Pro Trp Tyr 1 5 10 15 Cys <210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cyclic peptide of formula I <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> X = selectd from Cys; Lys-Ser-Pro; Lys; ornithine; 4-amino butyric acid; beta-alanine <220> <221> MOD_RES <222> (17) <223> X = ausgew?lt aus Cys; Asp; Gly, Glu <400> 8 Xaa Gly Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr 1 5 10 15 Xaa

Claims (12)

  1. 식 I: X1-GQRETPEGAEAKPWY-X2의 고리 펩티드를 포함하는 흡입용 약학적 조성물로서,
    상기 X1은 1 내지 4 개의 천연 및/또는 비천연 아미노산을 포함하고,
    상기 X2는 천연 아미노산을 포함하고,
    X1은 위치 1에 있는 왼쪽 N-말단 아미노산을 포함하고, X2는 마지막 오른쪽 위치에 있는 C-말단 아미노산을 포함하며,
    상기 펩티드는 동결건조물 형태이고,
    상기 동결건조물은 첨가제 및/또는 안정제를 포함하지 않고,
    상기 약학적 조성물은 첨가제 및/또는 안정제를 포함하지 않는 수성 에어로졸 형태형태이고,
    상기 식 I의 고리 펩티드는 아세테이트 염(salt)의 형태인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 X1은 C(Cys), KSP(Lys-Ser-Pro), K(Lys), 오르니틴, 4-아미노부티르산, 및 β-알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 내지 4개의 아미노산 서열인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 X2는 C(Cys), D(Asp), G(Gly) 및 E(Glu)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 고리 펩티드는 하기 서열번호(SEQ ID NO) 1 내지 6의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물:
    - SEQ ID NO:1
    시클로(CGQRETPEGAEAKPWYC)
    여기서 이황화 브릿지가 양 말단 시스테인 잔기 사이에 형성된다;
    - SEQ ID NO:2
    시클로(KSPGQRETPEGAEAKPWYE)
    여기서 아미드 결합이 N-말단 리신 잔기의 ε-탄소 원자에 부착된 아민기와 C-말단 글루타민산 잔기의 γ-탄소 원자에 부착된 측쇄 카복시기 사이에 형성된다;
    - SEQ ID NO:3
    시클로(KGQRETPEGAEAKPWYG)
    여기서 아미드 결합이 N-말단 리신 잔기의 측쇄의 ε-탄소 원자에 부착된 아민기와 C-말단 글리신 잔기의 카복시기 사이에 형성된다;
    - SEQ ID NO:4
    시클로(오르니틴-GQRETPEGAEAKPWYG)
    여기서 아미드 결합이 N-말단 오르니틴 잔기의 측쇄의 δ-탄소 원자에 부착된 아민기와 C-말단 글리신 잔기의 카복시기 사이에 형성된다;
    - SEQ ID NO:5
    시클로(4-아미노부탄산-GQRETPEGAEAKPWYD)
    여기서 아미드 결합이 N-말단 4-아미노부티르산 잔기의 아민기와 C-말단 아스파라긴산 잔기의 β-탄소 원자에 부착된 측쇄 카복시기 사이에 형성된다; 및
    - SEQ ID NO:6
    시클로(β-알라닌-GQRETPEGAEAKPWYE)
    여기서 아미드 결합이 N-말단 β-알라닌 잔기(3-아미노프로판산 잔기)의 아민기와 C-말단 글루타민산 잔기의 γ-탄소 원자에 부착된 측쇄 카복시기 사이에 형성된다.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 에어로졸의 입자는 ≤5m의 직경을 갖는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  9. 삭제
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 조성물은 폐기능 개선용인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 조성물은 폐부종(pulmonary edema) 예방 또는 치료용인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  12. 첨가제 및 안정제 없이 식 I: X1-GQRETPEGAEAKPWY-X2의 고리 펩티드의 동결건조물을 제조하는 단계; 및
    상기 동결건조물을 첨가제 및 안정제 없이 물에 용해하는 단계;를 포함하는 수성 에어로졸의 제조방법으로서,
    상기 X1은 1 내지 4 개의 천연 및/또는 비천연 아미노산을 포함하고,
    상기 X2는 천연 아미노산을 포함하고,
    X1은 위치 1에 있는 왼쪽 N-말단 아미노산을 포함하고, X2는 마지막 오른쪽 위치에 있는 C-말단 아미노산을 포함하고,
    상기 식 I의 고리 펩티드는 아세테이트 염(salt)의 형태인 것을 특징으로 하는, 제조방법.
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